JP2000038351A - Apoptosis-inducing agent containing acylpeptide hydrolase inhibitor as active ingredient - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an apoptosis-inducing agent which shows the inhibitory effect on acylpeptide hydrolase and inhibits the multiplication of various tumor cells by including an acylpeptide hydrolase inhibitor as an active ingredient. SOLUTION: This apoptosis-inducing agent is obtained by including an acylpeptide hydrolysate inhibitor, suitably a compound represented by R1-Y-R2 (Y is an amino acid residue; R1 is H or a substituent on the amino group in an amino acid residue; R2 is a lower alkyl which is a substituent on the carbonyl group in an amino acid residue and may be substituted with a halogen) or its pharmacologically permissible salt, e.g. acetylleuncine chloromethyl ketone or the like, as an active ingredient. Further, the daily clinical dose is about 1 mg-5 g per an adult and may be administrated once or several times a day.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、アシルペプチド加
水分解酵素の特異的阻害剤を有効成分とするアポトーシ
ス誘起剤、更には、アシルペプチド加水分解酵素の特異
的阻害剤を有効成分とする抗癌剤、抗炎症剤ないしは免
疫疾患治療剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an apoptosis-inducing agent comprising a specific inhibitor of acyl peptide hydrolase as an active ingredient, an anticancer agent comprising a specific inhibitor of acyl peptide hydrolase as an active ingredient, The present invention relates to an anti-inflammatory agent or a therapeutic agent for an immune disease.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アポトーシスは個体の発生、分化、生命
維持において重要な役割を担っている。アポトーシス誘
導に異常が生じると、生体の恒常性が破壊され、多くの
疾病が誘発される。アポトーシスは特に免疫系との関連
が深く、アポトーシスが誘導されないと自己抗原と反応
するリンパ球が除去されず、自己免疫疾患が誘発され
る。また、癌においては、癌抑制遺伝子の一つであるＰ
５３が変異している場合が多く、その結果、Ｐ５３経由
のアポトーシスによる癌排除機構が欠落し、癌細胞が不
死化すると考えられる。アポトーシスを誘起するシグナ
ルの経路としてＦＡＳ受容体（ＣＤ９５）やＴＮＦ受容
体を介する経路が知られている（ＣｅＩＩ，８８、３５
５、１９９７）。これらの受容体はＦＡＤＤ（Ｆａｓ−
ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ
ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ）やＴＲＡ
ＤＤ（Ｔｕｍｏ ｒｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ
ｄｏｍａｉｎ）と相互作用し、カスパーゼ類を次々に
活性化してアポトーシスのシグナルを伝達する。これら
アポトーシス関連分子を標的とするアポトーシスを誘導
する薬剤の開発が試みられている。2. Description of the Related Art Apoptosis plays an important role in the development, differentiation and life support of individuals. When abnormalities occur in the induction of apoptosis, homeostasis of the living body is destroyed, and many diseases are induced. Apoptosis is particularly closely related to the immune system. If apoptosis is not induced, lymphocytes that react with self antigens are not removed, and autoimmune diseases are induced. In cancer, one of the tumor suppressor genes, P
In many cases, 53 is mutated, and as a result, it is considered that the cancer elimination mechanism due to apoptosis via P53 is lost, and cancer cells are immortalized. As a signal pathway for inducing apoptosis, pathways mediated by FAS receptor (CD95) and TNF receptor are known (CeII, 88, 35).
5, 1997). These receptors are FADD (Fas-
associating Protein with
a novel death domain) or TRA
DD (Tumo rnecrosis factor)
receptor-associated depth
and interacts with the same to activate a series of caspases to signal apoptosis. Attempts have been made to develop drugs that induce apoptosis targeting these apoptosis-related molecules.

【０００３】[0003]

【発明を解決しようとする課題】生体内の多くの蛋白質
はそのＮ末端がアシル基などで保護されている場合が多
い。アシルペプチド加水分解酵素（ＥＣ３．４．１９．
１）はこのＮ末端がアシル化されているアミノ酸を加水
分解する酵素であり（Ａ．Ｓｃａｌｏｎｉ他、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１５０７６，１９９４）、Ｎ
−アセチル化ペプチドからアセチル化アミノ酸を除く働
きがある。この酵素はヒト赤血球、ラット肝臓など多く
の組織から単離されている。本酵素はセリンプロテアー
ゼとして分類され、生理的役割は明確でないが、アセチ
ル化された生物活性を有するペプチド、例えばＡＣＴ
Ｈ、メラノサイト刺激ホルモンなどの調節に関与してい
ると考えられる。ユビキチン分解系にアセチル蛋白が含
まれるので、通常では代謝されない阻止ペプチドの除
去、ある特定の蛋白質、例えば調節因子や増殖因子の除
去および不活化、ペプチドの代謝回転に関与するとも考
えられる。したがって、アシルペプチド加水分解酵素作
用及びその活性を阻害することによる疾患への関係解明
が待たれている。Many proteins in vivo are often protected at their N-terminus with an acyl group or the like. Acyl peptide hydrolase (EC 3.4.19.
1) is an enzyme that hydrolyzes an amino acid whose N-terminal is acylated (A. Scaloni et al., J. Bi).
ol. Chem. 269, 15076, 1994), N
-Works to remove acetylated amino acids from acetylated peptides. This enzyme has been isolated from many tissues such as human red blood cells and rat liver. This enzyme is classified as a serine protease and its physiological role is not clear, but acetylated peptides having biological activity, such as ACT
It is thought to be involved in the regulation of H, melanocyte stimulating hormone and the like. Since the ubiquitin-degrading system contains acetyl protein, it is also thought to be involved in removing blocking peptides that are not normally metabolized, removing and inactivating certain proteins such as regulatory factors and growth factors, and peptide turnover. Therefore, elucidation of the relationship to diseases by inhibiting the action of acylpeptide hydrolase and its activity is expected.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】癌、自己免疫疾患、炎症
時ではアシルペプチド加水分解酵素活性が高くなること
が想定される。その結果、恒常性維持のために必要なあ
る種のアシル化ペプチドがアシルペプチド加水分解酵素
により排除され、恒常性維持のための防御機構に破綻を
来し、さらに疾患、病気が進行して悪循環を呈する可能
性が考えられる。本発明者らは鋭意研究を行った結果、
アシルペプチド加水分解酵素の特異的阻害剤、例えば一
般式（１）で表される化合物またはその薬理学上許容さ
れる塩がアポトーシスを誘起することを見出したことに
より、本発明に到達したものである。すなわち、本発明
は以下の（１）〜（１０）に関するものである。Means for Solving the Problems It is assumed that acyl peptide hydrolase activity is increased in cancer, autoimmune disease and inflammation. As a result, certain acylated peptides required for homeostasis are eliminated by acylpeptide hydrolases, disrupting the defense mechanism for homeostasis, and further progressing diseases and diseases, resulting in a vicious cycle. May be considered. The present inventors have conducted intensive research, and as a result,
The present inventors have found that a specific inhibitor of an acylpeptide hydrolase, for example, a compound represented by the general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof induces apoptosis. is there. That is, the present invention relates to the following (1) to (10).

【０００５】（１）アシルペプチド加水分解酵素阻害剤
を有効成分とするアポトーシス誘起剤。 （２）アシルペプチド加水分解酵素阻害剤を有効成分と
する癌、炎症または免疫疾患に対する治療剤。 （３）アシルペプチド加水分解酵素阻害剤が下記一般式
（１）(1) An apoptosis-inducing agent containing an acylpeptide hydrolase inhibitor as an active ingredient. (2) A therapeutic agent for cancer, inflammation or immune disease, comprising an acylpeptide hydrolase inhibitor as an active ingredient. (3) The acyl peptide hydrolase inhibitor has the following general formula (1)

【化２】Ｒ１−Ｙ−Ｒ２ （１） 〔式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。Ｒ１はアミノ酸残基
のアミノ基上の水素原子又は置換基であり、水素原子、
置換基を有してもよい低級アシル基または低級炭化水素
スルホニル基を示す。Ｒ２はアミノ酸残基のカルボニル
基上の置換基であり、ハロゲン置換されても良い低級ア
ルキル基を示す。〕で表わされる化合物又はその薬理学
上許容される塩である前記１項記載のアポトーシス誘起
剤。Embedded image R1-YR2 (1) wherein Y represents an amino acid residue. R1 is a hydrogen atom or a substituent on the amino group of the amino acid residue;
It represents a lower acyl group or a lower hydrocarbon sulfonyl group which may have a substituent. R2 is a substituent on the carbonyl group of the amino acid residue, and represents a lower alkyl group which may be halogen-substituted. 2. The apoptosis-inducing agent according to the above 1, which is a compound represented by the formula: or a pharmacologically acceptable salt thereof.

【０００６】（４）Ｒ２がハロゲノ置換メチル基又はハ
ゲノ置換エチル基である前記３項記載のアポトーシス誘
起剤。 （５）Ｙがロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニ
ルアラニンまたはリジンの残基である前記３又は４項記
載のアポトーシス誘起剤。 （６）Ｒ１が水素原子、アセチル基、プロピオニル基、
イソプロピオニル基又はベンゾイル基である前記３〜５
項いずれかに記載のアポトーシス誘起剤。(4) The apoptosis-inducing agent according to the above (3), wherein R2 is a halogeno-substituted methyl group or a halogeno-substituted ethyl group. (5) The apoptosis-inducing agent according to the above (3) or (4), wherein Y is a residue of leucine, isoleucine, alanine, phenylalanine or lysine. (6) R1 is a hydrogen atom, an acetyl group, a propionyl group,
The above 3 to 5 which is an isopropionyl group or a benzoyl group;
Item 14. The apoptosis-inducing agent according to any one of the items.

【０００７】（７）Ｙがロイシン残基であり、Ｒ１が水
素、またはアセチル基、Ｒ２がクロロメチル基である前
記３項記載のアポトーシス誘起剤。 （８）前記３〜７項いずれかに記載の化合物又はその薬
理学上許容される塩を有効成分とする抗癌剤、抗炎症剤
または免疫疾患治療剤。 （９）前記３〜７項いずれかに記載の化合物又はその薬
理学上許容される塩を有効成分とする医薬。 （１０）前記３項記載の一般式（１）で表される化合物
（但し、Ｙがロイシン残基であり、Ｒ１がアセチル基、
Ｒ２がクロロメチル基の場合を除く）又はその薬理学上
許容される塩を有効成分とするアシルペプチド加水分解
酵素阻害剤。(7) The apoptosis-inducing agent according to the above (3), wherein Y is a leucine residue, R1 is hydrogen or an acetyl group, and R2 is a chloromethyl group. (8) An anticancer agent, an anti-inflammatory agent or a therapeutic agent for an immune disease, comprising the compound according to any of the above items 3 to 7 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. (9) A medicament comprising the compound according to any of the above items 3 to 7 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. (10) The compound represented by the general formula (1) according to the above item 3, wherein Y is a leucine residue, R1 is an acetyl group,
An acylpeptide hydrolase inhibitor comprising, as an active ingredient, R2 except a chloromethyl group) or a pharmacologically acceptable salt thereof.

【０００８】[0008]

【発明の実施の形態】本発明における一般式（１）で表
わされる化合物について説明する。Ｙにおけるアミノ酸
残基とはアミノ酸から結合のための水素、水酸基を除い
た残基を示し、該アミノ酸としては通常用いられる必須
アミノ酸等を示し、例えばロイシン、イソロイシン、ア
ラニン、フェニルアラニン、リジン等を示す。Ｒ１の低
級アシル基とは、置換基を有してもよいＣ₁〜Ｃ₁₅アシ
ル基を示し、例えばアセチル基、プロピオニル基、イソ
プロピオニル基、ベンゾイル基等を示す。その置換基と
しては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン、ニトロ、水
酸基が挙げられる。低級炭化水素スルホニル基とはＣ₁
〜Ｃ₁₀の炭化水素スルホニル基を示し、例えばパラトル
エンスルホニル基（トシル）等が挙げられる。また、Ｒ
２のハロゲン置換されても良い低級アルキル基とは、フ
ッ素、塩素、臭素等で置換されても良いＣ₁〜Ｃ₈アルキ
ル基を示す。本発明においてフッ素または塩素で置換さ
れたメチル、エチル、プロピル、イソプロピル等が好ま
しい。具体的に一般式（１）で表される化合物を以下に
示すが、本発明ではこれらに限定されない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The compound represented by formula (1) in the present invention will be described. The amino acid residue in Y indicates a residue obtained by removing hydrogen for bonding and a hydroxyl group from an amino acid, and indicates, as the amino acid, commonly used essential amino acids and the like, for example, leucine, isoleucine, alanine, phenylalanine, lysine, etc. . The lower acyl group of R1 represents a C ₁ -C ₁₅ acyl group which may have a substituent, for example, an acetyl group, a propionyl group, an isopropionyl group, a benzoyl group and the like. Examples of the substituent include halogen such as fluorine, chlorine, and bromine, nitro, and a hydroxyl group. A lower hydrocarbon sulfonyl group is C ₁
And represents a hydrocarbon sulfonyl group of from C ₁₀ to C ₁₀ , such as a paratoluene sulfonyl group (tosyl). Also, R
The lower alkyl group which may be substituted with 2 halogens refers to a C ₁ -C ₈ alkyl group which may be substituted with fluorine, chlorine, bromine and the like. In the present invention, methyl, ethyl, propyl, isopropyl and the like substituted by fluorine or chlorine are preferred. Specific examples of the compound represented by Formula (1) are shown below, but the invention is not limited thereto.

【０００９】・アセチルロイシンクロロメチルケトン ・プロピオニルロイシンクロロメチルケトン ・イソプロピオニルロイシンクロロメチルケトン ・アセチルイソロイシンクロロメチルケトン ・プロピオニルイソロイシンクロロメチルケトン ・イソプロピオニルイソロイシンクロロメチルケトン ・アセチルロイシンクロロエチルケトン ・プロピオニルロイシンクロロエチルケトン ・イソプロピオニルロイシンクロロエチルケトン ・アセチルイソロイシンクロロエチルケトン ・プロピオニルイソロイシンクロロエチルケトン ・イソプロピオニルイソロイシンクロロエチルケトン ・アセチルイソロシンクロロエチルケトン ・プロピオニルイソロイシンクロロエチルケトン ・イソプロピオニルイソロイシンクロロエチルケトン ・ロイシンクロロメチルケトン ・トシルフェニルアラニンクロロメチルケトン ・トシルリジンクロロメチルケトンAcetylleucine chloromethyl ketone Propionyl leucine chloromethyl ketone Isopropionyl leucine chloromethyl ketone Acetyl isoleucine chloromethyl ketone Propionyl isoleucine chloromethyl ketone Isopropionyl isoleucine chloromethyl ketone Acetyl leucine chloroethyl ketone Propionyl leucine Chloroethyl ketone ・ Isopropionyl leucine chloroethyl ketone ・ Acetyl isoleucine chloroethyl ketone ・ Propionyl isoleucine chloroethyl ketone ・ Isopropionyl isoleucine chloroethyl ketone ・ Acetyl isoleucine chloroethyl ketone ・ Propionyl isoleucine chloroethyl ketone ・ Isopropionyl isoleucine chloroethyl ketone・ Leucine Rollo ketone-tosyl-phenylalanine chloromethyl ketone-tosyl lysine chloromethyl ketone

【００１０】また、本発明においては一般式（１）で表
わされる化合物を薬理学上許容される塩として用いても
良い。塩としては酸又は塩基いずれでも薬理学上許容さ
れる塩を形成するものであれば特に限定はしないが、通
常は酸（無機塩又は有機塩）との塩が挙げられ、具体的
には塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。In the present invention, the compound represented by the general formula (1) may be used as a pharmacologically acceptable salt. The salt is not particularly limited as long as it forms a pharmacologically acceptable salt with either an acid or a base, and usually includes a salt with an acid (inorganic salt or organic salt). Salts, sulfates, phosphates and the like.

【００１１】本発明化合物、例えばアセチルロイシンク
ロロメチルケトンは公知化合物であり、公知の方法
（Ａ．Ｓｃａｌｏｎｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６７巻、３８１１頁、１９９２年）により製造して得
ることができる。他の本発明化合物も上記文献に準ずる
か、又は他の常法の製造方法により容易に製造して得る
ことができる。The compounds of the present invention, for example, acetylleucine chloromethyl ketone, are known compounds and are known in the art (A. Scaloni et al., J. Biol. Chem.,
267, 3811, 1992). Other compounds of the present invention can be obtained according to the above-mentioned literature or easily produced by other conventional production methods.

【００１２】本発明においてアシルペプチド加水分解酵
素阻害剤、例えは一般式（１）で表される化合物または
その薬理学上許容される塩を有効成分としてアポトーシ
ス誘起剤、又は癌、炎症ないしは免疫疾患に対する治療
剤として用いるには、固形剤、軟膏、液剤等の剤形にし
て経口剤または非経口剤として投与される。非経口剤と
しては特に限定されない。例えば、座剤、経皮吸収剤、
及び静脈注射剤等があげられる。アシルペプチド加水分
解酵素阻害剤、例えば一般式（１）で表される化合物ま
たはその薬理学上許容される塩を含む製剤は一般的に
は、上記有効成分の効果を発揮する量を適当な医薬用の
担体その他の補助剤と組み合わせて常法により製剤化す
ることにより得ることができる。また、アシルペプチド
加水分解阻害剤、例えば一般式（１）で表わされる化合
物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として
含有するアポトーシス誘起剤、更には癌、炎症ないしは
免疫疾患に対する治療剤の臨床投与量は、年齢、体重、
患者の感受性、症状の程度により異なるが、通常効果的
な量は、成人一日１ｍｇから５ｇ程度であり一日一回ま
たは数回に分けて投与することも可能である。また、必
要に応じて上記の範囲外の量を用いることもできる。In the present invention, an acyl peptide hydrolase inhibitor, for example, a compound represented by the general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient, an apoptosis-inducing agent, or a cancer, inflammation or immune disease To be used as a therapeutic agent for oral administration, it is administered as an oral preparation or parenteral preparation in the form of a solid preparation, ointment, liquid preparation or the like. The parenteral preparation is not particularly limited. For example, suppositories, transdermal absorbents,
And intravenous injections. Preparations containing an acylpeptide hydrolase inhibitor, for example, a compound represented by the general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof, are generally prepared in an amount sufficient to exert the effect of the above-mentioned active ingredient. By combining the carrier with other carriers and other auxiliaries by a conventional method. Further, an apoptosis-inducing agent containing an acylpeptide hydrolysis inhibitor, for example, a compound represented by the general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient, and a therapeutic agent for cancer, inflammation or immune disease. The clinical dose of age, weight,
The effective amount is usually about 1 mg to 5 g per day for an adult, although it depends on the sensitivity of the patient and the degree of symptoms, and it can be administered once or several times a day. Further, if necessary, an amount outside the above range can be used.

【００１３】[0013]

【実施例】以下に本発明について実施例に基づいて説明
する。なお、本実施例中で使用している細胞名の略号は
下記の通りを示す。 Ｕ９３７；Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ Ｉｙｍｐｈｏｍａ ＨＬ６０；Ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ Ｉｅｕｋｅｍ
ｉａ Ｋ５６２；Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ
Ｉｅｕｋｅｍｉａ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；Ａｃｕｔｅ Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓ
ｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｍｏｌｔ−３；Ｔｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ＫＢ；Ｅｐｉｄｅｔｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＨＴ２９；Ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｔ４７Ｄ；Ｂｒｅａｓｔ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ ＰＣ１０：Ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａDESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below based on embodiments. The abbreviations of the cell names used in the examples are as follows. U937; Histolytic Iymphoma HL60; Promyelochemical Ieukem
ia K562; Chronic myelogenous
Ieukemia CCRF-CEM; Acute Iymphoblas
Cytic leukemia Molt-3; Tcell leukemia KB; Epidetoid carcinoma HT29; Colon adenocarcinoma T47D; Breast duct carcinoma
a PC10: Lung carcinoma

【００１４】参考例１ 癌細胞におけるアシルペブチ
ド加水分解酵素活性 アシルペプチド加水分解酵素はヒト白血病細胞Ｕ９３
７、ＨＬ６０、Ｋ５６２において、リンパ球、顆粒球、
赤血球等に比して、高い活性を示した。また、固形癌Ｋ
Ｂについても、同様にアシルペプチド加水分解酵素を調
べたが、正常細胞に比して高い活性を示した。 （方法）ヒト白血球由来アシルペプチド加水分解酵素活
性の測定は小林らの方法（Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ他、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２、１１４３５、１９
８７）に基づいて行った。すなわち、２ｘ１０₆個の各
種細胞をＰＢＳ中にてホモジナイズし、１０５０００ｘ
ｇ上清を酵素源として用いた。この酵素源２５μｌに
０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７．８）１００
μｌ、０．４ｍＭアセチルアラニン−、ｐ−ニトロアニ
リド２５μｌを加えて３７℃にて６０分間反応させた。
反応後１０％ＳＤＳ溶液１００μｌを加えて反応を停止
し、アシルペプチド加水分解酵素により遊離するｐ−ニ
トロアニリンを４０５ｎｍの吸光度で比色定量し、単位
時間当たりに遊離するｐ−ニトロアニリンの量（ｎｍｏ
ｌ／時／ｍｇ 蛋白）にして表１に示した。Reference Example 1 Acyl Peptide Hydrolase Activity in Cancer Cells Acyl peptide hydrolase was obtained from human leukemia cell U93.
7. In HL60, K562, lymphocytes, granulocytes,
The activity was higher than that of erythrocytes. In addition, solid cancer K
As for B, acyl peptide hydrolase was examined in the same manner, but showed higher activity than normal cells. (Method) Measurement of human leukocyte-derived acylpeptide hydrolase activity was carried out by the method of Kobayashi et al. (K. Kobayashi et al.,
J. Biol. Chem. , 262, 11435, 19
87). That is, 2 × 10 ₆ various cells were homogenized in PBS and 105,000 ×
g supernatant was used as enzyme source. 0.1 M Tris-HCI buffer (pH 7.8) 100 was added to 25 μl of this enzyme source.
25 µl of 0.4 µm acetylalanine- and p-nitroanilide were added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 60 minutes.
After the reaction, the reaction was stopped by adding 100 μl of a 10% SDS solution, p-nitroaniline released by the acylpeptide hydrolase was colorimetrically determined by absorbance at 405 nm, and the amount of p-nitroaniline released per unit time ( nmo
1 / hr / mg protein) and shown in Table 1.

【００１５】[0015]

【表１】 表１ 各種ヒト癌細胞および正常血球細胞のアシルペプチド加水分解酵素活性 の比較 細胞名 比活性 ｎｍｏｌ／時／ｍｇ 蛋白 Ｕ９３７ ２２３０ ＨＬ６０ １８５０ Ｋ５６２ ９９５ ＫＢ １２４５ 赤血球 ３５０ 多形核白血球 ７８６ リンパ球 ７４８Table 1 Comparison of acylpeptide hydrolase activities of various human cancer cells and normal blood cells. Cell name Specific activity nmol / hr / mg 748

【００１６】実施例１ アセチルロイシンクロロメチルケトンとロイシンクロロ
メチルケトンによる各種ヒト癌細胞及び正常細胞のアシ
ルペプチド加水分解酵素の阻害 アセチルロイシンクロロメチルケトンは、ブタとヒト
（白血球由来）のアシルペプチド加水分解酵素を阻害し
た。その５０％阻害濃度は７．４７μＭと５．３９μＭ
であった。また、ヒト白血病細胞由来アシルペプチド加
水分解酵素に対しても同様に阻害し、その５０％阻害濃
度は２．５μＭであった。ロイシンクロロメチルケトン
はアセチルロイシンクロロメチルケトンに比べて、高い
濃度で阻害効果が認められた。 （方法）ブタ、ヒト（白血球由来）アシルペプチド加水
分解酵素に対するアセチルロイシンクロロメチルケトン
とロイシンクロロメチルケトンの阻害効果は上述の方法
を改変して行った。すなわち、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ７．８）８５μｌを加え、各濃度に調製
した酵素阻害物質の溶液１５μｌを加えて反応させ、反
応停止後に４０５ｎｍの吸光度（ａ）を測定した。同時
に酵素液を含まない盲検の吸光度（ｂ）を測定し、阻害
率［（ｂ−ａ）／ｂ］ｘ１００により計算した。アセチ
ルロイシンクロロメチルケトンとロイシンクロロメチル
ケトンによるヒト白血病細胞Ｕ９３７由来アシルペプチ
ド加水分解酵素の阻害作用を図１に示した。Example 1 Inhibition of acylpeptide hydrolase in various human cancer cells and normal cells by acetylleucine chloromethylketone and leucine chloromethylketone Acetylleucine chloromethylketone is an acylpeptide hydrolyzate of pig and human (derived from leukocytes). Degradative enzymes were inhibited. Its 50% inhibitory concentrations are 7.47 μM and 5.39 μM.
Met. It also inhibited human leukemia cell-derived acyl peptide hydrolase in the same manner, and its 50% inhibitory concentration was 2.5 μM. Leucine chloromethyl ketone showed an inhibitory effect at a higher concentration than acetylleucine chloromethyl ketone. (Method) The inhibitory effects of acetylleucine chloromethyl ketone and leucine chloromethyl ketone on porcine and human (leukocyte-derived) acyl peptide hydrolases were carried out by modifying the above method. That is, 0.1M Tris-HC
85 μl of 1 buffer solution (pH 7.8) was added, and 15 μl of a solution of the enzyme inhibitor prepared at each concentration was added to react. After stopping the reaction, the absorbance (a) at 405 nm was measured. At the same time, the absorbance (b) of a blind test containing no enzyme solution was measured and calculated by the inhibition rate [(ba) / b] × 100. FIG. 1 shows the inhibitory effects of acetylleucine chloromethyl ketone and leucine chloromethyl ketone on the acylpeptide hydrolase derived from human leukemia cell U937.

【００１７】実施例２ アシルペプチド加水分解酵素の阻害剤による各種癌細胞
の増殖効果 アシルペプチド加水分解酵素の阻害剤として、アセチル
ロイシンクロロメチルケトンはＵ９３７、ＨＬ６０、Ｋ
５６２の白血病細胞の増殖を阻害した。各々の白血病細
胞に介するＩＣ５０は３．８μＭ、７．０μＭ、７．５
μＭであった。形態学的検討におきてもＨＬ−６０、Ｃ
ＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−３について、アセチルロイ
シンクロロメチルケトン５０μＭを１２時間作用させた
時点で調べ、細胞質に多数の顆粒の出現を認め、核が膨
化する変化が認められた。また、ＫＢ、ＨＴ２９、ＰＣ
１０、Ｔ４７Ｄなどの固形癌についても増殖を抑制し
た。そのＩＣ５０は１４μＭから約２０μＭであり、白
血病細胞に比して高い濃度で増殖を阻害した。Example 2 Proliferation Effect of Various Cancer Cells by Inhibitor of Acyl Peptide Hydrolase As inhibitors of acyl peptide hydrolase, acetylleucine chloromethyl ketone is U937, HL60, K
562 leukemia cell proliferation was inhibited. The IC50 for each leukemia cell is 3.8 μM, 7.0 μM, 7.5.
μM. HL-60, C in morphological examination
CRF-CEM and MOLT-3 were examined when 50 μM of acetylleucine chloromethyl ketone was allowed to act for 12 hours. As a result, a large number of granules appeared in the cytoplasm, and a change in swelling of the nucleus was observed. Also, KB, HT29, PC
10. Growth was also suppressed for solid cancers such as T47D. Its IC50 was from 14 μM to about 20 μM, and inhibited proliferation at a higher concentration than leukemia cells.

【００１８】（方法）各濃度に調製した化合物を９６穴
にプレートに加えた後、５ｘ１０₃個の細胞をまき１０
０μｌ／穴とした。３７℃、４６時間培養後、ＭＴＴ試
薬（６．２５ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）を２０μｌ／穴添加
し、さらに２−４時間培養した後に、溶解緩衝液１００
μｌ／穴を添加した。暗所に一晩放置後、５７０ｎｍの
吸光度（ａ）を測定した。化合物を含まない盲検の吸光
度（ｂ）ならびに細胞を含まないブランクの吸光度
（ｃ）を測定し、次式により各化合物の細胞増殖阻害効
果（％）を求めた。 細胞増殖阻害効果（％）＝［１−（ａ−ｃ））／（ｂ−
ｃ）］ｘ１００(Method) After the compound prepared at each concentration was added to the plate in 96 wells, 5 × 10 ₃ cells were seeded.
0 μl / well. After culturing at 37 ° C. for 46 hours, MTT reagent (6.25 mg / ml PBS) was added at 20 μl / well, and after culturing for 2-4 hours, lysis buffer 100
μl / well was added. After standing in a dark place overnight, the absorbance (a) at 570 nm was measured. The blank absorbance (b) containing no compound and the blank absorbance (c) containing no cells were measured, and the cell growth inhibitory effect (%) of each compound was determined by the following formula. Cell growth inhibitory effect (%) = [1- (ac)) / (b-
c)] x100

【００１９】[0019]

【表２】表２ ヒト癌細胞に対するアセチルロイシンク
ロロメチルケトンの増殖抑制効果 がん細胞 ＩＣ５０（μＭ） Ｕ９３７ ３．８ ＨＬ６０ ７．０ Ｋ５６２ ７．５ ＫＢ １４．０ ＨＴ２９ １８．０ ＰＣ１０ ２０．５ Ｔ４７Ｄ ２１．５Table 2 Inhibitory effect of acetylleucine chloromethyl ketone on human cancer cells Cancer cell IC50 (μM) U937 3.8 HL60 7.0 K562 7.5 KB 14.0 HT29 18.0 PC10 20.5 T47D 21.5

【００２０】実施例３ アセチルロイシンクロロメチルケトンによるＨＬ６０白
血病細胞のＤＮＡ断片化 ＨＬ６０白血病細胞にアシルペプチド加水分解酵素の阻
害剤、例えばアセチルロイシンクロロメチルケトンを
８、２０、５０μｇ／ｍｌの濃度で添加して、ＤＮＡ断
片化の形成を調べた。２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し
て、２４時間後に著明なＤＮＡ断片化が認められた。 （方法）方法は馬島らに従った（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡ
Ｌ ＡＮＤ ＢＩＯＰＨＩＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣ
Ｈ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ、２０９、９０７、
１９９５）。ＨＬ６０白血病細胞を１０％ＦＣＳ含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地に１ｘ１０₄／ｍｌに調製し、３
７℃で２時間培養した後にアシルペプチド加水分解酵素
の阻害剤、例えばアセチルロインシンクロロメチルケト
ンを添加し培養した。２４時間後と４８時間後に１ｘ１
０₆個の細胞を回収し、ＤＮＡラダー検出法により解析
を行った。アセチルロイシンクロロメチルケトンによる
ＨＬ６０白血病細胞のＤＮＡ断片化を図２に示した。EXAMPLE 3 DNA Fragmentation of HL60 Leukemia Cells by Acetylleucine Chloromethyl Ketone To HL60 leukemia cells, an inhibitor of acyl peptide hydrolase, for example, acetylleucine chloromethyl ketone was added at a concentration of 8, 20, or 50 μg / ml. Then, the formation of DNA fragmentation was examined. At a concentration of 20 μg / ml, significant DNA fragmentation was observed 24 hours later. (Method) The method followed Majima et al. (BIOCHEMICA)
L AND BIOPHISICAL RESEARCH
H COMMUNICATIONS, 209, 907,
1995). HL60 leukemia cells with R containing 10% FCS
Prepare 1 × 10 ₄ / ml in PMI-1640 medium,
After culturing at 7 ° C. for 2 hours, an inhibitor of acyl peptide hydrolase, for example, acetylloincin chloromethyl ketone was added, followed by culturing. 1x1 after 24 hours and 48 hours
0 ₆ cells were collected and analyzed by DNA ladder detection method. DNA fragmentation of HL60 leukemia cells by acetylleucine chloromethyl ketone is shown in FIG.

【００２１】[0021]

【発明の効果】本発明化合物、例えばアセチルロイシン
クロロメチルケトンはアシルペプチド加水分解酵素に対
する阻害効果を示し、また各種癌細胞の増殖を抑制し
た。この抑制作用は形態学的検討およびＤＮＡラダー形
成の検討においてもアポトーシスを惹起させることに基
づくことが確認された。The compound of the present invention, for example, acetylleucine chloromethyl ketone, has an inhibitory effect on acyl peptide hydrolase and inhibits the growth of various cancer cells. It was confirmed that this inhibitory action was based on inducing apoptosis in morphological examination and DNA ladder formation examination.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明化合物のアシルペプチド加水分解酵素活
性阻害効果FIG. 1 shows the inhibitory effect of the compounds of the present invention on acyl peptide hydrolase activity.

【図２】アセチルロイシンクロロメチルケトンによるＨ
Ｌ６０白血病細胞のＤＮＡ断片化FIG. 2: H by acetylleucine chloromethyl ketone
DNA fragmentation of L60 leukemia cells

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 武弘 神奈川県横浜市青葉区あざみ野３−２−11 −102 (72)発明者 安部 史紀 東京都北区志茂４−31−11−203 Ｆターム(参考） 4C084 AA17 ZB071 ZB111 ZB211 ZB261 ZC202 4C206 AA01 AA02 FA53 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 ZC20  ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuing from the front page (72) Inventor Takehiro Sano 3-2-11-102, Azamino, Aoba-ku, Yokohama-shi, Kanagawa Prefecture Reference) 4C084 AA17 ZB071 ZB111 ZB211 ZB261 ZC202 4C206 AA01 AA02 FA53 ZB07 ZB11 ZB21 ZB26 ZC20

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】アシルペプチド加水分解酵素阻害剤を有効
成分とするアポトーシス誘起剤。1. An apoptosis-inducing agent comprising an acylpeptide hydrolase inhibitor as an active ingredient. 【請求項２】アシルペプチド加水分解酵素阻害剤を有効
成分とする癌、炎症または免疫疾患に対する治療剤。2. A therapeutic agent for cancer, inflammation or immune disease comprising an acyl peptide hydrolase inhibitor as an active ingredient. 【請求項３】アシルペプチド加水分解酵素阻害剤が下記
一般式（１） 【化１】Ｒ１−Ｙ−Ｒ２ （１） 〔式中、Ｙはアミノ酸残基を示す。Ｒ１はアミノ酸残基
のアミノ基上の水素原子又は置換基であり、水素原子、
置換基を有してもよい低級アシル基または低級炭化水素
スルホニル基を示す。Ｒ２はアミノ酸残基のカルボニル
基上の置換基であり、ハロゲン置換されても良い低級ア
ルキル基を示す。〕で表わされる化合物又はその薬理学
上許容される塩である請求項１記載のアポトーシス誘起
剤。3. An acylpeptide hydrolase inhibitor represented by the following general formula (1): R1-YR2 (1) wherein Y represents an amino acid residue. R1 is a hydrogen atom or a substituent on the amino group of the amino acid residue;
It represents a lower acyl group or a lower hydrocarbon sulfonyl group which may have a substituent. R2 is a substituent on the carbonyl group of the amino acid residue, and represents a lower alkyl group which may be halogen-substituted. And a pharmacologically acceptable salt thereof. 【請求項４】Ｒ２がハロゲノ置換メチル基又はハロゲノ
置換エチル基である請求項３記載のアポトーシス誘起
剤。4. The apoptosis-inducing agent according to claim 3, wherein R2 is a halogeno-substituted methyl group or a halogeno-substituted ethyl group. 【請求項５】Ｙがロイシン、イソロイシン、アラニン、
フェニルアラニンまたはリジンの残基である請求項３又
は４記載のアポトーシス誘起剤。(5) Y is leucine, isoleucine, alanine,
The apoptosis-inducing agent according to claim 3 or 4, which is a residue of phenylalanine or lysine. 【請求項６】Ｒ１が水素原子、アセチル基、プロピオニ
ル基、イソプロピオニル基又はベンゾイル基である請求
項３〜５いずれかに記載のアポトーシス誘起剤。6. The apoptosis-inducing agent according to claim 3, wherein R1 is a hydrogen atom, an acetyl group, a propionyl group, an isopropionyl group or a benzoyl group. 【請求項７】Ｙがロイシン残基であり、Ｒ１が水素、ま
たはアセチル基、Ｒ２がクロロメチル基である請求項３
記載のアポトーシス誘起剤。7. The method according to claim 3, wherein Y is a leucine residue, R1 is hydrogen or an acetyl group, and R2 is a chloromethyl group.
An apoptosis-inducing agent as described above. 【請求項８】請求項３〜７、いずれかに記載の化合物又
はその薬理学上許容される塩を有効成分とする抗癌剤、
抗炎症剤または免疫疾患治療剤。8. An anticancer agent comprising the compound according to claim 3 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient,
Anti-inflammatory agent or therapeutic agent for immune diseases. 【請求項９】請求項３〜７、いずれかに記載の化合物又
はその薬理学上許容される塩を有効成分とする医薬。9. A medicament comprising the compound according to any one of claims 3 to 7 or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. 【請求項１０】請求項３記載の一般式（１）で表される
化合物（但し、Ｙがロイシン残基であり、Ｒ１がアセチ
ル基、Ｒ２がクロロメチル基の場合を除く）又はその薬
理学上許容される塩を有効成分とするアシルペプチド加
水分解酵素阻害剤。10. A compound represented by the general formula (1) according to claim 3, except that Y is a leucine residue, R1 is an acetyl group and R2 is a chloromethyl group, or its pharmacology. An acylpeptide hydrolase inhibitor comprising a salt acceptable as an active ingredient.