JP2000154151A - Immunosuppressant - Google Patents

Immunosuppressant

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JP2000154151A
JP2000154151A JP11258650A JP25865099A JP2000154151A JP 2000154151 A JP2000154151 A JP 2000154151A JP 11258650 A JP11258650 A JP 11258650A JP 25865099 A JP25865099 A JP 25865099A JP 2000154151 A JP2000154151 A JP 2000154151A
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cells
formula
immunosuppressant
liver
extract
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Kyo Jo
強 徐
Ikuo Saiki
育夫 済木
Tei Chin
▲てい▼ 陳
Katsuko Komatsu
かつ子 小松
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an immunosuppressant hardly causing side effects, having a selective apoptosis activity, and useful for treatment of rejection symptom associated with transplantation, autoimmune disease, allergic disease or the like by using an active material selectively suppressing an activated T cell as an active ingredient. SOLUTION: This immunosuppressant contains an active material such as flavonoids and chromones selectively suppressing an activated T cell, represented by formula I [R is H or hydroxy-substituted phenyl; Rha is α-L-rhamnose residue; a dotted line represent the presence (absence) of a double bond] and exemplified by a compound of formula II as an active ingredient. Preferably, a plant extract of Smilax glabra Roxb. or the like, containing the flavonoids or the chromones of formula I is used as the active ingredient, and the daily dose of the active ingredient in the case of oral administration is 1-500 mg/person.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は免疫抑制剤に係り、
詳細には、活性化したＴ細胞を選択的に抑制する作用物
質を有効成分とする免疫抑制剤に係り、活性化したＴ細
胞に起因する免疫異常、例えば、移植に対する拒絶反
応、骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対宿主病、自
己免疫疾患、自己免疫疾患や類縁疾患に起因する組織の
損傷や感染に伴って起こる炎症反応、線維化さらに臓器
機能障害、アレルギー疾患等の治療剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunosuppressant,
More specifically, the present invention relates to an immunosuppressant containing an active substance that selectively inhibits activated T cells as an active ingredient, and relates to an immune abnormality caused by activated T cells, such as rejection to transplantation, bone marrow (hematopoietic stem cells). The present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory reaction, fibrosis, organ dysfunction, allergic disease and the like caused by tissue damage and infection caused by graft-versus-host disease, autoimmune disease, autoimmune disease and related diseases caused by transplantation.

【０００２】[0002]

【従来の技術】生体における免疫系は、本来、外来から
の異物である微生物を認識して排除するための生体防御
機構として進化してきたものである。そのために、生体
は自己の細胞や組織（すなわち、自己抗原）と、異物で
ある微生物（非自己抗原）を区別して認識し、自己抗原
に対しては免疫応答をしないか、あるいは反応したとし
ても免疫機能を発揮できない状態（免疫寛容）を保持し
つつ、外来性の非自己抗原を速やかに、かつ効率的に排
除するべく獲得免疫を発達させてきた。2. Description of the Related Art The immune system in a living body has originally evolved as a living body defense mechanism for recognizing and eliminating microorganisms which are foreign substances. For this reason, living organisms recognize and distinguish between their own cells and tissues (ie, self antigens) and foreign microorganisms (non-self antigens), and even if they do not respond or react to self antigens, Acquired immunity has been developed in order to eliminate foreign non-self antigens quickly and efficiently while maintaining a state in which an immune function cannot be exerted (immune tolerance).

【０００３】その免疫系において、中心的な役割を担っ
ているのがＴ細胞（Ｔリンパ球）である。末梢にでたば
かりのナイーブＣＤ４Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞レ
セプターを通じて、抗原提示細胞から抗原の提示を受け
ると同時に、活性化関連分子群からのある種のシグナル
により活性化され、Ｔ細胞増殖因子であるＩＬ−２を分
泌して増殖する（Ｔｈｐ：ヘルパーＴ細胞）。このＴｈ
ｐがＴｈ０に分化し、その後Ｔｈ１またはＴｈ２に分か
れ、さまざまなサイトカインの産生、さらなる細胞増
殖、細胞傷害活性などが誘導される。[0003] T cells (T lymphocytes) play a central role in the immune system. Na ナ イ ve CD4 T cells, which have just emerged in the periphery, are presented with antigen from antigen presenting cells through T cell receptors on the cell surface, and are activated by certain signals from activation-related molecules, resulting in T cell proliferation. Proliferates by secreting factor IL-2 (Thp: helper T cells). This Th
p differentiates into Th0 and then into Th1 or Th2, which induces the production of various cytokines, further cell proliferation, cytotoxic activity and the like.

【０００４】これら一連の免疫応答に異常が起きると、
リンパ球とくにＴ細胞が自己抗原に対して強く反応（自
己抗原に対して免疫応答）し、その結果、自己の組織傷
害を引き起こすことがあり、これを自己免疫疾患とい
う。これらの免疫異常反応における引き金のひとつとし
て、ウイルスや細菌に対する本来の免疫応答が、何らか
の機構で、自己抗原に対する免疫応答に変わってしまう
可能性が指摘されている。この自己免疫疾患により引き
起こされた組織の損傷や感染は、種々の炎症反応、さら
に組織の線維化、臓器の機能障害等をもたらす。When abnormalities occur in these series of immune responses,
Lymphocytes, especially T cells, react strongly to self-antigens (immune response to self-antigens), and as a result, may cause tissue damage to themselves. This is called an autoimmune disease. It has been pointed out that one of the triggers in these abnormal immune reactions is that the original immune response to viruses and bacteria may be changed to an immune response to self-antigen by some mechanism. Tissue damage or infection caused by this autoimmune disease results in various inflammatory reactions, tissue fibrosis, organ dysfunction, and the like.

【０００５】一方、正常な免疫応答であっても、臓器移
植に伴う拒絶反応や、骨髄（造血幹細胞）移植に伴う移
植片対宿主病を抑制することが治療上待望されている。
これらで誘導される免疫応答は、基本的に同一であり、
活性化されたＴ細胞が主体をなしている。[0005] On the other hand, even if the immune response is normal, suppression of rejection reaction associated with organ transplantation and graft-versus-host disease associated with bone marrow (hematopoietic stem cell) transplantation has been awaited for treatment.
The immune responses elicited in these are essentially the same,
Activated T cells are the main component.

【０００６】さらに近年、アレルギー疾患における活性
化Ｔ細胞の役割も注目されている。すなわち、活性化Ｔ
ｈ２細胞が主に産生するＩＬ−４，ＩＬ−５等のサイト
カインは、肥満細胞や好酸球を活性化して即時型アレル
ギーを惹起し、また、活性化Ｔｈ１細胞が主に産生する
ＩＦＮ−γ等は、遅延型アレルギーを惹起することが明
らかとなってきた。[0006] In recent years, the role of activated T cells in allergic diseases has also attracted attention. That is, activation T
Cytokines such as IL-4 and IL-5 mainly produced by h2 cells activate mast cells and eosinophils to cause immediate allergy, and IFN-γ mainly produced by activated Th1 cells. Et al. Have been shown to cause delayed allergy.

【０００７】したがって、自己免疫疾患や移植免疫、そ
れらに伴う慢性活動性の免疫学的な炎症反応、さらにア
レルギー疾患に対する治療のために、活性化Ｔ細胞の選
択的な抑制を確保し得る薬剤の登場が期待されている。[0007] Therefore, for the treatment of autoimmune diseases, transplant immunity, associated chronic active immunological inflammatory reactions, and allergic diseases, drugs capable of ensuring the selective suppression of activated T cells are required. It is expected to appear.

【０００８】このような状況下、Ｔ細胞活性化機構にお
けるメディエーターの制御による治療手段が検討されて
きており、シクロスポリンやＦＫ５０６等によるＴ細胞
に対する強力な免疫抑制効果、抗サイトカイン療法、抗
接着分子（活性化関連分子）療法、モノクローナル抗体
療法等が注目されている。[0008] Under these circumstances, therapeutic means by controlling the mediator in the T cell activation mechanism have been studied, and a strong immunosuppressive effect on T cells by cyclosporine or FK506, anti-cytokine therapy, anti-adhesion molecule ( (Activation-related molecule) therapy, monoclonal antibody therapy and the like have been attracting attention.

【０００９】しかしながら、これらの療法も、従来から
のグルココルチコイドによる療法と同様に、活性化Ｔ細
胞選択的とは言い難く、副作用等の問題が解決されてい
るものではない。However, these therapies, like conventional glucocorticoid therapies, are hardly selective for activated T cells and do not solve the problems such as side effects.

【００１０】ところで、自己免疫疾患は全身性に加え
て、ほとんどの臓器においても認めらる疾患である。ま
た今後、臓器移植手術や造血幹細胞移植手術がますます
発展するのに伴い、拒絶反応の問題や、移植片対宿主病
の問題も増大してくる。さらには、アレルギー性疾患は
文明病ともいわれ、一度罹患するとなかなか完治しにく
く、現在でも罹患患者数がきわめて多いのが現状であ
る。[0010] By the way, an autoimmune disease is a disease that is observed not only in systemic but also in most organs. In the future, as organ transplantation surgery and hematopoietic stem cell transplantation surgery progress further, the problem of rejection and the problem of graft-versus-host disease will also increase. Furthermore, the allergic disease is also called civilization disease, and it is difficult to completely cure it once it becomes afflicted. At present, the number of affected patients is extremely large.

【００１１】このように、活性化Ｔ細胞が中心的な役割
を担っている疾患は多岐にわたるものであり、これら疾
患に対する有効な治療薬の開発が期待されてはいるもの
の、いまだ活性化されたＴ細胞に起因する疾患の治療手
段として、活性化Ｔ細胞の働きを選択的に抑制するよう
な薬剤は登場していない。As described above, there are a wide variety of diseases in which activated T cells play a central role, and although development of an effective therapeutic agent for these diseases is expected, they are still activated. As a therapeutic means for a disease caused by T cells, there has been no drug that selectively suppresses the function of activated T cells.

【００１２】[0012]

【発明が解決しようとする課題】したがって本発明は、
上記した現状に鑑み、自己免疫疾患、自己免疫疾患や類
縁疾患に起因する組織の損傷や感染に伴って起こる炎症
反応さらに組織の線維化および臓器機能障害、臓器移植
の拒絶反応、骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対宿
主病、さらにアレルギー疾患に対して、その原因となる
活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する、副作用の少ない、臨
床的に適応し得る、有効な免疫抑制剤を提供することを
基本的課題とする。Accordingly, the present invention provides
In view of the above-mentioned current situation, autoimmune diseases, inflammatory reactions caused by tissue damage and infection caused by autoimmune diseases and related diseases, tissue fibrosis and organ dysfunction, organ transplant rejection, bone marrow (hematopoietic stem cells 2.) To provide an effective immunosuppressive agent that selectively suppresses activated T cells that cause causative disease of graft-versus-host disease and allergic disease caused by transplantation, has few side effects, and is clinically applicable. That is the basic task.

【００１３】かかる課題を解決するべく、本発明者は鋭
意検討をした結果、活性化Ｔ細胞の選択的アポトーシス
を機序として、活性化したＴ細胞を選択的に抑制する作
用物質を新規に見出した。さらに、この選択的抑制剤が
かかる機序により、活性化Ｔ細胞起因性の疾患を有効に
予防、または治療し得ることを新規に見出して、本発明
を完成させるに至った。As a result of intensive studies to solve such a problem, the present inventors have newly found an active substance that selectively suppresses activated T cells by using the mechanism of selective apoptosis of activated T cells. Was. Furthermore, they have newly found that this selective inhibitor can effectively prevent or treat activated T cell-induced diseases by such a mechanism, and have completed the present invention.

【００１４】[0014]

【課題を解決するための手段】しかして本発明は、その
一態様として、活性化したＴ細胞を選択的に抑制する作
用物質を有効成分とする免疫抑制剤を提供する。Accordingly, the present invention provides, as one aspect thereof, an immunosuppressant comprising an active ingredient which selectively inhibits activated T cells as an active ingredient.

【００１５】本発明において、活性化したＴ細胞とは、
各種サイトカインを産生、分泌して増殖し、引き続き一
連の反応を惹起するＴ細胞をいう。In the present invention, the activated T cell is
It refers to T cells that produce and secrete various cytokines, proliferate, and subsequently elicit a series of responses.

【００１６】本発明は、かかる活性化したＴ細胞に対し
て、選択的なアポトーシスを誘導させ、Ｔ細胞自体の働
きを抑制することにより、その活性化したＴ細胞に起因
する免疫異常に基づく種々の疾患を予防、または治療す
ることに特徴がある。The present invention provides a method for inducing selective apoptosis of such activated T cells and suppressing the function of the T cells themselves, thereby enabling various activations based on the immune abnormality caused by the activated T cells. It is characterized by preventing or treating the above diseases.

【００１７】したがって、本発明の活性化したＴ細胞を
選択的に抑制する作用物質を有効成分として含有する免
疫抑制剤は、より具体的な態様として、移植に対する拒
絶反応；骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対宿主
病；自己免疫疾患；自己免疫疾患や類縁疾患に起因する
組織の損傷や感染に伴って起こる炎症反応、組織の線維
化および臓器機能障害；さらにアレルギー疾患に対する
治療剤として使用される免疫抑制剤である。Therefore, the immunosuppressive agent of the present invention containing an active substance for selectively suppressing activated T cells as an active ingredient is more specifically described as a rejection reaction to transplantation; bone marrow (hematopoietic stem cell) transplantation. Used as a therapeutic agent for graft-versus-host disease; autoimmune diseases; inflammatory response, tissue fibrosis and organ dysfunction caused by tissue damage and infection caused by autoimmune diseases and related diseases; and allergic diseases Immunosuppressants.

【００１８】上記のなかで、本発明が提供する免疫抑制
剤により有効に予防、または治療し得る自己免疫疾患と
しては、自己免疫性肝炎、慢性関節リウマチ、インスリ
ン依存性糖尿病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、強皮
症、重症筋無力症、多発性筋炎・皮膚筋炎、橋本病、自
己免疫性血球減少症、シェーグレン症候群、血管炎症候
群、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患である。Among the above, autoimmune diseases which can be effectively prevented or treated by the immunosuppressant provided by the present invention include autoimmune hepatitis, rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus, ulcerative colitis, Autoimmune diseases such as multiple sclerosis, scleroderma, myasthenia gravis, polymyositis / dermatomyositis, Hashimoto's disease, autoimmune cytopenia, Sjogren's syndrome, vasculitis syndrome, and systemic lupus erythematosus.

【００１９】また、アレルギー疾患としては、気管支喘
息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、あ
るいは花粉症等のアレルギー疾患である。Further, the allergic diseases include bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, urticaria, and allergic diseases such as hay fever.

【００２０】本発明の免疫抑制剤は、これらの自己免疫
疾患あるいはアレルギー疾患に対しても、活性化Ｔ細胞
を選択的に抑制することにより、副作用が少なく、臨床
的に極めて有効に予防、または治療し得ることが判明し
た。The immunosuppressive agent of the present invention can also be used to suppress these activated T cells selectively against these autoimmune diseases or allergic diseases, so that they have few side effects and are extremely effectively prevented clinically, or It turned out to be treatable.

【００２１】これらの活性化されたＴ細胞を選択的に抑
制する作用物質は、例えば、後記する遅延型過敏反応誘
発マウスの活性化Ｔ細胞に対するアポトーシスを測定す
る方法で選択することができる。本発明者らの検討によ
れば、そのような遅延型過敏反応誘発マウスの活性化Ｔ
細胞に対するアポトーシスを誘導する作用物質として、
特に、次式（Ｉ）：[0021] These agents capable of selectively suppressing activated T cells can be selected, for example, by the method described below for measuring apoptosis of activated T cells in mice induced by delayed-type hypersensitivity reaction. According to the study of the present inventors, the activation T of such delayed hypersensitivity-induced mice
As an agent that induces apoptosis of cells,
In particular, the following formula (I):

【００２２】[0022]

【化３】 Embedded image

【００２３】（式中、Ｒは、水素原子または、１または
２個の水酸基により置換されたフェニル基を表し、Ｒｈ
ａは、α−Ｌ−ラムノース残基を表し、点線は、二重結
合の存在または不存在を表す。）で示されるフラボノイ
ド類またはクロモン類が好ましいものであることを確認
した。(Wherein, R represents a hydrogen atom or a phenyl group substituted by one or two hydroxyl groups;
a represents an α-L-rhamnose residue, and the dotted line represents the presence or absence of a double bond. ) Have been confirmed to be preferable.

【００２４】したがって、本発明のより具体的な免疫抑
制剤としては、活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する作用物
質として、上記式（Ｉ）で示されるフラボノイド類また
はクロモン類を有効成分として含有する免疫抑制剤であ
る。Therefore, a more specific immunosuppressant of the present invention contains a flavonoid or chromone represented by the above formula (I) as an active ingredient as an active substance for selectively suppressing activated T cells. It is an immunosuppressant.

【００２５】これらの中でも、特に、前記式（Ｉ）中、
Ｒが水素原子であるクロモン類、または４−ヒドロキシ
フェニル基、３，４−ジヒドロキシフェニル基、または
３，５−ジヒドロキシフェニル基であるフラボノイド類
が好ましく、より具体的には、次式（Ｉ−ａ）で示され
るスミチルビン（ｓｍｉｔｉｌｂｉｎ）、（Ｉ−ｂ）で
示されるアスチルビン（ａｓｔｉｌｂｉｎ）、（Ｉ−
ｃ）で示されるエンゲルチン（ｅｎｇｅｌｅｔｉｎ）ま
たは（Ｉ−ｄ）で示されるエウクリフィン（ｅｕｃｒｙ
ｐｈｉｎ）であり、最も好ましい化合物は式（Ｉ−ｄ）
のエウクリフィンである。Among these, in particular, in the above formula (I),
Chromones in which R is a hydrogen atom, or flavonoids in which the compound is a 4-hydroxyphenyl group, a 3,4-dihydroxyphenyl group, or a 3,5-dihydroxyphenyl group are preferred. More specifically, the following formula (I- a) Sutililbin shown as a), Astilbin shown as (Ib), (I-b)
c) engeltin shown in c) or eucryfin shown in (Id)
fin) and the most preferred compounds are of the formula (Id)
Euclifin.

【００２６】[0026]

【化４】 Embedded image

【００２７】本発明が提供する免疫抑制剤における有効
成分としての上記フラボノイド類またはクロモン類のう
ち、いくつかの化合物は公知の化合物でもある。しかし
ながらこれらの化合物については、その抗炎症効果が検
討されていたのみであり、このものに免疫異常を改善す
る作用があることは何ら知られていなかったものであ
る。Some of the above-mentioned flavonoids or chromones as active ingredients in the immunosuppressant provided by the present invention are also known compounds. However, these compounds have only been studied for their anti-inflammatory effects, and it has never been known that these compounds have an effect of improving immune abnormalities.

【００２８】そのなかでも、式（Ｉ−ａ）で示されるス
ミチルビンは本発明者により見出された全く新規な化合
物であり、したがって、本発明はまた別の態様として、
上記式（Ｉ−ａ）で示されるスミチルビン自体をも提供
するものである。Among them, simitilbin represented by the formula (Ia) is a completely novel compound discovered by the present inventors. Therefore, the present invention relates to another aspect of the present invention.
The present invention also provides sumitilbin itself represented by the above formula (Ia).

【００２９】[0029]

【発明の実施の形態】以下に本発明が提供する免疫抑制
剤の詳細を、例えば、遅延型過敏反応誘発マウスの活性
化Ｔ細胞に対するアポトーシスを誘導する、具体的フラ
ボノイド類またはクロモン類である式（Ｉ）の化合物を
例にとって説明していく。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The details of the immunosuppressive agent provided by the present invention will be described in detail below, for example, specific formulas of flavonoids or chromones that induce apoptosis on activated T cells of mice induced by a delayed type hypersensitivity reaction. The compound (I) will be described as an example.

【００３０】本発明が提供する免疫抑制剤における有効
成分としての上記式（Ｉ）で示されるフラボノイド類ま
たはクロモン類は、例えば、ユリ科の植物である土茯苓
（Ｓｍｉｌａｘ ｇｌａｂｒａ Ｒｏｘｂ．）に含まれ
る化合物である。なお、土茯苓の根茎（Ｒｈｉｚｏｍａ
ｓｍｉｌａｃｉｓ Ｇｌａｂｒａｅ）は、中国民間に
おいて慢性の皮膚疾患、梅毒性皮膚疾患、水銀中毒によ
る皮膚炎などの治療剤として、薬用に供されているもの
である。The flavonoids or chromones represented by the above formula (I) as an active ingredient in the immunosuppressant provided by the present invention are contained, for example, in the lily plant, Smilax grabra Roxb. Compound. In addition, the rhizome of Dobukuryo (Rhizoma
smilacis Glabrae) is provided medicinally as a treatment for chronic skin diseases, syphilitic skin diseases, dermatitis due to mercury poisoning, and the like in the Chinese private sector.

【００３１】この土茯苓を、適当な抽出溶媒により抽出
し、精製することにより、式（Ｉ）で示されるフラボノ
イド類またはクロモン類、より具体的には式（Ｉ−ａ）
であるスミチルビン、式（Ｉ−ｂ）であるアスチルビ
ン、式（Ｉ−ｃ）であるエンゲルチン、ならびに式（Ｉ
−ｄ）であるエウクリフィンを、それぞれ単品、かつ純
品として単離することができる。The Tokubukuryo is extracted with an appropriate extraction solvent and purified to obtain the flavonoids or chromones represented by the formula (I), more specifically, the formula (Ia)
Sumitilbin, astilbin of formula (Ib), Engeltin of formula (Ic), and
-E) can be isolated as a single product and a pure product, respectively.

【００３２】なお、本発明の免疫抑制剤にあっては、こ
れらフラボノイド類またはクロモン類は、その純品のみ
を有効成分として含有するものに限られるものではな
い。それらフラボノイド類またはクロモン類を含有する
植物抽出物、例えば土茯苓の抽出物を有効成分として含
有するものであってもよいことはいうまでもない。その
ような、土茯苓の抽出物としては、抽出液を濃縮し、さ
らに凍結乾燥することにより得た、粉末状物質、あるい
は、抽出液を適宜濃縮して得た抽出エキス等であっても
よい。In the immunosuppressant of the present invention, these flavonoids or chromones are not limited to those containing only pure products as active ingredients. It goes without saying that a plant extract containing such flavonoids or chromones, for example, an extract of Tokubukuryo may be contained as an active ingredient. Such an extract of Dobukuryo may be a powdery substance obtained by concentrating the extract and further freeze-drying, or an extract obtained by appropriately concentrating the extract, or the like. .

【００３３】この場合のフラボノイド類またはクロモン
類の具体的抽出手段としては、例えば、それを含有する
植物、好ましくはその乾燥粉砕物を、抽出溶媒と共に常
温ないし加熱還流下に浸潤して行うことができる。この
場合に使用し得る抽出溶媒としては、中間極性を有する
有機溶媒、低級アルコールまたは水を挙げることがで
き、より具体的には、酢酸エチルエステル、クロロホル
ム、石油エーテル、メタノール、エタノール、水等であ
る。なお、これらの抽出溶媒は複数の溶媒を混合して使
用してもよい。As a specific means for extracting flavonoids or chromones in this case, for example, a plant containing the flavonoids or chromone is preferably infiltrated with an extraction solvent at room temperature or under reflux with heating. it can. Examples of the extraction solvent that can be used in this case include an organic solvent having an intermediate polarity, a lower alcohol or water, and more specifically, ethyl acetate, chloroform, petroleum ether, methanol, ethanol, and water. is there. In addition, these extraction solvents may be used by mixing a plurality of solvents.

【００３４】また、抽出に際しての植物体またはその乾
燥粉砕物と抽出溶媒の比率は、一概に限定し得ないが、
２〜５回程度の複数回の抽出操作を行い、かつ、植物体
またはその乾燥粉砕物に対する重量比で、全量ほぼ５〜
１０倍量程度の溶媒を使用した抽出操作を行うのが好ま
しい。In addition, the ratio of the plant or the dried and crushed product thereof to the extraction solvent at the time of extraction cannot be unconditionally limited.
A plurality of extraction operations of about 2 to 5 times are performed, and the total amount is approximately 5 to 5 by weight to the plant or its dry and crushed material.
It is preferable to perform an extraction operation using about 10 times the amount of the solvent.

【００３５】かくして抽出を行った後、抽出溶媒を適当
な量まで濃縮した後、さらに各種の溶液を用いた分配抽
出、クロマトグラフィー、イオン交換樹脂処理、膜分離
処理等の通常の精製方法に付すことにより、高純度で、
かつ単品として単離された本発明のフラボノイド類また
はクロモン類を得ることができる。After the extraction, the extraction solvent is concentrated to an appropriate amount, and then subjected to ordinary purification methods such as distribution extraction using various solutions, chromatography, ion exchange resin treatment, and membrane separation treatment. With high purity,
In addition, the isolated flavonoids or chromones of the present invention can be obtained.

【００３６】なお、本発明の免疫抑制剤に含有される有
効成分であるこれらのフラボノイド類またはクロモン類
は、上記により植物体等から単離精製されたもののみな
らず、化学的合成手段により合成されたものであっても
よく、さらには、上記の抽出精製手段の各段階で得られ
た抽出エキスの状態のものであってもよい。The flavonoids or chromones as active ingredients contained in the immunosuppressant of the present invention are not only those isolated and purified from plants and the like as described above, but also those synthesized by chemical synthesis means. May be obtained, or may be in the form of an extracted extract obtained at each stage of the above-mentioned extraction and purification means.

【００３７】本発明の目的である、以上のようにして単
離精製された本発明の式（Ｉ）で示されるフラボノイド
類またはクロモン類が有する、活性化したＴ細胞に対す
る選択的な免疫抑制作用は、遅延型過敏反応誘発マウス
の活性化Ｔ細胞に対するアポトーシスの誘導により確認
された。The selective immunosuppressive activity of the flavonoids or chromones represented by the formula (I) of the present invention, isolated and purified as described above, on activated T cells, which is the object of the present invention. Was confirmed by induction of apoptosis on activated T cells of mice induced by delayed type hypersensitivity reaction.

【００３８】すなわち、具体的には、免疫学的に肝障害
を惹起させた遅延型過敏反応誘発マウスから単離した肝
障害性の肝非実質細胞を、これらのフラボノイド類また
はクロモン類の存在下に培養処理したところ、肝非実質
細胞の非付着細胞画分についての細胞死が多く、特に、
そのＤＮＡのアガロースゲル電気泳動においては、断片
化パターン（ラダーパターン）が認められ、その細胞死
はアポトーシスによるものであることが判明した。Specifically, hepatopathy nonhepatic non-parenchymal cells isolated from a mouse induced immunologically induced delayed hypersensitivity reaction are specifically treated with these flavonoids or chromones. As a result of the culture treatment, the cell death of the non-adherent cell fraction of non-liver parenchymal cells was large,
In the agarose gel electrophoresis of the DNA, a fragmentation pattern (ladder pattern) was observed, indicating that the cell death was due to apoptosis.

【００３９】この遅延型過敏反応を惹起した肝非実質細
胞に対する、式（Ｉ）のフラボノイド類またはクロモン
類によるアポトーシスを誘導した細胞死は、肝非実質細
胞の付着細胞画分にはみられず、非付着細胞画分（主に
ＣＤ４+とＣＤ８+Ｔ細胞から構成されている）に認めら
れた。その一方でこのような細胞死は、肝実質細胞では
観察されず、さらに免疫障害を伴わない正常な肝非実質
細胞、ならびに脾臓細胞においても観察されなかった。
これらの各点から判断すれば、本発明が提供する式
（Ｉ）のフラボノイド類またはクロモン類は、遅延型過
敏反応により活性化されたＴ細胞である免疫細胞（特に
肝非実質細胞の非付着細胞）を選択的に抑制しているも
のであり、有効な免疫抑制作用を有していることが理解
される。The apoptosis induced by the flavonoids or chromones of the formula (I) on the non-liver parenchymal cells which has caused the delayed type hypersensitivity reaction is not found in the adherent cell fraction of the non-liver parenchymal cells. Was observed in the non-adherent cell fraction (mainly composed of CD4 + and CD8 + T cells). On the other hand, such cell death was not observed in hepatic parenchymal cells, nor was it observed in normal hepatic non-parenchymal cells without immune damage, as well as in spleen cells.
Judging from these points, the flavonoids or chromones of the formula (I) provided by the present invention can be used for immune cells (especially non-adherent cells of liver non-parenchymal cells) activated by delayed type hypersensitivity. It is understood that the compound selectively inhibits the cells) and has an effective immunosuppressive action.

【００４０】さらに、本発明の式（Ｉ）で示されるフラ
ボノイド類またはクロモン類が、活性化したＴ細胞を選
択的に抑制することにより、活性化Ｔ細胞起因性の組織
障害に対する改善作用を有することは、遅延型過敏反応
により免疫的に肝障害を惹起させたマウスに、式（Ｉ）
のフラボノイド類またはクロモン類を投与したところ、
肝実質細胞の組織障害によるＡＬＴ（アラニンアミノト
ランスフェラーゼ）遊離が抑制されることからも確認さ
れた。Furthermore, the flavonoids or chromones represented by the formula (I) of the present invention have an effect of improving tissue damage caused by activated T cells by selectively suppressing activated T cells. This means that mice with immunologically induced liver damage by delayed-type hypersensitivity reaction have the formula (I)
When administered flavonoids or chromones of
It was also confirmed that ALT (alanine aminotransferase) release due to tissue damage of liver parenchymal cells was suppressed.

【００４１】以上のように、本発明が提供する免疫抑制
剤、例えば、式（Ｉ）で示されるフラボノイド類または
クロモン類を有効成分として含有する免疫抑制剤は、活
性化したＴ細胞に対し選択的にアポトーシスを誘導さ
せ、その結果、活性化したＴ細胞を選択的に抑制させる
ものである。As described above, the immunosuppressants provided by the present invention, for example, the immunosuppressants containing flavonoids or chromones represented by the formula (I) as an active ingredient, can be selectively used for activated T cells. Apoptosis is induced, and as a result, activated T cells are selectively suppressed.

【００４２】したがって、本発明の免疫抑制剤は、活性
化したＴ細胞に起因する免疫異常、例えば、移植に伴う
拒絶反応、骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対宿主
病、自己免疫疾患、自己免疫疾患や類縁疾患に起因する
組織の損傷や感染に伴って起こる炎症反応、組織の線維
化さらに臓器機能障害、アレルギー疾患等の治療に特に
有効なものであることが理解される。Accordingly, the immunosuppressive agent of the present invention provides immunological abnormalities caused by activated T cells, such as transplant rejection, graft-versus-host disease caused by bone marrow (hematopoietic stem cell) transplantation, autoimmune disease, autoimmune disease, It is understood that they are particularly effective for treating inflammatory reactions, tissue fibrosis, organ dysfunction, allergic diseases and the like caused by tissue damage and infection caused by immune diseases and related diseases.

【００４３】本発明が提供する、例えば、式（Ｉ）で示
されるフラボノイド類またはクロモン類、またはそれら
を含む植物抽出物による、活性化Ｔ細胞を選択的に抑制
する作用物質を有効成分とする免疫抑制剤としての剤形
は、特に限定されない。An active ingredient provided by the present invention, for example, a flavonoid or chromone represented by the formula (I) or a plant extract containing the same, which selectively inhibits activated T cells, is used as an active ingredient. The dosage form as the immunosuppressant is not particularly limited.

【００４４】例えば、式（Ｉ）で示されるフラボノイド
類またはクロモン類またはそれらの抽出物を用いて、製
剤学的に慣用される賦形剤と共にカプセル剤、錠剤、注
射剤等の適当な剤形として経口的または非経口的に投与
することができる。具体的には、例えば式（Ｉ）のフラ
ボノイド類またはクロモン類、あるいは粉末状の抽出物
を使用して、乳糖、澱粉またはその誘導体、セルロース
誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラチンカプセルに
充填することによりカプセル剤を調製することができ
る。For example, using the flavonoids or chromones represented by the formula (I) or an extract thereof, together with excipients commonly used in pharmaceutical preparations, suitable dosage forms such as capsules, tablets, injections, etc. Can be administered orally or parenterally. Specifically, for example, a flavonoid or chromone of the formula (I), or a powdery extract is used and mixed with an excipient such as lactose, starch or a derivative thereof, or a cellulose derivative, and then mixed with a gelatin capsule. By filling, a capsule can be prepared.

【００４５】また錠剤は、上記の賦形剤の他に、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビ
アゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒
として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸等の
滑沢剤を添加し、通常の圧縮打錠機を用いて錠剤に調製
することができる。The tablets are kneaded with a binder such as sodium carboxymethylcellulose, alginic acid, gum arabic, etc. in addition to the above-mentioned excipients, kneaded, and if necessary granulated as granules. A lubricant such as an acid is added, and the mixture can be prepared into tablets using a conventional compression tableting machine.

【００４６】さらに、注射による非経口的投与に際して
は、式（Ｉ）のフラボノイド類またはクロモン類を、溶
解補助剤と共に滅菌蒸留水または滅菌生理食塩水に溶解
し、アンプルに封入して注射用製剤とする。この場合、
必要により安定化剤、緩衝物質等を含有させてもよい。
これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あるいは点滴
静注により投与することができる。For parenteral administration by injection, the flavonoids or chromones of the formula (I) are dissolved together with a solubilizing agent in sterile distilled water or sterile physiological saline, and sealed in an ampoule. And in this case,
If necessary, a stabilizer, a buffer substance and the like may be contained.
These parenteral preparations can be administered intravenously or intravenously.

【００４７】本発明が提供する免疫抑制剤における有効
成分である、例えば式（Ｉ）で示されるフラボノイド類
またはクロモン類または抽出物の投与量は、種々の要
因、例えば治療すべき病態、患者の症状、重症度、年
齢、合併症等の有無により一概には限定できない。ま
た、投与経路、剤形、投与回数によっても異なるが、一
般的に経口投与の場合には、有効成分として、通常０．
１〜１０００ｍｇ／日／ヒト、好ましくは１〜５００ｍ
ｇ／日／ヒトの範囲内、また、非経口投与の場合には、
経口投与の場合における投与量の約１／１００〜１／２
程度の範囲内で適宜選択し、投与することができる。な
お、これらの投与量は、患者の年齢、症状等により適宜
増減し得ることはいうまでもない。The dosage of the active ingredient in the immunosuppressant provided by the present invention, for example, the flavonoids or chromones of the formula (I) or the extract may vary depending on various factors, for example, the condition to be treated, It cannot be unconditionally limited depending on the symptoms, severity, age, presence or absence of complications, and the like. In addition, although it varies depending on the administration route, dosage form, and number of administrations, in general, in the case of oral administration, the active ingredient is usually 0.1 mg.
1 to 1000 mg / day / human, preferably 1 to 500 m
g / day / human and for parenteral administration,
About 1/100 to 1/2 of the dose in the case of oral administration
It can be appropriately selected and administered within the range of the degree. Needless to say, these dosages can be appropriately increased or decreased depending on the age, symptoms, etc. of the patient.

【００４８】[0048]

【実施例】以下に本発明の実施例として、免疫学的に肝
障害を引き起こした遅延型過敏反応誘発マウスを用い、
本発明における治療剤が、活性化Ｔ細胞に対して選択的
にアポトーシスを誘導する点を明らかにすることによ
り、本発明の活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する作用物質
を有効成分として含有する免疫抑制剤を、さらに詳細に
説明する。なお、本発明の範囲は、これらの実施例の記
載により、何ら限定されるものではないことはいうまで
もない。EXAMPLES In the following, as examples of the present invention, mice using a delayed-type hypersensitivity reaction induced immunologically causing liver damage were used.
The therapeutic agent of the present invention clarifies that it selectively induces apoptosis on activated T cells, and thus contains, as an active ingredient, an active substance that selectively inhibits activated T cells of the present invention. The immunosuppressant will be described in more detail. It goes without saying that the scope of the present invention is not limited by the description of these examples.

【００４９】実施例１：土茯苓抽出物の調製 土茯苓の乾燥粉砕物を用い、１０重量倍量の蒸留水を用
い、１００℃にて１時間の抽出を２回行った。この抽出
液をあわせて遠心分離（１７００g）し、得られた上清
を凍結乾燥することにより、粉末組成物として土茯苓抽
出物を１１％の収率で得た。この土茯苓抽出物中には、
液体クロマトグラフ法で定量した結果、アスチルビンが
０．２７３％含有されているものであった。Example 1 Preparation of Tokubukuryo Extract Extract A dry and ground Tokubukuryo extract was extracted twice at 100 ° C. for 1 hour with 10 times by weight of distilled water. The extract was combined, centrifuged (1700 g), and the obtained supernatant was freeze-dried to obtain a Tokubukuryo extract in 11% yield as a powder composition. In this Tokubukuryo extract,
As a result of quantification by liquid chromatography, the powder contained 0.273% of astilbin.

【００５０】実施例２：土茯苓抽出物ならびに各種フラ
ボノイド類およびクロモン類の調製 ａ．抽出および単離操作：乾燥細切した土茯苓６ｋｇを
用い、３０Ｌのメタノールに浸漬し、２時間還流下に加
熱した。次いで、濾過して抽出液を採取し、残渣は再度
１８Ｌのメタノールに浸漬し、同様に処理した。その
後、濾過して抽出液を採取した後、残渣を再び１８Ｌの
メタノールに浸漬し、同様に処理した。上記３回の処理
により得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮して、５
６８ｇのメタノール抽出物を得た。Example 2: Preparation of Tokubukuryo extract and various flavonoids and chromones a. Extraction and isolation operation: 6 kg of dried and minced Tokubukuryo was immersed in 30 L of methanol, and heated under reflux for 2 hours. Then, the extract was collected by filtration, and the residue was again immersed in 18 L of methanol and treated in the same manner. Then, after filtering to collect the extract, the residue was immersed again in 18 L of methanol and treated in the same manner. The extracts obtained by the above three treatments were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 5
68 g of methanol extract were obtained.

【００５１】このメタノール抽出物を１Ｌの水中に懸濁
させ、１Ｌの石油エーテルにて３回抽出し、続いて１Ｌ
の酢酸エチルエステルで３回抽出した。これらの各抽出
液を濃縮して、石油エーテル抽出物として２３ｇ、およ
び酢酸エチルエステル抽出物として８０ｇを得た。This methanol extract was suspended in 1 L of water and extracted three times with 1 L of petroleum ether, followed by 1 L of water.
Extracted three times with ethyl acetate. Each of these extracts was concentrated to obtain 23 g as a petroleum ether extract and 80 g as an ethyl acetate extract.

【００５２】酢酸エチルエステル抽出物の７０ｇを、さ
らにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲ
ル：１０００ｇ）に供し、クロロホルム−メタノール混
合液（１９：１および４：１、各２Ｌ）で溶出させて、
画分Ａとして３２．５ｇ、画分Ｂとして２８ｇをそれぞ
れ得た。70 g of the ethyl acetate extract was further subjected to silica gel column chromatography (silica gel: 1000 g) and eluted with a chloroform-methanol mixture (19: 1 and 4: 1, 2 L each).
32.5 g of fraction A and 28 g of fraction B were obtained.

【００５３】画分Ａの２５ｇを、さらにシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（シリカゲル：５００ｇ）に供
し、クロロホルム−メタノール混合液（９：１および
４：１、各１Ｌ）で溶出させて分離し、画分Ａ−１とし
て２．５ｇ、画分Ａ−２として７．５ｇをそれぞれ得
た。25 g of the fraction A was further subjected to silica gel column chromatography (silica gel: 500 g) and eluted with a chloroform-methanol mixture (9: 1 and 4: 1, 1 L each) to separate the fraction A. 2.5 g as -1 and 7.5 g as fraction A-2 were obtained.

【００５４】画分Ａ−２の２．０ｇをさらに液体クロマ
トグラフィー（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５Ｃ18−Ｏ
ＰＮ）に供し、メタノール−水混合液（２：３および
３：２、各２００ｍＬ）で溶出させて分離し、式（Ｉ−
ｄ）で示されるエウクリフィンを７２ｍｇ得た。2.0 g of the fraction A-2 was further subjected to liquid chromatography (column: Cosmosil 75C 18 -O
PN) and eluted with a methanol-water mixture (2: 3 and 3: 2, 200 mL each) to separate the compound from the compound of the formula (I-
72 mg of euclifin shown in d) was obtained.

【００５５】一方、画分Ｂの２８ｇをさらに液体クロマ
トグラフィー（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ７５Ｃ18−Ｏ
ＰＮ）に供し、メタノール−水混合液（３：７、１：１
および７：３の混液）で溶出させて分離し、式（Ｉ−
ｂ）で示されるアスチルビンを８．２ｇと、画分Ｂ−２
として１１．５ｇを得た。On the other hand, 28 g of the fraction B was further subjected to liquid chromatography (column: Cosmosil 75C 18 -O
PN) and a methanol-water mixture (3: 7, 1: 1)
And a mixture of 7: 3).
8.2 g of astilbin shown in b) and fraction B-2
11.5 g was obtained.

【００５６】上記の画分Ｂ−２について、さらにシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：３５０
ｇ）に供し、クロロホルム−メタノール混合液（９：
１、５００ｍＬ）で溶出させて分離した後、薄層クロマ
トグラフィーで分離し、式（Ｉ−ａ）で示されるスミチ
ルビンを２．６ｇ、式（Ｉ−ｃ）で示されるエンゲルチ
ンを４２ｍｇ得た。The above fraction B-2 was further subjected to silica gel column chromatography (silica gel: 350
g), and a chloroform-methanol mixed solution (9:
(1,500 mL) and separated by thin-layer chromatography to obtain 2.6 g of simitilbin represented by the formula (I-a) and 42 mg of engertin represented by the formula (I-c). .

【００５７】これらの操作により得られたフラボノイド
類またはクロモン類の収量、および各化合物のメタノー
ル抽出物５６８ｇに対する収率をまとめると、以下の表
１のようになる。Table 1 below summarizes the yields of flavonoids or chromones obtained by these operations and the yield of each compound based on 568 g of methanol extract.

【００５８】[0058]

【表１】 [Table 1]

【００５９】ｂ．構造確認（物性データ） 上記の単離操作により得られた各化合物のうち、公知化
合物であるアスチルビン、エンゲルチンおよびエウクリ
フィンについては、質量分析および核磁気共鳴分析を行
い、その構造を確認した。新規化合物である式（Ｉ−
ａ）のスミチルビンの構造決定は、以下の物性評価によ
り行った。B. Structural confirmation (physical property data) Among the compounds obtained by the above-mentioned isolation operation, the known compounds astilbin, engeltin and eucribine were subjected to mass spectrometry and nuclear magnetic resonance analysis to confirm their structures. A novel compound of the formula (I-
The structure determination of sumicylbin in a) was performed by the following physical property evaluation.

【００６０】無色針状結晶（クロロホルム−メタノール
（９：１）混合液で結晶化時） 融点：１７９〜１８１℃ 比旋光度：［α］D −１６１．４°（メタノール、Ｃ
＝０．２） ＵＶ（メタノール）：λmax（Logε）＝２１７ｎｍ
（４．３９４）、２９１ｎｍ（４．２７９） ＩＲ：νmax＝３５００（ＯＨ）、１６２０（Ｃ＝
Ｏ），１３６０，１１６０，１０４０，９７０，８２
０，７８０ｃｍ-1 ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ： m/z＝４５１．１２３４（計算
値：Ｃ21Ｈ23Ｏ11；４５１．１２４０）Colorless needle crystals (crystallized with a mixed solution of chloroform-methanol (9: 1)) Melting point: 179-181 ° C. Specific rotation: [α] D -161.4 ° (methanol, C
= 0.2) UV (methanol): λmax (Logε) = 217 nm
(4.394), 291 nm (4.279) IR: νmax = 3500 (OH), 1620 (C =
O), 1360, 1160, 1040, 970, 82
0.780 cm -1 HR-FAB-MS: m / z = 451.1234 (calculated value: C 21 H 23 O 11 ; 451.1240)

【００６１】1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：0.79(3H,
d，J=6.0Hz, H-6''), 2.37(1H, m，H-5''), 3.04(1H,
t, J=9.5Hz, H-4''), 3.20(1H, dd, J=9.5 & 2.9Hz, H-
3''),3.47(1H, brs, H-2''), 4.15(1H, d, J=2.0Hz, H-
3), 4.74(1H, s, H-1''), 5.43(1H, d, J=2.0Hz, H-2),
5.90(1H, brs, H-6), 5.92(1H, brs, H-8), 6.70(2H,b
rs, H-4',6'), 6.81(1H, brs, H-2'), 11.63(1H, s, OH
-5) 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): 0.79 (3H,
d, J = 6.0Hz, H-6 ''), 2.37 (1H, m, H-5 ''), 3.04 (1H,
t, J = 9.5Hz, H-4 ''), 3.20 (1H, dd, J = 9.5 & 2.9Hz, H-
3 ''), 3.47 (1H, brs, H-2 ''), 4.15 (1H, d, J = 2.0Hz, H-
3), 4.74 (1H, s, H-1 ''), 5.43 (1H, d, J = 2.0Hz, H-2),
5.90 (1H, brs, H-6), 5.92 (1H, brs, H-8), 6.70 (2H, b
rs, H-4 ', 6'), 6.81 (1H, brs, H-2 '), 11.63 (1H, s, OH
-Five)

【００６２】13Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：80.85(C
-2), 74.38(C-3), 193.64(C-4), 164.75(C-5), 101.19
(C-6), 167.77(C-7), 96.20(C-8), 163.30(C-9), 97.30
(C-10),127.38(C-1'), 115.00(C-2'), 145.86(C-3'), 1
16.18(C-4'), 145.62(C-5'), 118.87(C-6'), 99.55(C-
1''), 71.01(C-2''), 71.01(C-3''), 72.11(C-4''), 6
9.84(C-5''), 18.11(C-6'') 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): 80.85 (C
-2), 74.38 (C-3), 193.64 (C-4), 164.75 (C-5), 101.19
(C-6), 167.77 (C-7), 96.20 (C-8), 163.30 (C-9), 97.30
(C-10), 127.38 (C-1 '), 115.00 (C-2'), 145.86 (C-3 '), 1
16.18 (C-4 '), 145.62 (C-5'), 118.87 (C-6 '), 99.55 (C-
1 ''), 71.01 (C-2 ''), 71.01 (C-3 ''), 72.11 (C-4 ''), 6
9.84 (C-5 ''), 18.11 (C-6 '')

【００６３】また、式（Ｉ−ａ）の化合物を酸による加
水分解を行い、その結果得られた生成物のＲｆ値は、ラ
ムノース一水和物と一致した。Further, the compound of formula (Ia) was hydrolyzed with an acid, and the Rf value of the resulting product was equal to that of rhamnose monohydrate.

【００６４】以下の各実施例での試験においては、上記
実施例１で得た土茯苓抽出物、あるいは実施例２で得た
化合物を使用した。In the tests in the following Examples, the Tokubukuryo extract obtained in Example 1 or the compound obtained in Example 2 was used.

【００６５】実施例３：マウス肝障害モデルの検討 試験１：遅延型過敏反応誘発マウスの作製およびその評
価 ａ．方法：６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雄性な
らびに雌性；体重２２±２ｇ）を用い、その腹部皮膚上
に、１％のピクリルクロライドのエタノール溶液０．１
ｍｌを、５日間隔で２回塗布して、抗原感作を行った。
２回目の抗原感作の５日後に、血液を一部採取した後、
０．２％のピクリルクロライド含有のオリーブ油１０μ
ｌをマウス肝臓内に注射し、続いて６，１２，１８およ
び２４時間後に、マウスからの採血、ならびに脾臓細
胞、肝非実質細胞および肝実質細胞の単離を行った。Example 3: Examination of mouse liver injury model Test 1: Preparation of delayed-type hypersensitivity reaction-induced mouse and its evaluation a. Method: Using BALB / c mice (male and female; body weight 22 ± 2 g) of 6 to 8 weeks of age, a 1% ethanol solution of picryl chloride in 0.1% on the abdominal skin.
ml was applied twice at 5 day intervals to perform antigen sensitization.
Five days after the second antigen sensitization, some blood was collected,
Olive oil containing 0.2% picryl chloride 10μ
1 was injected into mouse liver, followed by blood collection from mice and isolation of spleen cells, non-parenchymal and hepatic parenchymal cells after 6, 12, 18 and 24 hours.

【００６６】採取した血液は、アラニンアミノトランス
フェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトラ
ンスフェラーゼ（ＡＳＴ）の活性測定に供した。The collected blood was used for measurement of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) activities.

【００６７】一方、脾臓細胞ならびに肝非実質細胞の両
者を、抗マウスＬＦＡ−１（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅ
ｎ−１）抗体により、また、肝実質細胞を抗マウスＩＣ
ＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉ
ｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）抗体でそれぞれ処理をし
た。洗浄後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体で染
色し、ＰＢＳで洗浄して再浮遊した後、ＦＡＣＳｃａｎ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて、それぞれ
の細胞表面分子の発現を測定した。On the other hand, both spleen cells and nonhepatic non-parenchymal cells were isolated from anti-mouse LFA-1 (lymphocyte TF).
union associated antigeage
n-1) Antibody against hepatocytes by anti-mouse IC
AM-1 (intercellular adhesi
on molecular-1) antibody. After washing, the cells were stained with a FITC-labeled goat anti-rat IgG antibody, washed with PBS and resuspended.
(Becton Dickinson), the expression of each cell surface molecule was measured.

【００６８】さらに、正常マウス、ならびに肝障害を惹
起した０，６，１２，１８および２４時間後のマウスか
ら単離した肝非実質細胞または脾臓細胞と、肝実質細胞
を共培養し、その各培養上清中におけるＡＬＴの遊離に
ついての検討を、以下の方法により行った。Further, non-hepatic parenchymal cells or spleen cells isolated from normal mice and mice 0, 6, 12, 18 and 24 hours after the liver injury was induced, and hepatic parenchymal cells were co-cultured. The study on the release of ALT in the culture supernatant was performed by the following method.

【００６９】肝実質細胞（１×１０5 ｃｅｌｌ／ｍｌ）
を、ＷＥ液体培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％
（ｖ／ｖ）牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンお
よび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する
ウイリアムズ培地Ｅ）を用い、２４穴プレートにて５時
間、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素濃度エアー条件下で、
３７℃にて前培養した。次いで、この前培養処理した肝
実質細胞を、ＷＥ液体培地にて２回洗浄した後、肝非実
質細胞（４×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌ）あるいは脾臓細胞
（５×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌ）と一緒に、それぞれ同条
件下にて、さらに３時間共培養した。培養後、培養上清
中のＡＬＴ活性を測定した。Liver parenchymal cells (1 × 10 5 cells / ml)
With WE liquid medium (2 mM L-glutamine, 10%
(V / v) Williams' medium E) containing fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin, in a 24-well plate for 5 hours, 5% (v / v) carbon dioxide concentration air Under conditions,
Precultured at 37 ° C. Next, the pre-cultured liver parenchymal cells are washed twice with a WE liquid medium, and then washed together with liver non-parenchymal cells (4 × 10 5 cells / ml) or spleen cells (5 × 10 6 cells / ml). , And co-cultured under the same conditions for 3 hours. After the culture, the ALT activity in the culture supernatant was measured.

【００７０】ｂ．結果： その１：肝障害を惹起させたマウスにおける血清中ＡＬ
Ｔ活性の経時的変動、および脾臓細胞と肝非実質細胞に
おけるＬＦＡ−１発現、ならびに肝実質細胞におけるＩ
ＣＡＭ−１発現の変動を経時的に観察し、併せて肝障害
マウスにおける肝細胞の組織形態学的な経時的変化を観
察した。B. Results: Part 1: Serum AL in mice induced liver injury
Time course of T activity and LFA-1 expression in spleen cells and non-hepatic parenchymal cells and IFA in hepatocytes
The change of CAM-1 expression was observed over time, and the histomorphological change of hepatocytes in hepatopathy mice was observed over time.

【００７１】その結果、肝障害惹起の６時間後に脾臓細
胞でのＬＦＡ−１の発現は最大値を示した。一方、肝非
実質細胞でのＬＦＡ−１の発現ならびに肝実質細胞での
ＩＣＡＭ−１の発現は、１２時間後に最大値を示し、血
清中ＡＬＴ活性は、１８時間後に最大値を示した。As a result, the expression of LFA-1 in spleen cells showed the maximum value 6 hours after induction of liver injury. On the other hand, the expression of LFA-1 in non-parenchymal liver cells and the expression of ICAM-1 in parenchymal cells of liver showed the maximum value after 12 hours, and the ALT activity in serum showed the maximum value after 18 hours.

【００７２】さらに肝細胞の形態組織学的変化として
は、肝障害惹起時（０時間）では、肝細胞は正常であっ
たものの、６時間後においては穏やかな炎症性細胞浸潤
が観察されており、さらに１２時間後では著しい炎症性
細胞浸潤が観察された。その後１８時間では大量の肝細
胞がネクローシスを起こしているのが観察された。Further, as for the morphological histological changes of the hepatocytes, hepatocytes were normal at the time of induction of liver injury (0 hour), but mild inflammatory cell infiltration was observed after 6 hours. After another 12 hours, marked inflammatory cell infiltration was observed. At 18 hours thereafter, a large amount of hepatocytes was observed to be in necrosis.

【００７３】その２：肝障害惹起後の肝実質細胞に対す
る、肝非実質細胞および脾臓細胞によるＡＬＴ遊離の経
時的変化、ならびに正常マウスおよび肝障害惹起１２時
間後のマウスから単離された肝非実質細胞あるいは脾臓
細胞を、肝実質細胞と共培養した場合の、培養上清中の
ＡＬＴの遊離の変化を観察した。Part 2: Changes over time in ALT release by non-hepatic cells and spleen cells relative to hepatic parenchymal cells after induction of liver injury, and non-hepatic cells isolated from normal mice and mice 12 hours after induction of liver injury When the parenchymal cells or spleen cells were co-cultured with hepatic parenchymal cells, changes in ALT release in the culture supernatant were observed.

【００７４】その結果、ＡＬＴの遊離は、肝非実質細胞
では、肝障害惹起１２時間後に最大値を示し、脾臓細胞
では６〜１２時間後に最大であった。その遊離活性の強
度は、肝非実質細胞のほうが脾臓細胞よりも強く、約１
２．５倍の遊離活性を示した。As a result, ALT release was maximum in nonhepatic cells 12 hours after induction of hepatic injury, and maximum in spleen cells 6 to 12 hours. The intensity of the free activity is higher in non-hepatic cells than in spleen cells, and is about 1%.
It showed 2.5 times the free activity.

【００７５】以上の結果から判断すると、ピクリルクロ
ライドをマウスの腹部皮膚に５日間隔で２回塗布して抗
原を感作した後、５日後に同一抗原であるピクリルクロ
ライドを肝臓内に注射し、肝障害を惹起させることによ
り、活性化Ｔ細胞を作製することが可能となる。特に、
ピクリルクロライドを肝臓内に注射した１２時間後に
は、肝非実質細胞でのＬＦＡ−１の発現、および肝実質
細胞でのＩＣＡＭ−１の発現が最大になり、強い免疫反
応が生じていることが確認された。Judging from the above results, the mice were sensitized by applying picryl chloride twice on the abdominal skin of mice at 5 day intervals, and 5 days later, the same antigen, picryl chloride, was injected into the liver. However, by causing liver damage, activated T cells can be produced. In particular,
12 hours after the injection of picryl chloride into the liver, the expression of LFA-1 in non-hepatic cells and the expression of ICAM-1 in hepatic parenchymal cells are maximized, and a strong immune response is generated. Was confirmed.

【００７６】この強い免疫反応が生じている段階では、
血清中のＡＬＴ活性が高い値を示したことから、免疫反
応により肝障害が引き起こされていることが確認され
た。また、ピクリルクロライドを肝臓内に注射した１２
時間後のマウスから単離した肝非実質細胞と肝実質細胞
を共培養したときに、上清中のＡＬＴ活性が最大を示し
たことから、この方法が、インビトロの系として、活性
化Ｔ細胞の選択的抑制作用の確認試験として代用できる
ことが確認された。At the stage where this strong immune response is occurring,
Since ALT activity in the serum showed a high value, it was confirmed that liver damage was caused by the immune reaction. Also, picryl chloride was injected into the liver 12
When hepatic non-parenchymal cells and hepatocytes isolated from a mouse at a later time were co-cultured, ALT activity in the supernatant showed the maximum. It was confirmed that the test can be used as a substitute test for confirming the selective inhibitory action of.

【００７７】すなわち、ピクリルクロライドによる経皮
抗原感作後、さらにピクリルクロライドを肝臓内に注射
して１２時間後のマウスが、免疫的に肝障害を惹起させ
た遅延型過敏反応誘発マウスとして、活性化したＴ細胞
の選択的抑制を検討するために、最も好ましい試験系で
あることが判明した。したがって、以下の実施例におけ
る各試験は、抗原であるピクリルクロライドで経皮感作
後に、さらに抗原を肝臓内に注射して１２時間後の肝障
害マウスを対象に実施することとした。That is, after transcutaneous antigen sensitization with picryl chloride, the mouse 12 hours after the injection of picryl chloride into the liver, was used as a mouse with a delayed-type hypersensitivity reaction induced immunologically to cause liver damage. It turned out to be the most preferred test system for studying the selective suppression of activated T cells. Therefore, each test in the following examples was performed on liver-impaired mice 12 hours after transdermal sensitization with picryl chloride as an antigen and further injection of the antigen into the liver.

【００７８】実施例４：アスチルビンおよび土茯苓抽出
物の作用の検討 試験１．マウスの肝障害モデルの作製 実施例３に記載した方法に準じて、６〜８週齢のＢＡＬ
Ｂ／ｃ系マウス（雄性；体重２２±２ｇ）および６〜８
週齢のＩＣＲ系マウス（雄性；体重２２±２ｇ）を使用
し、その腹部皮膚上に、１％のピクリルクロライドのエ
タノール溶液０．１ｍｌを、５日間隔で２回塗布して、
抗原感作を行った。２回目の抗原感作の５日後に、血液
を一部採取した後、０．２％のピクリルクロライド含有
のオリーブ油１０μｌをマウス肝臓内に注射して肝障害
を惹起し、惹起１２時間後に、マウスから採血を行なう
とともに、肝細胞を単離した。Example 4 Investigation of Action of Astilbin and Tokubukuryo Extract Preparation of Mouse Hepatic Injury Model According to the method described in Example 3, 6-8 week old BAL
B / c mouse (male; body weight 22 ± 2 g) and 6-8
Using a week-old ICR mouse (male; body weight 22 ± 2 g), 0.1 ml of a 1% ethanol solution of picryl chloride was applied twice on the abdominal skin at intervals of 5 days.
Antigen sensitization was performed. Five days after the second antigen sensitization, a part of the blood was collected, and 10 μl of 0.2% picryl chloride-containing olive oil was injected into the mouse liver to induce liver injury. Blood was collected from the mice and hepatocytes were isolated.

【００７９】採取した血液について、常法によりＡＬＴ
およびＡＳＴの活性を測定した。一方、正常および肝障
害マウスから２段階灌流法により単離した肝細胞を、さ
らに肝実質細胞と肝非実質細胞に分離し、この分離した
細胞を直ちに共培養試験、あるいはアポトーシス測定に
供した。The collected blood was subjected to ALT by a conventional method.
And AST activities were measured. On the other hand, hepatocytes isolated from normal and liver-impaired mice by the two-step perfusion method were further separated into hepatocytes and nonhepatic cells, and the separated cells were immediately subjected to a co-culture test or apoptosis measurement.

【００８０】さらに、肝非実質細胞の一部を、培養皿上
で３時間培養して、付着細胞画分と非付着細胞画分に分
離した。なお、単離した肝実質細胞および肝非実質細胞
の両者は、トリパンブルーで染色した結果、約９０％の
細胞が生存していることを確認した。Further, a part of the non-parenchymal liver cells was cultured on a culture dish for 3 hours to separate an adherent cell fraction and a non-adherent cell fraction. In addition, both the isolated hepatic parenchymal cells and non-hepatic parenchymal cells were stained with trypan blue, and it was confirmed that about 90% of the cells survived.

【００８１】試験２．アポトーシス確認試験１（細胞死
数の測定） ａ．方法：肝障害を惹起して１２時間後のマウスから単
離した、肝実質細胞および肝非実質細胞、ならびに肝非
実質細胞を分画して得た付着細胞画分および非付着細胞
画分のそれぞれを、アスチルビンならびに土茯苓抽出物
を試験対象薬物とし、その５×１０-5ｇ／ｍｌ濃度溶液
と共に、ＲＰＭＩ １６４０培養液中で３７℃、１時間
の条件下で培養を行い、培養後の各細胞死数の変化を、
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Molecular Probes, In
c., USA）染色により観察した。なお、対照として、薬
物処理を行わなかった場合の各細胞をおいた。Test 2. Apoptosis Confirmation Test 1 (Measurement of Cell Death Number) a. Methods: Hepatic parenchymal cells and non-hepatic parenchymal cells isolated from mice 12 hours after inducing liver injury, and adherent and non-adherent cell fractions obtained by fractionating non-hepatic parenchymal cells Astilbin and Tokubukuryo extract were used as test drugs, respectively, and cultured in RPMI 1640 culture solution at 37 ° C. for 1 hour together with a 5 × 10 −5 g / ml solution thereof. Changes in the number of cell deaths
Hoechst 33342 (Molecular Probes, In
c., USA). In addition, each cell in the case where the drug treatment was not performed was set as a control.

【００８２】細胞死の観察は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３
４２染色により、細胞の断片化あるいは凝縮した核を有
する死んだ細胞数で測定した。すなわち、ＲＰＭＩ １
６４０培養液中の細胞を、室温で１分間染色した後、同
培養液で３回洗浄を行い、２％ホルムアルデヒド含有の
リン酸緩衝液（ＰＢＳ溶液）で固定した。２００個の細
胞を、異なる５個所で蛍光顕微鏡下観察し、全母集団中
の細胞死を起こした細胞数を測定した。Observation of cell death was performed using Hoechst 333
The number of dead cells having cell fragmentation or condensed nuclei was measured by 42 staining. That is, RPMI 1
The cells in the 640 culture solution were stained at room temperature for 1 minute, washed three times with the same culture solution, and fixed with a phosphate buffer (PBS solution) containing 2% formaldehyde. 200 cells were observed under a fluorescence microscope at five different locations, and the number of cells that had undergone cell death in the entire population was determined.

【００８３】ｂ．結果：図１に、肝障害を惹起したマウ
スから単離した、肝非実質細胞および肝実質細胞の細胞
死に対するアスチルビンおよび土茯苓抽出物の効果を示
した。B. Results: FIG. 1 shows the effect of astilbin and Tokubukuryo extract on cell death of non-hepatic parenchymal cells and hepatic parenchymal cells isolated from mice in which liver injury was induced.

【００８４】図中の結果からも明らかなように、対照群
である薬物未処理の肝実質細胞および肝非実質細胞全体
では、細胞死を起こした細胞数の比率は、それぞれ約１
０％と５％程度であった。これに対してアスチルビンお
よび土茯苓抽出物を、その５×１０-5ｇ／ｍｌの濃度で
共存させると、肝非実質細胞全体中での細胞死を起こし
た細胞数の割合が、明らかに増加しているが、肝実質細
胞ではこのような変化は観察されなかった。As is evident from the results in the figure, the ratio of the number of cells that had undergone cell death was about 1 in each of the untreated hepatic parenchymal cells and non-hepatic parenchymal cells as the control groups.
It was about 0% and 5%. On the other hand, when astilbin and Tokubukuryo extract coexisted at a concentration of 5 × 10 −5 g / ml, the proportion of the number of cells that had undergone cell death in all non-parenchymal liver cells clearly increased. However, such a change was not observed in hepatocytes.

【００８５】一方、肝非実質細胞の非付着細胞画分で
は、両薬物ともに、細胞死を起こした細胞数の割合を明
らかに増加させたが、付着細胞画分では細胞死数に変化
が見られなかった。On the other hand, in the non-adherent cell fraction of hepatic non-parenchymal cells, both drugs clearly increased the ratio of the number of cells that had undergone cell death, while the adherent cell fraction showed a change in the cell death number. I couldn't.

【００８６】試験３．アポトーシス確認試験２：断片化
ＤＮＡパターンの確認（アガロースゲル電気泳動） ａ．方法：正常なマウス、および肝障害惹起１２時間後
のマウスから単離した肝非実質細胞を、アスチルビンま
たは土茯苓抽出物で処理した後、アガロースゲル電気泳
動を行い、断片化ＤＮＡの測定を行った。Test 3. Apoptosis confirmation test 2: Confirmation of fragmented DNA pattern (agarose gel electrophoresis) a. Method: Non-parenchymal liver cells isolated from normal mice and mice 12 hours after induction of liver injury were treated with astilbin or Tokubukuryo extract, followed by agarose gel electrophoresis to measure fragmented DNA. Was.

【００８７】すなわち、正常なマウスおよび肝障害惹起
１２時間後のマウスから単離された肝非実質細胞を、そ
のまま、または５×１０-5ｇ／ｍｌ濃度のアスチルビン
または土茯苓抽出物とともに、ＲＰＭＩ １６４０培養
液中で３７℃、１時間の条件下で培養した。Specifically, non-liver parenchymal cells isolated from a normal mouse and a mouse 12 hours after the induction of liver injury were used as they were or together with an extract of 5 × 10 −5 g / ml of astilbin or tokubukuryo extract. The cells were cultured in a 1640 culture solution at 37 ° C. for 1 hour.

【００８８】次いで、それぞれの細胞の１０6 個を洗浄
し、遠心して得られた沈殿物を、０．２％ Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１００含有Ｌｙｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０
ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．５）０．
６ｍｌに再懸濁して、氷冷下に１０分間放置した後、遠
心した（２００００ｇ）。得られた上清を、等量のＴＥ
飽和フェノールと混合し、２〜３分間穏やかにかき混ぜ
た後、遠心し、上清をクロロホルム−イソアミルアルコ
ール（２４：１）混液と混合し、さらに２００００ｇに
て遠心した。得られた上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌと７
０％エタノール中で、−２０℃の条件下に一夜放置し、
ＤＮＡを沈殿させた。Next, 10 6 of each cell was washed, and the precipitate obtained by centrifugation was washed with 0.2% Trito.
Lysing buffer containing n X-100 (10
mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)
The suspension was resuspended in 6 ml, left under ice cooling for 10 minutes, and then centrifuged (20,000 g). The obtained supernatant is mixed with an equal amount of TE.
After mixing with saturated phenol and gently stirring for 2 to 3 minutes, the mixture was centrifuged. The supernatant was mixed with a mixed solution of chloroform-isoamyl alcohol (24: 1) and further centrifuged at 20,000 g. The obtained supernatant was mixed with 0.3 M NaCl and 7 M
Leave in 0% ethanol overnight at -20 ° C,
The DNA was precipitated.

【００８９】沈殿させたＤＮＡに、１ｍｇ／ｍｌのＲＮ
ａｓｅ Ａ １μｌを加え、３７℃にて３０分間インキ
ュベートした。インキュベート終了後、この溶液に１／
１０容量のＬｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０２％
のブロモフェノールブルー、０．０２％のｘｙｌｅｎｅ
ｃｙａｎｏｌ ＦＦ、５０％のグリセロール、０．１
％のＳＤＳ含有）を加えた。２％アガロースゲルを用
い、５０ｖで７５分間電気泳動を行い、臭化エチジウム
を用いて、ＤＮＡ断片を検出した。The precipitated DNA was added with 1 mg / ml RN.
1 μl of case A was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. After the incubation, add 1 /
10 volumes of Loading buffer (0.02%
Bromophenol blue, 0.02% xylene
cyanol FF, 50% glycerol, 0.1
% SDS). Electrophoresis was performed at 50 V for 75 minutes using a 2% agarose gel, and a DNA fragment was detected using ethidium bromide.

【００９０】ｂ．結果：正常マウス、および肝障害を惹
起したマウスの肝非実質細胞から単離したＤＮＡのアガ
ロースゲル電気泳動パターン、およびアスチルビンおよ
び土茯苓抽出物で処理した肝非実質細胞のＤＮＡのアガ
ロースゲル電気泳動パターンを比較すると、肝障害を惹
起したマウスから単離した肝非実質細胞では、アスチル
ビンおよび土茯苓抽出物で処理したときに、ＤＮＡのラ
ダーパターンが観察された。B. Results: Agarose gel electrophoresis patterns of DNA isolated from non-hepatic parenchymal cells of normal and liver-induced mice, and agarose gel electrophoresis of non-parenchymal DNA treated with astilbin and Tokubukuryo extract When the patterns were compared, a ladder pattern of DNA was observed in the non-hepatic parenchymal cells isolated from the mouse in which liver damage was induced, when treated with the astilbin and the Tokubukuryo extract.

【００９１】一方、正常なマウス由来の肝非実質細胞お
よび脾臓細胞では、両薬物で処理を行っても、そのよう
なＤＮＡの断片化が見られなかった。すなわち、正常マ
ウスの肝非実質細胞および脾臓細胞にはアポトーシスの
誘導は観察されなかった。On the other hand, in non-liver parenchymal cells and spleen cells derived from normal mice, such DNA fragmentation was not observed even when the treatment was carried out with both drugs. That is, induction of apoptosis was not observed in non-liver parenchymal cells and spleen cells of normal mice.

【００９２】これらのＤＮＡのアガロースゲル電気泳動
パターンからみれば、抗原（ピクリルクロライド）投与
１２時間後の肝障害を惹起したマウスから単離された、
肝非実質細胞に対するアスチルビンによる細胞死は、ア
ポトーシスであることが判明する。なおこの結果は、上
記試験２における、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２染色試
験で、正常な肝非実質細胞での細胞死が認められなかっ
た結果と一致するものであった。According to the agarose gel electrophoresis pattern of these DNAs, it was found that the DNAs were isolated from mice that had induced liver damage 12 hours after administration of the antigen (picryl chloride).
Cell death by astilbin on non-parenchymal liver cells is found to be apoptosis. In addition, this result was consistent with the result in which no cell death was observed in normal liver non-parenchymal cells in the Hoechst 33342 staining test in Test 2 described above.

【００９３】ところで、本発明者のこれまでの検討によ
れば、ピクリルクロライドによる経皮感作後に、肝臓に
同じ抗原を投与した場合には、肝非実質細胞内に含まれ
る細胞集団の組成が大きく変化することを、フローサイ
トメトリー（流量血球計算分析）で確認している。そし
て、抗原投与前に脾臓を摘出すると、肝障害の有無とそ
の程度を知るための指標である血清中ＡＬＴ活性レベル
が低くなることから、脾臓からリンパ球が肝臓へ浸潤し
て局在化し、肝非実質細胞の組成が変化することが肝障
害に至る主要因であることを確認してきている。By the way, according to the studies by the present inventors, when the same antigen is administered to the liver after transdermal sensitization with picryl chloride, the composition of the cell population contained in the non-parenchymal cells of the liver is increased. Has been confirmed by flow cytometry (flow cytometry analysis). Then, if the spleen is removed before the antigen administration, the serum ALT activity level, which is an indicator for knowing the presence and degree of liver damage, decreases, so that lymphocytes infiltrate into the liver from the spleen and localize, It has been confirmed that a change in the composition of hepatic non-parenchymal cells is a major factor leading to liver damage.

【００９４】また、実施例３の試験結果からも明らかな
ように、抗原投与１２時間後には、組織学上炎症性細胞
湿潤の程度と肝非実質細胞の肝細胞障害作用がインビト
ロで最大に達しており、この段階での肝非実質細胞はＬ
ＦＡ−１陽性細胞が約７２．６〜７８％であり、またＣ
Ｄ４+ Ｔ細胞４７．９％およびＣＤ８+ Ｔ細胞２３．２
％で構成されているものであることが判明している。こ
のような肝非実質細胞を、抗ＣＤ４モノクローナル抗体
−補体で処理すると、肝実質細胞からのＡＬＴの遊離が
完全に抑制され、抗ＣＤ８抗体では、ＡＬＴの遊離の抑
制傾向が観察されている。As is clear from the test results of Example 3, the degree of inflammatory cell infiltration and the effect of hepatocellular non-parenchymal hepatocellular cells reached a maximum in vitro 12 hours after the antigen administration. Hepatic non-parenchymal cells at this stage are L
About 72.6-78% of FA-1 positive cells,
D4 + T cells 47.9% and CD8 + T cells 23.2
%. When such non-liver parenchymal cells are treated with an anti-CD4 monoclonal antibody-complement, the release of ALT from liver parenchymal cells is completely suppressed, and the anti-CD8 antibody has a tendency to suppress the release of ALT. .

【００９５】かかる事実を踏まえ、本実施例４のこれま
での試験の結果を考察すると、アスチルビンおよび土茯
苓抽出物による細胞死の誘導は、肝非実質細胞の付着細
胞画分ではなく、非付着細胞画分で認められている。し
たがって、アスチルビンおよび土茯苓抽出物は、肝非実
質細胞の非付着細胞画分を主に構成するＴリンパ球集団
に対し作用していることは明白であるといえる。Considering the above results, considering the results of the previous tests of Example 4, the induction of cell death by astilbin and the Tokubukuryo extract was not due to the non-adherent cell fraction of non-parenchymal liver cells but to the non-adherent cells. Found in the cell fraction. Therefore, it can be clearly seen that astilbin and the Tokubukuryo extract act on the T lymphocyte population which mainly constitutes the non-adherent cell fraction of non-liver parenchymal cells.

【００９６】また、両薬物ともに、肝実質細胞と、正常
マウスの肝非実質細胞および脾臓細胞には細胞死を誘導
しなかったことからみれば、活性化された主にＴ細胞で
ある免疫細胞が、アスチルビンおよび土茯苓抽出物によ
り、選択的に阻害されることが明らかとなった。Further, both drugs did not induce cell death in liver parenchymal cells and non-hepatic non-parenchymal cells and spleen cells of normal mice, indicating that activated immune cells, mainly T cells, were activated. Was selectively inhibited by astilbin and the Tokubukuryo extract.

【００９７】試験４．ＡＬＴの遊離抑制試験（その１） ａ．方法：実施例３の方法により、肝障害惹起１２時間
後のマウスから、肝実質細胞および肝非実質細胞を単離
した。単離した肝実質細胞を、ＷＥ液体培地中に分散
し、２×１０4 ｃｅｌｌ／０．２ｍｌを９６穴プレート
にまき、３７℃にて、５％二酸化炭素濃度エアーの条件
下で５時間培養した。Test 4. ALT release inhibition test (part 1) a. Method: Hepatic parenchymal cells and non-hepatic parenchymal cells were isolated from mice 12 hours after the induction of liver injury by the method of Example 3. The isolated liver parenchymal cells are dispersed in a WE liquid medium, 2 × 10 4 cells / 0.2 ml are spread on a 96-well plate, and cultured at 37 ° C. for 5 hours under 5% carbon dioxide concentration air. did.

【００９８】次いで、培養細胞をＷＥ液体培地で２回洗
浄した後、各種濃度のアスチルビンまたは土茯苓抽出物
と、３７℃、１時間の条件下で処理した８×１０4 個の
肝非実質細胞とともに、同条件下にてさらに３時間共培
養した。培養終了後、培養上清を常法により集め、上清
中のＡＬＴならびにＡＳＴ活性を測定した。Next, the cultured cells were washed twice with a WE liquid medium, and thereafter, 8 × 10 4 non-parenchymal hepatic cells treated with various concentrations of astilbin or Tokubukuryo extract at 37 ° C. for 1 hour. At the same time, the cells were co-cultured for 3 hours under the same conditions. After completion of the culture, the culture supernatant was collected by a conventional method, and ALT and AST activities in the supernatant were measured.

【００９９】ｂ．結果：図２に、その結果を示した。図
中の結果から明らかなように、肝実質細胞を、肝非実質
細胞と３時間共培養することにより、ＡＬＴおよびＡＳ
Ｔの遊離レベルが著しく亢進されている。これに対し
て、共培養させる肝非実質細胞を、アスチルビンあるい
は土茯苓抽出物と前処理することにより、肝実質細胞か
らのＡＬＴの遊離は濃度依存的に抑制され、ＡＳＴの遊
離はアスチルビンにより濃度依存的に抑制されている。
特に、アスチルビンと土茯苓抽出物の両方においては、
５×１０-5ｇ／ｍｌの濃度で、ＡＬＴの遊離を完全に抑
制していることが理解される。B. Result: FIG. 2 shows the result. As is clear from the results in the figure, co-culture of hepatic parenchymal cells with non-hepatic non-parenchymal cells for 3 hours provided ALT and AS.
The release level of T is significantly enhanced. On the other hand, by pretreating the non-parenchymal liver cells to be co-cultured with astilbin or Tokubukuryo extract, the release of ALT from the liver parenchymal cells is suppressed in a concentration-dependent manner, and the release of AST is reduced by astilbin. Dependently suppressed.
In particular, in both astilbin and Tokubukuryo extract,
It is understood that the concentration of 5 × 10 −5 g / ml completely suppresses ALT release.

【０１００】試験５．ＡＬＴ遊離抑制試験（その２） ａ．方法：上記試験４と同様に、肝障害惹起１２時間後
のマウスから肝非実質細胞および肝実質細胞を単離し
た。単離した肝実質細胞を、ＷＥ液体培地中に分散し、
２×１０4ｃｅｌｌ／０．２ｍｌを９６穴プレートにま
き、３７℃にて、５％二酸化炭素濃度エアーの条件下で
５時間培養した。Test 5 ALT release inhibition test (part 2) a. Method: Non-parenchymal liver cells and parenchymal liver cells were isolated from mice 12 hours after the induction of liver injury as in Test 4 above. Dispersing the isolated hepatocytes in WE liquid medium;
2 × 10 4 cells / 0.2 ml were spread on a 96-well plate, and cultured at 37 ° C. for 5 hours under the condition of 5% carbon dioxide concentration air.

【０１０１】次いで、培養細胞をＷＥ液体培地で２回洗
浄した後、５×１０-5ｇ／ｍｌ濃度のアスチルビンまた
は土茯苓抽出物で３７℃にて５，１５，３０，６０およ
び１２０分間前処理した肝非実質細胞（それぞれ８×１
０4 個）とともに、同条件下にてさらに３時間共培養し
た。培養終了後、培養上清を常法により集め、上清中の
ＡＬＴ活性を測定した。Next, the cultured cells were washed twice with a WE liquid medium and then extracted with an astilbine or Tokubukuryo extract at a concentration of 5 × 10 −5 g / ml at 37 ° C. for 5, 15, 30, 60 and 120 minutes. Treated liver non-parenchymal cells (8 × 1 each)
With 0 4), and cultured further 3 hours co at the same conditions. After completion of the culture, the culture supernatant was collected by a conventional method, and the ALT activity in the supernatant was measured.

【０１０２】ｂ．結果：図３にその結果を示した。図中
の結果からも明らかなように、肝非実質細胞をアスチル
ビンあるいは土茯苓抽出物と前処理することにより、時
間依存的に肝実質細胞からのＡＬＴの遊離が抑制されて
おり、３０分間以上の処理によりその遊離が完全に抑制
された。なお、肝実質細胞については、高濃度のアスチ
ルビンあるいは土茯苓抽出物で２時間以上前処理して
も、ＡＬＴの遊離に変化は認められなかった。B. Results: The results are shown in FIG. As is clear from the results in the figure, pretreatment of non-parenchymal liver cells with astilbin or Tokubukuryo extract suppresses ALT release from liver parenchymal cells in a time-dependent manner. The release was completely suppressed. Regarding hepatocytes, no change was observed in the release of ALT even after pretreatment for 2 hours or more with a high concentration of astilbin or Tokubukuryo extract.

【０１０３】試験６．経口投与による遊離ＡＬＴ活性試
験 ａ．方法：６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雄性；
体重２２±２ｇ）および６〜８週齢のＩＣＲ系マウス
（雄性；体重２２±２ｇ）を使用した。マウスをピクリ
ルクロライドにより試験１と同様により経皮感作した
後、肝臓内に抗原投与して０，５および１０時間後に、
アスチルビンの１００ｍｇ／ｋｇ、および土茯苓抽出物
の２００ｍｇ／ｋｇのそれぞれを、経口投与した。最終
投与の２時間後に、マウスから採血を行い、血清中のＡ
ＬＴ活性を測定した。また、肝非実質細胞と肝実質細胞
を単離して、共培養し、得られた培養上清中のＡＬＴ活
性測定値と比較した。Test 6 Free ALT activity test by oral administration a. Method: 6-8 week old BALB / c mouse (male;
ICR mice (male; body weight 22 ± 2 g) weighing 22 ± 2 g) and 6-8 weeks of age were used. Mice were transcutaneously sensitized with picryl chloride in the same manner as in Test 1, and 0.5, and 10 hours after antigen administration into the liver,
Each of 100 mg / kg of astilbin and 200 mg / kg of the Tokubukuryo extract was orally administered. Two hours after the last administration, blood was collected from the mice, and A in serum was collected.
LT activity was measured. In addition, non-liver parenchymal cells and liver parenchymal cells were isolated, co-cultured, and compared with the measured ALT activity in the obtained culture supernatant.

【０１０４】ｂ．結果：図４にその結果を示した。図中
の結果より明らかなように、アスチルビンまたは土茯苓
抽出物を経口投与したマウスでは、対照群と比較して、
明らかに血清中ＡＬＴ活性が減少するとともに、単離し
た肝非実質細胞の肝実質細胞に対する細胞障害性も有意
に低下した。この結果は、肝障害マウスから単離した肝
非実質細胞をアスチルビンまたは土茯苓抽出物で処理し
た後に肝実質細胞と共培養するときに、対照群と比較し
て、培養上清中ＡＬＴ活性が減少し、肝実質細胞に対す
る細胞障害性が有意に低下したことと良く一致してい
る。B. Results: The results are shown in FIG. As is clear from the results in the figure, in the mice orally administered astilbin or Dobukuryo extract, compared to the control group,
The serum ALT activity was clearly reduced, and the cytotoxicity of the isolated non-hepatic parenchymal cells against hepatocytes was also significantly reduced. This result indicates that when hepatic non-parenchymal cells isolated from hepatopathy mice were treated with astilbin or Tokubukuryo extract and then co-cultured with hepatic parenchymal cells, ALT activity in the culture supernatant was lower than that in the control group. This is in good agreement with the significant decrease in cytotoxicity to hepatocytes.

【０１０５】試験７．薬物の投与時期の影響検討 ａ．方法：試験１と同様にしてマウスに肝障害を惹起さ
せた。その中でアスチルビンおよび土茯苓抽出物のｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅに対する効果を検討するた
めに、抗原であるピクリルクロライドを最初に経皮感作
してから１０日間、毎日１回ずつ、また、ｅｆｆｅｃｔ
ｏｒ ｐｈａｓｅに対する効果を検討するために、肝臓
内に抗原投与後０，５，１０時間後の計３回に、アスチ
ルビン（５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）なら
びに土茯苓抽出物（１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ
／ｋｇ）を経口投与した。なお、対照群として薬物の投
与をしないマウス、ならびに活性対照群として、免疫抑
制剤であるシクロフォスファミド（Ｃｙ）の１０ｍｇ／
ｋｇを腹腔内投与したマウスをおいた。Test 7. Examination of effects of drug administration timing a. Method: In the same manner as in Test 1, mice were caused liver injury. Among them, astilbin and tokubukuryo extract in
In order to examine the effect on the induction phase, once daily transdermal sensitization with picryl chloride, which is an antigen, was performed once a day for 10 days.
In order to examine the effect on or phase, astilbin (50 mg / kg and 100 mg / kg) and Tokubukuryo extract (100 mg / kg and 200 mg) were injected three times at 0.5, 5 and 10 hours after antigen administration into the liver.
/ Kg) was orally administered. As a control group, mice to which no drug was administered, and as an active control group, 10 mg / day of the immunosuppressant cyclophosphamide (Cy).
Mice were given kg intraperitoneally.

【０１０６】ピクリルクロライドの肝臓内投与の１８時
間後に、各マウスから採血を行い、常法に従い、血清中
のＡＬＴ活性を測定した。なお、併せて肝臓の病理組織
学的検討を行った。Eighteen hours after the administration of picryl chloride into the liver, blood was collected from each mouse, and the ALT activity in the serum was measured according to a conventional method. In addition, histopathological examination of the liver was also performed.

【０１０７】ｂ．結果：図５に、アスチルビン、土茯苓
抽出物およびシクロフォスファミドが、肝障害マウスに
おける血清中ＡＬＴの上昇に与える効果について示し
た。図中の結果から明らかなように、対照群では、正常
値よりも、血清中ＡＬＴ活性が著しく上昇している。対
照群と比較すると、アスチルビンまたは土茯苓抽出物の
高用量を、ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｈａｓｅに投与した場
合には、明らかにＡＬＴ活性が減少し、低用量では、減
少の傾向が観察され、肝障害改善作用が認められた。こ
れに対して、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅに投与し
た場合には、肝障害改善作用はほとんど見られなかっ
た。B. Results: FIG. 5 shows the effects of astilbine, Tokubukuryo extract and cyclophosphamide on the elevation of serum ALT in hepatically impaired mice. As is clear from the results in the figure, serum ALT activity is significantly higher in the control group than in the normal value. Compared with the control group, when a high dose of astilbin or Tokubukuryo extract was administered to the effector phase, the ALT activity was clearly decreased, and at a low dose, the tendency of decrease was observed. Admitted. In contrast, when administered to the induction phase, almost no hepatic disorder improving effect was observed.

【０１０８】なお、免疫抑制剤であるシクロフォスファ
ミドは両ｐｈａｓｅでの投与においても、明らかにＡＬ
Ｔ活性を減少させていた。病理組織学的検討において
は、対照群における主変化は、炎症性細胞浸潤と肝実質
細胞の凝固壊死であった。アスチルビンまたは土茯苓抽
出物投与群、ならびにシクロフォスファミド投与群にお
いて、ＡＬＴ活性が減少し、肝障害改善作用が認められ
たほとんどのマウスでは、病理組織学的変化の改善作用
が認められた。The immunosuppressant cyclophosphamide clearly showed AL even when administered in both phases.
T activity was reduced. In the histopathological examination, the main changes in the control group were inflammatory cell infiltration and coagulation necrosis of hepatic parenchymal cells. In the group administered with astilbin or Tokubukuryo extract and the group administered with cyclophosphamide, ALT activity was decreased, and almost all mice showing ameliorating effects on hepatic injury showed ameliorating effects on histopathological changes.

【０１０９】以上の各試験の結果よりみれば、アスチル
ビンおよび土茯苓抽出物は、遅延型アレルギー反応（Ｄ
ＴＨ反応）のｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｈａｓｅではな
く、ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｈａｓｅで投薬することによ
り、血中ＡＬＴ活性とＡＳＴ活性の上昇を明らかに抑制
していることが判明する。肝非実質細胞をアスチルビン
あるいは土茯苓抽出物で前処理したときには、濃度依存
的にＡＬＴおよびＡＳＴの遊離を抑制しており、アスチ
ルビンの方が土茯苓抽出物よりも強い抑制作用を示して
いる。[0109] According to the results of the above tests, astilbin and Tokubukuryo extract showed delayed allergic reaction (D
It is clear that the increase in blood ALT activity and AST activity is clearly suppressed by administering an effector phase instead of an induction phase (TH reaction). When pretreated liver non-parenchymal cells with astilbin or Tokubukuryo extract, the release of ALT and AST is suppressed in a concentration-dependent manner, and astilbin shows a stronger inhibitory effect than Dobukuryo extract.

【０１１０】また、アスチルビンと土茯苓抽出物の両方
においては、その５×１０-5ｇ／ｍｌの濃度で、肝非実
質細胞を３０分間以上前処理すると、ＡＬＴの遊離が完
全に抑制され、肝非実質細胞の機能である肝細胞障害作
用が完全に抑制されることが確認された。しかしなが
ら、共培養前に肝実質細胞をアスチルビンまたは土茯苓
抽出物で処理しても、肝非実質細胞による潜在的な肝細
胞障害作用を抑制することはできなかった。以上の結果
からは、活性化した主にＴ細胞からなる免疫細胞の機能
を選択的に除去することにより、肝障害に対する改善作
用を示すことが確認された。Further, in both the astilbin and the Tokubukuryo extract, pretreatment of the non-parenchymal cells for 30 minutes or more at a concentration of 5 × 10 −5 g / ml completely suppressed the release of ALT. It was confirmed that the hepatocyte-damaging effect, which is a function of non-hepatic cells, was completely suppressed. However, treatment of hepatic parenchymal cells with astilbin or Tokubukuryo extract prior to co-culture failed to suppress the potential hepatocellular damaging effects of non-hepatic parenchymal cells. From the above results, it was confirmed that by selectively removing the function of activated immune cells mainly composed of T cells, an effect of improving liver damage was exhibited.

【０１１１】試験８．四塩化炭素で誘導した肝障害モデ
ルマウスに対する評価 ａ．方法：ＩＣＲ系雄性マウスを１群８匹使用し、アス
チルビン（５０ｍｇ／ｋｇあるいは１００ｍｇ／ｋｇ）
および土茯苓抽出物（１００ｍｇ／ｋｇあるいは２００
ｍｇ／ｋｇ）を６日間、経口投与した。最終投与の１時
間後、各マウスに、０．２％四塩化炭素含有のオリーブ
油を、０．２ｍｌ／２０ｇの体重当たりの用量で腹腔内
投与した。なお対照として、正常マウス群である薬剤の
無投与／四塩化炭素無投与群を、対照群として四塩化炭
素のみの投与群をおいた。また、活性対照群としてＢＤ
Ｄ（ビフェニル ジメチル ジカルボキシレート）の１
５０ｍｇ／ｋｇ投与群をおいた。四塩化炭素投与から２
０時間後に各マウスから採血し、常法に従い、血清中の
ＡＬＴ活性およびＡＳＴ活性を測定した。Test 8 Evaluation on mouse model of liver injury induced by carbon tetrachloride a. Method: Ascirubin (50 mg / kg or 100 mg / kg) using 8 ICR male mice per group
And Tobukuryo extract (100 mg / kg or 200
mg / kg) was orally administered for 6 days. One hour after the last administration, each mouse was intraperitoneally administered with 0.2% carbon tetrachloride-containing olive oil at a dose of 0.2 ml / 20 g per body weight. As a control, a group of normal mice and no drug / carbon tetrachloride were not administered, and as a control group, only carbon tetrachloride was administered. In addition, BD as an activity control group
1 of D (biphenyl dimethyl dicarboxylate)
A 50 mg / kg administration group was set. 2 after administration of carbon tetrachloride
After 0 hour, blood was collected from each mouse, and ALT activity and AST activity in the serum were measured according to a conventional method.

【０１１２】ｂ．結果：それらの結果を、まとめて表２
に示した。B. Results: The results are summarized in Table 2.
It was shown to.

【０１１３】[0113]

【表２】 *Ｐ＜０．０１ 対照群と比較[Table 2] * P <0.01 compared to control group

【０１１４】表中の結果から明らかなように、四塩化炭
素投与群では血中ＡＬＴ活性およびＡＳＴ活性が著しく
上昇したが、これに対するアスチルビンおよび土茯苓抽
出物の影響は認められなかった。ＢＤＤはＡＬＴの上昇
を著しく抑制した。As is clear from the results in the table, in the group administered with carbon tetrachloride, blood ALT activity and AST activity were significantly increased, but no effect of astilbine and Tokubukuryo extract on these was observed. BDD significantly suppressed ALT elevation.

【０１１５】試験９．四塩化炭素によるマウス肝細胞障
害に対する評価 ａ．方法：試験８に使用したマウスと同様の正常なマウ
スから、肝実質細胞を単離し、アスチルビンあるいは土
茯苓抽出物で２時間処理した。次いで細胞をＷＥ液体培
地で２回洗浄後、０．２％四塩化炭素含有オリーブ油の
０．１ｍｌを添加し、さらに１時間反応させた。反応終
了後、上清中のＡＬＴ活性を測定した。Test 9. Evaluation of mouse hepatocyte damage by carbon tetrachloride a. Method: Hepatocytes were isolated from normal mice similar to the mice used in Test 8, and treated with astilbin or Tokubukuryo extract for 2 hours. Next, the cells were washed twice with a WE liquid medium, and 0.1 ml of 0.2% carbon tetrachloride-containing olive oil was added, followed by further reacting for 1 hour. After the reaction was completed, the ALT activity in the supernatant was measured.

【０１１６】ｂ．結果：アスチルビンおよび土茯苓抽出
物の両者は、それぞれ５×１０-6〜１×１０-4ｇ／ｍｌ
濃度で、四塩化炭素で障害を与えたマウス肝実質細胞か
らのＡＬＴの遊離に、なんらの影響を及ぼさなかった。B. Result: Both astilbin and Tokubukuryo extract were 5 × 10 −6 to 1 × 10 −4 g / ml, respectively.
At concentrations, it had no effect on the release of ALT from mouse liver parenchymal cells damaged by carbon tetrachloride.

【０１１７】この結果から明らかなように、アスチルビ
ンと土茯苓抽出物の両者を、肝実質細胞の前処理に用い
ても、四塩化炭素による肝細胞障害に対して、保護作用
がみられなかった。また、両薬物を予防的に６日間投薬
しても、マウスにおいて四塩化炭素により誘導される肝
障害に対して、改善作用を示さなかった。これらの結果
よりみれば、アスチルビンおよび土茯苓抽出物は、これ
までに知られているような肝細胞の保護作用ではなく、
活性化した主にＴ細胞からなる免疫細胞の機能を選択的
に抑制して、肝障害改善作用を示すものであることが判
明した。As is clear from the results, even when both astilbin and Tokubukuryo extract were used for pretreatment of hepatic parenchymal cells, no protective effect was observed against hepatocellular damage caused by carbon tetrachloride. . Even when both drugs were administered prophylactically for 6 days, mice did not show any ameliorating effect on liver damage induced by carbon tetrachloride in mice. According to these results, astilbin and Tokubukuryo extract are not the protective effects of hepatocytes as known so far,
It has been found that the function of the activated immune cells mainly composed of T cells is selectively suppressed to show a liver damage improving effect.

【０１１８】実施例５：各種フラボノイド類またはクロ
モン類の作用 試験１．ピクリルクロライドによる肝障害モデルマウス
の作製 ６ないし８週の雄性ＢＡＬＢ／ｃ系マウスを使用した。
実施例４の試験１と同様に、マウスの腹部皮膚上に、
０．１％のピクリルクロライドを含有するエタノール溶
液の０．１ｍｌを、５日間隔で２回塗布して、抗原感作
を行った。Example 5: Action of various flavonoids or chromones Test 1. Preparation of Model Mouse with Liver Injury by Picryl Chloride Male BALB / c mice of 6 to 8 weeks were used.
As in Test 1 of Example 4, on the abdominal skin of the mouse,
Antigen sensitization was performed by applying 0.1 ml of an ethanol solution containing 0.1% picryl chloride twice at 5-day intervals.

【０１１９】２回目の感作の５日後に、０．２％のピク
リルクロライド含有オリーブ油の１０μｌを肝臓内に投
与した。その１２時間後、２段階灌流法の変法により、
肝実質細胞および肝非実質細胞を単離した。次いで、単
離した肝実質細胞および肝非実質細胞を、トリパンブル
ー染色により評価し、約９０％の各細胞が生存している
ことを確認し、以下の各薬物との処理ならびに共培養の
試験に用いた。Five days after the second sensitization, 10 μl of 0.2% picryl chloride-containing olive oil was administered intrahepaticly. 12 hours later, by a modification of the two-stage perfusion method,
Hepatic parenchymal cells and non-hepatic parenchymal cells were isolated. Then, the isolated liver parenchymal cells and non-liver parenchymal cells were evaluated by trypan blue staining to confirm that about 90% of each cell was alive, and tested for treatment with each of the following drugs and for co-culture. It was used for.

【０１２０】試験２.細胞培養およびＡＬＴの遊離試験
（肝非実質細胞の前処理） ａ．方法：ＷＥ液体培地中の肝実質細胞（２×１０4 ｃ
ｅｌｌ／０．２ｍｌ）を９６穴のプレートにまき、３７
℃にて、５％二酸化炭素濃度エアー条件下にて培養を行
った。一方、肝非実質細胞を培地単独、あるいは各種濃
度の試験化合物を溶解した培地中で１時間反応させるこ
とにより、薬物処理を行った。なお、試験薬物として
は、式（Ｉ−ａ），（Ｉ−ｂ），（Ｉ−ｃ）および（Ｉ
−ｄ）で示されるスミチルビン、アスチルビン、エンゲ
ルチン、エウクリフィンを用いた。Test 2. Cell culture and ALT release test (pretreatment of liver non-parenchymal cells) a. Method: Hepatocytes (2 × 10 4 c) in WE liquid medium
ell / 0.2 ml) on a 96-well plate, and 37
Cultivation was performed at 5 ° C. under 5% carbon dioxide concentration in air. On the other hand, drug treatment was performed by reacting non-liver parenchymal cells in a medium alone or in a medium in which test compounds of various concentrations were dissolved, for 1 hour. In addition, as a test drug, Formula (Ia), (Ib), (Ic) and (Ic)
Sumitilbin, astilbin, engeltin, and eucribine shown in -d) were used.

【０１２１】５時間後に、肝実質細胞の単層を培地で２
回洗浄し、上記薬物で処理した肝非実質細胞、あるいは
処理していない肝非実質細胞のそれぞれ８×１０4 ｃｅ
ｌｌを添加した。添加後、さらに３時間共培養し、常法
により、集めた上清中のＡＬＴ活性を測定した。After 5 hours, the monolayer of liver parenchymal cells was
The liver non-parenchymal cells that were washed twice and treated with the above-mentioned drug or non-hepatic non-parenchymal cells not treated were each 8 × 10 4 ce
11 was added. After the addition, the cells were co-cultured for 3 hours, and the ALT activity in the collected supernatant was measured by a conventional method.

【０１２２】ｂ．結果：図６にその結果を示した。図中
の結果からも明らかなように、薬物未処理の肝非実質細
胞（対照群）では、培養上清中のＡＬＴ活性値が著しく
上昇している。これに対して、フラボノイド類のなかで
類似構造を持つアスチルビン、スミチルビン、エンゲル
チンは、濃度依存的にＡＬＴの遊離を抑制しており、そ
の抑制強度は３者とも同程度であり、クロモン類である
エウクリフィンが、最も強い抑制作用を示していること
が理解される。B. Results: The results are shown in FIG. As is clear from the results in the figure, the ALT activity value in the culture supernatant is significantly increased in the non-drug-treated liver non-parenchymal cells (control group). In contrast, among the flavonoids, astilbin, simitilbin, and engeltin, which have similar structures, suppress the release of ALT in a concentration-dependent manner, and the suppression intensity is the same for all three. It is understood that certain euclifins show the strongest inhibitory effect.

【０１２３】以上の結果から判断すると、本発明のフラ
ボノイド類またはクロモン類は、肝臓に浸潤した非実質
細胞、すなわち活性化Ｔ細胞の機能を不活化することに
より肝細胞障害作用を抑制しているといえる。Judging from the above results, the flavonoids or chromones of the present invention suppress the effect of hepatocellular injury by inactivating the function of non-parenchymal cells infiltrating the liver, ie, activated T cells. It can be said that.

【０１２４】試験３．細胞培養およびＡＬＴの遊離試験
（肝実質細胞の前処理） ａ．方法：肝実質細胞をＷＥ液体培地の単独、あるいは
各種濃度の試験化合物を溶解した培地とともに１時間反
応させて、薬物処理した。次いで、薬物処理を行った肝
実質細胞、あるいは薬物処理を行わなかった肝実質細胞
の２×１０4 ｃｅｌｌ／０．２ｍｌを９６穴のプレート
上にまき、３７℃にて、５％二酸化炭素濃度のエアー条
件下に培養を行った。Test 3. Cell culture and ALT release test (pretreatment of liver parenchymal cells) a. Method: Hepatocytes were treated with a WE liquid medium alone or with a medium in which test compounds of various concentrations were dissolved for 1 hour, and treated with a drug. Next, 2 × 10 4 cells / 0.2 ml of the hepatocytes treated with the drug or the hepatocytes not treated with the drug were spread on a 96-well plate, and the concentration of 5% carbon dioxide at 37 ° C. The culture was carried out under the air conditions described above.

【０１２５】５時間後に、肝実質細胞の単層を培地で２
回洗浄し、８×１０4 ｃｅｌｌの肝非実質細胞を添加
し、さらに３時間共培養し、常法により、集めた上清中
のＡＬＴ活性を測定した。なお、試験化合物は上記試験
２と同様のものを使用した。After 5 hours, the monolayer of liver parenchymal cells was
After washing twice, 8 × 10 4 cells of non-parenchymal liver cells were added, and the cells were co-cultured for 3 hours, and ALT activity in the collected supernatant was measured by a conventional method. The test compound used was the same as in Test 2 above.

【０１２６】ｂ．結果：その結果、各試験化合物を肝実
質細胞の前処理に用いたときには、肝非実質細胞との共
培養によるＡＬＴの遊離に影響を及ぼさなかった。B. Results: As a result, when each test compound was used for pretreatment of hepatic parenchymal cells, it did not affect ALT release by co-culture with non-hepatic parenchymal cells.

【０１２７】試験４．細胞培養およびＡＬＴの遊離試験
（四塩化炭素に対する影響） ａ．方法：正常なマウスから単離された肝実質細胞を用
い、２時間にわたり試験化合物で処理をした。なお、試
験化合物との未処理群を対照としておいた。処理終了
後、細胞を２回洗浄した後、０．２％の四塩化炭素を
０．１ｍｌ添加し、さらに１時間反応させ、常法によ
り、集めた上清中のＡＬＴ活性を測定した。試験化合物
は、上記試験２と同様のものを使用した。Test 4. Cell culture and ALT release test (effect on carbon tetrachloride) a. Methods: Hepatocytes isolated from normal mice were treated with test compounds for 2 hours. An untreated group with the test compound was used as a control. After the treatment, the cells were washed twice, 0.1 ml of 0.2% carbon tetrachloride was added, and the mixture was further reacted for 1 hour. The ALT activity in the collected supernatant was measured by a conventional method. The test compound used was the same as in Test 2 above.

【０１２８】ｂ．結果：試験化合物であるスミチルビ
ン、アスチルビン、エンゲルチンおよびエウクリフィン
は、いずれも５×１０-6〜１×１０-4ｇ／ｍｌの濃度
で、四塩化炭素で障害を与えたマウス肝実質細胞からの
ＡＬＴの遊離を抑制せず、肝細胞保護作用を示さなかっ
た。したがって、これらの化合物には、これまでに肝細
胞保護剤で見られていたような、肝細胞膜の安定化のよ
うな、肝細胞保護作用をもたないものであり、むしろ、
活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する肝機能保護作用である
ことが示された。B. Results: The test compounds Sumitilbin, Astilbin, Engeltin and Euclidin were all present at a concentration of 5 × 10 -6 to 1 × 10 -4 g / ml from mouse liver parenchymal cells impaired with carbon tetrachloride. It did not inhibit ALT release and did not show hepatocyte protective action. Therefore, these compounds do not have a hepatocyte protective action, such as stabilization of the hepatocyte membrane, which has been seen in hepatocyte protective agents so far.
It was shown to be a hepatic function protective effect that selectively inhibits activated T cells.

【０１２９】[0129]

【発明の効果】以上で詳細に説明したように、本発明の
活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する作用物質を有効成分と
して含有する免疫抑制剤は、活性化したＴ細胞に起因す
る疾患の治療、および改善において非常に優れた作用を
発揮している。したがって、本発明が提供する免疫抑制
剤は、活性化Ｔ細胞に起因する免疫異常、例えば、移植
に対する拒絶反応、骨髄（造血幹細胞）移植による移植
片対宿主病、自己免疫疾患、自己免疫疾患や類縁疾患に
起因する組織の損傷や感染に伴って起こる炎症反応、線
維化さらに臓器機能障害、アレルギー疾患等の治療に、
特に有効なものである。As described in detail above, the immunosuppressant containing an active substance which selectively inhibits activated T cells of the present invention as an active ingredient is useful for treating diseases caused by activated T cells. It has a very good effect on treatment and improvement. Therefore, the immunosuppressive agent provided by the present invention includes immunological disorders caused by activated T cells, such as rejection to transplantation, graft-versus-host disease due to bone marrow (hematopoietic stem cell) transplantation, autoimmune disease, autoimmune disease, For the treatment of inflammatory reactions, fibrosis, organ dysfunction, allergic diseases, etc. caused by tissue damage and infection caused by related diseases,
It is particularly effective.

【０１３０】その中でも特に、本発明が提供する式
（Ｉ）のフラボノイド類またはクロモン類は、活性化Ｔ
細胞を選択的に抑制するものであり、その抑制は、活性
化Ｔ細胞に対するアポトーシスの誘導として作用するも
のである。これらのフラボノイド類またはクロモン類
は、例えば、古くから民間で使用されている漢方薬に含
まれる成分でもあり、したがって、毒性も低く、その医
療上の価値は多大なものであるといえる。Among them, the flavonoids or chromones of the formula (I) provided by the present invention are preferably activated T
It selectively suppresses cells, and the suppression acts as induction of apoptosis on activated T cells. These flavonoids or chromones are, for example, components contained in Chinese herbal medicines that have been used in the private sector for a long time, and therefore have low toxicity and great medical value.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例４の試験２の結果を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the results of Test 2 of Example 4.

【図２】実施例４の試験４の結果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of Test 4 of Example 4.

【図３】実施例４の試験５の結果を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the results of Test 5 of Example 4.

【図４】実施例４の試験６の結果を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing the results of Test 6 of Example 4.

【図５】実施例４の試験７の結果を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing the results of Test 7 of Example 4.

【図６】実施例５の試験２の結果を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the results of Test 2 of Example 5.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 11/06 17/04 17/04 25/28 25/28 29/00 29/00 37/02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｈ 17/07 Ｃ０７Ｈ 17/07 // Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 35/78 Ｖ (72)発明者 陳 ▲てい▼ 中華人民共和国江蘇省南京市馬家街40号５ 幢１単元602号室 (72)発明者 小松 かつ子 富山県富山市五福末広町1073 コーポモビ リエ１−201──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 11/06 A61P 11/06 17/04 17/04 25/28 25/28 29/00 29/00 37 / 02 37/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 111 43/00 111 C07H 17/07 C07H 17/07 // A61K 35/78 A61K 35/78 V (72) Inventor Chen ▲ ▼▼ No. 40, No. 40, Majia Street, Nanjing City, Jiangsu Province, People's Republic of China Room 72 Unit 72 (72) Inventor Katsuko Komatsu 1073 Sofihirocho, Fukufukumachi, Toyama City, Toyama Prefecture

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 活性化Ｔ細胞を選択的に抑制する作用物
質を有効成分とする免疫抑制剤。1. An immunosuppressant comprising an active substance which selectively inhibits activated T cells as an active ingredient. 【請求項２】 移植に伴う拒絶反応に対する治療剤であ
る請求項１記載の免疫抑制剤。2. The immunosuppressant according to claim 1, which is a therapeutic agent for rejection associated with transplantation. 【請求項３】 骨髄（造血幹細胞）移植による移植片対
宿主病の治療剤である請求項１記載の免疫抑制剤。3. The immunosuppressive agent according to claim 1, which is a therapeutic agent for graft-versus-host disease by bone marrow (hematopoietic stem cell) transplantation. 【請求項４】 自己免疫疾患の治療剤である請求項１記
載の免疫抑制剤。4. The immunosuppressive agent according to claim 1, which is a therapeutic agent for an autoimmune disease. 【請求項５】 自己免疫疾患が、自己免疫性肝炎、慢性
関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、潰瘍性大腸
炎、多発性硬化症、強皮症、重症筋無力症、多発性筋炎
・皮膚筋炎、橋本病、自己免疫性血球減少症、シェーグ
レン症候群、血管炎症候群、全身性エリテマトーデス等
である請求項４記載の免疫抑制剤。5. The autoimmune disease includes autoimmune hepatitis, rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus, ulcerative colitis, multiple sclerosis, scleroderma, myasthenia gravis, polymyositis / dermatomyositis, The immunosuppressant according to claim 4, which is Hashimoto's disease, autoimmune cytopenia, Sjogren's syndrome, vasculitis syndrome, systemic lupus erythematosus, or the like. 【請求項６】 自己免疫疾患や類縁疾患に起因する組織
の損傷や感染に伴って起こる炎症反応、線維化さらに臓
器機能障害の治療剤である請求項１記載の免疫抑制剤。6. The immunosuppressive agent according to claim 1, which is a therapeutic agent for an inflammatory response, fibrosis, and organ dysfunction caused by tissue damage or infection caused by an autoimmune disease or a related disease. 【請求項７】 アレルギー疾患治療剤である請求項１記
載の免疫抑制剤。7. The immunosuppressant according to claim 1, which is a therapeutic agent for allergic diseases. 【請求項８】 アレルギー疾患が、気管支喘息、アレル
ギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、花粉症等であ
る請求項７記載の免疫抑制剤。8. The immunosuppressant according to claim 7, wherein the allergic disease is bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, urticaria, hay fever and the like. 【請求項９】 次式（Ｉ）： 【化１】 （式中、 Ｒは、水素原子または、１または２個の水酸基により置
換されたフェニル基を表し、 Ｒｈａは、α−Ｌ−ラムノース残基を表し、 点線は、二重結合の存在または不存在を表す。）で示さ
れるフラボノイド類またはクロモン類を有効成分とする
請求項１ないし８のいずれかに記載の免疫抑制剤。9. The following formula (I): (Wherein, R represents a hydrogen atom or a phenyl group substituted by one or two hydroxyl groups, Rha represents an α-L-rhamnose residue, and the dotted line represents the presence or absence of a double bond. The immunosuppressant according to any one of claims 1 to 8, comprising a flavonoid or chromone represented by the following formula: 【請求項１０】 前記式（Ｉ）中、Ｒが水素原子、４−
ヒドロキシフェニル基、３，４−ジヒドロキシフェニル
基、または３，５−ジヒドロキシフェニル基である請求
項９記載の免疫抑制剤。10. In the formula (I), R is a hydrogen atom,
The immunosuppressant according to claim 9, which is a hydroxyphenyl group, a 3,4-dihydroxyphenyl group, or a 3,5-dihydroxyphenyl group. 【請求項１１】 前記式（Ｉ）のフラボノイド類または
クロモン類が、次式（Ｉ−ａ）、（Ｉ−ｂ）、（Ｉ−
ｃ）または（Ｉ−ｄ）： 【化２】 で表されるフラボノイド類またはクロモン類である請求
項９に記載の免疫抑制剤。11. The flavonoids or chromones of the formula (I) are represented by the following formulas (Ia), (Ib) and (I-
c) or (Id): The immunosuppressant according to claim 9, which is a flavonoid or chromone represented by the formula: 【請求項１２】 請求項９に記載の式（Ｉ）で表される
フラボノイド類またはクロモン類を含有する植物抽出物
を有効成分とする請求項１ないし８のいずれかに記載の
免疫抑制剤。12. The immunosuppressive agent according to claim 1, comprising a plant extract containing the flavonoids or chromones represented by the formula (I) according to claim 9 as an active ingredient. 【請求項１３】 植物抽出物が、土茯苓抽出物である請
求項１２記載の免疫抑制剤。13. The immunosuppressant according to claim 12, wherein the plant extract is a Tokubukuryo extract. 【請求項１４】 請求項１１に記載の式（Ｉ−ａ）で表
されるスミチルビン。14. Sumitilbin represented by the formula (Ia) according to claim 11.
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