JP2000004882A - Human mp52 gene promotor and screening of useful substance using the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a promotor which consists of DNA which has human MP52 gene promotor domain having a specific base sequence, and is useful, for example, for screening of compounds which have bone-forming activity at a level similar to human BMP protein or inhibiting activity against it. SOLUTION: This promotor is new DNA which has a human MP52 gene promotor domain which has a base sequence of no. 1-3251 in the base sequence shown by the formula, or fragments of it, and is useful, for example, for screening of low molecular compounds which control, positively or negatively, expression of human MP52 using, as an index, a reporter activity of an animal cell in which a recombinant expression vector which is linked to this DNA and an appropriate reporter gene were introduced. Obtained low molecular compounds are useful, for example, for the treatment, for example, of skeletal diseases, chondropathy, tendon lesion, ligament lesion, and neurological disorders, and as anticancer agents. This promotor is obtained by screening a human genome library using a probe which was prepared by PCR of human embryo cDNA using degenerate primer(s).

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトＭＰ５２遺伝子の
プロモーターを含んだ５′上流域配列に関する。また、
本発明は、ヒトＭＰ５２遺伝子プロモーターを含んだ
５′上流遺伝子と適切なレポーター遺伝子に組み込んだ
組換え発現ベクターを動物細胞に導入した細胞集団を用
い、レポーター活性を指標にしてヒトＭＰ５２の発現を
正または負に制御する低分子化合物を検索する方法を提
供する。The present invention relates to a 5 'upstream sequence containing the promoter of the human MP52 gene. Also,
The present invention uses a cell population in which a 5 ′ upstream gene containing a human MP52 gene promoter and a recombinant expression vector incorporating an appropriate reporter gene have been introduced into animal cells, and corrects the expression of human MP52 using the reporter activity as an index. Alternatively, a method for searching for a low-molecular compound that is negatively controlled is provided.

【０００２】[0002]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】骨の
新生を促して、骨欠損、骨折等の治癒に利用可能な物質
は数多く知られている。そのうちの一つ、骨誘導因子
（bone morphogenic protein、以下ＢＭＰと呼ぶ）はＴ
ＧＦ（transforming growth factor）−βスーパーファ
ミリーに属する蛋白質で、元来、骨脱灰物に存在する異
所性骨化誘導物質として見つかってきたものである（Tr
ends in Biotechnol. 11, 379-383, 1993）。ＢＭＰ
は、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１４まで存在が知られてい
るが、そのうちＢＭＰ−２からＢＭＰ−１４に骨誘導作
用が確認されている。2. Description of the Related Art There are known a number of substances which promote bone regeneration and can be used for healing bone defects, fractures and the like. One of them, bone morphogenic protein (hereinafter referred to as BMP) is T
A protein belonging to the GF (transforming growth factor) -β superfamily, which was originally found as an ectopic ossification inducer present in bone demineralized matter (Tr
ends in Biotechnol. 11, 379-383, 1993). BMP
Is known to exist from BMP-1 to BMP-14, among which BMP-2 to BMP-14 have been confirmed to have an osteoinductive effect.

【０００３】ヒトＭＰ５２はＰＣＲクローニングにより
単離されたＢＭＰ様蛋白質であり（Biochem. Biophys.
Res. Comm. 204, 646-652, 1994）、組み換え型ヒトＭ
Ｐ５２は異所性骨化の誘導のみならず、動物モデルで骨
欠損にも有効なことが示されている（Growth Factors 1
3, 65-74, 1996）。これらＢＭＰ蛋白質は、さまざまな
骨障害、骨疾患の治療・予防に有効と考えられるが、天
然には微量にしか存在せず、治療に使用するよう大量に
入手するためには、組み換え型蛋白質を生産する必要が
ある。[0003] Human MP52 is a BMP-like protein isolated by PCR cloning (Biochem. Biophys.
Res. Comm. 204, 646-652, 1994), recombinant human M
P52 has been shown to be effective not only in inducing ectopic ossification but also in bone defects in animal models (Growth Factors 1
3, 65-74, 1996). These BMP proteins are thought to be effective in the treatment and prevention of various bone disorders and diseases, but are present only in trace amounts in nature, and in order to obtain them in large quantities for use in treatment, recombinant proteins must be used. Need to produce.

【０００４】一般的に、組み換え型蛋白質の生産には、
低分子化合物の生産よりはるかに多くの費用を要する。
また、蛋白質であるという特性から、医薬品としての物
性、投与方法にも制約がある。こういった点を考慮する
と、上記ＢＭＰ蛋白質と同等の活性を有した低分子有機
化合物が存在すれば、それはきわめて魅力的な医薬品と
なることが予想される。[0004] In general, the production of recombinant proteins involves:
It costs much more than the production of small molecules.
In addition, due to the property of being a protein, there are restrictions on the physical properties and administration method as a pharmaceutical. In view of these points, it is expected that the presence of a low molecular weight organic compound having the same activity as the BMP protein would be a very attractive drug.

【０００５】本発明は、ＢＭＰ様蛋白質であるヒトＭＰ
５２を誘導する物質の探索方法を提供する。この探索法
によって得られる有用物質は、骨形成因子であるヒトＭ
Ｐ５２の発現を誘導する効果を有するので、低分子であ
りながらヒトＭＰ５２と同等の効果を持ちあわせてお
り、極めて有用性が高いと考えられる。また、本発明は
ヒトＭＰ５２の発現を抑制する物質の探索方法も提供す
る。骨・軟骨の過剰形成にヒトＭＰ５２が関与している
ならば、この発現を抑制することで過剰形成症を防ぐこ
とができる。[0005] The present invention relates to a human MP, a BMP-like protein.
A method for searching for a substance that induces 52 is provided. The useful substance obtained by this search method is human bone
Since it has the effect of inducing the expression of P52, it has the same effect as human MP52 despite being a small molecule, and is considered to be extremely useful. The present invention also provides a method for searching for a substance that suppresses the expression of human MP52. If human MP52 is involved in bone / cartilage hyperplasia, suppressing this expression can prevent hyperplasia.

【０００６】さらに、最近、変異型のヒトＭＰ５２がそ
れ自身の活性を減ずるのみならず、他のＢＭＰと二量体
を形成することで、それらの活性を消失させてしまう可
能性が示唆されてきた（Nature Genetics 17, 58-64, 1
997）。このような、変異型ヒトＭＰ５２が引き起こす
軟骨異形成症の緩和にもヒトＭＰ５２発現抑制物質は有
効と考えられる。[0006] Furthermore, it has recently been suggested that mutant human MP52 may not only reduce its own activity but also abolish its activity by forming a dimer with other BMPs. (Nature Genetics 17, 58-64, 1
997). It is considered that the human MP52 expression inhibitor is also effective in alleviating chondrodysplasia caused by mutant human MP52.

【０００７】さらに、ヒトＭＰ５２には、腱・靭帯誘導
能（田代俊之ら、American Societyof Bone and Minera
l Research，F336，1997）、神経形成・誘導・防御効果
（J．Neurosci．Res．42，724-732，1995）、さらには
血管新生活性（Exp．Cell Res．235，218-226，1997）
があることも知られている。よって、本発明が提示する
探索方法によって、腱・靭帯誘導もしくは阻害物質、神
経誘導もしくは阻害物質、あるいは血管新生誘導物質ま
たは阻害物質を得ることも可能である。Further, human MP52 has tendon / ligament inducing ability (Toshihiro Tashiro et al., American Society of Bone and Minera
l Research, F336, 1997), neurogenesis / induction / protection effects (J. Neurosci. Res. 42, 724-732, 1995), and angiogenic activity (Exp. Cell Res. 235, 218-226, 1997). )
It is also known that there is. Therefore, by the search method presented by the present invention, it is also possible to obtain a tendon / ligament-inducing or inhibiting substance, a nerve-inducing or inhibiting substance, or an angiogenesis-inducing or inhibiting substance.

【０００８】これまで、こういった探索方法としてはマ
ウスＢＭＰ−２プロモーターを利用した例が報告（WO97
／15308）されているのみであり、ヒトＭＰ５２遺伝子
プロモーターを利用した例はない。本発明が提示する探
索方法における組換え発現ベクターは、全てヒト由来の
ものを使用することが可能なため、探索によって得られ
た物質は実際の臨床でも有効である。Heretofore, as such a search method, there has been reported an example utilizing a mouse BMP-2 promoter (WO97).
/ 15308), and there is no example using the human MP52 gene promoter. Since all recombinant expression vectors in the search method presented by the present invention can be human-derived, the substances obtained by the search are effective in actual clinical practice.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明は配列表配列番号
１において、１番から３５２１番までの塩基配列を有す
るヒトＭＰ５２遺伝子プロモーター領域を含んだＤＮ
Ａ、またはそれらの断片に関する。配列表配列番号１は
ヒトＭＰ５２遺伝子の５′上流配列を示す。本発明は配
列表配列番号１のＤＮＡを下記の順により製造する方法
に関する。 (１) 縮重プライマーを用いたＰＣＲによるｃＤＮＡプ
ローブの作製、(２) プローブによる、ヒトゲノムファ
ージライブラリーのプラークハイブリダイゼーションス
クリーニング、(３) 単離されたファージからの目的断
片のサブクローニング。ここで使用されるプラスミドベ
クターには制限がなく、市販されているベクターを使用
できる。好ましい例として、ｐＵＣ１８がある。According to the present invention, there is provided a DNA sequence comprising a human MP52 gene promoter region having a nucleotide sequence from No. 1 to No. 3521 in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
A, or fragments thereof. Sequence Listing SEQ ID NO: 1 shows the 5 'upstream sequence of the human MP52 gene. The present invention relates to a method for producing DNA of SEQ ID NO: 1 in the following order. (1) Preparation of a cDNA probe by PCR using degenerate primers, (2) Plaque hybridization screening of a human genomic phage library using the probe, and (3) Subcloning of a target fragment from the isolated phage. The plasmid vector used here is not limited, and a commercially available vector can be used. A preferred example is pUC18.

【００１０】本発明は配列表配列番号１のＤＮＡ全長、
あるいは一部をレポーター遺伝子に組み込まれているこ
とを特徴とする組換え発現ベクターに関する。詳しく
は、配列表配列番号１で示されるヒトＭＰ５２遺伝子の
５′上流遺伝子の適切な領域をレポーター遺伝子の上流
に配置した組換え発現ベクターを構築する。レポーター
遺伝子とは本来の生産物の代わりに発現状況を示すもの
で、例えばルシフェラーゼ遺伝子やβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子等が挙げられる。組換え発現ベクターを構築す
る基となるベクターに関しては特に制限はなく、市販の
プラスミドベクターを用いることが出来る。好ましい例
として本発明ではｐＧＬ３−basicを用いた。ｐＧＬ３
−basicを用い、ヒトＭＰ５２プロモーターとルシフェ
ラーゼレポーター遺伝子を含んだ組換えベクターｐＭＰ
５２Ｌ（８０８５ｂｐ）を得た。本発明ではこれを組換
え発現ベクターとした。このベクターをリポソームなど
により、哺乳類細胞、好ましくはヒト骨芽細胞様細胞、
例えばＳａＯＳ−２細胞に導入する必要がある。組換え
発現ベクターを導入した動物細胞は、耐性マーカーなど
を用いて安定発現するように選択される。[0010] The present invention relates to the full length DNA of SEQ ID NO: 1,
Alternatively, the present invention relates to a recombinant expression vector characterized in that a part thereof is incorporated into a reporter gene. Specifically, a recombinant expression vector is constructed in which an appropriate region of the 5 'upstream gene of the human MP52 gene shown in SEQ ID NO: 1 is arranged upstream of the reporter gene. The reporter gene indicates the expression status instead of the original product, and includes, for example, a luciferase gene and a β-galactosidase gene. There is no particular limitation on the vector on which the recombinant expression vector is constructed, and a commercially available plasmid vector can be used. In the present invention, pGL3-basic is used as a preferred example. pGL3
-Basic, recombinant vector pMP containing human MP52 promoter and luciferase reporter gene
52 L (8085 bp) was obtained. In the present invention, this was used as a recombinant expression vector. This vector is transformed into a mammalian cell, preferably a human osteoblast-like cell,
For example, it needs to be introduced into SaOS-2 cells. Animal cells into which the recombinant expression vector has been introduced are selected so as to be stably expressed using a resistance marker or the like.

【００１１】本発明は、配列表配列番号１のＤＮＡ全
長、あるいは一部をレポーター遺伝子に組み込まれてい
ることを特徴とする組換え発現ベクターを用いた有用物
質の探索方法に関する。配列表配列番号１における２８
８０から３５２１までの塩基配列は既に報告（Bioche
m．Biophys．Res．Comm．204，646-652，1994）されて
いる。より長い配列を組み込んだ組換え発現ベクターを
用いることにより、自然に近い探索方法が可能となる。
本発明は、この探索方法で得られる有用物質が骨関連物
質である探索方法に関する。本発明は特に、骨関連物質
が骨形成誘導物質もしくは骨形成阻害物質である探索方
法に関する。さらに本発明は、有用物質が神経形成物質
または血管新生物質である探索方法に関する。ヒトＭＰ
５２発現を誘導もしくは抑制する低分子化合物を得るに
は、この遺伝子発現を調節しているプロモーターを単離
し、適切なレポーター遺伝子に連結し、得られた構造体
を適切な哺乳類細胞に導入して検定系とする方法が考え
られる。この検定系中でヒトＭＰ５２の発現を調節する
物質はプロモーターに作用し、レポーター遺伝子の発現
を上昇または下降させるので、簡単、簡便なレポーター
活性の測定によって目的とする物質の探索を行うことが
できる。[0011] The present invention relates to a method for searching for a useful substance using a recombinant expression vector, wherein the full length or a part of the DNA of SEQ ID NO: 1 is incorporated into a reporter gene. 28 in Sequence Listing SEQ ID NO: 1
The nucleotide sequence from 80 to 3521 has already been reported (Bioche
m. Biophys. Res. Comm. 204, 646-652, 1994). The use of a recombinant expression vector incorporating a longer sequence enables a search method that is more natural.
The present invention relates to a search method in which the useful substance obtained by the search method is a bone-related substance. The present invention particularly relates to a search method in which the bone-related substance is an osteogenesis-inducing substance or an osteogenesis-inhibiting substance. Furthermore, the present invention relates to a search method in which the useful substance is a neurogenic substance or an angiogenic substance. Human MP
To obtain a low molecular compound that induces or suppresses the expression of 52, a promoter regulating this gene expression is isolated, ligated to an appropriate reporter gene, and the resulting construct is introduced into an appropriate mammalian cell. A method using a test system is conceivable. In this assay system, the substance that regulates the expression of human MP52 acts on the promoter to increase or decrease the expression of the reporter gene, so that the target substance can be searched for by simple and convenient measurement of reporter activity. .

【００１２】上記ベクターを遺伝子導入した動物細胞
は、ハイスループットスクリーニング（high through p
ut screening, Nature, 384, supp, 14-16, 1996）など
を用いた化合物ライブラリー、天然物からの活性物質探
索法として使用できる。この細胞を化合物で適当な時間
処理し、レポーター活性を測定し、活性を上昇もしくは
下降させる物質を探索する。こうして得られた化合物
は、例えば転写因子に作用することで直接もしくはシグ
ナル伝達系に関与することで間接的にヒトＭＰ５２のプ
ロモーターに作用することにより、その発現を調節する
ことができる。よって、これら化合物は、骨・軟骨疾患
予防・治療剤、もしくは骨転移阻害剤、骨形成過剰症予
防・治療剤として有効である。あるいはこれら化合物
は、腱・靭帯損傷修復薬、神経疾患治療薬、血管新生誘
導または阻害薬としても有効である。Animal cells into which the above-described vector has been transfected can be subjected to high-throughput screening (high through p
ut screening, Nature, 384, supp, 14-16, 1996), etc., and can be used as a method for searching for active substances from natural products. The cells are treated with the compound for an appropriate time, the reporter activity is measured, and a substance that increases or decreases the activity is searched for. The expression of the compound thus obtained can be regulated, for example, by acting directly on the transcription factor or indirectly by participating in the signal transduction system to act on the promoter of human MP52. Therefore, these compounds are effective as a preventive / therapeutic agent for bone / cartilage disease, a bone metastasis inhibitor, or a preventive / therapeutic agent for hyperostosis. Alternatively, these compounds are also effective as agents for repairing damage to tendons and ligaments, for treating neurological diseases, and for inducing or inhibiting angiogenesis.

【００１３】本発明で得られる物質は、骨あるいは軟骨
誘導活性を有するため、整形外科領域（骨折、変形性膝
関節症、変形性股関節症などの変形性関節症、骨関節
炎、半月板損傷などの軟骨損傷、外傷、腫瘍摘出などに
よる骨、軟骨欠損部の再生、脊椎固定術、脊柱管拡大術
などの骨再建、骨形成不全症、軟骨無形成症などの先天
性軟骨、骨疾疾患）または、歯科領域（口蓋裂、下顎骨
再建術、歯槽堤形成術などの骨再建）、さらには骨粗鬆
症などの予防および治療剤として有効である。さらに
は、本発明の物質は美容外科の骨移植の治療などに用い
ることができる。これらの治療には獣医外科領域の治療
等として有効である。一方、本発明により骨あるいは軟
骨誘導阻害物質を得ることも可能である。この場合、骨
・軟骨形成過剰症予防・治療剤として適用される。Since the substance obtained in the present invention has bone or cartilage inducing activity, it can be used in the field of orthopedic surgery (osteoarthritis such as fractures, knee osteoarthritis, osteoarthritis, osteoarthritis, meniscal injury, etc.). Bone and cartilage defects due to cartilage damage, trauma, tumor removal, bone reconstruction such as spinal fusion, spinal canal enlargement, congenital cartilage such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia, and bone diseases) Alternatively, it is effective as a prophylactic and therapeutic agent for dentistry (bone reconstruction such as cleft palate, mandibular reconstruction, alveolar plasty) and osteoporosis. Further, the substance of the present invention can be used for treating bone transplantation in cosmetic surgery. These treatments are effective as treatments in the field of veterinary surgery. On the other hand, it is also possible to obtain a bone or cartilage induction inhibitor according to the present invention. In this case, it is applied as a prophylactic / therapeutic agent for bone / chondrodysplasia.

【００１４】さらに、本発明によって腱・靭帯誘導もし
くは阻害物質も取得できる。よって、本発明は腱・靭帯
損傷治療薬の探索法も提供する。さらに、ヒトＭＰ５２
は神経形成・誘導・防御活性も有するため、本発明によ
り得られた化合物は、神経疾患治療薬としての適用も可
能である。さらには、血管新生誘導物質あるいは阻害物
質を得ることが可能である。得られた化合物は損傷治療
薬、抗癌剤、転移抑制剤として応用できる。Further, according to the present invention, a substance for inducing or inhibiting tendons and ligaments can be obtained. Therefore, the present invention also provides a method for searching for a therapeutic agent for tendon / ligament damage. Furthermore, human MP52
Has also neurogenic, inducing and protective activities, and thus the compounds obtained according to the present invention can also be applied as therapeutic agents for neurological diseases. Furthermore, an angiogenesis inducer or inhibitor can be obtained. The obtained compound can be applied as a therapeutic agent for damage, an anticancer agent, or a metastasis inhibitor.

【００１５】[0015]

【実施例】次に実施例を示して、本発明の効果を具体的
に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定
されるものではない。 実施例１ ヒトＭＰ５２の５′上流遺伝子のクローニン
グ 配列表配列番号２のプライマーＯＤと配列表配列番号３
のプライマーＯＩＤを用い、ヒト胎児（８〜９週齢）の
ｃＤＮＡを鋳型とし、１.５ユニットのＴａｑポリメラ
ーゼ（パーキンエルマー シータス社製）により４０サ
イクルのＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡをＳｐ
ｈＩとＡｌｗＮＩで処理した後、さらに１３回ＰＣＲ反
応を行うという過程を２度繰り返した。最後にＥｃｏＲ
Ｉで処理した後、ＰＣＲ産物をpBluescript SK（ストラ
タジン社製）と連結させた。クローニングされた配列
中、ＭＰ５２のｃＤＮＡ配列を含むものを用い、ヒトゲ
ノムファージライブラリー（ストラタジン社製）をプラ
ークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし
た。得られた２０ｋｂのＤＮＡはpBluescript SKベクタ
ーにサブクローニングし、さらに不要な部分を切断、除
去することにより、８.８ｋｂのヒトＭＰ５２遺伝子Ｄ
ＮＡを含む pBluescriptベクターを得た。このベクター
を E.coli pMP52と名づけた。E.coli pMP52 は、1998年
３月30日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託番号 FERM P−16734 として寄託された。EXAMPLES Next, the effects of the present invention will be specifically described with reference to examples. Note that the present invention is not limited by these examples. Example 1 Cloning of 5 'upstream gene of human MP52 Primer OD of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 of Sequence Listing
And PCR was performed for 40 cycles using 1.5 units of Taq polymerase (manufactured by PerkinElmer Cetus) using cDNA of human fetus (8-9 weeks old) as a template. Sp. Amplified DNA
After the treatment with hI and AlwNI, the process of further performing the PCR reaction 13 times was repeated twice. Finally EcoR
After treatment with I, the PCR product was ligated with pBluescript SK (Stratadyne). Using the cloned sequence containing the MP52 cDNA sequence, a human genomic phage library (Stratadin) was screened by plaque hybridization. The obtained 20 kb DNA was subcloned into a pBluescript SK vector, and unnecessary portions were cut and removed to obtain an 8.8 kb human MP52 gene D.
A pBluescript vector containing NA was obtained. This vector was named E. coli pMP52. E. coli pMP52 was deposited on March 30, 1998 with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Ministry of International Trade and Industry under the deposit number FERM P-16734.

【００１６】実施例２ ヒトＭＰ５２遺伝子ＤＮＡの遺
伝子配列決定 ８.８ｋｂのヒトＭＰ５２遺伝子ＤＮＡを含んだ pBlues
criptベクターをＸｂａＩで消化した後、残った大きな
方（７.６ｋｂ）の断片をアガロース電気泳動により精
製し、宝酒造社製品のライゲーションキットによりセル
フライゲーションした。この、４.７ｋｂのヒトＭＰ５
２遺伝子上流部分を含んだベクターを鋳型として、ＡＬ
Ｆ自動ＤＮＡ配列読み取り装置（ファルマシア・バイオ
テク社製品）により５′末端側３.５ｋｂの配列を決定
した（Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467,
1977）。３５２１塩基からなるヒトＭＰ５２ 遺伝子
５′上流を配列表配列番号１に示す。読み取りは最低３
回以上行い、読み取りが困難な部位についてはサブクロ
ーニングした上で、両側から配列を読み取った。本配列
番号１において２８８０から３５２１の塩基配列は既報
（Biochem. Biophys. Res. Comm. 204、646-652、199
4）のものである。EXAMPLE 2 Gene sequencing of human MP52 gene DNA pBlues containing 8.8 kb of human MP52 gene DNA
After digesting the cript vector with XbaI, the remaining larger (7.6 kb) fragment was purified by agarose electrophoresis and self-ligated using a ligation kit manufactured by Takara Shuzo. This 4.7 kb human MP5
Using a vector containing the upstream portion of two genes as a template, AL
F The sequence of 3.5 kb at the 5 'end was determined using an automatic DNA sequence reader (Pharmacia Biotech) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467,
1977). The 5 'upstream of the human MP52 gene consisting of 3521 bases is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. Read at least 3
The sequence was read from both sides after subcloning the site where reading was difficult. In this SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence from 2880 to 3521 has been reported (Biochem. Biophys. Res. Comm. 204, 646-652, 199).
4) thing.

【００１７】実施例３ ヒトＭＰ５２遺伝子プロモータ
ーとルシフェラーゼレポーター遺伝子を含んだ組換え発
現ベクターの構築 ヒトＭＰ５２の５′上流領域３.５ｋｂの制限酵素図を
図１に示す。ヒトＭＰ５２の５′上流領域のＡｐａＬＩ
−ＢｇｌII断片（０.６ｋｂ）を精製し、ＡｐａｌＩ側
を平滑化した。そして、この断片を、まずＨｉｎｄ II
I、ＢｇｌIIで処理し、さらに、Ｈｉｎｄ III側を平滑
化したｐＧＬ３−basicベクターに挿入した。得られた
ベクターをＢｇｌII、KpnI制限酵素で処理し、ＭＰ５２
の５′領域のＢｇｌII−ＫｐｎＩ（pBluescriptベクタ
ー由来）断片（２.７ｋｂ）と連結した。最終的に得ら
れた組換え発現ベクターｐＭＰ５２Ｌ（８０８５ｂｐ）
はヒトＭＰ５２ ５′上流域３.３ｋｂを含んでいる。図
２に構築した組換え発現ベクターの模式図を示す。Example 3 Construction of Recombinant Expression Vector Containing Human MP52 Gene Promoter and Luciferase Reporter Gene FIG. 1 shows a restriction enzyme diagram of 3.5 kb 5 'upstream region of human MP52. ApaLI in the 5 'upstream region of human MP52
The -BglII fragment (0.6 kb) was purified and the ApalI side was blunted. Then, this fragment was first converted to Hind II
The plasmid was treated with I and BglII, and inserted into a pGL3-basic vector in which the HindIII side was blunted. The resulting vector was treated with BglII and KpnI restriction enzymes to obtain MP52.
5 'region was ligated to a BglII-KpnI (derived from pBluescript vector) fragment (2.7 kb). The finally obtained recombinant expression vector pMP52L (8085 bp)
Contains 3.3 kb of the human MP525 5 'upstream region. FIG. 2 shows a schematic diagram of the constructed recombinant expression vector.

【００１８】実施例４ ヒトＭＰ５２プロモーター活性
の測定（組換え発現ベクターのヒト細胞への導入と一過
性発現） ヒトＭＰ５２組換え発現ベクターｐＭＰ５２Ｌを一過性
発現させるために、上記のベクターと遺伝子の導入効率
測定用の内部コントロールとしてのシーパンジールシフ
ェラーゼ遺伝子を含んだベクターｐＲＬ−ＳＶ４０（プ
ロメガ社製品）を等量混合した。さらに、カチオニック
リポソームリポフェクタミン Lipofectamine（ライフテ
ックオリエンタル社製品）と上記ＤＮＡ溶解液を混合
し、ヒト骨肉腫細胞ＨＯＳ、ＭＧ６３、およびＳａＯＳ
−２に添加し、トランスフェクションした。ホタル・ル
シフェラーゼ活性およびシーパンジー・ルシフェラーゼ
活性はピッカジーンデュアルキット（東洋インキ製品）
によって測定した。この結果を図３に示す。プロモータ
ー活性は、シーパンジー・ルシフェラーゼ活性に対する
ホタル・ルシフェラーゼ活性の相対比としてあらわし
た。この結果から本発明の配列表配列番号１のＤＮＡは
プロモーター活性を有することがわかった。Example 4 Measurement of Human MP52 Promoter Activity (Transformation of Recombinant Expression Vector into Human Cells and Transient Expression) In order to transiently express the human MP52 recombinant expression vector pMP52L, the above vector and gene were used. An equal amount of a vector pRL-SV40 (Promega) containing a seapan luciferase gene as an internal control for measuring the transfection efficiency was mixed. Further, the DNA lysate was mixed with the cationic liposome Lipofectamine (manufactured by Lifetech Oriental) and the mixture was mixed with human osteosarcoma cells HOS, MG63, and SaOS.
-2 and transfected. Firefly luciferase activity and sea pansy luciferase activity are measured by Picka Gene Dual Kit (Toyo Ink Products)
Was measured by The result is shown in FIG. Promoter activity was expressed as the relative ratio of firefly luciferase activity to sea pansy luciferase activity. From this result, it was found that the DNA of SEQ ID NO: 1 of the present invention has promoter activity.

【００１９】実施例５ ヒトＭＰ５２組換え発現ベクタ
ーを安定導入した細胞の樹立と活性化合物探索系として
の利用 ヒトＭＰ５２組換え発現ベクター（ｐＭＰ５２Ｌ）を安
定発現させるために、ピュロマイシン耐性遺伝子を含ん
だプラスミドｐＰＵＲと１０：１の割合で混合し、カチ
オニックリポソームリポフェクタミン Lipofectamine
（ライフテックオリエンタル社製品）と混合後、ＳａＯ
Ｓ−２細胞に添加し、トランスフェクションした。ピュ
ロマイシン（シグマ社製品）を含んだ培地で目的の遺伝
子が導入された細胞を選択した。Example 5 Establishment of cells stably transfected with a human MP52 recombinant expression vector and utilization as an active compound search system In order to stably express a human MP52 recombinant expression vector (pMP52L), a plasmid containing a puromycin resistance gene was used. The mixture was mixed with pPUR at a ratio of 10: 1, and the mixture was mixed with cationic liposome Lipofectamine.
(Lifetech Oriental) and mixed with SaO
Added to S-2 cells and transfected. Cells into which the target gene was introduced were selected in a medium containing puromycin (a product of Sigma).

【００２０】実施例６ 活性低分子化合物のスクリーニ
ング 選択した細胞を９６穴プレートに播種し、種々の化合物
ライブラリー中の物質で１−３日間処理した後、細胞を
細胞溶解剤（プロメガ社製品）で溶解させ、ルシフェラ
ーゼアッセイキット（プロメガ社製品）で酵素活性を測
定した。このようにして、ヒトＭＰ５２の発現を促進も
しくは抑制させる種々の物質を探索することができる。Example 6 Screening for Active Low-Molecular Compounds Selected cells were seeded on a 96-well plate, treated with substances in various compound libraries for 1-3 days, and then the cells were lysed with a cell lysing agent (Promega). And the enzyme activity was measured using a luciferase assay kit (promega). In this manner, various substances that promote or suppress the expression of human MP52 can be searched.

【００２１】[0021]

【発明の効果】ヒトＭＰ５２遺伝子プロモーターを含ん
だ５′上流遺伝子と適切なレポーター遺伝子に組込んだ
組換え発現ベクターを導入した動物細胞を用い、レポー
ター活性を指標にしてヒトＭＰ５２の発現を正または負
に制御する低分子化合物を探索することができる。これ
らの低分子化合物およびその誘導体は、ヒトＭＰ５２の
発現を介した骨・軟骨誘導活性または阻害活性を有し、
骨、軟骨疾患予防・治療剤、骨転移治療剤もしくは骨形
成過剰症予防・治療剤として有用である。さらにこれら
化合物は、腱・靭帯損傷修復剤、神経疾患治療剤、血管
新生誘導または阻害剤としても有効である。EFFECTS OF THE INVENTION Using animal cells into which a 5 'upstream gene containing a human MP52 gene promoter and a recombinant expression vector incorporated into an appropriate reporter gene have been introduced, the expression of human MP52 is positive or negative using the reporter activity as an index. It is possible to search for low-molecular compounds that are negatively controlled. These low molecular weight compounds and derivatives thereof have an activity of inducing or inhibiting bone / cartilage through expression of human MP52,
It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for bone and cartilage diseases, a therapeutic agent for bone metastasis or a prophylactic / therapeutic agent for hyperostosis. Further, these compounds are also effective as agents for repairing damage to tendons and ligaments, agents for treating neurological diseases, and agents for inducing or inhibiting angiogenesis.

【００２２】[0022]

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：3521 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 起源： 生物名：ヒト（Homo sapiens） 組織の種類：全血液 配列の特徴：ヒトＭＰ５２の５′上流遺伝子配列。翻訳開始点のＡＴＧは配列の 最後に位置している。 配列： TCGACTCGAT CACTTTATGC AATTTAATTT TATTTATTTT TTTAGTAGAG ACAGGGTTTC 60 ACCATGTTAG CCAGGATGGT CTTGATCTCC TGACCTCGTG ATCCACCTGC CTCGGCCTCC 120 CAAAGTGCTG GGATTACAGG CGTGAGCACT GCGCCTGGCC GCAATTTACT TCATTGAATC 180 TCCAACAAGA GTCCTGTGAG GTAAGCACTA TCGTTATCAC TGTTTAGAGT TTCAGAGGGG 240 TTTAGAGGCT TCCCAAGATC ACACAATACA TAAATAGCAG AACCAAGCTT CAAAACCAGG 300 TCTGTTTGTC TCCAGAATCC TTGCTCTTTA TCAAGCCACG TACAGAGACA TTGTGGTTGT 360 TCAACTCATT CATTTATTCA CTCTCTGAGC TTACAAAATG CTTAAGAAGT GGCAAGACAA 420 TTCTTCCCTT CAAGAAACTT AGAGTCTAAT GGGAAAGGCA GGTTATGTCC ACAAATAACT 480 ACACCTCAAA GTAGAAAATG ATGATTTTTG TCAATAAGGG CCAGTTAGAG ATTAATTTAT 540 TCATATAACA CGTACTGAGA GCTGCTGTGG GCTGGGCCTC TGCCAAGCAC TGGGTATAAT 600 TCAAAGATAA ATATGGCACA GTCTAGTCAT AATCTAATGG GAGAGACAGG TATGTAAAGA 660 AATTATTATA GTTATAAGGA ATTAAGTTAT GATTTTAAAA TATGACAAAA TACAGAGTGG 720 AAGAAACAAA CTGTGTTGGG ATAGGGGGCA GAGGCAGAGA CTGAATAAAC TTTCAGCTGC 780 CAAAAAATGT AAAAGAGCAC AGAAAATGTG TGATGGCAGC TCAGGGGGAG TGTGCATTTT 840 CTGGAGGATG CAAGAAGGCT TCATGGAGGA GGTGGCACGT GGGTTGGCAC TTGTTTGATG 900 GGTAGCTTTT AGTAGAGGGT TGAACCAGAG AGAGCCTGGA GGCCTAGAAG CCAGTTATAG 960 GGGAGAATCA TAGCGAGGCA AGCAATGAGG AGGACAGGGC AGTGACAGAG GTGGTGAGGA 1020 GGGAGTGAAG GGAGGGATGC CAGAGAGGAC TGGTTCAGTG GGAACAAGTC TGTTTTTAAT 1080 TTTTTTATTT TATTAATATT ATTTATTTAC TTATTTTGTG TGTGTGTGAT GGACTCTAGC 1140 TCTGTCACCT AGGCTGGHGT GCAGTGGTGC GATCTCGGCT CACTGCAACC TTTGCCTCCA 1200 CACCCGGCTA ATTTTTTGTA TTTTTGGTAG AGATGCCTGC AATCCCAGCA CTTTGAGAGG 1260 CCAAGGTGGG TGGATCACTT GAGGTCAGGA GCTCGAGACC AGACTGGCCA ACATGGTGAA 1320 ACTCCGTCTC TACTAAAAAT ACAAAAAATA GATAGGCATG GTGGTGTGCA CCTGTAGTCC 1380 CAGCTACTCG AGAGGCTGAG GCAGGAGAAT CGTTTGAACC CAGGAGGTGG AGATTACAGT 1440 GAGCCAAGAT CGCACCACTG CACTCCAGCC TAGGTGACAG AGTGAGACTC TGTCTCAAAA 1500 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGAAGGAA GCCTATCTGA CTATTGCTTC TCCCCCGCCA 1560 TCCTTCTTAC AGCGTGAAAA GTGTTGTTGT AGAGAAATGT ACAGAAGGGG TAACTGGCTC 1620 TGTCTGGGGA CGAGGAAAGG CTTCCCGAAG GAGGTAAATT TTCAGCTAAA CTTCTCAGGA 1680 TGTAGAGTGC TTCCTCCAGT TGTGGGAGAG AGAGAGGAGG ATATTTCAGG TGAAGCGAAC 1740 AGCTTTCCCC GCTGACCCTG TGTTAAGTTG CCCAGGGGCT CTACGGCGAA GGTTCCCCAG 1800 AGGAAGGGAT CTTCCATACT TCAATGAGGC ACTTTAAGAA ACCCTTGAGT TCAGCTGGAA 1860 TTCAGACCTT CCAGAGCTAC CAGAAAAACA TCATGTGGGA AATTGTGCCC GGCGCGGTGT 1920 CACGCCTGTA ATCCCAGCAC TTTGGGAGGC CGAGGCGGGC GGATCACGAG GTCAGGAGAT 1980 CGAGACCAAC CTGGCTAACA TGGTGAAACC CCATCTCTAC TACAAACGTA AAAAATCAGC 2040 CAGGTGTGGT GGCAGGGGCC TGTAGTCCCA GCTACTGGGG AGGCTGAGGC AGGGGAATGG 2100 CGTGAACCTG GGAGGCAGAG ATTGCAGTGA GCTGAGATCA TGCCACTGCA CTCGACAGAG 2160 GCGAACTCCG TCTCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGTCAT GTGGGAAATG GCTTTTCCAG 2220 CCTCCTGTAG GGGCCGCTGC TGCCCCAGAC TCAGCCAGTC TTGTCTAAGA AAACTCAGAG 2280 GACGTCTCTG CTGGGGTGGT GGTGGGGTAC ACCCTGGACC TGCCGCCATC CAAGGAGTGA 2340 ACTTAAGGGC GACAGTGCCC CCAAGCCTGA AGAATATGCA CTCAGTCAAT GGCATTTGGG 2400 GGTAGGGAGG GGGTGTAGTG GGCACTGATA TTTTTCAGTC TCTGGGTCAC CACAAGTTTA 2460 TTAAAATAAA AGAAAATGTG GGTAAATGCT GCCATCTGTG CTGTCCCTAC TCCCAATACA 2520 CACACACAGG CACACACACA CACAGGCACA CACACACACA GGCACACATA TACACACACA 2580 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACG CATAACAAAT CAGGTCCCAG 2640 ACTAGATGCA GGAGTTGAAA CTGCTTTAAA ACACTCTAAG AACTTAACTA CAAACCCACA 2700 CTCCCCATGC TTCTGGGGCT TAAGATCTTT GAGCTCATTC TTCAGCATCT CTCCACGAGA 2760 AAGTGGGGTG GGCTGCTCCA TGAGGTGGAG GTGAAGACCC CTGAGTCTGC CCCGTGGAGG 2820 GGGAGGCCCC CTAAGCCTAG AGTCCCGCTG CAGGGCTCTG TGCCAGGAGC CCCCGTGAGC 2880 CATGGCCTCG AAAGGGCAGC GGTGATTTTT TTCACATAAA TATATCGCAC TTAAATGAGT 2940 TTAGACAGCA TGACATCAGA GAGTAATTAA ATTGGTTTGG GTTGGAATTC CGTTTCCAAT 3000 TCCTGAGTTC AGGTTTGTAA AAGATTTTTC TGAGCACCTG CAGGCCTGTG AGTGTGTGTG 3060 TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGAA GTATTTTCAC TGGAAAGGAT TCAAAACTAG 3120 GGGGAAAAAA AAACTGGAGC ACACAGGCAG CATTACGCCA TTCTTCCTTC TTGGAAAAAT 3180 CCCTCAGCCT TATACAAGCC TCCTTCAAGC CCTCAGTCAG TTGTGCAGGA GAAAGGGGGC 3240 GGTTGGCTTT CTCCTTTCAA GAACGAGTTA TTTTCAGCTG CTGACTGGAG ACGGTGCACG 3300 TCTGGATACG AGAGCATTTC CACTATGGGA CTGGATACAA ACACACACCC GGCAGACTTC 3360 AAGAGTCTCA GACTGAGGAG AAAGCCTTTC CTTCTGCTGC TACTGCTGCT GCCGCTGCTT 3420 TTGAAAGTCC ACTCCTTTCA TGGTTTTTCC TGCCAAACCA GAGGCACCTT TGCTGCTGCC 3480 GCTGTTCTCT TTGGTGTCAT TCAGCGGCTG GCCAGAGGAT G 3521[Sequence list] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 3521 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin: Biological name: Human (Homo sapiens) Tissue type : Whole blood Sequence characteristics: 5 'upstream gene sequence of human MP52. The ATG at the translation start is located at the end of the sequence. SEQ: TCGACTCGAT CACTTTATGC AATTTAATTT TATTTATTTT TTTAGTAGAG ACAGGGTTTC 60 ACCATGTTAG CCAGGATGGT CTTGATCTCC TGACCTCGTG ATCCACCTGC CTCGGCCTCC 120 CAAAGTGCTG GGATTACAGG CGTGAGCACT GCGCCTGGCC GCAATTTACT TCATTGAATC 180 TCCAACAAGA GTCCTGTGAG GTAAGCACTA TCGTTATCAC TGTTTAGAGT TTCAGAGGGG 240 TTTAGAGGCT TCCCAAGATC ACACAATACA TAAATAGCAG AACCAAGCTT CAAAACCAGG 300 TCTGTTTGTC TCCAGAATCC TTGCTCTTTA TCAAGCCACG TACAGAGACA TTGTGGTTGT 360 TCAACTCATT CATTTATTCA CTCTCTGAGC TTACAAAATG CTTAAGAAGT GGCAAGACAA 420 TTCTTCCCTT CAAGAAACTT AGAGTCTAAT GGGAAAGGCA GGTTATGTCC ACAAATAACT 480 ACACCTCAAA GTAGAAAATG ATGATTTTTG TCAATAAGGG CCAGTTAGAG ATTAATTTAT 540 TCATATAACA CGTACTGAGA GCTGCTGTGG GCTGGGCCTC TGCCAAGCAC TGGGTATAAT 600 TCAAAGATAA ATATGGCACA GTCTAGTCAT AATCTAATGG GAGAGACAGG TATGTAAAGA 660 AATTATTATA GTTATAAGGA ATTAAGTTAT GATTTTAAAA TATGACAAAA TACAGAGTGG 720 AAGAAACAAA CTGTGTTGGG ATAGGGGGCA GAGGCAGAGA CTGAATAAAC TTTCAGCTGC 780 CAAAAAATGT AAAAGAGCAC AGAAAATGTG TGATGGCAGC TCAGGGGGAG TGTGCATTTT 840 CTGGAGGATG CAAGAAGGCT TCATGGAGGA GGTGGCACGT GGGTTGGCAC TTGTTTGATG 900 GGTAGCTTTT AGTAGAGGGT TGAACCAGAG AGAGCCTGGA GGCCTAGAAG CCAGTTATAG 960 GGGAGAATCA TAGCGAGGCA AGCAATGAGG AGGACAGGGC AGTGACAGAG GTGGTGAGGA 1020 GGGAGTGAAG GGAGGGATGC CAGAGAGGAC TGGTTCAGTG GGAACAAGTC TGTTTTTAAT 1080 TTTTTTATTT TATTAATATT ATTTATTTAC TTATTTTGTG TGTGTGTGAT GGACTCTAGC 1140 TCTGTCACCT AGGCTGGHGT GCAGTGGTGC GATCTCGGCT CACTGCAACC TTTGCCTCCA 1200 CACCCGGCTA ATTTTTTGTA TTTTTGGTAG AGATGCCTGC AATCCCAGCA CTTTGAGAGG 1260 CCAAGGTGGG TGGATCACTT GAGGTCAGGA GCTCGAGACC AGACTGGCCA ACATGGTGAA 1320 ACTCCGTCTC TACTAAAAAT ACAAAAAATA GATAGGCATG GTGGTGTGCA CCTGTAGTCC 1380 CAGCTACTCG AGAGGCTGAG GCAGGAGAAT CGTTTGAACC CAGGAGGTGG AGATTACAGT 1440 GAGCCAAGAT CGCACCACTG CACTCCAGCC TAGGTGACAG AGTGAGACTC TGTCTCAAAA 1500 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGAAGGAA GCCTATCTGA CTATTGCTTC TCCCCCGCCA 1560 TCCTTCTTAC AGCGTGAAAA GTGTTGTTGT AGAGAAATGT ACAGAAGGGG TAACTGGCTC 1620 TGTCTGGGGA CGAGGAAAGG CTTCCCGAAG GAGGTAAATT TTCAGCTAAA CTTCTCAGGA 1680 TGTAGAGTGC TTCCTCCA GT TGTGGGAGAG AGAGAGGAGG ATATTTCAGG TGAAGCGAAC 1740 AGCTTTCCCC GCTGACCCTG TGTTAAGTTG CCCAGGGGCT CTACGGCGAA GGTTCCCCAG 1800 AGGAAGGGAT CTTCCATACT TCAATGAGGC ACTTTAAGAA ACCCTTGAGT TCAGCTGGAA 1860 TTCAGACCTT CCAGAGCTAC CAGAAAAACA TCATGTGGGA AATTGTGCCC GGCGCGGTGT 1920 CACGCCTGTA ATCCCAGCAC TTTGGGAGGC CGAGGCGGGC GGATCACGAG GTCAGGAGAT 1980 CGAGACCAAC CTGGCTAACA TGGTGAAACC CCATCTCTAC TACAAACGTA AAAAATCAGC 2040 CAGGTGTGGT GGCAGGGGCC TGTAGTCCCA GCTACTGGGG AGGCTGAGGC AGGGGAATGG 2100 CGTGAACCTG GGAGGCAGAG ATTGCAGTGA GCTGAGATCA TGCCACTGCA CTCGACAGAG 2160 GCGAACTCCG TCTCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGTCAT GTGGGAAATG GCTTTTCCAG 2220 CCTCCTGTAG GGGCCGCTGC TGCCCCAGAC TCAGCCAGTC TTGTCTAAGA AAACTCAGAG 2280 GACGTCTCTG CTGGGGTGGT GGTGGGGTAC ACCCTGGACC TGCCGCCATC CAAGGAGTGA 2340 ACTTAAGGGC GACAGTGCCC CCAAGCCTGA AGAATATGCA CTCAGTCAAT GGCATTTGGG 2400 GGTAGGGAGG GGGTGTAGTG GGCACTGATA TTTTTCAGTC TCTGGGTCAC CACAAGTTTA 2460 TTAAAATAAA AGAAAATGTG GGTAAATGCT GCCATCTGTG CTGTCCCTAC TCCCAATACA 2520 CACACACAGG CACACACACA CAC AGGCACA CACACACACA GGCACACATA TACACACACA 2580 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACG CATAACAAAT CAGGTCCCAG 2640 ACTAGATGCA GGAGTTGAAA CTGCTTTAAA ACACTCTAAG AACTTAACTA CAAACCCACA 2700 CTCCCCATGC TTCTGGGGCT TAAGATCTTT GAGCTCATTC TTCAGCATCT CTCCACGAGA 2760 AAGTGGGGTG GGCTGCTCCA TGAGGTGGAG GTGAAGACCC CTGAGTCTGC CCCGTGGAGG 2820 GGGAGGCCCC CTAAGCCTAG AGTCCCGCTG CAGGGCTCTG TGCCAGGAGC CCCCGTGAGC 2880 CATGGCCTCG AAAGGGCAGC GGTGATTTTT TTCACATAAA TATATCGCAC TTAAATGAGT 2940 TTAGACAGCA TGACATCAGA GAGTAATTAA ATTGGTTTGG GTTGGAATTC CGTTTCCAAT 3000 TCCTGAGTTC AGGTTTGTAA AAGATTTTTC TGAGCACCTG CAGGCCTGTG AGTGTGTGTG 3060 TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGAA GTATTTTCAC TGGAAAGGAT TCAAAACTAG 3120 GGGGAAAAAA AAACTGGAGC ACACAGGCAG CATTACGCCA TTCTTCCTTC TTGGAAAAAT 3180 CCCTCAGCCT TATACAAGCC TCCTTCAAGC CCTCAGTCAG TTGTGCAGGA GAAAGGGGGC 3240 GGTTGGCTTT CTCCTTTCAA GAACGAGTTA TTTTCAGCTG CTGACTGGAG ACGGTGCACG 3300 TCTGGATACG AGAGCATTTC CACTATGGGA CTGGATACAA ACACACACCC GGCAGACTTC 3360 AAGAGTCTCA GACTGAGGAG AAAGCCTTT C CTTCTGCTGC TACTGCTGCT GCCGCTGCTT 3420 TTGAAAGTCC ACTCCTTTCA TGGTTTTTCC TGCCAAACCA GAGGCACCTT TGCTGCTGCC 3480 GCTGTTCTCT TTGGTGTCAT TCAGCGGCTG GCCAGAGGAT G 3521

【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 組織の種類：なし 配列の特徴：ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡ配列に相当する順方
向ＰＣＲプライマーＯＤ。 配列： ATGAATTCCC ATGGACCTGG GCTGGMAKGA MTGGAT 36SEQ ID NO: 2 Sequence length: 36 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Origin: None Organism name: None Tissue type: None Sequence Features: forward PCR primer OD corresponding to human MP52 cDNA sequence. Sequence: ATGAATTCCC ATGGACCTGG GCTGGMAKGA MTGGAT 36

【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 組織の種類：なし 配列の特徴：ヒトＭＰ５２ｃＤＮＡ配列に相当する逆方
向ＰＣＲプライマーＯＩＤ。 配列： ATGAATTCGA GCTGCGYSGG SRCACAGCA 29SEQ ID NO: 3 Sequence length: 29 Sequence type: Nucleic acid number of strands: Single stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Origin: None Organism name: None Tissue type: None Sequence Characteristic: Reverse PCR primer OID corresponding to human MP52 cDNA sequence. Sequence: ATGAATTCGA GCTGCGYSGG SRCACAGCA 29

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ヒトＭＰ５２の５′上流遺伝子３.５ｋｂの制
限酵素地図。FIG. 1 is a restriction map of 3.5 kb 5 ′ upstream gene of human MP52.

【図２】ヒトＭＰ５２の５′上流遺伝子を含んだ組換え
発現ベクター（pMP52L）。ｐＧＬ３−basicの制限酵素
部位ＨｉｎｄＩIIとＫｐｎＩに配列表配列番号の１から
３２２７番目の塩基（Apal１位）を挿入したもの。FIG. 2 shows a recombinant expression vector (pMP52L) containing a 5 ′ upstream gene of human MP52. The one obtained by inserting the 1st to 3227th base (Apal position 1) of SEQ ID NO: 1 into the restriction enzyme sites HindII and KpnI of pGL3-basic.

【図３】ヒトＭＰ５２プロモーター活性の測定（一過性
発現）の結果である。図中、ｐＧＬ３ＢとはｐＧＬ３−
basicのことである。FIG. 3 shows the results of measurement (transient expression) of human MP52 promoter activity. In the figure, pGL3B is pGL3-
Basic.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ゲルトルート・ヘツテン ドイツ連邦共和国デー−69245バメンター ル．ヴアインヴイーゼンヴエーグ17 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA80 CA01 CA04 CA07 CA09 CA20 DA03 EA03 EA04 FA01 FA02 FA10 GA11 GA13 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ10 QQ22 QQ42 QR32 QR33 QR52 QR56 QR60 QR62 QR77 QR80 QS11 QS25 QS34 QS38 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 BB37 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA012 ZA362 ZA962 ZB262 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12N 5/10 C12R 1:91) (72) Inventor Gerd Lud Hetten Germany Day-69245 Bamentar. Veinweisenweg 17 F term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA21 BA80 CA01 CA04 CA07 CA09 CA20 DA03 EA03 EA04 FA01 FA02 FA10 GA11 GA13 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ10 QQ22 QQ42 QR32 QR33 QR52 QR56 QR60 QS32 QS80 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 BB37 CA24 CA44 CA46 4C084 AA17 ZA012 ZA362 ZA962 ZB262

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列表配列番号１において、１番から３
５２１番までの塩基配列を有するヒトＭＰ５２遺伝子プ
ロモーター領域を含んだＤＮＡ、またはそれらの断片。1. The sequence listing SEQ ID NO: 1 from 1 to 3
DNA containing a human MP52 gene promoter region having a nucleotide sequence of up to 521, or a fragment thereof. 【請求項２】 配列表配列番号１において、１番から２
８７９番までの塩基配列を有するヒトＭＰ５２遺伝子プ
ロモーター領域を含んだＤＮＡ、またはそれらの断片。2. In the sequence listing SEQ ID NO.
DNA containing a human MP52 gene promoter region having a nucleotide sequence up to position 879, or a fragment thereof. 【請求項３】 配列表配列番号１のＤＮＡを下記の順に
より製造する方法。 (１) 縮重プライマーを用いたＰＣＲによるｃＤＮＡプ
ローブの作製、 (２) プローブによる、ヒトゲノムファージライブラリ
ーのプラークハイブリダイゼーションスクリーニング、 (３) 単離されたファージからの目的断片のサブクロー
ニング。3. A method for producing DNA of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing in the following order. (1) Preparation of a cDNA probe by PCR using degenerate primers; (2) Plaque hybridization screening of a human genomic phage library using the probe; and (3) Subcloning of a target fragment from an isolated phage. 【請求項４】 配列表配列番号１のＤＮＡの全長、ある
いは一部をレポーター遺伝子に組み込まれていることを
特徴とする組換え発現ベクター。4. A recombinant expression vector wherein the full length or a part of the DNA of SEQ ID NO: 1 is incorporated into a reporter gene. 【請求項５】 請求項４の組換え発現ベクターを用いて
なることを特徴とする有用物質の探索方法。5. A method for searching for a useful substance, which comprises using the recombinant expression vector according to claim 4. 【請求項６】 有用物質が骨関連物質である請求項５の
探索方法。6. The search method according to claim 5, wherein the useful substance is a bone-related substance. 【請求項７】 骨関連物質が骨形成誘導物質である請求
項６の探索方法。7. The method according to claim 6, wherein the bone-related substance is an osteogenesis-inducing substance. 【請求項８】 骨関連物質が骨形成阻害物質である請求
項６の探索方法。8. The method according to claim 6, wherein the bone-related substance is a bone formation inhibitor. 【請求項９】 有用物質が神経形成物質である請求項５
の探索方法。9. The useful substance is a neurogenic substance.
Search method. 【請求項１０】 有用物質が血管新生物質である請求項
５の探索方法。10. The method according to claim 5, wherein the useful substance is an angiogenic substance. 【請求項１１】 有用物質が血管新生阻害物質である請
求項５の探索方法。11. The method according to claim 5, wherein the useful substance is an angiogenesis inhibitor.