JP2000189162A - Mutagen-detection and transformed body used therefor - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光タンパク遺伝
子を導入した形質転換体を利用した変異原検出法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a mutagen detection method using a transformant into which a fluorescent protein gene has been introduced.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現在、遺伝毒性物質や癌原性物質の短期
スクリーニングとして変異原性試験法が数多く報告され
ているが、その中でも、世界中で最も広く一般的に使用
されているのが微生物を用いる復帰突然変異試験法であ
る。日本では、サルモネラの復帰変異試験（エームス試
験：Ｍａｒｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．：Ｒｅ
ｖｉｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ Ｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ
Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，１１３，１７３−２１
５，１９８３）と大腸菌の復帰変異試験（Ｇｒｅｅｎ，
Ｍ．Ｈ．Ｌ．，Ｍｕｒｉｅｌ，Ｗ．Ｊ．：Ｍｕｔａｇｅ
ｎ ｔｅｓｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＴＲＰ＋ｒｅｖｅｒ
ｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ．
Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．，３８，３−３２，１９７
６）が一般的に実施されている。2. Description of the Related Art At present, many mutagenicity test methods have been reported as short-term screenings for genotoxic substances and carcinogenic substances, and among them, microorganisms are most widely used worldwide. This is a reversion test method using In Japan, Salmonella reversion test (Ames test: Maron, DM, Ames, BN: Re
visited method for the Salm
onella Mutagenicity test
Mutation Res. , 113, 173-21
5, 1983) and a reversion test of E. coli (Green,
M. H. L. Muriel, W .; J. : Mutage
n testing using TRP + revers
session in Escherchia coli.
Mutation Res. , 38, 3-32, 197
6) is commonly practiced.
【０００３】該方法は、微生物を用いて、アミノ酸要求
性の復帰突然変異誘発をプレート法で試験し、それによ
り変異原を検索する方法である。例えば、サルモネラの
復帰変異試験は、ヒスチジン生合成系を欠損しているネ
ズミチフス菌株を用いて行う。該菌はヒスチジン要求性
であるので、ヒスチジンを欠いた培地では増殖できな
い。しかし、被験物質を添加した培地中で該菌を培養し
た場合、該被験物質に変異原性があるならば、それによ
り突然変異が惹起される。その結果生じるヒスチジン合
成能の復帰によって該菌の増殖が可能になる。実際の判
定は、復帰突然変異により形成されたコロニー数を、目
視または自動コロニーカウンターにより数えることで行
う。目視による場合は、判定が正確である反面、手間が
掛かり、しかも必要とされる労力および時間は測定する
検体数と共に増大する。それに対して、自動コロニーカ
ウンターを用いた場合は、測定に必要な労力と時間を節
約できるが、被験物質によっては、コロニーだけを特異
的に認識することができなくなり、その結果、正確な結
果を得にくい場合も生じた。特に、被験物質が有色物で
ある場合は、自動コロニーカウンターによる測定が不可
能であった。また、被験物質により析出物が生じる場合
には、析出物もコロニーとして数えてしまうおそれがあ
った。In this method, a reverse mutagenesis requiring an amino acid is tested by a plate method using a microorganism, and thereby a mutagen is searched. For example, a reversion test for Salmonella is performed using a Salmonella typhimurium strain deficient in the histidine biosynthesis system. Since the bacterium is histidine-requiring, it cannot grow on a medium lacking histidine. However, when the bacterium is cultured in a medium to which a test substance has been added, if the test substance has mutagenicity, a mutation is thereby caused. The resulting restoration of histidine synthesis capacity allows the bacteria to grow. The actual determination is made by counting the number of colonies formed by the back mutation visually or by an automatic colony counter. In the case of visual observation, although the determination is accurate, it takes time and effort, and the required labor and time increase with the number of samples to be measured. In contrast, when an automatic colony counter is used, the labor and time required for measurement can be saved, but depending on the test substance, it is not possible to specifically recognize only colonies, and as a result, accurate results can be obtained. In some cases, it was difficult to obtain. In particular, when the test substance was a colored substance, measurement using an automatic colony counter was impossible. Further, when a precipitate is generated by the test substance, the precipitate may be counted as a colony.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、被験物質の着色、または析出物の有無に関わらず、
変異原検出をより正確に行える変異原検出方法を提供す
ることである。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a test substance,
It is an object of the present invention to provide a mutagen detection method capable of more accurately detecting a mutagen.
【０００５】また、本発明の目的は、変異原検出を目視
で行う場合の労力と時間を軽減することである。Another object of the present invention is to reduce the labor and time required to visually detect a mutagen.
【０００６】また、本発明の更なる目的は、変異原検出
に自動コロニーカウンターを用いる場合でも、より正確
な判定を得ることが可能な変異原検出方法を提供するこ
とである。It is a further object of the present invention to provide a method for detecting a mutagen capable of obtaining a more accurate determination even when an automatic colony counter is used for mutagen detection.
【０００７】更に、本発明の目的は、変異原検出のため
の指標に用いる蛍光タンパクを、長時間安定して測定で
きる変異原検出方法を提供することである。It is a further object of the present invention to provide a mutagen detection method capable of stably measuring a fluorescent protein used as an indicator for mutagen detection for a long period of time.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ために、本発明は、被験試料中の変異原の存否を決定又
は存在量を測定するための方法であって、緑色蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）遺伝子若しくは該遺伝子を含んでなる
組換え遺伝子を宿主微生物または生物に導入すること
と、該遺伝子を導入した前記宿主微生物を前記被験試料
の含有されている培地中で培養することと、該変異によ
り検出可能となった緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍
光を測定することとを具備する方法を提供する。In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a method for determining the presence or absence of a mutagen in a test sample or measuring the abundance thereof, comprising a green fluorescent protein (GFP). A) introducing the gene or a recombinant gene comprising the gene into a host microorganism or organism, culturing the host microorganism into which the gene has been introduced in a medium containing the test sample, Measuring the fluorescence of green fluorescent protein (GFP), which can be detected by the above method.
【０００９】ここで前記測定方法は、前記宿主微生物と
して大腸菌またはネズミチフス菌を用いることが好まし
い。より詳しくは、前記宿主微生物として、トリプトフ
ァン要求性の大腸菌ＷＰ２系、またはヒスチジン要求性
のネズミチフス菌ＴＡ系等の何れかの菌を用いることが
好ましい。Here, in the above-mentioned measuring method, it is preferable to use Escherichia coli or Salmonella typhimurium as the host microorganism. More specifically, it is preferable to use any bacteria such as tryptophan-requiring Escherichia coli WP2 or histidine-requiring Salmonella typhimurium as the host microorganism.
【００１０】この方法の第１の態様では、緑色蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）で形質転換された宿主微生物または生
物を変異原により処理するとともに、変異を起こした宿
主微生物または生物のみがコロニー化し得る条件で培養
したので、コロニーを形成するにつれてＧＦＰの蛍光量
も自然に増加する。また、この方法の第２態様では、Ｄ
ＮＡ損傷を受けた宿主微生物または生物のみがＧＦＰ活
性を持つような試験工程を適用するのでＤＮＡ損傷を受
けた量に応じて蛍光量が増加する。従って、増加したＧ
ＦＰの蛍光を定性的または定量的に測定するだけで、コ
ロニーを特別な染色処理することなく、簡単に被験物質
による析出とコロニーの判別を実行できる。従って、目
視による認識が容易になり、それにより労力と時間が短
縮されると共に、自動コロニーカウンターでの検出の精
度も向上する。更に、コロニーを蛍光で測定できるの
で、被験物質が有色であったり析出したとしても、変異
の結果のみを選択的に測定できる点で有利である。その
上、該緑色蛍光タンパク質は、安定性に比較的優れてい
るので、長時間保存した後でもその蛍光を再び測定する
ことが可能である。[0010] In the first embodiment of the method, a host microorganism or organism transformed with green fluorescent protein (GFP) is treated with a mutagen, and under the conditions that only the mutated host microorganism or organism can colonize. Because of the culture, the amount of GFP fluorescence naturally increases as colonies are formed. Further, in the second embodiment of the method, D
Since the test step is applied such that only the NA-damaged host microorganism or organism has GFP activity, the amount of fluorescence increases with the amount of DNA-damaged. Therefore, the increased G
By simply measuring the FP fluorescence qualitatively or quantitatively, the precipitation with the test substance and the discrimination of the colonies can be easily performed without specially staining the colonies. Accordingly, visual recognition is facilitated, thereby reducing labor and time, and improving the accuracy of detection by the automatic colony counter. Furthermore, since the colonies can be measured by fluorescence, even if the test substance is colored or precipitated, it is advantageous in that only the result of mutation can be selectively measured. In addition, since the green fluorescent protein has relatively excellent stability, its fluorescence can be measured again even after storage for a long time.
【００１１】[0011]
【発明の実施の形態】本発明で使用する緑色蛍光タンパ
ク遺伝子（以下、ＧＦＰ遺伝子と略す）は、オワンクラ
ゲからクローニングされ、そのアミノ酸配列も公知であ
る（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ，
Ｖ．Ｋ．，Ｗａｒｄ，Ｗ．Ｗ．，Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓ
ｔ，Ｆ．Ｇ．，Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｍ．Ｊ．：Ｐｒｉｍａ
ｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒ
ｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅ，１１１（２），
２２９−２３３，１９９２）。このＧＦＰ遺伝子の導
入、および発現がなされた微生物は、３００から４３０
ｎｍの励起光を照射されたときに、４００から５８０ｎ
ｍの蛍光を生ずる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The green fluorescent protein gene (hereinafter abbreviated as GFP gene) used in the present invention has been cloned from Oan jellyfish and its amino acid sequence is also known (Prasher, DC, Eckenrode,
V. K. Ward, W .; W. , Prendergas
t, F. G. FIG. , Cormier, M .; J. : Prima
structure of the Aequor
ea victoria green-fluores
cent protein. Gene, 111 (2),
229-233, 1992). The microorganism into which the GFP gene has been introduced and expressed is 300 to 430
400 to 580 n when irradiated with excitation light
m fluorescence.
【００１２】ＧＦＰ遺伝子の宿主微生物への導入は、そ
の導入の後に該宿主微生物において発現されることが可
能であるような、ベクター等を用いた当業者に公知の如
何なる方法によっても行うことが可能である。好ましく
は、クロンテック・ラボラトリーズから入手可能な、Ｇ
ＦＰ遺伝子を導入したｐＥＧＦＰベクター（例えば、ｐ
ＧＦＰｕｖ）等を用いることが望ましい。ｐＥＧＦＰベ
クターは、より明るい蛍光と哺乳類細胞における高い発
現性を得るための、野生型緑蛍光タンパクの赤シフト変
異体遺伝子を有しており、該遺伝子によりコードされる
ＧＦＰの最大励起波長は４８８ｎｍ、最大蛍光波長は５
０７ｎｍである。しかし、宿主微生物または生物（特に
生物由来の細胞、組織、培養物）の種類や試験目的等に
応じて、別なＧＦＰ発現ベクターを使用してもよい。好
ましくは、形質転換した微生物または生物の培養期間中
および保存期間中に、ＧＦＰの組み込み状態を安定に維
持できるように、材料、処理条件等を設定するものとす
る。以下、本発明による変異原検出法の態様を説明す
る。The GFP gene can be introduced into a host microorganism by any method known to those skilled in the art using a vector or the like, which can be expressed in the host microorganism after the introduction. It is. Preferably, G available from Clontech Laboratories
PEGFP vector into which the FP gene has been introduced (for example, pEGFP vector
It is desirable to use GFPuv) or the like. The pEGFP vector has a red-shift mutant gene of wild-type green fluorescent protein to obtain brighter fluorescence and high expression in mammalian cells, and the maximum excitation wavelength of GFP encoded by the gene is 488 nm. Maximum fluorescence wavelength is 5
07 nm. However, another GFP expression vector may be used depending on the type of the host microorganism or organism (particularly, cells, tissues, and cultures derived from the organism) and the purpose of the test. Preferably, materials, processing conditions, and the like are set so that the GFP incorporation state can be stably maintained during the culture period and the storage period of the transformed microorganism or organism. Hereinafter, embodiments of the mutagen detection method according to the present invention will be described.
【００１３】１．微生物復帰突然変異試験 微生物を用いる復帰突然変異試験法は、アミノ酸要求性
変異株を用いて行う試験（通称、ＡＭＥＳ法）である。
ここで「アミノ酸要求性変異株」とは、本来生育に必要
なアミノ酸を生合成することが可能なアミノ酸非要求性
株であった野性株を、該アミノ酸の生合成系を支配する
遺伝子の突然変異を誘発することにより得た、特定のア
ミノ酸を合成することが不可能な変異株をいう。該試験
は、アミノ酸要求性変異株を変異原と共に培養し、それ
により惹起された突然変異によって、先の突然変異がキ
ャンセルされてアミノ酸非要求性の野生形に復帰した株
（アミノ酸要求性がなくなる程度に先の突然変異の作用
が抑制された株を含む）を検出する方法である。このよ
うな後復帰株は、野性株と同様にアミノ酸を自ら合成し
て生育できるので、炭素源としてグルコースだけを添加
した最少培地で増殖して、目視可能なコロニーを形成す
る。従って、その判定は、シャーレ等の横広の容器上に
ほぼ均一に播いたアミノ酸要求株が、アミノ酸非要求株
に復帰変異したことにより増殖して形成したコロニー数
を数えることによって行われる。1. Microbial reversion test The reversion test using a microorganism is a test (commonly called AMES method) performed using an amino acid-requiring mutant.
As used herein, the term "amino acid-requiring mutant" refers to a wild-type strain that was originally a non-amino acid-requiring strain capable of biosynthesizing an amino acid required for growth, by suddenly changing the gene controlling the amino acid biosynthesis system. It refers to a mutant strain obtained by inducing a mutation and incapable of synthesizing a specific amino acid. In this test, an amino acid-requiring mutant was cultured together with a mutagen, and the resulting mutation caused the previous mutation to be canceled and returned to a non-amino acid-requiring wild-type strain (the amino acid requirement was lost). (Including strains in which the action of the previous mutation has been suppressed to a considerable extent). Like the wild-type strain, such a revertant strain can grow by synthesizing amino acids by itself, and therefore grows in a minimal medium containing only glucose as a carbon source to form a visible colony. Therefore, the determination is made by counting the number of colonies formed by growing an amino acid-requiring strain that has been substantially uniformly sown on a horizontal container such as a petri dish and reverting to an amino acid-requiring strain.
【００１４】本発明の微生物を用いる復帰突然変異試験
では、通常用いられる宿主微生物にＧＦＰ遺伝子を導入
し、緑蛍光タンパク（以下、ＧＦＰと略す）を発現させ
る。これにより、該宿主微生物を変異原と共に培養した
後、復帰突然変異株が形成したコロニーは検出可能な蛍
光を発する。従って、この蛍光を測定することにより、
コロニーの数をカウントすることができる。In the reverse mutation test using the microorganism of the present invention, a GFP gene is introduced into a commonly used host microorganism to express a green fluorescent protein (hereinafter abbreviated as GFP). Thus, after culturing the host microorganism with the mutagen, the colony formed by the revertant emits detectable fluorescence. Therefore, by measuring this fluorescence,
The number of colonies can be counted.
【００１５】本発明で使用することが可能な宿主微生物
は、変異原試験で一般的に用いられる微生物である、ネ
ズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）や大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）である。詳しくは、ネズミチフス菌のＴＡ菌株、お
よび大腸菌のＷＰ２系株等である。The host microorganism that can be used in the present invention is Salmonella typhimu, a microorganism generally used in mutagen tests.
rium) and Escherichia coli (Escherichia col)
i). Specifically, it includes a TA strain of Salmonella typhimurium and a WP2 strain of Escherichia coli.
【００１６】より詳しくは、ヒスチジン要求性のネズミ
チフス菌ＴＡ系、更に詳しくは、ネズミチフス菌ＴＡ９
２、ネズミチフス菌ＴＡ１５３５、ネズミチフス菌ＴＡ
１００、ネズミチフス菌ＴＡ１５３７、ネズミチフス菌
ＴＡ２６３７、ネズミチフス菌ＴＡ９４、ネズミチフス
菌ＴＡ１５３８、ネズミチフス菌ＴＡ９８、ネズミチフ
ス菌ＴＡ９７、ネズミチフス菌ＴＡ１０２、ネズミチフ
ス菌ＴＡ１０３、ネズミチフス菌ＴＡ１０４である。More specifically, the histidine-requiring Salmonella typhimurium TA system, and more specifically, the Salmonella typhimurium TA9.
2. Salmonella typhimurium TA1535, Salmonella typhimurium TA
100, Salmonella typhimurium TA1537, Salmonella typhimurium TA2637, Salmonella typhimurium TA94, Salmonella typhimurium TA1538, Salmonella typhimurium TA98, Salmonella typhimurium TA97, Salmonella typhimurium TA102, Salmonella typhimurium TA103, and Salmonella typhimurium TA104.
【００１７】または、トリプトファン要求性の大腸菌Ｗ
Ｐ２系、更に詳しくは、大腸菌ＷＰ２Ｂ／ｒ、大腸菌Ｗ
Ｐ２ｕｖｒＡ、大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ／ｐＫＭ１０１で
ある。Alternatively, tryptophan-requiring Escherichia coli W
P2 system, more specifically E. coli WP2B / r, E. coli W
P2uvrA, E. coli WP2uvrA / pKM101.
【００１８】上記の菌株は、各々に特徴を有している。
上記のネズミチフス菌についての幾つかの特徴を示す
と；ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ９２、ＴＡ１０
２、ＴＡ１０３およびＴＡ１０４は、塩基対置換型の変
異原の検索に適している；ＴＡ９８、ＴＡ１５３７、Ｔ
Ａ１５３８、ＴＡ９４、ＴＡ９７およびＴＡ２６３７
は、フレームシフト型の変異原の検索に用いることが好
ましい；ＴＡ９２、ＴＡ９４およびＴＡ１０２は、ＤＮ
Ａ鎖間に架橋する型の変異原の検索に適する；ＴＡ１０
０、ＴＡ９８、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３８、ＴＡ１５
３７、ＴＡ９７およびＴＡ１０２は、膜変異ｒｆａを有
し、細胞壁のリポ多糖類の合成能がないので、被験物質
の透過性が高く、従って分子量の大きい物質も細胞内に
入れることができる；ＴＡ１００およびＴＡ９８は薬剤
耐性のＲ−ｆａｃｔｏｒのプラスミドｐＫＭ１０１の導
入された菌株であり、高感受性である。Each of the above strains has its own characteristics.
Some characteristics of the Salmonella typhimurium described above are shown; TA100, TA1535, TA92, TA10.
2, TA103 and TA104 are suitable for searching for base pair-substituted mutagens; TA98, TA1537, T
A1538, TA94, TA97 and TA2637
Is preferably used to search for a frameshift mutagen; TA92, TA94 and TA102
Suitable for searching for a type of mutagen that crosslinks between A chains; TA10
0, TA98, TA1535, TA1538, TA15
37, TA97 and TA102 have a membrane mutation rfa and are incapable of synthesizing lipopolysaccharide in the cell wall, so that test substances are highly permeable and therefore substances with a high molecular weight can also be introduced into cells; TA100 and TA100 TA98 is a strain into which the drug-resistant R-factor plasmid pKM101 has been introduced, and is highly sensitive.
【００１９】一方、上記の大腸菌は、主に塩基対置換型
の変異原の検索に用いる。特に、ＷＰ２ｕｖｒＡ（ｔｒ
ｐ−）株は、ＤＮＡ修復機能に関するｕｖｒＡ遺伝子を
欠失しているため、紫外線感受性を有する。更に、ネズ
ミチフス菌では陰性となってしまうような金属変異原に
対しても、正確な結果を得ることが可能である。また、
アゾ色素、ヒドラジン化合物およびニトロソ化合物に対
しても高い感受性を示す。On the other hand, the above-mentioned Escherichia coli is mainly used for searching for a mutagen of a base pair substitution type. In particular, WP2uvrA (tr
The p-) strain is UV-sensitive because it lacks the uvrA gene for DNA repair function. Further, accurate results can be obtained even for metal mutagens that are negative in Salmonella typhimurium. Also,
High sensitivity to azo dyes, hydrazine compounds and nitroso compounds.
【００２０】従って、試験を実施するに当たっては、被
験物質やその他の情報を考慮し、宿主微生物を選択し、
或いは必要に応じて複数の菌株を用いることが好ましい
が、このことは当業者には周知のことである。Therefore, in conducting the test, the host microorganism is selected in consideration of the test substance and other information,
Alternatively, it is preferable to use a plurality of strains as necessary, which is well known to those skilled in the art.
【００２１】本発明の微生物を用いる復帰突然変異試験
においては、先ず、一般的に使用される何れかの方法に
よって、使用する宿主微生物に該ＧＦＰ遺伝子を導入す
る。ここで使用される導入方法としては、ＧＦＰ遺伝子
を組み込んだ自己複製能をもつプラスミドベクターやウ
イルスベクター等を使用することが可能である。このよ
うなベクターを、リン酸カルシウム法、トランスフェク
ション法、リポフェクション法、エレクトロポレーショ
ン法等の当業者に周知の方法で、宿主微生物に導入すれ
ばよい。場合によっては、宿主のゲノム中にＧＦＰ遺伝
子を組み込んでもよい。しかし、該導入を行った結果、
コロニー数を数える作業等により変異性を検出する最終
段階において、該宿主微生物にＧＦＰ遺伝子が発現さ
れ、検出可能な程度に蛍光が生じなくてはならない。In the reverse mutation test using the microorganism of the present invention, first, the GFP gene is introduced into a host microorganism to be used by any of the commonly used methods. As an introduction method used here, a plasmid vector or a virus vector having a self-replicating ability into which a GFP gene is incorporated can be used. Such a vector may be introduced into a host microorganism by a method known to those skilled in the art, such as a calcium phosphate method, a transfection method, a lipofection method, and an electroporation method. In some cases, the GFP gene may be integrated into the genome of the host. However, as a result of the introduction,
In the final step of detecting variability by counting the number of colonies or the like, the GFP gene must be expressed in the host microorganism and fluorescence must be generated to a detectable degree.
【００２２】前記の遺伝子の導入に続き、該宿主微生物
を２〜３日間培養する。このとき使用する培地には、目
的に応じた各被験物質を任意の濃度で含ませる。また、
ここで用いる培地の選択は、培養する宿主微生物に応じ
て選択する必要がある。Following the introduction of the gene, the host microorganism is cultured for 2-3 days. The medium used at this time contains each test substance according to the purpose at an arbitrary concentration. Also,
It is necessary to select the medium used here according to the host microorganism to be cultured.
【００２３】例として、ＧＦＰ遺伝子を導入した大腸菌
ＷＰ２ｕｖｒＡ形質転換体を用いた場合を簡略的に説明
する。アンピシリンおよびＩＰＴＧ(isopropyl- β-D-t
hiogalactopyanoside)添加ＮＢ培地（Nutrient Broth N
o.2 ）に大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ形質転換体を植菌し、対
数増殖期まで培養する。この菌を、種々の濃度に調製し
た被験物質、０．１Ｍナトリウム−リン酸緩衝液および
０．５ｍＭＬ−トリプトファン含有軟寒天と混合し、最
少グルコース寒天平板培地上に重層する。３７℃で４８
時間インキュベートし、出現した変異コロニーをＵＶ等
の励起光照射により生じた発光を数える。As an example, the case where a transformant of E. coli WP2uvrA into which a GFP gene has been introduced will be described briefly. Ampicillin and IPTG (isopropyl-β-Dt
hiogalactopyanoside) NB medium (Nutrient Broth N
o.2) is inoculated with a transformant of E. coli WP2uvrA and cultured until exponential growth. This bacterium is mixed with a test substance prepared at various concentrations, a soft agar containing 0.1 M sodium-phosphate buffer and 0.5 mM L-tryptophan, and overlaid on a minimal glucose agar plate medium. 48 at 37 ° C
After incubation for a period of time, the mutated colonies that have appeared are counted for luminescence generated by irradiation with excitation light such as UV.
【００２４】被験物質に変異原性があった場合、復帰突
然変異によりコロニーが形成されるので、紫外線等を照
射することにより緑色蛍光を有するコロニーの数を、目
視または自動コロニーカウンターにより数えることがで
きる。照射する励起光の波長は、使用するＧＦＰに応じ
て発光を励起し得る波長を含んでいればよいが、使用す
るＧＦＰの最大励起波長になるべく近いものが好まし
い。またこのとき、コロニーの数を直接数える代わり
に、生じる緑蛍光の光量を測定してもよい。If the test substance is mutagenic, colonies are formed by reversion, and the number of colonies having green fluorescence can be counted visually or by an automatic colony counter by irradiating ultraviolet rays or the like. it can. The wavelength of the excitation light to be irradiated may include a wavelength capable of exciting light emission according to the GFP to be used, but is preferably as close as possible to the maximum excitation wavelength of the GFP to be used. At this time, instead of directly counting the number of colonies, the amount of generated green fluorescence may be measured.
【００２５】また、本発明は、被験物質の代謝産物の変
異原性試験を行うことも可能である。この場合、検索す
る薬物代謝系を誘導する処理を行った哺乳類（ラット
等）の肝ホモジネートを遠心（９，０００×ｇ、１０分
間）して得た上清（Ｓ９）に、補酵素等を添加したＳ９
ｍｉｘを、試験系に添加して行う。また、この場合、Ｓ
９ｍｉｘを添加しない条件と、Ｓ９ｍｉｘを添加した条
件の両方を組み合わせて実施することが好ましい。In the present invention, it is also possible to conduct a mutagenicity test of a metabolite of a test substance. In this case, a coenzyme or the like is added to the supernatant (S9) obtained by centrifuging (9,000 × g, 10 minutes) the liver homogenate of a mammal (rat or the like) that has been subjected to a process of inducing a drug metabolic system to be searched. S9 added
mix is added to the test system. In this case, S
It is preferable to carry out the combination of both the condition where 9mix is not added and the condition where S9mix is added.
【００２６】２．ｕｍｕ試験 本発明をｕｍｕ試験に応用してもよい。2. umu Test The present invention may be applied to the umu test.
【００２７】この試験は、大腸菌のＳＯＳ反応のうち突
然変異生成に直接関与するｕｍｕＣ遺伝子の発現を利用
して、種々の化学変異原を含んだ溶液中の酵素活性を測
定することによりＤＮＡ損傷を短期間に検出する方法で
ある。This test utilizes the expression of the umuC gene which is directly involved in mutagenesis in the SOS reaction of Escherichia coli, and measures DNA damage by measuring enzyme activity in a solution containing various chemical mutagens. This is a method to detect in a short time.
【００２８】大腸菌を放射線（紫外線、Ｘ線）や変異原
で処理し、ＤＮＡを損傷させたりＤＮＡ合成を阻害させ
ると、ＤＮＡ修復能の活性化、プロファージの誘発、細
胞***の停止（フィラメント形成）、突然変異の誘導な
ど、多様な一連の反応が起る。これらを総称してＳＯＳ
反応（ＳＯＳは、細胞の緊急事態の発生信号）と呼ぶ。
この反応は細胞が生存を図るための適応反応と考えられ
る。これらの一連の反応に関与するＳＯＳ遺伝子群（約
２０種類が知られている）は主としてｌｅｘＡとｒｅｃ
Ａの２つの遺伝子よって発現が制御されている。即ち、
通常の条件下ではそれぞれのＳＯＳ遺伝子群はｌｅｘＡ
遺伝子により産生されるリプレッサータンパクによって
発現が抑制されている。ＤＮＡに一旦損傷が起ると、こ
の損傷などの状況下で生成される単鎖ＤＮＡなどによっ
て、ｒｅｃＡ遺伝子の産生するＲｅｃＡタンパクの持つ
プロテアーゼが活性化され、これがＬｅｘＡリプレッサ
ータンパクを分解して、ＳＯＳ遺伝子群が発現される。
ＳＯＳ遺伝子群のうちＤＮＡ修復酵素の働きでＤＮＡの
損傷が修復されて、細胞内のアクチベーターの濃度が下
がると、ＬｅｘＡタンパクが再び蓄積してＳＯＳ遺伝子
の発現が抑制される。When Escherichia coli is treated with radiation (ultraviolet rays, X-rays) or a mutagen to damage DNA or inhibit DNA synthesis, activation of DNA repair ability, induction of prophages, arrest of cell division (filament formation) ), A variety of reactions occur, including the induction of mutations. These are collectively called SOS
The reaction (SOS is the cell emergency occurrence signal).
This reaction is considered to be an adaptive response for the cells to survive. SOS genes involved in these series of reactions (about 20 are known) are mainly lexA and rec.
Expression is controlled by two genes of A. That is,
Under normal conditions, each SOS gene group is lexA
Expression is suppressed by the repressor protein produced by the gene. Once the DNA is damaged, the protease of the RecA protein produced by the recA gene is activated by single-stranded DNA or the like generated under the conditions of the damage, and this degrades the LexA repressor protein, The SOS genes are expressed.
When DNA damage is repaired by the action of a DNA repair enzyme in the SOS gene group and the concentration of the activator in the cell decreases, LexA protein is accumulated again, and the expression of the SOS gene is suppressed.
【００２９】ｕｍｕテストの原理は、変異原によってＳ
ＯＳ反応が誘発されると、ｕｍｕＤＣ遺伝子のプロモー
ターの調節下にあるＵｍｕＣ’−ＬａｃＺ雑種タンパク
はβ−ガラクトシダーゼ活性を持つので、その活性を測
定することによりｕｍｕＣ遺伝子発現の誘導力（ＳＯＳ
反応の強さ）を調べるものである。The principle of the umu test is that mutagen
When the OS response is induced, UmuC'-LacZ hybrid protein under the control of the promoter of the umuDC gene has β-galactosidase activity. Therefore, by measuring the activity, the inducibility of umuC gene expression (SOS
(Strength of reaction).
【００３０】近年、上記のｌａｃＺ遺伝子に換えて、ル
シフェラーゼ活性を発現する酵素を発現する遺伝子を導
入し、ルシフェラーゼ活性を測定することによる、ｕｍ
ｕテストも開発された（特開平０７−１６３３５９、特
開平０７−２２７２８５）。In recent years, a gene expressing an enzyme expressing luciferase activity has been introduced in place of the lacZ gene, and the luciferase activity has been measured.
u-tests have also been developed (JP-A-07-163359 and JP-A-07-227285).
【００３１】本発明で用いたＧＦＰ遺伝子を、上記ｌａ
ｃＺ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子の代わりに導入する
ことにより、従来にない効果が期待される。即ち、ルシ
フェラーゼ活性を測定することによる方法は、基質を同
時に存在させ、且つそれらを酵素反応させることが必要
であるため、被験物質の種類や濃度等の影響により、酵
素反応を一定条件で測定できない可能性がある。また、
酵素反応による発色等の反応は持続時間が比較的短いの
で、再測定したり順番に大量検体を測定（または判定）
するのが困難である。それに比較し、本発明の方法では
ＧＦＰの蛍光により測定することができるので、手間が
少なく簡便であり、且つ安定して長時間測定に適する蛍
光を維持することが可能である。更に、測定工程に、酵
素反応のような化学反応が介在しないので、一定した測
定条件が得られる。The GFP gene used in the present invention was
By introducing the gene in place of the cZ gene or the luciferase gene, an effect that has not been achieved before is expected. That is, the method by measuring the luciferase activity requires the simultaneous presence of the substrate and the enzymatic reaction of the substrates, so that the enzymatic reaction cannot be measured under certain conditions due to the influence of the type and concentration of the test substance. there is a possibility. Also,
Reactions such as color development by enzyme reaction are relatively short in duration, so they can be re-measured or measure (or judge) a large number of samples in order.
Difficult to do. In contrast, in the method of the present invention, the measurement can be carried out by the fluorescence of GFP, so that it is possible to easily and stably maintain the fluorescence suitable for the measurement for a long time with less labor. Further, since a chemical reaction such as an enzyme reaction does not intervene in the measurement step, constant measurement conditions can be obtained.
【００３２】本発明で用いたＧＦＰ遺伝子を、ｕｍｕ
Ｄ，Ｃ遺伝子又はｓｆｉＡ遺伝子の下流に導入する方法
は、一般的に用いられる如何なる方法によっても行え
る。The GFP gene used in the present invention was
The method of introducing the gene into the downstream of the D, C gene or sfiA gene can be performed by any method generally used.
【００３３】ＧＦＰ遺伝子の組込みが可能な宿主微生物
は、一般的にｕｍｕテストで使用されるネズミチフス菌
や大腸菌である。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、酵母
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）等が挙げられる。[0033] Host microorganisms into which the GFP gene can be integrated are Salmonella typhimurium and Escherichia coli generally used in the umu test. Specifically, for example, Escherichia coli (Esc
herichia coli, Salmonella typhimurium (Sa)
lmonella typhimurium), yeast (Saccharomyces cerevisia)
e) and the like.
【００３４】また、本発明によれば、各種変異原検出の
ための各種試験において、試験用微生物または試験用生
物を供給できる。即ち、コロニー形成能を有する任意の
微生物または生物を、形質転換処理によりＧＦＰを導入
した後で、生物活性を復元可能な条件下で、コロニー形
成を停止させるように保存することにより、この保存状
態のまま輸送し、販売して、使用者に提供することがで
きる。ここで、コロニー形成を一時的に停止させる手段
としては、冷凍（例えば、マイナス８０℃以下の低温に
よるもの）法が挙げられる。これ以外にも、凍結乾燥等
を行ってもよい。According to the present invention, a test microorganism or a test organism can be supplied in various tests for detecting various mutagens. That is, any microorganism or organism having a colony-forming ability is transfected with GFP, and then stored under conditions capable of restoring the biological activity so as to stop the colony formation. It can be transported as it is, sold, and provided to the user. Here, as a means for temporarily stopping the colony formation, a freezing method (for example, at a low temperature of −80 ° C. or less) can be mentioned. Alternatively, freeze-drying or the like may be performed.
【００３５】このようにして、提供された形質転換微生
物または形質転換生物を利用するに当っては、先ず、解
凍処理等により、形質転換体の生物活性を復元させる。
次に、復元した形質転換体を上述したように変異原が疑
われる物質と共に培養する。この培養工程と同時に、ま
たは後続する工程において、上述したような条件の培地
にて培養することにより、変異復帰したが否かを蛍光測
定によって検出する。ここで、蛍光測定する手段として
は、培養容器を直接観察することにより測定してもよい
し、市販の蛍光顕微鏡下で画像解析したり画像表示した
ものを肉眼で判定してもよい。かかる測定による結果
は、変異原性の存否のみを判定したり、手動ないし自動
カウントして変異原性の強度を判定するようにしてよ
い。変異原性の強度を測定する場合には、カウンタで蛍
光を発する個数を積算してもよいが、変異した形質転換
体の個数と蛍光総量が良好に相関する場合には、蛍光総
量に基づいて強度判断するようにしてもよい。かかる蛍
光強度および／または蛍光数により判定アルゴリズムは
極めて単純なので、画像解析装置も高価にならずに済
む。更に、可能ならば、ＧＦＰによる形質転換体のみで
なく、これを利用するに相応しい培地（好ましくは、培
養液のみではなく培養容器を含むもの）等の試験用装備
をセットにした試験キットとして提供してもよい。ま
た、宿主としては、培養細胞（ヒト等の高等生物由来を
含む）であってもよい。In utilizing the provided transformed microorganism or transformed organism, the biological activity of the transformed body is first restored by thawing treatment or the like.
Next, the reconstructed transformant is cultured with a substance suspected of being a mutagen as described above. Simultaneously with the culturing step or in a subsequent step, culturing is performed in a medium under the above-described conditions, thereby detecting whether or not the mutation has been returned by fluorescence measurement. Here, as a means for measuring the fluorescence, the measurement may be performed by directly observing the culture vessel, or the image analysis or image display under a commercially available fluorescence microscope may be visually determined. Based on the result of such measurement, the presence or absence of mutagenicity may be determined, or the intensity of mutagenicity may be determined by manual or automatic counting. When measuring the intensity of mutagenicity, the number that emits fluorescence with a counter may be integrated, but if the number of mutated transformants and the total amount of fluorescence correlate well, based on the total amount of fluorescence The strength may be determined. Since the determination algorithm is extremely simple based on the fluorescence intensity and / or the number of fluorescence, the image analyzer does not need to be expensive. Furthermore, if possible, a test kit including test equipment such as not only a GFP transformant but also a medium suitable for the use of the transformant (preferably, not only a culture solution but also a culture vessel) is provided. May be. The host may be a cultured cell (including a cell derived from a higher organism such as human).
【００３６】[0036]
【実施例】以下、微生物復帰突然変異試験の１例を示す
が、本発明は、これに限定されるものではない。EXAMPLES Hereinafter, an example of a microbial reversion test will be described, but the present invention is not limited thereto.
【００３７】（１）形質転換体の作成 大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡを対数増殖期に至るまで培養し、
その後、塩化カルシウム法によりコンピテントセルを作
成した。これを、使用時まで冷蔵庫にて冷凍保存した。
溶解したコンピテントセル１００μｌにアンピシリン耐
性を有するＧＦＰを含むベクターであるｐＥＧＦＰ（ク
ロンテック・ラボラトリーズ社、カタログ番号６０７７
−１）溶液を１μｌ添加し、５秒間穏やかに混和した。
これを氷上で３０分間静置した。４２℃で１分間インキ
ュベートし、氷上で５分間放置した。次に、５００μｌ
のＳＯＣ培養液を添加し、６０分間３７℃でインキュベ
ートし、続いて、それをアンピシリンを含むＬＢプレー
トに播き、３７℃で一晩培養して形質転換体をコロニー
として得た。(1) Preparation of Transformant Escherichia coli WP2uvrA was cultured until the logarithmic growth phase.
Thereafter, competent cells were prepared by the calcium chloride method. This was frozen and stored in a refrigerator until use.
PEGFP, a vector containing GFP having ampicillin resistance in 100 μl of the dissolved competent cells (Clontech Laboratories, catalog number 6077)
-1) 1 μl of the solution was added and mixed gently for 5 seconds.
This was left on ice for 30 minutes. Incubated at 42 ° C. for 1 minute and left on ice for 5 minutes. Next, 500 μl
Was added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes, and then plated on LB plates containing ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight to obtain transformants as colonies.
【００３８】（２）形質転換体の機能確認 上記（１）で得た大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡ形質転換体がＧ
ＦＰ遺伝子を有し、更に該遺伝子が機能的に発現するこ
とを確認するために以下の操作を行った。３ｍｌのアン
ピシリンおよびＩＰＴＧ添加ＮＢ培地に該大腸菌ＷＰ２
ｕｖｒＡ形質転換体を植菌し、３７℃で一晩培養した。
この菌懸濁液を５×１０５生菌／ｍｌに希釈して、アン
ピシリンおよびＩＰＴＧを普通寒天平板であるＢＡＢ培
地（１リットル中に、ペプトン１０ｇ、肉エキス５ｇ、
酵母エキス２ｇ、塩化ナトリウム５ｇおよび寒天１５ｇ
を含有する）に添加したものに播いた。これを３７℃で
一晩培養し、形質転換体をコロニーとして得た。これに
ＵＶ（３００ｎｍ付近：Transilluminator による) を
照射し、蛍光コロニーが生じていることを確認した（図
１）。図１は、各菌を培養した写真である。ＧＦＰ遺伝
子導入菌のコロニーは、はっきりとした蛍光を生じた
（向かって左の写真）に対し、非導入菌の場合には、蛍
光が生じなかった（向かって右の写真）。また、該蛍光
は、長時間、例えば冷蔵庫に保管すれば数日間維持する
ことが可能であった。(2) Confirmation of the function of the transformant The E. coli WP2uvrA transformant obtained in the above (1) is G
The following operation was performed to confirm that the FP gene had a FP gene and that the gene was functionally expressed. The E. coli WP2 was added to 3 ml of NB medium supplemented with ampicillin and IPTG.
The uvrA transformant was inoculated and cultured at 37 ° C. overnight.
This bacterial suspension was diluted to 5 × 10 5 viable bacteria / ml, and ampicillin and IPTG were added to a BAB medium as a normal agar plate (10 g of peptone, 5 g of meat extract, 1 liter,
2 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride and 15 g of agar
). This was cultured at 37 ° C. overnight to obtain a transformant as a colony. This was irradiated with UV (around 300 nm: using a Transilluminator), and it was confirmed that fluorescent colonies had occurred (FIG. 1). FIG. 1 is a photograph in which each bacterium was cultured. The colony of the GFP transgenic bacterium produced a clear fluorescence (left photograph), whereas the non-transfected bacterium did not produce the fluorescence (right photograph). Further, the fluorescence could be maintained for a long time, for example, several days if stored in a refrigerator.
【００３９】続いて、プラスミドの導入を確認した。前
記で得た単一コロニーを３ｍｌのアンピシリンおよびＩ
ＰＴＧ添加ＮＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。
この菌懸濁液からアルカリ法によりＤＮＡを抽出し、ア
ガロース電気泳動でプラスミドが導入されていることを
確認した（図２）。図２は、電気泳動の結果を示す写真
である。右２列は、導入されている遺伝子を示し、左端
は、分子量マーカーである。このようにプラスミドを介
して導入したＧＦＰは、宿主微生物を冷凍保存（例えば
マイナス８０℃以下の低温）することにより、随時、試
験に供することができる。Subsequently, introduction of the plasmid was confirmed. The single colony obtained above was mixed with 3 ml of ampicillin and I
The cells were inoculated into NB medium supplemented with PTG and cultured at 37 ° C. overnight.
DNA was extracted from this bacterial suspension by an alkali method, and the introduction of the plasmid was confirmed by agarose electrophoresis (FIG. 2). FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis. The right two columns show the introduced genes, and the left end is a molecular weight marker. The GFP introduced via the plasmid as described above can be subjected to a test at any time by storing the host microorganism in a frozen state (for example, at a low temperature of −80 ° C. or lower).
【００４０】[0040]
【発明の効果】本発明では、微生物中で発現された該Ｇ
ＦＰにより、変異原により形成された変異コロニーは発
光を生じる。従って、本発明を用いることにより、被験
物質の着色、または析出物の有無に関わらずに変異原の
検出がより正確に、且つ容易に行うことが可能であり、
それにより測定時間が短縮される。また本発明は、蛍光
量の測定により、定量化することも可能である。更に、
ＧＦＰの発現による蛍光は、比較的長時間安定しており
退色しにくいので、検体を保存した後でも、再度測定す
ることも可能である。According to the present invention, the G expressed in a microorganism is
By FP, the mutant colony formed by the mutagen emits light. Therefore, by using the present invention, regardless of the coloring of the test substance, or the presence or absence of a precipitate, mutagen detection can be performed more accurately and easily,
Thereby, the measurement time is reduced. The present invention can also be quantified by measuring the amount of fluorescence. Furthermore,
Since the fluorescence due to the expression of GFP is stable for a relatively long time and is not easily discolored, it is possible to measure again even after storing the sample.
【図１】ＢＡＢ培地に形成したＧＦＰ遺伝子導入菌のコ
ロニー形態（左）と非導入菌のコロニー形態（右）とを
比較した、生物の形態を示す写真。FIG. 1 is a photograph showing the morphology of an organism comparing the colony morphology of a GFP gene-transformed bacterium (left) and the non-transfected bacterium formed on a BAB medium (right).
【図２】プラスミド導入菌のＤＮＡ抽出物をアガロース
電気泳動させた電気泳動写真。FIG. 2 is an electrophoresis photograph obtained by agarose electrophoresis of a DNA extract of a plasmid-introduced bacterium.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/58 33/58 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:42） (72)発明者 佐藤 卓朋 東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号 オリ ンパス光学工業株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB20 CB21 DA13 DA36 FB12 GC15 4B024 AA11 BA80 CA04 DA05 DA06 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QQ06 QQ99 QR41 QS40 QX02 4B065 AA26X AA46X AA80X AA90Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA46Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat II (reference) G01N 33/50 G01N 33/50 Z 33/58 33/58 Z // (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:42) (C12Q 1/02 C12R 1:19) (C12Q 1/02 C12R 1:42) (72) Inventor Takutomo Sato 2-43-2 Hatagaya, Shibuya-ku, Tokyo Olympus Optical F term (reference) 2G045 AA35 BB20 CB21 DA13 DA36 FB12 GC15 4B024 AA11 BA80 CA04 DA05 DA06 EA04 GA11 HA11 4B063 QA01 QQ06 QQ99 QR41 QS40 QX02 4B065 AA26X AA46X AA8020 ABA20 AC01
Claims (6)
異性の強さを測定するための方法であって、緑色蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、若しくは該遺伝子を含んで
なる組換え遺伝子を宿主に導入することと、該遺伝子を
導入した前記宿主を前記被験試料が含有されている培地
中で培養することと、変異により検出可能となった緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光を測定することとを具
備する方法。1. A method for determining the presence or absence of a mutagen in a test sample or measuring the strength of the mutagenesis, comprising the steps of: locating a green fluorescent protein (GFP) gene or a recombinant gene comprising the gene; Introducing the host into a host, culturing the host into which the gene has been introduced in a medium containing the test sample, and measuring the fluorescence of a green fluorescent protein (GFP) detectable by the mutation. A method comprising:
存否を決定又は変異性の強さを測定するための方法であ
って、前記宿主が、大腸菌またはネズミチフス菌である
方法。2. A method for determining the presence or absence of a mutagen in a test sample according to claim 1 or measuring the strength of the mutagen, wherein the host is Escherichia coli or Salmonella typhimurium.
る物質によって復帰し得る突然変異を発現した遺伝子を
有している方法。3. The method according to claim 1, wherein the host has a gene expressing a mutation that can be restored by a mutagenic substance.
存否を決定又は変異性の強さを測定するための方法であ
って、前記宿主がトリプトファン要求性の大腸菌ＷＰ２
系である方法。4. The method according to claim 1, wherein the host is a tryptophan-requiring Escherichia coli WP2 wherein the presence or absence of a mutagen in the test sample is determined or the strength of the mutagen is measured.
The way that is system.
存否を決定又は変異性の強さを測定するための方法であ
って、前記宿主がヒスチジン要求性のネズミチフス菌Ｔ
Ａ系である方法。5. The method for determining the presence or absence of a mutagen in a test sample according to claim 1 or measuring the strength of the mutagen, wherein the host is a histidine-requiring Salmonella typhimurium T.
A method that is A-series.
変異性の強さを測定するために使用され、緑色蛍光タン
パク質（ＧＥＰ）遺伝子を体内の遺伝子の一部として含
むと共に、適宜の保存条件下で生物活性を実質的に停止
した状態に保存してなる形質転換体。6. It is used for determining the presence or absence of a mutagen in a test sample or for measuring the strength of the mutagenesis, and contains the green fluorescent protein (GEP) gene as a part of the gene in the body and appropriately stores it. A transformant stored under a condition in which biological activity is substantially stopped.
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|---|---|---|---|
| JP10370349A JP2000189162A (en) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | Mutagen-detection and transformed body used therefor |
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|---|---|---|---|
| JP10370349A JP2000189162A (en) | 1998-12-25 | 1998-12-25 | Mutagen-detection and transformed body used therefor |
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Cited By (4)
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1998
- 1998-12-25 JP JP10370349A patent/JP2000189162A/en not_active Withdrawn
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