JP2000152791A - ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ - Google Patents
ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼInfo
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物及び菌類のリボフラビン生合成経路の最
終的および最後から2番目の酵素すなわちルマジンシン
ターゼ(LS)およびリボフラビンシンターゼ(RS)
の提供。 【解決手段】 LSタンパク質をコードする植物もしく
は真菌からの核酸断片、RSタンパク質をコードする植
物もしくは真菌からの核酸断片、センスもしくはアンチ
センスの向きのLSの全部もしくは一部をコードするキ
メラ遺伝子、該キメラ遺伝子を用いる植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活性を
阻害する化合物の能力を評価方法、ならびに除草剤もし
くは殺真菌剤の候補を同定するためのインビボおよびイ
ンビトロの方法。
終的および最後から2番目の酵素すなわちルマジンシン
ターゼ(LS)およびリボフラビンシンターゼ(RS)
の提供。 【解決手段】 LSタンパク質をコードする植物もしく
は真菌からの核酸断片、RSタンパク質をコードする植
物もしくは真菌からの核酸断片、センスもしくはアンチ
センスの向きのLSの全部もしくは一部をコードするキ
メラ遺伝子、該キメラ遺伝子を用いる植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活性を
阻害する化合物の能力を評価方法、ならびに除草剤もし
くは殺真菌剤の候補を同定するためのインビボおよびイ
ンビトロの方法。
Description
【0001】
【発明の属する技術的分野】本発明は植物および真菌の
分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、
植物もしくは真菌のリボフラビン生合成経路に関与する
タンパク質をコードする核酸断片に関する。
分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、
植物もしくは真菌のリボフラビン生合成経路に関与する
タンパク質をコードする核酸断片に関する。
【0002】
【従来の技術】リボフラビンすなわちビタミンB2は、
水素化物、酸素および電子伝達反応を媒介する多数の主
流の代謝酵素に不可欠な補因子、フラビンモノヌクレオ
チド(FMN)およびフラビンアデニンジヌクレオチド
(FAD)の前駆体である。リボフラビン依存性酵素
は、コハク酸デヒドロゲナーゼ、NADHデヒドロゲナ
ーゼ、フェレドキシン−NADP+オキシドレダクター
ゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ複合体を包含する。結果として、脂肪酸
酸化、TCA回路、ミトコンドリア電子伝達、光合成お
よび多数の他の細胞過程は、決定的に、補欠分子族とし
てFMNもしくはFADのいずれかに依存性である。他
の注目すべきフラボタンパク質(flavoproteins)は、グ
ルタチオンレダクターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、
P450オキシドレダクターゼ、スクアレンエポキシダ
ーゼ、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼおよびα−グ
リセロリン酸デヒドロゲナーゼを包含する。大腸菌(E.
coli)(リヒター(Richter)ら、J. Bacteriol. 174:4050
-4056(1992))およびS.セレビシエ(S. cerevisiae)
(サントス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1
995))におけるリボフラビン生合成の遺伝子的崩壊(dis
ruption)は、リボフラビン補充によってのみ克服される
致死的表現型をもたらす。これは、リボフラビン欠乏で
発生するとみられる有害な多面発現性効果の全体的効果
(ensemble)を考慮すれば驚くべきことではない。
水素化物、酸素および電子伝達反応を媒介する多数の主
流の代謝酵素に不可欠な補因子、フラビンモノヌクレオ
チド(FMN)およびフラビンアデニンジヌクレオチド
(FAD)の前駆体である。リボフラビン依存性酵素
は、コハク酸デヒドロゲナーゼ、NADHデヒドロゲナ
ーゼ、フェレドキシン−NADP+オキシドレダクター
ゼ、アシルCoAデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼ複合体を包含する。結果として、脂肪酸
酸化、TCA回路、ミトコンドリア電子伝達、光合成お
よび多数の他の細胞過程は、決定的に、補欠分子族とし
てFMNもしくはFADのいずれかに依存性である。他
の注目すべきフラボタンパク質(flavoproteins)は、グ
ルタチオンレダクターゼ、グリコール酸オキシダーゼ、
P450オキシドレダクターゼ、スクアレンエポキシダ
ーゼ、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼおよびα−グ
リセロリン酸デヒドロゲナーゼを包含する。大腸菌(E.
coli)(リヒター(Richter)ら、J. Bacteriol. 174:4050
-4056(1992))およびS.セレビシエ(S. cerevisiae)
(サントス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1
995))におけるリボフラビン生合成の遺伝子的崩壊(dis
ruption)は、リボフラビン補充によってのみ克服される
致死的表現型をもたらす。これは、リボフラビン欠乏で
発生するとみられる有害な多面発現性効果の全体的効果
(ensemble)を考慮すれば驚くべきことではない。
【0003】リボフラビンは、植物ならびに細菌および
真菌を包含する多数の微生物により合成される(バッハ
ー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemistry of Flav
oproteins(ミュラー(Muiller, F.)編)、Vol.I、pp.21
5-259、ケミカル ラバーカンパニー(Chemical Rubber
Co.)、フロリダ州ボカレイトン(1990))。鳥類、哺乳
動物および他の高等生物体はこのビタミンを合成するこ
とが不可能であり、そして、代わりに、それらの代謝的
欲求に合致させるのにその食餌摂取に頼るため、リボフ
ラビン生合成の原因である酵素は、将来の抗生物質、抗
真菌剤および除草剤の潜在的標的である。さらに、遠く
関連する植物および微生物の酵素が、強力な微生物特異
的阻害剤の開発において活用され得るという明瞭な特徴
を有することが可能である。かように、例えば植物から
のリボフラビン生合成酵素(1種もしくは複数)の構
造、機構、力学および基質結合特性の詳細な理解は、除
草剤として有用でありうる化合物の合理的設計の出発点
として役に立つであろう。真正の植物タンパク質(1種
もしくは複数)を手中に有することもまた、リボフラビ
ン生合成阻害剤の探究における化学物質のライブラリー
のインビトロスクリーニングのための価値ある道具を提
供するとみられる。
真菌を包含する多数の微生物により合成される(バッハ
ー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemistry of Flav
oproteins(ミュラー(Muiller, F.)編)、Vol.I、pp.21
5-259、ケミカル ラバーカンパニー(Chemical Rubber
Co.)、フロリダ州ボカレイトン(1990))。鳥類、哺乳
動物および他の高等生物体はこのビタミンを合成するこ
とが不可能であり、そして、代わりに、それらの代謝的
欲求に合致させるのにその食餌摂取に頼るため、リボフ
ラビン生合成の原因である酵素は、将来の抗生物質、抗
真菌剤および除草剤の潜在的標的である。さらに、遠く
関連する植物および微生物の酵素が、強力な微生物特異
的阻害剤の開発において活用され得るという明瞭な特徴
を有することが可能である。かように、例えば植物から
のリボフラビン生合成酵素(1種もしくは複数)の構
造、機構、力学および基質結合特性の詳細な理解は、除
草剤として有用でありうる化合物の合理的設計の出発点
として役に立つであろう。真正の植物タンパク質(1種
もしくは複数)を手中に有することもまた、リボフラビ
ン生合成阻害剤の探究における化学物質のライブラリー
のインビトロスクリーニングのための価値ある道具を提
供するとみられる。
【0004】細菌および真菌のリボフラビン生合成は40
年以上も集中的に研究されている(最近の総説について
は、バッハー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemist
ry of Flavoproteins(ミュラー(Muiller, F.)編)、Vo
l.I、pp.215-259および293-316、ケミカル ラバー カ
ンパニー(Chemical Rubber Co.)、フロリダ州ボカレイ
トン(1990)を参照)。この合成経路は7種の別個の酵素
触媒反応から成り、グアノシン5’−三リン酸(GT
P)およびリブロース5−リン酸が最終的前駆体であ
る。リボフラビン生合成の第二および第三段階は細菌お
よび真菌において反対の順序で存在する一方、残存する
経路の中間体は双方の微生物において同一である。構造
的および機構的には、当該経路中の最後の2反応、すな
わち6,7−ジメチル−8−リビチルルマジンシンター
ゼ(LS)およびリボフラビンシンターゼ(RS)によ
り触媒されるものが最もよく特徴づけられている。枯草
菌(B.subtilis)においては、これら2酵素は、約1MDa
の組み合わされた分子集団を伴う巨大球形粒子中で相互
に物理的に連合し(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Che
m. 255:632-637(1980);リツェルト(Ritsert)ら、J. Mo
l. Biol. 253、151-167(1995);バッハー(Bacher)ら、B
iochem. Soc. Trans. 24(1):89-94(1996));二機能性
タンパク質複合体のX線構造は3.3オングストローム分
解能で決定されている(ラーデンシュタイン(Ladenstei
n)ら、J. Mol. Biol. 203:1045-1070)。LS/RS複
合体は中空の二十面体キャプシドを形成する12個の五量
体に組織化される60個のLSサブユニットから成る。単
一分子のRSすなわち3個の同一サブユニットの三量体
がこの構造の中央核中に閉じ込められて存する。力学的
研究は、この複合体内の2種の酵素の区画化が、おそら
く「基質チャネリング(substrate channeling)」を介し
て低基質濃度でのリボフラビン産生の全体的触媒効率を
向上させることを示す(キス(Kis)ら、J. Biol. Chem.
270:16788-16795(1995))。二機能性LS/RS複合体
は他の微生物で観察されていないとは言え、最近、天然
の大腸菌(E. coli)LSもまた60個の同一サブユニット
の中空の二十面体キャプシドとしてインビボで存在する
ことが示された(メルトル(Moertl)ら、J. Biol. Chem.
271:33201-33207(1996))。
年以上も集中的に研究されている(最近の総説について
は、バッハー(Bacher, A.)、Chemistry and Biochemist
ry of Flavoproteins(ミュラー(Muiller, F.)編)、Vo
l.I、pp.215-259および293-316、ケミカル ラバー カ
ンパニー(Chemical Rubber Co.)、フロリダ州ボカレイ
トン(1990)を参照)。この合成経路は7種の別個の酵素
触媒反応から成り、グアノシン5’−三リン酸(GT
P)およびリブロース5−リン酸が最終的前駆体であ
る。リボフラビン生合成の第二および第三段階は細菌お
よび真菌において反対の順序で存在する一方、残存する
経路の中間体は双方の微生物において同一である。構造
的および機構的には、当該経路中の最後の2反応、すな
わち6,7−ジメチル−8−リビチルルマジンシンター
ゼ(LS)およびリボフラビンシンターゼ(RS)によ
り触媒されるものが最もよく特徴づけられている。枯草
菌(B.subtilis)においては、これら2酵素は、約1MDa
の組み合わされた分子集団を伴う巨大球形粒子中で相互
に物理的に連合し(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Che
m. 255:632-637(1980);リツェルト(Ritsert)ら、J. Mo
l. Biol. 253、151-167(1995);バッハー(Bacher)ら、B
iochem. Soc. Trans. 24(1):89-94(1996));二機能性
タンパク質複合体のX線構造は3.3オングストローム分
解能で決定されている(ラーデンシュタイン(Ladenstei
n)ら、J. Mol. Biol. 203:1045-1070)。LS/RS複
合体は中空の二十面体キャプシドを形成する12個の五量
体に組織化される60個のLSサブユニットから成る。単
一分子のRSすなわち3個の同一サブユニットの三量体
がこの構造の中央核中に閉じ込められて存する。力学的
研究は、この複合体内の2種の酵素の区画化が、おそら
く「基質チャネリング(substrate channeling)」を介し
て低基質濃度でのリボフラビン産生の全体的触媒効率を
向上させることを示す(キス(Kis)ら、J. Biol. Chem.
270:16788-16795(1995))。二機能性LS/RS複合体
は他の微生物で観察されていないとは言え、最近、天然
の大腸菌(E. coli)LSもまた60個の同一サブユニット
の中空の二十面体キャプシドとしてインビボで存在する
ことが示された(メルトル(Moertl)ら、J. Biol. Chem.
271:33201-33207(1996))。
【0005】リボフラビン生合成の終わりから2番目の
酵素LSは、3,4−ジヒドロキシ−2−ブタノン4−
リン酸の4−リビチルアミノ−5−アミノ−2,6−ジ
ヒドロキシピリミジン(RAADP)との縮合を触媒し
て、オルトリン酸および6,7−ジメチル−8−(1’
−D−リビチル)ルマジン(DMRL)のそれぞれ1モ
ルを生じる。後者はリボフラビンの直接の前駆体であ
る。LSをコードする遺伝子は、大腸菌(E. coli)(タ
ウラ(Taura)ら、Mol. Gen. Genet. 234:429-432(199
2))、A.プリューロニューモニエ(A. pleuroneumonia
e)(フラー(Fuller)ら、J. Bacteriol. 177:7265-7270
(1995))、P.ホスホレウム(P. phosphoreum)(リー(L
ee)ら、J. Bacteriol. 176:2100-2104(1994)、枯草菌
(B. subtilis)(ミロノフ(Mironov)ら、Dokl. Akad. Na
uk SSSR 305:482-487(1989))、およびS.セレビシエ
(S. cerevisiae)(ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramire
z)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995))を包含
する多数の微生物からクローニングされている。全ての
場合において、LS遺伝子産物のサブユニットの分子質
量(molecular mass)は小さく、大きさは約16〜17kDaの
範囲にわたる。多様なLS相同物は全て共通にある構造
的特徴を共有する一方、一次アミノ酸配列レベルでのそ
れらの全体的相同性はむしろ乏しい。例えば、ジェネテ
ィクス コンピュータグループ ギャップ プログラム
(Genetics Computer Group Gap program)(ウィスコン
シン パッケージ バージョン9.0、ジェネティクス
コンピュータグループ(Genetics Computer Group)(G
CG)、ウィスコンシン州マディソン)で決定されるよ
うに、大腸菌(E. coli)LSは、それぞれ、A.プリュ
ーロニューモニエ(A. pleuroneumoniae)、P.ホスホレ
ウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
S.セレビシエ(S. cerevisiae)の相同タンパク質と58
%、65%、53%および36%のみ同一である。実際のとこ
ろ、これら5種のタンパク質の対での比較は、2種の最
も類似の相同物が72%の同一性のみを共有することを示
す。
酵素LSは、3,4−ジヒドロキシ−2−ブタノン4−
リン酸の4−リビチルアミノ−5−アミノ−2,6−ジ
ヒドロキシピリミジン(RAADP)との縮合を触媒し
て、オルトリン酸および6,7−ジメチル−8−(1’
−D−リビチル)ルマジン(DMRL)のそれぞれ1モ
ルを生じる。後者はリボフラビンの直接の前駆体であ
る。LSをコードする遺伝子は、大腸菌(E. coli)(タ
ウラ(Taura)ら、Mol. Gen. Genet. 234:429-432(199
2))、A.プリューロニューモニエ(A. pleuroneumonia
e)(フラー(Fuller)ら、J. Bacteriol. 177:7265-7270
(1995))、P.ホスホレウム(P. phosphoreum)(リー(L
ee)ら、J. Bacteriol. 176:2100-2104(1994)、枯草菌
(B. subtilis)(ミロノフ(Mironov)ら、Dokl. Akad. Na
uk SSSR 305:482-487(1989))、およびS.セレビシエ
(S. cerevisiae)(ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramire
z)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995))を包含
する多数の微生物からクローニングされている。全ての
場合において、LS遺伝子産物のサブユニットの分子質
量(molecular mass)は小さく、大きさは約16〜17kDaの
範囲にわたる。多様なLS相同物は全て共通にある構造
的特徴を共有する一方、一次アミノ酸配列レベルでのそ
れらの全体的相同性はむしろ乏しい。例えば、ジェネテ
ィクス コンピュータグループ ギャップ プログラム
(Genetics Computer Group Gap program)(ウィスコン
シン パッケージ バージョン9.0、ジェネティクス
コンピュータグループ(Genetics Computer Group)(G
CG)、ウィスコンシン州マディソン)で決定されるよ
うに、大腸菌(E. coli)LSは、それぞれ、A.プリュ
ーロニューモニエ(A. pleuroneumoniae)、P.ホスホレ
ウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
S.セレビシエ(S. cerevisiae)の相同タンパク質と58
%、65%、53%および36%のみ同一である。実際のとこ
ろ、これら5種のタンパク質の対での比較は、2種の最
も類似の相同物が72%の同一性のみを共有することを示
す。
【0006】リボフラビン生合成の最終段階はRSによ
り媒介される。この酵素は2分子のDMRLの不均化を
触媒して1モルのリボフラビンおよびRAADPを生じ
る。後者の産物はまたLSの基質の1種でもあるという
ことが、上に示された枯草菌(B. subtilis)LS/RS
複合体の高められた触媒効率を部分的に説明する。RS
の結晶構造は決定されるべきままであるとは言え、天然
の細菌(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632
-637(1980))および真菌(サントス(Santos)ら、J. Bio
l. Chem. 270:437-444(1995))のタンパク質は三量体で
あり、それぞれ3個の同一の約25kDaのサブユニットか
ら成ることが推測される。今日までに、RSは約12種の
微生物からクローニングされているのみであり、また、
検査されている種の全てはそれらのN末端およびC末端
ドメインに著明な内部相同性を表す(ショト(Schott)
ら、J. Biol. Chem. 265:4204-4209(1990);サントス(S
antos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1995))。これ
らの観察結果を基礎として、RSプロモーターの2個の
半分が遺伝子重複により生じていること、および、それ
ぞれがDMRLの基質結合部位を含有することが示唆さ
れている。しかしながら、この構造的類似性にもかかわ
らず、多様なRSタンパク質の全体的配列相同性は極め
て制限される。かように、大腸菌(E. coli)RSタンパ
ク質は、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、P.ホスホ
レウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
P.レイオグナチ(P. leiognathi)におけるその対照物
に32%、36%、35%および31%のみ同一であり;後者の
4種のタンパク質のジェンバンク(GenBank)受託番号は
それぞれZ21621、L11391、X51510お
よびM90094である。
り媒介される。この酵素は2分子のDMRLの不均化を
触媒して1モルのリボフラビンおよびRAADPを生じ
る。後者の産物はまたLSの基質の1種でもあるという
ことが、上に示された枯草菌(B. subtilis)LS/RS
複合体の高められた触媒効率を部分的に説明する。RS
の結晶構造は決定されるべきままであるとは言え、天然
の細菌(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632
-637(1980))および真菌(サントス(Santos)ら、J. Bio
l. Chem. 270:437-444(1995))のタンパク質は三量体で
あり、それぞれ3個の同一の約25kDaのサブユニットか
ら成ることが推測される。今日までに、RSは約12種の
微生物からクローニングされているのみであり、また、
検査されている種の全てはそれらのN末端およびC末端
ドメインに著明な内部相同性を表す(ショト(Schott)
ら、J. Biol. Chem. 265:4204-4209(1990);サントス(S
antos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(1995))。これ
らの観察結果を基礎として、RSプロモーターの2個の
半分が遺伝子重複により生じていること、および、それ
ぞれがDMRLの基質結合部位を含有することが示唆さ
れている。しかしながら、この構造的類似性にもかかわ
らず、多様なRSタンパク質の全体的配列相同性は極め
て制限される。かように、大腸菌(E. coli)RSタンパ
ク質は、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、P.ホスホ
レウム(P. phosphoreum)、枯草菌(B. subtilis)および
P.レイオグナチ(P. leiognathi)におけるその対照物
に32%、36%、35%および31%のみ同一であり;後者の
4種のタンパク質のジェンバンク(GenBank)受託番号は
それぞれZ21621、L11391、X51510お
よびM90094である。
【0007】リボフラビン生合成の最初に掛かり合った
酵素GTPシクロヒドロラーゼIIを除いて、事実上、高
等植物のリボフラビン生合成装置について何も知られて
いない。このタンパク質の遺伝子は、最近、アラビドプ
シスのcDNAライブラリーからクローニングされた
(コバヤシ(Kobayashi)ら、Gene 160:303-304(199
5))。クローニングされた植物遺伝子のタンパク質配列
は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、P.レイ
オグナチ(P. leiognathi)およびP.ホスホレウム(P. p
hosporeum)からの相同タンパク質に37〜58%のみ同一で
ある。完全長のcDNA配列はいかなる他の植物のリボ
フラビン生合成酵素についても報告されていない一方、
ジェンバンク(GenBank)データベースは、植物LS遺伝
子に潜在的に対応する2種のESTs(発現された配列
標識(Expressed Sequence Tag))を含有する。これらの
一方はトウゴマからでありかつ他者はアラビドプシスか
らである。
酵素GTPシクロヒドロラーゼIIを除いて、事実上、高
等植物のリボフラビン生合成装置について何も知られて
いない。このタンパク質の遺伝子は、最近、アラビドプ
シスのcDNAライブラリーからクローニングされた
(コバヤシ(Kobayashi)ら、Gene 160:303-304(199
5))。クローニングされた植物遺伝子のタンパク質配列
は、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、P.レイ
オグナチ(P. leiognathi)およびP.ホスホレウム(P. p
hosporeum)からの相同タンパク質に37〜58%のみ同一で
ある。完全長のcDNA配列はいかなる他の植物のリボ
フラビン生合成酵素についても報告されていない一方、
ジェンバンク(GenBank)データベースは、植物LS遺伝
子に潜在的に対応する2種のESTs(発現された配列
標識(Expressed Sequence Tag))を含有する。これらの
一方はトウゴマからでありかつ他者はアラビドプシスか
らである。
【0008】トウゴマのcDNAクローン(ジェンバン
ク(GenBank)受託番号T15152;ファン・デ・ルー
(van de Loo)ら、Plant Physiol. 108:1141-1150(199
5))はその5’端で短くされ、そして、最低60個のN末
端アミノ酸残基に対応するDNAを喪失している。アラ
ビドプシスのcDNAクローン(ジェンバンク(GenBan
k)受託番号Z34233;直接提出)は、国立バイオテ
クノロジー情報センター(National Center for Biotech
nology Information)(NCBI)により提供されたT
BLASTNアルゴリズムを使用するBLAST(基本
的局所的整列検索ツール(Basic Local Alignment Searc
h Tool);アルチュール(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 2
15:403-410(1990))検索により同定された。BLAST
検索について疑問の配列は翻訳された大腸菌(E. coli)
LS遺伝子(ジェンバンク(GenBank)受託番号X643
95)であり、また、アラビドプシスのESTに対する
類似性の確率スコアはP=0.45であった。不幸なこと
に、配列決定されたcDNA挿入物の部分はこのタンパ
ク質の最後の26個のC末端アミノ酸残基のみを含有し、
そのため、それが部分的cDNAクローンか完全長cD
NAクローンかは未知である。これらのクローンのいず
れもポリA末端(tail)を保有しないため、それらがcD
NAライブラリーの調製の間の何れかの点で導入され
た、汚染する微生物DNAを反映するということが可能
である。
ク(GenBank)受託番号T15152;ファン・デ・ルー
(van de Loo)ら、Plant Physiol. 108:1141-1150(199
5))はその5’端で短くされ、そして、最低60個のN末
端アミノ酸残基に対応するDNAを喪失している。アラ
ビドプシスのcDNAクローン(ジェンバンク(GenBan
k)受託番号Z34233;直接提出)は、国立バイオテ
クノロジー情報センター(National Center for Biotech
nology Information)(NCBI)により提供されたT
BLASTNアルゴリズムを使用するBLAST(基本
的局所的整列検索ツール(Basic Local Alignment Searc
h Tool);アルチュール(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 2
15:403-410(1990))検索により同定された。BLAST
検索について疑問の配列は翻訳された大腸菌(E. coli)
LS遺伝子(ジェンバンク(GenBank)受託番号X643
95)であり、また、アラビドプシスのESTに対する
類似性の確率スコアはP=0.45であった。不幸なこと
に、配列決定されたcDNA挿入物の部分はこのタンパ
ク質の最後の26個のC末端アミノ酸残基のみを含有し、
そのため、それが部分的cDNAクローンか完全長cD
NAクローンかは未知である。これらのクローンのいず
れもポリA末端(tail)を保有しないため、それらがcD
NAライブラリーの調製の間の何れかの点で導入され
た、汚染する微生物DNAを反映するということが可能
である。
【0009】LSとは対照的に、BLAST検索は、大
腸菌(E. coli)もしくは酵母のいずれかのRSに対する
有意の一次アミノ酸配列相同性でジェンバンク(GenBan
k)データベース中のいずれかの植物DNA配列を同定す
ることに失敗した。しかしながら、RS活性は多様な植
物種からの抽出物で検出されており(プロート(Plaut,
G.)、Metabolic Pathways(グリーンバーグ(Greenberg,
D.M.)編)、vol II、p.673、アカデミックプレス(Acad
emic Press)、ニューヨーク(1961))、また、ホウレン
ソウ相同物の部分的精製が記述されている(ミツダ(Mit
suda)ら、Methods Enzymol. 18b:539-543(1970))。
腸菌(E. coli)もしくは酵母のいずれかのRSに対する
有意の一次アミノ酸配列相同性でジェンバンク(GenBan
k)データベース中のいずれかの植物DNA配列を同定す
ることに失敗した。しかしながら、RS活性は多様な植
物種からの抽出物で検出されており(プロート(Plaut,
G.)、Metabolic Pathways(グリーンバーグ(Greenberg,
D.M.)編)、vol II、p.673、アカデミックプレス(Acad
emic Press)、ニューヨーク(1961))、また、ホウレン
ソウ相同物の部分的精製が記述されている(ミツダ(Mit
suda)ら、Methods Enzymol. 18b:539-543(1970))。
【0010】前述の論考から、植物のLSもしくはRS
遺伝子/タンパク質、および、最も古典的なアプローチ
を使用していずれかの植物種からのLSもしくはRSを
コードする遺伝子の単離を可能にする既知の微生物相同
物に対するそれらの関係についてほとんど知られていな
いことが明らかである。後者は、相同的もしくは異種の
遺伝子でのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブ法(probing)、保存されたアミノ酸配列モ
チーフに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用
する目的の遺伝子のPCR増幅、および/もしくは微生
物宿主で発現されたcDNA挿入物の免疫学的検出を包
含する。不幸なことに、これらの技術は植物のLSもし
くはRS遺伝子の単離に非常に有用であることが期待さ
れないとみられる。なぜなら、それらは全て、同一の機
能を有する既知のタンパク質および遺伝子との有意の構
造的類似性(すなわちDNAもしくはアミノ酸配列)の
存在にひどく頼っているからである。LSおよびRSタ
ンパク質は微生物のなかでさえ双方とも非常に不十分に
保存されているという観察結果を考えれば、既知の微生
物相同物が高等植物におけるそれらの対照物と有意の構
造的類似性を共有するとみられることは高度にありそう
でない。
遺伝子/タンパク質、および、最も古典的なアプローチ
を使用していずれかの植物種からのLSもしくはRSを
コードする遺伝子の単離を可能にする既知の微生物相同
物に対するそれらの関係についてほとんど知られていな
いことが明らかである。後者は、相同的もしくは異種の
遺伝子でのcDNAライブラリーのハイブリダイゼーシ
ョンプローブ法(probing)、保存されたアミノ酸配列モ
チーフに対応するオリゴヌクレオチドプライマーを使用
する目的の遺伝子のPCR増幅、および/もしくは微生
物宿主で発現されたcDNA挿入物の免疫学的検出を包
含する。不幸なことに、これらの技術は植物のLSもし
くはRS遺伝子の単離に非常に有用であることが期待さ
れないとみられる。なぜなら、それらは全て、同一の機
能を有する既知のタンパク質および遺伝子との有意の構
造的類似性(すなわちDNAもしくはアミノ酸配列)の
存在にひどく頼っているからである。LSおよびRSタ
ンパク質は微生物のなかでさえ双方とも非常に不十分に
保存されているという観察結果を考えれば、既知の微生
物相同物が高等植物におけるそれらの対照物と有意の構
造的類似性を共有するとみられることは高度にありそう
でない。
【0011】高等真核生物から他の代謝経路における生
合成の遺伝子をクローニングするのに使用されている代
替のアプローチは、目的の酵素活性が不十分である微生
物突然変異体の相補による。この戦略は、崩壊された宿
主遺伝子および目的の標的遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の間の機能的類似性にのみ頼るため、同一の反
応を触媒する構造的に非類似性のタンパク質をクローニ
ングするのに理想的に適する。機能的相補のためには、
cDNAライブラリーを、微生物宿主中でcDNAの発
現を指図し得るベクター中に構築する。このプラスミド
ライブラリーをその後、突然変異体の細菌に導入し、そ
してもはや表現型的に突然変異体でないコロニーを選択
する。実際のところ、LS(ガルシア・ラミレズ(Garci
a-Ramirez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(199
5))および酵母のRS(サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995))ならびにアラビドプシスG
TPシクロヒドロラーゼII(コバヤシ(Kobayashi)ら、G
ene 160:303-304(1995))は、全て、微生物のリボフラ
ビン栄養要求体の機能的相補によりクローニングされ
た。この戦略はまた、リシン生合成(フリッシュ(Frisc
h)ら、Mol. Gen. Genet.228:287-293(1991))、プリン
生合成(アイミ(Aimi)ら、J. Biol. Chem. 265:9011-90
14(1990))およびトリプトファン生合成(ニヨギ(Niyog
i)ら、Plant Cell5:1011-1027(1993))を包含する他の
代謝経路に関与する高等真核生物から遺伝子を単離する
のにも役立っており、また、グルタミンシンセターゼ
(スヌスタッド(Snustad)ら、Genetics 120:1111-1124
(1988))、ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ(デ
ラウネイ(Delauney)ら、Mol. Genet. 221:299-305(199
0))、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(フリッシュ(F
risch)ら、Mol. Gen. Genet. 228:287-293(1991))、3
−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(エレルシュ
トローム(Ellerstrom)ら、Plant Mol. Biol. 18:557-56
6(1992))およびジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ
(ミネ(Minet)ら、Plant J. 2:417-422(1992))を包含
する多様な植物遺伝子の単離においてもまた成功裏に使
用されている。
合成の遺伝子をクローニングするのに使用されている代
替のアプローチは、目的の酵素活性が不十分である微生
物突然変異体の相補による。この戦略は、崩壊された宿
主遺伝子および目的の標的遺伝子によりコードされたタ
ンパク質の間の機能的類似性にのみ頼るため、同一の反
応を触媒する構造的に非類似性のタンパク質をクローニ
ングするのに理想的に適する。機能的相補のためには、
cDNAライブラリーを、微生物宿主中でcDNAの発
現を指図し得るベクター中に構築する。このプラスミド
ライブラリーをその後、突然変異体の細菌に導入し、そ
してもはや表現型的に突然変異体でないコロニーを選択
する。実際のところ、LS(ガルシア・ラミレズ(Garci
a-Ramirez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(199
5))および酵母のRS(サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995))ならびにアラビドプシスG
TPシクロヒドロラーゼII(コバヤシ(Kobayashi)ら、G
ene 160:303-304(1995))は、全て、微生物のリボフラ
ビン栄養要求体の機能的相補によりクローニングされ
た。この戦略はまた、リシン生合成(フリッシュ(Frisc
h)ら、Mol. Gen. Genet.228:287-293(1991))、プリン
生合成(アイミ(Aimi)ら、J. Biol. Chem. 265:9011-90
14(1990))およびトリプトファン生合成(ニヨギ(Niyog
i)ら、Plant Cell5:1011-1027(1993))を包含する他の
代謝経路に関与する高等真核生物から遺伝子を単離する
のにも役立っており、また、グルタミンシンセターゼ
(スヌスタッド(Snustad)ら、Genetics 120:1111-1124
(1988))、ピロリン−5−カルボン酸レダクターゼ(デ
ラウネイ(Delauney)ら、Mol. Genet. 221:299-305(199
0))、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(フリッシュ(F
risch)ら、Mol. Gen. Genet. 228:287-293(1991))、3
−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(エレルシュ
トローム(Ellerstrom)ら、Plant Mol. Biol. 18:557-56
6(1992))およびジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ
(ミネ(Minet)ら、Plant J. 2:417-422(1992))を包含
する多様な植物遺伝子の単離においてもまた成功裏に使
用されている。
【0012】
【発明が解決しようとする課題】機能的相補によるクロ
ーニングの明らかな魅力的な特徴にもかかわらず、この
アプローチが高等植物のLSおよびRS遺伝子に適用さ
れる場合に役立たないかも知れない理由が存在する。第
一に、真核生物のcDNA配列は、好ましいコドン使用
頻度における差異を包含する多様な理由から、突然変異
体の細菌中で十分なレベルで発現されないかも知れな
い。第二に、クローニングされた真核生物の遺伝子は、
例えば酵素活性が微生物宿主により実施されないアセチ
ル化、グリコシル化もしくはホルホリル化のような翻訳
後修飾を必要とする場合は機能的ポリペプチドを産生し
ない可能性がある。第三に、異種植物タンパク質は宿主
に致死性でありうるのでその発現を不可能にする。第四
に、真核生物のタンパク質は、折り畳みの問題、封入体
形成もしくは多様な他の理由のため、外来の微生物環境
中でその本来のコンホメーションを達成することに失敗
しうる。高等植物のLSおよびRS酵素は、微生物宿主
に存在しない葉緑体、ミトコンドリアもしくは何らかの
他のオルガネラに翻訳後に標的化される(targeted)、核
にコードされる(nuclear-encoded)タンパク質であるこ
ともまた可能である。これが事実でありかつオルガネラ
に標的化される配列のタンパク質分解的除去が酵素活性
に必要とされる場合は、機能的相補によるこれらの遺伝
子のクローニングは可能でないであろう。
ーニングの明らかな魅力的な特徴にもかかわらず、この
アプローチが高等植物のLSおよびRS遺伝子に適用さ
れる場合に役立たないかも知れない理由が存在する。第
一に、真核生物のcDNA配列は、好ましいコドン使用
頻度における差異を包含する多様な理由から、突然変異
体の細菌中で十分なレベルで発現されないかも知れな
い。第二に、クローニングされた真核生物の遺伝子は、
例えば酵素活性が微生物宿主により実施されないアセチ
ル化、グリコシル化もしくはホルホリル化のような翻訳
後修飾を必要とする場合は機能的ポリペプチドを産生し
ない可能性がある。第三に、異種植物タンパク質は宿主
に致死性でありうるのでその発現を不可能にする。第四
に、真核生物のタンパク質は、折り畳みの問題、封入体
形成もしくは多様な他の理由のため、外来の微生物環境
中でその本来のコンホメーションを達成することに失敗
しうる。高等植物のLSおよびRS酵素は、微生物宿主
に存在しない葉緑体、ミトコンドリアもしくは何らかの
他のオルガネラに翻訳後に標的化される(targeted)、核
にコードされる(nuclear-encoded)タンパク質であるこ
ともまた可能である。これが事実でありかつオルガネラ
に標的化される配列のタンパク質分解的除去が酵素活性
に必要とされる場合は、機能的相補によるこれらの遺伝
子のクローニングは可能でないであろう。
【0013】
【課題を解決するための手段】本発明は、リボフラビン
生合成に関与する植物もしくは真菌の酵素をコードする
単離された核酸断片に関する。とりわけ、本発明は、植
物もしくは真菌のLSをコードする単離された核酸断片
に関し、植物はホウレンソウ、タバコもしくはアラビド
プシスであり、また、真菌はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)である。本発明はまた、植物もしく
は真菌のRSをコードする単離された核酸断片にも関
し、植物はホウレンソウもしくはアラビドプシスであ
り、また、真菌はマグナポルテ グリセア(Magnaporthe
grisea)である。加えて、本発明は、植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコード
する核酸断片に相補的である核酸断片に関する。
生合成に関与する植物もしくは真菌の酵素をコードする
単離された核酸断片に関する。とりわけ、本発明は、植
物もしくは真菌のLSをコードする単離された核酸断片
に関し、植物はホウレンソウ、タバコもしくはアラビド
プシスであり、また、真菌はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)である。本発明はまた、植物もしく
は真菌のRSをコードする単離された核酸断片にも関
し、植物はホウレンソウもしくはアラビドプシスであ
り、また、真菌はマグナポルテ グリセア(Magnaporthe
grisea)である。加えて、本発明は、植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコード
する核酸断片に相補的である核酸断片に関する。
【0014】植物のLS酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、(a)配列番号2、配列番号4および
配列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片;(b)配列番号2、配列番号4および配列番号6か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類
似である単離された核酸断片;(c)配列番号2、配列
番号4および配列番号6から成る群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも72%の同一性を有するポリペプチ
ドをコードする単離された核酸断片;ならびに(d)
(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単離され
た核酸断片である。
れた核酸断片は、(a)配列番号2、配列番号4および
配列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片;(b)配列番号2、配列番号4および配列番号6か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類
似である単離された核酸断片;(c)配列番号2、配列
番号4および配列番号6から成る群から選択されるアミ
ノ酸配列と少なくとも72%の同一性を有するポリペプチ
ドをコードする単離された核酸断片;ならびに(d)
(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単離され
た核酸断片である。
【0015】植物のRS酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、(a)配列番号8および配列番号10
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは
本質的部分をコードする単離された核酸断片;(b)配
配列番号8および配列番号10から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片;(c)配列番号8および配列番号10から成る
群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一
性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断
片;ならびに(d)(a)、(b)もしくは(c)に相
補的である単離された核酸断片である。
れた核酸断片は、(a)配列番号8および配列番号10
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは
本質的部分をコードする単離された核酸断片;(b)配
配列番号8および配列番号10から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片;(c)配列番号8および配列番号10から成る
群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一
性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸断
片;ならびに(d)(a)、(b)もしくは(c)に相
補的である単離された核酸断片である。
【0016】真菌のRS酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、(a)配列番号12に述べられるアミ
ノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離さ
れた核酸断片;(b)配列番号12に示されているアミ
ノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本質
的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部分
に相同である単離された核酸断片;(c)(a)もしく
は(b)に相補的である単離された核酸断片である。
れた核酸断片は、(a)配列番号12に述べられるアミ
ノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離さ
れた核酸断片;(b)配列番号12に示されているアミ
ノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本質
的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部分
に相同である単離された核酸断片;(c)(a)もしく
は(b)に相補的である単離された核酸断片である。
【0017】真菌のLS酵素をコードする特定の単離さ
れた核酸断片は、(a)配列番号38に示されているア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片;(b)配列番号38に示されているア
ミノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本
質的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部
分に相同である単離された核酸断片;および(c)
(a)もしくは(b)に相補的である単離された核酸断
片である。
れた核酸断片は、(a)配列番号38に示されているア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片;(b)配列番号38に示されているア
ミノ酸配列の全部をコードする単離された核酸断片に本
質的に類似であるか、もしくは少なくともその本質的部
分に相同である単離された核酸断片;および(c)
(a)もしくは(b)に相補的である単離された核酸断
片である。
【0018】別の態様において、本発明は、適する調節
配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌のLS
酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコードするキ
メラ遺伝子、あるいは、当該酵素をコードする核酸断片
に相補的である核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子に関
し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質転換されない宿主
細胞で産生されるレベルから改変される(すなわち増加
もしくは減少される)レベルの形質転換された宿主細胞
でのコードされた酵素の産生をもたらす。
配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌のLS
酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコードするキ
メラ遺伝子、あるいは、当該酵素をコードする核酸断片
に相補的である核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子に関
し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質転換されない宿主
細胞で産生されるレベルから改変される(すなわち増加
もしくは減少される)レベルの形質転換された宿主細胞
でのコードされた酵素の産生をもたらす。
【0019】さらなる態様において、本発明は、適する
調節配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌の
LS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコードす
るキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んで成る形質転換さ
れた宿主細胞に関し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質
転換された宿主細胞での植物のLS酵素または植物もし
くは真菌のRS酵素の改変されたレベルの産生をもたら
す。形質転換された宿主細胞は真核生物もしくは原核生
物起源のものであり得、そして高等植物および微生物由
来の細胞を包含する。本発明はまた、高等植物の形質転
換された宿主細胞およびこうした形質転換された植物由
来の種子から生じる形質転換された植物も包含する。
調節配列に操作可能に連結された、植物もしくは真菌の
LS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコードす
るキメラ遺伝子をそのゲノム中に含んで成る形質転換さ
れた宿主細胞に関し、当該キメラ遺伝子の発現は、形質
転換された宿主細胞での植物のLS酵素または植物もし
くは真菌のRS酵素の改変されたレベルの産生をもたら
す。形質転換された宿主細胞は真核生物もしくは原核生
物起源のものであり得、そして高等植物および微生物由
来の細胞を包含する。本発明はまた、高等植物の形質転
換された宿主細胞およびこうした形質転換された植物由
来の種子から生じる形質転換された植物も包含する。
【0020】本発明の付加的な一態様は、a)宿主細胞
を、適する調節配列に操作可能に連結された、植物もし
くは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素
をコードするキメラ遺伝子で形質転換すること;そして
b)このキメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質転
換された宿主細胞を成長させることであって、このキメ
ラ遺伝子の発現が形質転換された細胞でのLSもしくは
RSの改変されたレベルの産生をもたらすことを含んで
成る、形質転換された宿主細胞における植物もしくは真
菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の発現
のレベルを改変する方法に関する。
を、適する調節配列に操作可能に連結された、植物もし
くは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素
をコードするキメラ遺伝子で形質転換すること;そして
b)このキメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質転
換された宿主細胞を成長させることであって、このキメ
ラ遺伝子の発現が形質転換された細胞でのLSもしくは
RSの改変されたレベルの産生をもたらすことを含んで
成る、形質転換された宿主細胞における植物もしくは真
菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の発現
のレベルを改変する方法に関する。
【0021】本発明の付加的な一態様は、植物もしくは
真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
ードする核酸断片を得る方法に関する。
真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
ードする核酸断片を得る方法に関する。
【0022】加えて、(a)適する微生物宿主の内因性
LSもしくはRS遺伝子を崩壊させて微生物宿主細胞の
成長を添加されたリボフラビンに依存性とすること;
(b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、植物
もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS
酵素をコードする単離された核酸断片を含むキメラ遺伝
子であって、微生物宿主細胞中でのその発現を可能にす
る、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結された
キメラ遺伝子で形質転換すること;(c)キメラ遺伝子
すなわち植物もしくは真菌のLSもしくはRS遺伝子の
発現に適する条件下で段階(a)の形質転換された宿主
細胞を成長させること;(d)形質転換された微生物宿
主細胞を、宿主細胞が指数的に増殖している際にかつ添
加されたリボフラビンの存在および非存在の双方におい
て、十分に制御された実験により目的の化合物に接触さ
せること;(e)添加されたリボフラビンの非存在下で
成長された場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の
成長を阻害する目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もし
くは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素
の活性を阻害し、そしてかように作物保護化学物質とし
てはたらく化合物を除草性もしくは殺真菌性の候補と同
定するためのインビボの方法が提供される。適する単離
された核酸断片は上に述べられたものである。このイン
ビボアッセイに適する微生物宿主は、後述される大腸菌
(E. coli)のLSおよびRSのリボフラビン栄養要求体
を包含し、その双方は通常は成長のためにリボフラビン
の補充を必要とする。これらの突然変異体に導入される
機能性の植物もしくは真菌遺伝子の特異的阻害が、その
後、形質転換された宿主細胞が添加されたリボフラビン
の存在下および非存在下双方で成長される平行アッセイ
で直接評価され得る。リボフラビン補充の非存在下での
み代謝活性(成長)に影響を及ぼす阻害性化合物は潜在
的な除草剤および/もしくは殺真菌剤を表す。
LSもしくはRS遺伝子を崩壊させて微生物宿主細胞の
成長を添加されたリボフラビンに依存性とすること;
(b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、植物
もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS
酵素をコードする単離された核酸断片を含むキメラ遺伝
子であって、微生物宿主細胞中でのその発現を可能にす
る、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結された
キメラ遺伝子で形質転換すること;(c)キメラ遺伝子
すなわち植物もしくは真菌のLSもしくはRS遺伝子の
発現に適する条件下で段階(a)の形質転換された宿主
細胞を成長させること;(d)形質転換された微生物宿
主細胞を、宿主細胞が指数的に増殖している際にかつ添
加されたリボフラビンの存在および非存在の双方におい
て、十分に制御された実験により目的の化合物に接触さ
せること;(e)添加されたリボフラビンの非存在下で
成長された場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の
成長を阻害する目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もし
くは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素
の活性を阻害し、そしてかように作物保護化学物質とし
てはたらく化合物を除草性もしくは殺真菌性の候補と同
定するためのインビボの方法が提供される。適する単離
された核酸断片は上に述べられたものである。このイン
ビボアッセイに適する微生物宿主は、後述される大腸菌
(E. coli)のLSおよびRSのリボフラビン栄養要求体
を包含し、その双方は通常は成長のためにリボフラビン
の補充を必要とする。これらの突然変異体に導入される
機能性の植物もしくは真菌遺伝子の特異的阻害が、その
後、形質転換された宿主細胞が添加されたリボフラビン
の存在下および非存在下双方で成長される平行アッセイ
で直接評価され得る。リボフラビン補充の非存在下での
み代謝活性(成長)に影響を及ぼす阻害性化合物は潜在
的な除草剤および/もしくは殺真菌剤を表す。
【0023】代替の態様において、(a)宿主細胞を、
植物もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌の
RS酵素をコードする核酸断片を含むキメラ遺伝子であ
って、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結され
たキメラ遺伝子で形質転換すること;(b)当該キメラ
遺伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換さ
れた宿主細胞を成長させて植物もしくは真菌のLS酵素
または植物もしくは真菌のRS酵素の産生をもたらすこ
と;(c)形質転換された宿主細胞により発現される植
物もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のR
S酵素を精製すること;(d)この酵素を目的の化合物
と接触させること;そして(e)目的の化合物の非存在
下でのそれぞれの酵素の活性に関して植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活性を
低下させる目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もしくは
真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活
性を阻害しそしてかように作物保護化学物質としてはた
らく化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候補と同定する
ためのインビトロ法が提供される。こうした低下された
活性は、その化合物が作物保護化学物質として潜在的に
有用であることを示す。適する単離された核酸断片は上
に述べられたものである。
植物もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌の
RS酵素をコードする核酸断片を含むキメラ遺伝子であ
って、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結され
たキメラ遺伝子で形質転換すること;(b)当該キメラ
遺伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換さ
れた宿主細胞を成長させて植物もしくは真菌のLS酵素
または植物もしくは真菌のRS酵素の産生をもたらすこ
と;(c)形質転換された宿主細胞により発現される植
物もしくは真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のR
S酵素を精製すること;(d)この酵素を目的の化合物
と接触させること;そして(e)目的の化合物の非存在
下でのそれぞれの酵素の活性に関して植物もしくは真菌
のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活性を
低下させる目的の化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る、植物もしくは
真菌のLS酵素または植物もしくは真菌のRS酵素の活
性を阻害しそしてかように作物保護化学物質としてはた
らく化合物を除草剤もしくは殺真菌剤の候補と同定する
ためのインビトロ法が提供される。こうした低下された
活性は、その化合物が作物保護化学物質として潜在的に
有用であることを示す。適する単離された核酸断片は上
に述べられたものである。
【0024】図1〜4はGCG積み重ねプログラム(GCG
Pileup program)(ジェネティクスコンピュータ グル
ープ(Genetics Computer Group)、ウィスコンシン州マ
ディソン)で生じられた一次アミノ酸配列の整列を示
す。
Pileup program)(ジェネティクスコンピュータ グル
ープ(Genetics Computer Group)、ウィスコンシン州マ
ディソン)で生じられた一次アミノ酸配列の整列を示
す。
【0025】図1は既知の微生物RS相同物およびクロ
ーニングされたホウレンソウRS前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
ーニングされたホウレンソウRS前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
【0026】図2は既知の微生物LS相同物およびクロ
ーニングされたホウレンソウLS前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
ーニングされたホウレンソウLS前駆体タンパク質の一
次アミノ酸配列の整列を示す。
【0027】図3はホウレンソウおよびアラビドプシス
のRS前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示
す。囲まれた残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列
(例えば輸送ペプチド(transit peptide))を示す。
のRS前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示
す。囲まれた残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列
(例えば輸送ペプチド(transit peptide))を示す。
【0028】図4はホウレンソウ、タバコおよびアラビ
ドプシスのLS前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の
整列を示す。囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的
化された配列(例えば輸送ペプチド)を示す。
ドプシスのLS前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の
整列を示す。囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的
化された配列(例えば輸送ペプチド)を示す。
【0029】以下の配列の記述およびこれに付属された
配列表は、C.F.R.第37条§1.821〜1.825に述べら
れるような特許出願におけるヌクレオチドおよび/もし
くはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。配列
の記述は、Nucleic Acids Research 13:3021-3030(198
5)およびBiochemical Journal 219(2):345-373(1984)
(これらは引用により本明細書に組み込まれる)に記述
されたIUPAC−IYUBの基準に従って定義される
ように、ヌクレオチド配列文字について1文字記号を、
またアミノ酸について3文字記号を含有する。本発明
は、ジェネティクスコンピュータ グループ(Genetics
Computer Group)(GCG)、ウィスコンシン州マディ
ソンからのウィスコンシン パッケージ バージョン9.
0ソフトウェアを利用した。
配列表は、C.F.R.第37条§1.821〜1.825に述べら
れるような特許出願におけるヌクレオチドおよび/もし
くはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。配列
の記述は、Nucleic Acids Research 13:3021-3030(198
5)およびBiochemical Journal 219(2):345-373(1984)
(これらは引用により本明細書に組み込まれる)に記述
されたIUPAC−IYUBの基準に従って定義される
ように、ヌクレオチド配列文字について1文字記号を、
またアミノ酸について3文字記号を含有する。本発明
は、ジェネティクスコンピュータ グループ(Genetics
Computer Group)(GCG)、ウィスコンシン州マディ
ソンからのウィスコンシン パッケージ バージョン9.
0ソフトウェアを利用した。
【0030】配列番号1は成熟ホウレンソウLSをコー
ドするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配列
である。
ドするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配列
である。
【0031】配列番号2は成熟ホウレンソウLSをコー
ドするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列
である。
ドするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列
である。
【0032】配列番号3は成熟タバコLSをコードする
クローニングされたcDNAのヌクレオチド配列であ
る。
クローニングされたcDNAのヌクレオチド配列であ
る。
【0033】配列番号4は成熟タバコLSをコードする
クローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列であ
る。
クローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列であ
る。
【0034】配列番号5は成熟アラビドプシスLSをコ
ードするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配
列である。
ードするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配
列である。
【0035】配列番号6は成熟アラビドプシスLSをコ
ードするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配
列である。
ードするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配
列である。
【0036】配列番号7は成熟ホウレンソウRSをコー
ドするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配列
である。
ドするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配列
である。
【0037】配列番号8は成熟ホウレンソウRSをコー
ドするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列
である。
ドするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸配列
である。
【0038】配列番号9は成熟アラビドプシスRSをコ
ードするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配
列である。
ードするクローニングされたcDNAのヌクレオチド配
列である。
【0039】配列番号10は成熟アラビドプシスRSを
コードするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸
配列である。
コードするクローニングされたcDNAの推定アミノ酸
配列である。
【0040】配列番号11はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)RSをコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
agnaporthe grisea)RSをコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
【0041】配列番号12はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)RSをコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
agnaporthe grisea)RSをコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
【0042】配列番号13はジェンバンク(GenBank)受
託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの増
幅に有用な5’プライマーである。
託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの増
幅に有用な5’プライマーである。
【0043】配列番号14はジェンバンク(GenBank)受
託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの増
幅に有用な3’プライマーである。
託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの増
幅に有用な3’プライマーである。
【0044】配列番号15はジェンバンク(GenBank)受
託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの増
幅に有用な5’プライマーである。
託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの増
幅に有用な5’プライマーである。
【0045】配列番号16はジェンバンク(GenBank)受
託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの増
幅に有用な3’プライマーである。
託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの増
幅に有用な3’プライマーである。
【0046】配列番号17は、NotI切断部位での、
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号X64395
およびX69109を有する大腸菌(E. coli)LSおよ
びRS遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるDNA断片
の導入に有用な5’プライマーである。
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号X64395
およびX69109を有する大腸菌(E. coli)LSおよ
びRS遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるDNA断片
の導入に有用な5’プライマーである。
【0047】配列番号18は、NotI切断部位での、
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号X64395
およびX69109を有する大腸菌(E. coli)LSおよ
びRS遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるDNA断片
の導入に有用な3’プライマーである。
それぞれジェンバンク(GenBank)受託番号X64395
およびX69109を有する大腸菌(E. coli)LSおよ
びRS遺伝子へのカナマイシン耐性を与えるDNA断片
の導入に有用な3’プライマーである。
【0048】配列番号19は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド2273〜2290にハイブリダ
イゼーションする)。
受託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド2273〜2290にハイブリダ
イゼーションする)。
【0049】配列番号20は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド2243〜2261にハイブリダ
イゼーションする)。
受託番号X64395を有する大腸菌(E. coli)LSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド2243〜2261にハイブリダ
イゼーションする)。
【0050】配列番号21は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド1217〜1233にハイブリダ
イゼーションする)。
受託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド1217〜1233にハイブリダ
イゼーションする)。
【0051】配列番号22は、ジェンバンク(GenBank)
受託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする)。
受託番号X69109を有する大腸菌(E. coli)RSの
中央のNotI切断部位の導入に有用なPCRプライマ
ーの1種である(ヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする)。
【0052】配列番号23はクローニングされたホウレ
ンソウRS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
5’プライマーである。
ンソウRS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
5’プライマーである。
【0053】配列番号24はクローニングされたホウレ
ンソウRS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
3’プライマーである。
ンソウRS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
3’プライマーである。
【0054】配列番号25はクローニングされたホウレ
ンソウLS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
5’プライマーである。
ンソウLS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
5’プライマーである。
【0055】配列番号26はクローニングされたホウレ
ンソウLS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
3’プライマーである。
ンソウLS前駆体からの輸送ペプチドの除去に有用な
3’プライマーである。
【0056】配列番号27はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウLS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAのヌクレオチド配列である。
ウレンソウLS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAのヌクレオチド配列である。
【0057】配列番号28はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウLS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAの推定アミノ酸配列である。
ウレンソウLS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAの推定アミノ酸配列である。
【0058】配列番号29はその輸送ペプチドを含むタ
バコLS前駆体をコードするクローニングされたcDN
Aのヌクレオチド配列である。
バコLS前駆体をコードするクローニングされたcDN
Aのヌクレオチド配列である。
【0059】配列番号30はその輸送ペプチドを含むタ
バコLS前駆体をコードするクローニングされたcDN
Aの推定アミノ酸配列である。
バコLS前駆体をコードするクローニングされたcDN
Aの推定アミノ酸配列である。
【0060】配列番号31はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスLS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
ラビドプシスLS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
【0061】配列番号32はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスLS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
ラビドプシスLS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
【0062】配列番号33はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウRS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAのヌクレオチド配列である。
ウレンソウRS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAのヌクレオチド配列である。
【0063】配列番号34はその輸送ペプチドを含むホ
ウレンソウRS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAの推定アミノ酸配列である。
ウレンソウRS前駆体をコードするクローニングされた
cDNAの推定アミノ酸配列である。
【0064】配列番号35はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスRS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
ラビドプシスRS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
【0065】配列番号36はその輸送ペプチドを含むア
ラビドプシスRS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
ラビドプシスRS前駆体をコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
【0066】配列番号37はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)LSをコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
agnaporthe grisea)LSをコードするクローニングされ
たcDNAのヌクレオチド配列である。
【0067】配列番号38はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)LSをコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
agnaporthe grisea)LSをコードするクローニングされ
たcDNAの推定アミノ酸配列である。
【0068】配列番号39は植物LSタンパク質に見出
される高度に保存されたC末端アミノ酸配列である。
される高度に保存されたC末端アミノ酸配列である。
【0069】ルマジンシンターゼ(LS)およびリボフ
ラビンシンターゼ(RS)すなわちホウレンソウのリボ
フラビン生合成経路の最後と最後から2番目の酵素は、
大腸菌(E. coli)栄養要求体の機能相補の使用によりク
ローニングされている。
ラビンシンターゼ(RS)すなわちホウレンソウのリボ
フラビン生合成経路の最後と最後から2番目の酵素は、
大腸菌(E. coli)栄養要求体の機能相補の使用によりク
ローニングされている。
【0070】それぞれLSタンパク質およびRSタンパ
ク質をコードする核酸断片が植物および真菌から単離さ
れている。他の植物および真菌からのLSおよびRS遺
伝子は、今や、発明者により提供される配列との無作為
cDNA配列の比較により同定され得る。本発明は、当
該酵素経路に関する作物保護化学物質をスクリーニング
するためのこれらの核酸断片を使用するアッセイ、なら
びに宿主細胞中のLSおよびRS酵素の産生のレベルを
改変する方法を包含する。
ク質をコードする核酸断片が植物および真菌から単離さ
れている。他の植物および真菌からのLSおよびRS遺
伝子は、今や、発明者により提供される配列との無作為
cDNA配列の比較により同定され得る。本発明は、当
該酵素経路に関する作物保護化学物質をスクリーニング
するためのこれらの核酸断片を使用するアッセイ、なら
びに宿主細胞中のLSおよびRS酵素の産生のレベルを
改変する方法を包含する。
【0071】本開示では多数の用語および略語が使用さ
れる。以下の定義が提供される。
れる。以下の定義が提供される。
【0072】「ルマジンシンターゼ」はLSと略称され
る。
る。
【0073】「リボフラビンシンターゼ」はRSと略称
される。
される。
【0074】「フラビンモノヌクレオチド」はFMNと
略称される。
略称される。
【0075】「フラビンアデニンジヌクレオチド」はF
ADと略称される。
ADと略称される。
【0076】「ポリメラーゼ連鎖反応」はPCRと略称
される。
される。
【0077】「発現された配列標識」はESTと略称さ
れる。
れる。
【0078】「ジメチルスルホキシド」はDMSOと略
称される。
称される。
【0079】「6,7−ジメチル−8−(1’−リビチ
ル)ルマジン」はDMRLと略称される。
ル)ルマジン」はDMRLと略称される。
【0080】「4−リビチルアミノ−5−アミノ−2,
6−ジヒドロキシピリミジン」はRAADPと略称され
る。
6−ジヒドロキシピリミジン」はRAADPと略称され
る。
【0081】「3,4−ジビドロキシブタノン4−リン
酸」はDHBPと略称される。
酸」はDHBPと略称される。
【0082】「イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラ
クトピラノシド」はIPTGと略称される。
クトピラノシド」はIPTGと略称される。
【0083】「ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動」はSDS−PAGEと略称され
る。
アミドゲル電気泳動」はSDS−PAGEと略称され
る。
【0084】「読み取り枠」はORFと略称される。
【0085】「単離された核酸断片」は、場合によって
は合成の非天然すなわち改変されたヌクレオチド塩基を
含有する、一本鎖もしくは二本鎖であるRNAもしくは
DNAのポリマーである。DNAのポリマーの形態の単
離された核酸断片は、cDNA、ゲノムDNAもしくは
合成DNAの1種もしくはそれ以上の区分から成ってよ
い。
は合成の非天然すなわち改変されたヌクレオチド塩基を
含有する、一本鎖もしくは二本鎖であるRNAもしくは
DNAのポリマーである。DNAのポリマーの形態の単
離された核酸断片は、cDNA、ゲノムDNAもしくは
合成DNAの1種もしくはそれ以上の区分から成ってよ
い。
【0086】「成熟」タンパク質はその輸送ペプチドを
含まない機能性のLSもしくはRS酵素を指す。「前駆
体」タンパク質は天然もしくは外来性の輸送ペプチドを
含む成熟ペプチドを指す。「輸送ペプチド」という用語
はポリペプチドのアミノ末端の伸長を指し、これはその
ポリペプチドとともに翻訳されて前駆体ペプチドを形成
し、かつ、プラスチドもしくは葉緑体のようなオルガネ
ラによるその取り込みに必要とされる。
含まない機能性のLSもしくはRS酵素を指す。「前駆
体」タンパク質は天然もしくは外来性の輸送ペプチドを
含む成熟ペプチドを指す。「輸送ペプチド」という用語
はポリペプチドのアミノ末端の伸長を指し、これはその
ポリペプチドとともに翻訳されて前駆体ペプチドを形成
し、かつ、プラスチドもしくは葉緑体のようなオルガネ
ラによるその取り込みに必要とされる。
【0087】「栄養要求性」は、微生物の成長、胞子形
成および結晶産生に必要な栄養要求を指す。本発明の目
的上、「栄養要求体」という用語は、本明細書では、成
長のためにリボフラビンの添加を必要とする生物体を意
味すると定義される。
成および結晶産生に必要な栄養要求を指す。本発明の目
的上、「栄養要求体」という用語は、本明細書では、成
長のためにリボフラビンの添加を必要とする生物体を意
味すると定義される。
【0088】「宿主細胞」および「宿主生物体」という
用語は、外来すなわち異種の遺伝子を受領しかつそれら
の遺伝子を発現して活性の遺伝子産物を産生することが
可能な細胞を指す。適する宿主細胞は細菌および真菌の
ような微生物、ならびに植物細胞を包含する。
用語は、外来すなわち異種の遺伝子を受領しかつそれら
の遺伝子を発現して活性の遺伝子産物を産生することが
可能な細胞を指す。適する宿主細胞は細菌および真菌の
ような微生物、ならびに植物細胞を包含する。
【0089】「ルマジンシンターゼ」すなわち「LS」
という用語は、「6,7−ジメチル−8−リビチルルマ
ジンシンターゼ」と互換可能に使用され、そして、オル
トリン酸および6,7−ジメチル−8−(1’−D−リ
ビチル)ルマジン(DMRL)を生じさせる、3,4−
ジヒドロキシ−2−ブタノン4−リン酸の4−リビチル
アミノ−5−アミノ−2,6−ジヒドロキシピリミジン
(RAADP)との縮合を触媒する植物もしくは真菌の
酵素を指す。
という用語は、「6,7−ジメチル−8−リビチルルマ
ジンシンターゼ」と互換可能に使用され、そして、オル
トリン酸および6,7−ジメチル−8−(1’−D−リ
ビチル)ルマジン(DMRL)を生じさせる、3,4−
ジヒドロキシ−2−ブタノン4−リン酸の4−リビチル
アミノ−5−アミノ−2,6−ジヒドロキシピリミジン
(RAADP)との縮合を触媒する植物もしくは真菌の
酵素を指す。
【0090】「リボフラビンシンターゼ」すなわち「R
S」という用語は、4−リビチルアミノ−5−アミノ−
2,6−ジヒドロキシピリミジン(RAADP)ととも
にリボフラビンおよび3,4−ジヒドロキシ−2−ブタ
ノン4−リン酸(DHBP)を生じさせる、6,7−ジ
メチル−8−(1’−D−リビチル)ルマジン(DMR
L)の不均化を触媒する植物もしくは真菌の酵素を指
す。
S」という用語は、4−リビチルアミノ−5−アミノ−
2,6−ジヒドロキシピリミジン(RAADP)ととも
にリボフラビンおよび3,4−ジヒドロキシ−2−ブタ
ノン4−リン酸(DHBP)を生じさせる、6,7−ジ
メチル−8−(1’−D−リビチル)ルマジン(DMR
L)の不均化を触媒する植物もしくは真菌の酵素を指
す。
【0091】「代謝活性」という用語は、成長を支持す
るのに必要とされる通常の細胞活性を指す。本明細書で
使用されるように、代謝活性を阻害することができる作
物保護化学物質のような作用物質もまた、一般に細胞の
成長を阻害することができる。
るのに必要とされる通常の細胞活性を指す。本明細書で
使用されるように、代謝活性を阻害することができる作
物保護化学物質のような作用物質もまた、一般に細胞の
成長を阻害することができる。
【0092】「本質的に類似の」という用語は、1個も
しくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が1個もしく
はそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、しかしその
DNA配列によりコードされるタンパク質の機能的特性
に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「本質的に類似
の」はまた、1個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の変化が、アンチセンスもしくは同時サプレッション(c
o-suppression)技術による遺伝子発現の変化を媒介する
その核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片も指
す。「本質的に類似の」はまた、アンチセンスもしくは
同時サプレッション技術による遺伝子発現の変化または
生じるタンパク質分子の機能的特性の変化を媒介する能
力について生じる転写物の機能的特性に本質的に影響を
及ぼさない、1個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の欠失もしくは挿入のような本発明の核酸断片の修飾も
指す。従って、本発明は特定の例示的配列以上を包含す
ることが理解される。
しくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が1個もしく
はそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、しかしその
DNA配列によりコードされるタンパク質の機能的特性
に影響を及ぼさない核酸断片を指す。「本質的に類似
の」はまた、1個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の変化が、アンチセンスもしくは同時サプレッション(c
o-suppression)技術による遺伝子発現の変化を媒介する
その核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片も指
す。「本質的に類似の」はまた、アンチセンスもしくは
同時サプレッション技術による遺伝子発現の変化または
生じるタンパク質分子の機能的特性の変化を媒介する能
力について生じる転写物の機能的特性に本質的に影響を
及ぼさない、1個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基
の欠失もしくは挿入のような本発明の核酸断片の修飾も
指す。従って、本発明は特定の例示的配列以上を包含す
ることが理解される。
【0093】「本質的部分」は、当業者による配列の人
的評価もしくはBLAST(基本的局所的整列検索ツー
ル(Basic Local Alignment Search Tool);アルチュー
ル(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990);w
ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/もまた参照)のようなアル
ゴリズムを使用するコンピュータで自動化された配列の
比較および同定のいずれかによりポリペプチドもしくは
遺伝子の推定の同定を与えるのに十分なそのポリペプチ
ドのアミノ酸配列もしくは遺伝子のヌクレオチド配列を
含んで成る、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列を指
す。一般に、10個もしくはそれ以上の隣接するアミノ
酸、すなわち30個もしくはそれ以上のヌクレオチドが、
ポリペプチドもしくは核酸配列を既知のタンパク質もし
くは遺伝子と相同と推定的に同定するために必要であ
る。さらに、ヌクレオチド配列に関して、20〜30個の隣
接するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブが、遺伝子同定(例えばサザンハイ
ブリダイゼーション)および単離(例えば細菌コロニー
もしくはバクテリオファージプラークのインシトゥハイ
ブリダイゼーション)の配列依存性の方法で使用されて
よい。加えて、短いオリゴヌクレオチド(一般に12塩基
もしくはより長い)が、そのプライマーを含んで成る特
定の核酸断片を得るためのPCRの増幅プライマーとし
て使用されてよい。従って、ヌクレオチド配列の「本質
的部分」は、その配列を含んで成る核酸断片の特異的同
定および/もしくは単離を与える配列を十分に含んで成
る。本明細書は、1個もしくはそれ以上の特定の植物タ
ンパク質をコードする部分的もしくは完全なアミノ酸お
よびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告され
るような配列の利益を有する当業者は、今や、当業者に
既知の目的上開示された配列の全部もしくは本質的部分
を使用しうる。従って、本発明は、付随する配列表に報
告されたような完全な配列、ならびに上に定義されたよ
うなそれらの配列の本質的部分を含んで成る。
的評価もしくはBLAST(基本的局所的整列検索ツー
ル(Basic Local Alignment Search Tool);アルチュー
ル(Altschul)ら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990);w
ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/もまた参照)のようなアル
ゴリズムを使用するコンピュータで自動化された配列の
比較および同定のいずれかによりポリペプチドもしくは
遺伝子の推定の同定を与えるのに十分なそのポリペプチ
ドのアミノ酸配列もしくは遺伝子のヌクレオチド配列を
含んで成る、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列を指
す。一般に、10個もしくはそれ以上の隣接するアミノ
酸、すなわち30個もしくはそれ以上のヌクレオチドが、
ポリペプチドもしくは核酸配列を既知のタンパク質もし
くは遺伝子と相同と推定的に同定するために必要であ
る。さらに、ヌクレオチド配列に関して、20〜30個の隣
接するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的オリゴヌ
クレオチドプローブが、遺伝子同定(例えばサザンハイ
ブリダイゼーション)および単離(例えば細菌コロニー
もしくはバクテリオファージプラークのインシトゥハイ
ブリダイゼーション)の配列依存性の方法で使用されて
よい。加えて、短いオリゴヌクレオチド(一般に12塩基
もしくはより長い)が、そのプライマーを含んで成る特
定の核酸断片を得るためのPCRの増幅プライマーとし
て使用されてよい。従って、ヌクレオチド配列の「本質
的部分」は、その配列を含んで成る核酸断片の特異的同
定および/もしくは単離を与える配列を十分に含んで成
る。本明細書は、1個もしくはそれ以上の特定の植物タ
ンパク質をコードする部分的もしくは完全なアミノ酸お
よびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告され
るような配列の利益を有する当業者は、今や、当業者に
既知の目的上開示された配列の全部もしくは本質的部分
を使用しうる。従って、本発明は、付随する配列表に報
告されたような完全な配列、ならびに上に定義されたよ
うなそれらの配列の本質的部分を含んで成る。
【0094】例えば、遺伝子発現のアンチセンス抑圧お
よび同時サプレッションは、遺伝子のコーディング領域
全体未満を表す核酸断片を使用して、および抑圧される
べき遺伝子と100%の同一性を共有しない核酸断片によ
り成し遂げられうることが、当該技術分野で公知であ
る。さらに、与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸
の産生をもたらすがしかしコードされたタンパク質の機
能的特性に影響しない遺伝子の変化は当該技術分野で公
知である。かように、疎水性アミノ酸であるアミノ酸ア
ラニンのコドンは、グリシンのような別のより小さく疎
水性の残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイ
シンのようなより大きく疎水性の残基をコードするコド
ンにより置き換えられてよい。同様に、グルタミン酸の
代わりにアスパラギン酸のような、1個の負に荷電した
残基の別のものへの、もしくはアルギニンの代わりにリ
シンのような1個の正に荷電した残基の別のものへの置
換をもたらす変化はまた、機能的に同等な産物を産生す
ることも期待され得る。タンパク質分子のN末端および
C末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化はまた、
そのタンパク質の活性を変えることが期待されないとみ
られる。提案された修飾のそれぞれは、コードされた産
物の生物学的活性の保持の決定でそうであるように、十
分に当該技術分野の慣例の技能内にある。さらに、当業
者は、本発明により包含される本質的に類似の配列はま
た、本明細書に例示される配列と緊縮条件下(0.1×S
SC、0.1%SDS、65℃)でハイブリダイゼーション
するそれらの能力によっても定義されることを認識す
る。本発明の好ましい本質的に類似の核酸断片は、その
DNA配列が本明細書で報告される核酸断片のDNA配
列に80%同一である核酸断片である。より好ましい核酸
断片は本明細書に報告される核酸断片のDNA配列に90
%同一である。本明細書に報告される核酸断片のDNA
配列に95%同一である核酸断片が最も好ましい。
よび同時サプレッションは、遺伝子のコーディング領域
全体未満を表す核酸断片を使用して、および抑圧される
べき遺伝子と100%の同一性を共有しない核酸断片によ
り成し遂げられうることが、当該技術分野で公知であ
る。さらに、与えられた部位で化学的に同等なアミノ酸
の産生をもたらすがしかしコードされたタンパク質の機
能的特性に影響しない遺伝子の変化は当該技術分野で公
知である。かように、疎水性アミノ酸であるアミノ酸ア
ラニンのコドンは、グリシンのような別のより小さく疎
水性の残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイ
シンのようなより大きく疎水性の残基をコードするコド
ンにより置き換えられてよい。同様に、グルタミン酸の
代わりにアスパラギン酸のような、1個の負に荷電した
残基の別のものへの、もしくはアルギニンの代わりにリ
シンのような1個の正に荷電した残基の別のものへの置
換をもたらす変化はまた、機能的に同等な産物を産生す
ることも期待され得る。タンパク質分子のN末端および
C末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化はまた、
そのタンパク質の活性を変えることが期待されないとみ
られる。提案された修飾のそれぞれは、コードされた産
物の生物学的活性の保持の決定でそうであるように、十
分に当該技術分野の慣例の技能内にある。さらに、当業
者は、本発明により包含される本質的に類似の配列はま
た、本明細書に例示される配列と緊縮条件下(0.1×S
SC、0.1%SDS、65℃)でハイブリダイゼーション
するそれらの能力によっても定義されることを認識す
る。本発明の好ましい本質的に類似の核酸断片は、その
DNA配列が本明細書で報告される核酸断片のDNA配
列に80%同一である核酸断片である。より好ましい核酸
断片は本明細書に報告される核酸断片のDNA配列に90
%同一である。本明細書に報告される核酸断片のDNA
配列に95%同一である核酸断片が最も好ましい。
【0095】「コドン縮重」は、コードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列に影響することなくヌクレオチド配
列の変動を可能にする遺伝暗号中の冗長性を指す。従っ
て、本発明は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、
配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列
番号38に述べられるようなLSもしくはRS生合成酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードするいずれかの核酸断片に関する。当業者は、
与えられたアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使
用において特定の宿主細胞により表される「コドンの偏
り」を十分に知っている。従って、宿主細胞中での改良
された発現のため遺伝子を合成する場合、そのコドン使
用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくよ
うに遺伝子を設計することが望ましい。
チドのアミノ酸配列に影響することなくヌクレオチド配
列の変動を可能にする遺伝暗号中の冗長性を指す。従っ
て、本発明は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、
配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列
番号38に述べられるようなLSもしくはRS生合成酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードするいずれかの核酸断片に関する。当業者は、
与えられたアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使
用において特定の宿主細胞により表される「コドンの偏
り」を十分に知っている。従って、宿主細胞中での改良
された発現のため遺伝子を合成する場合、そのコドン使
用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくよ
うに遺伝子を設計することが望ましい。
【0096】「パーセント同一性」という用語は、2種
のアミノ酸配列もしくは2種のヌクレオチド配列のいず
れかを比較する場合のアミノ酸もしくは塩基のいずれか
の同一の合致のパーセントを指す。
のアミノ酸配列もしくは2種のヌクレオチド配列のいず
れかを比較する場合のアミノ酸もしくは塩基のいずれか
の同一の合致のパーセントを指す。
【0097】「相補的」という用語は、相互にハイブリ
ダイゼーションすることが可能であるヌクレオチド塩基
の間の関係を記述するのに使用される。これゆえに、D
NAに関して、アデノシンはチミジンに相補的でありか
つシトシンはグアニンに相補的である。
ダイゼーションすることが可能であるヌクレオチド塩基
の間の関係を記述するのに使用される。これゆえに、D
NAに関して、アデノシンはチミジンに相補的でありか
つシトシンはグアニンに相補的である。
【0098】「合成遺伝子」は、当業者に既知の処置を
使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単
位から集成され得る。これらの基礎単位は連結されかつ
アニーリングされて遺伝子区分を形成し、これはその後
酵素的に集成されて遺伝子全体を構築する。DNAの配
列に関するところの「化学的に合成された」は、成分の
ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味す
る。DNAの人的な化学合成が十分に確立された処置を
使用して成し遂げられうるか、もしくは、自動化化学合
成が多数の商業的に入手可能な機械の1種を使用して実
施され得る。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏
りを反映するようなヌクレオチド配列の至適化を基礎と
して至適な遺伝子発現のため作られ得る。当業者は、コ
ドン使用頻度が宿主により好まれるコドンに偏らされる
場合、成功する遺伝子発現の見込みの真価を認める。好
ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合
は宿主細胞由来の遺伝子の検分を基礎とし得る。
使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単
位から集成され得る。これらの基礎単位は連結されかつ
アニーリングされて遺伝子区分を形成し、これはその後
酵素的に集成されて遺伝子全体を構築する。DNAの配
列に関するところの「化学的に合成された」は、成分の
ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味す
る。DNAの人的な化学合成が十分に確立された処置を
使用して成し遂げられうるか、もしくは、自動化化学合
成が多数の商業的に入手可能な機械の1種を使用して実
施され得る。従って、遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏
りを反映するようなヌクレオチド配列の至適化を基礎と
して至適な遺伝子発現のため作られ得る。当業者は、コ
ドン使用頻度が宿主により好まれるコドンに偏らされる
場合、成功する遺伝子発現の見込みの真価を認める。好
ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である場合
は宿主細胞由来の遺伝子の検分を基礎とし得る。
【0099】「遺伝子」は、コーディング配列に先立つ
(5’非翻訳配列)および後に続く(3’非翻訳配列)
調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸
断片を指す。「本来の遺伝子」はそれ自身の調節配列と
ともに天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ
遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコ
ーディング配列を含んで成る、生来の遺伝子でないいず
れかの遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる
起源由来である調節配列およびコーディング配列、もし
くは同一起源由来だがしかし天然に見出されるものと異
なる様式で配置される調節配列およびコーディング配列
を含んでよい。「内因性遺伝子」は生物体のゲノム中の
その天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺
伝子は宿主生物体中に通常は見出されない遺伝子を指す
が、しかしそれは遺伝子導入により宿主生物体に導入さ
れる。外来遺伝子は非本来の生物体に挿入された本来の
遺伝子もしくはキメラ遺伝子を含み得る。「トランス遺
伝子(transgene)」は形質転換処置によりゲノム中に導
入された遺伝子である。
(5’非翻訳配列)および後に続く(3’非翻訳配列)
調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸
断片を指す。「本来の遺伝子」はそれ自身の調節配列と
ともに天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ
遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコ
ーディング配列を含んで成る、生来の遺伝子でないいず
れかの遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる
起源由来である調節配列およびコーディング配列、もし
くは同一起源由来だがしかし天然に見出されるものと異
なる様式で配置される調節配列およびコーディング配列
を含んでよい。「内因性遺伝子」は生物体のゲノム中の
その天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺
伝子は宿主生物体中に通常は見出されない遺伝子を指す
が、しかしそれは遺伝子導入により宿主生物体に導入さ
れる。外来遺伝子は非本来の生物体に挿入された本来の
遺伝子もしくはキメラ遺伝子を含み得る。「トランス遺
伝子(transgene)」は形質転換処置によりゲノム中に導
入された遺伝子である。
【0100】「コーディング配列」は特定のアミノ酸配
列をコードするDNA配列を指す。「調節配列」は、コ
ーディング配列の上流(5’非翻訳配列)、内もしくは
下流(3’非翻訳配列)に配置されたヌクレオチド配列
を指し、また、これは、転写、RNAのプロセシングも
しくは安定性、または連合されたコーディング配列の翻
訳に影響する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダ
ー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を包
含しうる。
列をコードするDNA配列を指す。「調節配列」は、コ
ーディング配列の上流(5’非翻訳配列)、内もしくは
下流(3’非翻訳配列)に配置されたヌクレオチド配列
を指し、また、これは、転写、RNAのプロセシングも
しくは安定性、または連合されたコーディング配列の翻
訳に影響する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダ
ー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列を包
含しうる。
【0101】「プロモーター」はコーディング配列もし
くは機能性RNAの発現を制御することが可能なDNA
配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター
配列の3’に配置される。プロモーター配列は近位およ
びより遠位の上流要素から成り、後者の要素はしばしば
エンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激し得かつプロモーターの内
在的要素またはプロモーターのレベルもしくは組織特異
性を高めるよう挿入された異種要素でありうるDNA配
列である。プロモーターは本来の遺伝子からそっくりそ
のまま得られうるか、もしくは、天然に見出される多様
なプロモーター由来の多様な要素から成りうるか、また
は合成DNA区分さえ含みうる。多様なプロモーター
は、多様な組織もしくは細胞型または発達の多様な段階
で、あるいは多様な環境条件に反応して、遺伝子発現を
指図しうることが当業者により理解される。大部分の時
点で大部分の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーター
は普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞
中で有用な多様な型の新規プロモーターが定常的に発見
されており;多数の例はオカムロ(Okamuro)とゴールド
ベルグ(Goldberg)による編集物(Biochemistry of Plan
ts 15:1-82(1989))で見出されうる。大部分の場合には
調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、
多様な長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有
しうることがさらに認識される。
くは機能性RNAの発現を制御することが可能なDNA
配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター
配列の3’に配置される。プロモーター配列は近位およ
びより遠位の上流要素から成り、後者の要素はしばしば
エンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」
は、プロモーター活性を刺激し得かつプロモーターの内
在的要素またはプロモーターのレベルもしくは組織特異
性を高めるよう挿入された異種要素でありうるDNA配
列である。プロモーターは本来の遺伝子からそっくりそ
のまま得られうるか、もしくは、天然に見出される多様
なプロモーター由来の多様な要素から成りうるか、また
は合成DNA区分さえ含みうる。多様なプロモーター
は、多様な組織もしくは細胞型または発達の多様な段階
で、あるいは多様な環境条件に反応して、遺伝子発現を
指図しうることが当業者により理解される。大部分の時
点で大部分の細胞型で遺伝子を発現させるプロモーター
は普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞
中で有用な多様な型の新規プロモーターが定常的に発見
されており;多数の例はオカムロ(Okamuro)とゴールド
ベルグ(Goldberg)による編集物(Biochemistry of Plan
ts 15:1-82(1989))で見出されうる。大部分の場合には
調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、
多様な長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有
しうることがさらに認識される。
【0102】「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモ
ーター配列とコーディング配列との間に配置されるDN
A配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流
の完全にプロセシングされたmRNAに存在する。翻訳
リーダー配列はmRNAに対する一次転写物のプロセシ
ング、mRNAの安定性もしくは翻訳効率に影響を及ぼ
しうる。翻訳リーダー配列の例が記述されている(ター
ナー(Turner)ら、Mol.Biotech. 3:225(1995))。
ーター配列とコーディング配列との間に配置されるDN
A配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流
の完全にプロセシングされたmRNAに存在する。翻訳
リーダー配列はmRNAに対する一次転写物のプロセシ
ング、mRNAの安定性もしくは翻訳効率に影響を及ぼ
しうる。翻訳リーダー配列の例が記述されている(ター
ナー(Turner)ら、Mol.Biotech. 3:225(1995))。
【0103】「3’非翻訳配列」は、コーディング配列
の下流に配置されるDNA配列を指し、また、ポリアデ
ニル化認識配列、およびmRNAのプロセシングもしく
は遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナル
をコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグ
ナルは、通常、mRNA前駆体の3’端へのポリアデニ
ル酸域(tract)の付加に影響を及ぼすことにより特徴づ
けられる。多様な3’非翻訳配列の使用はインゲルブレ
ヒト(Ingelbrecht)ら、Plant Cell 1:671-680(1989)に
より例示される。
の下流に配置されるDNA配列を指し、また、ポリアデ
ニル化認識配列、およびmRNAのプロセシングもしく
は遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナル
をコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグ
ナルは、通常、mRNA前駆体の3’端へのポリアデニ
ル酸域(tract)の付加に影響を及ぼすことにより特徴づ
けられる。多様な3’非翻訳配列の使用はインゲルブレ
ヒト(Ingelbrecht)ら、Plant Cell 1:671-680(1989)に
より例示される。
【0104】「RNA転写物」は、DNA配列のRNA
ポリメラーゼで触媒される転写から生じる産物を指す。
RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである
場合はそれは一次転写物と称されるか、もしくは、それ
は一次転写物の転写後プロセリング由来のRNA配列で
あることができ、かつ、成熟RNAと称される。「メッ
センジャーRNA」(mRNA)は、イントロンを含ま
ずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るRNAを指
す。「cDNA」は、mRNAに相補的でありかつこれ
由来である二本鎖DNAを指す。「センス」RNAは、
mRNAを包含しそして従って細胞によりタンパク質に
翻訳され得るRNA転写物を指す。「アンチセンスRN
A」は、標的の一次転写物もしくはmRNAの全部もし
くは一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を封鎖す
るRNA転写物を指す(US 5,107,065)。アンチセンス
RNAの相補性は、特定の遺伝子転写物のいずれかの部
分、すなわち5’非翻訳配列、3’非翻訳配列、イント
ロンもしくはコーディング配列とでありうる。「機能性
RNA」は、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、
もしくは翻訳されないがそれでもなお細胞の過程に対し
影響を有する他のRNAを指す。
ポリメラーゼで触媒される転写から生じる産物を指す。
RNA転写物がDNA配列の完全な相補的コピーである
場合はそれは一次転写物と称されるか、もしくは、それ
は一次転写物の転写後プロセリング由来のRNA配列で
あることができ、かつ、成熟RNAと称される。「メッ
センジャーRNA」(mRNA)は、イントロンを含ま
ずかつ細胞によりタンパク質に翻訳され得るRNAを指
す。「cDNA」は、mRNAに相補的でありかつこれ
由来である二本鎖DNAを指す。「センス」RNAは、
mRNAを包含しそして従って細胞によりタンパク質に
翻訳され得るRNA転写物を指す。「アンチセンスRN
A」は、標的の一次転写物もしくはmRNAの全部もし
くは一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を封鎖す
るRNA転写物を指す(US 5,107,065)。アンチセンス
RNAの相補性は、特定の遺伝子転写物のいずれかの部
分、すなわち5’非翻訳配列、3’非翻訳配列、イント
ロンもしくはコーディング配列とでありうる。「機能性
RNA」は、アンチセンスRNA、リボザイムRNA、
もしくは翻訳されないがそれでもなお細胞の過程に対し
影響を有する他のRNAを指す。
【0105】「操作可能に連結される」という用語は、
一方の機能が他方により影響を及ぼされるような単一の
核酸断片上の核酸配列の連合を指す。例えば、プロモー
ターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼす
ことが可能である(すなわちコーディング配列がそのプ
ロモーターの転写制御下にある)場合にそのコーディン
グ配列と操作可能に連結される。コーディング配列は、
センスもしくはアンチセンスの向きで調節配列に操作可
能に連結され得る。
一方の機能が他方により影響を及ぼされるような単一の
核酸断片上の核酸配列の連合を指す。例えば、プロモー
ターは、それがコーディング配列の発現に影響を及ぼす
ことが可能である(すなわちコーディング配列がそのプ
ロモーターの転写制御下にある)場合にそのコーディン
グ配列と操作可能に連結される。コーディング配列は、
センスもしくはアンチセンスの向きで調節配列に操作可
能に連結され得る。
【0106】本明細書で使用されるところの「発現」と
いう用語は、本発明の核酸断片由来のセンス(mRN
A)もしくはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄
積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻
訳も指しうる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク
質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスRN
A転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常のすなわ
ち形質転換されない生物体での産生のレベルを越えるト
ランスジェニック生物体での遺伝子産物の産生を指す。
「同時サプレッション」は、同一のもしくは本質的に類
似の外来もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することが
可能なセンスRNA転写物の産生を指す(US 5,231,02
0)。
いう用語は、本発明の核酸断片由来のセンス(mRN
A)もしくはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄
積を指す。発現はまた、mRNAのポリペプチドへの翻
訳も指しうる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク
質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスRN
A転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常のすなわ
ち形質転換されない生物体での産生のレベルを越えるト
ランスジェニック生物体での遺伝子産物の産生を指す。
「同時サプレッション」は、同一のもしくは本質的に類
似の外来もしくは内因性遺伝子の発現を抑制することが
可能なセンスRNA転写物の産生を指す(US 5,231,02
0)。
【0107】「変えられたレベル」は、正常のすなわち
形質転換されない生物体のものと異なる量もしくは比率
での生物体における遺伝子産物(1種もしくは複数)の
産生を指す。
形質転換されない生物体のものと異なる量もしくは比率
での生物体における遺伝子産物(1種もしくは複数)の
産生を指す。
【0108】「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝形
質をもたらす、核酸断片の宿主生物体のゲノムへの導入
を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体
は「トランスジェニック」生物体と称される。植物の形
質転換法の例は、アグロバクテリウム属(Agrobacteriu
m)媒介性形質転換(デブレルク(De Blaerc)ら、Meth.En
zymol. 143:277(1987))および粒子加速(particle-acce
lerated)すなわち「ジーンガン(gene gun)」形質転換技
術(クライン(Klein)ら、Nature, London 327:70-73(19
87);US 4,945,050)を包含する。
質をもたらす、核酸断片の宿主生物体のゲノムへの導入
を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体
は「トランスジェニック」生物体と称される。植物の形
質転換法の例は、アグロバクテリウム属(Agrobacteriu
m)媒介性形質転換(デブレルク(De Blaerc)ら、Meth.En
zymol. 143:277(1987))および粒子加速(particle-acce
lerated)すなわち「ジーンガン(gene gun)」形質転換技
術(クライン(Klein)ら、Nature, London 327:70-73(19
87);US 4,945,050)を包含する。
【0109】「目的の化合物」および「試験化合物」
は、除草剤もしくは殺真菌剤の作物保護化学物質として
のその潜在能力を評価する本アッセイでスクリーニング
されている物質を指す。
は、除草剤もしくは殺真菌剤の作物保護化学物質として
のその潜在能力を評価する本アッセイでスクリーニング
されている物質を指す。
【0110】ホウレンソウLSが単離され、そして、当
業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウLSの
cDNAのヌクレオチド配列は配列番号1に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号2に提供される。他
の植物からのLS遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウLSの配列との無作為cDNA配列の比
較により同定され得る。
業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウLSの
cDNAのヌクレオチド配列は配列番号1に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号2に提供される。他
の植物からのLS遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウLSの配列との無作為cDNA配列の比
較により同定され得る。
【0111】タバコLSが単離され、そして、当業者に
公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェンバンク
(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列の比較
により同定されている。成熟タバコLSのcDNAのヌ
クレオチド配列は配列番号3に提供され、また、推定ア
ミノ酸配列は配列番号4に提供される。他の植物からの
LS遺伝子は、今や、本明細書に提供されるタバコLS
の配列との無作為cDNA配列の比較により同定され得
る。
公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェンバンク
(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列の比較
により同定されている。成熟タバコLSのcDNAのヌ
クレオチド配列は配列番号3に提供され、また、推定ア
ミノ酸配列は配列番号4に提供される。他の植物からの
LS遺伝子は、今や、本明細書に提供されるタバコLS
の配列との無作為cDNA配列の比較により同定され得
る。
【0112】アラビドプシスLSが単離され、そして、
当業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスL
SのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号5に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号6に提供され
る。他の植物からのLS遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスLSの配列との無作為cDNA
配列の比較により同定され得る。
当業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスL
SのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号5に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号6に提供され
る。他の植物からのLS遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスLSの配列との無作為cDNA
配列の比較により同定され得る。
【0113】マグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)LSが単離され、そして、当業者に公知のBLAS
Tアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為cDNA配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
LSのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号37に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号38に提供
される。他の真菌からのLS遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)LSの配列との無作為cDNA配列の比較により同
定され得る。
sea)LSが単離され、そして、当業者に公知のBLAS
Tアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為cDNA配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
LSのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号37に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号38に提供
される。他の真菌からのLS遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)LSの配列との無作為cDNA配列の比較により同
定され得る。
【0114】ホウレンソウRSが単離され、そして、当
業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウRSの
cDNAのヌクレオチド配列は配列番号7に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号8に提供される。他
の植物からのRS遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウRSの配列との無作為cDNA配列の比
較により同定され得る。
業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェン
バンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配列
の比較により同定されている。成熟ホウレンソウRSの
cDNAのヌクレオチド配列は配列番号7に提供され、
また、推定アミノ酸配列は配列番号8に提供される。他
の植物からのRS遺伝子は、今や、本明細書に提供され
るホウレンソウRSの配列との無作為cDNA配列の比
較により同定され得る。
【0115】アラビドプシスRSが単離され、そして、
当業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスR
SのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号9に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号10に提供され
る。他の植物からのRS遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスRSの配列との無作為cDNA
配列の比較により同定され得る。
当業者に公知のBLASTアルゴリズムを使用するジェ
ンバンク(GenBank)データベースとの無作為cDNA配
列の比較により同定されている。成熟アラビドプシスR
SのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号9に提供さ
れ、また、推定アミノ酸配列は配列番号10に提供され
る。他の植物からのRS遺伝子は、今や、本明細書に提
供されるアラビドプシスRSの配列との無作為cDNA
配列の比較により同定され得る。
【0116】マグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)RSが単離され、そして、当業者に公知のBLAS
Tアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為cDNA配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
RSのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号11に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号12に提供
される。他の真菌からのRS遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)RSの配列との無作為cDNA配列の比較により同
定され得る。
sea)RSが単離され、そして、当業者に公知のBLAS
Tアルゴリズムを使用するジェンバンク(GenBank)デー
タベースとの無作為cDNA配列の比較により同定され
ている。マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)
RSのcDNAのヌクレオチド配列は配列番号11に提
供され、また、推定アミノ酸配列は配列番号12に提供
される。他の真菌からのRS遺伝子は、今や、本明細書
に提供されるマグナポルテ グリセア(Magnaporthe gri
sea)RSの配列との無作為cDNA配列の比較により同
定され得る。
【0117】本発明の核酸断片が、同一もしくは他の植
物もしくは真菌種から相同的LSおよびRSをコードす
るcDNAおよび遺伝子を単離するのに使用されうる。
配列依存性プロトコールを使用する相同遺伝子の単離は
当該技術分野で公知である。配列依存性プロトコールの
例は、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅
技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくは
リガーゼ連鎖反応)の多様な用途により例示されるよう
なDNAおよびRNA増幅法を包含するがしかしこれら
に制限されない。
物もしくは真菌種から相同的LSおよびRSをコードす
るcDNAおよび遺伝子を単離するのに使用されうる。
配列依存性プロトコールを使用する相同遺伝子の単離は
当該技術分野で公知である。配列依存性プロトコールの
例は、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅
技術(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくは
リガーゼ連鎖反応)の多様な用途により例示されるよう
なDNAおよびRNA増幅法を包含するがしかしこれら
に制限されない。
【0118】例えば、cDNAもしくはゲノムDNAの
いずれかとしてのLSもしくはRS遺伝子は、DNAハ
イブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部
もしくは一部を使用して当業者に公知の方法論を使用す
るいずれかの所望の植物(もしくは真菌)からのライブ
ラリーをスクリーニングすることにより直接単離され得
る。本LSもしくはRS配列を基礎とする特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法に
より設計かつ合成され得る(マニアティス(Maniatis)、
上記)。さらに、全体の配列は、ランダムプライマー、
DNA標識、ニックトランスレーションもしくはエンド
ラベル技術のような当業者に既知の方法によりDNAプ
ローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用し
てRNAプローブを合成するのに直接使用され得る。加
えて、特異的プライマーは、本配列の一部もしくは完全
長を増幅するために設計かつ使用され得る。生じる増幅
産物は、増幅反応の間に直接標識され得るか、もしくは
増幅反応後に標識され得、そして適切な緊縮の条件下で
完全長のcDNAもしくはゲノム断片を単離するための
プローブとして使用され得る。
いずれかとしてのLSもしくはRS遺伝子は、DNAハ
イブリダイゼーションプローブとして本核酸断片の全部
もしくは一部を使用して当業者に公知の方法論を使用す
るいずれかの所望の植物(もしくは真菌)からのライブ
ラリーをスクリーニングすることにより直接単離され得
る。本LSもしくはRS配列を基礎とする特異的オリゴ
ヌクレオチドプローブは、当該技術分野で既知の方法に
より設計かつ合成され得る(マニアティス(Maniatis)、
上記)。さらに、全体の配列は、ランダムプライマー、
DNA標識、ニックトランスレーションもしくはエンド
ラベル技術のような当業者に既知の方法によりDNAプ
ローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用し
てRNAプローブを合成するのに直接使用され得る。加
えて、特異的プライマーは、本配列の一部もしくは完全
長を増幅するために設計かつ使用され得る。生じる増幅
産物は、増幅反応の間に直接標識され得るか、もしくは
増幅反応後に標識され得、そして適切な緊縮の条件下で
完全長のcDNAもしくはゲノム断片を単離するための
プローブとして使用され得る。
【0119】加えて、本核酸断片の2種の短い区分が、
DNAもしくはRNAから相同的LSもしくはRS遺伝
子をコードするより長い核酸断片を増幅するPCRプロ
トコールで使用されてよい。ポリメラーゼ連鎖反応もま
た、クローニングされた核酸断片のライブラリーで実施
されてよく、ここで一方のプライマーの配列は本核酸断
片由来であり、かつ、他方のプライマーの配列は植物の
LSもしくはRSをコードするmRNA前駆体の3’端
へのポリアデニル酸域の存在を利用する。あるいは、第
二のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列
を基礎としてよい。例えば、当業者は、RACEプロト
コール(フローマン(Frohman)ら、Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA 85:8998(1988))に従い、PCRを使用して転写
物の単一点と3’もしくは5’端との間の領域のコピー
を増幅することによりcDNAを生じさせ得る。3’お
よび5’の方向に向けられたプライマーが本配列から設
計され得る。商業的に入手可能な3’RACEもしくは
5’RACEシステム(BRL)を使用して、特異的
3’もしくは5’cDNA断片が単離され得る(オハラ
(Ohara)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673(198
9);ロー(Loh)ら、Science 243:217(1989))。3’およ
び5’RACE処置により生じられる産物が組み合わさ
れて完全長のcDNAを生じ得る(フローマン(Frohma
n)ら、Techniques 1:165(1989))。
DNAもしくはRNAから相同的LSもしくはRS遺伝
子をコードするより長い核酸断片を増幅するPCRプロ
トコールで使用されてよい。ポリメラーゼ連鎖反応もま
た、クローニングされた核酸断片のライブラリーで実施
されてよく、ここで一方のプライマーの配列は本核酸断
片由来であり、かつ、他方のプライマーの配列は植物の
LSもしくはRSをコードするmRNA前駆体の3’端
へのポリアデニル酸域の存在を利用する。あるいは、第
二のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列
を基礎としてよい。例えば、当業者は、RACEプロト
コール(フローマン(Frohman)ら、Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA 85:8998(1988))に従い、PCRを使用して転写
物の単一点と3’もしくは5’端との間の領域のコピー
を増幅することによりcDNAを生じさせ得る。3’お
よび5’の方向に向けられたプライマーが本配列から設
計され得る。商業的に入手可能な3’RACEもしくは
5’RACEシステム(BRL)を使用して、特異的
3’もしくは5’cDNA断片が単離され得る(オハラ
(Ohara)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673(198
9);ロー(Loh)ら、Science 243:217(1989))。3’およ
び5’RACE処置により生じられる産物が組み合わさ
れて完全長のcDNAを生じ得る(フローマン(Frohma
n)ら、Techniques 1:165(1989))。
【0120】最後に、本ヌクレオチドおよび推定アミノ
酸の配列の入手可能性が、cDNA発現ライブラリーの
免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の
部分を代表する合成ペプチドが合成されうる。これらの
ペプチドが、動物を免疫してこのアミノ酸配列を含んで
成るペプチドもしくはタンパク質に対する特異性をもつ
ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生する
のに使用され得る。これらの抗体はその後、cDNA発
現ライブラリーをスクリーニングして目的の完全長cD
NAクローンを単離するのに使用され得る(ラーナー(L
erner)ら、Adv.Immunol. 36:1(1984);マニアティス(Ma
niatis))。
酸の配列の入手可能性が、cDNA発現ライブラリーの
免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の
部分を代表する合成ペプチドが合成されうる。これらの
ペプチドが、動物を免疫してこのアミノ酸配列を含んで
成るペプチドもしくはタンパク質に対する特異性をもつ
ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生する
のに使用され得る。これらの抗体はその後、cDNA発
現ライブラリーをスクリーニングして目的の完全長cD
NAクローンを単離するのに使用され得る(ラーナー(L
erner)ら、Adv.Immunol. 36:1(1984);マニアティス(Ma
niatis))。
【0121】本発明の核酸断片はまた、本LSもしくは
RSタンパク質が通常より高もしくは低レベルで存在す
るトランスジェニック植物を創製するのにも使用されう
る。こうした操作は、考えられるところでは、リボフラ
ビン、それゆえに不可欠な補因子FADおよびFMNの
細胞内レベルを改変するとみられ、潜在的な商業的価値
の新規表現型を生ずる。あるいは、若干の応用において
は、特定の植物組織および/もしくは細胞型、またはそ
れらが通常は遭遇されないとみられる発達段階の間に、
本LSもしくはRSタンパク質を発現することが望まし
いであろう。
RSタンパク質が通常より高もしくは低レベルで存在す
るトランスジェニック植物を創製するのにも使用されう
る。こうした操作は、考えられるところでは、リボフラ
ビン、それゆえに不可欠な補因子FADおよびFMNの
細胞内レベルを改変するとみられ、潜在的な商業的価値
の新規表現型を生ずる。あるいは、若干の応用において
は、特定の植物組織および/もしくは細胞型、またはそ
れらが通常は遭遇されないとみられる発達段階の間に、
本LSもしくはRSタンパク質を発現することが望まし
いであろう。
【0122】本LSもしくはRSの過剰発現は、最初
に、LSもしくはRSコーディング領域が発達の所望の
段階で所望の組織中での遺伝子発現を指図することが可
能なプロモーターに操作可能に連結される、キメラ遺伝
子を構築することにより成し遂げられうる。便宜性の理
由から、このキメラ遺伝子は同一遺伝子由来のプロモー
ター配列および翻訳リーダー配列を含みうる。3’非翻
訳配列をコードする転写終止シグナルもまた提供されな
ければならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を
助長するため、1個もしくはそれ以上のイントロンも含
みうる。
に、LSもしくはRSコーディング領域が発達の所望の
段階で所望の組織中での遺伝子発現を指図することが可
能なプロモーターに操作可能に連結される、キメラ遺伝
子を構築することにより成し遂げられうる。便宜性の理
由から、このキメラ遺伝子は同一遺伝子由来のプロモー
ター配列および翻訳リーダー配列を含みうる。3’非翻
訳配列をコードする転写終止シグナルもまた提供されな
ければならない。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を
助長するため、1個もしくはそれ以上のイントロンも含
みうる。
【0123】本キメラ遺伝子を含んで成るプラスミドベ
クターがその後構築され得る。プラスミドベクターの選
択は宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方
法に依存性である。当業者は、キメラ遺伝子を含有する
宿主細胞を成功して形質転換し、選択しそして増殖させ
るためにプラスミドベクターに存在しなければならない
遺伝子要素を十分に知っている。当業者はまた、多様な
独立の形質転換事象が多様なレベルおよびパターンの発
現をもたらすことができること(ジョーンズ(Jones)
ら、EMBO J. 4:2411-2418(1985);デアルメイダ(De Alm
eida)ら、Mol. Gen. Genetics 218:78-86(1989))、そ
して従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパ
ターンを表す系列(line)を得るためにスクリーニングさ
れなければならないことも認識することができる。こう
したスクリーニングは、DNAのサザン分析、mRNA
発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析
もしくは表現型分析により成し遂げられうる。
クターがその後構築され得る。プラスミドベクターの選
択は宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方
法に依存性である。当業者は、キメラ遺伝子を含有する
宿主細胞を成功して形質転換し、選択しそして増殖させ
るためにプラスミドベクターに存在しなければならない
遺伝子要素を十分に知っている。当業者はまた、多様な
独立の形質転換事象が多様なレベルおよびパターンの発
現をもたらすことができること(ジョーンズ(Jones)
ら、EMBO J. 4:2411-2418(1985);デアルメイダ(De Alm
eida)ら、Mol. Gen. Genetics 218:78-86(1989))、そ
して従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパ
ターンを表す系列(line)を得るためにスクリーニングさ
れなければならないことも認識することができる。こう
したスクリーニングは、DNAのサザン分析、mRNA
発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析
もしくは表現型分析により成し遂げられうる。
【0124】若干の応用については、LSもしくはRS
タンパク質を異なる細胞区画に向けること、または細胞
からのそれらの分泌を助長することが有用でありうる。
かように、上述されたキメラ遺伝子は、それらのコーデ
ィング領域への適切な細胞内性もしくは細胞外性に標的
化された配列の付加によりさらに修飾されうることが予
見される。これらは、葉緑体輸送ペプチド(キーグスト
ラ(Keegstra)ら、Cell56:247-253(1989))、タンパク質
を小胞体に向かわせるシグナル配列(クリスピールス(C
hrispeels)ら、Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. 42:
21-53(1991))および核局在化シグナル(ライケール(Ra
ikhel)ら、Plant Phys. 100:1627-1632(1992))を包含
する。引用される参考文献はこれらのそれぞれの例を与
える一方、この列挙は網羅的でなく、そして利用すべき
より多くの目標を向けるシグナルが将来発見されうる。
下述されるように、植物のLSおよびRSは、双方とも
それらのN末端に葉緑体に対して標的化された配列を伴
う核にコードされた前駆体タンパク質として合成される
ことが、本発明において示される。従って、これらのタ
ンパク質は他の細胞区画に向かわせるための良好な候補
であるとみられる。あるいは、それらの葉緑体輸送ペプ
チドを単に除去することにより、LSもしくはRSを独
占的に植物細胞質で発現させることが可能であるはずで
ある。
タンパク質を異なる細胞区画に向けること、または細胞
からのそれらの分泌を助長することが有用でありうる。
かように、上述されたキメラ遺伝子は、それらのコーデ
ィング領域への適切な細胞内性もしくは細胞外性に標的
化された配列の付加によりさらに修飾されうることが予
見される。これらは、葉緑体輸送ペプチド(キーグスト
ラ(Keegstra)ら、Cell56:247-253(1989))、タンパク質
を小胞体に向かわせるシグナル配列(クリスピールス(C
hrispeels)ら、Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. 42:
21-53(1991))および核局在化シグナル(ライケール(Ra
ikhel)ら、Plant Phys. 100:1627-1632(1992))を包含
する。引用される参考文献はこれらのそれぞれの例を与
える一方、この列挙は網羅的でなく、そして利用すべき
より多くの目標を向けるシグナルが将来発見されうる。
下述されるように、植物のLSおよびRSは、双方とも
それらのN末端に葉緑体に対して標的化された配列を伴
う核にコードされた前駆体タンパク質として合成される
ことが、本発明において示される。従って、これらのタ
ンパク質は他の細胞区画に向かわせるための良好な候補
であるとみられる。あるいは、それらの葉緑体輸送ペプ
チドを単に除去することにより、LSもしくはRSを独
占的に植物細胞質で発現させることが可能であるはずで
ある。
【0125】いくつかの応用に関しては植物でのLSも
しくはRS遺伝子の発現を低下させるもしくは排除する
こともまた望ましいことができる。これを成し遂げるた
め、LSもしくはRSのアンチセンスもしくは共抑制の
ため設計されたキメラ遺伝子が、これらの酵素の部分を
コードする遺伝子もしくは遺伝子断片を植物プロモータ
ー配列に連結することにより構築され得る。従って、L
SもしくはRSの全部もしくは一部のアンチセンスRN
Aを発現するよう設計されたキメラ遺伝子が、LSもし
くはRSの遺伝子もしくは遺伝子断片を逆方向で植物プ
ロモーター配列に連結することにより構築され得る。同
時サプレッションもしくはアンチセンスキメラ遺伝子構
築物が、その後、公知の形質転換プロトコールを介して
植物中に導入されてLSもしくはRS遺伝子産物の内因
性発現を低下もしくは排除し得る。
しくはRS遺伝子の発現を低下させるもしくは排除する
こともまた望ましいことができる。これを成し遂げるた
め、LSもしくはRSのアンチセンスもしくは共抑制の
ため設計されたキメラ遺伝子が、これらの酵素の部分を
コードする遺伝子もしくは遺伝子断片を植物プロモータ
ー配列に連結することにより構築され得る。従って、L
SもしくはRSの全部もしくは一部のアンチセンスRN
Aを発現するよう設計されたキメラ遺伝子が、LSもし
くはRSの遺伝子もしくは遺伝子断片を逆方向で植物プ
ロモーター配列に連結することにより構築され得る。同
時サプレッションもしくはアンチセンスキメラ遺伝子構
築物が、その後、公知の形質転換プロトコールを介して
植物中に導入されてLSもしくはRS遺伝子産物の内因
性発現を低下もしくは排除し得る。
【0126】異種宿主細胞、とりわけ微生物宿主細胞で
産生されたLSもしくはRSタンパク質は、当業者に公
知の方法によりこの酵素に対する抗体を調製するのに使
用され得る。この抗体は、インシトゥで細胞中で、もし
くはインビトロで細胞抽出物中で、本LSもしくはRS
タンパク質を検出するのに有用であるとみられる。本L
SもしくはRSタンパク質の産生に好ましい異種宿主細
胞は微生物宿主である。微生物発現系、および外来タン
パク質の高レベル発現を指図する調節配列を含有する発
現ベクターは当業者に公知である。これらのいずれも、
本LSもしくはRSの産生のためのキメラ遺伝子を構築
するのに使用され得る。これらのキメラ遺伝子はその
後、形質転換を介して適切な微生物中に導入されて本L
SもしくはRSタンパク質の高レベル発現を提供し得
る。
産生されたLSもしくはRSタンパク質は、当業者に公
知の方法によりこの酵素に対する抗体を調製するのに使
用され得る。この抗体は、インシトゥで細胞中で、もし
くはインビトロで細胞抽出物中で、本LSもしくはRS
タンパク質を検出するのに有用であるとみられる。本L
SもしくはRSタンパク質の産生に好ましい異種宿主細
胞は微生物宿主である。微生物発現系、および外来タン
パク質の高レベル発現を指図する調節配列を含有する発
現ベクターは当業者に公知である。これらのいずれも、
本LSもしくはRSの産生のためのキメラ遺伝子を構築
するのに使用され得る。これらのキメラ遺伝子はその
後、形質転換を介して適切な微生物中に導入されて本L
SもしくはRSタンパク質の高レベル発現を提供し得
る。
【0127】本LSおよびRS酵素の発現に適する微生
物宿主細胞は、これらの酵素をコードするキメラ遺伝子
の発現が可能であるいかなる細胞も包含する。こうした
細胞は、例えば酵母(例えばアスペルギルス属(Aspergi
llus)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(P
ichia)、カンジダ属(Candida)およびハンセヌラ属(Hans
enula))、バチルス属(Bacillus)ならびに腸内細菌の構
成員(例えばエシェリキア属(Escherichia)、サルモネ
ラ属(Salmonella)およびシゲラ属(Shigella))を包含す
る細菌および真菌双方を包含することができる。こうし
た宿主の形質転換および外来タンパク質の発現の方法は
当該技術分野で公知であり、また、適するプロトコール
の例は、Manual of Methods for General Bacteriology
(ゲルハルト(Gerhardt)ら、編、アメリカ微生物学会(A
merican Society for Microbiology)、ワシントンDC
(1994))、もしくはブルック(Brook, T.D.)、Biotechno
logy: A Textbook of Industrial Microbiology、第2
版、サイナウアー アソシエーツ インク(Sinauer Ass
ociates, Inc.)、メーン州サンダーランド(1989))に見
出されうる。
物宿主細胞は、これらの酵素をコードするキメラ遺伝子
の発現が可能であるいかなる細胞も包含する。こうした
細胞は、例えば酵母(例えばアスペルギルス属(Aspergi
llus)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(P
ichia)、カンジダ属(Candida)およびハンセヌラ属(Hans
enula))、バチルス属(Bacillus)ならびに腸内細菌の構
成員(例えばエシェリキア属(Escherichia)、サルモネ
ラ属(Salmonella)およびシゲラ属(Shigella))を包含す
る細菌および真菌双方を包含することができる。こうし
た宿主の形質転換および外来タンパク質の発現の方法は
当該技術分野で公知であり、また、適するプロトコール
の例は、Manual of Methods for General Bacteriology
(ゲルハルト(Gerhardt)ら、編、アメリカ微生物学会(A
merican Society for Microbiology)、ワシントンDC
(1994))、もしくはブルック(Brook, T.D.)、Biotechno
logy: A Textbook of Industrial Microbiology、第2
版、サイナウアー アソシエーツ インク(Sinauer Ass
ociates, Inc.)、メーン州サンダーランド(1989))に見
出されうる。
【0128】適する微生物宿主細胞の形質転換に有用な
ベクターもしくはカセットは当該技術分野で公知であ
る。典型的には、このベクターもしくはカセットは、関
連する遺伝子の転写および翻訳を指図する配列、選択可
能なマーカー、ならびに自律複製もしくは染色体組込み
を可能にする配列を含有する。適するベクターは、転写
開始制御をもつ遺伝子の5’の領域および転写終止を制
御するDNA断片の3’の領域を含んで成る。双方の制
御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子由来で
ある場合が最も好ましいが、とは言えこうした制御領域
は産生宿主として選ばれた特定の種の本来の遺伝子由来
である必要がないことが理解されるべきである。
ベクターもしくはカセットは当該技術分野で公知であ
る。典型的には、このベクターもしくはカセットは、関
連する遺伝子の転写および翻訳を指図する配列、選択可
能なマーカー、ならびに自律複製もしくは染色体組込み
を可能にする配列を含有する。適するベクターは、転写
開始制御をもつ遺伝子の5’の領域および転写終止を制
御するDNA断片の3’の領域を含んで成る。双方の制
御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子由来で
ある場合が最も好ましいが、とは言えこうした制御領域
は産生宿主として選ばれた特定の種の本来の遺伝子由来
である必要がないことが理解されるべきである。
【0129】所望の宿主細胞において、RSもしくはL
S酵素をコードする遺伝子の発現に至らせる(drive)の
に有用である、開始制御領域すなわちプロモーターは多
数であり、かつ当業者に馴染みである。事実上、CYC
1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PG
K、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、UR
A3、LEU2、ENO、TP1(サッカロミセス属(S
accharomyces)での発現に有用);AOX1(ピキア属
(Pichia)での発現に有用);ならびにlac、trp、
1PL、1PR、T7、tacおよびtrc(大腸菌(E. c
oli)での発現に有用)を包含するがこれらに制限されな
い、これらの遺伝子を動かす(drive)ことが可能ないか
なるプロモーターも本発明に適する。終止制御領域もま
た好ましい宿主の本来の多様な遺伝子由来でありうる。
場合によっては、終止部位は不必要であることができる
が、しかしながら包含される場合が最も好ましい。
S酵素をコードする遺伝子の発現に至らせる(drive)の
に有用である、開始制御領域すなわちプロモーターは多
数であり、かつ当業者に馴染みである。事実上、CYC
1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PG
K、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、UR
A3、LEU2、ENO、TP1(サッカロミセス属(S
accharomyces)での発現に有用);AOX1(ピキア属
(Pichia)での発現に有用);ならびにlac、trp、
1PL、1PR、T7、tacおよびtrc(大腸菌(E. c
oli)での発現に有用)を包含するがこれらに制限されな
い、これらの遺伝子を動かす(drive)ことが可能ないか
なるプロモーターも本発明に適する。終止制御領域もま
た好ましい宿主の本来の多様な遺伝子由来でありうる。
場合によっては、終止部位は不必要であることができる
が、しかしながら包含される場合が最も好ましい。
【0130】本LSおよびRSタンパク質は、除草剤も
しくは殺真菌剤として有用と判明しうる特定の化学物質
の設計および/もしくは同定を助長する道具として使用
され得る。これは、精製された本植物タンパク質由来で
ある構造的および/もしくは機構的情報から生じる強力
な酵素阻害剤の合理的設計および合成、または化学物質
のライブラリーの無作為インビトロスクリーニングのい
ずれかにより達成され得る。LSおよびRSは植物およ
び微生物のリボフラビン生合成の最後の2段階を触媒
し、また、多数の重要な酸化還元酵素の不可欠な補欠分
子族であるFADおよびFMNの産生に必要とされる。
結果として、本明細書に記述されるLSもしくはRSタ
ンパク質のいずれかの有意のインビボ阻害が、細胞の代
謝をひどく損ないかつおそらく植物もしくは真菌の死を
もたらすことができることが予期される。
しくは殺真菌剤として有用と判明しうる特定の化学物質
の設計および/もしくは同定を助長する道具として使用
され得る。これは、精製された本植物タンパク質由来で
ある構造的および/もしくは機構的情報から生じる強力
な酵素阻害剤の合理的設計および合成、または化学物質
のライブラリーの無作為インビトロスクリーニングのい
ずれかにより達成され得る。LSおよびRSは植物およ
び微生物のリボフラビン生合成の最後の2段階を触媒
し、また、多数の重要な酸化還元酵素の不可欠な補欠分
子族であるFADおよびFMNの産生に必要とされる。
結果として、本明細書に記述されるLSもしくはRSタ
ンパク質のいずれかの有意のインビボ阻害が、細胞の代
謝をひどく損ないかつおそらく植物もしくは真菌の死を
もたらすことができることが予期される。
【0131】本発明の核酸断片の全部もしくは一部はま
た、それらが一部である遺伝子を遺伝子的におよび物理
的にマッピングするためのプローブ、ならびに本LSも
しくはRSの発現に連結される特徴についてのマーカー
としても使用されうる。こうした情報は、所望の表現型
をもつ系列を開発するための植物育種において有用であ
りうる。
た、それらが一部である遺伝子を遺伝子的におよび物理
的にマッピングするためのプローブ、ならびに本LSも
しくはRSの発現に連結される特徴についてのマーカー
としても使用されうる。こうした情報は、所望の表現型
をもつ系列を開発するための植物育種において有用であ
りうる。
【0132】例えば、本核酸断片は制限断片長多型(R
FLP)マーカーとして使用されうる。制限酵素切断さ
れた植物ゲノムDNAのサザンブロット(マニアティス
(Maniatis))が本発明の核酸断片でプロービングされる
(probe)。生じるバンド形成(banding)パターンは、その
後、遺伝子地図を構築するために、マップメーカー(Map
Maker)(ランダー(Lander)ら、Genomics 1:174-181(198
7))のようなコンピュータプログラムを使用する遺伝子
分析にかけられうる。加えて、本発明の核酸断片は、定
義された遺伝子交差(genetic cross)の親および子孫を
表す一組の個体の制限エンドヌクレアーゼ処理されたゲ
ノムDNAを含有するサザンブロットに探りを入れるの
に使用されうる。DNA多型の分離が示され、かつ、こ
の集団を使用して以前に得られた遺伝子地図における本
核酸配列の位置を計算するのに使用される(ボトシュタ
イン(Botstein)ら、Am. J. Hum. Genet. 32:314-331(19
80))。
FLP)マーカーとして使用されうる。制限酵素切断さ
れた植物ゲノムDNAのサザンブロット(マニアティス
(Maniatis))が本発明の核酸断片でプロービングされる
(probe)。生じるバンド形成(banding)パターンは、その
後、遺伝子地図を構築するために、マップメーカー(Map
Maker)(ランダー(Lander)ら、Genomics 1:174-181(198
7))のようなコンピュータプログラムを使用する遺伝子
分析にかけられうる。加えて、本発明の核酸断片は、定
義された遺伝子交差(genetic cross)の親および子孫を
表す一組の個体の制限エンドヌクレアーゼ処理されたゲ
ノムDNAを含有するサザンブロットに探りを入れるの
に使用されうる。DNA多型の分離が示され、かつ、こ
の集団を使用して以前に得られた遺伝子地図における本
核酸配列の位置を計算するのに使用される(ボトシュタ
イン(Botstein)ら、Am. J. Hum. Genet. 32:314-331(19
80))。
【0133】遺伝子マッピングでの使用のための植物遺
伝子由来プローブの調製および使用は、ベルナツキ(Ber
natzky)およびタンクスレー(Tanksley)により記述され
る(Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41(1986))。多
数の出版物が、上に概説された方法論もしくはその変法
を使用する特異的cDNAクローンの遺伝子マッピング
を記述する。例えば、F2交雑集団、戻し交雑集団、無
作為交配集団(randomlymated population)、近同遺伝子
系の系列(near isogenic lines)および他の個体の組が
マッピングに使用されうる。こうした方法論は当業者に
公知である。
伝子由来プローブの調製および使用は、ベルナツキ(Ber
natzky)およびタンクスレー(Tanksley)により記述され
る(Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41(1986))。多
数の出版物が、上に概説された方法論もしくはその変法
を使用する特異的cDNAクローンの遺伝子マッピング
を記述する。例えば、F2交雑集団、戻し交雑集団、無
作為交配集団(randomlymated population)、近同遺伝子
系の系列(near isogenic lines)および他の個体の組が
マッピングに使用されうる。こうした方法論は当業者に
公知である。
【0134】本核酸配列由来の核酸プローブは物理的マ
ッピングにもまた使用されうる(すなわち物理的地図上
の配列の配置;ホーエイゼル(Hoheisel)ら、Nonmammali
an Genomic Analysis: A Practical Guide、pp.319-34
6、アカデミックプレス(1996)およびその中に引用され
る参考文献を参照)。
ッピングにもまた使用されうる(すなわち物理的地図上
の配列の配置;ホーエイゼル(Hoheisel)ら、Nonmammali
an Genomic Analysis: A Practical Guide、pp.319-34
6、アカデミックプレス(1996)およびその中に引用され
る参考文献を参照)。
【0135】別の態様において、本核酸配列由来の核酸
プローブが、直接蛍光インシトゥハイブリダイゼーショ
ン(FISH)マッピングで使用されうる。FISHマ
ッピングの現在の方法は大型のクローン(数ないし数百
kb)の使用を好むとは言え、感度における改良がより短
いプローブを使用するFISHマッピングの実施を可能
にしうる。
プローブが、直接蛍光インシトゥハイブリダイゼーショ
ン(FISH)マッピングで使用されうる。FISHマ
ッピングの現在の方法は大型のクローン(数ないし数百
kb)の使用を好むとは言え、感度における改良がより短
いプローブを使用するFISHマッピングの実施を可能
にしうる。
【0136】遺伝子および物理的マッピングの多様な核
酸増幅を基礎とする方法が、本核酸配列を使用して実施
されうる。例は、対立遺伝子特異的増幅、PCR増幅断
片の多型(CAPS)、対立遺伝子特異的連結、ヌクレ
オチド伸長反応、照射ハイブリッドマッピング(Radiati
on Hybrid Mapping)およびハッピーマッピング(HappyMa
pping)を包含する。これらの方法に関して、核酸断片の
配列は、増幅反応もしくはプライマー伸長反応での使用
のためのプライマー対を設計かつ調製するのに使用され
る。こうしたプライマーの設計は当業者に公知である。
PCRを基礎とした遺伝子マッピングを使用する方法に
おいて、本核酸配列に対応する領域でのマッピング交差
(mapping cross)の親の間のDNA配列の差異を同定す
ることが必要でありうる。これは、しかしながら、マッ
ピング法には一般に必要でない。こうした情報は所望の
表現型をもつ系列を開発するための植物育種において有
用でありうる。
酸増幅を基礎とする方法が、本核酸配列を使用して実施
されうる。例は、対立遺伝子特異的増幅、PCR増幅断
片の多型(CAPS)、対立遺伝子特異的連結、ヌクレ
オチド伸長反応、照射ハイブリッドマッピング(Radiati
on Hybrid Mapping)およびハッピーマッピング(HappyMa
pping)を包含する。これらの方法に関して、核酸断片の
配列は、増幅反応もしくはプライマー伸長反応での使用
のためのプライマー対を設計かつ調製するのに使用され
る。こうしたプライマーの設計は当業者に公知である。
PCRを基礎とした遺伝子マッピングを使用する方法に
おいて、本核酸配列に対応する領域でのマッピング交差
(mapping cross)の親の間のDNA配列の差異を同定す
ることが必要でありうる。これは、しかしながら、マッ
ピング法には一般に必要でない。こうした情報は所望の
表現型をもつ系列を開発するための植物育種において有
用でありうる。
【0137】
【実施例】本発明は以下の実施例でさらに定義され、こ
こで、別の方法で言明されない限り、全ての割合および
パーセントは重量であり、かつ、温度は摂氏である。こ
れらの実施例は本発明の好ましい態様を示す一方、具体
的な説明としてのみ与えられることが理解されるべきで
ある。上の論考及びこれらの実施例から、当業者は本発
明の本質の特徴を確かめ得、また、その技術思想および
範囲から離れることなく、それを多様な使用および条件
に適合させるよう本発明の多様な変更および改変をなし
得る。
こで、別の方法で言明されない限り、全ての割合および
パーセントは重量であり、かつ、温度は摂氏である。こ
れらの実施例は本発明の好ましい態様を示す一方、具体
的な説明としてのみ与えられることが理解されるべきで
ある。上の論考及びこれらの実施例から、当業者は本発
明の本質の特徴を確かめ得、また、その技術思想および
範囲から離れることなく、それを多様な使用および条件
に適合させるよう本発明の多様な変更および改変をなし
得る。
【0138】ここで使用される標準的な組換えDNAお
よび分子クローニングの技術は当該技術分野で公知であ
ることができ、また、サンブルック(Sambrook, J.)、フ
リッチュ(Fritsch, E.F.)とマニアティス(Maniatis,
T.)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(C
old Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプ
リングハーバー、1989;ならびに、シルハヴィ(T.J. Si
lhavy)、ベナン(M.L. Bennan)とエンクィスト(L.W.Enqu
ist)、Experiments with Gene Fusions、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー プレス(Cold Spring
Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド
スプリング(1984)およびアウスベル(Ausubel, F.M.)
ら、Current Protocols in Molecular Biology、グリー
ン パブリッシング アソシエーツ(Greene Publishing
Assoc.)およびウィレイ インターサイエンス(Wiley-I
nterscience)により出版(1987)により記述される。
よび分子クローニングの技術は当該技術分野で公知であ
ることができ、また、サンブルック(Sambrook, J.)、フ
リッチュ(Fritsch, E.F.)とマニアティス(Maniatis,
T.)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コー
ルド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(C
old Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプ
リングハーバー、1989;ならびに、シルハヴィ(T.J. Si
lhavy)、ベナン(M.L. Bennan)とエンクィスト(L.W.Enqu
ist)、Experiments with Gene Fusions、コールド ス
プリング ハーバーラボラトリー プレス(Cold Spring
Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド
スプリング(1984)およびアウスベル(Ausubel, F.M.)
ら、Current Protocols in Molecular Biology、グリー
ン パブリッシング アソシエーツ(Greene Publishing
Assoc.)およびウィレイ インターサイエンス(Wiley-I
nterscience)により出版(1987)により記述される。
【0139】遺伝子配列の操作は、ジェネティクス コ
ンピュータ グループ インク(Genetics Computer Gro
up Inc.)から入手可能なプログラム一式(ウィスコンシ
ンパッケージ バージョン9.0、ジェネティクス コン
ピュータ グループ(Genetics Computer Group)(GC
G)、ウィスコンシン州マディソン)を使用して成し遂
げられた。
ンピュータ グループ インク(Genetics Computer Gro
up Inc.)から入手可能なプログラム一式(ウィスコンシ
ンパッケージ バージョン9.0、ジェネティクス コン
ピュータ グループ(Genetics Computer Group)(GC
G)、ウィスコンシン州マディソン)を使用して成し遂
げられた。
【0140】略語の意味は以下のようである。すなわち
「sec」は秒(1もしくは複数)を意味し、「mi
n」は分(1もしくは複数)を意味し、「h」は時間
(1もしくは複数)を意味し、「d」は日(1もしくは
複数)を意味し、「μl」はマイクロリットルを意味
し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットル
を意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモ
ル濃度を意味し、「mmol」はミリモル(1もしくは複
数)を意味する。
「sec」は秒(1もしくは複数)を意味し、「mi
n」は分(1もしくは複数)を意味し、「h」は時間
(1もしくは複数)を意味し、「d」は日(1もしくは
複数)を意味し、「μl」はマイクロリットルを意味
し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットル
を意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモ
ル濃度を意味し、「mmol」はミリモル(1もしくは複
数)を意味する。
【0141】実施例1 大腸菌(E. coli)LSおよびRSのPCRクローニング 遺伝子特異的PCRプライマーを使用して、高コピー数
プラスミドへの後の連結のためのそれらの隣接領域に唯
一の制限酵素切断部位を付加しつつ、ゲノムDNAから
大腸菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子を増幅した。こ
の目的上使用されたプライマーは、大腸菌(E. coli)L
SおよびRS遺伝子(それぞれジェンバンク(GenBank)
受託番号X64395およびX60109)の公表され
たDNA配列を基礎とし、かつ、以下のヌクレオチドか
ら成った。すなわち プライマー1(配列番号13):5’−CGA AGG
AAG Acc atg gCC ATT ATT
GAA GCT AAC GTT GC−3’ プライマー2(配列番号14):5’−ATC TTA
CTg tcg acT TCA GGC CTT
GAT GGC TTT C−3’ プライマー3(配列番号15):5’−ACT CAT
TTA cca tgg CTA CGG GGA
TTG TAC AGG GC−3’ プライマー4(配列番号16):5’−ATC TTA
CTg tcg acT TCA GGC TTC
TGT GCC TGG TT−3’ 下線をつけられた塩基は標的遺伝子にハイブリダイゼー
ションする一方、小文字はPCRプライマーの端に付加
された制限酵素切断部位(NcoIもしくはSalI)
を示す。
プラスミドへの後の連結のためのそれらの隣接領域に唯
一の制限酵素切断部位を付加しつつ、ゲノムDNAから
大腸菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子を増幅した。こ
の目的上使用されたプライマーは、大腸菌(E. coli)L
SおよびRS遺伝子(それぞれジェンバンク(GenBank)
受託番号X64395およびX60109)の公表され
たDNA配列を基礎とし、かつ、以下のヌクレオチドか
ら成った。すなわち プライマー1(配列番号13):5’−CGA AGG
AAG Acc atg gCC ATT ATT
GAA GCT AAC GTT GC−3’ プライマー2(配列番号14):5’−ATC TTA
CTg tcg acT TCA GGC CTT
GAT GGC TTT C−3’ プライマー3(配列番号15):5’−ACT CAT
TTA cca tgg CTA CGG GGA
TTG TAC AGG GC−3’ プライマー4(配列番号16):5’−ATC TTA
CTg tcg acT TCA GGC TTC
TGT GCC TGG TT−3’ 下線をつけられた塩基は標的遺伝子にハイブリダイゼー
ションする一方、小文字はPCRプライマーの端に付加
された制限酵素切断部位(NcoIもしくはSalI)
を示す。
【0142】LS遺伝子の増幅は、プライマー1および
2、ならびに大腸菌(E. coli)株W3110(キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978))からのゲノムDNAを使用して達成した。プ
ライマー1は遺伝子の開始でハイブリダイゼーション
し、かつ、このタンパク質の開始コドンにNcoI部位
を導入する一方、プライマー2は反対端でハイブリダイ
ゼーションし、かつ、終止コドンを過ぎてすぐにSal
I部位を提供する。100μlのPCR反応は約100ngのゲ
ノムDNAおよび0.5μMの最終濃度の双方のプライマー
を含有した。他の反応成分を、製造元のプロトコールに
従い、ジーンアンプ(GeneAmp)PCR試薬キット(パー
キン エルマー(Perkin Elmer))により提供した。増幅
を、DNAサーモサイクラー(Thermocycler)480(パ
ーキン エルマー(Perkin Elmer))で28サイクル実施
し、それぞれは94℃で1分、53℃で2分および72℃で2
分を含んで成った。最終サイクルの後、72℃で7分の伸
長期間が存在した。PCR産物をNotIおよびSal
Iで切断し、そして同様に切断されたpGEM−5Zf
(+)(プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディ
ソン)に連結した。後者は、それがNcoIおよびSa
lIでの二重切断後にNotI切断部位を欠くため適す
るクローニングベクターとして選んだ(下を参照)。こ
の連結反応混合物を使用して大腸菌(E. coli)DH5α
コンピテント細胞(ギブコBRL(Gibco BRL))を形質
転換し、そして形質転換体を100μg/mLのアンピシリン
で補充されたLB培地上で選択した。
2、ならびに大腸菌(E. coli)株W3110(キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978))からのゲノムDNAを使用して達成した。プ
ライマー1は遺伝子の開始でハイブリダイゼーション
し、かつ、このタンパク質の開始コドンにNcoI部位
を導入する一方、プライマー2は反対端でハイブリダイ
ゼーションし、かつ、終止コドンを過ぎてすぐにSal
I部位を提供する。100μlのPCR反応は約100ngのゲ
ノムDNAおよび0.5μMの最終濃度の双方のプライマー
を含有した。他の反応成分を、製造元のプロトコールに
従い、ジーンアンプ(GeneAmp)PCR試薬キット(パー
キン エルマー(Perkin Elmer))により提供した。増幅
を、DNAサーモサイクラー(Thermocycler)480(パ
ーキン エルマー(Perkin Elmer))で28サイクル実施
し、それぞれは94℃で1分、53℃で2分および72℃で2
分を含んで成った。最終サイクルの後、72℃で7分の伸
長期間が存在した。PCR産物をNotIおよびSal
Iで切断し、そして同様に切断されたpGEM−5Zf
(+)(プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディ
ソン)に連結した。後者は、それがNcoIおよびSa
lIでの二重切断後にNotI切断部位を欠くため適す
るクローニングベクターとして選んだ(下を参照)。こ
の連結反応混合物を使用して大腸菌(E. coli)DH5α
コンピテント細胞(ギブコBRL(Gibco BRL))を形質
転換し、そして形質転換体を100μg/mLのアンピシリン
で補充されたLB培地上で選択した。
【0143】大腸菌(E. coli)RS遺伝子を、プライマ
ー3および4を使用して類似の様式でゲノムDNAから
増幅した。前者は当該タンパク質の開始コドンにNco
I部位を導入する一方、後者は終止コドン直後にSal
I部位を提供する。PCR産物のpGEM−5Zf
(+)への連結および生じる構築物でのDH5αの形質
転換を包含するその後の段階は、正確に、上述されたと
おりであった。
ー3および4を使用して類似の様式でゲノムDNAから
増幅した。前者は当該タンパク質の開始コドンにNco
I部位を導入する一方、後者は終止コドン直後にSal
I部位を提供する。PCR産物のpGEM−5Zf
(+)への連結および生じる構築物でのDH5αの形質
転換を包含するその後の段階は、正確に、上述されたと
おりであった。
【0144】クローニングされた大腸菌(E. coli)LS
およびRS遺伝子をもつプラスミドを制限酵素切断分析
により同定した。プラスミドDNAを、ウィザード(Wiz
ard)DNA精製システム((プロメガ(Promega)、ウィ
スコンシン州マディソン)を使用して多数のアンピシリ
ン耐性コロニーから単離し、そしてNcoIおよびSa
lIでの切断にかけた。サンプルをアガロースゲル電気
泳動により分析し、そして正しい大きさの挿入物を生じ
る各遺伝子の代表的プラスミドを完全に配列決定してP
CRの誤りの非存在を確かめた。クローニングの目的上
意図的に変えた5’および3’端のヌクレオチド以外
は、増幅された大腸菌(E. coli)LSおよびRSの遺伝
子配列は文献に報告されたものと同一であった。
およびRS遺伝子をもつプラスミドを制限酵素切断分析
により同定した。プラスミドDNAを、ウィザード(Wiz
ard)DNA精製システム((プロメガ(Promega)、ウィ
スコンシン州マディソン)を使用して多数のアンピシリ
ン耐性コロニーから単離し、そしてNcoIおよびSa
lIでの切断にかけた。サンプルをアガロースゲル電気
泳動により分析し、そして正しい大きさの挿入物を生じ
る各遺伝子の代表的プラスミドを完全に配列決定してP
CRの誤りの非存在を確かめた。クローニングの目的上
意図的に変えた5’および3’端のヌクレオチド以外
は、増幅された大腸菌(E. coli)LSおよびRSの遺伝
子配列は文献に報告されたものと同一であった。
【0145】実施例2 大腸菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子の挿入的不活性
化 リボフラビンを合成する能力を欠く細菌の栄養要求体を
創製するため、クローニングされた大腸菌(E. coli)L
SおよびRS遺伝子を、挿入的不活性化(insertional i
nactivation)により非機能性とした。簡潔には、唯一の
NotI部位を標的遺伝子のそれぞれのコーディング領
域の中央に導入し、そしてカナマイシン耐性を与えるD
NA断片を工作された部位に連結した。後者は商業的に
入手可能なカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カート
リッジ(ファルマシア(Pharmacia))により提供し、こ
れはその端の双方にNotI切断部位を付加するようP
CRにより修飾した。この修飾は、標準的PCR反応で
プライマー5および6を使用して成し遂げ;下線を付け
られた部分はカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)にハ
イブリダイゼーションし、また、小文字はNotI切断
部位を示す。
化 リボフラビンを合成する能力を欠く細菌の栄養要求体を
創製するため、クローニングされた大腸菌(E. coli)L
SおよびRS遺伝子を、挿入的不活性化(insertional i
nactivation)により非機能性とした。簡潔には、唯一の
NotI部位を標的遺伝子のそれぞれのコーディング領
域の中央に導入し、そしてカナマイシン耐性を与えるD
NA断片を工作された部位に連結した。後者は商業的に
入手可能なカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カート
リッジ(ファルマシア(Pharmacia))により提供し、こ
れはその端の双方にNotI切断部位を付加するようP
CRにより修飾した。この修飾は、標準的PCR反応で
プライマー5および6を使用して成し遂げ;下線を付け
られた部分はカン(Kan)rジェンブロック(GenBlock)にハ
イブリダイゼーションし、また、小文字はNotI切断
部位を示す。
【0146】プライマー5(配列番号17):5’−A
AC TAG ATC Agc ggc cgc AG
C CAC GTT GTG TCT CAA A−
3’ プライマー6(配列番号18):5’−GAC AAA
CAT Agc ggc cgc TGA GGT
CTG CCT CGT GAA−3’ 増幅後、修飾されたカン(Kan)rジェンブロック(GenBloc
k)をNotIで切断し、そして生じる断片をアガロース
ゲル電気泳動により精製した。
AC TAG ATC Agc ggc cgc AG
C CAC GTT GTG TCT CAA A−
3’ プライマー6(配列番号18):5’−GAC AAA
CAT Agc ggc cgc TGA GGT
CTG CCT CGT GAA−3’ 増幅後、修飾されたカン(Kan)rジェンブロック(GenBloc
k)をNotIで切断し、そして生じる断片をアガロース
ゲル電気泳動により精製した。
【0147】PCRプライマーはまた、2個の標的遺伝
子の中央に唯一のNotI切断部位を導入するのにも使
用した。これは、オフマン(Ochman)らによりPCR Protoc
ols:A Guide to Methods and Applications(インニス
(Innis)ら、編)pp.219-227、アカデミックプレス(Acade
mic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に完
全に記述される「逆PCR(inverse PCR)」技術の応用
により成し遂げた。逆PCRの標的は通常は二本鎖環状
DNA分子である。しかしながら、他のPCRの応用と
対照的に、この2個のプライマーは、それらの3’端が
環状の鋳型全体の周囲を反対方向に伸長するよう相互か
ら離れて向けられる。プライマーが相互にすぐ隣接して
ハイブリダイゼーションするよう設計される場合、ベク
ター配列全体を包含しかつその開始および終止点として
元来のプライマー結合部位を有する直鎖状DNA断片が
産生される。最終的な結果は条件として特定位置で環状
プラスミドを直鎖状にすることに類似である。適切なヌ
クレオチド配列を双方のPCRプライマーのハイブリダ
イゼーションしない5’端に付属することにより、環状
の鋳型内のいずれかの所望の位置に唯一の制限酵素切断
部位を導入することが、従って可能である。
子の中央に唯一のNotI切断部位を導入するのにも使
用した。これは、オフマン(Ochman)らによりPCR Protoc
ols:A Guide to Methods and Applications(インニス
(Innis)ら、編)pp.219-227、アカデミックプレス(Acade
mic Press)、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に完
全に記述される「逆PCR(inverse PCR)」技術の応用
により成し遂げた。逆PCRの標的は通常は二本鎖環状
DNA分子である。しかしながら、他のPCRの応用と
対照的に、この2個のプライマーは、それらの3’端が
環状の鋳型全体の周囲を反対方向に伸長するよう相互か
ら離れて向けられる。プライマーが相互にすぐ隣接して
ハイブリダイゼーションするよう設計される場合、ベク
ター配列全体を包含しかつその開始および終止点として
元来のプライマー結合部位を有する直鎖状DNA断片が
産生される。最終的な結果は条件として特定位置で環状
プラスミドを直鎖状にすることに類似である。適切なヌ
クレオチド配列を双方のPCRプライマーのハイブリダ
イゼーションしない5’端に付属することにより、環状
の鋳型内のいずれかの所望の位置に唯一の制限酵素切断
部位を導入することが、従って可能である。
【0148】プライマー7および8(それぞれジェンバ
ンク(GenBank)受託番号X64395のDNA配列のヌ
クレオチド2273〜2290およびヌクレオチド2243〜2261に
ハイブリダイゼーションする)を、大腸菌(E. coli)L
S遺伝子の中央にNotI切断部位を導入するよう設計
し;標的遺伝子にハイブリダイゼーションするヌクレオ
チドに下線を付け、また、NotI切断部位を小文字で
示す。
ンク(GenBank)受託番号X64395のDNA配列のヌ
クレオチド2273〜2290およびヌクレオチド2243〜2261に
ハイブリダイゼーションする)を、大腸菌(E. coli)L
S遺伝子の中央にNotI切断部位を導入するよう設計
し;標的遺伝子にハイブリダイゼーションするヌクレオ
チドに下線を付け、また、NotI切断部位を小文字で
示す。
【0149】プライマー7(配列番号19):5’−A
AC TAG ATC Agc ggc cgc GG
T ACG GTT ATT CGT GGT−3’ プライマー8−LS(配列番号20):5’−GAC
AAA CAT Agc ggc cgc GTC G
TA TTT ACC GGT−3’ プライマー9および10(それぞれジェンバンク(GenBa
nk)受託番号X69109のDNA配列のヌクレオチド1
217〜1233およびヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする)を、大腸菌(E. coli)RS遺伝子の
中央にNotI切断部位を導入するのに使用した。
AC TAG ATC Agc ggc cgc GG
T ACG GTT ATT CGT GGT−3’ プライマー8−LS(配列番号20):5’−GAC
AAA CAT Agc ggc cgc GTC G
TA TTT ACC GGT−3’ プライマー9および10(それぞれジェンバンク(GenBa
nk)受託番号X69109のDNA配列のヌクレオチド1
217〜1233およびヌクレオチド1190〜1208にハイブリダ
イゼーションする)を、大腸菌(E. coli)RS遺伝子の
中央にNotI切断部位を導入するのに使用した。
【0150】プライマー9(配列番号21):5’−A
AC TAG ATC Agc ggc cgc AC
C ACT GCT GAA GTG GC−3’ プライマー10(配列番号22):5’−GAC AA
A CAT Agc ggc cgc GAC CTG
ACA TTA AGT GTC C−3’ 逆PCRのための環状の鋳型は、大腸菌(E. coli)LS
およびRS遺伝子を含有するpGEM−5Zf(+)構
築物であった。100μlのPCR反応は0.5ngのプラスミ
ドDNAおよび0.5μMの最終濃度の適切なプライマーの
それぞれを含有した。増幅を、DNAサーモサイクラー
(Thermocycler)480(パーキン エルマー(Perkin El
mer))で30サイクル実施し、それぞれは94℃で50秒、55
℃で1分および72℃で3分を含んで成った。PCR産物
をNotIで切断し、そして生じる断片をアガロースゲ
ル電気泳動により精製し;除去されたバンドは期待され
た大きさのものであった。次に、精製された断片をT4
DNAリガーゼ(ノヴァジェン(Novagen))で再環化し
て機能性プラスミドを再生させ、そして連結反応混合物
のアリコートを使用して大腸菌(E. coli)DH5αコン
ピテント細胞(ギブコBRL(Gibco BRL))を形質転換
した。成長をアンピシリン(100μg/mL)を含有するL
B培地上で選択し、そしてプラスミドDNAを、Not
I、SalIおよびNcoIでの制限酵素切断分析のた
め多数の形質転換体から単離した。標的遺伝子のそれぞ
れについて、これらの酵素で正しい切断パターンを生じ
る代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
AC TAG ATC Agc ggc cgc AC
C ACT GCT GAA GTG GC−3’ プライマー10(配列番号22):5’−GAC AA
A CAT Agc ggc cgc GAC CTG
ACA TTA AGT GTC C−3’ 逆PCRのための環状の鋳型は、大腸菌(E. coli)LS
およびRS遺伝子を含有するpGEM−5Zf(+)構
築物であった。100μlのPCR反応は0.5ngのプラスミ
ドDNAおよび0.5μMの最終濃度の適切なプライマーの
それぞれを含有した。増幅を、DNAサーモサイクラー
(Thermocycler)480(パーキン エルマー(Perkin El
mer))で30サイクル実施し、それぞれは94℃で50秒、55
℃で1分および72℃で3分を含んで成った。PCR産物
をNotIで切断し、そして生じる断片をアガロースゲ
ル電気泳動により精製し;除去されたバンドは期待され
た大きさのものであった。次に、精製された断片をT4
DNAリガーゼ(ノヴァジェン(Novagen))で再環化し
て機能性プラスミドを再生させ、そして連結反応混合物
のアリコートを使用して大腸菌(E. coli)DH5αコン
ピテント細胞(ギブコBRL(Gibco BRL))を形質転換
した。成長をアンピシリン(100μg/mL)を含有するL
B培地上で選択し、そしてプラスミドDNAを、Not
I、SalIおよびNcoIでの制限酵素切断分析のた
め多数の形質転換体から単離した。標的遺伝子のそれぞ
れについて、これらの酵素で正しい切断パターンを生じ
る代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
【0151】カナマイシン耐性遺伝子を挿入するため、
上述された2種のプラスミド構築物をNotIで切断
し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。断
片のそれぞれをその後、4倍モル過剰の修飾されたカン
(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カートリッジとともに
個別にインキュベーションし、そしてT4DNAリガー
ゼ(ノヴァジェン(Novagen))の存在下に標準的連結反
応にかけた。連結反応混合物のアリコートを使用して大
腸菌(E. coli)DH5αコンピテント細胞(ギブコBR
L(Gibco BRL))を形質転換し、そして、成長を、カナ
マイシン(30μg/mL)およびアンピシリン(100μg/m
L)を含有するLB培地上で選択した。崩壊された大腸
菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子をもつプラスミドを
制限酵素切断分析により同定した。このプラスミドをN
coIおよびSalIで切断し、そしてその後アガロー
スゲル電気泳動にかけて、挿入されたカナマイシン耐性
遺伝子の存在をチェックした。正しい大きさの断片を生
じる代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
これらのプラスミドのDNA配列分析は、カナマイシン
耐性遺伝子が双方の標的遺伝子の正しい位置に挿入され
ていることを確認した。 実施例3 大腸菌(E. coli)LSおよびRS栄養要求体の発生 挿入的に不活性化された大腸菌(E. coli)LSおよびR
S遺伝子を、NcoIおよびSalIを使用して上述さ
れたプラスミド構築物から遊離させ、そしてアガロース
ゲル電気泳動により精製した。断片のそれぞれをその
後、製造元のプロトコールに従い、BTXトランスフェ
クター(Transfector)100(バイオテクノロジーズ
アンド エクスペリメンタル リサーチ インク(Biote
chnologiesand Experimental Research Inc.))を使用
して、電気穿孔法により、大腸菌(E. coli)株ATCC
47002(バルバス(Balbas)ら、Gene 136:211-213(1
993)に完全に記述されかつJC7623(バッハマン(B
achmann, B.)によりE. coliand Salmonella typhimuriu
m: Cellular and Molecular Biology(ニードハート(Ni
edhardt)ら、編)p.2466、アメリカ微生物学会(America
n Society of Microbiology)、ワシントンDC(1987))
に記述される)と同遺伝子型)に個別に導入した。遺伝
子置換の最初のレシピエント(recipient)としてのこの
株の選択は、その十分に確立された高rec表現型、お
よび、高頻度の二重交差相同組換えを受ける関連する能
力を基礎とした(ワイマン(Wyman)ら、Proc. Natl. Aca
d.Sci. USA 82:2880-2884(1985);バルバス(Balbas)
ら、Gene 136:211-213(1993);バルバス(Balbas)ら、Ge
ne 172:65-69(1996))。かように、挿入的に不活性化さ
れた大腸菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子は、カナマ
イシン選択下で、ATCC47002中のそれらの機能
性の染色体の対照物を効率的に置き換えることができる
ことが予期された。
上述された2種のプラスミド構築物をNotIで切断
し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製した。断
片のそれぞれをその後、4倍モル過剰の修飾されたカン
(Kan)rジェンブロック(GenBlock)カートリッジとともに
個別にインキュベーションし、そしてT4DNAリガー
ゼ(ノヴァジェン(Novagen))の存在下に標準的連結反
応にかけた。連結反応混合物のアリコートを使用して大
腸菌(E. coli)DH5αコンピテント細胞(ギブコBR
L(Gibco BRL))を形質転換し、そして、成長を、カナ
マイシン(30μg/mL)およびアンピシリン(100μg/m
L)を含有するLB培地上で選択した。崩壊された大腸
菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子をもつプラスミドを
制限酵素切断分析により同定した。このプラスミドをN
coIおよびSalIで切断し、そしてその後アガロー
スゲル電気泳動にかけて、挿入されたカナマイシン耐性
遺伝子の存在をチェックした。正しい大きさの断片を生
じる代表的プラスミドをさらなる操作のため選択した。
これらのプラスミドのDNA配列分析は、カナマイシン
耐性遺伝子が双方の標的遺伝子の正しい位置に挿入され
ていることを確認した。 実施例3 大腸菌(E. coli)LSおよびRS栄養要求体の発生 挿入的に不活性化された大腸菌(E. coli)LSおよびR
S遺伝子を、NcoIおよびSalIを使用して上述さ
れたプラスミド構築物から遊離させ、そしてアガロース
ゲル電気泳動により精製した。断片のそれぞれをその
後、製造元のプロトコールに従い、BTXトランスフェ
クター(Transfector)100(バイオテクノロジーズ
アンド エクスペリメンタル リサーチ インク(Biote
chnologiesand Experimental Research Inc.))を使用
して、電気穿孔法により、大腸菌(E. coli)株ATCC
47002(バルバス(Balbas)ら、Gene 136:211-213(1
993)に完全に記述されかつJC7623(バッハマン(B
achmann, B.)によりE. coliand Salmonella typhimuriu
m: Cellular and Molecular Biology(ニードハート(Ni
edhardt)ら、編)p.2466、アメリカ微生物学会(America
n Society of Microbiology)、ワシントンDC(1987))
に記述される)と同遺伝子型)に個別に導入した。遺伝
子置換の最初のレシピエント(recipient)としてのこの
株の選択は、その十分に確立された高rec表現型、お
よび、高頻度の二重交差相同組換えを受ける関連する能
力を基礎とした(ワイマン(Wyman)ら、Proc. Natl. Aca
d.Sci. USA 82:2880-2884(1985);バルバス(Balbas)
ら、Gene 136:211-213(1993);バルバス(Balbas)ら、Ge
ne 172:65-69(1996))。かように、挿入的に不活性化さ
れた大腸菌(E. coli)LSおよびRS遺伝子は、カナマ
イシン選択下で、ATCC47002中のそれらの機能
性の染色体の対照物を効率的に置き換えることができる
ことが予期された。
【0152】電気穿孔法の後、形質転換された細胞を、
リボフラビン(400μg/mL)で補充された10mLのS.
O.C.培地(ギブコBRL(Gibco BRL))中に再懸濁
し、そして37℃で1時間インキュベーションした。カナ
マイシン耐性を、その後、リボフラビン(400μg/mL)
およびカナマイシン(30μg/mL)双方を含有したLBプ
レート上で37℃で選択し;コロニーは24〜48時間後に出
現した。正しい染色体組込み事象の表現型の検出をレプ
リカプレート作成(replica-plating)実験により成し遂
げた。崩壊された標的遺伝子のいずれかの二重交差相同
組換えから生じたリボフラビン栄養要求体は、カナマイ
シンに耐性、アンピシリンに感受性であり、かつ、添加
されたリボフラビンの存在下でのみ成長を表すと予期さ
れることができた。この表現型を表す代表的細菌コロニ
ーをさらなる研究のため選択した。
リボフラビン(400μg/mL)で補充された10mLのS.
O.C.培地(ギブコBRL(Gibco BRL))中に再懸濁
し、そして37℃で1時間インキュベーションした。カナ
マイシン耐性を、その後、リボフラビン(400μg/mL)
およびカナマイシン(30μg/mL)双方を含有したLBプ
レート上で37℃で選択し;コロニーは24〜48時間後に出
現した。正しい染色体組込み事象の表現型の検出をレプ
リカプレート作成(replica-plating)実験により成し遂
げた。崩壊された標的遺伝子のいずれかの二重交差相同
組換えから生じたリボフラビン栄養要求体は、カナマイ
シンに耐性、アンピシリンに感受性であり、かつ、添加
されたリボフラビンの存在下でのみ成長を表すと予期さ
れることができた。この表現型を表す代表的細菌コロニ
ーをさらなる研究のため選択した。
【0153】ATCC47002は大腸菌(E. coli)
「ノックアウト」を創製するのに優れた株である一方、
recBCD遺伝子座におけるその複数の突然変異はそ
れをColE1型プラスミドを増殖させることを不可能
にする(バルバス(Balbas)ら、Gene 172:65-69(199
6))。結果として、上述されたリボフラビン栄養要求体
は、機能的相補によりプラスミドcDNAライブラリー
をスクリーニングするのに適さない。この最終目標を達
成するため、従って、挿入的に不活性化されたLSおよ
びRS遺伝子を、ATCC47002の染色体から適す
る野生型バックグラウンドに移動させることが必要であ
った。この操作を、P1vlr、およびミラー(Miller, J.
H)によりExperiments in Molecular Genetics、pp.201-
205、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コール
ドスプリングハーバー(1972)に完全に記述されるような
標準的方法論を使用して、一般化されたファージ導入に
より成し遂げた。大腸菌(E.coli)W3110(キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978))を、挿入的に不活性化されたLSおよびRS
遺伝子の受給体株として選択した。ファージ導入の後、
細菌の成長を、カナマイシン(35μg/mL)およびリボフ
ラビン(400μg/mL)で補充されたLB培地上で選択し
た。崩壊された大腸菌(E. coli)LSもしくはRS遺伝
子をもつ安定な形質導入体をその後、ATCC4700
2について上述されたものと類似のレプリカプレート作
成実験により同定した。かように、個々のコロニーを、
リボフラビン(400μg/mL)を含むもしくは含まない、
LB培地、クエン酸ナトリウム(7.5mM)、硫酸マグネ
シウム(1.5mM)およびカナマイシン(35μg/mL)を含
有するプレート上にまだらにした(patched)。さらなる
研究およびその後の相補クローニング(下を参照)のた
め選択したLSおよびRSリボフラビン栄養要求体は添
加されたリボフラビンの存在下で成長することのみ可能
であり、かつ、アンピシリン(100μg/mL)もしくはス
トレプトマイシン(25μg/mL)に耐性でなかった;スト
レプトマイシンに対する感受性はW3110の特徴であ
るがしかしATCC47002の特徴でない。
「ノックアウト」を創製するのに優れた株である一方、
recBCD遺伝子座におけるその複数の突然変異はそ
れをColE1型プラスミドを増殖させることを不可能
にする(バルバス(Balbas)ら、Gene 172:65-69(199
6))。結果として、上述されたリボフラビン栄養要求体
は、機能的相補によりプラスミドcDNAライブラリー
をスクリーニングするのに適さない。この最終目標を達
成するため、従って、挿入的に不活性化されたLSおよ
びRS遺伝子を、ATCC47002の染色体から適す
る野生型バックグラウンドに移動させることが必要であ
った。この操作を、P1vlr、およびミラー(Miller, J.
H)によりExperiments in Molecular Genetics、pp.201-
205、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Co
ld Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コール
ドスプリングハーバー(1972)に完全に記述されるような
標準的方法論を使用して、一般化されたファージ導入に
より成し遂げた。大腸菌(E.coli)W3110(キャンベ
ル(Campbell)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 75:2276-228
4(1978))を、挿入的に不活性化されたLSおよびRS
遺伝子の受給体株として選択した。ファージ導入の後、
細菌の成長を、カナマイシン(35μg/mL)およびリボフ
ラビン(400μg/mL)で補充されたLB培地上で選択し
た。崩壊された大腸菌(E. coli)LSもしくはRS遺伝
子をもつ安定な形質導入体をその後、ATCC4700
2について上述されたものと類似のレプリカプレート作
成実験により同定した。かように、個々のコロニーを、
リボフラビン(400μg/mL)を含むもしくは含まない、
LB培地、クエン酸ナトリウム(7.5mM)、硫酸マグネ
シウム(1.5mM)およびカナマイシン(35μg/mL)を含
有するプレート上にまだらにした(patched)。さらなる
研究およびその後の相補クローニング(下を参照)のた
め選択したLSおよびRSリボフラビン栄養要求体は添
加されたリボフラビンの存在下で成長することのみ可能
であり、かつ、アンピシリン(100μg/mL)もしくはス
トレプトマイシン(25μg/mL)に耐性でなかった;スト
レプトマイシンに対する感受性はW3110の特徴であ
るがしかしATCC47002の特徴でない。
【0154】実施例4 機能的相補によるホウレンソウLSおよびRS遺伝子の
クローニング λ Zap II中のホウレンソウ(Spinacea oleracea)
cDNA発現ライブラリーをストラタジーン(Stratagen
e)(カリフォルニア州ラホヤ)から得、そして製造元の
プロトコールに従って集団除去(mass excision)にかけ
た。除去に際し、遊離されたcDNA挿入物は、アンピ
シリンに対する耐性を与えるプラスミドベクターpBl
uescriptに含有され、そしてイソプロピル−1
−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)での
誘導に際して大腸菌(E. coli)でのそれらの発現を可能
にする。除去されたプラスミドの生じる混合物をその
後、BTXトランスフェクター(Transfector)100
(バイオテクノロジーズ アンド エクスペリメンタル
リサーチ インク(Biotechnologies and Experimenta
l Research Inc.))および製造元の条件を使用して、大
腸菌(E. coli)LSおよびRSリボフラビン栄養要求体
(双方ともW3110の誘導体)に電気穿孔した。形質
転換された細胞を、Bアガー(クエン酸ナトリウム(7.
5mM)、硫酸マグネシウム(1.5mM)、カナマイシン(35
μg/mL)、アンピシリン(100μg/mL)およびIPTG
(0.6mM)を含有するLB培地)を含有したプレート上
で、添加されたリボフラビンの非存在下での成長につい
て選択した。37℃での48時間のインキュベーション期間
の後、細菌の成長を観察し、そして、リボフラビン非依
存性コロニーを、大腸菌(E. coli)LSおよびRS栄養
要求体についてそれぞれ約4.2×10-6および約3.1×10-7
の頻度で回収した。標的遺伝子のそれぞれについて、プ
ラスミドDNAを代表的コロニーから単離し、そしてさ
らなる分析にかけた;選択されたプラスミドの双方は、
適切な大腸菌(E. coli)栄養要求体を高頻度でリボフラ
ビン原栄養性に形質転換することが可能であった。これ
らのプラスミドに含有されたcDNA挿入物を、その
後、蛍光ジデオキシターミネーターおよび注文設計され
たプライマーを使用し、ABI377自動化シークェン
サー(アプライド バイオシステムズ(Applied Biosyst
ems))で完全に配列決定した。
クローニング λ Zap II中のホウレンソウ(Spinacea oleracea)
cDNA発現ライブラリーをストラタジーン(Stratagen
e)(カリフォルニア州ラホヤ)から得、そして製造元の
プロトコールに従って集団除去(mass excision)にかけ
た。除去に際し、遊離されたcDNA挿入物は、アンピ
シリンに対する耐性を与えるプラスミドベクターpBl
uescriptに含有され、そしてイソプロピル−1
−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(IPTG)での
誘導に際して大腸菌(E. coli)でのそれらの発現を可能
にする。除去されたプラスミドの生じる混合物をその
後、BTXトランスフェクター(Transfector)100
(バイオテクノロジーズ アンド エクスペリメンタル
リサーチ インク(Biotechnologies and Experimenta
l Research Inc.))および製造元の条件を使用して、大
腸菌(E. coli)LSおよびRSリボフラビン栄養要求体
(双方ともW3110の誘導体)に電気穿孔した。形質
転換された細胞を、Bアガー(クエン酸ナトリウム(7.
5mM)、硫酸マグネシウム(1.5mM)、カナマイシン(35
μg/mL)、アンピシリン(100μg/mL)およびIPTG
(0.6mM)を含有するLB培地)を含有したプレート上
で、添加されたリボフラビンの非存在下での成長につい
て選択した。37℃での48時間のインキュベーション期間
の後、細菌の成長を観察し、そして、リボフラビン非依
存性コロニーを、大腸菌(E. coli)LSおよびRS栄養
要求体についてそれぞれ約4.2×10-6および約3.1×10-7
の頻度で回収した。標的遺伝子のそれぞれについて、プ
ラスミドDNAを代表的コロニーから単離し、そしてさ
らなる分析にかけた;選択されたプラスミドの双方は、
適切な大腸菌(E. coli)栄養要求体を高頻度でリボフラ
ビン原栄養性に形質転換することが可能であった。これ
らのプラスミドに含有されたcDNA挿入物を、その
後、蛍光ジデオキシターミネーターおよび注文設計され
たプライマーを使用し、ABI377自動化シークェン
サー(アプライド バイオシステムズ(Applied Biosyst
ems))で完全に配列決定した。
【0155】大腸菌(E. coli)RS栄養要求体を救出し
た(rescue)およそ1.2kbpのホウレンソウcDNA挿入物
は、明らかにリボフラビンシンターゼをコードする。こ
のタンパク質の読み取り枠(ORF)のヌクレオチド配
列およびその予測される一次アミノ酸配列がそれぞれ配
列番号33および配列番号34に述べられる。クローニ
ングされた植物タンパク質と、大腸菌(E. coli)、枯草
菌(B. subtilis)、P.レイオグナチ(P. leiognathi)、
P.ホスホレウム(P. phosphoreum)およびS.セレビシ
エ(S. cerevisiae)からのもの(ジェンバンク(GenBank)
受託番号、それぞれX69109、X51510、M9
0094、L11391およびZ21621)を包含す
る既知の微生物RS相同物との間に間違えようのない類
似性が存在する一方、若干の有意の差異もまた存在す
る。最も明らかなものは、ホウレンソウRSがずっとよ
り大きなタンパク質であるということである。微生物で
のその対照物と比較して、それはそのN末端に付加的な
69アミノ酸を保有する(図1)。このN末端ポリペプチ
ド伸長はSerおよびThr残基が豊富で相対的に塩基
性であり、そしてそれ自体、葉緑体輸送ペプチドに似て
いる(ゲイヴェル(Gavel)ら、FEBS Lett. 261:455-458
(1990))。この観察結果は、ホウレンソウRSは核にコ
ードされた前駆体タンパク質として合成され、そしてそ
の後葉緑体に目標を向けられ、そこでそれがその成熟形
態にタンパク質分解的にプロセシングされることを示唆
した。実際、図1に示される配列の整列(ジェネティク
ス コンピュータ グループ積み重ねプログラム(Genet
ics Computer Group Pileup program)で生じられる)を
基礎とすれば、成熟のための予測された切断部位はホウ
レンソウRS前駆体のアミノ酸残基69と70との間に存在
し、22.8kDaの分子質量をもつ成熟ポリペプチド(配列
番号8)を生じさせる。この割り当て(assignment)が正
しいことは、全ての既知の微生物RS相同物が5ペプチ
ドモチーフMet−Phe−Thr−Gly−Ileで
開始するという事実により強く支持され、このモチーフ
は機能に明らかに決定的である(サントス(Santos)ら、
J. Biol. Chem. 270:437-444(1995))。
た(rescue)およそ1.2kbpのホウレンソウcDNA挿入物
は、明らかにリボフラビンシンターゼをコードする。こ
のタンパク質の読み取り枠(ORF)のヌクレオチド配
列およびその予測される一次アミノ酸配列がそれぞれ配
列番号33および配列番号34に述べられる。クローニ
ングされた植物タンパク質と、大腸菌(E. coli)、枯草
菌(B. subtilis)、P.レイオグナチ(P. leiognathi)、
P.ホスホレウム(P. phosphoreum)およびS.セレビシ
エ(S. cerevisiae)からのもの(ジェンバンク(GenBank)
受託番号、それぞれX69109、X51510、M9
0094、L11391およびZ21621)を包含す
る既知の微生物RS相同物との間に間違えようのない類
似性が存在する一方、若干の有意の差異もまた存在す
る。最も明らかなものは、ホウレンソウRSがずっとよ
り大きなタンパク質であるということである。微生物で
のその対照物と比較して、それはそのN末端に付加的な
69アミノ酸を保有する(図1)。このN末端ポリペプチ
ド伸長はSerおよびThr残基が豊富で相対的に塩基
性であり、そしてそれ自体、葉緑体輸送ペプチドに似て
いる(ゲイヴェル(Gavel)ら、FEBS Lett. 261:455-458
(1990))。この観察結果は、ホウレンソウRSは核にコ
ードされた前駆体タンパク質として合成され、そしてそ
の後葉緑体に目標を向けられ、そこでそれがその成熟形
態にタンパク質分解的にプロセシングされることを示唆
した。実際、図1に示される配列の整列(ジェネティク
ス コンピュータ グループ積み重ねプログラム(Genet
ics Computer Group Pileup program)で生じられる)を
基礎とすれば、成熟のための予測された切断部位はホウ
レンソウRS前駆体のアミノ酸残基69と70との間に存在
し、22.8kDaの分子質量をもつ成熟ポリペプチド(配列
番号8)を生じさせる。この割り当て(assignment)が正
しいことは、全ての既知の微生物RS相同物が5ペプチ
ドモチーフMet−Phe−Thr−Gly−Ileで
開始するという事実により強く支持され、このモチーフ
は機能に明らかに決定的である(サントス(Santos)ら、
J. Biol. Chem. 270:437-444(1995))。
【0156】成熟ホウレンソウRSが葉緑体に局在化さ
れるという概念はまた、実験的証拠によっても支持され
る。かように、精製された組換えタンパク質(下を参
照)に対し向けられる抗体は、ホウレンソウの葉緑体抽
出物がSDS−PAGEおよびウェスタン分析にかけら
れる場合に、期待された大きさのポリペプチドと特異的
に相互作用する。他の実験は、ホウレンソウRS前駆体
がプラスミドに組み入れられ(imported)、そこでそれは
その成熟形態にタンパク質分解的に切断されることを明
らかに示している。これらの研究において、完全長のホ
ウレンソウRS前駆体を、クローニングされた遺伝子の
インビトロ転写/翻訳により[S35]−メチオニンで標
識し、そして、完全な単離されたホウレンソウ葉緑体を
使用するインビトロでのタンパク質の組み入れアッセイ
にかけた(クライン(Cline)ら、J.Biol. Chem. 260、36
91-3696(1988);ビイタネン(Viitanen)ら、J. Biol. Ch
em.263、15000-15007(1988))。
れるという概念はまた、実験的証拠によっても支持され
る。かように、精製された組換えタンパク質(下を参
照)に対し向けられる抗体は、ホウレンソウの葉緑体抽
出物がSDS−PAGEおよびウェスタン分析にかけら
れる場合に、期待された大きさのポリペプチドと特異的
に相互作用する。他の実験は、ホウレンソウRS前駆体
がプラスミドに組み入れられ(imported)、そこでそれは
その成熟形態にタンパク質分解的に切断されることを明
らかに示している。これらの研究において、完全長のホ
ウレンソウRS前駆体を、クローニングされた遺伝子の
インビトロ転写/翻訳により[S35]−メチオニンで標
識し、そして、完全な単離されたホウレンソウ葉緑体を
使用するインビトロでのタンパク質の組み入れアッセイ
にかけた(クライン(Cline)ら、J.Biol. Chem. 260、36
91-3696(1988);ビイタネン(Viitanen)ら、J. Biol. Ch
em.263、15000-15007(1988))。
【0157】図1に示される多様な微生物相同物のう
ち、成熟ホウレンソウRS(配列番号8)が、一次アミ
ノ酸配列レベルで酵母のタンパク質と最大の類似性を示
す(例えばおよそ47%の同一性)。対照的に、成熟ホウ
レンソウRSは、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtili
s)、P.レイオグナチ(P. leiognathi)およびP.ホス
ホレウム(P. phosphoreum)からの対応するタンパク質に
それぞれおよそ35%、42%、34%および40%のみ同一で
ある。植物タンパク質に独特であるN末端の葉緑体に対
して標的化された配列を考慮に入れれば、進化の相違は
より大きくさえなる。
ち、成熟ホウレンソウRS(配列番号8)が、一次アミ
ノ酸配列レベルで酵母のタンパク質と最大の類似性を示
す(例えばおよそ47%の同一性)。対照的に、成熟ホウ
レンソウRSは、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtili
s)、P.レイオグナチ(P. leiognathi)およびP.ホス
ホレウム(P. phosphoreum)からの対応するタンパク質に
それぞれおよそ35%、42%、34%および40%のみ同一で
ある。植物タンパク質に独特であるN末端の葉緑体に対
して標的化された配列を考慮に入れれば、進化の相違は
より大きくさえなる。
【0158】類似の観察を、リボフラビン原栄養性を大
腸菌(E. coli)LS栄養要求体に回復することが可能で
あったホウレンソウcDNA挿入物で行った。この場
合、救助するプラスミドのおよそ1.3kbpのDNA断片
は、通常よりずっと大きなLS相同物をコードしたOR
Fを含有し;後者のDNA配列および予測アミノ酸配列
がそれぞれ配列番号27および配列番号28に示され
る。ホウレンソウRS前駆体での状況と類似して、クロ
ーニングされたホウレンソウLSの付加的長さ(酵母を
包含する微生物でのその相同物に関して)は、完全に、
N末端の葉緑体輸送ペプチド様伸長に帰される(図
2)。かように、高等植物のリボフラビン生合成の少な
くとも最後の2段階は葉緑体で起こる。免疫および葉緑
体タンパク質輸入実験(ホウレンソウRSについて上述
されたものに類似)は、ホウレンソウLS前駆体もまた
プラスチドに標的化されたことを示したとは言え、この
場合は、成熟タンパク質の正確な開始を確実に予測する
ことがより困難である。既知の微生物LS相同物のなか
でさえ、最初の15〜20個のN末端アミノ酸残基が乏しく
保存されることが明らかである。にもかかわらず、図2
の配列の整列から、成熟に決定的な切断事象がホウレン
ソウLS前駆体のAla66とVal67との間で起こ
り、およそ16.5kDaの予測された分子質量をもつポリペ
プチドを生じることがありそうである。この概念は実験
的に決定されるべきままである一方、この割り当てを基
礎とした成熟ホウレンソウLSの予測アミノ酸配列が配
列番号2に与えられる。その葉緑体に目標を向ける配列
なしでさえ、成熟ホウレンソウLSは、大腸菌(E. col
i)、A.プリューロニューモニエ(A. pleuropneumonia
e)、枯草菌(B. subtilis)、P.ホスホレウム(P. phos
phoreum)およびS.セレビシエ(S. cerevisiae)のその
対照物(例えば図2に示される他のタンパク質)にそれ
ぞれ49%、44%、43%および29%のみ同一であることに
注意せよ。
腸菌(E. coli)LS栄養要求体に回復することが可能で
あったホウレンソウcDNA挿入物で行った。この場
合、救助するプラスミドのおよそ1.3kbpのDNA断片
は、通常よりずっと大きなLS相同物をコードしたOR
Fを含有し;後者のDNA配列および予測アミノ酸配列
がそれぞれ配列番号27および配列番号28に示され
る。ホウレンソウRS前駆体での状況と類似して、クロ
ーニングされたホウレンソウLSの付加的長さ(酵母を
包含する微生物でのその相同物に関して)は、完全に、
N末端の葉緑体輸送ペプチド様伸長に帰される(図
2)。かように、高等植物のリボフラビン生合成の少な
くとも最後の2段階は葉緑体で起こる。免疫および葉緑
体タンパク質輸入実験(ホウレンソウRSについて上述
されたものに類似)は、ホウレンソウLS前駆体もまた
プラスチドに標的化されたことを示したとは言え、この
場合は、成熟タンパク質の正確な開始を確実に予測する
ことがより困難である。既知の微生物LS相同物のなか
でさえ、最初の15〜20個のN末端アミノ酸残基が乏しく
保存されることが明らかである。にもかかわらず、図2
の配列の整列から、成熟に決定的な切断事象がホウレン
ソウLS前駆体のAla66とVal67との間で起こ
り、およそ16.5kDaの予測された分子質量をもつポリペ
プチドを生じることがありそうである。この概念は実験
的に決定されるべきままである一方、この割り当てを基
礎とした成熟ホウレンソウLSの予測アミノ酸配列が配
列番号2に与えられる。その葉緑体に目標を向ける配列
なしでさえ、成熟ホウレンソウLSは、大腸菌(E. col
i)、A.プリューロニューモニエ(A. pleuropneumonia
e)、枯草菌(B. subtilis)、P.ホスホレウム(P. phos
phoreum)およびS.セレビシエ(S. cerevisiae)のその
対照物(例えば図2に示される他のタンパク質)にそれ
ぞれ49%、44%、43%および29%のみ同一であることに
注意せよ。
【0159】実施例5 大腸菌(E. coli)での成熟ホウレンソウLSおよびRS
の発現 実施例4で同定された、クローニングされたホウレンソ
ウRS前駆体の葉緑体に対して標的化された配列を、プ
ライマー11(配列番号23)および12(配列番号2
4)を使用する標準的PCR反応により除去した。プラ
イマー11(5’−CTA CTC ATT TCA
TAT GTT CAC TGG CAT TGT T
GA A−3’)(配列番号23)は、ホウレンソウR
S前駆体のヌクレオチド208〜228(配列番号33)にハ
イブリダイゼーションする。それは成熟タンパク質(配
列番号8)の予測された開始で大腸菌(E. coli)でタン
パク質合成を開始するよう設計され、かつ、クローニン
グの目的上、イニシエイターMet残基から上流に唯一
のNdeI部位を組み込む。プライマー12(5’−C
AT CTT ACT GGA TCC ACT AT
G TGA ATTTGG TAG GAT C−
3’)(配列番号24)は、ORFの他端でヌクレオチ
ド820〜840にハイブリダイゼーションし、そしてそのタ
ンパク質の終止コドンをちょうど過ぎて唯一のBamH
I部位を導入する。PCR増幅の標的は、ホウレンソウ
RS前駆体のcDNA挿入物を含有する精製されたプラ
スミドであった。予測されたPCR産物はいかなる修飾
も伴わない完全長の成熟ホウレンソウRSをコードする
(配列番号8)。
の発現 実施例4で同定された、クローニングされたホウレンソ
ウRS前駆体の葉緑体に対して標的化された配列を、プ
ライマー11(配列番号23)および12(配列番号2
4)を使用する標準的PCR反応により除去した。プラ
イマー11(5’−CTA CTC ATT TCA
TAT GTT CAC TGG CAT TGT T
GA A−3’)(配列番号23)は、ホウレンソウR
S前駆体のヌクレオチド208〜228(配列番号33)にハ
イブリダイゼーションする。それは成熟タンパク質(配
列番号8)の予測された開始で大腸菌(E. coli)でタン
パク質合成を開始するよう設計され、かつ、クローニン
グの目的上、イニシエイターMet残基から上流に唯一
のNdeI部位を組み込む。プライマー12(5’−C
AT CTT ACT GGA TCC ACT AT
G TGA ATTTGG TAG GAT C−
3’)(配列番号24)は、ORFの他端でヌクレオチ
ド820〜840にハイブリダイゼーションし、そしてそのタ
ンパク質の終止コドンをちょうど過ぎて唯一のBamH
I部位を導入する。PCR増幅の標的は、ホウレンソウ
RS前駆体のcDNA挿入物を含有する精製されたプラ
スミドであった。予測されたPCR産物はいかなる修飾
も伴わない完全長の成熟ホウレンソウRSをコードする
(配列番号8)。
【0160】類似の戦略を使用して、大腸菌(E. coli)
での発現のため、クローニングされたホウレンソウLS
前駆体から輸送ペプチドを除去した。しかしながら、こ
の場合、予測された輸送ペプチド切断部位にイニシエイ
ターMet残基をもつ短くされた植物タンパク質を提供
することもまた必要であった。なぜなら、天然に存在す
るものが欠けていたからである。これはプライマー13
(配列番号25)および14(配列番号26)を使用し
て、ホウレンソウLS前駆体のcDNA挿入物を含有す
る精製されたプラスミドを用いる標準的PCR反応で成
し遂げられた。プライマー13(5’−CTA CTC
ATT TCA TAT GAA CGA GCT
TGA AGG TTA TGT CAC−3’)(配
列番号25)はホウレンソウLS前駆体のヌクレオチド
205〜224(配列番号27)にハイブリダイゼーション
し、そして、成熟タンパク質(配列番号2)の予測され
る開始Val67により現在のところ占有される位置に
イニシエイターMet残基を導入する(配列番号2
8)。このプライマーはまた、導入されたイニシエイタ
ーMet残基に唯一のNdeI部位も提供し、そして2
番目のアミノ酸をArgからAsnに変える。これらの
変化が酵素活性を損なわないとみられ、かつ、修飾され
た植物タンパク質の細菌の発現を実際に向上しうること
が推論された。なぜなら、大腸菌(E. coli)および枯草
菌(B. subtilis)双方のLS相同物はジペプチド配列M
et−Asnで開始するからである。プライマー14
(5’−CATCTT ACT GGA TCC AT
C AGG CCT TCA AATGAT GTT
CG−3’)(配列番号26)は、ホウレンソウLS前
駆体の他端でヌクレオチド648〜667にハイブリダイゼー
ションし、そして終止コドンをちょうど過ぎて唯一のB
amHI部位を提供する。かように、最初の2アミノ酸
を除き、プライマー13および14で発生されるPCR
断片は、配列番号2に示されるものと同一の一次アミノ
酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。
での発現のため、クローニングされたホウレンソウLS
前駆体から輸送ペプチドを除去した。しかしながら、こ
の場合、予測された輸送ペプチド切断部位にイニシエイ
ターMet残基をもつ短くされた植物タンパク質を提供
することもまた必要であった。なぜなら、天然に存在す
るものが欠けていたからである。これはプライマー13
(配列番号25)および14(配列番号26)を使用し
て、ホウレンソウLS前駆体のcDNA挿入物を含有す
る精製されたプラスミドを用いる標準的PCR反応で成
し遂げられた。プライマー13(5’−CTA CTC
ATT TCA TAT GAA CGA GCT
TGA AGG TTA TGT CAC−3’)(配
列番号25)はホウレンソウLS前駆体のヌクレオチド
205〜224(配列番号27)にハイブリダイゼーション
し、そして、成熟タンパク質(配列番号2)の予測され
る開始Val67により現在のところ占有される位置に
イニシエイターMet残基を導入する(配列番号2
8)。このプライマーはまた、導入されたイニシエイタ
ーMet残基に唯一のNdeI部位も提供し、そして2
番目のアミノ酸をArgからAsnに変える。これらの
変化が酵素活性を損なわないとみられ、かつ、修飾され
た植物タンパク質の細菌の発現を実際に向上しうること
が推論された。なぜなら、大腸菌(E. coli)および枯草
菌(B. subtilis)双方のLS相同物はジペプチド配列M
et−Asnで開始するからである。プライマー14
(5’−CATCTT ACT GGA TCC AT
C AGG CCT TCA AATGAT GTT
CG−3’)(配列番号26)は、ホウレンソウLS前
駆体の他端でヌクレオチド648〜667にハイブリダイゼー
ションし、そして終止コドンをちょうど過ぎて唯一のB
amHI部位を提供する。かように、最初の2アミノ酸
を除き、プライマー13および14で発生されるPCR
断片は、配列番号2に示されるものと同一の一次アミノ
酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。
【0161】2個の標的遺伝子の増幅後、このPCR断
片をNdeIおよびBanHIで切断し、そして類似に
切断されたpET−24a(+)(ノヴァジェン(Novag
en))に個々に連結した。後者はT7プロモーターの制
御下にある高レベル大腸菌(E. coli)発現ベクターであ
る。この連結反応混合物のアリコートを、その後、製造
元のプロトコールに従い、BTXトランスフェクター(T
ransfector)100(バイオテクノロジーズ アンド
エクスペリメンタル リサーチ インク(Biotechnologi
es and Experimental Research Inc.))を使用して大腸
菌(E. coli)BL21(DE3)を形質転換するのに使
用した。形質転換された細胞をカナマイシン(50μg/m
L)を含有するLB培地上で培養し、そして37℃でイン
キュベーションして、単一のコロニーを得た。正しい挿
入物をもつプラスミドをもつクローンを、個々の再懸濁
されたコロニーおよび適切なプライマー対(すなわち、
成熟ホウレンソウRS構築物についてプライマー11お
よび12、ならびに成熟ホウレンソウLS構築物につい
てプライマー13および14)を使用するPCR反応に
より同定した。この処置の後、標的遺伝子のそれぞれの
代表的クローンをさらなる操作のため選択し、そしてこ
れらの2株を下述されるような組換えタンパク質の産生
のため使用した。これらの株からのプラスミドDNAを
完全に配列決定してPCRの誤りをチェックし、そして
双方の場合で見出されなかった。
片をNdeIおよびBanHIで切断し、そして類似に
切断されたpET−24a(+)(ノヴァジェン(Novag
en))に個々に連結した。後者はT7プロモーターの制
御下にある高レベル大腸菌(E. coli)発現ベクターであ
る。この連結反応混合物のアリコートを、その後、製造
元のプロトコールに従い、BTXトランスフェクター(T
ransfector)100(バイオテクノロジーズ アンド
エクスペリメンタル リサーチ インク(Biotechnologi
es and Experimental Research Inc.))を使用して大腸
菌(E. coli)BL21(DE3)を形質転換するのに使
用した。形質転換された細胞をカナマイシン(50μg/m
L)を含有するLB培地上で培養し、そして37℃でイン
キュベーションして、単一のコロニーを得た。正しい挿
入物をもつプラスミドをもつクローンを、個々の再懸濁
されたコロニーおよび適切なプライマー対(すなわち、
成熟ホウレンソウRS構築物についてプライマー11お
よび12、ならびに成熟ホウレンソウLS構築物につい
てプライマー13および14)を使用するPCR反応に
より同定した。この処置の後、標的遺伝子のそれぞれの
代表的クローンをさらなる操作のため選択し、そしてこ
れらの2株を下述されるような組換えタンパク質の産生
のため使用した。これらの株からのプラスミドDNAを
完全に配列決定してPCRの誤りをチェックし、そして
双方の場合で見出されなかった。
【0162】成熟ホウレンソウLSおよびRSタンパク
質の過剰発現のため、上述されたBL21(DE3)株
をカナマイシン(50μg/mL)を含有するLB培地で37℃
で成長させた。細胞を、約1.0のA600nmでIPTG(1
mM)で誘導し、そして3時間後に遠心分離により収穫し
た。双方の植物タンパク質が総可溶性タンパク質の15%
を越えるレベルで細菌宿主中で十分に発現された。その
後の操作は0〜4℃でであった。組換えホウレンソウR
Sを含有する細胞ペレットを2.5体積の0.1Mリン酸カリ
ウム(pH7.2)、10mM亜硫酸ナトリウム、10mMEDT
Aに再懸濁し、そしてフレンチ圧小室(French pressure
cell)を20,000psiで2回通過させた。破片を遠心分離
(105×g、1時間)により除去し、そして1mLあたり44
mgのタンパク質を含有する細胞を含まない抽出物をグリ
セロール(5%)で補充し、そして後の使用のため−80
℃で保存した。タンパク質濃度を、標準としてBSAを
使用して、ロウリー(Lowry)らの方法(ロウリー(Lowry)
ら、J. Biol. Chem. 193:265-275(1951))により測定し
た。組換えホウレンソウLSを含有する細胞ペレットを
同一の様式で崩壊させたが、しかし、細胞の再懸濁に使
用された緩衝液は100mMトリス−塩酸(pH7.7)、5mM
硫酸マグネシウム、0.03mg/mLDNアーゼI(シグマ(Si
gma))、0.5mMフェニルメチルスルホニルフロリド、1m
Mジチオスレイトールであり、かつ、細胞を含まない抽
出物のタンパク質濃度は39mg/mLであった。細胞を含ま
ない抽出物のSDS−PAGE分析は、双方の植物タン
パク質が総可溶性タンパク質の20%を越えるレベルで細
菌宿主中で十分に発現されたことを示した。
質の過剰発現のため、上述されたBL21(DE3)株
をカナマイシン(50μg/mL)を含有するLB培地で37℃
で成長させた。細胞を、約1.0のA600nmでIPTG(1
mM)で誘導し、そして3時間後に遠心分離により収穫し
た。双方の植物タンパク質が総可溶性タンパク質の15%
を越えるレベルで細菌宿主中で十分に発現された。その
後の操作は0〜4℃でであった。組換えホウレンソウR
Sを含有する細胞ペレットを2.5体積の0.1Mリン酸カリ
ウム(pH7.2)、10mM亜硫酸ナトリウム、10mMEDT
Aに再懸濁し、そしてフレンチ圧小室(French pressure
cell)を20,000psiで2回通過させた。破片を遠心分離
(105×g、1時間)により除去し、そして1mLあたり44
mgのタンパク質を含有する細胞を含まない抽出物をグリ
セロール(5%)で補充し、そして後の使用のため−80
℃で保存した。タンパク質濃度を、標準としてBSAを
使用して、ロウリー(Lowry)らの方法(ロウリー(Lowry)
ら、J. Biol. Chem. 193:265-275(1951))により測定し
た。組換えホウレンソウLSを含有する細胞ペレットを
同一の様式で崩壊させたが、しかし、細胞の再懸濁に使
用された緩衝液は100mMトリス−塩酸(pH7.7)、5mM
硫酸マグネシウム、0.03mg/mLDNアーゼI(シグマ(Si
gma))、0.5mMフェニルメチルスルホニルフロリド、1m
Mジチオスレイトールであり、かつ、細胞を含まない抽
出物のタンパク質濃度は39mg/mLであった。細胞を含ま
ない抽出物のSDS−PAGE分析は、双方の植物タン
パク質が総可溶性タンパク質の20%を越えるレベルで細
菌宿主中で十分に発現されたことを示した。
【0163】実施例6 組換え成熟ホウレンソウRSの精製 組換えホウレンソウRSを含有する大腸菌(E. coli)の
細胞を含まない抽出物のアリコート(0.5mL)を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で1:1に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター(ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192)を通
して濾過した。サンプル全体をその後、緩衝液Q(50mM
トリス−塩酸、pH7.7、10mM亜硫酸ナトリウム、1mM
EDTA)で25℃で予め平衡化されたモノQ(Mono Q)H
R5/5カラム(ファルマシアバイオテク インク(Pha
rmacia Biotech Inc))に適用した。このカラムを0〜
1.0M塩化ナトリウム(緩衝液Q中)の直線濃度勾配(30
mL)で1.0mL/分で展開し、そして1mLのフラクションを
収集した。ホウレンソウRSが溶出する濃度勾配の位置
を、15%ゲルおよびクマシーブルー染色を使用してSD
S−PAGE(レムリ(Laemmli U)、Nature 227:680-68
5(1970))により決定した。その後、0.167〜0.233M塩化
ナトリウムの間で溶出するカラムフラクションを合わ
せ、そしてセントリコン(Centricon)−10(アミコン
インク(Amicon Inc))で4℃で最終体積450μLに濃縮
した。次の段階で、この素材の半分を、0.3M塩化ナトリ
ウムを含有する緩衝液Qで予め平衡化された7.5×600mm
のTSK G3000SWゲル濾過カラム(トーソー株
式会社(TOSOH Corp.))に適用した。このカラムを1.0m
L/分(25℃)の流速で展開し、そして高度に精製された
ホウレンソウRSは15.2〜16.2分の間に溶出した。後者
を、サンプルの残存する半分を同一の様式で処理する間
氷上に保った。2個のゲル濾過カラムからのピークフラ
クションを合わせ、グリセロール(5%)で補充し、1
mLあたり6.6mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用
のため−80℃で保存した。精製されたタンパク質の収量
は2.9mgであり、細胞を含まない抽出物中に存在した総
タンパク質の13%に相当した。過負荷されたクマシー染
色ゲルの可視的検分は、最終調製物が95%以上純粋であ
ったことを示唆した。
細胞を含まない抽出物のアリコート(0.5mL)を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で1:1に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター(ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192)を通
して濾過した。サンプル全体をその後、緩衝液Q(50mM
トリス−塩酸、pH7.7、10mM亜硫酸ナトリウム、1mM
EDTA)で25℃で予め平衡化されたモノQ(Mono Q)H
R5/5カラム(ファルマシアバイオテク インク(Pha
rmacia Biotech Inc))に適用した。このカラムを0〜
1.0M塩化ナトリウム(緩衝液Q中)の直線濃度勾配(30
mL)で1.0mL/分で展開し、そして1mLのフラクションを
収集した。ホウレンソウRSが溶出する濃度勾配の位置
を、15%ゲルおよびクマシーブルー染色を使用してSD
S−PAGE(レムリ(Laemmli U)、Nature 227:680-68
5(1970))により決定した。その後、0.167〜0.233M塩化
ナトリウムの間で溶出するカラムフラクションを合わ
せ、そしてセントリコン(Centricon)−10(アミコン
インク(Amicon Inc))で4℃で最終体積450μLに濃縮
した。次の段階で、この素材の半分を、0.3M塩化ナトリ
ウムを含有する緩衝液Qで予め平衡化された7.5×600mm
のTSK G3000SWゲル濾過カラム(トーソー株
式会社(TOSOH Corp.))に適用した。このカラムを1.0m
L/分(25℃)の流速で展開し、そして高度に精製された
ホウレンソウRSは15.2〜16.2分の間に溶出した。後者
を、サンプルの残存する半分を同一の様式で処理する間
氷上に保った。2個のゲル濾過カラムからのピークフラ
クションを合わせ、グリセロール(5%)で補充し、1
mLあたり6.6mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用
のため−80℃で保存した。精製されたタンパク質の収量
は2.9mgであり、細胞を含まない抽出物中に存在した総
タンパク質の13%に相当した。過負荷されたクマシー染
色ゲルの可視的検分は、最終調製物が95%以上純粋であ
ったことを示唆した。
【0164】精製された組換えホウレンソウRSのエド
マン分解は、その最初の21アミノ酸が、その構築で使用
されたPCR戦略に従い、配列番号8に示されるタンパ
ク質のものに同一であることを示した。これは、さら
に、組換えタンパク質のN末端が精製処置の間完全なま
まであったことを示す。電子スプレーイオン化質量分析
法により決定されるように、精製された組換えホウレン
ソウRSのプロモーターの分子質量は22808.3ダルト
ン、すなわちそのDNA配列から予測されたもの(2280
7.26ダルトン)と優れた一致にある値であった。大腸菌
(E. coli)(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:
632-637(1980))および酵母(サントス(Santos)ら、J.
Biol. Chem. 270:437-444(1995))のRS相同物(その
双方は天然の状態で三量体である)と類似して、組換え
ホウレンソウRSは65kDaの見かけの分子質量で分析的
ゲル濾過の間に溶出した。より重要には、成熟植物タン
パク質は触媒的に活性である。下述されるインビトロ酵
素アッセイにおいて、精製された組換えホウレンソウR
Sは25℃でおよそ0.08/秒の回転数を表した(プロモー
ターを基礎として)。比較として、37℃でのS.セレビ
シエ(S. cerevisiae)(サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995))および枯草菌(B. subtili
s)(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632-637
(1980))のRSの報告された回転数は、それぞれ0.13/
秒および0.33/秒である。酵素反応が最低2のQ10
(温度係数)により特徴づけられると仮定すれば、これ
らの観察結果は、精製された組換えホウレンソウRSが
おそらく完全に活性であることを示唆する。
マン分解は、その最初の21アミノ酸が、その構築で使用
されたPCR戦略に従い、配列番号8に示されるタンパ
ク質のものに同一であることを示した。これは、さら
に、組換えタンパク質のN末端が精製処置の間完全なま
まであったことを示す。電子スプレーイオン化質量分析
法により決定されるように、精製された組換えホウレン
ソウRSのプロモーターの分子質量は22808.3ダルト
ン、すなわちそのDNA配列から予測されたもの(2280
7.26ダルトン)と優れた一致にある値であった。大腸菌
(E. coli)(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:
632-637(1980))および酵母(サントス(Santos)ら、J.
Biol. Chem. 270:437-444(1995))のRS相同物(その
双方は天然の状態で三量体である)と類似して、組換え
ホウレンソウRSは65kDaの見かけの分子質量で分析的
ゲル濾過の間に溶出した。より重要には、成熟植物タン
パク質は触媒的に活性である。下述されるインビトロ酵
素アッセイにおいて、精製された組換えホウレンソウR
Sは25℃でおよそ0.08/秒の回転数を表した(プロモー
ターを基礎として)。比較として、37℃でのS.セレビ
シエ(S. cerevisiae)(サントス(Santos)ら、J. Biol.
Chem. 270:437-444(1995))および枯草菌(B. subtili
s)(バッハー(Bacher)ら、J. Biol. Chem. 255:632-637
(1980))のRSの報告された回転数は、それぞれ0.13/
秒および0.33/秒である。酵素反応が最低2のQ10
(温度係数)により特徴づけられると仮定すれば、これ
らの観察結果は、精製された組換えホウレンソウRSが
おそらく完全に活性であることを示唆する。
【0165】実施例7 組換え成熟ホウレンソウLSの精製および物理的特性 組換えホウレンソウLSを含有する大腸菌(E. coli)の
細胞を含まない抽出物のアリコート(0.5mL)を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で1:1に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター(ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192)を通
して濾過した。サンプル全体をその後、組換えホウレン
ソウRSについて上述された同一の緩衝液および条件を
使用して、モノQ(Mono Q)HR5/5カラムで分画し
た。0.367〜0.433M塩化ナトリウムの間に溶出する物質
を合わせ、450μLに濃縮し、そして、組換えホウレンソ
ウRSについて、正確に、上述されたように、ゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。高度に精製されたホウレ
ンソウLSは、10.15〜10.85分の間に溶出する鋭いピー
クとして大きさを分ける(sizing)カラムから出現し、そ
してこの物質をグリセロール(5%)で補充し、1mLあ
たり12.1mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用のた
め−80℃で保存した。精製されたタンパク質の最終的収
量は4.3mgであり(細胞を含まない抽出物に存在する総
タンパク質のほぼ22%)、そしてこの調製物はクマシー
染色ゲルから判断されるように本質的に均質であった。
細胞を含まない抽出物のアリコート(0.5mL)を迅速に
室温に解凍し、脱イオン水で1:1に希釈し、そして0.
2μmアクロディスク(Acrodisc)フィルター(ゲルマン
サイエンス(Gelman Science)、カタログ番号4192)を通
して濾過した。サンプル全体をその後、組換えホウレン
ソウRSについて上述された同一の緩衝液および条件を
使用して、モノQ(Mono Q)HR5/5カラムで分画し
た。0.367〜0.433M塩化ナトリウムの間に溶出する物質
を合わせ、450μLに濃縮し、そして、組換えホウレンソ
ウRSについて、正確に、上述されたように、ゲル濾過
クロマトグラフィーにかけた。高度に精製されたホウレ
ンソウLSは、10.15〜10.85分の間に溶出する鋭いピー
クとして大きさを分ける(sizing)カラムから出現し、そ
してこの物質をグリセロール(5%)で補充し、1mLあ
たり12.1mgのタンパク質に濃縮し、そして後の使用のた
め−80℃で保存した。精製されたタンパク質の最終的収
量は4.3mgであり(細胞を含まない抽出物に存在する総
タンパク質のほぼ22%)、そしてこの調製物はクマシー
染色ゲルから判断されるように本質的に均質であった。
【0166】成熟組換えホウレンソウLSのヌクレオチ
ド配列は、16534.71ダルトン、すなわち電子スプレーイ
オン化質量分析法を使用して精製されたタンパク質で得
られたもの(16536.3ダルトン)と事実上同一である値
を予測する。植物LSが、大腸菌(E. coli)(メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(1996))
および枯草菌(B. subtilis)(バッハー(Bacher)ら、J.
Biol. Chem. 255:632-637(1980))相同物のように60個
の同一のサブユニットから成る中空の球状粒子を形成す
ると仮定すれば、その本来の分子質量は約992kDaである
はずである。実際のところ、分析的ゲル濾過の間、精製
された組換えホウレンソウLSは、約823kDaの見かけの
分子質量を表した。従って、このリボフラビン生合成酵
素の四次構造は細菌から高等植物までの進化で高度に保
存されていると思われるとみられる。エドマン分解は、
この組換えタンパク質の最初の2個のN末端アミノ酸残
基が、以前に記述されたように、PCRによりVal−
ArgからMet−Asnに正しく変えられていたこと
を確認した。これらの置換および葉緑体に目標を向ける
配列の除去にもかかわらず、精製された組換えホウレン
ソウLSはなお触媒活性を保持した。25℃で、下述され
るインビトロ酵素アッセイを使用して、その回転数は0.
013/秒であった(プロモーターを基礎として)。この値
は、全て37℃で測定された、精製された大腸菌(E. col
i)、酵母および枯草菌(B. subtilis)の酵素について報
告された回転数(0.06/秒)と合理的一致にある(キス
(Kis)ら、Biochemistry 34:2883-2892(1995);メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(199
6))。かように、組換えホウレンソウLSもまた完全に
活性である可能性が非常に高い。
ド配列は、16534.71ダルトン、すなわち電子スプレーイ
オン化質量分析法を使用して精製されたタンパク質で得
られたもの(16536.3ダルトン)と事実上同一である値
を予測する。植物LSが、大腸菌(E. coli)(メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(1996))
および枯草菌(B. subtilis)(バッハー(Bacher)ら、J.
Biol. Chem. 255:632-637(1980))相同物のように60個
の同一のサブユニットから成る中空の球状粒子を形成す
ると仮定すれば、その本来の分子質量は約992kDaである
はずである。実際のところ、分析的ゲル濾過の間、精製
された組換えホウレンソウLSは、約823kDaの見かけの
分子質量を表した。従って、このリボフラビン生合成酵
素の四次構造は細菌から高等植物までの進化で高度に保
存されていると思われるとみられる。エドマン分解は、
この組換えタンパク質の最初の2個のN末端アミノ酸残
基が、以前に記述されたように、PCRによりVal−
ArgからMet−Asnに正しく変えられていたこと
を確認した。これらの置換および葉緑体に目標を向ける
配列の除去にもかかわらず、精製された組換えホウレン
ソウLSはなお触媒活性を保持した。25℃で、下述され
るインビトロ酵素アッセイを使用して、その回転数は0.
013/秒であった(プロモーターを基礎として)。この値
は、全て37℃で測定された、精製された大腸菌(E. col
i)、酵母および枯草菌(B. subtilis)の酵素について報
告された回転数(0.06/秒)と合理的一致にある(キス
(Kis)ら、Biochemistry 34:2883-2892(1995);メルトル
(Moertl)ら、J. Biol. Chem. 271:33201-33207(199
6))。かように、組換えホウレンソウLSもまた完全に
活性である可能性が非常に高い。
【0167】実施例8 RSおよびLSの基質の調製 6,7−ジメチル−8−(1’−D−リビチル)ルマジ
ン(DMRL)を、以前に記述されたように(プロート
(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、Methods
in Enzymology(マコーミック(McCormick, D.B.)とラ
イト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part B、pp.515-53
8、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨー
ク(1971))合成し、そして、水ないしメタノールの濃度
勾配で展開されるC−18カラムでのHPLCにより精製
した。精製された物質をロトバップ(rotovap)で乾固と
し、そして後の使用のため−20℃で保存した。
ン(DMRL)を、以前に記述されたように(プロート
(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、Methods
in Enzymology(マコーミック(McCormick, D.B.)とラ
イト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part B、pp.515-53
8、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨー
ク(1971))合成し、そして、水ないしメタノールの濃度
勾配で展開されるC−18カラムでのHPLCにより精製
した。精製された物質をロトバップ(rotovap)で乾固と
し、そして後の使用のため−20℃で保存した。
【0168】4−リビチルアミノ−5−アミノ−2,6
−ジヒドロキシピリミジン(RAADP)を、触媒的水
素化(プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey,
R.A.)、Methods in Enzymology(マコーミック(McCormi
ck, D.B.)とライト(Wright,L.D.)、編)vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971))により4−リビチルアミノ−
5−ニトロソ−2,6−ジヒドロキシピリミジンから調
製した。40mLの反応混合物は、10mM酢酸に溶解された0.
4mmolの後者の化合物および20mgの10%炭素上パラジウ
ム(palladium on carbon)を含有した。25℃での一夜の
インキュベーション期間(50psiの水素下での穏やかな
振とうを伴う)の後、触媒を濾過により除去し、そして
RAADPを含有する濾液をアリコートで−80℃で保存
した。
−ジヒドロキシピリミジン(RAADP)を、触媒的水
素化(プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey,
R.A.)、Methods in Enzymology(マコーミック(McCormi
ck, D.B.)とライト(Wright,L.D.)、編)vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971))により4−リビチルアミノ−
5−ニトロソ−2,6−ジヒドロキシピリミジンから調
製した。40mLの反応混合物は、10mM酢酸に溶解された0.
4mmolの後者の化合物および20mgの10%炭素上パラジウ
ム(palladium on carbon)を含有した。25℃での一夜の
インキュベーション期間(50psiの水素下での穏やかな
振とうを伴う)の後、触媒を濾過により除去し、そして
RAADPを含有する濾液をアリコートで−80℃で保存
した。
【0169】3,4−ジヒドロキシブタノン4−リン酸
(DHBP)はD−リボース5−リン酸から酵素的に調
製した。反応混合物は、50mMトリス−塩酸(pH7.
5)、20mM塩化マグネシウム、20mMD−リボース5−リ
ン酸、10単位/mLホスホリボイソメラーゼ(シグマ(Sig
ma)、カタログ番号P7434)および0.3単位/mL大腸菌(E.
coli)DHBPシンターゼを含有した。25℃で2時間
後、反応は完了に到達し、そしてDHBPを含有する溶
液のアリコートを−80℃で保存した。
(DHBP)はD−リボース5−リン酸から酵素的に調
製した。反応混合物は、50mMトリス−塩酸(pH7.
5)、20mM塩化マグネシウム、20mMD−リボース5−リ
ン酸、10単位/mLホスホリボイソメラーゼ(シグマ(Sig
ma)、カタログ番号P7434)および0.3単位/mL大腸菌(E.
coli)DHBPシンターゼを含有した。25℃で2時間
後、反応は完了に到達し、そしてDHBPを含有する溶
液のアリコートを−80℃で保存した。
【0170】実施例9 リボフラビンシンターゼアッセイ リボフラビンシンターゼアッセイを、50mMトリス−塩酸
(pH7.5)中に0.1mMDMRLを含有する1mLの反応混
合物を使用して25℃で行った。反応は精製された組換え
ホウレンソウRSの添加により開始し、そして反応の初
期速度を470nmで継続的に測定した。470nmで9500のモル
吸光係数(ε)を使用してリボフラビンの形成を計算し
た(プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.
A.)、Methods in Enzymology(マコーミック(McCormic
k, D.B.)とライト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971))。
(pH7.5)中に0.1mMDMRLを含有する1mLの反応混
合物を使用して25℃で行った。反応は精製された組換え
ホウレンソウRSの添加により開始し、そして反応の初
期速度を470nmで継続的に測定した。470nmで9500のモル
吸光係数(ε)を使用してリボフラビンの形成を計算し
た(プロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.
A.)、Methods in Enzymology(マコーミック(McCormic
k, D.B.)とライト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part
B、pp.515-538、アカデミックプレス(Academic Pres
s)、ニューヨーク(1971))。
【0171】阻害剤のスクリーニングを96穴プレートで
実施した。潜在的阻害性化合物をジメチルスルホキシド
(DMSO)に溶解し(10mg/mL)、そしてその後、1
%水性DMSO中0.1mg/mLの濃度まで水で連続的に希釈
した。反応混合物(計0.21mL)は、25℃で、0.115mLの1
00mMトリス−塩酸(pH7.5)中DMRL(0.035mM)お
よび0.085mLの潜在的阻害性化合物(0.1mg/mL)を含有
した。酵素で反応を開始する前に470nmでの吸光度を記
録した。反応を、0.01mLの精製された組換えホウレンソ
ウRS(0.28mg/mL)で開始し、そして25℃で3分のイ
ンキュベーション後、プレートを470nmで読んだ。最初
の吸光度の読みを2番目から差し引いてリボフラビン形
成速度を与えた。96穴プレートのカラム1は化合物を含
有せず、そしてこれらの穴での反応は阻害されない対照
としてはたらいた。リボフラビン形成速度を低下させた
化合物(阻害されない対照反応に比較して)を1mLの確
認アッセイで追跡し、IC50を決定した。
実施した。潜在的阻害性化合物をジメチルスルホキシド
(DMSO)に溶解し(10mg/mL)、そしてその後、1
%水性DMSO中0.1mg/mLの濃度まで水で連続的に希釈
した。反応混合物(計0.21mL)は、25℃で、0.115mLの1
00mMトリス−塩酸(pH7.5)中DMRL(0.035mM)お
よび0.085mLの潜在的阻害性化合物(0.1mg/mL)を含有
した。酵素で反応を開始する前に470nmでの吸光度を記
録した。反応を、0.01mLの精製された組換えホウレンソ
ウRS(0.28mg/mL)で開始し、そして25℃で3分のイ
ンキュベーション後、プレートを470nmで読んだ。最初
の吸光度の読みを2番目から差し引いてリボフラビン形
成速度を与えた。96穴プレートのカラム1は化合物を含
有せず、そしてこれらの穴での反応は阻害されない対照
としてはたらいた。リボフラビン形成速度を低下させた
化合物(阻害されない対照反応に比較して)を1mLの確
認アッセイで追跡し、IC50を決定した。
【0172】実施例10 ルマジンシンターゼアッセイ ルマジンシンターゼアッセイを、25℃で50mMトリス−塩
酸(pH7.5)中に0.05mMRAADPおよび0.05mMDH
BPを含有する1mLの反応混合物を使用して行った。反
応をその後、精製された組換えホウレンソウLSの添加
により開始し、そして反応の初期速度を408nmの吸光度
で継続的にモニターした。408nmで10,000のモル吸光係
数(ε)を使用してDMRLの形成速度を計算した(プ
ロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、M
ethods in Enzymology(マコーミック(McCormick, D.
B.)とライト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part B、p
p.515-538、アカデミックプレス(Academic Press)、ニ
ューヨーク(1971))。
酸(pH7.5)中に0.05mMRAADPおよび0.05mMDH
BPを含有する1mLの反応混合物を使用して行った。反
応をその後、精製された組換えホウレンソウLSの添加
により開始し、そして反応の初期速度を408nmの吸光度
で継続的にモニターした。408nmで10,000のモル吸光係
数(ε)を使用してDMRLの形成速度を計算した(プ
ロート(Plaut, G.W.E.)とハーヴェイ(Harvey, R.A.)、M
ethods in Enzymology(マコーミック(McCormick, D.
B.)とライト(Wright, L.D.)、編)vol. 18、part B、p
p.515-538、アカデミックプレス(Academic Press)、ニ
ューヨーク(1971))。
【0173】阻害剤のスクリーニングを96穴プレートで
実施する。潜在的阻害性化合物を10%水性DMSOに1
mg/mLの濃度に溶解する。反応混合物(計0.21mL)を、2
5℃で、0.005mLの潜在的阻害性化合物(1.0mg/mL)を50
mMトリス−塩酸(pH7.5)中に0.05mMDHBP、0.05m
MRAADPを含有する0.195mLの溶液に添加することに
より調製する。反応を、その後、0.01mLの精製された組
換えホウレンソウLS(1.6mg/mL)で開始し、そして反
応の進行を408nmで5分間継続的にモニターする。96穴
プレートのカラム1は試験化合物を含有せず、そしてこ
れらの穴でのDMRL形成速度は阻害されない対照とし
てはたらく。DMRL形成速度を低下させる化合物(阻
害されない対照に比較して)を、1mLの確認アッセイで
追跡し、IC50を決定する。
実施する。潜在的阻害性化合物を10%水性DMSOに1
mg/mLの濃度に溶解する。反応混合物(計0.21mL)を、2
5℃で、0.005mLの潜在的阻害性化合物(1.0mg/mL)を50
mMトリス−塩酸(pH7.5)中に0.05mMDHBP、0.05m
MRAADPを含有する0.195mLの溶液に添加することに
より調製する。反応を、その後、0.01mLの精製された組
換えホウレンソウLS(1.6mg/mL)で開始し、そして反
応の進行を408nmで5分間継続的にモニターする。96穴
プレートのカラム1は試験化合物を含有せず、そしてこ
れらの穴でのDMRL形成速度は阻害されない対照とし
てはたらく。DMRL形成速度を低下させる化合物(阻
害されない対照に比較して)を、1mLの確認アッセイで
追跡し、IC50を決定する。
【0174】実施例11 他の植物および真菌のRSおよびLS遺伝子 実施例4に記述された方法論を使用して、いくつかの他
の植物および真菌のLSおよびRSのcDNAが、大腸
菌(E. coli)リボフラビン栄養要求体の機能的相補によ
りクローニングされている。これらは、アラビドプシス
RS、タバコLSおよびアラビドプシスLSの核にコー
ドされた前駆体タンパク質、ならびに、コメ胚真菌マグ
ナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)からの完全長
成熟RSおよびLSタンパク質を包含する。これらのタ
ンパク質のORFのヌクレオチド配列は、それぞれ配列
番号35、配列番号29、配列番号31、配列番号11
および配列番号37に詳細に記録され、また、それらの
対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号36、配列番
号30、配列番号32、配列番号12および配列番号3
8に与えられる。それからアラビドプシスLSおよびR
S遺伝子ならびにタバコLS遺伝子がクローニングされ
たλ cDNA発現ライブラリーは、ストラタジーン(S
tratagene)から商業的に入手可能である(それぞれカタ
ログ番号937010および936002)。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthe grisea)RS遺伝子が得られた
cDNA発現ライブラリーは、λ ZipLoxベクタ
ー(ギブコBRL(Gibco BRL))中にポリリンカー領域
のNotIとSalI切断部位との間に含有され、そし
て慣用方法(マニアティス(Maniatis))を使用して、単
離されたmRNAから調製した。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthegrisea)LS遺伝子が得られた
cDNA発現ライブラリーを、ストラタジーン(Stratag
ene)から入手可能なプラスミドベクターpBluesc
ript II SK(+)のEcoRIとXhoI部位
との間にクローニングし、そしてまた標準的処置(マニ
アティス(Maniatis))を使用して、単離されたmRNA
から調製した。ホウレンソウLSおよびRS前駆体遺伝
子のクローニングについて上述されたように(実施例4
でのように)、多様なλ cDNA発現ライブラリーを
まず集団除去を受けさせてプラスミドcDNAライブラ
リーを生じさせ、これをその後電気穿孔法を介して大腸
菌(E. coli)LSおよびRS栄養要求体(W3110誘
導体)に導入した。この処置の後、形質転換体を、添加
されたリボフラビンの非存在下での成長について(Bア
ガーを含有するプレート上で)選択し、そして救助する
プラスミドのcDNA挿入物を単離し、かつ注文設計さ
れたいプライマーを使用して完全に配列決定した。
の植物および真菌のLSおよびRSのcDNAが、大腸
菌(E. coli)リボフラビン栄養要求体の機能的相補によ
りクローニングされている。これらは、アラビドプシス
RS、タバコLSおよびアラビドプシスLSの核にコー
ドされた前駆体タンパク質、ならびに、コメ胚真菌マグ
ナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)からの完全長
成熟RSおよびLSタンパク質を包含する。これらのタ
ンパク質のORFのヌクレオチド配列は、それぞれ配列
番号35、配列番号29、配列番号31、配列番号11
および配列番号37に詳細に記録され、また、それらの
対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号36、配列番
号30、配列番号32、配列番号12および配列番号3
8に与えられる。それからアラビドプシスLSおよびR
S遺伝子ならびにタバコLS遺伝子がクローニングされ
たλ cDNA発現ライブラリーは、ストラタジーン(S
tratagene)から商業的に入手可能である(それぞれカタ
ログ番号937010および936002)。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthe grisea)RS遺伝子が得られた
cDNA発現ライブラリーは、λ ZipLoxベクタ
ー(ギブコBRL(Gibco BRL))中にポリリンカー領域
のNotIとSalI切断部位との間に含有され、そし
て慣用方法(マニアティス(Maniatis))を使用して、単
離されたmRNAから調製した。それからマグナポルテ
グリセア(Magnaporthegrisea)LS遺伝子が得られた
cDNA発現ライブラリーを、ストラタジーン(Stratag
ene)から入手可能なプラスミドベクターpBluesc
ript II SK(+)のEcoRIとXhoI部位
との間にクローニングし、そしてまた標準的処置(マニ
アティス(Maniatis))を使用して、単離されたmRNA
から調製した。ホウレンソウLSおよびRS前駆体遺伝
子のクローニングについて上述されたように(実施例4
でのように)、多様なλ cDNA発現ライブラリーを
まず集団除去を受けさせてプラスミドcDNAライブラ
リーを生じさせ、これをその後電気穿孔法を介して大腸
菌(E. coli)LSおよびRS栄養要求体(W3110誘
導体)に導入した。この処置の後、形質転換体を、添加
されたリボフラビンの非存在下での成長について(Bア
ガーを含有するプレート上で)選択し、そして救助する
プラスミドのcDNA挿入物を単離し、かつ注文設計さ
れたいプライマーを使用して完全に配列決定した。
【0175】図3に示されるように、クローニングされ
たホウレンソウおよびアラビドプシスのRSは非常に類
似である。双方のタンパク質は、それらのN末端に葉緑
体に目標を向ける配列(図3中の囲まれた残基)をもつ
より大きな分子量の前駆体として合成される。2個の植
物種の輸送ペプチドは匹敵する長さのものであるとは言
え、それらは高度に互いに異なり、また、一次アミノ酸
配列のレベルで相互にほとんど類似度をもたない。対照
的に、成熟ホウレンソウおよびアラビドプシスのRSは
十分に保存され、それらの残基のほぼ70%が同一であ
る。これらの観察結果は驚くことでない。なぜなら、リ
ブロース−1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキ
シゲナーゼ(マズール(Mazur)ら、Nucl. Acids Res. 1
3:2373-2386(1985))の小サブユニットの前駆体を包含
する、大部分の核にコードされる葉緑体タンパク質は、
その分子の成熟部分でよりそれらの葉緑体に対して標的
化された配列でずっとより大きな種間の(species-to-sp
ecies)変動を表すからである。2種の植物RS相同物は
また、現在配列決定されている細菌および真菌のRS相
同物に存在しない多数のポリペプチドモチーフも保有す
る。植物に独特であるこれらの高度に保存された領域の
いくつかが高等植物のRSの触媒および/もしくは調節
特性に特異的に影響し、それにより除草剤として有用で
あり得る酵素阻害剤の設計に価値ある洞察を提供しうる
ことが可能である。
たホウレンソウおよびアラビドプシスのRSは非常に類
似である。双方のタンパク質は、それらのN末端に葉緑
体に目標を向ける配列(図3中の囲まれた残基)をもつ
より大きな分子量の前駆体として合成される。2個の植
物種の輸送ペプチドは匹敵する長さのものであるとは言
え、それらは高度に互いに異なり、また、一次アミノ酸
配列のレベルで相互にほとんど類似度をもたない。対照
的に、成熟ホウレンソウおよびアラビドプシスのRSは
十分に保存され、それらの残基のほぼ70%が同一であ
る。これらの観察結果は驚くことでない。なぜなら、リ
ブロース−1,5−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキ
シゲナーゼ(マズール(Mazur)ら、Nucl. Acids Res. 1
3:2373-2386(1985))の小サブユニットの前駆体を包含
する、大部分の核にコードされる葉緑体タンパク質は、
その分子の成熟部分でよりそれらの葉緑体に対して標的
化された配列でずっとより大きな種間の(species-to-sp
ecies)変動を表すからである。2種の植物RS相同物は
また、現在配列決定されている細菌および真菌のRS相
同物に存在しない多数のポリペプチドモチーフも保有す
る。植物に独特であるこれらの高度に保存された領域の
いくつかが高等植物のRSの触媒および/もしくは調節
特性に特異的に影響し、それにより除草剤として有用で
あり得る酵素阻害剤の設計に価値ある洞察を提供しうる
ことが可能である。
【0176】また機能的相補によりクローニングされた
ホウレンソウ、タバコおよびアラビドプシスのLS前駆
体タンパク質の比較は類似の状況を提供する(図4)。
再度、3種の前駆体の葉緑体輸送ペプチドは乏しく保存
され(囲まれた残基)る一方、成熟タンパク質はアミノ
酸配列レベルで72〜76%の同一性を表す。加えて、全3
種の植物タンパク質は、それらのC末端にアミノ酸残基
の独特の伸長(例えばASLFEHHLK(配列番号3
9))、すなわち微生物LS相同物で高度に相互に異な
るポリペプチドの領域を保有する。これら9残基が3種
の異なる植物種について同一であることは、それらが高
等植物タンパク質の機能性に特に重要でありうることを
示唆する。この観察結果を基礎とすれば、本明細書に記
述される精製された植物LSタンパク質でのさらなる構
造的および機械的研究が、特異的に除草性である酵素阻
害剤の合理的設計を大きく補助することができることが
予期される。
ホウレンソウ、タバコおよびアラビドプシスのLS前駆
体タンパク質の比較は類似の状況を提供する(図4)。
再度、3種の前駆体の葉緑体輸送ペプチドは乏しく保存
され(囲まれた残基)る一方、成熟タンパク質はアミノ
酸配列レベルで72〜76%の同一性を表す。加えて、全3
種の植物タンパク質は、それらのC末端にアミノ酸残基
の独特の伸長(例えばASLFEHHLK(配列番号3
9))、すなわち微生物LS相同物で高度に相互に異な
るポリペプチドの領域を保有する。これら9残基が3種
の異なる植物種について同一であることは、それらが高
等植物タンパク質の機能性に特に重要でありうることを
示唆する。この観察結果を基礎とすれば、本明細書に記
述される精製された植物LSタンパク質でのさらなる構
造的および機械的研究が、特異的に除草性である酵素阻
害剤の合理的設計を大きく補助することができることが
予期される。
【0177】本発明までに配列決定されていた唯一の真
菌のLSおよびRS相同物はS.セレビシエ(S. cerevi
siae)のものである(ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramir
ez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995);サン
トス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(199
5))。これらのタンパク質は、機能的相補により本研究
でクローニングされたマグナポルテ グリセア(Magnapo
rthe grisea)LSおよびRSタンパク質にほとんど類似
度をもたない。2種の真菌のRS相同物は一次アミノ酸
配列レベルで47%のみ同一である。類似の保存の程度
は、マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)と
S.セレビシエ(S. cerevisiae)のLSタンパク質との
間で観察される(51%同一性)一方、前者は、他の既知
の微生物相同物より有意に長い。さらに、このタンパク
質の付加的長さは、高等植物のLSおよびRS前駆体に
ついて上述されたような切断可能なN末端の目標に向け
る配列の存在のためではない。代わりに、それは、その
タンパク質のほぼ中央の右に挿入されていると思われる
独特のポリペプチド区分を保有し;他のLS相同物との
配列の整列を基礎とすれば、付加的残基(主としてSe
rおよびThrから成る)はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)LSのアミノ酸74〜104に対応する
(配列番号38)。この観察結果の重要性は未だ理解さ
れないが、しかし、それは、コメ胚の処理での使用のた
めの新規殺真菌剤の開発において実用的応用性を有し得
る。
菌のLSおよびRS相同物はS.セレビシエ(S. cerevi
siae)のものである(ガルシア・ラミレズ(Garcia-Ramir
ez)ら、J. Biol. Chem. 270:23801-23807(1995);サン
トス(Santos)ら、J. Biol. Chem. 270:437-444(199
5))。これらのタンパク質は、機能的相補により本研究
でクローニングされたマグナポルテ グリセア(Magnapo
rthe grisea)LSおよびRSタンパク質にほとんど類似
度をもたない。2種の真菌のRS相同物は一次アミノ酸
配列レベルで47%のみ同一である。類似の保存の程度
は、マグナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)と
S.セレビシエ(S. cerevisiae)のLSタンパク質との
間で観察される(51%同一性)一方、前者は、他の既知
の微生物相同物より有意に長い。さらに、このタンパク
質の付加的長さは、高等植物のLSおよびRS前駆体に
ついて上述されたような切断可能なN末端の目標に向け
る配列の存在のためではない。代わりに、それは、その
タンパク質のほぼ中央の右に挿入されていると思われる
独特のポリペプチド区分を保有し;他のLS相同物との
配列の整列を基礎とすれば、付加的残基(主としてSe
rおよびThrから成る)はマグナポルテ グリセア(M
agnaporthe grisea)LSのアミノ酸74〜104に対応する
(配列番号38)。この観察結果の重要性は未だ理解さ
れないが、しかし、それは、コメ胚の処理での使用のた
めの新規殺真菌剤の開発において実用的応用性を有し得
る。
【0178】なお、本発明の主要な特徴もしくは態様を
以下に挙げる。
以下に挙げる。
【0179】1.(a)配列番号2、配列番号4および
配列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片; (b)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類似で
ある単離された核酸断片; (c)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同
一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
断片;ならびに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物LS
酵素をコードする単離された核酸断片。
配列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断
片; (b)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類似で
ある単離された核酸断片; (c)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同
一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
断片;ならびに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物LS
酵素をコードする単離された核酸断片。
【0180】2.配列番号1、配列番号3および配列番
号5から成る群から選択される、前記1の単離された核
酸断片。
号5から成る群から選択される、前記1の単離された核
酸断片。
【0181】3.植物がホウレンソウ、タバコもしくは
アラビドプシスである、植物のLS酵素をコードする前
記1の単離された核酸断片。
アラビドプシスである、植物のLS酵素をコードする前
記1の単離された核酸断片。
【0182】4.前記1の単離された核酸断片によりコ
ードされるポリペプチド。
ードされるポリペプチド。
【0183】5.配列番号2、配列番号4および配列番
号6から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくと
も72%の同一性を有する、請求項2のポリペプチド。
号6から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくと
も72%の同一性を有する、請求項2のポリペプチド。
【0184】6.配列番号2、配列番号4および配列番
号6から成る群から選択される、請求項2のポリペプチ
ド。
号6から成る群から選択される、請求項2のポリペプチ
ド。
【0185】7.適する調節配列に操作可能に連結され
た、前記1の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺
伝子。
た、前記1の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺
伝子。
【0186】8.宿主細胞および前記4のキメラ遺伝子
を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【0187】9.宿主細胞が植物細胞である、前記5の
形質転換された宿主細胞。
形質転換された宿主細胞。
【0188】10.宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記5の形質転換された宿主細胞。
る、前記5の形質転換された宿主細胞。
【0189】11.(a)宿主細胞を請求項4のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のLS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のLS酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のLS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のLS酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
【0190】12.(a)前記1の核酸断片でcDNA
もしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記1の核酸断片とハイブリダイゼーションする
DNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする核酸断片を得る方法
であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、植物のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする方法。
もしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記1の核酸断片とハイブリダイゼーションする
DNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的部分をコードする核酸断片を得る方法
であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、植物のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする方法。
【0191】13.(a)配列番号1、配列番号3およ
び配列番号5から成る群から選択される配列の一部に対
応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること;
そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、およびクローニングベクターの配列を表すプライマ
ーを使用して、クローニングベクターに存在するcDN
A挿入物を増幅すること、を含んで成る、植物のLS酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードする核酸断片を得る方法であって、増幅された
cDNA挿入物が植物のLS酵素をコードするアミノ酸
配列の一部をコードする方法。
び配列番号5から成る群から選択される配列の一部に対
応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること;
そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマ
ー、およびクローニングベクターの配列を表すプライマ
ーを使用して、クローニングベクターに存在するcDN
A挿入物を増幅すること、を含んで成る、植物のLS酵
素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分
をコードする核酸断片を得る方法であって、増幅された
cDNA挿入物が植物のLS酵素をコードするアミノ酸
配列の一部をコードする方法。
【0192】14.前記7もしくは8の方法の産物。
【0193】15.前記1の単離された核酸断片により
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主細胞の内因性LS遺伝子を崩壊
させて微生物宿主細胞の成長を添加されたリボフラビン
に依存性とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のLS酵素をコードしかつ微生物宿主細胞によるその発
現を可能にする最低1個の適する調節配列に操作可能に
連結された、前記1の単離された核酸断片を含んで成る
キメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物LS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること; (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主細胞の内因性LS遺伝子を崩壊
させて微生物宿主細胞の成長を添加されたリボフラビン
に依存性とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のLS酵素をコードしかつ微生物宿主細胞によるその発
現を可能にする最低1個の適する調節配列に操作可能に
連結された、前記1の単離された核酸断片を含んで成る
キメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物LS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること; (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
【0194】16.核酸断片が配列番号1、配列番号3
および配列番号5から成る群から選択され、かつ、LS
酵素が、配列番号2、配列番号4および配列番号6から
成る群から選択される、前記10の方法。
および配列番号5から成る群から選択され、かつ、LS
酵素が、配列番号2、配列番号4および配列番号6から
成る群から選択される、前記10の方法。
【0195】17.前記1の単離された核酸断片により
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 (a)宿主細胞を、植物のLS酵素をコードする前記1
の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質
転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低1個の
適する調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、植物の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される植物の
LS酵素を精製すること; (d)植物のLS酵素を目的の化合物と接触させるこ
と;そして (e)目的の化合物の非存在下での植物のLS酵素の活
性に関して植物のLS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
る方法。
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 (a)宿主細胞を、植物のLS酵素をコードする前記1
の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質
転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低1個の
適する調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、植物の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される植物の
LS酵素を精製すること; (d)植物のLS酵素を目的の化合物と接触させるこ
と;そして (e)目的の化合物の非存在下での植物のLS酵素の活
性に関して植物のLS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
る方法。
【0196】18.核酸断片が、配列番号1、配列番号
3および配列番号5から成る群から選択され、かつ、L
S酵素が、配列番号2、配列番号4および配列番号6か
ら成る群から選択される、前記11の方法。
3および配列番号5から成る群から選択され、かつ、L
S酵素が、配列番号2、配列番号4および配列番号6か
ら成る群から選択される、前記11の方法。
【0197】19.(a)配列番号8および配列番号1
0から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしく
は本質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする単離された核酸断片に本質的に類似である単離さ
れた核酸断片; (c)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有す
るポリペプチドをコードする単離された核酸断片;なら
びに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物のR
S酵素をコードする単離された植物の核酸断片。
0から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしく
は本質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする単離された核酸断片に本質的に類似である単離さ
れた核酸断片; (c)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有す
るポリペプチドをコードする単離された核酸断片;なら
びに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物のR
S酵素をコードする単離された植物の核酸断片。
【0198】20.配列番号7および配列番号9から成
る群から選択される、前記19の単離された核酸断片。
る群から選択される、前記19の単離された核酸断片。
【0199】21.植物がホウレンソウもしくはアラビ
ドプシスである、植物のRS酵素をコードする前記19
の単離された核酸断片。
ドプシスである、植物のRS酵素をコードする前記19
の単離された核酸断片。
【0200】22.前記19の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
りコードされるポリペプチド。
【0201】23.配列番号8および配列番号10から
成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の
同一性を有する、前記22のポリペプチド。
成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の
同一性を有する、前記22のポリペプチド。
【0202】24.配列番号8および配列番号10から
成る群から選択される、前記22のポリペプチド。
成る群から選択される、前記22のポリペプチド。
【0203】25.適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記19の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
れる、前記19の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【0204】26.宿主細胞および前記25のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【0205】27.宿主細胞が植物細胞である、前記2
6の形質転換された宿主細胞。
6の形質転換された宿主細胞。
【0206】28.宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記26の形質転換された宿主細胞。
る、前記26の形質転換された宿主細胞。
【0207】29.(a)宿主細胞を前記25のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のRS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のRS酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における植物のRS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関して
形質転換された宿主細胞での植物のRS酵素の変えられ
たレベルの産生をもたらす方法。
【0208】30.(a)前記19の核酸断片でcDN
Aもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記19の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断
片が、植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
Aもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記19の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断
片が、植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
【0209】31.(a)配列番号7および配列番号9
から成る群から選択される配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成すること;そして(b)
段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、およびク
ローニングベクターの配列を表すプライマーを使用し
て、クローニングベクターに存在するcDNA挿入物を
増幅すること、を含んで成る、植物のRS酵素をコード
するアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードす
る核酸断片を得る方法であって、増幅されたcDNA挿
入物が植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の一部
をコードする方法。
から成る群から選択される配列の一部に対応するオリゴ
ヌクレオチドプライマーを合成すること;そして(b)
段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、およびク
ローニングベクターの配列を表すプライマーを使用し
て、クローニングベクターに存在するcDNA挿入物を
増幅すること、を含んで成る、植物のRS酵素をコード
するアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードす
る核酸断片を得る方法であって、増幅されたcDNA挿
入物が植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の一部
をコードする方法。
【0210】32.前記30もしくは31の方法の産
物。
物。
【0211】33.前記19の単離された核酸断片によ
りコードされる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物
を除草剤の候補と同定するためのインビボの方法であっ
て、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記19の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
りコードされる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物
を除草剤の候補と同定するためのインビボの方法であっ
て、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、植物
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記19の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。
【0212】34.核酸断片が配列番号7および配列番
号9から成る群から選択され、かつ、RS酵素が配列番
号8および配列番号10から成る群から選択される、前
記33の方法。
号9から成る群から選択され、かつ、RS酵素が配列番
号8および配列番号10から成る群から選択される、前
記33の方法。
【0213】35.前記19の核酸断片によりコードさ
れる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物を除草剤の
候補と同定するためのインビトロの方法であって、当該
方法は、 (a)適する微生物宿主細胞を、植物のRS酵素をコー
ドする前記19の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で
形質転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低1
個の適する調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させて、
植物のRS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された微生物宿主細胞により発現される
植物のRS酵素を精製すること;(d)植物のRS酵素
を目的の化合物と接触させること;そして(e)目的の
化合物の非存在下での植物のRS酵素の活性に関して植
物のRS酵素の活性を低下させる目的の化合物を除草剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
れる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物を除草剤の
候補と同定するためのインビトロの方法であって、当該
方法は、 (a)適する微生物宿主細胞を、植物のRS酵素をコー
ドする前記19の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で
形質転換することであって、当該キメラ遺伝子は最低1
個の適する調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させて、
植物のRS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された微生物宿主細胞により発現される
植物のRS酵素を精製すること;(d)植物のRS酵素
を目的の化合物と接触させること;そして(e)目的の
化合物の非存在下での植物のRS酵素の活性に関して植
物のRS酵素の活性を低下させる目的の化合物を除草剤
の候補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
【0214】36.核酸断片が配列番号7および配列番
号9から成る群から選択され、かつ、RS酵素が配列番
号8および配列番号10から成る群から選択される、前
記35の方法。
号9から成る群から選択され、かつ、RS酵素が配列番
号8および配列番号10から成る群から選択される、前
記35の方法。
【0215】37.(a)配列番号12に述べられるア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号12に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片; (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のRS酵素を
コードする単離された核酸断片。38.配列番号11に
述べられるような、前記37の単離された核酸断片。
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号12に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片; (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のRS酵素を
コードする単離された核酸断片。38.配列番号11に
述べられるような、前記37の単離された核酸断片。
【0216】39.マグナポルテ グリセア(Magnaport
he grisea)から得られる真菌のRS酵素をコードする、
前記37の単離された核酸断片。
he grisea)から得られる真菌のRS酵素をコードする、
前記37の単離された核酸断片。
【0217】40.前記37の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
りコードされるポリペプチド。
【0218】41.配列番号12に述べられるようなア
ミノ酸配列を有する、前記40のポリペプチド。
ミノ酸配列を有する、前記40のポリペプチド。
【0219】42.適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記37の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
れる、前記37の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【0220】43.宿主細胞および前記42のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【0221】44.宿主細胞が植物細胞である、前記4
3の形質転換された宿主細胞。
3の形質転換された宿主細胞。
【0222】45.宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記43の形質転換された宿主細胞。
る、前記43の形質転換された宿主細胞。
【0223】46.(a)宿主細胞を前記42のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のRSの発現レベルを変える方法であっ
て、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関してマ
グナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)RS酵素の
変えられたレベルの産生をもたらす方法。
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のRSの発現レベルを変える方法であっ
て、形質転換されない宿主細胞の発現レベルに関してマ
グナポルテ グリセア(Magnaporthe grisea)RS酵素の
変えられたレベルの産生をもたらす方法。
【0224】47.(a)前記37の単離された核酸断
片でcDNAもしくはゲノムライブラリーに探りを入れ
ること; (b)前記37の単離された核酸断片とハイブリダイゼ
ーションするDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方法で
あって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部もしく
は本質的に全部をコードする方法。
片でcDNAもしくはゲノムライブラリーに探りを入れ
ること; (b)前記37の単離された核酸断片とハイブリダイゼ
ーションするDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方法で
あって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部もしく
は本質的に全部をコードする方法。
【0225】48.(a)配列番号11に述べられる配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオ
チドプライマー、およびクローニングベクターの配列を
表すプライマーを使用して、クローニングベクターに存
在するcDNA挿入物を増幅すること、を含んで成る、
真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする核酸断片を得る方法であって、増
幅されたcDNA挿入物がマグナポルテ グリセア(Mag
naporthe grisea)RS酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオ
チドプライマー、およびクローニングベクターの配列を
表すプライマーを使用して、クローニングベクターに存
在するcDNA挿入物を増幅すること、を含んで成る、
真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする核酸断片を得る方法であって、増
幅されたcDNA挿入物がマグナポルテ グリセア(Mag
naporthe grisea)RS酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
【0226】49.前記47もしくは48の方法の産
物。
物。
【0227】50.前記37の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記37の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された宿主細胞の成長を阻害する目
的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を
含んで成る方法。
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記37の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された宿主細胞の成長を阻害する目
的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を
含んで成る方法。
【0228】51.単離された核酸断片が配列番号11
の配列に対応し、かつ、RS酵素断片が配列番号12の
配列に対応する、前記50の方法。
の配列に対応し、かつ、RS酵素断片が配列番号12の
配列に対応する、前記50の方法。
【0229】52.前記37の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を同定するためのインビトロの方法であって、当該方法
は、 (a)宿主細胞を、真菌のRS酵素をコードする前記3
7の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形
質転換することであって、当該遺伝子は最低1個の適す
る調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
RS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
RS酵素を精製すること;(d)真菌のRS酵素を化合
物と接触させること;そして(e)目的の化合物の非存
在下での真菌のRS酵素の活性に関して真菌のRS酵素
の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候補と同
定すること、の段階を含んで成る方法。
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を同定するためのインビトロの方法であって、当該方法
は、 (a)宿主細胞を、真菌のRS酵素をコードする前記3
7の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形
質転換することであって、当該遺伝子は最低1個の適す
る調節配列に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
RS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
RS酵素を精製すること;(d)真菌のRS酵素を化合
物と接触させること;そして(e)目的の化合物の非存
在下での真菌のRS酵素の活性に関して真菌のRS酵素
の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候補と同
定すること、の段階を含んで成る方法。
【0230】53.単離された核酸断片が配列番号11
の配列に対応し、かつ、真菌のRS酵素断片が配列番号
12の配列に対応する、前記52の方法。
の配列に対応し、かつ、真菌のRS酵素断片が配列番号
12の配列に対応する、前記52の方法。
【0231】54.(a)配列番号38に述べられるア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号38に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片;および (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のLS酵素を
コードする単離された核酸断片。55.配列番号37に
述べられるような、前記54の単離された核酸断片。
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号38に述べられるアミノ酸配列の全部を
コードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片;および (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のLS酵素を
コードする単離された核酸断片。55.配列番号37に
述べられるような、前記54の単離された核酸断片。
【0232】56.マグナポルテ グリセア(Magnaport
he grisea)から得られる真菌のLS酵素をコードする、
前記54の単離された核酸断片。
he grisea)から得られる真菌のLS酵素をコードする、
前記54の単離された核酸断片。
【0233】57.前記54の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
りコードされるポリペプチド。
【0234】58.配列番号38に述べられるようなア
ミノ酸配列を有する、前記60のポリペプチド。
ミノ酸配列を有する、前記60のポリペプチド。
【0235】59.適する調節配列に操作可能に連結さ
れる、前記54の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
れる、前記54の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。
【0236】60.宿主細胞および前記59のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。
【0237】61.宿主細胞が植物細胞である、前記6
0の形質転換された宿主細胞。
0の形質転換された宿主細胞。
【0238】62.宿主細胞が大腸菌(E. coli)であ
る、前記60の形質転換された宿主細胞。
る、前記60の形質転換された宿主細胞。
【0239】63.(a)宿主細胞を前記59のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のLS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現に関して真菌の
LS酵素の変えられたレベルの産生をもたらす方法。
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞
における真菌のLS酵素の発現レベルを変える方法であ
って、形質転換されない宿主細胞の発現に関して真菌の
LS酵素の変えられたレベルの産生をもたらす方法。
【0240】64.(a)前記54の核酸断片でcDN
Aもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記54の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断
片が、真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
Aもしくはゲノムライブラリーに探りを入れること; (b)前記54の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成る、真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全
部もしくは本質的に全部をコードする核酸断片を得る方
法であって、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断
片が、真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部
もしくは本質的に全部をコードする方法。
【0241】65.(a)配列番号37に述べられる配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして (b)段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、お
よびクローニングベクターの配列を表すプライマーを使
用して、クローニングベクターに存在するcDNA挿入
物を増幅すること、を含んで成る、真菌のLS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする核酸断片を得る方法であって、増幅されたcDN
A挿入物が真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして (b)段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、お
よびクローニングベクターの配列を表すプライマーを使
用して、クローニングベクターに存在するcDNA挿入
物を増幅すること、を含んで成る、真菌のLS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする核酸断片を得る方法であって、増幅されたcDN
A挿入物が真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする方法。
【0242】66.前記64もしくは65の方法の産
物。
物。
【0243】67.前記54の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性LS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のLS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記54の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌LS遺伝子の発現に適する条件下で段
階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させる
こと; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の
段階を含んで成る方法。
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、当該方法は、 (a)適する微生物宿主の内因性LS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の変えられた微生物宿主細胞を、真菌
のLS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、前記54の核酸断片を含ん
で成るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌LS遺伝子の発現に適する条件下で段
階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させる
こと; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の
段階を含んで成る方法。
【0244】68.単離された核酸断片が配列番号37
の配列に対応し、かつ、LS酵素断片が配列番号38の
配列に対応する、前記67の方法。
の配列に対応し、かつ、LS酵素断片が配列番号38の
配列に対応する、前記67の方法。
【0245】69.前記54の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 (a)宿主細胞を、真菌のLS酵素をコードする前記5
4の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質転換する
ことであって、この遺伝子は最低1個の適する調節配列
に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
LS酵素を精製すること;(d)真菌のLS酵素を目的
の化合物と接触させること;そして(e)目的の化合物
の非存在下での真菌のLS酵素の活性に関して真菌のL
S酵素の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビトロの方法で
あって、当該方法は、 (a)宿主細胞を、真菌のLS酵素をコードする前記5
4の核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子で形質転換する
ことであって、この遺伝子は最低1個の適する調節配列
に操作可能に連結され; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
LS酵素を精製すること;(d)真菌のLS酵素を目的
の化合物と接触させること;そして(e)目的の化合物
の非存在下での真菌のLS酵素の活性に関して真菌のL
S酵素の活性を低下させる目的の化合物を殺真菌剤の候
補と同定すること、の段階を含んで成る方法。
【0246】70.単離された核酸断片が配列番号37
の配列に対応し、かつ、真菌のLS酵素断片が配列番号
38の配列に対応する、前記69の方法。
の配列に対応し、かつ、真菌のLS酵素断片が配列番号
38の配列に対応する、前記69の方法。
【0247】71.(a)配列番号27、配列番号2
9、配列番号31、配列番号33および配列番号35か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号27、配列番号29、配列番号31、配
列番号33および配列番号35から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片;ならびに (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、単離された核酸断
片。
9、配列番号31、配列番号33および配列番号35か
ら成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本
質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号27、配列番号29、配列番号31、配
列番号33および配列番号35から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片;ならびに (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、単離された核酸断
片。
【0248】72.配列番号28、配列番号30、配列
番号32、配列番号34および配列番号36から成る群
から選択される、前記71の単離された核酸断片。
番号32、配列番号34および配列番号36から成る群
から選択される、前記71の単離された核酸断片。
【0249】73.前記71の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。
りコードされるポリペプチド。
【0250】74.配列番号27、配列番号29、配列
番号31、配列番号33および配列番号35から成る群
から選択される、前記73のポリペプチド。
番号31、配列番号33および配列番号35から成る群
から選択される、前記73のポリペプチド。
【0251】
【表1】
【0252】
【表2】
【0253】
【表3】
【0254】
【表4】
【0255】
【表5】
【0256】
【表6】
【0257】
【表7】
【0258】
【表8】
【0259】
【表9】
【0260】
【表10】
【0261】
【表11】
【0262】
【表12】
【0263】
【表13】
【0264】
【表14】
【0265】
【表15】
【0266】
【表16】
【0267】
【表17】
【0268】
【表18】
【0269】
【表19】
【0270】
【表20】
【0271】
【表21】
【0272】
【表22】
【0273】
【表23】
【図1】既知の微生物RS相同物およびクローニングさ
れたホウレンソウRS前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
れたホウレンソウRS前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
【図2】既知の微生物LS相同物およびクローニングさ
れたホウレンソウLS前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
れたホウレンソウLS前駆体タンパク質の一次アミノ酸
配列の整列を示す。
【図3】ホウレンソウおよびアラビドプシスRS前駆体
タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。囲まれた
残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列(例えば輸送ペ
プチド(transit peptide))を示す。
タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。囲まれた
残基は推定の葉緑体に目標を向ける配列(例えば輸送ペ
プチド(transit peptide))を示す。
【図4】ホウレンソウ、タバコおよびアラビドプシスL
S前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。
囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的化された配列
(例えば輸送ペプチド)を示す。
S前駆体タンパク質の一次アミノ酸配列の整列を示す。
囲まれた残基は推定の葉緑体に対して標的化された配列
(例えば輸送ペプチド)を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:91) (72)発明者 ダグラス・ブライアン・ジヨーダン アメリカ合衆国デラウエア州19802ウイル ミントン・ノースハリソンストリート2715 (72)発明者 カレン・オンリー・バコツト アメリカ合衆国ペンシルベニア州19350ラ ンデンバーグ・マーサーミルロード191 Fターム(参考) 4B024 AA07 AA11 BA10 CA04 CA20 DA06 EA04 FA01 FA10 GA14 HA03 HA12 HA20 4B050 CC03 CC04 DD03 DD13 LL03 4B063 QA01 QA05 QA18 QQ06 QQ07 QQ26 QQ95 QR41 QR55 QR62 QR69 QR75 QR80 QS12 QS24 QS34 4B065 AA26X AA58Y AA88Y AB01 AC14 BA03 BB13 BC50 CA29 CA46 CA47
Claims (39)
- 【請求項1】 (a)配列番号2、配列番号4および配
列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部
もしくは本質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする単離された核酸断片に本質的に類似で
ある単離された核酸断片; (c)配列番号2、配列番号4および配列番号6から成
る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも72%の同
一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
断片;ならびに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物LS
酵素をコードする単離された核酸断片。 - 【請求項2】 請求項1の単離された核酸断片によりコ
ードされるポリペプチド。 - 【請求項3】 配列番号2、配列番号4および配列番号
6から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも
72%の同一性を有する、請求項2のポリペプチド。 - 【請求項4】 適する調節配列に操作可能に連結され
た、請求項1の単離された核酸断片を含んで成るキメラ
遺伝子。 - 【請求項5】 宿主細胞および請求項4のキメラ遺伝子
を含んで成る、形質転換された宿主細胞。 - 【請求項6】 (a)宿主細胞を請求項4のキメラ遺伝
子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺伝子
の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換された宿
主細胞を成長させること、を含んで成り、形質転換され
ない宿主細胞の発現レベルに関して形質転換された宿主
細胞での植物のLS酵素の改変されたレベルの産生をも
たらす宿主細胞における植物のLS酵素の発現レベルを
変える方法。 - 【請求項7】 (a)請求項1の核酸断片でcDNAも
しくはゲノムライブラリーをプロービングすること; (b)請求項1の核酸断片とハイブリダイゼーションす
るDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含むcDNA
もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
り、配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片が、植
物のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは
本質的に全部をコードする、植物のLS酵素をコードす
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
核酸断片を得る方法。 - 【請求項8】 (a)配列番号1、配列番号3および配
列番号5から成る群から選択される配列の一部に対応す
るオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること;そし
て(b)段階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、
およびクローニングベクターの配列に相当するプライマ
ーを使用して、クローニングベクター中に存在するcD
NA挿入物を増幅すること、を含んで成り、増幅された
cDNA挿入物が植物のLS酵素をコードするアミノ酸
配列の一部をコードする、植物のLS酵素をコードする
アミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核
酸断片を得る方法。 - 【請求項9】 請求項7もしくは8の方法の産物。
- 【請求項10】 請求項1の単離された核酸断片により
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビボの方法であ
って、 (a)適する微生物宿主細胞の内因性LS遺伝子を崩壊
させて微生物宿主細胞の成長を添加されたリボフラビン
に依存性とすること; (b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、植物
のLS酵素をコードしかつ微生物宿主細胞によるその発
現を可能にする最低1個の適する調節配列に操作可能に
連結された、請求項1の単離された核酸断片を含んで成
るキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物LS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること; (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。 - 【請求項11】 請求項1の単離された核酸断片により
コードされる植物のLS酵素の活性を阻害する化合物を
除草剤の候補として同定するためのインビトロの方法で
あって、 (a)宿主細胞を、植物のLS酵素をコードする請求項
1の単離された核酸断片を含んで成るキメラ遺伝子であ
って、かつ最低1個の適する調節配列に操作可能に連結
されたキメラ遺伝子で形質転換すること; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、植物の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される植物の
LS酵素を精製すること; (d)植物のLS酵素を目的の化合物と接触させるこ
と;そして (e)目的の化合物の非存在下での植物のLS酵素の活
性に関して植物のLS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
る方法。 - 【請求項12】 (a)配列番号8および配列番号10
から成る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは
本質的部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコー
ドする単離された核酸断片に本質的に類似である単離さ
れた核酸断片; (c)配列番号8および配列番号10から成る群から選
択されるアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有す
るポリペプチドをコードする単離された核酸断片;なら
びに (d)(a)、(b)もしくは(c)に相補的である単
離された核酸断片から成る群から選択される、植物RS
酵素をコードする単離された植物の核酸断片。 - 【請求項13】 請求項12の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。 - 【請求項14】 適する調節配列に操作可能に連結され
た、請求項12の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。 - 【請求項15】 宿主細胞および請求項14のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。 - 【請求項16】 (a)宿主細胞を請求項14のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
転換されない宿主細胞の発現レベルに関して形質転換さ
れた宿主細胞での植物のRS酵素の改変されたレベルの
産生をもたらす、宿主細胞における植物のRS酵素の発
現レベルを改変する方法。 - 【請求項17】 (a)請求項12の核酸断片でcDN
Aもしくはゲノムライブラリーをプロービングするこ
と; (b)請求項12の核酸断片とハイブリダイゼーション
するDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含むcDNA
もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
り、かつ配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする、植物のRS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
ードする核酸断片を得る方法。 - 【請求項18】 (a)配列番号7および配列番号9か
ら成る群から選択される配列の一部に対応するオリゴヌ
クレオチドプライマーを合成すること;そして(b)段
階(a)のオリゴヌクレオチドプライマー、およびクロ
ーニングベクターの配列に相当するプライマーを使用し
て、クローニングベクター中に存在するcDNA挿入物
を増幅すること、を含んで成り、かつ増幅されたcDN
A挿入物が植物のRS酵素をコードするアミノ酸配列の
一部をコードする、植物のRS酵素をコードするアミノ
酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核酸断片
を得る方法。 - 【請求項19】 請求項12の単離された核酸断片によ
りコードされる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物
を除草剤の候補と同定するためのインビボの方法であっ
て、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、植物
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、請求項12の核酸断片を含
むキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ植物RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を除草剤の候補と同定すること、の段
階を含んで成る方法。 - 【請求項20】 請求項12の核酸断片によりコードさ
れる植物のRS酵素の活性を阻害する化合物を除草剤の
候補と同定するためのインビトロの方法であって、 (a)適する微生物宿主細胞を、植物のRS酵素をコー
ドする請求項12の核酸断片を含むキメラ遺伝子であっ
て、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結された
キメラ遺伝子で形質転換すること; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させて、
植物のRS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された微生物宿主細胞により発現される
植物のRS酵素を精製すること; (d)植物のRS酵素を目的の化合物と接触させるこ
と;そして (e)目的の化合物の非存在下での植物のRS酵素の活
性に関して植物のRS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を除草剤の候補と同定すること、の段階を含んで成
る方法。 - 【請求項21】 (a)配列番号12に示されているア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号12に示されているアミノ酸配列の全部
をコードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片; (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のRS酵素を
コードする単離された核酸断片。 - 【請求項22】 請求項21の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。 - 【請求項23】 適する調節配列に操作可能に連結され
る、請求項21の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。 - 【請求項24】 宿主細胞および請求項23のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。 - 【請求項25】 (a)宿主細胞を請求項23のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
転換されない宿主細胞の発現レベルに関してマグナポル
テ グリセア(Magnaporthe grisea)RS酵素の改変され
たレベルの産生をもたらす、宿主細胞における真菌のR
Sの発現レベルを改変する方法。 - 【請求項26】 (a)請求項21の単離された核酸断
片でcDNAもしくはゲノムライブラリーをプロービン
グすること; (b)請求項21の単離された核酸断片とハイブリダイ
ゼーションするDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含んで成るc
DNAもしくはゲノム断片を配列決定すること、を含ん
で成り、かつ配列決定されたcDNAもしくはゲノム断
片が、真菌のRSをコードするアミノ酸配列の全部もし
くは本質的に全部をコードする、真菌のRSをコードす
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコードす
る核酸断片を得る方法。 - 【請求項27】 (a)配列番号11に示されている配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオ
チドプライマー、およびクローニングベクターの配列に
相当するプライマーを使用して、クローニングベクター
に存在するcDNA挿入物を増幅すること、を含んで成
り、かつ増幅されたcDNA挿入物がマグナポルテ グ
リセア(Magnaporthe grisea)RS酵素をコードするアミ
ノ酸配列の一部をコードする、真菌のRSをコードする
アミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする核
酸断片を得る方法。 - 【請求項28】 請求項21の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、 (a)適する微生物宿主の内因性RS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、真菌
のRS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、請求項21の核酸断片を含
むキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌RS遺伝子の発現を可能にする条件下
で段階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長さ
せること; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された宿主細胞の成長を阻害する目
的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を
含んで成る方法。 - 【請求項29】 請求項21の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のRS酵素の活性を阻害する化合物
を同定するためのインビトロの方法であって、 (a)宿主細胞を、真菌のRS酵素をコードする請求項
21の単離された核酸断片を含むキメラ遺伝子であっ
て、最低1個の適する調節配列に操作可能に連結された
キメラ遺伝子で形質転換すること; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
RS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
RS酵素を精製すること; (d)真菌のRS酵素を化合物と接触させること;そし
て (e)目的の化合物の非存在下での真菌のRS酵素の活
性に関して真菌のRS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を含んで
成る方法。 - 【請求項30】 (a)配列番号38に示されているア
ミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする単離
された核酸断片; (b)配列番号38に示されているアミノ酸配列の全部
をコードする単離された核酸断片に本質的に類似である
か、もしくは少なくともその本質的部分に相同である単
離された核酸断片;および (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、真菌のLS酵素を
コードする単離された核酸断片。 - 【請求項31】 請求項30の単離された核酸断片によ
りコードされるポリペプチド。 - 【請求項32】 適する調節配列に操作可能に連結され
た、請求項30の単離された核酸断片を含んで成るキメ
ラ遺伝子。 - 【請求項33】 宿主細胞および請求項32のキメラ遺
伝子を含んで成る、形質転換された宿主細胞。 - 【請求項34】 (a)宿主細胞を請求項32のキメラ
遺伝子で形質転換すること;そして(b)このキメラ遺
伝子の発現に適する条件下で段階(a)の形質転換され
た宿主細胞を成長させること、を含んで成り、かつ形質
転換されない宿主細胞の発現に関して真菌のLS酵素の
改変されたレベルの産生をもたらす、宿主細胞における
真菌のLS酵素の発現レベルを改変する方法。 - 【請求項35】 (a)請求項30の核酸断片でcDN
Aもしくはゲノムライブラリーをプロービングするこ
と; (b)請求項30の核酸断片とハイブリダイゼーション
するDNAクローンを同定すること;そして (c)段階(b)で同定されたクローンを含むcDNA
もしくはゲノム断片を配列決定すること、を含んで成
り、かつ配列決定されたcDNAもしくはゲノム断片
が、真菌のLS酵素をコードするアミノ酸配列の全部も
しくは本質的に全部をコードする、真菌のLS酵素をコ
ードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的に全部をコ
ードする核酸断片を得る方法。 - 【請求項36】 (a)配列番号37に示されている配
列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合
成すること;そして(b)段階(a)のオリゴヌクレオ
チドプライマー、およびクローニングベクターの配列に
相当するプライマーを使用して、クローニングベクター
に存在するcDNA挿入物を増幅すること、を含んで成
り、かつ増幅されたcDNA挿入物が真菌のLS酵素を
コードするアミノ酸配列の一部をコードする、真菌のL
S酵素をコードするアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする核酸断片を得る方法。 - 【請求項37】 請求項30の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビボの方法であ
って、 (a)適する微生物宿主の内因性LS遺伝子を崩壊させ
て微生物宿主の成長を添加されたリボフラビンに依存性
とすること; (b)段階(a)の改変された微生物宿主細胞を、真菌
のLS酵素をコードしかつ形質転換された微生物宿主細
胞によるその発現を可能にする最低1個の適する調節配
列に操作可能に連結された、請求項30の核酸断片を含
むキメラ遺伝子で形質転換すること; (c)キメラ真菌LS遺伝子の発現に適する条件下で段
階(b)の形質転換された微生物宿主細胞を成長させる
こと; (d)段階(c)の形質転換された微生物宿主細胞を、
それが指数的に増殖している際に、かつ添加されたリボ
フラビンの存在および非存在の双方において、目的の化
合物に接触させること;そして (e)添加されたリボフラビンの非存在下で成長された
場合にのみ形質転換された微生物宿主細胞の成長を阻害
する目的の化合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の
段階を含んで成る方法。 - 【請求項38】 請求項30の単離された核酸断片によ
りコードされる真菌のLS酵素の活性を阻害する化合物
を殺真菌剤の候補と同定するためのインビトロの方法で
あって、 (a)宿主細胞を、真菌のLS酵素をコードする請求項
30の核酸断片を含むキメラ遺伝子であって、最低1個
の適する調節配列に操作可能に連結されたキメラ遺伝子
で形質転換すること; (b)当該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で段階
(a)の形質転換された宿主細胞を成長させて、真菌の
LS酵素の産生をもたらすこと; (c)形質転換された宿主細胞により発現される真菌の
LS酵素を精製すること; (d)真菌のLS酵素を目的の化合物と接触させるこ
と;そして (e)目的の化合物の非存在下での真菌のLS酵素の活
性に関して真菌のLS酵素の活性を低下させる目的の化
合物を殺真菌剤の候補と同定すること、の段階を含んで
成る方法。 - 【請求項39】 (a)配列番号27、配列番号29、
配列番号31、配列番号33および配列番号35から成
る群から選択されるアミノ酸配列の全部もしくは本質的
部分をコードする単離された核酸断片; (b)配列番号27、配列番号29、配列番号31、配
列番号33および配列番号35から成る群から選択され
るアミノ酸配列の全部もしくは本質的部分をコードする
単離された核酸断片に本質的に類似である単離された核
酸断片;ならびに (c)(a)もしくは(b)に相補的である単離された
核酸断片から成る群から選択される、単離された核酸断
片。
Priority Applications (2)
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EP98310187A EP1010760A1 (en) | 1998-11-11 | 1998-12-11 | Lumazine synthase and riboflavin synthase |
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---|---|---|---|
JP10336558A JP2000152791A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ |
EP98310187A EP1010760A1 (en) | 1998-11-11 | 1998-12-11 | Lumazine synthase and riboflavin synthase |
Publications (1)
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---|---|
JP2000152791A true JP2000152791A (ja) | 2000-06-06 |
Family
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
JP10336558A Pending JP2000152791A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | ルマジンシンターゼおよびリボフラビンシンターゼ |
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Country | Link |
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EP (1) | EP1010760A1 (ja) |
JP (1) | JP2000152791A (ja) |
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DE19954059A1 (de) * | 1999-11-10 | 2001-05-17 | Adelbert Bacher | Riboflavinsynthase-Gene und Inhibitoren |
US9630994B2 (en) | 2014-11-03 | 2017-04-25 | University Of Washington | Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures |
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-
1998
- 1998-11-11 JP JP10336558A patent/JP2000152791A/ja active Pending
- 1998-12-11 EP EP98310187A patent/EP1010760A1/en not_active Withdrawn
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