JP2000139462A - 細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステム - Google Patents
細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステムInfo
- Publication number
- JP2000139462A JP2000139462A JP32100798A JP32100798A JP2000139462A JP 2000139462 A JP2000139462 A JP 2000139462A JP 32100798 A JP32100798 A JP 32100798A JP 32100798 A JP32100798 A JP 32100798A JP 2000139462 A JP2000139462 A JP 2000139462A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- drug
- cells
- cell
- cell layer
- change
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 薬剤の腸管吸収を、生体外で迅速に評価する
ことができる評価法の提供。 【解決手段】 （１）細胞層を形成する工程と、（２）
前記細胞層に蛍光色素を導入する工程と、（３）前記蛍
光色素を導入した前記細胞層を薬剤を含む緩衝液と接触
させ、前記細胞層に薬剤を吸収させる工程と、（４）
（３）で得られた細胞層の細胞中のｐＨ変化を蛍光分析
することにより、前記細胞中の薬剤の存在量を評価する
工程とを具えたことを特徴とする薬剤の腸管吸収の評価
法。
ことができる評価法の提供。 【解決手段】 （１）細胞層を形成する工程と、（２）
前記細胞層に蛍光色素を導入する工程と、（３）前記蛍
光色素を導入した前記細胞層を薬剤を含む緩衝液と接触
させ、前記細胞層に薬剤を吸収させる工程と、（４）
（３）で得られた細胞層の細胞中のｐＨ変化を蛍光分析
することにより、前記細胞中の薬剤の存在量を評価する
工程とを具えたことを特徴とする薬剤の腸管吸収の評価
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、経口投与の薬剤吸
収の評価法に関する。詳細には、本発明は、経口投与の
薬剤の腸管吸収の生体外での迅速な評価（スクリーニン
グ）法に関する。
収の評価法に関する。詳細には、本発明は、経口投与の
薬剤の腸管吸収の生体外での迅速な評価（スクリーニン
グ）法に関する。
【０００２】
【従来の技術】経口投与される薬剤は、主として腸管に
おいて体内に吸収され、その効果を発揮する。したがっ
て、その薬剤が経口投与できるかどうかの判断基準とし
て、腸管で吸収されるか否かは非常に重要である。創薬
段階において、特にリード化合物探索の段階において、
薬剤の腸管吸収を短時間で大量のサンプルについて試験
できる方法を確立することは極めて重要である。
おいて体内に吸収され、その効果を発揮する。したがっ
て、その薬剤が経口投与できるかどうかの判断基準とし
て、腸管で吸収されるか否かは非常に重要である。創薬
段階において、特にリード化合物探索の段階において、
薬剤の腸管吸収を短時間で大量のサンプルについて試験
できる方法を確立することは極めて重要である。
【０００３】薬剤の腸管吸収性に関して、ラットの腸管
を用いて行われるのが一般的である。すなわち、ラット
の腸管内に薬剤を含む緩衝液を注入し、その腸管の支配
血管中に薬剤が侵透してくるかどうかを試験するもので
ある。しかし、この方法は大量のラットを使用するた
め、特に米国では動物***の観点から、行いにくくなり
つつある。また、後述するようにコストおよび時間を消
費する薬剤の定量法も問題点の１つである。
を用いて行われるのが一般的である。すなわち、ラット
の腸管内に薬剤を含む緩衝液を注入し、その腸管の支配
血管中に薬剤が侵透してくるかどうかを試験するもので
ある。しかし、この方法は大量のラットを使用するた
め、特に米国では動物***の観点から、行いにくくなり
つつある。また、後述するようにコストおよび時間を消
費する薬剤の定量法も問題点の１つである。
【０００４】ラットの腸管を用いる方法に代わる物とし
て、ヒトの大腸ガン由来のＣａｃｏ−２という細胞を用
いる方法が欧米では主流となりつつある。この方法は、
多孔性の膜上に形成したＣａｃｏ−２の単層を通過する
薬剤の量を測定するものである。具体的な方法として
は、たとえば、底が多孔性膜で形成され、その膜上にＣ
ａｃｏ−２の単層を形成した容器を用い、その容器中に
薬剤を含む緩衝液（Ａ）を注入し、その容器を薬剤を含
まない緩衝液（Ｂ）中に浸積し、一定時間後にＣａｃｏ
−２の単層を通過して緩衝液（Ｂ）中に存在する薬剤を
定量する方法である。通過量を測定する方法としては、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法または液体
クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法等が用
いられる。
て、ヒトの大腸ガン由来のＣａｃｏ−２という細胞を用
いる方法が欧米では主流となりつつある。この方法は、
多孔性の膜上に形成したＣａｃｏ−２の単層を通過する
薬剤の量を測定するものである。具体的な方法として
は、たとえば、底が多孔性膜で形成され、その膜上にＣ
ａｃｏ−２の単層を形成した容器を用い、その容器中に
薬剤を含む緩衝液（Ａ）を注入し、その容器を薬剤を含
まない緩衝液（Ｂ）中に浸積し、一定時間後にＣａｃｏ
−２の単層を通過して緩衝液（Ｂ）中に存在する薬剤を
定量する方法である。通過量を測定する方法としては、
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法または液体
クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法等が用
いられる。
【０００５】薬剤が腸管において吸収されるときには、
ある種の薬剤は、腸管の上皮細胞表面上のトランスポー
ターにより細胞中に一度吸収され、引き続いて腸管の血
管中に放出されることで吸収されると考えられている。
また、薬剤がトランスポーターにより細胞中に吸収され
る際に、いくつかのトランスポーターにおいては、薬剤
とともに溶液中の水素イオンをも同時に細胞内に吸収す
ることが知られている。したがって、当該技術におい
て、薬剤の吸収とともに、細胞内のｐＨも変化するもの
であるが、薬剤の輸送（すなわち第１段階としての吸収
をふくむ）に伴う細胞内のｐＨの変化が報告された例は
ほとんどなく、わずかにWenzel等のThe Journal of Pha
rmacology and Experimental Therapeutics, 277, 831-
839(1996)に記載されているＣａｃｏ−２細胞およびト
ランスポーターを発現させたカエル卵母細胞を用いた測
定がある。
ある種の薬剤は、腸管の上皮細胞表面上のトランスポー
ターにより細胞中に一度吸収され、引き続いて腸管の血
管中に放出されることで吸収されると考えられている。
また、薬剤がトランスポーターにより細胞中に吸収され
る際に、いくつかのトランスポーターにおいては、薬剤
とともに溶液中の水素イオンをも同時に細胞内に吸収す
ることが知られている。したがって、当該技術におい
て、薬剤の吸収とともに、細胞内のｐＨも変化するもの
であるが、薬剤の輸送（すなわち第１段階としての吸収
をふくむ）に伴う細胞内のｐＨの変化が報告された例は
ほとんどなく、わずかにWenzel等のThe Journal of Pha
rmacology and Experimental Therapeutics, 277, 831-
839(1996)に記載されているＣａｃｏ−２細胞およびト
ランスポーターを発現させたカエル卵母細胞を用いた測
定がある。
【０００６】また、リポソームに対するサリチル酸など
酸性薬剤の透過に伴うリポソーム中のｐＨ変化がThe Jo
urnal of Pharmacology and Experimental Therapeutic
s,285(3), 1175-1180(1998) にて報告されている。Ｃａ
ｃｏ−２細胞を用いた場合のサリチル酸の透過に伴う細
胞内ｐＨ変化について、発明者らが１９９８年３月の日
本薬学会年会にて報告している。また、辻等も同年会に
おいて、同様の結果を報告している。
酸性薬剤の透過に伴うリポソーム中のｐＨ変化がThe Jo
urnal of Pharmacology and Experimental Therapeutic
s,285(3), 1175-1180(1998) にて報告されている。Ｃａ
ｃｏ−２細胞を用いた場合のサリチル酸の透過に伴う細
胞内ｐＨ変化について、発明者らが１９９８年３月の日
本薬学会年会にて報告している。また、辻等も同年会に
おいて、同様の結果を報告している。
【０００７】上記の報告における細胞内ｐＨ変化の測定
方法は、いずれもｐＨ感受性を有する蛍光色素を細胞内
に充填し、その蛍光強度の変化をもって細胞内ｐＨを測
定するものである。
方法は、いずれもｐＨ感受性を有する蛍光色素を細胞内
に充填し、その蛍光強度の変化をもって細胞内ｐＨを測
定するものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】Ｃａｃｏ−２を用いる
薬剤の透過性試験における薬剤の検出方法は、現在のと
ころ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法また
は液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法
等である。
薬剤の透過性試験における薬剤の検出方法は、現在のと
ころ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法また
は液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法
等である。
【０００９】しかし、ＨＰＬＣ法においては、一般に１
サンプル当りの分析時間が１〜２時間必要であり、コン
ビナトリアルケミストリー等の方法で大量のサンプルが
迅速に供給される現在では、必要とする試験数を実行す
るためには、数多くのＨＰＬＣ装置を用いてさえなお多
大な時間が必要であることが問題である。一方、ＬＣ／
ＭＳ法においては、分析時間は数十分程度に短縮される
が、試験装置からのサンプリング等の被検薬剤の取り扱
いの煩雑さが問題である。
サンプル当りの分析時間が１〜２時間必要であり、コン
ビナトリアルケミストリー等の方法で大量のサンプルが
迅速に供給される現在では、必要とする試験数を実行す
るためには、数多くのＨＰＬＣ装置を用いてさえなお多
大な時間が必要であることが問題である。一方、ＬＣ／
ＭＳ法においては、分析時間は数十分程度に短縮される
が、試験装置からのサンプリング等の被検薬剤の取り扱
いの煩雑さが問題である。
【００１０】一方、多くの薬剤は、酸性または塩基性の
いずれかの性質を有しており、これらの薬剤が細胞内に
吸収された場合に、当然細胞内のｐＨが変化することが
考えられる。したがって、このｐＨの変化を迅速に定量
的に測定することが可能ならば、これをもって薬剤の細
胞内吸収、さらには薬剤の腸管吸収の評価基準とするこ
とができると考えられる。
いずれかの性質を有しており、これらの薬剤が細胞内に
吸収された場合に、当然細胞内のｐＨが変化することが
考えられる。したがって、このｐＨの変化を迅速に定量
的に測定することが可能ならば、これをもって薬剤の細
胞内吸収、さらには薬剤の腸管吸収の評価基準とするこ
とができると考えられる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの実施の形
態としては： （１）細胞層を形成する工程と、（２）前記細胞層に蛍
光色素を導入する工程と、（３）前記蛍光色素を導入し
た前記細胞層を薬剤を含む緩衝液と接触させ、前記薬剤
を前記細胞層に吸収させる工程と、（４）（３）で得ら
れた細胞層の細胞中のｐＨ変化を蛍光分析することによ
り、前記細胞中の薬剤の存在量を評価する工程とを具え
る薬剤の腸管吸収の評価法（スクリーニングシステム）
である。
態としては： （１）細胞層を形成する工程と、（２）前記細胞層に蛍
光色素を導入する工程と、（３）前記蛍光色素を導入し
た前記細胞層を薬剤を含む緩衝液と接触させ、前記薬剤
を前記細胞層に吸収させる工程と、（４）（３）で得ら
れた細胞層の細胞中のｐＨ変化を蛍光分析することによ
り、前記細胞中の薬剤の存在量を評価する工程とを具え
る薬剤の腸管吸収の評価法（スクリーニングシステム）
である。
【００１２】本発明の別の実施の形態としては、細胞と
してヒト大腸ガン由来のＣａｃｏ−２細胞またはＨＴ２
９細胞、または腎臓尿細管由来のＭＤＣＫ細胞を用いる
前記の評価法である。
してヒト大腸ガン由来のＣａｃｏ−２細胞またはＨＴ２
９細胞、または腎臓尿細管由来のＭＤＣＫ細胞を用いる
前記の評価法である。
【００１３】また、本発明の別の実施の形態としては、
細胞として遺伝子操作によりトランスポーターを高密度
で発現させた細胞株を用いる前記の評価法である。
細胞として遺伝子操作によりトランスポーターを高密度
で発現させた細胞株を用いる前記の評価法である。
【００１４】また、本発明の別の実施の形態としては、
ｐＨが５．０〜８．０の範囲内の緩衝液を用いる前記の
評価法である。
ｐＨが５．０〜８．０の範囲内の緩衝液を用いる前記の
評価法である。
【００１５】本発明の別の実施の形態としては、緩衝液
が等張な緩衝液である前記の評価法である。
が等張な緩衝液である前記の評価法である。
【００１６】また、本発明の別の実施の形態としては、
薬剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである緩衝液を
用いる前記の評価法である。
薬剤の濃度が０．０１ｍＭ〜１００ｍＭである緩衝液を
用いる前記の評価法である。
【００１７】本発明の別の実施の形態としては、（３）
の工程を細胞に影響のない範囲の温度で行う前記の評価
法である。
の工程を細胞に影響のない範囲の温度で行う前記の評価
法である。
【００１８】さらに、本発明の別の実施の形態は、蛍光
分析を蛍光リーダーを用いて行う上記の評価法である。
分析を蛍光リーダーを用いて行う上記の評価法である。
【００１９】
【発明の実施の形態】本発明において、その腸管吸収を
試験できる化合物（薬剤）は、弱酸性化合物、弱塩基性
化合物、およびペプタイドトランスポーターの基質とな
る可能性を有したペプタイド類似化合物がある。たとえ
ば、弱酸性化合物としては、サリチル酸、ｍ−ヒドロキ
シ安息香酸、ｏ−アニス酸、コハク酸、ベンゼンスルホ
ン酸、酢酸、スルファニル酸、ニコチン酸、安息香酸等
を挙げることができる。弱塩基性化合物としては、プロ
プラノロール、アテロノール、イミプラミン等を挙げる
ことができる。ペプタイドトランスポーターの基質とな
る可能性を有するペプタイド類似物質としては、セフデ
ィニル、ベンジルペニシリン、セファゾリン、ジクロキ
サシリン、カプトプリル、オキサシリン、セフティゾキ
シム、セフィキシム、カルベニシリン、セフチブテン、
サルベニシリン、リシノプリル等を挙げることができ
る。
試験できる化合物（薬剤）は、弱酸性化合物、弱塩基性
化合物、およびペプタイドトランスポーターの基質とな
る可能性を有したペプタイド類似化合物がある。たとえ
ば、弱酸性化合物としては、サリチル酸、ｍ−ヒドロキ
シ安息香酸、ｏ−アニス酸、コハク酸、ベンゼンスルホ
ン酸、酢酸、スルファニル酸、ニコチン酸、安息香酸等
を挙げることができる。弱塩基性化合物としては、プロ
プラノロール、アテロノール、イミプラミン等を挙げる
ことができる。ペプタイドトランスポーターの基質とな
る可能性を有するペプタイド類似物質としては、セフデ
ィニル、ベンジルペニシリン、セファゾリン、ジクロキ
サシリン、カプトプリル、オキサシリン、セフティゾキ
シム、セフィキシム、カルベニシリン、セフチブテン、
サルベニシリン、リシノプリル等を挙げることができ
る。
【００２０】本発明の試験法において用いることができ
る細胞種は、消化管上皮細胞と同様の形態を呈する培養
上皮細胞一般であり、たとえばヒト大腸ガン由来のＣａ
ｃｏ−２細胞およびＨＴ２９細胞等、および腎臓尿細管
由来のＭＤＣＫ細胞等であり、また遺伝子導入によりト
ランスポーターを高密度に発現させた細胞株等である。
この遺伝子導入によりトランスポーターを高密度に発現
させることは、薬剤の細胞内吸収量を増加し、細胞内の
ｐＨ変化を増大させ、したがって本発明の方法の感度を
向上させることに対して有効である。
る細胞種は、消化管上皮細胞と同様の形態を呈する培養
上皮細胞一般であり、たとえばヒト大腸ガン由来のＣａ
ｃｏ−２細胞およびＨＴ２９細胞等、および腎臓尿細管
由来のＭＤＣＫ細胞等であり、また遺伝子導入によりト
ランスポーターを高密度に発現させた細胞株等である。
この遺伝子導入によりトランスポーターを高密度に発現
させることは、薬剤の細胞内吸収量を増加し、細胞内の
ｐＨ変化を増大させ、したがって本発明の方法の感度を
向上させることに対して有効である。
【００２１】本発明において用いる種々の細胞の培養
は、当該技術においてよく知られているように、用いる
細胞に最も適した培養条件下で行うことが望ましい。さ
らには、評価の迅速化の目的で、種々の短期間培養法を
採用することができる。
は、当該技術においてよく知られているように、用いる
細胞に最も適した培養条件下で行うことが望ましい。さ
らには、評価の迅速化の目的で、種々の短期間培養法を
採用することができる。
【００２２】上記の方法により培養された細胞は、単層
を形成しても、または多重層を形成してもよい。細胞層
は、少なくとも蛍光の測定部において均一な層を形成し
ていることが好ましい。また、細胞層を形成する細胞同
士は、緊密に結合した(tightconjunction)状態であるこ
とが好ましい。
を形成しても、または多重層を形成してもよい。細胞層
は、少なくとも蛍光の測定部において均一な層を形成し
ていることが好ましい。また、細胞層を形成する細胞同
士は、緊密に結合した(tightconjunction)状態であるこ
とが好ましい。
【００２３】測定に用いる薬剤の濃度は、０．０１ｍＭ
〜１００ｍＭの範囲内であることが好ましく、および
０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内であることがより好まし
い。この濃度は評価すべき薬剤によって引き起こされる
細胞内ｐＨ変化を考慮して決定することができる。
〜１００ｍＭの範囲内であることが好ましく、および
０．１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内であることがより好まし
い。この濃度は評価すべき薬剤によって引き起こされる
細胞内ｐＨ変化を考慮して決定することができる。
【００２４】測定に用いる溶液の組成としては、用いる
細胞に対して等張化された緩衝液を用いることが望まし
い。そのような緩衝液の例として、ＨＢＳＳ、ＫＨＢＢ
などを用いることができる。
細胞に対して等張化された緩衝液を用いることが望まし
い。そのような緩衝液の例として、ＨＢＳＳ、ＫＨＢＢ
などを用いることができる。
【００２５】上記の緩衝液のｐＨは、５．０〜８．０で
あってもよい。好ましくは、実際の消化管（小腸）内の
ｐＨを基準として調製することができる。その消化管内
のｐＨは通常５．０〜７．５の範囲であり、その範囲内
で本発明の測定を行うことが好ましい。
あってもよい。好ましくは、実際の消化管（小腸）内の
ｐＨを基準として調製することができる。その消化管内
のｐＨは通常５．０〜７．５の範囲であり、その範囲内
で本発明の測定を行うことが好ましい。
【００２６】細胞層への薬剤吸収を試験する際の温度
は、用いる細胞に影響のない範囲内であるべきである。
好ましくは０℃から５０℃の範囲内であり、より好まし
くは４℃から４２℃の範囲内であり、最も好ましくは４
℃から３８℃の範囲内である。
は、用いる細胞に影響のない範囲内であるべきである。
好ましくは０℃から５０℃の範囲内であり、より好まし
くは４℃から４２℃の範囲内であり、最も好ましくは４
℃から３８℃の範囲内である。
【００２７】細胞内のｐＨ変化を測定するためには、ｐ
Ｈに依存した蛍光強度の変化を示す蛍光試薬を細胞中に
導入して使用することができる。そのような試薬は、商
業的に市販されており、たとえばＢＣＥＣＦ（（株）同
仁化学研究所）、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（（株）同仁化学研
究所）、５（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイン、５（および６）−カルボキシ−
２′，７′−ジクロロフルオレセインジアセテート、５
（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジクロロフル
オレセインジアセテート スクシミジルエステル、５
（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジクロロフル
オレセイン スクシミジルエステル、５（および６）−
カルボキシ−フルオレセインなどを用いることができ
る。ＢＣＥＣＦ、またはＢＣＥＣＦ−ＡＭを用いること
が好ましい。
Ｈに依存した蛍光強度の変化を示す蛍光試薬を細胞中に
導入して使用することができる。そのような試薬は、商
業的に市販されており、たとえばＢＣＥＣＦ（（株）同
仁化学研究所）、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（（株）同仁化学研
究所）、５（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジ
クロロフルオレセイン、５（および６）−カルボキシ−
２′，７′−ジクロロフルオレセインジアセテート、５
（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジクロロフル
オレセインジアセテート スクシミジルエステル、５
（および６）−カルボキシ−２′，７′−ジクロロフル
オレセイン スクシミジルエステル、５（および６）−
カルボキシ−フルオレセインなどを用いることができ
る。ＢＣＥＣＦ、またはＢＣＥＣＦ−ＡＭを用いること
が好ましい。
【００２８】上記の蛍光試薬を導入した細胞内のｐＨ変
化は、通常の蛍光強度測定用機器を用いて測定すること
が可能であり、たとえば蛍光リーダー等の機器を用いる
ことができる。測定の精度を向上させるためには、バッ
クグラウンドの蛍光を除去するような方法を使用するこ
とが好ましい。そのような方法の一例として、ＦＬＩＰ
Ｒ（蛍光イメージング・プレート読取機(FLuorometric
Imaging Plate Reader) ）システムがある。このシステ
ムは、強力なアルゴンレーザー照射システム、ＣＣＤイ
メージカメラ、細胞層分離光学系、９６ウェルピペッタ
ーを統合し、マイクロプレート上の９６ウェル全てに対
して蛍光分析を行い、秒単位での動的データの解析が可
能である。すなわち、アルゴンレーザーを用いて測定す
べき特異変化に適した蛍光試薬を励起して蛍光を発生さ
せ、細胞層分離光学系により細胞外で発生するバックグ
ラウンド蛍光を除去し、冷却ＣＣＤカメラを統合検出器
として使用して、蛍光強度を測定する。
化は、通常の蛍光強度測定用機器を用いて測定すること
が可能であり、たとえば蛍光リーダー等の機器を用いる
ことができる。測定の精度を向上させるためには、バッ
クグラウンドの蛍光を除去するような方法を使用するこ
とが好ましい。そのような方法の一例として、ＦＬＩＰ
Ｒ（蛍光イメージング・プレート読取機(FLuorometric
Imaging Plate Reader) ）システムがある。このシステ
ムは、強力なアルゴンレーザー照射システム、ＣＣＤイ
メージカメラ、細胞層分離光学系、９６ウェルピペッタ
ーを統合し、マイクロプレート上の９６ウェル全てに対
して蛍光分析を行い、秒単位での動的データの解析が可
能である。すなわち、アルゴンレーザーを用いて測定す
べき特異変化に適した蛍光試薬を励起して蛍光を発生さ
せ、細胞層分離光学系により細胞外で発生するバックグ
ラウンド蛍光を除去し、冷却ＣＣＤカメラを統合検出器
として使用して、蛍光強度を測定する。
【００２９】
【実施例】（１）Ｃａｃｏ−２細胞を用いた細胞内ｐＨ
の測定 以下の方法を用いて、薬剤としてスルファニル酸（ＳＵ
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、Ｃａｃ
ｏ−２細胞内のｐＨ変化に対応する蛍光強度を測定し
た。対照ウェルとして薬剤を含まないＨＢＢＳを注入し
たウェルの蛍光強度を測定した。
の測定 以下の方法を用いて、薬剤としてスルファニル酸（ＳＵ
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、Ｃａｃ
ｏ−２細胞内のｐＨ変化に対応する蛍光強度を測定し
た。対照ウェルとして薬剤を含まないＨＢＢＳを注入し
たウェルの蛍光強度を測定した。
【００３０】Ｃａｃｏ−２細胞は、コラーゲンコートを
施した９６穴のブラック／透明ウェルプレート上で培養
した。培養法としては、Becton Dickinson社によって開
発された３日間培養法（3-day BIOCOAT （登録商標）HT
S Caco-2 Assay System ）を改良した４日間培養法を用
いた。培養終了後に、各ウェルに蛍光物質のＢＣＥＣＦ
を加え、約３７℃において１時間にわたり、Ｃａｃｏ−
２細胞中に導入した。その後に、Hankの生理食塩水緩衝
液（ＨＢＳＳ）で４回洗浄し、最終的に各ウェル内にＨ
ＢＳＳを９０μＬ残した。この状態のウェルプレートを
ＦＬＩＰＲシステムに装着し、各ウェルにそれぞれの試
験薬剤（３ｍＭまたは１５ｍＭ）を含むＨＢＳＳ溶液
（ｐＨ６．０）の４５μＬを９６ウェルピペッターを用
いて同時に添加した。この時の各ウェル内の薬剤濃度は
それぞれ１ｍＭまたは３ｍＭである。薬剤注入直後から
１５分間にわたって、２秒間隔で各ウェルの蛍光強度を
測定した。各ウェルの蛍光強度と、対照ウェルの蛍光強
度の差を計算し、その値を薬物による細胞内ｐＨ変化の
指標として用いた。
施した９６穴のブラック／透明ウェルプレート上で培養
した。培養法としては、Becton Dickinson社によって開
発された３日間培養法（3-day BIOCOAT （登録商標）HT
S Caco-2 Assay System ）を改良した４日間培養法を用
いた。培養終了後に、各ウェルに蛍光物質のＢＣＥＣＦ
を加え、約３７℃において１時間にわたり、Ｃａｃｏ−
２細胞中に導入した。その後に、Hankの生理食塩水緩衝
液（ＨＢＳＳ）で４回洗浄し、最終的に各ウェル内にＨ
ＢＳＳを９０μＬ残した。この状態のウェルプレートを
ＦＬＩＰＲシステムに装着し、各ウェルにそれぞれの試
験薬剤（３ｍＭまたは１５ｍＭ）を含むＨＢＳＳ溶液
（ｐＨ６．０）の４５μＬを９６ウェルピペッターを用
いて同時に添加した。この時の各ウェル内の薬剤濃度は
それぞれ１ｍＭまたは３ｍＭである。薬剤注入直後から
１５分間にわたって、２秒間隔で各ウェルの蛍光強度を
測定した。各ウェルの蛍光強度と、対照ウェルの蛍光強
度の差を計算し、その値を薬物による細胞内ｐＨ変化の
指標として用いた。
【００３１】サリチル酸を用いた場合、および対照ウェ
ルの蛍光強度の時間変化を図１に示した。
ルの蛍光強度の時間変化を図１に示した。
【００３２】（２）ラット小腸粘膜透過性の試験 以下の方法を用いて、薬剤としてスルファニル酸（ＳＵ
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、ラット
小腸粘膜透過性を測定した。
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、ラット
小腸粘膜透過性を測定した。
【００３３】Wister系雄性ラット（２３０〜２８０ｇ）
をペントバルビタールで麻酔後、開腹し、空腸上部より
１５ｃｍ〜３０ｃｍ程度の部分の約１５ｃｍの上下にポ
リエチレンチューブをカニュレーションし、小腸ループ
を作成した。ループ上部より、流速０．２〜０．４ｍＬ
／ｍｉｎの速度で薬物を含む灌流液を流し、その後約９
０分間にわたって１０分間隔でループ下部より流出した
灌流液を採取した。薬物の小腸膜透過性は、灌流前と灌
流後の灌流液中薬物濃度の差（膜透過量に該当）からco
mpletely radial mixingモデルに従って算出した。灌流
液としては、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、
ＭＥＳ／ＨＥＰＥＳ １０ｍＭおよびＦＩＴＣ−Ｄｅｘ
ｔｒａｎ １ｍＭを含む等張溶液（ｐＨ ６．５）を用
い、常に、Ｏ2 ：ＣＯ2 ＝９５：５の混合ガスでバブリ
ングを行った。ここで、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎは灌
流中に起こった小腸からの水の吸収の補正のために添加
されており、その灌流前と灌流後の濃度比から水の吸収
による薬物の濃度補正を行った。
をペントバルビタールで麻酔後、開腹し、空腸上部より
１５ｃｍ〜３０ｃｍ程度の部分の約１５ｃｍの上下にポ
リエチレンチューブをカニュレーションし、小腸ループ
を作成した。ループ上部より、流速０．２〜０．４ｍＬ
／ｍｉｎの速度で薬物を含む灌流液を流し、その後約９
０分間にわたって１０分間隔でループ下部より流出した
灌流液を採取した。薬物の小腸膜透過性は、灌流前と灌
流後の灌流液中薬物濃度の差（膜透過量に該当）からco
mpletely radial mixingモデルに従って算出した。灌流
液としては、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、
ＭＥＳ／ＨＥＰＥＳ １０ｍＭおよびＦＩＴＣ−Ｄｅｘ
ｔｒａｎ １ｍＭを含む等張溶液（ｐＨ ６．５）を用
い、常に、Ｏ2 ：ＣＯ2 ＝９５：５の混合ガスでバブリ
ングを行った。ここで、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎは灌
流中に起こった小腸からの水の吸収の補正のために添加
されており、その灌流前と灌流後の濃度比から水の吸収
による薬物の濃度補正を行った。
【００３４】（３）Ｃａｃｏ−２単層膜を用いた透過性
試験 以下の方法を用いて、薬剤としてスルファニル酸（ＳＵ
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、Ｃａｃ
ｏ−２単層膜を用いた透過性を測定した。
試験 以下の方法を用いて、薬剤としてスルファニル酸（ＳＵ
Ａ）、ｍ−ヒドロキシ安息香酸（ｍ−ＨＢＡ）、安息香
酸（ＢＡ）、ニコチン酸（ＮＡ）、サリチル酸（Ｓ
Ａ）、ベンゼンスルホン酸（ＢＳＡ）を用いて、Ｃａｃ
ｏ−２単層膜を用いた透過性を測定した。
【００３５】以下の組成のトランスポート・メディア
（Ｔ．Ｍ）を調製した。
（Ｔ．Ｍ）を調製した。
【００３６】 NaCl 136.89ｍＭ グルコース 19.45ｍＭ KCl 5.36ｍＭ CaCl2 1.26ｍＭ Na2HPO4 0.34ｍＭ MgCl2 ・6H2O 0.49ｍＭ KH2PO4 0.44ｍＭ NaHCO3 4.17ｍＭ MgSO4 ・7H2O 0.41ｍＭ Hepes 10.00ｍＭ Ｔ．Ｍは実験前に３７℃に加温したものを用い、それぞ
れｐＨ ７．４およびｐＨ ６．０に調整した。さら
に、各薬剤を０．１ｍＭになるようにＴ．Ｍに溶解さ
せ、再びｐＨ ７．４およびｐＨ ６．０に調整して、
薬剤試料液として用いた。
れｐＨ ７．４およびｐＨ ６．０に調整した。さら
に、各薬剤を０．１ｍＭになるようにＴ．Ｍに溶解さ
せ、再びｐＨ ７．４およびｐＨ ６．０に調整して、
薬剤試料液として用いた。
【００３７】インサート付ウェルのserosal 側に２．６
ｍＬのＴ．Ｍ（ｐＨ ７．４）、mucosal 側にＴ．Ｍ
（ｐＨ ６．０）を導入し、３７℃において２０分間に
わたって予備温置した。次に、別にＴ．Ｍ（ｐＨ ７．
４）２．６ｍＬを入れておいたウェルにカップを移し、
mucosal 側に薬剤試料液（１．５ｍＬ）を導入後、１０
分毎に６０分間serosal 側より０．１ｍＬずつサンプリ
ングを行った。サンプリング後、直ちに体積補正のため
にＴ．Ｍ（ｐＨ ７．４）を０．１ｍＬを添加する。得
られたサンプル中の薬物濃度を定量し、初濃度からその
値を引き、各時間でのmucosal 側に残存している薬物濃
度を算出した。そして、初濃度の対数からそのmucosal
側濃度の対数を引いた値と時間の傾きから、一次の吸収
速度定数Kaを求め、mucosal 側に添加した体積を乗算
し、カップの有効面積（4.71ｃｍ2 ）で除算することに
より、膜透過係数（ｃｍ／ｍｉｎ）を求めた。
ｍＬのＴ．Ｍ（ｐＨ ７．４）、mucosal 側にＴ．Ｍ
（ｐＨ ６．０）を導入し、３７℃において２０分間に
わたって予備温置した。次に、別にＴ．Ｍ（ｐＨ ７．
４）２．６ｍＬを入れておいたウェルにカップを移し、
mucosal 側に薬剤試料液（１．５ｍＬ）を導入後、１０
分毎に６０分間serosal 側より０．１ｍＬずつサンプリ
ングを行った。サンプリング後、直ちに体積補正のため
にＴ．Ｍ（ｐＨ ７．４）を０．１ｍＬを添加する。得
られたサンプル中の薬物濃度を定量し、初濃度からその
値を引き、各時間でのmucosal 側に残存している薬物濃
度を算出した。そして、初濃度の対数からそのmucosal
側濃度の対数を引いた値と時間の傾きから、一次の吸収
速度定数Kaを求め、mucosal 側に添加した体積を乗算
し、カップの有効面積（4.71ｃｍ2 ）で除算することに
より、膜透過係数（ｃｍ／ｍｉｎ）を求めた。
【００３８】（４）結果の総括 前記（１）のＣａｃｏ−２細胞内ｐＨの変化と（３）で
得られたＣａｃｏ−２細胞単層膜の透過性の結果を対比
したグラフを図２に示した。また、（１）で得られた薬
剤吸収によるＣａｃｏ−２細胞内ｐＨの変化と（２）で
得られたラット小腸粘膜透過性の結果を対比したグラフ
を図３に示した。それぞれのグラフにおいて、細胞内ｐ
Ｈの変化は薬剤添加後１０秒後の値を用いた。
得られたＣａｃｏ−２細胞単層膜の透過性の結果を対比
したグラフを図２に示した。また、（１）で得られた薬
剤吸収によるＣａｃｏ−２細胞内ｐＨの変化と（２）で
得られたラット小腸粘膜透過性の結果を対比したグラフ
を図３に示した。それぞれのグラフにおいて、細胞内ｐ
Ｈの変化は薬剤添加後１０秒後の値を用いた。
【００３９】図２および図３にて示されるように、Ｃａ
ｃｏ−２細胞内ｐＨの変化とラット小腸粘膜透過性の結
果およびＣａｃｏ−２細胞単層膜の透過性は良好な相関
関係を示した（相関係数Ｒはそれぞれ０．９９および
０．９８）。
ｃｏ−２細胞内ｐＨの変化とラット小腸粘膜透過性の結
果およびＣａｃｏ−２細胞単層膜の透過性は良好な相関
関係を示した（相関係数Ｒはそれぞれ０．９９および
０．９８）。
【００４０】
【発明の効果】本発明の方法を用いることにより、多く
の時間を必要とし、かつ被検薬剤の取り扱いが煩雑であ
る薬剤自体の定量を行うことなく、Ｃａｃｏ−２細胞内
ｐＨの変化をｐＨ感受性の蛍光試薬が発生する蛍光の強
度を用いて測定することにより、薬物の膜透過性を短時
間でかつ一度に多数のサンプルについて評価することが
可能であることが明らかとなった。したがって、本発明
の方法は、創薬段階での迅速な薬物の吸収性評価法とし
て極めて有用である。
の時間を必要とし、かつ被検薬剤の取り扱いが煩雑であ
る薬剤自体の定量を行うことなく、Ｃａｃｏ−２細胞内
ｐＨの変化をｐＨ感受性の蛍光試薬が発生する蛍光の強
度を用いて測定することにより、薬物の膜透過性を短時
間でかつ一度に多数のサンプルについて評価することが
可能であることが明らかとなった。したがって、本発明
の方法は、創薬段階での迅速な薬物の吸収性評価法とし
て極めて有用である。
【図１】サリチル酸を用いた場合の、Ｃａｃｏ−２細胞
内のｐＨ変化による蛍光強度および対照ウェルの蛍光強
度の時間変化を示したグラフである。
内のｐＨ変化による蛍光強度および対照ウェルの蛍光強
度の時間変化を示したグラフである。
【図２】Ｃａｃｏ−２細胞内のｐＨ変化による蛍光強度
の変化とＣａｃｏ−２細胞単層の透過性との比較のグラ
フである。
の変化とＣａｃｏ−２細胞単層の透過性との比較のグラ
フである。
【図３】Ｃａｃｏ−２細胞内のｐＨ変化による蛍光強度
の変化とラット空腸の透過性との比較のグラフである。
の変化とラット空腸の透過性との比較のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 多喜 陽子 大阪府枚方市南樟葉１−３−４ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB52 CB01 CB02 DB03 FA11 FB12 GC15 4B024 AA11 BA80 DA02 GA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ61 QQ91 QQ98 QR41 QR51 QR57 QR66 QR69 QR77 QS24 QS36 QX02
Claims (8)
- 【請求項１】 （１）細胞層を形成する工程と、（２）
前記細胞層に蛍光色素を導入する工程と、（３）前記蛍
光色素を導入した前記細胞層を薬剤を含む緩衝液と接触
させ、前記薬剤を前記細胞層に吸収させる工程と、
（４）（３）で得られた細胞層の細胞中のｐＨ変化を蛍
光分析することにより、前記細胞中の薬剤の存在量を評
価する工程とを具えたことを特徴とする薬剤の腸管吸収
の評価法。 - 【請求項２】 前記細胞が、ヒト大腸ガン由来のＣａｃ
ｏ−２細胞、ヒト大腸ガン由来のＨＴ２９細胞、および
腎臓尿細管由来のＭＤＣＫ細胞からなる群から選択され
ることを特徴とする請求項１に記載の評価法。 - 【請求項３】 前記細胞が、遺伝子操作によりトランス
ポーターを高密度で発現させた細胞株であることを特徴
とする請求項１に記載の評価法。 - 【請求項４】 前記緩衝液のｐＨが、５．０〜８．０の
範囲内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか
１つに記載の評価法。 - 【請求項５】 前記緩衝液が、等張な緩衝液であること
を特徴とする請求項１〜４のいずれか１つに記載の評価
法。 - 【請求項６】 前記薬剤を含む緩衝液において、薬剤の
濃度が０．０１ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とす
る請求項１〜５のいずれか１つに記載の評価法。 - 【請求項７】 （３）の工程を前記細胞に影響のない範
囲の温度で行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれ
か１つに記載の評価法。 - 【請求項８】 前記蛍光分析を蛍光リーダーを用いて行
うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つに記載
の評価法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32100798A JP2000139462A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステム |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32100798A JP2000139462A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステム |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000139462A true JP2000139462A (ja) | 2000-05-23 |
Family
ID=18127758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32100798A Pending JP2000139462A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | 細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000139462A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2365336A1 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-14 | Fujifilm Corporation | pH measurement, abnormal-region detection, living-matter analysis methods and apparatuses |
| EP2365337A1 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-14 | Fujifilm Corporation | Intracellular pH imaging method and apparatus using fluorescence lifetime |
| JP2011231127A (ja) * | 2011-08-01 | 2011-11-17 | Sekisui Medical Co Ltd | 経口吸収改善剤およびこれを利用する医薬組成物 |
| WO2015045516A1 (ja) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 富士フイルム株式会社 | 蛍光観察装置、内視鏡システム及びプロセッサ装置並びに作動方法 |
-
1998
- 1998-11-11 JP JP32100798A patent/JP2000139462A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2365336A1 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-14 | Fujifilm Corporation | pH measurement, abnormal-region detection, living-matter analysis methods and apparatuses |
| EP2365337A1 (en) | 2010-03-10 | 2011-09-14 | Fujifilm Corporation | Intracellular pH imaging method and apparatus using fluorescence lifetime |
| JP2011231127A (ja) * | 2011-08-01 | 2011-11-17 | Sekisui Medical Co Ltd | 経口吸収改善剤およびこれを利用する医薬組成物 |
| WO2015045516A1 (ja) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 富士フイルム株式会社 | 蛍光観察装置、内視鏡システム及びプロセッサ装置並びに作動方法 |
| JP2015066129A (ja) * | 2013-09-27 | 2015-04-13 | 富士フイルム株式会社 | 蛍光観察装置、内視鏡システム及びプロセッサ装置並びに作動方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bohets et al. | Strategies for absorption screening in drug discovery and development | |
| Illsley et al. | Membrane chloride transport measured using a chloride-sensitive fluorescent probe | |
| JPH02502405A (ja) | アッセイを実施するための方法及び装置 | |
| JPH0933537A (ja) | 品質管理方法及びこれに用いる液体 | |
| RU2006142859A (ru) | Аналитические системы, устройства и картриджи для них | |
| CN101013137A (zh) | 一类检测缺血性修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法 | |
| EP0755654B1 (en) | A test tube for determining the erythrocyte sedimentation rate and a surfactant for use therein | |
| US8980572B2 (en) | Methods of signal generation and signal localization for improvement of signal readability in solid phase based bioassays | |
| Coentro et al. | Collagen quantification in tissue specimens | |
| JP2000139462A (ja) | 細胞内ｐＨ変化の測定による薬物吸収性の高速スクリーニングシステム | |
| US7507395B2 (en) | Methods of using fluorescent pH indicators for intracellular assays | |
| US4260579A (en) | Device and method for simulating bilirubin in urine | |
| Szmacinski et al. | Potassium and sodium measurements at clinical concentrations using phase-modulation fluorometry | |
| US7371565B2 (en) | Apparatus and method for measuring intracellular reactions | |
| EP0983514B1 (en) | A process and a test kit for heroin detection | |
| JPH11504507A (ja) | 生物学的に活性な基質を、生きている細胞に関するこれらの影響によって同定するための方法 | |
| JP2004527757A (ja) | 溶液中の揮発性物質を特定する方法および装置 | |
| JP4691726B2 (ja) | 混合ｌｂ膜を用いたカドミウムイオンセンサー | |
| CN111474358A (zh) | 一种3d立体免疫荧光染色试剂盒及其应用 | |
| BE1011487A3 (fr) | Dispositif d'essai pour la determination d'analytes dans un produit laitier liquide. | |
| SE456371B (sv) | Anordning for fotometrisk metning av syrgashaltiga gasprover eller flytandeprover, i synnerhet i andedrekten och blodet | |
| JP2000266751A (ja) | 免疫クロマトグラフィー測定装置 | |
| US11796471B2 (en) | Fluorescence sensor for detecting biomarkers in a sweat sample | |
| Holm-Jensen | Conductometric determination of CO2 in air samples | |
| KR950010395B1 (ko) | 마약계의 간이 검출법 및 검출용 킷트 |