JP2000028613A - Immunological inspection method and immunological inspection kit thereof - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To detect an inspection object speedily with high sensitivity by bonding a marker substance to an immunochemical component, which can bond specifically via an intercalary substance with an antibody which does not bond with the inspection object, thereby forming a second marker body, and forming an immune complex on a stationary phase of a water- absorptive base. SOLUTION: The mixture of a liquid containing a sample to be inspected and a liquid containing a first marker body is dropped and developed from one end of a water-absorptive base. The mixture bonds with a first immunochemical component, immobilized to a stationary phase and is caught on the stationary phase. Then, a liquid containing an intervening substance for mediating a bond between a third and a fourth immunochemical components is dropped and developed to the water-absorptive base, whereby the intervening substance bonds with the third immunochemical component in the immune complex caught on the stationary phase. Furthermore, a liquid containing a second marker body is dropped and developed to the water-absorptive base, whereby the intervening substance in the immune complex caught on the stationary phase bonds with the fourth immunochemical component in the second marker body, thereby forming a complex. Marker substances constituting the first and second marker bodies are hence collected and bonded o the stationary phase, so that detected signal is amplified.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、簡便、迅速に且つ
高精度、高感度で被検試料中の検査対象物の検出を行い
得る免疫学的検査方法およびそのためのキットに関す
る。より詳細には、本発明は検出シグナルを増幅させる
工程を含む免疫クロマトグラフ法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an immunological test method and a kit therefor which can detect a test object in a test sample simply, quickly, with high precision and high sensitivity. More specifically, the present invention relates to immunochromatographic methods that include the step of amplifying a detection signal.

【０００２】[0002]

【従来の技術】生体試料等の免疫学的分析法において、
迅速且つ簡便にその検査を行う方法として免疫クロマト
グラフ法が挙げられる。この方法は、一般に以下のよう
な工程を含む。すなわち、検査対象物と特異的に結合し
得る抗体を固定化した固定相を有する吸水性基材からな
る検査片の一端より、該検査対象物に特異的に結合し得
る標識された抗体と被検液との混合物を吸収させて展開
すると、該混合物中で形成された標識抗体−検査対象物
複合体は固定化された抗体と結合して固定相上に捕捉さ
れる。したがって、該固定相に結合した標識抗体を測定
することにより被検液中の検査対象物を測定することが
できる。2. Description of the Related Art In immunological analysis of biological samples and the like,
An immunochromatographic method can be mentioned as a method for performing the test quickly and simply. This method generally includes the following steps. That is, from one end of a test piece composed of a water-absorbing substrate having a stationary phase on which an antibody capable of specifically binding to a test object is immobilized, a labeled antibody capable of specifically binding to the test object is coated with a coating. When the mixture with the test solution is absorbed and developed, the labeled antibody-test object complex formed in the mixture binds to the immobilized antibody and is captured on the stationary phase. Therefore, the test object in the test solution can be measured by measuring the labeled antibody bound to the stationary phase.

【０００３】また、上記免疫クロマトグラフ法の検出シ
グナルをより高感度で得るための方法として、特開平１
０−０６２４１９号において、二種の標識抗体を用いる
方法が開示されている。つまり、検査対象物と特異的に
結合し得る抗体を標識した第一標識抗体と、該抗体に特
異的に結合し得る二次抗体を標識した第二標識抗体と
を、検査片中の被検試料滴下部と固定相（該検査対象物
と特異的に結合し得る別の抗体が固定化されている）の
間に標識相としてそれぞれ設置した（吸収させた）構成
である。試料中の検査対象物は、第一標識抗体と複合体
を形成した後、さらに第二標識抗体が第一標識抗体に結
合して（被検物−第一標識抗体−第二標識抗体）の複合
体を形成する。該免疫複合体は固定相上に固定化された
抗体により捕捉される。したがって、固定相上で第二標
識抗体により増幅させたシグナルが検出される。Further, as a method for obtaining a detection signal of the above immunochromatography with higher sensitivity, Japanese Patent Application Laid-Open No.
In 0-062419, a method using two kinds of labeled antibodies is disclosed. That is, a first labeled antibody labeled with an antibody capable of specifically binding to the test object and a second labeled antibody labeled with a secondary antibody capable of specifically binding to the antibody are tested in the test strip. In this configuration, a label phase is provided (absorbed) between the sample dropping portion and a stationary phase (another antibody capable of specifically binding to the test object is immobilized). The test object in the sample forms a complex with the first labeled antibody, and then the second labeled antibody binds to the first labeled antibody (test substance-first labeled antibody-second labeled antibody). Form a complex. The immune complex is captured by the antibody immobilized on the stationary phase. Therefore, the signal amplified by the second labeled antibody on the stationary phase is detected.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
シグナル増幅免疫クロマトグラフ法によってもまだ十分
な検出感度が得られていないのが現状である。さらに、
被検試料が糞便、尿、血液等の場合、前処理として試料
を適当な緩衝液に懸濁する工程、および／または被検試
料中の夾雑物質を分離除去する部分精製工程等の付加的
な操作が必要となり、迅速性に欠けるといった問題点も
ある。したがって、本発明の目的は、免疫クロマトグラ
フ法に関し、より迅速に、且つ高感度で検査対象物を検
出することが可能な免疫学的検査方法およびそのための
キットを提供することである。However, at present, sufficient detection sensitivity has not yet been obtained by the above-described signal amplification immunochromatography. further,
When the test sample is stool, urine, blood, or the like, additional steps such as a step of suspending the sample in an appropriate buffer as a pretreatment and / or a partial purification step of separating and removing contaminants in the test sample are performed. Operation is required, and there is a problem that lack of speed is required. Accordingly, an object of the present invention is to provide an immunological test method and a kit therefor, which can detect a test object more quickly and with high sensitivity with respect to immunochromatography.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、検査対象物と特
異的に結合する第二の抗体とともに検査対象物とは結合
しない抗体を標識物質に結合して第一標識体とし、さら
にこの検査対象物とは結合しない抗体と介在物質を介し
て特異的に結合し得る免疫化学的成分（具体的には、例
えば、検査対象物とは結合しない抗体により認識される
抗原を介して結合する、該抗原を認識する抗体）に標識
物質を結合して第二標識体とし、これらを用いて免疫ク
ロマトグラフ法を行い、吸水性基材の固定相上におい
て、（固定化された抗体−検査対象物−第一標識体−介
在物質−第二標識体）の免疫複合体を形成させることに
より、固定相上での検出シグナルが従来よりも効率よく
増幅され、より高感度に検査対象物を検出できることを
見出した。また、被検試料を予め吸水性基材の一端と固
定相との間に滴下または塗布し、該吸水性基材の該一端
から第一および第二標識体並びに介在物質を滴下して展
開させる（以下、被検試料、第一および第二標識体並び
に介在物質を滴下する吸水性基材の一端を、吸液部と称
する場合もある）ことにより、被検試料を希釈する前処
理を省略できることを見出して、測定時間を短縮するこ
とに成功した。さらに、吸液部と固定相との間に、被検
試料中の検査対象物と他の物質とを分離するための分離
相を設けることにより、被検試料の部分精製などの前処
理を省略でき、より迅速で、高精度且つ高感度の測定を
行うことに成功して本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, they did not bind to the test object together with the second antibody that specifically binds to the test object. An antibody is bound to a labeling substance to form a first label, and an immunochemical component capable of specifically binding to an antibody that does not bind to the test substance via an intermediary substance (specifically, for example, An antibody that binds through an antigen that is recognized by an antibody that does not bind to the substance, and binds the labeling substance to the second labeled substance, and performs immunochromatography using these substances, By forming an immune complex of (immobilized antibody-test object-first label-intermediate-second label) on the stationary phase of the substrate, the detection signal on the stationary phase is increased. Amplified more efficiently than before, higher feeling It found to be able to detect an inspection target object. In addition, the test sample is previously dropped or applied between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase, and the first and second label bodies and the intervening substance are dropped and developed from the one end of the water-absorbing substrate. (Hereinafter, one end of the water-absorbing substrate onto which the test sample, the first and second labels, and the intervening substance are dropped may be referred to as a liquid-absorbing part), thereby omitting the pretreatment for diluting the test sample. We found what we could do and succeeded in reducing the measurement time. Furthermore, by providing a separation phase between the liquid absorption part and the stationary phase for separating the test object and other substances in the test sample, pretreatment such as partial purification of the test sample is omitted. The present invention was completed, and the measurement was completed more quickly, with high accuracy and high sensitivity, and the present invention was completed.

【０００６】すなわち、本発明は以下の通りである。 １．以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方
法： (1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材の一端から、検査対象物と特異的に結合し得
る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しな
い第三の免疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就
中、着色されたラテックス粒子または金コロイド粒子）
が結合してなる標識体（第一標識体）を含有する液と被
検試料を含有する液との混合物を展開し、該混合物中で
形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、
固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合さ
せて捕捉した後、(2) 第三および第四の免疫化学的成分
の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材
に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の
免疫化学的成分に結合させ、(3) さらに第三の免疫化学
的成分と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免
疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色さ
れたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合して
なる標識体（第二標識体）を含有する液を該吸水性基材
に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在
物質に結合させた後、(4) 該固定相上の標識物質のシグ
ナルを測定することにより該検査対象物を検出する。 ２．以下の工程を含むことを特徴とする免疫学的検査方
法： (1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材の一端と該固定相との間の任意の領域に被検
試料を供給し、(2) 該吸水性基材の該一端から検査対象
物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的成分および検
査対象物とは結合しない第三の免疫化学的成分に標識物
質（特に着色粒子、就中、着色されたラテックス粒子ま
たは金コロイド粒子）が結合してなる標識体（第一標識
体）を含有する液を展開し、該吸水性基材上で形成され
る検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、固定相に
固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉
した後、(3) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を
仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開
し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化
学的成分に結合させ、(4) さらに第三の免疫化学的成分
と介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学
的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラ
テックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標
識体（第二標識体）を含有する液を該吸水性基材に展開
し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質に
結合させた後、(5) 該固定相上の標識物質のシグナルを
測定することにより該検査対象物を検出する。 ３．該吸水性基材が、その一端と固定相との間の任意の
領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端と固定相と
の間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めて
それより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中
の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたもので
あることを特徴とする上記１または２の方法。 ４．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の
免疫化学的成分と特異的に結合する物質である上記１〜
３のいずれかの方法。 ５．検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得る第二の免
疫化学的成分および検査対象物とは結合しない第三の免
疫化学的成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色さ
れたラテックス粒子または金コロイド粒子）が結合して
なる標識体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と
介在物質を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的
成分に標識物質（特に着色粒子、就中、着色されたラテ
ックス粒子または金コロイド粒子）が結合してなる標識
体（第二標識体）、並びに第三および第四の免疫化学的
成分の結合を仲介する介在物質を含み、以下の（ａ）お
よび（ｂ）の免疫学的検査方法に使用され得る免疫学的
検査キット： 方法（ａ） (1) 該吸水性基材の一端から、被検試料を含有する液と
第一標識体を含有する液との混合物を展開し、該混合物
中で形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体
を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結
合させて捕捉した後、(2) 第三および第四の免疫化学的
成分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性
基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第
三の免疫化学的成分に結合させ、(3) さらに第二標識体
を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉
された免疫複合体中の該介在物質に結合させた後、(4)
該固定相上の標識物質のシグナルを測定することにより
該検査対象物を検出する。 方法（ｂ） (1) 該吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に
被検試料を供給し、(2) 該吸水性基材の該一端から第一
標識体を含有する液を展開し、該吸水性基材上で形成さ
れる検査対象物と第一標識体との免疫複合体を、固定相
に固定化された該第一の免疫化学的成分に結合させて捕
捉した後、(3) 該介在物質を含有する液を該吸水性基材
に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の
免疫化学的成分に結合させ、(4) さらに第二標識体を含
有する液を該吸水性基材に展開し、固定相上に捕捉され
た免疫複合体中の該介在物質に結合させた後、(5) 該固
定相上の標識物質のシグナルを測定することにより該検
査対象物を検出する。 ６．該吸水性基材が、その一端と固定相との間の任意の
領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端と固定相と
の間の任意の領域に供給する場合は、その領域を含めて
それより固定相側の領域）に、検査対象物と被検試料中
の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設けたもので
あることを特徴とする上記５のキット。 ７．該介在物質が抗原抗体反応により第三および第四の
免疫化学的成分と特異的に結合する物質である上記５ま
たは６のキット。That is, the present invention is as follows. 1. An immunological test method characterized by comprising the following steps: (1) A stationary phase in which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized on an arbitrary region on a surface. From one end of the provided water-absorbent substrate, a labeling substance (particularly a colored particle, especially a colored particle, a second immunochemical component capable of specifically binding to the test object and a third immunochemical component not binding to the test object) Especially, colored latex particles or colloidal gold particles)
Develops a mixture of a solution containing a label (first label) formed by binding to a sample and a solution containing a test sample, and immunizes the test object formed in the mixture with the first label. The complex
After binding and capturing the first immunochemical component immobilized on the stationary phase, (2) a solution containing an intermediary substance that mediates the binding of the third and fourth immunochemical components is absorbed into the water-absorbing liquid. (3) further bound to the third immunochemical component in the immunocomplex captured on the stationary phase, and further specifically via the third immunochemical component and an intermediary substance. A liquid containing a label (second label) obtained by binding a labeling substance (particularly colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) to a fourth immunochemical component capable of binding is prepared. After being spread on a water-absorbent substrate and binding to the mediator in the immune complex captured on the stationary phase, (4) measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase, the test object Is detected. 2. An immunological test method characterized by comprising the following steps: (1) A stationary phase in which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized on an arbitrary region on a surface. A test sample is supplied to an arbitrary region between one end of the provided water-absorbent substrate and the stationary phase, and (2) a test sample that can specifically bind to the test object from the one end of the water-absorbent substrate. Labeled substance (particularly colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) bound to the second immunochemical component and the third immunochemical component that does not bind to the test object ( The liquid containing the first label is developed, and the immune complex of the test object and the first label formed on the water-absorbent substrate is immobilized on the stationary phase to form the first immune system. After binding to and trapping of chemical components, (3) contains intermediaries that mediate the binding of the third and fourth immunochemical components. Spreading the liquid having on the water-absorbent substrate, binding to the third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase, (4) further the third immunochemical component and the intermediary substance Labeling substance (particularly colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) bound to a fourth immunochemical component capable of specifically binding via (5) measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase after developing the contained solution on the water-absorbing substrate and binding it to the intervening substance in the immune complex captured on the stationary phase. To detect the inspection object. 3. When the water-absorbing substrate is supplied to any region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase (however, when the test sample is supplied to any region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase, And (2) a separation phase capable of separating the test object and other substances in the test sample, in the region including the region and on the stationary phase side thereof. Method. 4. The above-mentioned 1 to 4, wherein the intervening substance is a substance that specifically binds to the third and fourth immunochemical components by an antigen-antibody reaction.
Any of the three methods. 5. A water-absorbing substrate provided with a stationary phase on which an immobilized first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is provided on an arbitrary region on the surface, and a second phase capable of specifically binding to the test object. A labeled substance (particularly colored particles, especially colored latex particles or colloidal gold particles) bound to a third immunochemical component that does not bind to the immunochemical component of A labeled substance (especially colored particles, especially colored latex particles or gold) to a fourth immunochemical component capable of specifically binding to the third immunochemical component via an intervening substance. (A) and (b) comprising a label (a second label) formed by binding a colloid particle) and an intermediate substance that mediates the binding of the third and fourth immunochemical components. Immunoassay kit that can be used for the dynamic test method: Method (a (1) A mixture of a liquid containing the test sample and a liquid containing the first label is developed from one end of the water-absorbent substrate, and the test object formed in the mixture and the first label After capturing and binding the immune complex with the body to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase, (2) mediating the binding of the third and fourth immunochemical components A solution containing the substance is spread on the water-absorbing substrate, and bound to the third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase, and (3) a solution further containing the second label. Is spread on the water-absorbing substrate, and allowed to bind to the mediator in the immune complex captured on the stationary phase, (4)
The test object is detected by measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase. Method (b) (1) A test sample is supplied to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase, and (2) a first labeled substance is contained from the one end of the water-absorbing substrate. Developing the liquid to be bound, and binding the immune complex of the test object and the first label formed on the water-absorbent substrate to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capture, (3) the solution containing the mediator is spread on the water-absorbent substrate, and allowed to bind to the third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase, (4) Further, a liquid containing the second label is spread on the water-absorbing substrate, and after binding to the intervening substance in the immune complex captured on the stationary phase, (5) a labeling substance on the stationary phase The test object is detected by measuring the signal of (1). 6. When the water-absorbing substrate is supplied to any region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase (however, when the test sample is supplied to any region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase, The kit according to the above item 5, further comprising a separation phase capable of separating the test object and other substances in the test sample, in a region including the region and on the stationary phase side thereof). 7. 7. The kit according to the above item 5 or 6, wherein the intervening substance is a substance that specifically binds to the third and fourth immunochemical components by an antigen-antibody reaction.

【０００７】[0007]

【発明の実施の形態】本発明の方法により検出され得る
検査対象物は、免疫化学的反応（すなわち抗原抗体反
応）により第一の免疫化学的成分および第二の免疫化学
的成分と結合してサンドイッチ免疫複合体を形成し得る
ものであれば特に制限されない。例えば、細菌（特に大
腸菌Ｏ−１５７、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の病
原性細菌）、放線菌、酵母、かび、ウイルス（特に、Ｈ
ＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等）などの微生物もしくは表面抗
原等の該微生物の構成蛋白質、またはそれらに対する抗
体、あるいは腫瘍マーカー抗原などの生体試料中の抗原
性ペプチド等が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A test object that can be detected by the method of the present invention binds to a first immunochemical component and a second immunochemical component by an immunochemical reaction (ie, an antigen-antibody reaction). There is no particular limitation as long as it can form a sandwich immune complex. For example, bacteria (particularly pathogenic bacteria such as Escherichia coli O-157 and methicillin-resistant Staphylococcus aureus), actinomycetes, yeasts, molds, and viruses (particularly, H
(IV, HBV, HCV, etc.) or a constituent protein of the microorganism such as a surface antigen, or an antibody thereto, or an antigenic peptide in a biological sample such as a tumor marker antigen.

【０００８】本発明の方法において、固定相に固定化さ
れる第一の免疫化学的成分と、第一標識体として用いる
第二の免疫化学的成分は、いずれも抗原抗体反応により
検査対象物と特異的に結合し得る物質であれば特に制限
はない。検査対象物が抗原（例えば、蛋白質、ペプチ
ド、ハプテンなど）であれば、第一および第二の免疫化
学的成分は、該抗原と特異的に結合し得る抗体である。
該抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル
抗体であってもよい。また本発明における抗体とは、検
査対象物との特異的親和性を保持する抗体の断片物、例
えばＨ鎖、Ｌ鎖、Ｆab、Ｆ(ab')₂、Ｖ_H 、Ｖ_L 等も含む
ものとする。一方、検査対象物が抗体である場合には、
第一および第二の免疫化学的成分は、該抗体と特異的に
結合し得る抗原もしくは該抗体を抗原として特異的に結
合し得る二次抗体である。第一の免疫化学的成分および
第二の免疫化学的成分は、検査対象物に応じてサンドイ
ッチ法などで用いられる自体公知のものを適宜選択すれ
ばよい。また、該免疫化学的成分が抗体であれば、単離
された検査対象物を感作抗原として、公知の抗体作製技
術を用いて調製することもできる。第一および第二の免
疫化学的成分がいずれも抗体の場合、第一の抗体および
第二の抗体は、同一のものであっても異なるものであっ
てもよい。また、異なる抗体としては、同一の抗原決定
基を認識する二種の抗体を用いることも、あるいは異な
る抗原決定基を認識する二種の抗体を用いることもでき
る。[0008] In the method of the present invention, both the first immunochemical component immobilized on the stationary phase and the second immunochemical component used as the first label are different from the test object by an antigen-antibody reaction. There is no particular limitation as long as it is a substance that can specifically bind. If the test object is an antigen (eg, a protein, peptide, hapten, etc.), the first and second immunochemical components are antibodies capable of specifically binding to the antigen.
The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Further, the antibody in the present invention includes fragments of an antibody having specific affinity for a test object, for example, H chain, L chain, Fab, F (ab ') ₂ , V _H , V _{L and the} like. . On the other hand, when the test object is an antibody,
The first and second immunochemical components are an antigen capable of specifically binding to the antibody or a secondary antibody capable of specifically binding using the antibody as an antigen. The first immunochemical component and the second immunochemical component may be appropriately selected from those known per se used in the sandwich method or the like according to the test object. In addition, when the immunochemical component is an antibody, the immunochemical component can be prepared using the isolated test object as a sensitizing antigen using a known antibody production technique. When the first and second immunochemical components are both antibodies, the first antibody and the second antibody may be the same or different. As the different antibodies, two kinds of antibodies recognizing the same antigenic determinant can be used, or two kinds of antibodies recognizing different antigenic determinants can be used.

【０００９】本発明において、第一標識体として用いる
第三の免疫化学的成分、および第二標識体として用いる
第四の免疫化学的成分は、介在物質を介して特異的に結
合し合える抗体（モノクローナル抗体であってもポリク
ローナル抗体であってもよい。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆa
b、Ｆ(ab')₂、Ｖ_H 、Ｖ_L 等の断片化された抗体であっ
てもよい）または抗原（例えば、蛋白質、ペプチド、ハ
プテンなど）であり、且つ検査対象物および固定化され
た第一の免疫化学的成分とは特異的親和性を有しないも
のである。好ましくは、これらの免疫化学的成分は、さ
らに第二の免疫化学的成分とも特異的親和性を有しない
ものである。In the present invention, the third immunochemical component used as the first label and the fourth immunochemical component used as the second label are composed of an antibody capable of binding specifically via an intermediary substance ( The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
b, may be a fragmented antibody such as F (ab ') ₂ , _VH , _VL, etc.) or an antigen (eg, protein, peptide, hapten, etc.), and may be a test object and immobilized The first immunochemical component has no specific affinity. Preferably, these immunochemical components also have no specific affinity for the second immunochemical component.

【００１０】第三および第四の免疫化学的成分の結合を
仲介する本発明の介在物質は、第三および第四の免疫化
学的成分に同時に結合して（第三の免疫化学的成分−介
在物質−第四の免疫化学的成分）の複合体を形成し得る
物質であれば特に限定されないが、好ましくは、抗原抗
体反応により第三および第四の免疫化学的成分と特異的
に結合し得る免疫化学的成分である。すなわち、第三の
免疫化学的成分が抗体であれば、介在物質は該抗体によ
り認識される抗原もしくは該抗体と特異的に結合し得る
二次抗体であり、第四の免疫化学的成分は該抗原と特異
的に結合し得る抗体もしくは該二次抗体により認識され
る抗原であることが好ましい。このとき、第三および第
四の免疫化学的成分がともに抗体であれば、それらは同
一の抗体であっても異なるものであってもよい。一方、
第三の免疫化学的成分が抗原であれば、介在物質は該抗
原と特異的に結合し得る抗体であり、第四の免疫化学的
成分は該抗体により認識される抗原もしくは該抗体と特
異的に結合し得る二次抗体である。第三および第四の免
疫化学的成分がともに抗原であれば、それらは同一の抗
原であっても、介在物質である抗体と交叉反応性のある
異なる抗原であってもよい。第三および第四の免疫化学
的成分、並びに介在物質は、サンドイッチ法等で用いら
れている公知のものを適宜選択して使用することができ
る。[0010] The mediator of the present invention which mediates the binding of the third and fourth immunochemical components can bind simultaneously to the third and fourth immunochemical components (third immunochemical component-mediated). The substance is not particularly limited as long as it can form a complex of the substance and the fourth immunochemical component), but preferably can specifically bind to the third and fourth immunochemical components by an antigen-antibody reaction. It is an immunochemical component. That is, if the third immunochemical component is an antibody, the mediator is an antigen recognized by the antibody or a secondary antibody capable of specifically binding to the antibody, and the fourth immunochemical component is the An antibody capable of specifically binding to an antigen or an antigen recognized by the secondary antibody is preferable. At this time, if both the third and fourth immunochemical components are antibodies, they may be the same antibody or different antibodies. on the other hand,
If the third immunochemical component is an antigen, the mediator is an antibody that can specifically bind to the antigen, and the fourth immunochemical component is an antigen recognized by the antibody or specific for the antibody. Is a secondary antibody that can bind to If the third and fourth immunochemical components are both antigens, they may be the same antigen or different antigens cross-reactive with the intervening antibody. As the third and fourth immunochemical components and intervening substances, known substances used in the sandwich method or the like can be appropriately selected and used.

【００１１】本発明において用いられる吸水性基材は、
検査対象物を含有する被検試料、例えば、食品から抽出
した溶液やその培養上清、血清や血液、尿、便、唾液
等、あるいはそれらを適当な希釈溶媒によって希釈して
なる希釈液、第一標識体、第二標識体および介在物質を
それぞれ含有する液を吸収できるものであれば特に限定
されない。本発明においては、被検試料中の検査対象物
が第一標識体や固定相に固定化された第一の免疫化学的
成分と十分な反応を行うための、並びに第一標識体が介
在物質を介して第二標識体と十分な反応を行うための時
間を確保できるような吸水性基材が好ましく用いられ
る。The water-absorbing substrate used in the present invention comprises:
A test sample containing a test object, for example, a solution extracted from food or its culture supernatant, serum or blood, urine, stool, saliva, or the like, or a diluent obtained by diluting them with an appropriate diluting solvent, There is no particular limitation as long as it can absorb the liquid containing the one label, the second label, and the intervening substance. In the present invention, in order for the test object in the test sample to sufficiently react with the first immunochemical component immobilized on the first label or the stationary phase, and the first label is an intermediate substance A water-absorbing substrate that can secure a time for performing a sufficient reaction with the second label via the above is preferably used.

【００１２】吸水性基材が吸水性に劣る場合には、後述
するように被検試料が固定相に到達するのに長時間を要
し、その結果、迅速な測定を行うことができない。一
方、吸水性基材の吸水性があまりに高すぎる場合には、
被検試料中の検査対象物が標識体や固定相の第一免疫化
学的成分と十分な反応を行うために必要な時間が不足す
るので、正確な測定を行うことが困難である。When the water-absorbing substrate is poor in water absorption, it takes a long time for the test sample to reach the stationary phase as described later, and as a result, rapid measurement cannot be performed. On the other hand, if the water absorption of the water-absorbing substrate is too high,
Since the time required for the test object in the test sample to sufficiently react with the label or the first immunochemical component of the stationary phase is insufficient, it is difficult to perform an accurate measurement.

【００１３】したがって、本発明における吸水性基材の
好ましい吸水性の程度は、５ｍｍ幅の短冊状に裁断した
吸水性基材の片端部を水に浸漬し、１分間経過後の吸水
距離が０．５〜５ｃｍ程度である。Therefore, the preferable degree of water absorption of the water-absorbing substrate in the present invention is such that one end of the water-absorbing substrate cut into a strip having a width of 5 mm is immersed in water, and the water-absorbing distance after one minute has passed is 0. It is about 0.5 to 5 cm.

【００１４】本発明の吸水性基材の好ましい具体例とし
ては、不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガラスフィルタ
ー、ニトロセルロースフィルター、多孔質材料などが挙
げられる。これらの基材は適度な吸水速度を有するとと
もに、標識物質が着色粒子の場合、着色粒子が結合して
発色した際の目視確認性に優れるなどの利点を有するも
のである。Preferred examples of the water-absorbing substrate of the present invention include nonwoven fabric, filter paper, glass fiber cloth, glass filter, nitrocellulose filter, and porous material. These substrates have an appropriate water absorption rate and, when the labeling substance is a colored particle, have advantages such as excellent visual confirmation when the colored particle is bonded to form a color.

【００１５】また、これらの基材の吸水性を調整するた
めに、基材の表面に親水性重合体や界面活性剤を被覆
し、あるいは含浸させることもできる。さらに、本発明
においては吸水性基材として同一材料からなる基材を用
いてもよいし、あるいは異種の材料からなるものを任意
の接着手段によって接合して得られる連続した基材を用
いることもできる。In order to adjust the water absorption of these substrates, the surface of the substrate can be coated with or impregnated with a hydrophilic polymer or a surfactant. Further, in the present invention, a substrate made of the same material may be used as the water-absorbing substrate, or a continuous substrate obtained by joining materials made of different materials by any bonding means may be used. it can.

【００１６】本発明において、吸水性基材の形状は、被
検試料を展開できる形状であれば特に限定されるもので
はなく、例えば、矩形のシート状（片状）やロッド状な
どが好ましい。In the present invention, the shape of the water-absorbing substrate is not particularly limited as long as the sample to be tested can be developed. For example, a rectangular sheet-like (piece-like) or rod-like shape is preferable.

【００１７】本発明において、固定相とは、検査対象物
と特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分が吸水性基
材上に固定化された領域を意味する。第一の免疫化学的
成分を吸水性基材上に固定化する方法（固定化相の作製
方法）も特に限定されるものではないが、従来から知ら
れている物理吸着法や共有結合法によるのが好適であ
り、特に、該免疫化学的成分が基材から脱離しにくいと
いう点で共有結合法によるのが好ましい。吸水性基材が
上記共有結合法のための官能基を有しないときは、例え
ば適当な官能基を有する重合体を用いて基材を作製し、
吸水性基材の吸水性を阻害しない程度に付着させること
ができる。また、第一の免疫化学的成分および親水性重
合体を含む溶液を吸水性基材に塗布した後、上記親水性
重合体を凝固させる凝固溶剤に浸漬することで固定相を
作製することもできる。上記親水性重合体としては、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコ
ール、ヒドロキシエチルセルロースなどが用いられる。
また、上記凝固溶剤としては、アセトン、エタノール、
メタノール、エーテルなどを用いることができる。In the present invention, the stationary phase means a region where a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized on a water-absorbent substrate. The method for immobilizing the first immunochemical component on the water-absorbing substrate (the method for producing the immobilized phase) is not particularly limited, either, but it is possible to use a conventionally known physical adsorption method or covalent bonding method. It is particularly preferable to use the covalent bonding method in that the immunochemical component is not easily detached from the substrate. When the water-absorbing substrate does not have a functional group for the covalent bonding method, for example, to prepare a substrate using a polymer having an appropriate functional group,
It can be attached to such an extent that the water absorption of the water-absorbing substrate is not hindered. Alternatively, after applying the solution containing the first immunochemical component and the hydrophilic polymer to the water-absorbent substrate, the stationary phase can be prepared by immersing the solution in a coagulation solvent that coagulates the hydrophilic polymer. . Examples of the hydrophilic polymer include hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, and hydroxyethylcellulose.
As the coagulating solvent, acetone, ethanol,
Methanol, ether and the like can be used.

【００１８】本発明において、上記固定相と、吸水性基
材の一端の、被検試料含有液、第一標識体含有液、第二
標識体含有液、介在物質含有液等の吸収が開始される部
位（すなわち吸液部）との間の距離は特に限定されない
が好ましくは１〜６ｃｍ、より好ましくは３〜４ｃｍ程
度である。距離があまりに遠すぎると、固定相まで被検
試料が到達しなかったり、検出シグナル感度が強すぎた
り、あるいは測定に時間がかかる等の問題を生じるおそ
れがある。一方、距離が近すぎると固定相上に捕捉され
る標識物質が均一ではなくまばらになったり、検出シグ
ナル感度が低すぎるという問題を生じるおそれがある。In the present invention, absorption of the liquid containing the test sample, the liquid containing the first label, the liquid containing the second label, the liquid containing the intermediary substance, etc. at one end of the stationary phase and the water-absorbing substrate is started. There is no particular limitation on the distance between the parts (i.e., the liquid absorbing part), but it is preferably about 1 to 6 cm, and more preferably about 3 to 4 cm. If the distance is too long, there is a possibility that the test sample does not reach the stationary phase, the detection signal sensitivity is too strong, or the measurement takes a long time. On the other hand, if the distance is too short, there is a possibility that the labeling substance captured on the stationary phase is not uniform but sparse, or the sensitivity of the detection signal is too low.

【００１９】吸液部としては、被検試料、標識体、並び
に介在物質をそれぞれ含有する液の吸水性基材への移動
を妨げるものでなければ特に限定されず、基材と兼用し
たものであっても、新たに不織布や織布等を該吸水性基
材に接着させたものであってもよい。本発明において、
検査対象物に特異的に結合し得る第一の免疫化学的成分
が固定化された固定相、並びに吸液部を有する吸水性基
材を、以下、本発明の免疫学的検査片または単に検査片
という場合もある。The liquid absorbing portion is not particularly limited as long as it does not prevent the liquid containing the test sample, the label, and the intervening substance from moving to the water-absorbing substrate, and is also used as the substrate. Alternatively, a nonwoven fabric, a woven fabric, or the like may be newly bonded to the water-absorbing substrate. In the present invention,
A stationary phase on which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized, and a water-absorbing substrate having a liquid-absorbing portion are hereinafter referred to as an immunological test strip of the present invention or simply a test. Sometimes it is a piece.

【００２０】本発明の方法における第一標識体は、検査
対象物に特異的に結合し得る免疫化学的成分（第二の免
疫化学的成分）および検査対象物とは結合しない第三の
免疫化学的成分に標識物質を結合させたものであり、ま
た、第二標識体は、該第三の免疫化学的成分と介在物質
を介して特異的に結合し得る免疫化学的成分（第四の免
疫化学的成分）に標識物質を結合させたものである。こ
こで用いられる標識物質は、免疫化学的測定法において
常套的に使用されるいかなる標識物質であってもよく、
例えば着色粒子、酵素（アルカリホスファターゼ、ペル
オキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン
等）などが挙げられるが、効率のよい検出シグナルの増
幅を達成するためには、第一および第二標識体に使用さ
れる標識物質は同一のものであることが好ましい。本発
明の方法では、迅速な検出を行う意味で、標識物質とし
て着色粒子が好ましく使用される。着色粒子は肉眼で検
出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、金、
銀、銅などの金属からなるコロイド粒子、スダンブルー
やスダンレッドIV、スダンIII 、オイルオレンジ、キニ
ザリングリーン等に代表される顔料や染料などでラテッ
クスを着色してなる着色ラテックスなどを用いることが
できる。目視確認性の点からは、金コロイドや青、赤、
緑もしくはオレンジ色に着色した着色ラテックスの使用
が好ましく、また、分散安定性や検査対象物の検出感度
の調節が容易であるなどの点を考慮すると、青色、赤色
等に着色された水分散型高分子重合体粒子からなる着色
ラテックスを使用することがさらに望ましい。In the method of the present invention, the first label is an immunochemical component (second immunochemical component) capable of specifically binding to the test object and a third immunochemical component not binding to the test object. And a labeling substance bound to the target component, and the second label is an immunochemical component (fourth immunochemical component) capable of specifically binding to the third immunochemical component via an intervening substance. (Chemical component) and a labeling substance. The labeling substance used here may be any labeling substance conventionally used in an immunochemical assay,
Examples thereof include colored particles, enzymes (eg, alkaline phosphatase, peroxidase, etc.), and fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine, etc.). In order to achieve efficient amplification of the detection signal, the first and second labels are used. The labeling substances to be performed are preferably the same. In the method of the present invention, colored particles are preferably used as the labeling substance in order to perform rapid detection. The colored particles are not particularly limited as long as they can be detected with the naked eye, for example, gold,
Colloidal particles made of a metal such as silver or copper, colored latex obtained by coloring latex with a pigment or dye represented by Sudan Blue, Sudan Red IV, Sudan III, oil orange, quinizarin green, or the like can be used. From the viewpoint of visual confirmation, gold colloid, blue, red,
It is preferable to use a colored latex colored in green or orange, and in consideration of the dispersion stability and easy adjustment of the detection sensitivity of the test object, an aqueous dispersion colored in blue, red, etc. It is further desirable to use a colored latex composed of high molecular weight polymer particles.

【００２１】着色粒子の粒径は、検出の際の発色がよく
且つ吸水性基材の吸水性を低下させない程度の該基材中
での移動性を有するものであれば特に制限はないが、保
存安定性や調製が容易であるなどの点から、好ましくは
０．０１〜５μｍ、より好ましくは０．０５〜３μｍの
範囲が例示される。粒径があまりに小さすぎると、１粒
子あたりの着色の程度が少ないので、固定相に結合して
も発色の程度が悪く目視確認性に劣るようになる。ま
た、粒径が大きすぎると、着色粒子わずかに凝集しただ
けで吸水性基材に目詰まりを起こして吸水性を低下させ
たり、非特異的発色を生じたりすることがある。The particle size of the colored particles is not particularly limited as long as the coloration at the time of detection is good and the water-absorbing substrate has mobility in the substrate to such an extent that the water absorption of the substrate is not reduced. From the viewpoints of storage stability and ease of preparation, the range is preferably 0.01 to 5 μm, more preferably 0.05 to 3 μm. If the particle size is too small, the degree of coloring per particle is small, so that even if bound to the stationary phase, the degree of color development is poor and visual confirmation is poor. On the other hand, if the particle size is too large, the water-absorbent substrate may be clogged by a slight aggregation of the colored particles, resulting in a decrease in water absorption or non-specific coloring.

【００２２】第二および第三の免疫化学的成分の両方、
並びに第四の免疫化学的成分を、このような着色粒子で
標識する方法としては、従来公知の方法、例えば共有結
合法、物理的吸着法、イオン結合法等を使用することが
できるが、免疫化学的成分からの着色粒子の脱離がなく
安定であるという点から共有結合法がより好ましく用い
られる。Both the second and third immunochemical components,
As a method for labeling the fourth immunochemical component with such colored particles, conventionally known methods such as a covalent bonding method, a physical adsorption method, and an ion bonding method can be used. The covalent bonding method is more preferably used from the viewpoint that the colored particles are not desorbed from the chemical components and are stable.

【００２３】本発明の方法において、被検試料中の複数
の検査対象物を検出するために、対応する複数の免疫化
学的成分をそれぞれ別の着色粒子で標識することができ
るが、この際に用いられる着色粒子は同一色であっても
異なる色であってもよい。同一色の着色粒子を用いる場
合、各検査対象物にそれぞれ特異的に結合し得る免疫化
学的成分を固定化した固定相を識別可能な程度に離して
設置することが望ましい。In the method of the present invention, in order to detect a plurality of test objects in a test sample, a plurality of corresponding immunochemical components can be labeled with different colored particles. The colored particles used may be the same color or different colors. In the case of using colored particles of the same color, it is desirable to dispose a stationary phase on which an immunochemical component capable of specifically binding to each test object is immobilized, so as to be identifiable.

【００２４】標識物質が酵素や蛍光物質の場合には、固
定相の標識物質の検出は、ＥＩＡや蛍光抗体法（ＦＩ
Ａ）で従来使用されている検出手段が適宜選択される。When the labeling substance is an enzyme or a fluorescent substance, the detection of the labeling substance on the stationary phase is performed by EIA or fluorescent antibody method (FIA).
The detection means conventionally used in A) is appropriately selected.

【００２５】第一標識体含有液、第二標識体含有液およ
び介在物質含有液は、標識体または介在物質を適当な分
散媒（溶媒）中に分散（溶解）させることにより調製さ
れる。標識体または介在物質を分散させる分散媒は、検
査対象物と第一標識体、第一標識体と介在物質および介
在物質と第二標識体の特異的結合反応を阻害しないもの
であれば特に制限はないが、好ましくは該抗原抗体反応
に適したｐＨおよび塩濃度の有する緩衝液、例えばリン
酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液等を適宜選択して使用することができる。シグナル検
出時の各標識体濃度は０．００５〜５％、好ましくは
０．０１〜０．５％の範囲である。濃度があまりに低す
ぎると、固定相に結合する粒子数が少なく検出感度が悪
くなる。また、濃度が高すぎると、不経済なばかりでな
く過剰の標識物質が固定相以外に残留し、固定相のシグ
ナルを不明瞭にする等の問題を生じる。The liquid containing the first label, the liquid containing the second label, and the liquid containing the intermediate substance are prepared by dispersing (dissolving) the label or the intermediate substance in an appropriate dispersion medium (solvent). The dispersion medium for dispersing the label or mediator is not particularly limited as long as it does not inhibit the specific binding reaction between the test object and the first label, the first label with the mediator, and the mediator with the second label. However, preferably, a buffer having a pH and a salt concentration suitable for the antigen-antibody reaction, for example, a phosphate buffer, an acetate buffer, a borate buffer, a Tris-HCl buffer, or the like is appropriately selected and used. Can be. The concentration of each label at the time of signal detection is in the range of 0.005 to 5%, preferably 0.01 to 0.5%. If the concentration is too low, the number of particles bound to the stationary phase will be small and the detection sensitivity will be poor. On the other hand, if the concentration is too high, not only is it uneconomical, but also an excess of the labeling substance remains in the non-stationary phase, causing problems such as obscuring the signal of the stationary phase.

【００２６】本発明の方法の好ましい一態様では、各工
程において以下の反応が行われる。すなわち、吸水性基
材の一端（すなわち吸液部）から、被検試料を含有する
液と第一標識体を含有する液との混合物（該混合物中で
検査対象物と第一標識体中の第二の免疫化学的成分とが
複合体を形成する）を滴下して展開すると、該免疫複合
体は液の移動とともに吸水性基材上を移動し、固定相に
固定化された第一の免疫化学的成分と結合して固定相上
に捕捉される。次いで、第三および第四の免疫化学的成
分の結合を仲介する介在物質を含有する液を該吸水性基
材に滴下して展開することにより、該介在物質は固定相
上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に
結合する。さらに、第二標識体を含有する液を該吸水性
基材に滴下して展開すると、固定相上に捕捉された免疫
複合体中の該介在物質に第二標識体中の第四の免疫化学
的成分が結合して、（固定化された第一の免疫化学的成
分−検査対象物−第一標識体−第二標識体）の複合体が
形成される。このようにして、第一および第二標識体を
構成する標識物質が固定相上に集合、結合して検出シグ
ナルが増幅され、それによってより高感度に検査対象物
の存在を検出することが可能となる。In a preferred embodiment of the method of the present invention, the following reaction is performed in each step. That is, a mixture of the liquid containing the test sample and the liquid containing the first label (from the one end of the water-absorbing substrate (that is, the liquid absorbing portion)) When the second immunochemical component forms a complex), the immunocomplex moves on the water-absorbing substrate with the movement of the liquid, and the first complex immobilized on the stationary phase. It binds to the immunochemical component and is captured on the stationary phase. Next, a liquid containing an intermediary substance that mediates the binding of the third and fourth immunochemical components is dropped on the water-absorbent substrate and developed, whereby the intermediary substance is captured on the stationary phase. Binds to a third immunochemical component in the complex. Further, when the liquid containing the second label is dropped on the water-absorbent substrate and developed, the intermediary substance in the immune complex captured on the stationary phase becomes the fourth immunochemical in the second label. The target components bind to form a complex of (immobilized first immunochemical component-test object-first label-second label). In this way, the labeling substances constituting the first and second labels are assembled and bound on the stationary phase, and the detection signal is amplified, whereby the presence of the test object can be detected with higher sensitivity. Becomes

【００２７】本発明の方法の別の好ましい一態様とし
て、上記の方法において、被検試料を吸液部から滴下す
る代わりに、吸液部と固定相との間に滴下または塗布し
た後、第一標識体を含有する液を吸液部に滴下して展開
する方法が挙げられる。この場合、第一標識体を含有す
る液が被検試料を滴下または塗布した領域に達すると、
被検試料中の検査対象物は、第一標識体中の第二の免疫
化学的成分と結合して免疫複合体を形成し、液の移動と
ともに吸水性基材上を移動して固定相上で固定化された
第一の免疫化学的成分に結合して捕捉される。As another preferred embodiment of the method of the present invention, in the above method, instead of dropping the test sample from the liquid absorbing portion, the sample is dropped or applied between the liquid absorbing portion and the stationary phase. A method of dropping a liquid containing one label into the liquid absorbing part and developing the liquid is used. In this case, when the liquid containing the first label reaches the area where the test sample is dropped or applied,
The test object in the test sample binds to the second immunochemical component in the first label to form an immune complex, and moves on the water-absorbing substrate with the movement of the liquid, and moves on the stationary phase. Binds to and is captured by the first immunochemical component immobilized in step (1).

【００２８】本発明の免疫学的検査用キットは、本発明
の免疫学的検査方法に好ましく用いることができる。該
キットは、少なくとも下記の内容を含むものである。 (a) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材 (b) 検査対象物と特異的に結合し得る第二の免疫化学的
成分および検査対象物とは結合しない第三の免疫化学的
成分に標識物質が結合してなる標識体（第一標識体） (c) 該第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特異的
に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結合し
てなる標識体（第二標識体） (d) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する
介在物質 該吸水性基材、第一および第二標識体、並びに介在物質
の好ましい態様は、上記したような本発明の方法におい
て好ましく用いられるものである。The immunological test kit of the present invention can be preferably used for the immunological test method of the present invention. The kit includes at least the following contents. (a) a water-absorbing substrate provided with a stationary phase on which an immobilized first immunochemical component capable of specifically binding to the test object is provided in an arbitrary area on the surface; A label (first label) in which a labeling substance is bound to a second immunochemical component capable of binding and a third immunochemical component not binding to the test object (c) the third immunochemistry (Labelled substance) obtained by binding a labeling substance to a fourth immunochemical component capable of specifically binding to a target component via an intervening substance (d) Third and fourth immunochemical components Intermediates that mediate the binding of the water-absorbing substrate, the first and second labels, and the intervening substances are preferably used in the method of the present invention as described above.

【００２９】本発明のキットに用いられる吸水性基材の
好ましい態様の１つとして、その一端（すなわち吸液
部）と固定相との間の任意の領域（但し、被検試料を該
吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に滴下ま
たは塗布する場合はその領域を含めてそれより固定相側
の領域）に、検査対象物と被検試料中の他の物質とを分
離し得る分離相をさらに設けたものが挙げられる。As a preferred embodiment of the water-absorbing substrate used in the kit of the present invention, an arbitrary region between one end (that is, the liquid-absorbing portion) and the stationary phase (provided that the test sample is When dripping or applying to an arbitrary region between one end of the base material and the stationary phase, the region to be inspected and the other substances in the test sample are applied to the region including the region and the stationary phase side. Examples include those further provided with a separable phase.

【００３０】本発明において、分離相は、分離しようと
する方向の孔径が検査対象物、各標識体、並びに介在物
質よりも大きく、分離除去しようとする被検試料中の他
の物質よりも小さいことが望ましい。また、分離方向と
しては、標識体が吸水性基材上を展開する方向であって
も、あるいはその方向と垂直の方向であってもよく、さ
らに、検査対象物を被検試料中の他の物質から分離した
後は、該分離相を除去して後の測定を行ってもよい。In the present invention, the separated phase has a pore size in the direction to be separated larger than the test object, each label, and the intervening substance, and smaller than other substances in the test sample to be separated and removed. It is desirable. In addition, the direction of separation may be the direction in which the marker spreads on the water-absorbent substrate, or may be a direction perpendicular to that direction. After separation from the substance, the subsequent measurement may be performed after removing the separated phase.

【００３１】分離相の材質としては、例えば、レーヨ
ン、ポリエステル等の不織布、濾紙、ガラス繊維布、ガ
ラスフィルター、ニトロセルロースフィルター、ポリス
ルホンフィルター、多孔質材料等が挙げられる。Examples of the material of the separated phase include non-woven fabric such as rayon and polyester, filter paper, glass fiber cloth, glass filter, nitrocellulose filter, polysulfone filter, and porous material.

【００３２】本発明のキットは、上記の内容物以外に、
本発明の免疫学的検査方法において好ましく使用され得
る付加的な内容物を含んでいてもよい。例えば、第一お
よび第二標識体、並びに介在物質を分散させるのに好ま
しく使用される上記の緩衝液などが挙げられる。The kit of the present invention comprises, in addition to the above-mentioned contents,
It may contain additional contents that can be preferably used in the immunological test method of the present invention. For example, the above-mentioned buffer and the like preferably used for dispersing the first and second labels and the intervening substance can be mentioned.

【００３３】[0033]

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説
明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定する
ものではない。 実施例１ 免疫学的検査用キット構成物の作製 （１）水分散型高分子重合体粒子からなる着色ラテック
スの作製 スチレンモノマー５０ｇ、アクリル酸０．５ｇ、トリエ
チレングリコールジメタクリレート０．２ｇ、及び蒸留
水４４０ｇを窒素気流下で温度７５℃にて攪拌しなが
ら、これに過硫酸カリウム０．２５ｇを水１０ｇに溶解
した水溶液を加え、１０時間重合させて、平均粒子径
０．２２μｍの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を
得た。この重合体粒子分散液をアルカリ、酸、蒸留水の
順序にて遠心洗浄した後、固形分濃度１０重量％に調整
した（担体粒子分散液）。スダンブルー０．２ｇをトル
エン２０ｍｌに溶解し、これにドデシル硫酸ナトリウム
０．２ｇ、及び蒸留水１００ｍｌを加え、超音波分散機
でこの混合液を乳化した。この液に上記担体粒子分散液
（固形分濃度１０重量％）３０ｍｌを加え、室温にて２
４時間攪拌した。この液をエバポレータにてトルエンを
除去した後、０．０１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．５）に
て遠心洗浄を行い、固形分濃度５重量％となるように調
整した。この液５０ｍｌに、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、及び０．０３Ｍｍ−キシレ
ンジアミン水溶液５０ｍｌを加え、室温にて５時間反応
させた。この液を７５℃にて５時間加熱処理した後、前
記と同じ緩衝液にて遠心洗浄を行い、固形分濃度１重量
％となるように調整した（スダンブルー染色キシレンジ
アミンスペーサ化粒子分散液）。The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which do not limit the scope of the present invention in any way. Example 1 Preparation of kit composition for immunological test (1) Preparation of colored latex composed of water-dispersed polymer particles 50 g of styrene monomer, 0.5 g of acrylic acid, 0.2 g of triethylene glycol dimethacrylate, and While stirring 440 g of distilled water at a temperature of 75 ° C. under a nitrogen stream, an aqueous solution in which 0.25 g of potassium persulfate was dissolved in 10 g of water was added thereto, and the mixture was polymerized for 10 hours to obtain an aqueous dispersion having an average particle diameter of 0.22 μm. An aqueous dispersion of type high molecular weight polymer particles was obtained. This polymer particle dispersion was subjected to centrifugal washing in the order of alkali, acid and distilled water, and then adjusted to a solid content concentration of 10% by weight (carrier particle dispersion). 0.2 g of Sudan blue was dissolved in 20 ml of toluene, 0.2 g of sodium dodecyl sulfate and 100 ml of distilled water were added thereto, and the mixture was emulsified with an ultrasonic disperser. 30 ml of the above carrier particle dispersion (solid content concentration: 10% by weight) was added to this solution, and the mixture was added at room temperature.
Stir for 4 hours. The toluene was removed from this solution using an evaporator, and the solution was centrifugally washed with a 0.01M borate buffer (pH 7.5) to adjust the solid content to 5% by weight. To 50 ml of this solution, 5 ml of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride aqueous solution (10 mg / ml) and 50 ml of 0.03 Mm-xylene diamine aqueous solution were added, and the mixture was reacted at room temperature for 5 hours. After heat-treating this solution at 75 ° C. for 5 hours, it was centrifugally washed with the same buffer solution as described above, and adjusted to a solid concentration of 1% by weight (Sudan blue-stained xylene diamine spacer-containing particle dispersion).

【００３４】（２）第一標識体含有液の作製 上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミ
ンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド
水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２
時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、
固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１
０ｍｌに第三の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロビ
ン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、第
二の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギＩ
ｇＧ，５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ、それぞれ加え、１０℃
にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ緩衝液で遠心
洗浄し、固形分濃度１重量％となるように再分散させ、
共有結合で抗体を結合したスダンブルー染色粒子標識抗
ヒトヘモグロビン抗体−抗ヒトＨＢｓ抗体（第一標識
体）含有液を得た。(2) Preparation of First Labeled Body-Containing Liquid To 10 ml of the Sudan Blue-stained xylene diamine spacer-containing particle dispersion prepared in (1) above, 1 ml of an aqueous glutaraldehyde solution (0.1 mg / ml) was added, and the mixture was added at room temperature.
After reacting for hours, it was centrifugally washed with the same buffer solution as above,
The dispersion was adjusted to a solid concentration of 1% by weight. This dispersion 1
1 ml of the anti-human hemoglobin antibody (rabbit IgG, 10 mg / ml) as the third immunochemical component and 0 ml of the anti-human HBs antibody (rabbit I) as the second immunochemical component.
gG, 5 mg / ml) at 10 ° C.
For 24 hours. This was centrifugally washed with the same buffer as above, and redispersed to a solid concentration of 1% by weight.
A solution containing an anti-human hemoglobin antibody-anti-human HBs antibody (first labeled body) labeled with a Sudan blue stained particle to which an antibody was bound by a covalent bond was obtained.

【００３５】（３）第二標識体含有液の作製 上記（１）で調製したスダンブルー染色キシレンジアミ
ンスペーサ化粒子分散液１０ｍｌにグルタルアルデヒド
水溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌを加え、室温にて２
時間反応させた後、前記と同じ緩衝液にて遠心洗浄し、
固形分濃度１重量％の分散液に調整した。この分散液１
０ｍｌに、第四の免疫化学的成分として抗ヒトヘモグロ
ビン抗体（ウサギＩｇＧ，１０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、を
加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と同じ
緩衝液で遠心洗浄し、固形分濃度１重量％となるように
再分散させ、共有結合で抗体を結合したスダンブルー染
色粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体（第二標識体）含有
液を得た。(3) Preparation of Second Labeled Body-Containing Liquid To 10 ml of the Sudan Blue-stained xylene diamine spacer-containing particle dispersion prepared in the above (1), 1 ml of an aqueous glutaraldehyde solution (0.1 mg / ml) was added.
After reacting for hours, it was centrifugally washed with the same buffer solution as above,
The dispersion was adjusted to a solid concentration of 1% by weight. This dispersion 1
To 0 ml, 2 ml of an anti-human hemoglobin antibody (rabbit IgG, 10 mg / ml) was added as a fourth immunochemical component, and the mixture was stirred at 10 ° C. for 24 hours. This was centrifugally washed with the same buffer as above, and redispersed to a solid concentration of 1% by weight, and a solution containing an anti-human hemoglobin antibody (second label) labeled with a Sudan blue stained particle to which an antibody was bound by a covalent bond was added. Obtained.

【００３６】（４）免疫学的検査片の作製 第一の免疫化学的成分として抗ヒトＨＢｓ抗体（ウサギ
ＩｇＧ）を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて
希釈し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの水溶液に調整した。こ
の水溶液に、ニトロセルロースメンブランフィルター
（東洋ろ紙、５×１００ｍｍ）の一端から５０ｍｍ部位
に１０μｌ塗布した後、直ちに３７℃で１時間静置した
後、ニトロセルロースメンブランフィルターを取り出
し、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０の水溶液に１時間浸漬させた。その後、ニトロセル
ロースメンブランフィルターを取り出し、室温で３時間
静置し、抗ヒトＨＢｓ抗体を有するニトロセルロースメ
ンブランフィルターを得た。次に、上記の抗ヒトＨＢｓ
抗体固定化ニトロセルロースメンブランフィルターの試
験片の一端（吸液部）の近傍に血球分離相（東洋ろ紙Ｎ
ｏ．２、５×１０ｍｍ）を設け、固定相および血球分離
相を有するニトロセルロースメンブランフィルターから
なる検査片を得た。(4) Preparation of immunological test strip An anti-human HBs antibody (rabbit IgG) as a first immunochemical component was diluted with a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) to obtain a final concentration. Adjusted to a 1 mg / ml aqueous solution. To this aqueous solution, 10 μl of a nitrocellulose membrane filter (Toyo filter paper, 5 × 100 mm) was applied to a 50 mm site from one end, and immediately left at 37 ° C. for 1 hour. Serum albumin, 0.1% Tween
20 for 1 hour. Thereafter, the nitrocellulose membrane filter was taken out and allowed to stand at room temperature for 3 hours to obtain a nitrocellulose membrane filter having an anti-human HBs antibody. Next, the above-mentioned anti-human HBs
In the vicinity of one end (liquid absorption part) of the test piece of the antibody-immobilized nitrocellulose membrane filter, a blood cell separation phase (Toyo Roshi N
o. 2, 5 × 10 mm) to obtain a test piece composed of a nitrocellulose membrane filter having a stationary phase and a blood cell separation phase.

【００３７】実施例２ 免疫学的検査用キットによるヒ
トＨＢｓ抗原の検出 実施例１の（４）で作製した検査片の血球分離相に、ヒ
トＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液１０
μｌを滴下した。その後、直ちに実施例１の（２）で作
製した第一標識体含有液（固形分濃度０．２重量％）５
０μｌを吸液部に滴下して展開した（図１Ａ）。１０分
後、ヘモグロビン抗原溶液（蛋白質濃度２００ｎｇ／ｍ
ｌ）１００μｌを吸液部に滴下して展開した（図１Ｂ，
Ｃ）。さらに１０分後、実施例１の（３）で作製した第
二標識体含有液（固形分濃度０．２重量％）５０μｌを
吸液部に滴下して展開した（図１Ｄ）。１０分後の固定
相上での発色を目視観察した。その結果を表１に示す。Example 2 Detection of human HBs antigen using an immunological test kit A test solution prepared by dissolving a human HBs antigen in a physiological saline solution in the blood cell separation phase of the test piece prepared in (4) of Example 1. 10
μl was added dropwise. Then, immediately, the liquid containing the first label (solid concentration 0.2% by weight) 5 prepared in (2) of Example 1
0 μl was dropped on the liquid absorbing part and developed (FIG. 1A). After 10 minutes, a hemoglobin antigen solution (protein concentration 200 ng / m
l) 100 μl was dropped on the liquid absorbing part and developed (FIG. 1B,
C). After another 10 minutes, 50 μl of the liquid containing the second label (solid concentration: 0.2% by weight) prepared in (3) of Example 1 was dropped on the liquid absorbing portion and developed (FIG. 1D). After 10 minutes, the color development on the stationary phase was visually observed. Table 1 shows the results.

【００３８】[0038]

【表１】 [Table 1]

【００３９】比較例 実施例１の（４）で作製した検査片の血球分離相に、ヒ
トＨＢｓ抗原を生理食塩水溶液に溶解させた被検液１０
μｌを滴下した。その後、直ちに実施例１の（２）で作
製した第一標識体含有液（固形分濃度０．２重量％）５
０μｌを吸液部に滴下して展開した。１０分後、ヘモグ
ロビン抗原溶液（蛋白質濃度２００ｎｇ／ｍｌ）１００
μｌを吸液部に滴下して展開した。さらに１０分後、実
施例１の（３）で作製した第二標識体含有液（固形分濃
度０．２重量％）５０μｌを吸液部に滴下して展開し
た。１０分後の固定相上での発色を目視観察した。その
結果を表２に示す。COMPARATIVE EXAMPLE A test solution 10 in which a human HBs antigen was dissolved in a physiological saline solution was added to the blood cell separation phase of the test piece prepared in (4) of Example 1.
μl was added dropwise. Then, immediately, the liquid containing the first label (solid concentration 0.2% by weight) 5 prepared in (2) of Example 1
0 μl was dropped on the liquid absorbing portion and developed. After 10 minutes, a hemoglobin antigen solution (protein concentration 200 ng / ml) 100
μl was dropped into the liquid absorbing portion and developed. After another 10 minutes, 50 μl of the liquid containing the second label (solid content concentration: 0.2% by weight) prepared in (3) of Example 1 was dropped and developed. After 10 minutes, the color development on the stationary phase was visually observed. Table 2 shows the results.

【００４０】[0040]

【表２】 [Table 2]

【００４１】[0041]

【発明の効果】本発明の方法（および本発明のキットの
使用）は、シグナルを増幅する工程を含む免疫クロマト
グラフ法において、介在物質を介して第一標識体と第二
標識体を結合させることにより、従来より効率よく検出
シグナルを増幅させることができる。また、本発明の方
法の好ましい態様においては、便や血液等の検査におい
て従来必要とされた被検試料の前処理の工程を省略する
ことができるので、より迅速に検査対象物を測定するこ
とが可能となる。According to the method of the present invention (and the use of the kit of the present invention), the first label and the second label are bound via an intermediary substance in an immunochromatography method including a step of amplifying a signal. Thereby, the detection signal can be amplified more efficiently than before. Further, in a preferred embodiment of the method of the present invention, it is possible to omit the step of pretreatment of the test sample conventionally required in the test of stool, blood, etc., so that the test object can be measured more quickly. Becomes possible.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の免疫学的検査キットを用いたヒトＨＢ
ｓ抗原の測定の各工程における抗原抗体反応の様子を示
す模式図である。FIG. 1 shows human HB using the immunological test kit of the present invention.
It is a schematic diagram which shows the mode of an antigen-antibody reaction in each process of s antigen measurement.

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の工程を含むことを特徴とする免疫
学的検査方法： (1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材の一端から、検査対象物と特異的に結合し得
る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しな
い第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識
体（第一標識体）を含有する液と被検試料を含有する液
との混合物を展開し、該混合物中で形成される検査対象
物と第一標識体との免疫複合体を、固定相に固定化され
た該第一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、 (2) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する
介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相
上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に
結合させ、 (3) さらに第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特
異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結
合してなる標識体（第二標識体）を含有する液を該吸水
性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の
該介在物質に結合させた後、 (4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。1. An immunoassay method comprising the following steps: (1) A stationary phase on which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized on a surface. From one end of the water-absorbing base material provided in an arbitrary region of the above, a labeling substance is added to a second immunochemical component capable of specifically binding to the test object and a third immunochemical component not binding to the test object. Develops a mixture of a solution containing a label (first label) formed by binding to a sample and a solution containing a test sample, and immunizes the test object formed in the mixture with the first label. After binding and capturing the complex with the first immunochemical component immobilized on the stationary phase, (2) containing an intermediary that mediates the binding of the third and fourth immunochemical components A liquid is spread on the water-absorbent substrate and bound to a third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase. (3) further comprising a label (second label) obtained by binding a label to a fourth immunochemical component capable of specifically binding to the third immunochemical component via an intervening substance. After the solution is spread on the water-absorbent substrate and allowed to bind to the mediator in the immune complex captured on the stationary phase, (4) measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase, Detect an inspection object. 【請求項２】 以下の工程を含むことを特徴とする免疫
学的検査方法： (1) 検査対象物と特異的に結合し得る第一の免疫化学的
成分を固定化した固定相を表面上の任意の領域に設けた
吸水性基材の一端と該固定相との間の任意の領域に被検
試料を供給し、 (2) 該吸水性基材の該一端から検査対象物と特異的に結
合し得る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結
合しない第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してな
る標識体（第一標識体）を含有する液を展開し、該吸水
性基材上で形成される検査対象物と第一標識体との免疫
複合体を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成
分に結合させて捕捉した後、 (3) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する
介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相
上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に
結合させ、 (4) さらに第三の免疫化学的成分と介在物質を介して特
異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標識物質が結
合してなる標識体（第二標識体）を含有する液を該吸水
性基材に展開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の
該介在物質に結合させた後、 (5) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。2. An immunological test method comprising the following steps: (1) A stationary phase on which a first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is immobilized, Supplying a test sample to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate provided in an arbitrary region and the stationary phase, and (2) a test object specific from the one end of the water-absorbing substrate. A liquid containing a label (first label) obtained by binding a labeling substance to a second immunochemical component capable of binding to the third immunochemical component not binding to the test object is developed, After capturing and binding the immune complex of the test object and the first label formed on the water-absorbent substrate to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase, ) A liquid containing an intermediary that mediates the binding of the third and fourth immunochemical components is spread on the water-absorbing substrate, and the solution captured on the stationary phase is removed. (4) A labeling substance is added to the fourth immunochemical component that can specifically bind to the third immunochemical component via an intermediary substance. After the solution containing the bound label (second label) is developed on the water-absorbent substrate and allowed to bind to the intervening substance in the immune complex captured on the stationary phase, (5) The test object is detected by measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase. 【請求項３】 該吸水性基材が、その一端と固定相との
間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端
と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領
域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と
被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設
けたものであることを特徴とする請求項１または２記載
の方法。3. The water-absorbing substrate is supplied to an arbitrary region between one end thereof and a stationary phase (provided that a test sample is supplied to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase). In this case, a separation phase capable of separating the test object and other substances in the test sample is further provided in the region including the region and on the stationary phase side thereof). The method according to claim 1. 【請求項４】 該介在物質が抗原抗体反応により第三お
よび第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質であ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the mediator is a substance that specifically binds to the third and fourth immunochemical components by an antigen-antibody reaction. 【請求項５】 該標識物質が着色粒子である請求項１〜
４のいずれかに記載の方法。5. The labeling substance according to claim 1, wherein the labeling substance is a colored particle.
5. The method according to any one of 4. 【請求項６】 該着色粒子が着色されたラテックス粒子
または金コロイド粒子である請求項５記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the colored particles are colored latex particles or colloidal gold particles. 【請求項７】 検査対象物と特異的に結合し得る第一の
免疫化学的成分を固定化した固定相を表面上の任意の領
域に設けた吸水性基材、検査対象物と特異的に結合し得
る第二の免疫化学的成分および検査対象物とは結合しな
い第三の免疫化学的成分に標識物質が結合してなる標識
体（第一標識体）、該第三の免疫化学的成分と介在物質
を介して特異的に結合し得る第四の免疫化学的成分に標
識物質が結合してなる標識体（第二標識体）、並びに第
三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する介在物
質を含み、以下の（ａ）および（ｂ）の免疫学的検査方
法に使用され得る免疫学的検査キット： 方法（ａ） (1) 該吸水性基材の一端から、被検試料を含有する液と
第一標識体を含有する液との混合物を展開し、該混合物
中で形成される検査対象物と第一標識体との免疫複合体
を、固定相に固定化された該第一の免疫化学的成分に結
合させて捕捉した後、 (2) 第三および第四の免疫化学的成分の結合を仲介する
介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、固定相
上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的成分に
結合させ、 (3) さらに第二標識体を含有する液を該吸水性基材に展
開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質
に結合させた後、 (4) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。 方法（ｂ） (1) 該吸水性基材の一端と固定相との間の任意の領域に
被検試料を供給し、 (2) 該吸水性基材の該一端から第一標識体を含有する液
を展開し、該吸水性基材上で形成される検査対象物と第
一標識体との免疫複合体を、固定相に固定化された該第
一の免疫化学的成分に結合させて捕捉した後、 (3) 該介在物質を含有する液を該吸水性基材に展開し、
固定相上に捕捉された免疫複合体中の第三の免疫化学的
成分に結合させ、 (4) さらに第二標識体を含有する液を該吸水性基材に展
開し、固定相上に捕捉された免疫複合体中の該介在物質
に結合させた後、 (5) 該固定相上の標識物質のシグナルを測定することに
より該検査対象物を検出する。7. A water-absorbing substrate provided with a stationary phase on which an immobilized first immunochemical component capable of specifically binding to a test object is provided in an arbitrary region on a surface, and specifically for a test object. A labeled substance (a first labeled substance) in which a labeling substance is bound to a second immunochemical component capable of binding and a third immunochemical component not binding to the test object, the third immunochemical component (A second label) in which a labeling substance is bound to a fourth immunochemical component capable of specifically binding to the drug via an intervening substance, and the binding of the third and fourth immunochemical components. An immunological test kit containing an intermediary substance and which can be used in the following immunological test methods (a) and (b): Method (a) (1) From one end of the water-absorbent substrate, A mixture of a liquid containing a sample and a liquid containing a first label is developed, and a test object formed in the mixture is developed. After capturing and binding the immunoconjugate of the product and the first label to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase, (2) the third and fourth immunochemical components A solution containing an intermediary substance that mediates binding is spread on the water-absorbing substrate, and allowed to bind to the third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase. After the solution containing the body is spread on the water-absorbent substrate and allowed to bind to the intervening substance in the immune complex captured on the stationary phase, (4) measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase Then, the inspection object is detected. Method (b) (1) A test sample is supplied to an arbitrary region between one end of the water-absorbing substrate and the stationary phase, and (2) a first labeled substance is contained from the one end of the water-absorbing substrate. Developing the liquid to be bound, and binding the immune complex of the test object and the first label formed on the water-absorbent substrate to the first immunochemical component immobilized on the stationary phase. After capturing, (3) spread the liquid containing the mediator on the water-absorbent substrate,
Binding to the third immunochemical component in the immune complex captured on the stationary phase, (4) further developing a liquid containing the second label on the water-absorbent substrate and capturing on the stationary phase After binding to the intervening substance in the immune complex thus obtained, (5) the test object is detected by measuring the signal of the labeling substance on the stationary phase. 【請求項８】 該吸水性基材が、その一端と固定相との
間の任意の領域（但し、被検試料を該吸水性基材の一端
と固定相との間の任意の領域に供給する場合は、その領
域を含めてそれより固定相側の領域）に、検査対象物と
被検試料中の他の物質とを分離し得る分離相をさらに設
けたものであることを特徴とする請求項７記載のキッ
ト。8. The water-absorbent substrate is supplied to an arbitrary region between one end and a stationary phase (provided that a test sample is supplied to an arbitrary region between one end of the water-absorbent substrate and the stationary phase). In this case, a separation phase capable of separating the test object and other substances in the test sample is further provided in the region including the region and on the stationary phase side thereof). The kit according to claim 7. 【請求項９】 該介在物質が抗原抗体反応により第三お
よび第四の免疫化学的成分と特異的に結合する物質であ
る請求項７または８記載のキット。9. The kit according to claim 7, wherein the mediator is a substance that specifically binds to the third and fourth immunochemical components by an antigen-antibody reaction. 【請求項１０】 該標識物質が着色粒子である請求項７
〜９のいずれかに記載のキット。10. The labeling substance according to claim 7, wherein the labeling substance is a colored particle.
The kit according to any one of claims 9 to 9. 【請求項１１】 該着色粒子が着色されたラテックス粒
子または金コロイド粒子である請求項１０記載のキッ
ト。11. The kit according to claim 10, wherein the colored particles are colored latex particles or colloidal gold particles.