JP2000065831A - Chemiluminescent engime immuno-measurement method - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for measuring immunologically an antigen or an antibody by a new chemiluminescent system by using peroxidase engime as marker material. SOLUTION: In this chemiluminescent engime immuno-measurement method by using peroxidase engime as marker material, an antigen or an antibody is measured immunologically with high sensitivity by a chemilumunescent reaction by using a chemiluminescent reagent obtained by adding a specific amino alcohol compound at the reaction time and/or after the reaction, when N,N'- disubstituted-9,9'-bisacridinium salts are reacted in the presence of N,N'- disubstituted carboxylic acid amide compound under light irradiation.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光反応を利
用する酵素免疫測定方法に関するものであり、更に詳し
くは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特
定の新規化学発光試薬を用いる抗原又は抗体の免疫学的
測定方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an enzyme immunoassay using a chemiluminescence reaction, and more particularly to a method for detecting an antigen or an antibody using a specific novel chemiluminescent reagent using a peroxidase enzyme as a labeling substance. The present invention relates to an immunological measurement method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】酵素免疫測定方法は、標識物質に放射性
同位元素を使用しないので良好な測定環境を保持するこ
とが可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定
方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されて
いる。この酵素免疫測定方法において使用される酵素と
しては、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等を
挙げることができる。これらの酵素を用いた酵素標識抗
体又は抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化
水素／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−
ホスフェ−ト、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド
等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色
性物質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素
活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する比色
法が一般的である。2. Description of the Related Art Enzyme-linked immunosorbent assays have been developed as immunoassays that do not use radioactive isotopes as labeling substances and thus can maintain a favorable assay environment and are less dangerous to the human body. It is used in the measurement system for substances. The enzymes used in this enzyme immunoassay include peroxidase, alkaline phosphatase,
β-galactosidase and glucose oxidase can be exemplified. Methods for detecting the enzyme activity of an enzyme-labeled antibody or antigen using these enzymes include hydrogen peroxide / o-phenylenediamine, 4-nitrophenyl-
An antibody having a correlation with this enzyme activity by measuring the amount of coloring of a chromogenic substance produced by an enzyme-decomposing reaction of an enzyme substrate such as phosphate and 2-nitrophenyl-β-galactoside to determine the enzyme activity. Alternatively, a colorimetric method for quantifying the amount of the antigen is generally used.

【０００３】しかしながら、臨床化学分析においては、
その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であ
り、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられ
ることが多く、そのために、より高感度及び高精度な測
定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に
満足させることは難しい。However, in clinical chemistry analysis,
The measurement target is a biological sample (mainly, serum, urine, etc.), and the measured value is often used for diagnosis or follow-up of a disease state. Therefore, higher sensitivity and higher precision measurement are required. However, it is difficult to completely satisfy this requirement by a colorimetric method.

【０００４】そこで、この要求を満たすことを目的とし
て蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた
酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−
メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を
分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して
酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体
又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法で
は、励起光の散乱が存在するため前記の要求を満たすに
は充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キ
セノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由
来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因とな
り、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうの
で、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に
困難である。Therefore, a fluorescence method has been proposed to satisfy this requirement. The fluorescence method means that 4-hydroxyphenylacetic acid,
4-methylumbelliferyl-β-galactoside, 4-
After decomposing a fluorescent substrate such as methylumbelliferyl-phosphate to generate fluorescence, the fluorescence intensity is measured to quantify the enzyme activity, and the amount of the antibody or antigen having a correlation with the enzyme activity is determined. Is the way. However, it is difficult to say that the fluorescence method is sufficient to satisfy the above requirements because of the scattering of excitation light. Further, in the colorimetric method and the fluorescent method, a light source such as a xenon lamp is required, and a stray phenomenon derived from light from the light source and Raman light derived from the solvent cause a background level to rise. In principle, it is difficult to increase the sensitivity of the measurement by the colorimetric method and the fluorescent method.

【０００５】近年、比色法及び蛍光法を上回る高感度な
酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定方法
（ＣＬＥＩＡ）が開発され注目されている。ＣＬＥＩＡ
は、酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を
経て励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に
放出される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵
素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方
法であり、化学反応により化学発光性物質を発光させる
ため光源が不要であり、光源に起因するバックグラウン
ドの上昇等がないため測定の高感度化が可能である。Ｃ
ＬＥＩＡに用いられる酵素としては、ぺルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げら
れる。これらのなかで、取り扱い易さ、入手し易さ等の
点でぺルオキシダーゼが好適に用いられる。酵素にペル
オキシダーゼ、化学発光性物質にルミノール、発光増強
剤にｐ−ヨードフェノールを各々用いる化学発光系が開
発され、種々の物質が化学発光反応により免疫学的に高
感度に定量することが可能になっている。In recent years, a chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA) has been developed and attracted attention as a more sensitive enzyme immunoassay than colorimetric and fluorescent methods. CLEIA
Is to determine the enzymatic activity by measuring the amount of luminescence emitted when the chemiluminescent substance becomes an excited state via an intermediate due to the catalytic activity of the enzyme and returning from this state to the ground state. A method for quantifying the amount of an antibody or antigen having a chromosome, which emits a chemiluminescent substance by a chemical reaction, eliminating the need for a light source and increasing the sensitivity of measurement because there is no increase in background caused by the light source. It is. C
The enzymes used for LEIA include peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase,
Glucose oxidase, dehydrogenase and the like can be mentioned. Of these, peroxidase is preferably used in terms of ease of handling and availability. A chemiluminescence system using peroxidase as an enzyme, luminol as a chemiluminescent substance, and p-iodophenol as a luminescence enhancer has been developed, and various substances can be quantified with high sensitivity immunologically by chemiluminescence reaction. Has become.

【０００６】しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標
識物質とするＣＬＥＩＡにおいては、測定対象物質の低
濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケース
が多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥ
ＩＡの更なる高感度化が望まれていた。However, in the case of CLEIA using a peroxidase enzyme as a labeling substance, it is often necessary to further improve the quantification of the substance to be measured in a low concentration region, and CLEIA using a peroxidase enzyme as a labeling substance is often required.
It has been desired to further increase the sensitivity of IA.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、前
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光反応による新規な免疫測定系を利用した酵素免
疫測定方法を提供することを課題とする。Accordingly, the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides an enzyme immunoassay method using a novel immunoassay system by a chemiluminescence reaction capable of measuring a substance to be measured with higher sensitivity. That is the task.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光性物質として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物の存在下において光照射により反応させる際
に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化
合物を添加することにより得られる化学発光試薬を用
い、さらに、発光増強剤として特定のフェノール系化合
物を用いる化学発光系が、化学発光性物質にルミノール
を用いる系より高感度に測定対象物質を免疫学的に定量
することが可能なことを見い出し、これらの知見に基づ
いて本発明に到達した。Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have:
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts were converted to N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds as chemiluminescent substances. When reacting by light irradiation in the presence, a chemiluminescent reagent obtained by adding an amino alcohol compound during and / or after the reaction is used, and further, a specific phenolic compound is used as a luminescence enhancer. The present inventor has found that the system is capable of immunologically quantifying the substance to be measured with higher sensitivity than the system using luminol as the chemiluminescent substance, and has arrived at the present invention based on these findings.

【０００９】すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ酵
素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原
若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反
応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体から
なる免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体
を不溶性担体に固定化した抗体若しくは抗原と反応させ
て該不溶性担体上に捕捉した後、これに、Ｎ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ
置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射に
より反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にア
ミノアルコール化合物を添加することにより得られる化
学発光試薬を添加し、水素受容体の存在下において化学
発光させ、その発光強度を測定することにより試料中の
抗原又は抗体の量を定量することを特徴とする化学発光
酵素免疫測定方法に関するものである。That is, the present invention provides an immunocomplex comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex by mixing an antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme with an antigen or an antibody to be measured in a sample, or an aggregate thereof. A body is formed, and if necessary, the immune complex is reacted with an antibody or antigen immobilized on an insoluble carrier and captured on the insoluble carrier, and then the N, N'-disubstituted-9,9 ' -A chemiluminescent reagent obtained by adding an amino alcohol compound during and / or after the reaction of bisacridinium salts by light irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound Is added, chemiluminescence is performed in the presence of a hydrogen receptor, and the amount of the antigen or antibody in the sample is determined by measuring the luminescence intensity. It relates chemiluminescent enzyme immunoassay method, characterized in that the amount.

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗
体反応により測定すべき抗原若しくは抗体をペルオキシ
ダーゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応
段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する
標識酵素を用いる化学発光反応により測定する化学発光
反応段階とからなる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail. The chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention comprises an immunoreaction step of capturing an antigen or an antibody to be measured by an antigen-antibody reaction as an immune complex labeled with a peroxidase enzyme, and the produced immunocomplex is present in the molecule. And a chemiluminescence reaction step measured by a chemiluminescence reaction using a labeling enzyme.

【００１１】免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方
法は任意であり、前記化学発光試薬を用いることができ
るものであれば、いずれの方法も採用することができ
る。例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、さらにこの抗体に対する標識第二
抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、さらに、 ビオチン標識抗体及びペルオキシダーゼ酵素標識アビ
ジンを反応させるビチオン−アビジン法等 を非限定的に用いることができる。The method of the antigen-antibody reaction constituting the immune reaction step is optional, and any method can be adopted as long as the chemiluminescent reagent can be used. For example, a sandwich method in which an antigen to be measured in a sample is captured by an antibody bound to an insoluble carrier, and then a peroxidase enzyme-labeled antibody is reacted.In the sandwich method, an antibody derived from an animal species different from the antibody bound to the insoluble carrier is used. A two-antibody method in which the produced sandwich complex is further reacted with a labeled second antibody against this antibody. The antigen to be measured in the sample is reacted with an antibody bound to an insoluble carrier in the presence of a peroxidase enzyme-labeled antigen. Competition method, a sample containing the antigen or antibody to be measured is reacted with a labeled antibody or antigen that specifically reacts with the sample to cause aggregation and precipitation, and then the labeled substance in the immune complex separated by centrifugation is separated. Coagulation sedimentation method for detection, Antigen to be measured in a sample is attached to an antigen bound to an insoluble carrier. Antibody detection method for applying a gamma globulin antibody, further biotin reacted biotinylated antibody and peroxidase enzyme-labeled avidin - can be used avidin method, or the like without limitation.

【００１２】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアク
リロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサ
ッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、
磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。ま
た、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球
状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレ
ート、試験管等の種々の形状で用いることができる。さ
らに、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法
は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結
合法等を用いることができる。The insoluble carrier used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention includes, for example, polymer compounds such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharide, and glass. ,metal,
Examples include magnetic particles and combinations thereof. As the shape of the insoluble carrier, various shapes such as a tray, a sphere, a fiber, a bar, a disk, a container, a cell, a microplate, and a test tube can be used. Further, the method of immobilizing the antigen or antibody on these insoluble carriers is arbitrary, but a physical adsorption method, a covalent bonding method, an ionic bonding method and the like can be used.

【００１３】また、本発明の化学発光酵素免疫測定方法
において用いられる抗体類は、モノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、
その形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ等
の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意
であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来
する抗体が好適に用いられる。The antibodies used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention can be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
As the form, whole antibodies or fragments such as F (ab ') ₂ and Fab can be used. The origin of the antibody is arbitrary, but antibodies derived from mice, rats, rabbits, sheep, goats, chickens and the like are preferably used.

【００１４】本発明の化学発光酵素免疫測定方法の後段
を構成する化学発光反応段階は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反
応させる際にその反応時及び／又は反応後にアミノアル
コールを添加して得られる化学発光試薬を用い、更に所
望により発光増強剤の存在下に水素受容体を作用させて
不溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキシダ
ーゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方順は
任意であるが、一般に、化学発光性物質及び発光増強剤
を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗体又
は抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定
塩基性ｐＨ領域において過酸化水素水溶液を添加して化
学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測定
する方法等が行なわれている。[0014] The chemiluminescence reaction step constituting the latter stage of the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention comprises N, N'-disubstitution-
Chemiluminescence obtained by adding an amino alcohol during and / or after the reaction of a 9,9′-bisacridinium salt by light irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound A reagent is used, and if necessary, a hydrogen acceptor is acted on in the presence of a luminescence enhancer to measure the activity of a peroxidase enzyme, which is a labeling substance captured on an insoluble carrier. However, in general, a measurement reagent containing a chemiluminescent substance and a luminescence enhancer is added to an insoluble carrier that immunologically captures a peroxidase enzyme-labeled antibody or antigen, and an aqueous hydrogen peroxide solution is added in a specific basic pH range. A chemiluminescence reaction, and measuring the amount of chemiluminescence with a luminescence measuring device.

【００１５】次に、本発明の化学発光酵素免疫測定方法
に用いられる化学発光試薬について説明する。前記化学
発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
の存在下において光照射により反応させる際に、その反
応時及び／又は反応後に特定のアミノアルコール化合物
を添加することにより得られる化学発光性物質を含有す
る反応混合物である。前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類は、下記一般式（１）Next, the chemiluminescent reagent used in the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention will be described. When the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt is reacted by light irradiation in the presence of an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, the chemiluminescent reagent reacts during the reaction. And / or a reaction mixture containing a chemiluminescent substance obtained by adding a specific amino alcohol compound after the reaction. The N, N′-disubstitution-9,9 ′
The bisacridinium salts are represented by the following general formula (1)

【００１６】[0016]

【化４】 で表わすことができる。Embedded image Can be represented by

【００１７】前記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ²
は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基
からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるも
のでもよい。また、アルキル基としては炭素数１〜１４
の直鎖状又は分岐状のものを挙げることができ、特に、
炭素数１〜１０のものが好ましく、具体的には、メチル
基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル
基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキ
シル基、イソヘキシル基等を例示することができる。ア
リール基は炭素数６〜２０のものであり、アリール基に
は炭素数１〜１４のアルキル基が結合したものでもよ
い。具体的にはフェニル基、トリール基、キシリル基等
を例示することができる。Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶
は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ
基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選
択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アル
キル基は炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のものであ
り、特に、炭素数１〜１０のものが好ましく、具体的に
は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチ
ル基等を例示することができる。アリール基は炭素数６
〜２０であり、アリール基には炭素数１〜１４のアルキ
ル基が結合したものでもよい。具体的には、フェニル
基、トリール基、キシリル基等を例示することができ
る。アルコキシ基は炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状
アルキル基を有し、また、アリーロキシ基は、炭素数６
〜２０のアリール基を有する。In the general formula (1), R ¹ and R ²
Are selected from the group consisting of an alkyl group, an aryl group and an aryl halide group, and may be the same or different from each other. The alkyl group has 1 to 14 carbon atoms.
Straight or branched ones, in particular,
Those having 1 to 10 carbon atoms are preferred, and specific examples include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a pentyl group, an isopentyl group, a hexyl group, and an isohexyl group. it can. The aryl group has 6 to 20 carbon atoms, and the aryl group may have an alkyl group having 1 to 14 carbon atoms bonded thereto. Specific examples include a phenyl group, a tolyl group, and a xylyl group. R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶
Are selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an aryloxy group and a halogen atom, and may be the same or different from each other. The alkyl group is a linear or branched one having 1 to 14 carbon atoms, and particularly preferably one having 1 to 10 carbon atoms, specifically, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, and a butyl group. Group, isobutyl group, pentyl group, isopentyl group and the like. The aryl group has 6 carbon atoms.
To 20, and an aryl group to which an alkyl group having 1 to 14 carbon atoms is bonded may be used. Specific examples include a phenyl group, a tolyl group, and a xylyl group. The alkoxy group has a linear or branched alkyl group having 1 to 14 carbon atoms, and the aryloxy group has 6 carbon atoms.
It has up to 20 aryl groups.

【００１８】前記式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオ
ンであり、ｎは１又は２である。陰イオン（対イオン）
としては、具体的には硝酸イオン、ハロゲンイオン、リ
ン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等が挙げら
れる。In the above formula (1), X is an n-valent anion, and n is 1 or 2. Anion (counter ion)
Specific examples include nitrate ions, halogen ions, phosphate ions, sulfate ions, sulfonate ions, and the like.

【００１９】前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
プロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩などが挙げられ、特に、Ｎ，Ｎ’−
ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレー
ト（ルシゲニン）が好適である。前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）Specific examples of the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts include N, N'-dimethyl-9,9'-bisacridinium salts and N, N '-Diethyl-9,9'-bisacridinium salt, N, N'-dipropyl-9,9'-bisacridinium salt, N, N '
-Diisopropyl-9,9'-bisacridinium salt,
N, N'-diphenyl-9,9'-bisacridinium salt; N, N'-di-m-chlorophenyl-9,9'-bisacridinium salt; −
Dimethyl-9,9'-bisacridinium dinitrate (lucigenin) is preferred. The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound has the following general formula (2)

【００２０】[0020]

【化５】 で表わすことができる。Embedded image Can be represented by

【００２１】前記一般式（２）において、Ｒ₁ は、炭素
数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル
基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択
され、アリール基はアルキル基、ハロゲン、ニトロ基、
水酸基及びアミノ基等で置換されていてもよく、Ｒ₂
は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
₃ は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０の
アルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる
群より選択され、アリール基はアルキル基、ハロゲン原
子、ニトロ基、水酸基及びアミノ基等で置換されていて
もよい。Ｒ₁ 及びＲ₃ のアルキル基としては、例えば、
メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル
基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、
デシル基等の直鎖状又は分岐状のものを挙げることがで
きる。また、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれ
が結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の
窒素原子と共に環を形成していてもよい。In the general formula (2), R ₁ is selected from the group consisting of an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms. Represents an alkyl group, a halogen, a nitro group,
It may be substituted with a hydroxyl group and an amino group, R ₂
Is selected from the group consisting of a methyl group and an ethyl group;
₃ is selected from the group consisting of an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, wherein the aryl group is an alkyl group, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group and It may be substituted with an amino group or the like. As the alkyl group for R ₁ and R ₃ , for example,
Methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl,
A straight or branched one such as a decyl group can be used. R ₁ and R ₃ may be bonded to each other to form a ring together with the carbon atom of the carbonyl group to which they are bonded and the nitrogen atom of the amide group.

【００２２】前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等が非限定的に挙げられる。また、化学発光試薬の製
造に用いられる原料の一つであるアミノアルコール化合
物は、下記一般式（３）Specific examples of the N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound include N, N-dimethylformamide,
N, N-dimethylacetamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-dimethylpropionamide,
Non-limiting examples include N-dimethylbenzamide, N-methyl-2-pyrrolidone, and the like. An amino alcohol compound, which is one of the raw materials used for producing a chemiluminescent reagent, has the following general formula (3)

【００２３】[0023]

【化６】 で表わすことができる。前記一般式（３）において、Ｒ
は炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素基であり、ｍは
１〜３の整数である。その具体的な例としては、モノエ
タノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノール
アミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノ
ールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的
に挙げることができる。Embedded image Can be represented by In the general formula (3), R
Is a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, and m is an integer of 1 to 3. Specific examples thereof include, but are not limited to, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monoisopropanolamine, diisopropanolamine, and triisopropanolamine.

【００２４】前記アミノアルコール化合物の添加は、発
光反応時において、ブランク値を低下させる効果及びペ
ルオキシダーゼの高濃度領域における発光強度を上昇さ
せる効果を有し、また、化学発光試薬の保存時におい
て、その発光性能の低下を防ぐ保存安定性を改善する効
果等を有し、化学発光試薬の感度や安定性等の性能の向
上に寄与する処が大きい。The addition of the amino alcohol compound has the effect of lowering the blank value during the luminescence reaction and the effect of increasing the luminescence intensity in the high concentration region of peroxidase. It has the effect of improving storage stability for preventing a decrease in luminescence performance, and greatly contributes to the improvement of performance such as sensitivity and stability of a chemiluminescent reagent.

【００２５】前記化学発光試薬の製造に用いられる光照
射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍ
の範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８０
０ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源として
は、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱
電灯等を非限定的に用いることができ、特に、白熱電灯
が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学
発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学
発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同
量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示す
ことと、この反応を光遮断下に実施した場合にはペルオ
キシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られな
いことから、化学発光性化合物の生成には光照射が重要
な役割を担っていることが認められる。The light beam used for producing the chemiluminescent reagent for light irradiation has a wavelength range of about 290 to 800 nm.
Is used, and in particular, about 400 to 80
Visible light in the range of 0 nm is desirable. As these light sources, high-pressure mercury lamps, low-pressure mercury lamps, germicidal lamps, fluorescent lamps, incandescent lamps and the like can be used without limitation, and incandescent lamps are particularly preferably used. The chemiluminescent reagent obtained by this light irradiation has a very high luminescence in a short time when manufactured at the same raw material lucigenin concentration and used in the same amount, compared to a chemiluminescent reagent manufactured under natural light without using a light source. Light irradiation plays an important role in the production of a chemiluminescent compound because it shows strength and, when this reaction is performed under light blocking, a chemiluminescent reagent having a peroxidase concentration-dependent property cannot be obtained. Is recognized.

【００２６】前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペ
ルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応
は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオ
ンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しか
し、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の
高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオン
への対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の
高い塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化
し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物
の配位若しくは溶媒和によって安定化され、この安定化
されたビラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解によ
り生成する活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタ
ン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存
した発光強度が得られるものと考えられる。この光照射
による反応において、アミノアルコール化合物の添加
は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
カチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進し、発
光反応時のブランク値を高める副生成物の生成を抑え、
且つ生成するビラジカルを更に安定化する作用を有する
ものと考えられる。The N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts do not cause a remarkable luminescence reaction with hydrogen peroxide at around pH 8 or with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase. N, N'-disubstitution-9,9'-
This is probably because the bisacridinium cation forms a stable salt with the counter ion, particularly the nitrate ion. However, by performing light irradiation in the presence of a highly polar compound such as an N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound, N, N
The charge transfer from the counter anion to the N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium cation is promoted, and the salt is changed from a highly ionic salt to a radical charge transfer complex. The N-disubstituted carboxylic acid amide compound is stabilized by coordination or solvation, and the stabilized biradical compound reacts with active oxygen generated by enzymatic decomposition of hydrogen peroxide to form an excited state dioxetane structure. It is considered that since the light is emitted after passing through, the light emission intensity depending on the peroxidase concentration can be obtained. In the reaction by light irradiation, the addition of the amino alcohol compound promotes the reaction by participating in charge transfer to the N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium cation, and promotes the reaction during the luminescence reaction. Suppress the generation of by-products that increase the blank value,
Further, it is considered to have an action of further stabilizing the generated biradical.

【００２７】前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及びアミノアルコール化合物の混合モル比は、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対
してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万
倍モル、アミノアルコール化合物を１〜１万倍モルの量
でそれぞれ用いることができ、さらに、同種及び／又は
異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又
はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。The N, N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salts, the N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound and the amino alcohol compound are mixed in a molar ratio of N, N
The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound and the amino alcohol compound are used in an amount of from 10,000 to 10,000 times mol and from the N'-disubstituted-9,9'-bisacridinium salt by mol, respectively. Each of them can be used, and the same and / or different N, N-disubstituted carboxylic acid amide compounds and / or other solvents can be used as the reaction solvent.

【００２８】光照射反応の反応温度は用いられる溶媒の
有無及び種類によって異なるが、一般的に−１０〜＋１
５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０
〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一昼
夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０
分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。The reaction temperature of the light irradiation reaction depends on the presence or absence and the type of the solvent used, but is generally -10 to +1.
50 ° C, preferably 0 to 120 ° C, particularly preferably 20 ° C.
Temperatures in the range of ℃ 90 ° C. The reaction time is 1 minute to 24 hours, preferably 10 minutes to 15 hours, particularly preferably 30 minutes.
It can be carried out in a time ranging from minutes to 10 hours.

【００２９】前記化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の
塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペ
ルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発
光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強
することが認められる。このようなフェノール性化合物
としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノ
ール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−
（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨード
フェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブ
ロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジク
ロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が
非限定的に挙げられる。The above chemiluminescent reagent emits light under basic conditions of pH 7.5 to 13 in the presence of an excess of hydrogen peroxide in an amount depending on the concentration of peroxidase. It is recognized that this luminescence is enhanced by a luminescence promoter such as a phenolic compound. Such phenolic compounds include p-hydroxycinnamic acid, p-phenylphenol, p- (4-chlorophenyl) phenol, p-
(4-bromophenyl) phenol, p- (4-iodophenyl) phenol, p-iodophenol, p-bromophenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, p-coumaric acid, 6-hydroxybenzothiazole , 2-naphthol, firefly luciferin and the like.

【００３０】前記化学発光試薬の濃度は、１０^-8〜１
Ｍ、好ましくは１０^-6〜１０^-2Ｍ、さらに好ましくは１
０^-4〜１０^-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、その使用量は
１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲
で用いるのが望ましい。また、発光促進剤は、化学発光
試薬の量の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１
〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０^-6〜１Ｍ、
好ましくは１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲で用いるのが望まし
い。The concentration of the chemiluminescent reagent is from 10 ^-8 to 1
M, preferably 10 ^-6 to 10 ^-2 M, more preferably 1
It is used at a concentration in the range of 0 ^-4 to 10 ^-2 M, and its use amount is preferably in the range of 10 to 500 µl, preferably 50 to 300 µl. Further, the luminescence promoter is used in an amount of 0.01 to 100 times, preferably 0.1 to 100 times the amount of the chemiluminescent reagent.
Used in the range of 10 to 10-fold molar, and its concentration is 10 ^{-6 to 1} M,
Preferably, it is used in the range of 10 ^-4 to 10 ^-2 M.

【００３１】化学発光反応に用いられる水素受容体とし
ては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであ
れば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無
機過酸化物等が任意に用いられ、特に、過酸化水素が好
ましい。この水素受容体の使用量は化学発光試薬に対し
て充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用
量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましくは
１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが望ましい。The hydrogen acceptor used in the chemiluminescence reaction is not particularly limited as long as it can serve as a substrate for a peroxidase enzyme, and organic peroxides, inorganic peroxides and the like are arbitrarily used. In particular, hydrogen peroxide is preferred. It is necessary to use the hydrogen acceptor in a sufficient excess amount with respect to the chemiluminescent reagent, and the use amount is 30,000 to 10,000 times, preferably 10 to 1,000 times, relative to the chemiluminescent reagent. It is desirable to use it in the molar range.

【００３２】また、ペルオキシダーゼを標識物質として
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。In the case of quantifying various substances by labeling an antibody, nucleic acid or the like using peroxidase as a labeling substance, horseradish peroxidase (HRP) is preferably used as the peroxidase, although it is not particularly limited. .

【００３３】化学発光反応に用いる塩基性緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面
活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることがで
きる。As the basic buffer used for the chemiluminescence reaction, a Tris buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, a carbonate buffer, a glycine-sodium hydroxide buffer and the like can be arbitrarily used. The concentration of these buffers is between 1 mM and
It is desirable to use in the range of 1M. In addition, additives such as a surfactant and a chelating agent can be optionally used during the reaction.

【００３４】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におけ
る化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測
定することができる。その際に、発光量測定の開始点及
び積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量
の濃度依存性の高い時間を選択するのが望ましい。例え
ば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０
〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積
算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ま
しくは１〜１０秒である。The amount of luminescence of the chemiluminescence reaction in the method for immunoassay of chemiluminescent enzyme of the present invention can be measured using a luminescence photometer. At this time, the start point and the integration time of the light emission amount measurement are arbitrary, but it is desirable to select a time in which the light emission amount is stable and the light emission amount has high concentration dependency. For example, the measurement start point is 0 to 1 hour after mixing the reagents, preferably 0 to 1 hour.
The time is from 1 second to 1 minute, preferably from 1 to 30 seconds, particularly preferably from 1 to 10 seconds.

【００３５】[0035]

【実施例】以下、参考例と共に実施例及び比較例を示
し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は実施
例等により限定されるものではない。尚、参考例及び実
施例中の％は重量％を意味する。The present invention will be specifically described below with reference to Examples and Comparative Examples together with Reference Examples. However, the present invention is not limited by the examples and the like. Incidentally,% in Reference Examples and Examples means% by weight.

【００３６】［参考例１］化学発光試薬の調製 ルシゲニンを１．５ｍｇ試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミドを１ｍｌ加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することにより化学発光試薬を得た。次に、この
化学発光試薬を８×１０^-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７
５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈
することにより化学発光試薬溶液を調製した。[Reference Example 1] Preparation of chemiluminescent reagent 1.5 mg of lucigenin was placed in a test tube, and N, N-
After adding and dissolving 1 ml of dimethylacetamide, 3
After irradiation with a 250 W copy lamp for 7 hours in a water bath at a temperature of 0 ° C., 0.5 ml of triethanolamine was added and mixed to obtain a chemiluminescent reagent. Next, this chemiluminescent reagent was added to 8 × 10 ⁻⁴ M p-iodophenol 7
A chemiluminescent reagent solution was prepared by diluting 500-fold with a 5 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) solution.

【００３７】［参考例２］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクロ
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)
（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、
白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに
０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。Reference Example 2 Production of Polyclonal Antibody Immobilized on Insoluble Carrier A polyclonal antibody derived from an animal such as a rabbit having specific reactivity to an antigen was prepared by adding 10 mM phosphate buffered saline (pH 7.4).
(PBS) at a concentration of 10 mg / ml,
0.1 ml was added to each well of a white microplate (Lab System), left at 37 ° C. for 1 hour, washed with PBS, and then 0.3 ml of 1% bovine serum albumin (BSA) aqueous solution was added. In addition, the plate was left standing at a temperature of 37 ° C. for 1 hour to perform a post-coating treatment, thereby obtaining a polyclonal antibody-immobilized white microplate.

【００３８】［参考例３］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクロー
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(p
H7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温
度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ
・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰ
ＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジ
ルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデッ
クスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩
衝液(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィ
ド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオン
バック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、
これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ
酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5) １ｍｌを添加して、２５℃
の温度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリ
ジルジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾
過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。次に、
マレイミド化モノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰと
を混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／
ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した
後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を
充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ
酵素標識モノクローナル抗体を得た。Reference Example 3 Production of Peroxidase Enzyme-Labeled Monoclonal Antibody A monoclonal antibody derived from a mouse or the like having specific reactivity with an antigen was prepared by adding 10 mM phosphate buffered saline (PBS) (p
H7.4) at a concentration of 1.0 mg / ml in 1 ml
To this was added 0.1 ml of a 10 mg / ml dimethylformamide solution of N- (m-maleimidobenzoic acid) -N-succinimide ester (MBS), and the mixture was reacted at a temperature of 25 ° C. for 30 minutes. Next, the reaction mixture was charged to a column packed with Sephadex G-25,
Gel filtration was performed using an M phosphate buffer (pH 6.0) to separate the maleimidated monoclonal antibody from unreacted MBS.
On the other hand, horseradish peroxidase (HRP) was used as a peroxidase enzyme at a concentration of 1.0 mg / ml P
10 mg / ml of N-succinimidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) was added to the BS solution.
Ethanol solution at a concentration of 30 ° C. at a temperature of 25 ° C.
Allowed to react for minutes. Next, the reaction mixture was purified by gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 using 10 mM acetate buffer (pH 4.5), and a fraction containing pyridyl disulfide-modified HRP was collected. It was concentrated about 10-fold in a collodion bag under ice cooling. next,
0.1M containing 0.1M dithiothreitol
Add 1 ml of acetate buffered saline (pH 4.5) and add
After reducing the pyridyl disulfide group introduced into the HRP molecule by stirring at a temperature of 30 minutes, the reaction mixture was subjected to gel filtration using a column packed with Sephadex G-25 to obtain a fraction containing thiolated HRP. Got a minute. next,
The maleimidated monoclonal antibody was mixed with the thiolated HRP, and 4 mg / ml was added under ice cooling using a collodion bag.
After concentrating to a protein concentration of 1 ml and standing at 4 ° C. for 24 hours, gel filtration was performed using a column packed with Ultrogel AcA44 (SEPRACOR) to obtain a peroxidase enzyme-labeled monoclonal antibody.

【００３９】［実施例１］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロテ
イン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、
これに参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ
及び０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩
酸緩衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた
後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製
ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定
し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることに
より、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。
この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０１
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。[Example 1] α-fetoprotein by simultaneous sandwich method CLEIA
Measurement of in (AFP) A 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human AFP (standard substance) in a range of 0 to 800 ng / ml is placed on a white microplate on which a rabbit anti-human AFP polyclonal antibody is immobilized. ) 50 μl and about 3 μg / mouse anti-human AFP monoclonal antibody labeled with peroxidase enzyme
2% BSA-containing PBS solution (pH 7.
4) 100 μl was added, and the mixture was incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, after aspirating and removing the solution in the well, the inside of the well was washed with physiological saline, and then 100 μl of 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added to each well,
100 µl of the chemiluminescent reagent solution prepared in Reference Example 1
And 50 μl of 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.0017% hydrogen peroxide were sequentially injected to emit light, and the amount of the emitted light was measured using a luminometer (Diatron Co., Ltd., Luminous CT-9000D). The measurement was performed by integrating for 5 seconds, and this value was plotted against the concentration of the standard substance to obtain a calibration curve having good concentration dependency shown in FIG.
Using this calibration curve, human AFP in serum samples was
It was possible to measure up to a concentration of ng / ml.

【００４０】［実施例２］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、
ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これ
に参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０．０１
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。[Example 2] Prolactin (P) by simultaneous sandwich method CLEIA
RL) 50 μl of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing purified human PRL (standard substance) in a range of 0 to 200 ng / ml on a white microplate on which a rabbit anti-human PRL polyclonal antibody is immobilized. And peroxidase enzyme-labeled mouse anti-human PRL monoclonal antibody at about 2 μg /
2% BSA-containing PBS solution (pH 7.
4) 100 μl was added, and the mixture was incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Then, the solution in the well is removed by suction,
Wash the wells with saline, then add 75
100 μl of mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added, and 100 μl of the chemiluminescent reagent solution prepared in Reference Example 1 and 50 μl of 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.0017% hydrogen peroxide were sequentially added thereto. After injecting and emitting light, this light emission amount was measured by integrating for 0 to 5 seconds using a luminometer (Diatron Co., Ltd., Luminous CT-9000D), and this value was plotted against the concentration of the standard substance.
A calibration curve with good concentration dependency shown in FIG. 2 was obtained. Using this calibration curve, human prolactin in serum samples was
It was possible to measure up to a concentration of ng / ml.

【００４１】［実施例３］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナド
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これに
参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０．０１ｍＩＵ／
ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。[Example 3] Human chorionic gonado by simultaneous sandwich method CLEIA
Measurement of tropin β chain (βhCG) Purified βhCG (standard substance) was added to a white microplate on which a rabbit anti-human hCG polyclonal antibody was immobilized.
50 μl of a 2% BSA-containing PBS solution (pH 7.4) containing ２００200 mIU / ml and about 2 μg / m 2 of a mouse anti-βhCG monoclonal antibody labeled with a peroxidase enzyme.
1% PBS solution containing 2% BSA (pH 7.4)
100 μl was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, after aspirating and removing the solution in the wells, the wells were washed with physiological saline, and then 75 m was added to each well.
100 μl of M Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added, and 100 μl of the chemiluminescent reagent solution prepared in Reference Example 1 and 50 μl of 75 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.0017% hydrogen peroxide were sequentially added thereto. After injecting and emitting light, this light emission amount was measured by integrating for 0 to 5 seconds using a luminometer (Diatron Co., Ltd., Luminous CT-9000D), and this value was plotted against the concentration of the standard substance.
A calibration curve with good concentration dependency shown in FIG. 3 was obtained. Using this calibration curve, βhCG in the serum sample was determined to be 0.01 mIU /
It was possible to measure up to a concentration of ml.

【００４２】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識
マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−ヨ
ードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌを加え、これにルミ
ノールを５．６×１０^-5Ｍの濃度で含有する０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び０．００３４
％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ５０
μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノメーター
（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０
〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対し
てプロットすることにより、図４に示される濃度依存性
を有する検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中
のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定するこ
とが可能であった。[Comparative Example 1] A simultaneous sandwich method CLEIA using luminol
Measurement of α-fetoprotein (AFP) Purified human AFP (standard substance) containing 2% BSA containing PSA in a range of 0 to 800 ng / m was placed on a white microplate on which a rabbit anti-human AFP polyclonal antibody was immobilized.
50 µl of a BS solution (pH 7.4) and about 3 µg / m2 of a mouse anti-human AFP monoclonal antibody labeled with a peroxidase enzyme.
1% PBS solution containing 2% BSA (pH 7.4)
100 μl was added and incubated at a temperature of 37 ° C. for 1 hour. Next, after the solution in the wells was removed by suction, the wells were washed with physiological saline, and then 0.1 M Tris-HCl buffer containing p-iodophenol at a concentration of 10 ⁻³ M was added to each well. 100 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.4) containing luminol at a concentration of 5.6 × 10 ⁻⁵ M, and 0.0034 μl.
50% 0.1% Tris-HCl buffer (pH 8.4) 50% hydrogen peroxide
μl was injected to emit light, and the amount of emitted light was measured using a luminometer (Luminous CT-9000D manufactured by Diatron Co., Ltd.).
Measurement was performed by integrating for 〜5 seconds, and this value was plotted against the standard substance concentration to obtain a calibration curve having a concentration dependency shown in FIG. Using this calibration curve, it was possible to measure human AFP in serum samples up to a concentration of 2.0 ng / ml.

【００４３】[0043]

【発明の効果】本発明の化学発光酵素免疫測定方法によ
れば、入手が容易であり取り扱いも比較的に容易なペル
オキシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が
容易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製
造できる新規化学発光試薬を用いる化学発光反応により
測定対象物質である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に
高感度に測定することができる。According to the chemiluminescent enzyme immunoassay of the present invention, a peroxidase enzyme that is easily available and relatively easy to handle is used as a labeling substance, and lucigenin or the like that is inexpensive and easily available is used as a starting material. In addition, various antigens or antibodies to be measured can be immunologically measured with high sensitivity by a chemiluminescence reaction using a novel chemiluminescent reagent that can be easily produced.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。FIG. 1 is a calibration curve for measuring human αAFP prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 1 as a function of the concentration of human αAFP (standard substance).

【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。FIG. 2 is a calibration curve for measuring human prolactin prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 2 as a function of the concentration of human prolactin (standard substance).

【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。FIG. 3 is a calibration curve for βhCG measurement prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Example 3 as a function of the concentration of βhCG (standard substance).

【図４】 比較例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。FIG. 4 is a calibration curve for human αAFP measurement prepared by plotting the amount of chemiluminescence chemiluminescent using the reaction system described in Comparative Example 1 as a function of the concentration of human αAFP (standard substance).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 佐藤 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR02 QR41 QR50 QR66 QR82 QX02  ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Genichiro Aratani 1-9-4 Horinouchi, Adachi-ku, Tokyo Dainichi Seika Kogyo Co., Ltd. Technology Research Center (72) Inventor Toshifumi Katsuragi One of Horinouchi, Adachi-ku, Tokyo No. 9-4 Dainichi Seika Industry Co., Ltd. Technology Research Center (72) Inventor Mio Sato 1-9-4 Horinouchi Adachi-ku, Tokyo Dainichi Seika Kogyo Co., Ltd. Technical Research Center F-term (reference) 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR02 QR41 QR50 QR66 QR82 QX02

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又
はこれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
を形成させた後、これにＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸の
存在下において光照射により反応させる際に、その反応
時及び／又は反応後アミノアルコール化合物を添加する
ことにより得られる化学発光試薬を添加し、水素受容体
の存在下において化学発光させ、その発光強度を測定す
ることにより試料中の抗原又は抗体の量を測定すること
を特徴とする化学発光酵素免疫測定方法。An antibody or an antigen labeled with a peroxidase enzyme is mixed with an antigen or an antibody to be measured in a sample or an aggregate thereof to form an immune complex comprising a peroxidase enzyme-labeled-antigen-antibody complex by an antigen-antibody reaction. After that, the N, N'-disubstituted-9,9'-
When reacting bisacridinium salts by light irradiation in the presence of N, N-disubstituted carboxylic acid, a chemiluminescent reagent obtained by adding an amino alcohol compound during the reaction and / or after the reaction is added. A chemiluminescent enzyme immunoassay method, wherein chemiluminescence is caused in the presence of a hydrogen receptor, and the amount of the antigen or antibody in the sample is measured by measuring the luminescence intensity. 【請求項２】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類が、下記一般式（１） 【化１】 （前記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよ
く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル
基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハ
ロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又
は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎ
は１又は２である。）で表わされる化合物である請求項
１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。2. The N, N′-disubstituted-9,9′-
Bisacridinium salts are represented by the following general formula (1): (In the general formula (1), R ¹ and R ² are selected from the group consisting of an alkyl group, an aryl group, and a halogenated aryl group, and may be the same or different from each other; R ³ , R ⁴ , R ⁵ And R ⁶ are selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, an alkoxy group, an aryloxy group, and a halogen atom, and may be the same or different from each other; X is an n-valent anion;
Is 1 or 2. 2. The method according to claim 1, which is a compound represented by the formula: 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物が、下記一般式（２） 【化２】 （前記一般式（２）において、Ｒ₁ は、炭素数１〜１０
のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素
数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリ
ール基はアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基
及びアミノ基等で置換されていてもよく、Ｒ₂ は、メチ
ル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は、炭素数１〜１０のア
ルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６
〜２０のアリール基からなる群より選択され、アリール
基はアルキル基、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基及び
アミノ基等で置換されていてもよく、また、Ｒ₁ 及びＲ
₃ は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボ
ニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形
成していてもよい。）で表わされる化合物である請求項
１又は２に記載の化学発光酵素免疫測定方法。3. The N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound represented by the following general formula (2): (In the general formula (2), R ₁ has 1 to 10 carbon atoms.
Selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms and an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, wherein the aryl group is substituted with an alkyl group, a halogen atom, a nitro group, a hydroxyl group, an amino group, or the like. R ₂ may be a methyl group or an ethyl group, and R ₃ may be an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 10 carbon atoms, and 6 carbon atoms.
Is selected from the group consisting of an aryl group to 20, an aryl group an alkyl group, a halogen atom, a nitro group, may be substituted with a hydroxyl group and an amino group or the like, also, R ₁ and R
₃ may be bonded to each other to form a ring together with the carbon atom of the carbonyl group to which they are bonded and the nitrogen atom of the amide group. The method according to claim 1 or 2, which is a compound represented by the formula: 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニ
ン）である請求項１ないし３のいずれかの１項に記載の
化学発光酵素免疫測定方法。4. The N, N′-disubstituted-9,9′-
When bisacridinium salts are N, N'-dimethyl-9,
The chemiluminescent enzyme immunoassay according to any one of claims 1 to 3, wherein the method is 9'-bisacridinium dinitrate (lucigenin). 【請求項５】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミドである請求項１ないし４のいず
れかの１項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。5. The method according to claim 1, wherein the N, N-disubstituted carboxylic acid amide compound is N, N-dimethylformamide or N, N
The chemiluminescent enzyme immunoassay according to any one of claims 1 to 4, which is -dimethylacetamide. 【請求項６】 前記アミノアルコール化合物が、下
記一般式（３） 【化３】 （前記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
の脂肪族炭化水素基であり、ｍは１〜３の整数であ
る。）で表わされる化合物である請求項１ないし５のい
ずれかの１に記載の化学発光酵素免疫測定方法。6. The amino alcohol compound represented by the following general formula (3): (Wherein, in the general formula (3), R is a divalent aliphatic hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, and m is an integer of 1 to 3). The chemiluminescent enzyme immunoassay according to any one of the above. 【請求項７】 前記アミノアルコール化合物が、モ
ノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタ
ノールアミンからなる群より選択される少なくとも一種
の化合物である請求項１ないし６のいずれかの１項に記
載の化学発光酵素免疫測定方法。7. The chemiluminescent enzyme according to claim 1, wherein the amino alcohol compound is at least one compound selected from the group consisting of monoethanolamine, diethanolamine and triethanolamine. Immunoassay method. 【請求項８】 前記水素受容体が、過酸化水素又は
過酸化水素源である請求項１ないし７のいずれかの１項
に記載の化学発光酵素免疫測定方法。8. The immunoassay according to claim 1, wherein the hydrogen acceptor is hydrogen peroxide or a hydrogen peroxide source. 【請求項９】 前記化学発光反応を行なう際に、さ
らに、発光増強剤を含有させてなる請求項１ないし８の
いずれかの１項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。9. The chemiluminescent enzyme immunoassay according to claim 1, further comprising a luminescence enhancer when performing the chemiluminescence reaction. 【請求項１０】 前記発光増強剤が、フェノール性化
合物である請求項９に記載の化学発光酵素免疫測定方
法。10. The method according to claim 9, wherein the luminescence enhancer is a phenolic compound.