ITVI20110310A1 - COMBINATORIAL COATING INCLUDING TWO CHEMICAL PROTEINS TO INCREASE THE ATTRACTION OF ENDOTELIAL CELLS AND ENDOTHIAL PROGENITRIC CELLS ON A METALLIC SURFACE - Google Patents
COMBINATORIAL COATING INCLUDING TWO CHEMICAL PROTEINS TO INCREASE THE ATTRACTION OF ENDOTELIAL CELLS AND ENDOTHIAL PROGENITRIC CELLS ON A METALLIC SURFACE Download PDFInfo
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Description
RIVESTIMENTO COMBINATORIO COMPRENDENTE DUE PROTEINE CHIMERICHE PER AUMENTARE L'ATTRAZIONE DI CELLULE ENDOTELIALI E CELLULE PROGENITRICI ENDOTELIALI SU UNA COMBINATORY COATING INCLUDING TWO CHEMERIC PROTEINS TO INCREASE THE ATTRACTION OF ENDOTHELIAL AND ENDOTHELIAL PROGENITRIC CELLS ON ONE
SUPERFICIE METALLICA METALLIC SURFACE
La presente invenzione riguarda un rivestimento combinatorio comprendente due proteine chimeriche per aumentare l’attrazione di cellule endoteliali e cellule progenitrici endoteliali su una superficie metallica. In particolare, la presente invenzione riguarda un rivestimento combinatorio comprendente due proteine chimeriche per aumentare l’attrazione di cellule endoteliali e cellule progenitrici endoteliali su una superficie metallica per la prevenzione di restenosi e trombosi in-stent, evitando la necessità di somministrazione a lungo termine delle terapie anti-piastrine. The present invention relates to a combinatorial coating comprising two chimeric proteins to increase the attraction of endothelial cells and endothelial progenitor cells on a metal surface. In particular, the present invention relates to a combinatorial coating comprising two chimeric proteins to increase the attraction of endothelial cells and endothelial progenitor cells on a metal surface for the prevention of restenosis and in-stent thrombosis, avoiding the need for long-term administration. anti-platelet therapies.
La malattia coronarica à ̈ la principale causa di morte in tutto il mondo. Questo à ̈ stato attribuito a numerosi meccanismi patologici che si verificano in corrispondenza della parete vasale a causa di danni sia locali che sistemici: la saturazione della cellula endoteliale da parte di particelle di grasso, meccanismi immunitari, stati patologici legati all'età e le reazioni infiammatorie, ma il meccanismo finale comune à ̈ attribuito ad una disfunzione della cellula endoteliale. Coronary heart disease is the leading cause of death worldwide. This has been attributed to numerous pathological mechanisms that occur at the vessel wall due to both local and systemic damage: saturation of the endothelial cell by fat particles, immune mechanisms, age-related pathological states and reactions inflammatory, but the final common mechanism is attributed to endothelial cell dysfunction.
Cellule endoteliali disfunzionali portano all’accumulazione di composti grassi dovuti alle loro alterazioni del metabolismo ed al turn-over all'interno delle cellule di rivestimento endoteliale. Dysfunctional endothelial cells lead to the accumulation of fatty compounds due to their alterations in metabolism and to the turn-over inside the endothelial lining cells.
I macrofagi attivati reclutati per pulire questi materiali inutilizzati, sono causa di un’infiammazione fin all’inizio ed anche in seguito. Questo porta ad un accumulo di irregolarità nella cellula endoteliale. Questo circolo vizioso favorisce un ulteriore disturbo nella funzione delle cellule endoteliali e favorisce anche la crescita di placche aterosclerotiche. The activated macrophages recruited to clean these unused materials are the cause of inflammation from the very beginning and even afterwards. This leads to an accumulation of irregularities in the endothelial cell. This vicious circle promotes further disturbance in endothelial cell function and also promotes the growth of atherosclerotic plaques.
Il meccanismo principale relativo ad eventi coronarici acuti à ̈ dovuto alla rottura di una placca aterosclerotica preesistente all'interno della parete del vaso. In generale, le placche con un nucleo grasso importante e le piccole capsule fibrose sono estremamente vulnerabili a rottura. The main mechanism related to acute coronary events is due to the rupture of a pre-existing atherosclerotic plaque within the vessel wall. In general, plaques with a large fatty core and small fibrous capsules are extremely vulnerable to rupture.
Delle condizioni di stress impongono un grande sforzo sulla parete indebolita dei vasi e di conseguenza si verifica una sindrome coronarica acuta. Stressful conditions place a great deal of strain on the weakened vessel wall and as a result an acute coronary syndrome occurs.
Per il trattamento di patologie acute e croniche delle arterie coronarie, sono attualmente utilizzati in tutto il mondo interventi percutanei. La procedura più scelta per il trattamento delle complicanze delle placche aterosclerotiche, come la rottura della placca, à ̈ l'impianto di uno stent (diretto o indiretto). Percutaneous interventions are currently used worldwide for the treatment of acute and chronic coronary artery disease. The most preferred procedure for treating complications of atherosclerotic plaques, such as plaque rupture, is the implantation of a stent (direct or indirect).
Sostanziali progressi sono stati compiuti nel campo della progettazione e applicazione dello stent, attraverso l'osservazione di inconvenienti che si verificano durante una angioplastica intravascolare con palloncino. Substantial progress has been made in the field of stent design and application, through the observation of problems that occur during an intravascular balloon angioplasty.
Nonostante le indubbie benefiche applicazioni dello stent nel trattamento delle ostruzioni acute e croniche dei vasi coronarici e periferici, la restenosi intrastent à ̈ il grande ostacolo per ottenere una pervietà vasale ottimale. Questo problema à ̈ più frequente con stent di metallo nudo, mentre il tasso di restenosi intrastent risulta ridotta in caso di installazione di stent medicati. La restenosi intrastent à ̈ dovuta principalmente alla proliferazione e alla migrazione delle cellule muscolari lisce allo strato intimale di una parete del vaso. Despite the undoubtedly beneficial applications of the stent in the treatment of acute and chronic obstructions of the coronary and peripheral vessels, intrastent restenosis is the great obstacle to obtaining optimal vascular patency. This problem is more common with bare metal stents, while the intrastent restenosis rate is reduced with the installation of drug-eluting stents. Intrastent restenosis is mainly due to the proliferation and migration of smooth muscle cells to the intimal layer of a vessel wall.
L'attivazione del sistema immunitario contro lo stent come un corpo estraneo porta alla formazione di iperplasia neo-intimale. Lo strato neo-intimale costruito limita la pervietà vascolare a seguito dei trattamenti endovascolari. Activation of the immune system against the stent as a foreign body leads to the formation of neo-intimal hyperplasia. The constructed neo-intimal layer limits vascular patency following endovascular treatments.
L’uso di stent medicati, o di stent a eluizione di Serolimus e Pacitaxle, diminuisce la restenosi dello stent, in quanto induce un arresto del ciclo cellulare, tuttavia questo avviene a scapito di una maggiore possibilità di trombosi in-stent (precoce o tardiva). The use of medicated stents, or Serolimus and Pacitaxle eluting stents, decreases the restenosis of the stent, as it induces a cell cycle arrest, however this occurs at the expense of a greater possibility of in-stent thrombosis (early or late).
Le trombosi da stent si manifestano più spesso con dolore toracico acuto a causa di un infarto miocardico acuto. Pertanto, per evitare questa triste eventualità , si garantisce una doppia terapia antipiastrinica a lungo termine. Stent thrombosis most often occurs with acute chest pain due to acute myocardial infarction. Therefore, to avoid this sad eventuality, a long-term double antiplatelet therapy is guaranteed.
Questa doppia terapia anti-piastrinica risulta associate a un maggior rischio di emorragie maggiori e minori; in particolare, al momento del bisogno emergente, di un intervento chirurgico. This dual anti-platelet therapy is associated with an increased risk of major and minor bleeding; in particular, at the time of the emerging need, for a surgical intervention.
La cessazione della somministrazione dei due agenti anti-piastrinici prima di un’operazione chirurgica predispone il paziente a insorgenza di trombosi dello stent. The cessation of the administration of the two anti-platelet agents before a surgical operation predisposes the patient to the onset of stent thrombosis.
La causa principale di trombosi da stent dopo un impianto di stent medicati à ̈ il loro effetto naturale, considerato come arresto del ciclo cellulare endoteliale. The main cause of stent thrombosis after drug-eluting stenting is their natural effect, considered to be endothelial cell cycle arrest.
L’apoptosi della cellula endoteliale, indotta dai farmaci rilasciati dallo stent, porta alla generazione di uno strato scoperto, in corrispondenza del sito di denudazione che viene indotta dallo stent. The apoptosis of the endothelial cell, induced by the drugs released by the stent, leads to the generation of an uncovered layer, at the denudation site that is induced by the stent.
Questo porta all’esposizione di una superficie trombogena, che attira piastrine attivate. This leads to the exposure of a thrombogenic surface, which attracts activated platelets.
Le piastrine reclutate, dopo l'attivazione avvenuta da parte dello strato di collagene trombogeno, suscitano una cascata coagulativa. The recruited platelets, after activation by the thrombogenic collagen layer, elicit a coagulation cascade.
Recentemente, le nuove strategie terapeutiche si basano sull’attacco alle cellule muscolari lisce per prevenire la loro proliferazione, impedire l'attivazione delle piastrine e promuovere l’attrazione delle cellule endoteliali e delle cellule progenitrici endoteliali (EPC). Recently, new therapeutic strategies have been based on attacking smooth muscle cells to prevent their proliferation, prevent platelet activation and promote the attraction of endothelial cells and endothelial progenitor cells (EPCs).
Questo approccio a più fasi dovrebbe avvenire simultaneamente per ottenere la pervietà ottimale dei vasi e diminuire sia la restenosi in-stent sia la trombosi. This multi-step approach should take place simultaneously to achieve optimal vessel patency and decrease both in-stent restenosis and thrombosis.
In questo contesto, alcuni sviluppi tecnici hanno permesso di progredire in questo campo, come la coltivazione delle cellule. In this context, some technical developments have made it possible to progress in this field, such as cell cultivation.
L’espansione ex vivo delle cellule endoteliali ed EPC rappresenta un nuovo approccio potenziale. Tuttavia, la scarsa accumulazione locale delle cellule infuse e i meccanismi ignoti che sono responsabili per il loro posizionamento hanno limitato la loro applicazione clinica. The ex vivo expansion of endothelial and EPC cells represents a new potential approach. However, the poor local accumulation of the infused cells and the unknown mechanisms that are responsible for their positioning have limited their clinical application.
Lo stesso obiettivo à ̈ stato recentemente ottenuto utilizzando uno stent rivestito con un anticorpo monoclonale anti-CD34, anche conosciuto come EPC-capture stent (Brevetto n. US 7.803.183). Questo stent accelera la cattura di EPC per la generazione di uno strato funzionale, che copre la superficie danneggiata della parete del vaso, che si era creata a causa della denudazione dello stent, in corrispondenza del sito precedentemente danneggiato da placche ateromatose. The same goal has recently been achieved using a stent coated with an anti-CD34 monoclonal antibody, also known as EPC-capture stent (Patent No. US 7,803,183). This stent accelerates the capture of EPC to generate a functional layer, which covers the damaged surface of the vessel wall, which was created due to the denudation of the stent, at the site previously damaged by atheromatous plaques.
Questa pronto endotelializzazione va a compensare i danni indotti dallo stent, in favore di una minore possibilità di trombosi dello stent. This prompt endothelialization compensates for the damage induced by the stent, in favor of a lower chance of stent thrombosis.
Lo strato benefico fornito da questo stent ha spianato la strada alla migliore pervietà del vaso dopo un impianto di stent, senza la necessità della doppia terapia antipiastrinica. Nel caso della chirurgia d’emergenza, non si impone un rischio maggiore per il paziente. The beneficial layer provided by this stent paved the way for improved vessel patency after stenting, without the need for dual antiplatelet therapy. In the case of emergency surgery, there is no greater risk for the patient.
Ma il problema principale rimasto à ̈ l’applicazione dell’anticorpo. But the main problem that remains is the application of the antibody.
L’attrazione delle cellule con l’anticorpo CD34 significa l’attrazione di un intero gruppo di cellule CD34-positive verso il sito in cui à ̈ impiantato lo stent. L’anticorpo CD34 à ̈ un marcatore per le cellule staminali ematopoietiche, le cellule staminali mesenchimali e le cellule albero. The attraction of the cells with the CD34 antibody means the attraction of a whole group of CD34-positive cells towards the site where the stent is implanted. The CD34 antibody is a marker for hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells and mast cells.
Alcune di queste cellule reclutate potrebbero esercitare effetti sfavorevoli sul risultato dello stent installato, come le cellule staminali mesenchimali, che sono i precursori delle cellule muscolari lisce, le principali cause di iperplasia neointimale coinvolti nella restenosi in-stent. Some of these recruited cells could have adverse effects on the outcome of the installed stent, such as mesenchymal stem cells, which are the precursors of smooth muscle cells, the main causes of neointimal hyperplasia involved in in-stent restenosis.
Infatti, i mastociti partecipano alle reazioni infiammatorie dopo un impianto di stent, con conseguente diminuzione dei risultati. In fact, mast cells participate in inflammatory reactions after a stent implantation, resulting in decreased results.
Un altro svantaggio di questi stent à ̈ l'applicazione di anticorpi umanizzati murini che attiva il sistema immunitario contro questi anticorpi e porta alla generazione di anticorpi contro questa proteina murina. Another disadvantage of these stents is the application of mouse humanized antibodies which activates the immune system against these antibodies and leads to the generation of antibodies against this mouse protein.
La generazione di questi anticorpi potrebbe portare ad una infiammazione promossa a causa di reazioni antigene-anticorpo con probabili svantaggi per gli esiti finali. The generation of these antibodies could lead to a promoted inflammation due to antigen-antibody reactions with probable disadvantages for the final outcomes.
Alla luce di quanto sopra, à ̈ evidente la necessità di fornire nuovi metodi per la prevenzione della restenosi in-stent, che siano in grado di superare gli svantaggi dei metodi conosciuti. In light of the above, it is evident the need to provide new methods for the prevention of in-stent restenosis, which are able to overcome the disadvantages of the known methods.
Le cellule EPC costituiscono una rara popolazione di cellule in circolo, partecipanti all’angiogenesi, alla vasculogenesi ed alle riparazioni delle pareti dei vasi sanguigni danneggiati, per mezzo della differenziazione delle cellule del rivestimento endoteliale. EPC cells constitute a rare population of circulating cells, participating in angiogenesis, vasculogenesis and repair of damaged blood vessel walls by means of the differentiation of cells of the endothelial lining.
Le cellule EPCs esprimono marcatori progenitori/endoteliali (CD34, fattore di von Willebrand, fattore di crescita vascolare endoteliale del recettore-2 e vascolare endoteliale caderina). Queste cellule proliferanti assorbono lipoproteine a bassa densità di acetilato, si legano alla Ulexlectina ed a marcatori con mancanza dei monociti/leucociti (CD14, P-selectina ligando della glicoproteina-1, L-selectina). EPCs cells express progenitor / endothelial markers (CD34, von Willebrand factor, vascular endothelial receptor growth factor-2 and vascular endothelial cadherin). These proliferating cells absorb low-density acetylated lipoproteins, bind to Ulexlectin and to monocyte / leukocyte deficient markers (CD14, P-selectin glycoprotein-1 ligand, L-selectin).
Le EPC mobilitate tornano verso le regioni ischemiche e stimolano l'angiogenesi e la riparazione del rivestimento dei vasi sanguigni danneggiati durante l'attacco cardiaco, per mezzo dell’espressione di varie citochine e fattori di crescita. The mobilized EPCs return to the ischemic regions and stimulate angiogenesis and repair of the lining of blood vessels damaged during the heart attack, by means of the expression of various cytokines and growth factors.
Le EPC sono considerate come un potenziale trattamento per varie malattie cardiovascolari. EPCs are considered as a potential treatment for various cardiovascular diseases.
Le cellule endoteliali, che rivestono un sottile strato di endotelio in corrispondenza della superficie interiore di vasi sanguigni, costituiscono un'interfaccia tra il sangue circolante nel lume e quello negli altri segmenti della parete vasale. Endothelial cells, which line a thin layer of endothelium at the inner surface of blood vessels, form an interface between the blood circulating in the lumen and that in the other segments of the vessel wall.
Queste cellule rivestono l'intero sistema circolatorio, dal cuore alle più piccole arteriole. Le cellule endoteliali riducono la turbolenza del flusso di sangue, in modo che il sangue possa essere pompato più lontano. These cells line the entire circulatory system, from the heart to the smallest arterioles. The endothelial cells reduce the turbulence of the blood flow, so that the blood can be pumped farther.
Le cellule endoteliali sane forniscono una superficie non-trombogenica a causa della presenza di solfato di eparan, che agisce come cofattore per l'antitrombina III. Healthy endothelial cells provide a non-thrombogenic surface due to the presence of heparan sulfate, which acts as a cofactor for antithrombin III.
Le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante in molti aspetti della biologia vascolare. Le cellule endoteliali funzionali creano una barriera selettiva tra il lume vasale e i tessuti circostanti. Le cellule endoteliali partecipano alla formazione di nuovi vasi sanguigni (angiogenesi). Endothelial cells play an important role in many aspects of vascular biology. Functional endothelial cells create a selective barrier between the vessel lumen and surrounding tissues. Endothelial cells participate in the formation of new blood vessels (angiogenesis).
Uno dei marcatori selettivi per l’attrazione delle cellule endoteliali e delle loro cellule progenitrici à ̈ la L-selectina. One of the selective markers for the attraction of endothelial cells and their progenitor cells is L-selectin.
La L-selectina (CD62L) à ̈ una glicoproteina di adesione alla superficie della cellula della famiglia delle selectine delle proteine recettrici di adesione/ritorno. La L-selectina à ̈ anche conosciuta come Leu-8, nodo antigene MEL-14, dreg e la linfa del recettore di homing. L-selectin (CD62L) is a cell surface adhesion glycoprotein of the selectin family of adhesion / return receptor proteins. L-selectin is also known as Leu-8, MEL-14 antigen node, dreg and homing receptor lymph.
Due forme principali di questa glicoproteina sono conosciute grazie alla modificazione posttrascrizionale del gene situato sul cromosoma 1. È composto da un dominio omologo di lectine, una a fattore di crescita epidermico e da due domini di unità di ripetizione del consenso che sono stati trovati nelle proteine C3/C4-binding. Two main forms of this glycoprotein are known due to the post-transcriptional modification of the gene located on chromosome 1. It is composed of a homologous domain of lectins, an epidermal growth factor and two domains of repeat consensus units that have been found in proteins C3 / C4-binding.
Nella parte N-terminale della molecola trans-membrana che si trova nella superficie esterna della proteina, vi à ̈ un dominio di carboidrati vincolante. La Lselectina si esprime sulla superficie di leucociti e svolge un ruolo importante nelle interazioni leucociti-cellula endoteliale. Il suo ligando à ̈ espresso sulle cellule endoteliali. In the N-terminal part of the trans-membrane molecule found in the outer surface of the protein, there is a binding carbohydrate domain. Lselectin is expressed on the surface of leukocytes and plays an important role in leukocyte-endothelial cell interactions. Its ligand is expressed on endothelial cells.
Riconosce domini di carboidrati sialilati ed esercita un grande ruolo nell’attaccamento dei leucociti alle cellule endoteliali. Sebbene la funzione di frazioni di sialomucin all'interno della proteina L-selectina sia rimasta elusiva, ha aumentato la proliferazione, ha inibito la differenziazione e si propone di giocare un ruolo pro-adesivo, come il loro agire con le funzioni principali di un ligando di L-selectina pro-adesiva. It recognizes syalylated carbohydrate domains and plays a great role in the attachment of leukocytes to endothelial cells. Although the function of sialomucin fractions within the L-selectin protein remained elusive, it increased proliferation, inhibited differentiation, and is proposed to play a pro-adhesive role, such as their acting with the main functions of a ligand. of pro-adhesive L-selectin.
Il gruppo principale di riduzione dei ligandi di L-selectina à ̈ Sialyl 6-sulfo Lewis X. Per l'attività legante, la N-acetilglucosamina (GlcNAc) a 6-solfatazione, che à ̈ catalizzata da GlcNAc 6-O-sulfotransferasi (GlcNAc6STs), à ̈ essenziale. La L-selectina porta alla homing delle cellule attraverso l'interazione ligando-target. The main L-selectin ligand-reducing group is Sialyl 6-sulfo Lewis X. For the binding activity, 6-sulfation N-acetylglucosamine (GlcNAc), which is catalyzed by GlcNAc 6-O-sulfotransferase ( GlcNAc6STs), it is essential. L-selectin leads to cell homing through ligand-target interaction.
La L-selectina migliora l’alloggiamento vascolare delle EPC all'interno dei siti di espressione legante di selectina per mezzo di meccanismi tipici di adesione dei leucociti. L-selectin improves the vascular housing of EPCs within selectin binding expression sites by means of typical leukocyte adhesion mechanisms.
Questa molecola si lega al suo ligando sulla superficie della cellula endoteliale e delle EPC con la co-presenza di L-selectina e marcatori di lignaggio endoteliale. This molecule binds to its ligand on the surface of the endothelial cell and EPCs with the co-presence of L-selectin and endothelial lineage markers.
Uno dei suoi ligandi obiettivo à ̈ il CD34, un sialomucin fortemente glicosilato di tipo I con molecola trans-membrana. Il CD34, che à ̈ sulla superficie di entrambe le cellule, endoteliali ed EPC, funge da legante per la L-selectina. One of its target ligands is CD34, a highly glycosylated type I sialomucin with a trans-membrane molecule. CD34, which is on the surface of both endothelial and EPC cells, acts as a binder for L-selectin.
L’intrappolamento delle cellule e la loro cattura con la proteina L-selectina attrae le cellule che esprimono CD34 portatrici di un ligando di L-selectina. È interessante notare che non tutte le cellule CD34-positive esprimono un ligando di L-selectina. Il CD34 sulla superficie di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPCs) non à ̈ un ligando per la L-selectina. Cell entrapment and their capture with the L-selectin protein attracts CD34-expressing cells carrying an L-selectin ligand. Interestingly, not all CD34-positive cells express an L-selectin ligand. CD34 on the surface of hematopoietic stem / progenitor cells (HSPCs) is not a ligand for L-selectin.
Come già accennato, negli studi precedenti, alcuni ricercatori hanno usato proteine chimera CD34-Fc, che sono state ricavate da Murine, al fine di rivestire stent per il cuore. As mentioned, in previous studies, some researchers used CD34-Fc chimera proteins, which were derived from Murine, in order to coat stents for the heart.
Anche se questi stent ora sono disponibili e diventati commerciali, tuttavia il frammento Fc delle proteine rivestite à ̈ ricavato da risorse non-umane, per cui esso può generare reazioni nel paziente ricevente. Inoltre, nei loro studi, hanno usato alcuni strati di collegamento per collegare lo strato di antigene e poi hanno usato il frammento Fab per legarsi agli strati Ag. Although these stents are now available and commercial, however, the Fc-coated protein fragment is sourced from non-human resources, so it can generate reactions in the recipient patient. Also, in their studies, they used some linking layers to connect the antigen layer and then used the Fab fragment to bind to the Ag layers.
L’utilizzo dello strato Fab per l'attacco sembra essere specifico, ma con bassa affinità aderenza. Le interazioni di Fab-antigeni sono legami nonelettrostatici per lo più deboli, come l'idrogeno o il legame di van der Waals. D'altra parte, utilizzando tamponi diversi e differenti soluzioni di lavaggio durante la preparazione di stent influenza tali legami Fab-antigene. The use of the Fab layer for the binding appears to be specific, but with low affinity for grip. The interactions of Fab-antigens are mostly weak non-electrostatic bonds, such as hydrogen or the van der Waals bond. On the other hand, using different buffers and different washing solutions during stent preparation affects these Fab-antigen bonds.
Un altro approccio per la costruzione di uno strato difensivo funzionale endoteliale à ̈ l’attrazione di cellule endoteliali vicine e il serraggio delle giunzioni tra le cellule endoteliale desquamate. Another approach for building a functional endothelial defensive layer is the attraction of neighboring endothelial cells and the tightening of the junctions between desquamated endothelial cells.
Una di queste proteine à ̈ la caderina Vascolare Endoteliale (VE-caderina), CD144 o Caderina 5, che fa parte della grande famiglia di adesione cellulare nota anche come Caderine. Le Caderine sono molecole trans-membrana con azioni calcio-dipendenti. One of these proteins is Vascular Endothelial Cadherin (VE-cadherin), CD144 or Cadherin 5, which is part of the large cell adhesion family also known as Cadherin. Cadherins are trans-membrane molecules with calcium-dependent actions.
La VE-caderina, la caderina classica della superfamiglia delle Caderine, si trova in un grappolo di sei in una regione sul cromosoma 16. La VE-caderina à ̈ una glicoproteina ad adesione cellulacellula calcio-dipendente, in grado di aderire in maniera omofila. VE-cadherin, the classic cadherin of the cadherin superfamily, is found in a cluster of six in a region on chromosome 16. VE-cadherin is a calcium-dependent cell adhesion glycoprotein, capable of adhering homophilically.
Nella loro regione C-terminale, queste proteine sono collegate a tre tipi di Cathenine (α, β e γ). Questo collegamento fornisce un collegamento tra le Caderine e lo scheletro intracellulare. In their C-terminal region, these proteins are linked to three types of Cathenine (Î ±, β and γ). This link provides a link between the caderins and the intracellular skeleton.
In assenza di questo legame, la Caderina non può agire come una molecola adesiva. Le Caderine rivestono un ruolo importante durante lo sviluppo, l'organogenesi, la vasculogenesi e l’angiogenesi. In the absence of this bond, Cadherin cannot act as an adhesive molecule. Cadherins play an important role during development, organogenesis, vasculogenesis and angiogenesis.
La parte extracellulare N-terminale della proteina possiede domini ripetitivi di DXD DXNDN e che sono responsabili di legami calcio-dipendenti. Poi, si trovano domini trans-membrana e carbossilici legati alle proteine Cathenine. The N-terminal extracellular part of the protein possesses DXD and DXNDN repetitive domains which are responsible for calcium-dependent bonds. Then, trans-membrane and carboxylic domains bound to Cathenine proteins are found.
La VE-caderina umana viene trascritta come 784 aminoacidi. In proteina matura si ripetono cinque caderine extracellulari, la regione trans-membrana e la coda carbossilica citoplasmatica posse 546, 27 e 164 aminoacidi, rispettivamente. La VE-caderina à ̈ considerata come un marcatore endoteliale specifico o un marcatore di lignaggio endoteliale. Human VE-cadherin is transcribed as 784 amino acids. Five extracellular cadherins are repeated in mature protein, the trans-membrane region and the cytoplasmic carboxylic tail possess 546, 27 and 164 amino acids, respectively. VE-cadherin is considered to be a specific endothelial marker or an endothelial lineage marker.
Il suo ligando à ̈ la VE-caderina, un’altra VE-caderina posizionata sulla cellula endoteliale adiacente e nella circolazione EPC. Effettua realmente una selezione delle cellule endoteliali e stringe le loro giunzioni. Questa proteina à ̈ importante per la biologia della cellula endoteliale e per il mantenimento di una barriera restrittiva endoteliale attraverso la regolamentazione della coesione e l'organizzazione delle giunzioni intercellulari. La giunzione ad aderenza basata sulla VE-caderina à ̈ necessaria per il corretto sviluppo vascolare, mantenendo i vasi neoformati e mantenendo l'integrità delle giunzioni intercellulari. Its ligand is VE-cadherin, another VE-cadherin positioned on the adjacent endothelial cell and in the EPC circulation. It actually carries out a selection of endothelial cells and tightens their junctions. This protein is important for the biology of the endothelial cell and for the maintenance of a restrictive endothelial barrier through the regulation of cohesion and organization of intercellular junctions. The VE-cadherin-based adherence junction is necessary for proper vascular development, maintaining the newly formed vessels and maintaining the integrity of the intercellular junctions.
Gli autori della presente invenzione ora hanno preparato un metallo titanio da L-selectina e molecole chimera VE-caderina in grado di reclutare specificamente cellule endoteliali ed EPC, per evitare l'attacco di piastrine o di cellule staminali mesenchimali e le reazioni infiammatorie. The authors of the present invention have now prepared a titanium metal from L-selectin and VE-cadherin chimera molecules capable of specifically recruiting endothelial and EPC cells, to avoid platelet or mesenchymal stem cell attack and inflammatory reactions.
Come già accennato, infatti, la L-selectina à ̈ un marker selettivo per l’attrazione delle cellule endoteliali e delle loro cellule progenitrici. La L-selectina si esprime sulla superficie dei linfociti T-cellula attivati, così i linfociti T-cellulari sono reclutati verso cellule endoteliali utilizzando un ligando di L-selectina e non la proteina L-selectina. La proteina L-selectina intrappola le cellule endoteliali ed EPC che sono attratti dal ligando di L-selectina sulla loro superficie. As already mentioned, in fact, L-selectin is a selective marker for the attraction of endothelial cells and their progenitor cells. L-selectin is expressed on the surface of activated T-cell lymphocytes, so T-cell lymphocytes are recruited to endothelial cells using an L-selectin ligand and not the L-selectin protein. The L-selectin protein traps endothelial and EPC cells that are attracted to the L-selectin ligand on their surface.
In questo modo, non si sarebbe verificata nessuna reazione infiammatoria e solo le cellule endoteliali e le loro progenitrici saranno attratte sulla superficie dello stent impiantato. La L-selectina non à ̈ un "recettore homing" di cellule staminali mesenchimali, e questo à ̈ un punto a favore della prevenzione di restenosi. In this way, no inflammatory reaction would occur and only the endothelial cells and their progenitors will be attracted to the surface of the implanted stent. L-selectin is not a "homing receptor" of mesenchymal stem cells, which is a point in favor of restenosis prevention.
La VE-caderina à ̈ in grado di reclutare le cellule endoteliali vicine e di serrare le giunzioni tra le cellule endoteliali desquamate. Le cellule endoteliali vicine sono in grado di risolvere tale difetto sulla parete dei vasi causato da un impianto di stent. VE-cadherin is able to recruit neighboring endothelial cells and tighten the junctions between desquamated endothelial cells. Neighboring endothelial cells are able to resolve this defect on the vessel wall caused by a stent implant.
A dispetto dell’aumento di attrazione delle cellule desiderate, la superficie candidata potrebbe avere poca affinità per le piastrine. Il fissaggio delle piastrine alla superficie promuove la formazione di trombi, che diminuisce di conseguenza l'efficacia della superficie per il trattamento endovascolare. È interessante notare che le piastrine non hanno recettori per La VE-caderina e la L-selectina. Despite the increased attraction of the desired cells, the candidate surface may have little affinity for platelets. Fixation of platelets to the surface promotes thrombus formation, which consequently decreases the effectiveness of the surface for endovascular treatment. Interestingly, platelets have no receptors for VE-cadherin and L-selectin.
Le molecole chimera secondo la presente invenzione sono costruite dall’unione delle codifiche delle sequenze di mRNA di parti di L-selectina e VEcaderina relative alla sequenza codificante della regione FC degli anticorpi. Nel terminale carbossilico della molecola o FC si trovano sei residui di istidina, che facilitano il suo fissaggio ai metalli come il titanio e principalmente al nichel. The chimera molecules according to the present invention are constructed by joining the coding of the mRNA sequences of parts of L-selectin and VEcaderin relative to the coding sequence of the FC region of the antibodies. In the carboxy terminus of the molecule or FC there are six histidine residues, which facilitate its attachment to metals such as titanium and mainly to nickel.
Il peso molecolare di queste due chimere à ̈ di circa 100-116 KDa, misurata con il metodo SDS-PAGE. Queste chimere sono generate in linee cellulari di mieloma NSO di topi e disponibili in commercio da R & S. The molecular weight of these two chimeras is approximately 100-116 KDa, measured by the SDS-PAGE method. These chimeras are generated in mouse NSO myeloma cell lines and commercially available from R&D.
Il rivestimento combinatorio di L-selectina e VE-caderina porta all’attrazione di selectina nelle cellule che costituiscono la parete vasale (Cellule endoteliali ed EPC). Questa superficie ritarda l’attrazione di altre cellule sconvenienti come le piastrine e le cellule staminali mesenchimali nel sito di impianto dello stent. The combinatorial coating of L-selectin and VE-cadherin leads to the attraction of selectin in the cells that make up the vessel wall (endothelial cells and EPC). This surface delays the attraction of other inappropriate cells such as platelets and mesenchymal stem cells to the stent implantation site.
Si tratta di una sorta di manipolazione della parete del vaso orientata. It is a kind of manipulation of the oriented vessel wall.
Quindi, la strategia della presente invenzione impedisce la restenosi in-stent e la trombosi e potrebbe bypassare la necessità della prescrizione di aspirina (acido acetilsalicilico) e Plavix (Solfato Clopidogrel) a lungo termine, denominata doppia terapia anti-piastrinica. Il rivestimento dell’invenzione migliora l’attrazione di cellule endoteliali ed EPC al sito della denudazione indotta dello stent, ed à ̈ usato per manipolare la parete del vaso nel modo desiderato al fine di superare le complicazioni dell’impianto dello stent. Thus, the strategy of the present invention prevents in-stent restenosis and thrombosis and could bypass the need for long-term prescription of aspirin (acetylsalicylic acid) and Plavix (Clopidogrel sulphate), called dual anti-platelet therapy. The coating of the invention improves the attraction of endothelial cells and EPCs to the site of induced stent denudation, and is used to manipulate the vessel wall as desired in order to overcome the complications of stent implantation.
Le proteine di fusione Fc giocano un ruolo nella dimerizzazione, riguardo all’emivita in vivo, nell'attivazione del recettore e nell'affinità per il ligando affine. Hanno un vantaggio rispetto ai recettori solubili come molti recettori sono solo funzionali in forma dimerica, il recettore Fc dimerico può simulare la forma attiva e aumentare la sua affinità per il ligando affine. Fc fusion proteins play a role in dimerization, in vivo half-life, receptor activation and affinity for the cognate ligand. They have an advantage over soluble receptors as many receptors are only functional in dimeric form, the dimeric Fc receptor can mimic the active form and increase its affinity for the cognate ligand.
Le proteine chimeriche Fc contengono la glicosilazione specifica per l’uomo e sono adatti agli studi che coinvolgono le proteine e le cellule umane. Possono essere usati per neutralizzare l'attività biologica dei loro ligandi affini in vitro e in vivo. Possono anche essere usati in studi per quantificare l’affinità recettore-ligando con la risonanza plasmonica di superficie. Chimeric Fc proteins contain human-specific glycosylation and are suitable for studies involving human proteins and cells. They can be used to neutralize the biological activity of their related ligands in vitro and in vivo. They can also be used in studies to quantify receptor-ligand affinity with surface plasmon resonance.
Un altro vantaggio delle proteine di fusione Fc à ̈ la capacità di fissaggio alle superfici e ai recettori nel frammento Fc. Per gli studi in vitro le proteine contenenti frammenti Fc mostrano proprietà di connessione superiori a quelle delle proteine immature. D’altra parte, poiché contengono un frammento Fc, i rivestimenti di queste proteine sono più facili e veloci da individuare. Nella routine e nel protocollo a una fase ELISA, per il rilevamento di proteine di fusione Fc, à ̈ possibile utilizzare degli anticorpi anti Fc. Questo punto positivo à ̈ molto importante per la ricerca di possibilità di un protocollo, senza l’utilizzo di anticorpi specifici e di altri materiali. Another advantage of Fc fusion proteins is the ability to attach to surfaces and receptors in the Fc fragment. For in vitro studies, proteins containing Fc fragments show superior connection properties to those of immature proteins. On the other hand, because they contain an Fc fragment, the coatings of these proteins are easier and faster to detect. In the routine and one-step ELISA protocol, anti-Fc antibodies can be used for the detection of Fc fusion proteins. This positive point is very important for the search for the possibility of a protocol, without the use of specific antibodies and other materials.
Inoltre nel rivestimento dell'invenzione, le proteine linker sono ridotte utilizzando delle proteine di fusione Fc. I frammenti linker o le proteine che sono utilizzate per collegare due o più proteine insieme possono portare ad abbassare l’attaccamento o l’attaccamento non specifico, ma poiché le proteine di fusione Fc hanno una singola molecola si attaccano a superfici più forti. Inoltre, le linker possono avere proprietà immunogeniche, e questo porta a un uso limitato di esse per metodi in vivo. Un più stretto fissaggio e l'esistenza di un fissaggio delle linker e della sequenza bersaglio in una singola molecola rende le proteine di fusione Fc più applicabili a studi in vitro e in vivo. Also in the coating of the invention, linker proteins are reduced by using Fc fusion proteins. Linker fragments or proteins that are used to link two or more proteins together can lead to lower attachment or non-specific attachment, but since Fc fusion proteins have a single molecule they attach to stronger surfaces . Furthermore, linkers may have immunogenic properties, which leads to limited use of them for in vivo methods. Tighter fixation and the existence of linker and target sequence fixation in a single molecule makes Fc fusion proteins more applicable to in vitro and in vivo studies.
Il tagging di poli-istidine può essere utilizzato per rilevare interazioni proteinaproteina nello stesso modo come un test pull-down. Proteine His-tag che sono espresse possono essere purificate e individuate facilmente perché la stringa di residui di Istidina si lega a diversi tipi di ioni metallici immobilizzati, tra cui nichel, cobalto, titanio e rame, in condizioni di buffer specifico (domanda di brevetto US 20100160182). Si pensa che questo legame sia elettrostatico, e per questo à ̈ così forte. Polyhistidine tagging can be used to detect protein-protein interactions in the same way as a pull-down test. His-tag proteins that are expressed can be purified and identified easily because the histidine residue string binds to different types of immobilized metal ions, including nickel, cobalt, titanium and copper, under specific buffer conditions (patent application US 20100160182). This bond is thought to be electrostatic, which is why it is so strong.
Come accennato in precedenza, le proteine chimera CD34-Fc derivanti da Murine sono state usate per il rivestimento di stent cardiaci. In confronto, così come l’interazione di antigeni Fab sono per lo più legami non-elettrostatici come quello dell’idrogeno o di van der Waals, queste interazioni sono tanto più deboli rispetto alle interazioni fra His-tag e ioni metallici. D'altra parte, l’uso di buffer diversi e di diverse soluzioni di lavaggio durante la preparazione di questi stent influenza i legami di antigeni Fab. As previously mentioned, murine-derived CD34-Fc chimera proteins have been used for cardiac stent coating. By comparison, just as the interaction of Fab antigens are mostly non-electrostatic bonds such as hydrogen or van der Waals, these interactions are much weaker than the interactions between His-tag and metal ions. On the other hand, the use of different buffers and different washing solutions during the preparation of these stents affects the binding of Fab antigens.
Tutte le proteine e gli anticorpi umanizzati o provenienti da materiale umano sono migliori, avendo meno proprietà di immunogenicità , per cui risultano di interesse nella ricerca e nell’applicazione biomedica. È la prima volta che due proteine di fusione Fc, completamente derivate da materiale umano, hanno rivestito contemporaneamente una superficie metallica. Su queste superfici sono stati effettuati ulteriori studi, quali la rilevazione di procedure di rivestimento con ELISA e test di cellula- cultura. All proteins and antibodies humanized or coming from human material are better, having less properties of immunogenicity, so they are of interest in research and biomedical application. It is the first time that two Fc fusion proteins, completely derived from human material, have coated a metal surface at the same time. Further studies were performed on these surfaces, such as the detection of ELISA coating procedures and cell-culture tests.
Utilizzando le proteine di fusione Fc contenenti residui di His-tag à ̈ possibile raggiungere un maggiore fissaggio di proteine su queste superfici ed una maggiore stabilità , la riduzione degli strati di collegamento, la riduzione nell'uso di immunogeni esterni, l’attaccamento di cellule ai loro recettori rivestiti direttamente sulle superfici e la semplificazione della procedura di preparazione di tali superfici. La superficie secondo la presente invenzione non ha mostrato citotossicità . By using the Fc fusion proteins containing His-tag residues it is possible to achieve greater protein fixation on these surfaces and greater stability, the reduction of the connecting layers, the reduction in the use of external immunogens, the attachment of cells to their receptors coated directly on the surfaces and the simplification of the procedure for preparing those surfaces. The surface according to the present invention showed no cytotoxicity.
È quindi un oggetto specifico della presente invenzione una superficie metallica rivestita con una proteina chimerica umana L-selectina Fc con numero di accesso # P14151 ed una proteina chimerica umana VE-caderina Fc con numero di accesso # P33151. Therefore, a specific object of the present invention is a metal surface coated with a human chimeric protein L-selectin Fc with access number # P14151 and a human chimeric protein VE-cadherin Fc with access number # P33151.
Inoltre, Ã ̈ oggetto della presente invenzione una superficie metallica rivestita con una proteina chimerica umana L-selectina Fc con numero di accesso # P14151 o una proteina chimerica umana VE-caderina Fc con numero di accesso # P33151. Furthermore, the object of the present invention is a metal surface coated with a human chimeric protein L-selectin Fc with access number # P14151 or a human chimeric protein VE-cadherin Fc with access number # P33151.
Quando la superficie metallica à ̈ rivestita con entrambe le proteine chimeriche citate sopra, il rapporto tra detta proteina chimerica L-selectina Fc e detta una proteina chimerica umana VE-caderina Fc sulla superficie metallica può variare da 25:75 a 75:25, preferibilmente, il rapporto à ̈ 50:50. When the metal surface is coated with both chimeric proteins mentioned above, the ratio between said chimeric protein L-selectin Fc and said human chimeric protein VE-cadherin Fc on the metal surface can range from 25:75 to 75:25, preferably , the ratio is 50:50.
La superficie metallica può essere fatta di titanio, nichel, cobalto, rame, preferibilmente titanio, grazie alle sue proprietà bioinerti. In particolare, la superficie metallica può essere la superficie di un dispositivo medico, come ad esempio uno stent. The metal surface can be made of titanium, nickel, cobalt, copper, preferably titanium, thanks to its bio-inert properties. In particular, the metal surface can be the surface of a medical device, such as a stent.
È un ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo di preparazione della superficie metallica come definito sopra, detto metodo comprendendo o essendo costituito delle seguenti fasi: a) contattare la superficie metallica con una soluzione di proteina chimerica umana L-selectina Fc con numero di accesso #P14151 e / o una proteina chimerica umana VE-caderina Fc con numero di accesso #P33151, b) incubazione per un periodo adeguato ad ottenere il rivestimento; c) risciacquo con una soluzione tampone. Per quanto riguarda il tempo di incubazione, gli inventori hanno utilizzato il tempo di routine per il rivestimento ELISA (2 ore in tampone carbonato a temperatura ambiente o l'incubazione, durante la notte in PBS a 4 ° C). Tuttavia, il tempo di incubazione per ottenere il rivestimento può essere facilmente trovato da una qualsiasi persona qualificata, secondo un metodo di prova ed errore. Gli inventori hanno trovato che non vi era alcuna differenza significativa tra periodi di tempo di incubazione di 1, 2, 4, 8 e 24 ore. A further object of the present invention is a method for preparing the metal surface as defined above, said method comprising or consisting of the following steps: a) contacting the metal surface with a solution of human chimeric protein L-selectin Fc with access number # P14151 and / or a human chimeric protein VE-cadherin Fc with access number # P33151, b) incubation for an appropriate period to obtain the coating; c) rinsing with a buffer solution. Regarding the incubation time, the inventors used the routine time for the ELISA coating (2 hours in carbonate buffer at room temperature or incubation, overnight in PBS at 4 ° C). However, the incubation time for obtaining the coating can easily be found by any qualified person according to a trial and error method. The inventors found that there was no significant difference between incubation time periods of 1, 2, 4, 8 and 24 hours.
La soluzione della fase a) può ulteriormente comprendere degli ioni calcio. Preferibilmente, la concentrazione di tali proteine chimeriche umane L-selectina Fc e la concentrazione di tali proteine chimeriche umane VE-caderina Fc nella soluzione della fase a) à ̈ di 50 ng/ml o superiore a 50 ng/ml. Il rapporto tra la concentrazione di dette proteine chimeriche umane L-selectina Fc e la concentrazione di tali proteine chimeriche umane VE-caderina Fc nella soluzione della fase a) può variare da 25:75 a 75:25, preferibilmente il rapporto à ̈ di 50:50. The solution of step a) may further include calcium ions. Preferably, the concentration of such human chimeric proteins L-selectin Fc and the concentration of such human chimeric proteins VE-cadherin Fc in the solution of step a) is 50 ng / ml or higher than 50 ng / ml. The ratio between the concentration of said human chimeric proteins L-selectin Fc and the concentration of such human chimeric proteins VE-cadherin Fc in the solution of step a) can vary from 25:75 to 75:25, preferably the ratio is 50 : 50.
Inoltre, la presente invenzione riguarda l’uso di una proteina chimerica umana L-selectina Fc con numero di accesso # P14151 e/o una proteina chimerica umana VE-caderina Fc con numero di accesso # P33151 per il rivestimento di una superficie metallica, ad esempio una superficie metallica di dispositivi medici, come di stent. Furthermore, the present invention relates to the use of a human chimeric protein L-selectin Fc with access number # P14151 and / or a human chimeric protein VE-cadherin Fc with access number # P33151 for coating a metal surface, for example a metal surface of medical devices, such as stents.
La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme di realizzazione preferite, con particolare riferimento alle figure allegate, in cui: The present invention will now be described, for illustrative but not limitative purposes, according to its preferred embodiments, with particular reference to the attached figures, in which:
la figura 1 mostra EPC isolate, con una morfologia del tipo delle cellule endoteliali a forma di fuso. Figure 1 shows isolated EPCs, with a spindle-shaped endothelial cell type morphology.
la figura 2 mostra i nuclei delle cellule attaccate alla superficie di titanio (L-selectina e VE-caderina in rapporto 50/50). Figure 2 shows the nuclei of the cells attached to the titanium surface (L-selectin and VE-cadherin in a 50/50 ratio).
La figura 3 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio rivestita con L-selectina. Figure 3 shows the attachment of platelets to a titanium surface coated with L-selectin.
La figura 4 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio rivestita con VE-caderina. Figure 4 shows the attachment of platelets to a titanium surface coated with VE-cadherin.
La figura 5 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio rivestita con L-selectina VE-caderina (50:50). Figure 5 shows the attachment of platelets to a titanium surface coated with L-selectin VE-cadherin (50:50).
La figura 6 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio rivestita con L-selectina VE-caderina (25:75). Figure 6 shows the attachment of platelets to a titanium surface coated with L-selectin VE-cadherin (25:75).
La figura 7 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio rivestita con L-selectina VE-caderina (75:25). Figure 7 shows the attachment of platelets to a titanium surface coated with L-selectin VE-cadherin (75:25).
La figura 8 mostra l’attaccamento di piastrine su una superficie di titanio non trattata. Figure 8 shows the attachment of platelets to an untreated titanium surface.
Esempio 1: Preparazione di superfici titanio rivestite dalle proteine chimera o da una loro miscela secondo l'invenzione e studio sull'adesione di EPC, cellula endoteliale e fissaggio piastrinico su dette superfici. Example 1: Preparation of titanium surfaces coated with chimera proteins or a mixture thereof according to the invention and study on the adhesion of EPC, endothelial cell and platelet fixation on said surfaces.
Preparazione del supporto Preparation of the substrate
Un titanio commercialmente puro di grado 1 ASTM B 265, avente 0,5 millimetri di spessore x 250mm x 250mm, à ̈ stato tagliato in quadrati da 1 × 1 cm<2>con un taglio automatico. I quadrati sono stati sgrassati e puliti per mezzo delle tre seguenti fasi: A commercially pure grade 1 ASTM B 265 titanium, 0.5mm thick x 250mm x 250mm, was cut into 1 × 1cm <2> squares with an automatic cut. The squares were degreased and cleaned by means of the following three steps:
Venti minuti in Tetrachloroethilene in bagno a ultrasuoni Twenty minutes in Tetrachlorethylene in an ultrasonic bath
Venti minuti in acetone in bagno a ultrasuoni Venti minuti in etanolo al 70% in bagno a ultrasuoni Twenty minutes in acetone in an ultrasonic bath Twenty minutes in 70% ethanol in an ultrasonic bath
E dopo le fasi di lavaggio à ̈ stata eseguita una asciugatura ad aria. I supporti sono stati inseriti sotto una cappa UV laminare di classe II per due ore. And after the washing phases an air drying was performed. The supports were placed under a class II laminar UV hood for two hours.
Protocollo per il rivestimento di una proteina 728-LS Protocol for coating a 728-LS protein
Sono state utilizzate due proteine chimeriche Fc commerciali, L-selectina umana (Trp39 Asn332, codice di accesso #P14151) e VE-caderina umana (Asp48 Gln593, codice di accesso #P33151) dell'azienda R & D. Tutte le parti di queste proteine, tra cui la L-selectina, la VE-caderina e i frammenti Fc di IgG1, sono derivati dall'uomo, che si esprime in linee cellulari di mieloma Murino. Two commercial Fc chimeric proteins were used, human L-selectin (Trp39 Asn332, access code # P14151) and human VE-cadherin (Asp48 Gln593, access code # P33151) from the R&D company. All parts of these proteins, including L-selectin, VE-cadherin and Fc fragments of IgG1, are human-derived, which is expressed in Murine myeloma cell lines.
L’analisi della sequenza N-terminale delle proteine ha confermato l'esistenza di Trp39 e Asp48, rispettivamente per la chimera L-selectina-Fc e per la chimera VE-caderina-Fc. Entrambe le molecole hanno forma di omodimero disolfuro legato e 116 kDa e 100 kDa in condizioni di ridotta SDS-PAGE. The analysis of the N-terminal sequence of proteins confirmed the existence of Trp39 and Asp48, respectively for the L-selectin-Fc chimera and for the VE-cadherin-Fc chimera, respectively. Both molecules have the form of bonded disulfide homodimer and are 116 kDa and 100 kDa under reduced SDS-PAGE conditions.
Ricostituzione, suddivisione e preparazione della piastra: Reconstitution, division and preparation of the plate:
I. Aggiungere 100µL d'acqua sterile al flaconcino della chimera L-selectina Fc (Cat. n.: 728-LS) per preparare una concentrazione di 1 mg / ml II. Suddividere in volumi da 10µl e conservare a una temperatura variabile da -20° a -70° C per un massimo di tre mesi. I. Add 100µL of sterile water to the vial of chimera L-selectin Fc (Cat. No .: 728-LS) to prepare a concentration of 1 mg / ml II. Divide into 10µl volumes and store at -20 ° to -70 ° C for up to three months.
III. Aggiungere 10000µL di buffer Carbonato (CB) per preparare la soluzione di lavoro (1000ng/ml) per una piastra ELISA (96 pozzetti). III. Add 10000µL of Carbonate (CB) buffer to prepare the working solution (1000ng / ml) for an ELISA plate (96 wells).
IV. Aggiungere 100µL di soluzione di lavoro delle proteine di acquisizione per ogni pozzetto, sigillare e incubare per 2 ore a temperatura ambiente per un rivestimento veloce, oppure con PBS a 4° C per tutta la notte. Il tempo di incubazione del rivestimento può richiedere qualche ottimizzazione. IV. Add 100µL of Acquisition Protein Working Solution to each well, seal and incubate for 2 hours at room temperature for a fast coating, or with 4 ° C PBS overnight. The incubation time of the coating may require some optimization.
V. Aspirare e lavare ogni pozzetto con un tampone di lavaggio (WB), ripetendo il processo due volte per un totale di tre lavaggi. Lavare riempiendo ogni pozzetto con un tampone di lavaggio (280µL). V. Aspirate and wash each well with Wash Buffer (WB), repeating the process twice for a total of three washes. Wash by filling each well with wash buffer (280µL).
La rimozione completa del liquido in ciascuna fase à ̈ essenziale per una buona performance. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere eventuali residui del tampone di lavaggio aspirando o capovolgendo e pulendo la piastra contro dei fogli di carta assorbente. Questa procedura di lavaggio à ̈ utilizzata in tutte le fasi del lavaggio in questo protocollo. Complete removal of the liquid in each phase is essential for good performance. After the last wash, remove any remaining wash buffer residues by vacuuming or inverting and wiping the plate against absorbent paper sheets. This washing procedure is used in all washing steps in this protocol.
VI. Bloccare le piastre aggiungendo 250µL di diluente del reattivo (RD) in ciascun pozzetto. Sigillare la piastra ed incubare a temperatura ambiente per un minimo di 1 ora. Se il tempo di blocco può essere prolungato per più di 4 ore, tenere a 4° C. YOU. Block plates by adding 250µL of Reagent Diluent (RD) to each well. Seal the plate and incubate at room temperature for a minimum of 1 hour. If the block time can be extended for more than 4 hours, keep at 4 ° C.
VII. Ripetere il punto 5. VII. Repeat step 5.
VIII. Ora la piastra à ̈ pronta per le fasi di rilevazione o di ulteriori procedure. VIII. Now the plate is ready for the detection steps or further procedures.
Fasi di Rilevazione: Detection phases:
1) Aggiungere 100µL di soluzione di lavoro di anticorpi (BBA24) per pozzetto. Sigillare la piastra ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente. 1) Add 100µL of Antibody Working Solution (BBA24) per well. Seal the plate and incubate for 2 hours at room temperature.
2) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. 2) Repeat step 5 of plate preparation.
3) Aggiungere 100µL di anticorpo secondario, diluito nel diluente del reattivo, in ciascun pozzetto. Coprire con un nuovo nastro adesivo e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. 3) Add 100µL of secondary antibody, diluted in the reagent diluent, to each well. Cover with new adhesive tape and incubate for 2 hours at room temperature.
4) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. (Se il vostro anticorpo secondario à ̈ coniugato con streptavidina-HRP andare alle fasi di raccolta dei dati). 4) Repeat step 5 of plate preparation. (If your secondary antibody is conjugated to streptavidin-HRP go to the data collection steps).
5) Aggiungere 100µL della diluizione di lavoro di streptavidina-HRP in ogni pozzetto. Coprire la piastra ed incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Evitare di esporre la piastra alla luce diretta. 5) Add 100µL of Streptavidin-HRP working dilution to each well. Cover the plate and incubate for 20 minutes at room temperature. Avoid exposing the plate to direct light.
6) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. 6) Repeat step 5 of plate preparation.
Fasi di raccolta dei dati: Stages of data collection:
1) Aggiungere 100µL della soluzione di substrato (CMG-TMB) in ogni pozzetto. 1) Add 100µL of the substrate solution (CMG-TMB) to each well.
2) Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Evitare di esporre la piastra alla luce diretta. 2) Incubate for 20 minutes at room temperature. Avoid exposing the plate to direct light.
3) Aggiungere 50µL di soluzione bloccante in ogni pozzetto. Agitare gentilmente la piastra per garantire la omogeneizzazione della miscela. 3) Add 50µL of Stop Solution to each well. Gently shake the plate to ensure homogenization of the mixture.
4) Determinare la densità ottica immediatamente a 450 nm. Se à ̈ possibile una correzione della lunghezza d'onda, impostarla a 630 nm. Se non fosse possibile una correzione della lunghezza d'onda, sottrarre le letture a 630 nm dalle letture a 450 nm. Questa sottrazione correggerà le imperfezioni ottiche nella piastra. Le letture effettuate direttamente a 450 nm senza correzione potrebbero risultare superiori e meno accurate. 4) Determine the optical density immediately at 450 nm. If wavelength correction is possible, set it to 630 nm. If a wavelength correction is not possible, subtract the 630 nm readings from the 450 nm readings. This subtraction will correct the optical imperfections in the plate. Readings taken directly at 450 nm without correction may be higher and less accurate.
Protocollo per un rivestimento di proteine 938-VC Ricostituzione, suddivisione e preparazione della piastra: Protocol for a 938-VC Protein Coating Reconstitution, Splitting, and Plate Preparation:
1) Aggiungere 50µL d'acqua deionizzata sterile contenente 2 mM di calcio (24 ore prima dell'uso) per un flaconcino della chimera VE-caderina/Fc (Cat. n.: 938-VC) per preparare una concentrazione di 0,1 mg / ml. 1) Add 50µL of sterile deionized water containing 2 mM of calcium (24 hours before use) to a vial of VE-cadherin / Fc chimera (Cat.no .: 938-VC) to prepare a concentration of 0.1 mg / ml.
2) Suddividere in volumi da 10µl e conservare a una temperatura variabile da -20° a -70°C per un massimo di tre mesi. 2) Divide into 10µl volumes and store at -20 ° to -70 ° C for up to three months.
3) Aggiungere 10000µL di buffer Carbonato (CB) per preparare la soluzione di lavoro (100ng/ml) per una piastra ELISA (96 pozzetti). 3) Add 10000µL of Carbonate (CB) buffer to prepare the working solution (100ng / ml) for an ELISA plate (96 wells).
4) Aggiungere 100µL di soluzione di lavoro di proteine di acquisizione per ogni pozzetto, sigillare e incubare per 2 ore a temperatura ambiente per un rivestimento veloce, o con PBS a 4C per tutta la notte. Il tempo di incubazione del rivestimento può richiedere qualche ottimizzazione. 4) Add 100µL of Acquisition Protein Working Solution to each well, seal and incubate for 2 hours at room temperature for a fast coating, or with 4C PBS overnight. The incubation time of the coating may require some optimization.
5) Aspirare e lavare ogni pozzetto con un tampone di lavaggio (WB), ripetendo la procedura due volte per un totale di tre lavaggi. Lavare riempiendo ogni pozzetto con del tampone di lavaggio (280µL). La rimozione completa del liquido in ciascuna fase à ̈ essenziale per una buona performance. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere eventuali residui del tampone di lavaggio aspirando o capovolgendo e pulendo la piastra contro salviette di carta assorbente. Questa procedura di lavaggio à ̈ utilizzata in tutte le fasi di lavaggio in questo protocollo. 5) Aspirate and wash each well with Wash Buffer (WB), repeating the procedure twice for a total of three washes. Wash by filling each well with wash buffer (280µL). Complete removal of the liquid in each phase is essential for good performance. After the last wash, remove any residual wash buffer by vacuuming or inverting and wiping the plate against absorbent paper towels. This washing procedure is used in all washing steps in this protocol.
6) bloccare le piastre aggiungendo 250µL di diluente del reattivo (RD) in ciascun pozzetto. 6) block the plates by adding 250µL of reagent diluent (RD) to each well.
Sigillare la piastra ed incubare a temperatura ambiente per un minimo di 1 ora. Se il tempo di blocco può essere prolungato per più di 4 ore, tenere a 4° C. Seal the plate and incubate at room temperature for a minimum of 1 hour. If the block time can be extended for more than 4 hours, keep at 4 ° C.
7) Ripetere la fase 5. 7) Repeat step 5.
8) Ora la piastra à ̈ pronta per le fasi di rilevazione o di ulteriori procedure. 8) Now the plate is ready for the detection phases or further procedures.
Fasi di rilevazione: Detection phases:
1) Aggiungere 100µL della soluzione di lavoro dell'anticorpo (AF938) per pozzetto. Sigillare la piastra ed incubare per 2 ore a temperatura ambiente. 1) Add 100µL of Antibody Working Solution (AF938) per well. Seal the plate and incubate for 2 hours at room temperature.
2) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. 2) Repeat step 5 of plate preparation.
3) Aggiungere 100µL di anticorpo secondario, diluito nel diluente del reattivo, in ciascun pozzetto. Coprire con un nuovo nastro adesivo e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. 3) Add 100µL of secondary antibody, diluted in the reagent diluent, to each well. Cover with new adhesive tape and incubate for 2 hours at room temperature.
4) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. (Se il vostro anticorpo secondario à ̈ coniugato con streptavidina-HRP andare alle fasi di raccolta dei dati). 4) Repeat step 5 of plate preparation. (If your secondary antibody is conjugated to streptavidin-HRP go to the data collection steps).
5) Aggiungere 100µL della diluizione di lavoro di streptavidina-HRP in ogni pozzetto. Coprire la piastra ed incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Evitare di esporre la piastra a luce diretta. 5) Add 100µL of Streptavidin-HRP working dilution to each well. Cover the plate and incubate for 20 minutes at room temperature. Avoid exposing the plate to direct light.
6) Ripetere la fase 5 della preparazione della piastra. 6) Repeat step 5 of plate preparation.
Fasi di Rilevazione: Detection phases:
1) Aggiungere 100µL della soluzione di substrato (CMG-TMB) in ogni pozzetto. 1) Add 100µL of the substrate solution (CMG-TMB) to each well.
2) Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Evitare di esporre la piastra a luce diretta. 2) Incubate for 20 minutes at room temperature. Avoid exposing the plate to direct light.
3) Aggiungere 50µL di soluzione di arresto (CMG-STP) in ciascun pozzetto. Agitare gentilmente la piastra per garantire la omogeneizzazione della miscela. 3) Add 50µL of Stop Solution (CMG-STP) to each well. Gently shake the plate to ensure homogenization of the mixture.
4) Determinare la densità ottica immediatamente a 450 nm. Se à ̈ possibile una correzione della lunghezza d'onda impostarla a 630 nm. Se non fosse possibile una correzione della lunghezza d'onda, sottrarre le letture a 630 nm dalle letture a 450 nm. Questa sottrazione correggerà le imperfezioni ottiche nella piastra. Le letture effettuate direttamente a 450 nm senza correzione potrebbero risultare superiori e meno accurate. 4) Determine the optical density immediately at 450 nm. If wavelength correction is possible set it to 630 nm. If a wavelength correction is not possible, subtract the 630 nm readings from the 450 nm readings. This subtraction will correct the optical imperfections in the plate. Readings taken directly at 450 nm without correction may be higher and less accurate.
Ottimizzazione della concentrazione di proteine: Optimization of protein concentration:
Diverse concentrazioni di L-selectina Fc e VE-caderina Fc tra cui 10000, 1000, 100, 10, 1 ng / ml sono state preparate ed usate come rivestimento di piastre ELISA. Come dimostrano i dati nella tabella 1, la migliore concentrazione minima per entrambe le proteine à ̈ 50ng/ml. Different concentrations of L-selectin Fc and VE-cadherin Fc including 10000, 1000, 100, 10, 1 ng / ml were prepared and used as coating of ELISA plates. As the data in Table 1 demonstrate, the best trough concentration for both proteins is 50ng / mL.
Tavola 1 Table 1
Proteine 10000 1000 100 50 10 1 Blank ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml Protein 10000 1000 100 50 10 1 Blank ng / ml ng / ml ng / ml ng / ml ng / ml ng / ml
L- 3.8 3.369 3.375 - 0.974 0.554 0.530 selectina L- 3.8 3.369 3.375 - 0.974 0.554 0.530 selectin
-Fc -Fc
VE- 3.44 3.378 2.991 2.069 0.775 0.592 0.136 caderina-Fc VE- 3.44 3.378 2.991 2.069 0.775 0.592 0.136 cadherin-Fc
Gli effetti del calcio sul rivestimento delle The effects of calcium on the lining of the
proteine L-selectina Fc e VE-caderina Fc: L-selectin Fc and VE-cadherin Fc proteins:
Le proteine (50 ng / ml ciascuna) sono state The proteins (50 ng / ml each) were
preparate in un tampone carbonato e il tampone prepared in a carbonate buffer and the buffer
conteneva 0,2 mM di calcio, separatamente. Poi le contained 0.2 mM of calcium, separately. Then the
proteine hanno generato il rivestimento sulla piastra proteins generated the coating on the plate
ELISA. Come mostrano i dati nella Tavola 2, il ELISA. As the data in Table 2 show, the
rivestimento dato da entrambe le proteine à ̈ stato coating given by both proteins was
potenziato in presenza di calcio (p <0,05) ma esso boosted in the presence of calcium (p <0.05) but it
non ha generato alcun effetto su nessuna delle due it had no effect on either
proteine prese separatamente. proteins taken separately.
Tavola 2 Table 2
Proteine CB Calcio Blank Protein CB Calcium Blank
L-selectina-Fc 0.170 0.223 0.055 L-selectin-Fc 0.170 0.223 0.055
VE-caderina-Fc 2.313 2.930 0.055 VE-cadherin-Fc 2.313 2.930 0.055
L-selectina-Fc 1.334 3.343 0.055 L-selectin-Fc 1.334 3.343 0.055
VE-caderina-Fc VE-cadherin-Fc
Gli effetti della temperatura sul rivestimento The effects of temperature on the coating
delle proteine L-selectina Fc e VE-caderina Fc: of L-selectin Fc and VE-cadherin Fc proteins:
Per studiare l'effetto della temperatura sul To study the effect of temperature on the
rivestimento di queste proteine, sono state rivestite coating of these proteins, have been coated
due piastre ELISA rispettivamente con 50ng/ml di two ELISA plates with 50ng / ml of respectively
ciascuna proteina, incubate a 40°C ed a 200°C. Come each protein, incubated at 40 ° C and 200 ° C. How
mostra la Tavola 3, il rivestimento di queste shows Table 3, the covering of these
proteine à ̈ indipendente dal calore. protein is independent of heat.
Tavola 3 Table 3
Proteine 4â °C 20â °C Blank Protein 4â ° C 20â ° C Blank
L-selectina-Fc 0.193 0.219 0.059 L-selectin-Fc 0.193 0.219 0.059
VE-caderina-Fc 2.01 2.211 0.059 VE-cadherin-Fc 2.01 2.211 0.059
L-selectina-Fc 1.212 1.300 0.059 L-selectin-Fc 1,212 1,300 0.059
VE-caderina-Fc VE-cadherin-Fc
Gli effetti dello shock pH sul rivestimento delle The effects of the pH shock on the coating of the
proteine L-selectina Fc e VE-caderina Fc: L-selectin Fc and VE-cadherin Fc proteins:
Sono state rivestite tre piastre ELISA con le Three ELISA plates were coated with the
proteine L-selectina Fc e VE-caderina Fc L-selectin Fc and VE-cadherin Fc proteins
rispettivamente con pH = 2, 7.2 e 9.6. I nostri dati respectively with pH = 2, 7.2 and 9.6. Our data
in Tavola 4 dimostrano che il rivestimento di queste in Plate 4 show that the coating of these
proteine non à ̈ influenzato dallo shock da pH. protein is not affected by pH shock.
Tavola 4 Table 4
Proteine PH=2 PH=7.2 Ph=9.6 Blank Proteins PH = 2 PH = 7.2 Ph = 9.6 Blank
L-selectina-Fc 0.152 0.150 0.185 0.059 L-selectin-Fc 0.152 0.150 0.185 0.059
VE-caderina- 0.253 0.287 0.298 0.059 VE-cadherin - 0.253 0.287 0.298 0.059
Fc Fc
L-selectina-Fc 0.231 0.250 0.255 0.059 L-selectin-Fc 0.231 0.250 0.255 0.059
+ VE-caderina-Fc + VE-cadherin-Fc
Ricostituzione degli anticorpi e suddivisione: Reconstitution of antibodies and partitioning:
1 - BBA24: Ricostituire con PBS sterile. Se 1 - BBA24: Reconstitute with sterile PBS. Self
viene utilizzato 1 ml di PBS, la concentrazione 1 ml of PBS is used, the concentration
anticorpale sarà 200µg/ml. Suddividere in volumi da antibody will be 200µg / ml. Divide into volumes from
5µL e conservare ad una temperatura variabile da -20: 5µL and store at a temperature ranging from -20:
°C a -70: °C per un periodo fino a sei mesi. ° C to -70: ° C for a period of up to six months.
Aggiungere RD 2000µL per preparare 100 ng / ml Add RD 2000µL to prepare 100 ng / ml
di una soluzione di lavoro per una piastra ELISA da of a working solution for an ELISA plate from
96 pozzetti. Può essere necessario preparare un altro 96 wells. It may be necessary to prepare another
diluente appropriato. appropriate thinner.
2- AF938: Ricostituire con PBS sterile. Se viene utilizzato 1ml di PBS, la concentrazione anticorpale sarà 0,1 mg / ml. Suddividere in volumi da 5µL e conservare ad una temperatura variabile da -20: C a -70: C per un massimo di sei mesi. Aggiungere RD 2000µL per preparare 50 ng / ml di soluzione di lavoro per una piastra ELISA da 96pozzetti. Può essere necessario preparare altri diluenti appropriati. 2- AF938: Reconstitute with sterile PBS. If 1ml of PBS is used, the antibody concentration will be 0.1mg / ml. Divide into 5µL volumes and store at -20: C to -70: C for up to six months. Add RD 2000µL to prepare 50 ng / mL working solution for a 96-well ELISA plate. It may be necessary to prepare other appropriate diluents.
Reagenti e tamponi: Reagents and Buffers:
PBS: CMG-PBS à ̈ altamente raccomandato per questo protocollo. Se non à ̈ disponibile, utilizzare la formula seguente: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2 - 7,4 PBS: CMG-PBS is highly recommended for this protocol. If not available, use the following formula: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.2 - 7.4
Reagente Diluente (RD): 1% BSA in PBS, pH 7.2 -7.4. Diluent Reagent (RD): 1% BSA in PBS, pH 7.2 -7.4.
Tampone di lavaggio (WB): 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2 - 7.4. Wash Buffer (WB): 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2 - 7.4.
Tampone carbonato: (100 mM): 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3, 1000 ml di acqua distillata, pH 9.6 o (50mM): 1.59 g Na2CO3, 2.93 g NaHCO3 , 1000 ml di acqua distillata, pH 9.6. Carbonate buffer: (100mM): 3.03g Na2CO3, 6.0g NaHCO3, 1000ml distilled water, pH 9.6 or (50mM): 1.59g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 1000ml distilled water, pH 9.6.
Protocollo utilizzato per l'isolamento delle EPC e la loro coltura Protocol used for the isolation of EPCs and their culture
1. sono stati raccolti almeno 20 ml di sangue periferico, con un anti-coagulante, per evitare la coagulazione 1. At least 20 ml of peripheral blood was collected, with an anti-coagulant, to avoid clotting
2. à ̈ stato aggiunto del sangue periferico a una provetta in polipropilene da 50 ml contenente 10 ml di PBS ed à ̈ stato delicatamente mescolato 2. Peripheral blood was added to a 50 mL polypropylene tube containing 10 mL of PBS and mixed gently
3. sono stati aggiunti 10 ml di Histopaque ® 1077 ® in 2 × 50 ml provette individualmente 3. 10 ml of Histopaque ® 1077 ® was added in 2 × 50 ml tubes individually
4. sono stati sovrapposti 15 ml di sangue diluito alla Histopaque ®, con cautela per evitare di rompere l'interfaccia. 4. 15 ml of diluted blood was superimposed on Histopaque ®, with caution to avoid breaking the interface.
. La provetta à ̈ stata centrifugata a 400 g per 30 minuti a temperatura ambiente e alla pausa à ̈ stato girato nella posizione "off". . The tube was centrifuged at 400 g for 30 minutes at room temperature and at the break it was turned to the "off" position.
6. Dopo la centrifugazione, à ̈ stata trasferita la fase intermedia tra l'Histopaque ® e lo strato di plasma in un nuovo tubo da 50 ml in polipropilene, al fine di raccogliere le cellule mononucleate (MNC). È stato aggiunto nel tubo del PBS contenente il 2% di FBS fino al volume finale di 40 ml. 6. After centrifugation, the intermediate step between the Histopaque ® and the plasma layer was transferred into a new 50 ml polypropylene tube in order to collect the mononuclear cells (MNCs). PBS containing 2% FBS was added to the final volume of 40 mL.
7. È stato centrifugato a 250 × g con la procedura di "interruzione e accelerazione" per 10 minuti a temperatura ambiente. 7. It was centrifuged at 250 × g with the "stop and accelerate" procedure for 10 minutes at room temperature.
8. Il surnatante à ̈ stato decantato e il pellet à ̈ stato nuovamente sospeso entro 6 ml di PBS con il 2% di FBS. 8. The supernatant was decanted and the pellet was resuspended within 6 mL of PBS with 2% FBS.
9. La sospensione à ̈ stata trasferita in un nuovo tubo da 15 ml da centrifuga. La provetta da 50 ml à ̈ stata risciacquata con l'aggiunta di 6 ml di PBS contenente il 2% di FBS, e poi ha subito 10 minuti di centrifugazione a temperatura ambiente con la procedura di "interruzione e accelerazione" per ottenere cellule pellet. 9. The suspension was transferred to a new 15 ml centrifuge tube. The 50 ml tube was rinsed with the addition of 6 ml of PBS containing 2% FBS, and then underwent 10 minutes of centrifugation at room temperature with the "stop and accelerate" procedure to obtain pelleted cells.
10. Il surnatante à ̈ stato nuovamente sospeso in ml 1-3 di EBM2 MV singolo strato medio, a seconda delle dimensioni delle cellule pellet. Sono state contate delle cellule nucleate con 1/20 di diluizione. 10. The supernatant was again suspended in 1-3 ml of EBM2 MV single layer medium, depending on the size of the pelleted cells. Nucleated cells were counted with 1/20 dilution.
11. le MNC che sono state seminate su piastre di fibronectina hanno generato il rivestimento di piastre da 3,5 cm con rapporto 1 × 107 cellule/pozzetto (piastre da 6 pozzetti) e incubate a 370°C, con 5% di CO2 e con ≥ 95% di umidità . 11. MNCs that were seeded on fibronectin plates generated the coating of 3.5 cm plates with a ratio of 1 ÷ 107 cells / well (6-well plates) and incubated at 370 ° C, with 5% CO2 and with â ‰ ¥ 95% humidity.
12. Il mezzo à ̈ stato cambiato con EBM-2 MV fresca, delicatamente. Le cellule in sospensione sono state mantenute su colture per altri 2 giorni. Dopo 3-5 giorni, le cellule attaccate prendono il nome di EPC precoci. 12. The medium was changed to fresh EBM-2 MV, gently. Cells in suspension were kept on cultures for a further 2 days. After 3-5 days, the attacked cells are called early EPCs.
13. Il mezzo à ̈ stato cambiato e le cellule sospese sono state rimosse. Poi, dopo, il mezzo à ̈ stato cambiato con EBM2 MV, ogni 3 giorni. 13. The medium was changed and the suspended cells were removed. Then, after that, the vehicle was changed to EBM2 MV, every 3 days.
14. Dopo altri 5-6 giorni, le cellule prodotte sono chiamate EPC espanse. 14. After another 5-6 days, the cells produced are called expanded EPCs.
15. Le cellule sono state tripsinizzate e riseminate su piastre rivestite di 0,25% di gelatina in singole parti di EBM2 MV. Queste cellule, nel primo passaggio, possono essere riutilizzate in diversi passaggi per diverse generazioni. 15. Cells were trypsinized and resown on plates coated with 0.25% gelatin in single parts of EBM2 MV. These cells, in the first step, can be reused in several steps for several generations.
La figura 1 mostra EPC isolate a forma affusolata con la morfologia simile alla cellula endoteliale. Figure 1 shows isolated tapered EPCs with endothelial cell-like morphology.
Protocollo utilizzato per l’isolamento e la coltura cellulare endoteliale del cordone ombelicale umano (HUVEC) Protocol used for the isolation and endothelial cell culture of the human umbilical cord (HUVEC)
1. Capsule di Petri (35 mm) sono state rivestite con 1 goccia di fibronectina, un giorno prima della manipolazione (totale 7 capsule per cordone). 1. Petri dishes (35 mm) were coated with 1 drop of fibronectin, one day before manipulation (total 7 capsules per bead).
2. I cordoni sono stati trasportati al laboratorio con 3 recipienti contenenti 50 ml di tampone di conservazione per i cordoni di cui 50 ml di PBS, 1 ml di 1 M Colimicina e 1 ml di 1M penicillina G. 2. The cords were transported to the laboratory with 3 vessels containing 50 ml of storage buffer for the cords including 50 ml of PBS, 1 ml of 1 M Colimycin and 1 ml of 1M penicillin G.
3. Il recipiente à ̈ stato riempito con circa 500 ml di siero fisiologico e mantenuto a 37 ° C (a bagnomaria) al giorno della manipolazione. 3. The container was filled with approximately 500 ml of physiological serum and kept at 37 ° C (in a water bath) on the day of handling.
4. Due estremità del cordone sono state tagliate utilizzando un bisturi sterile 4. Two ends of the cord were cut using a sterile scalpel
5. Una cannula à ̈ stata introdotta a ogni estremità della vena (entro il vaso più ampio). È stato stretto con uno spago 5. A cannula was introduced at each end of the vein (within the larger vessel). It was tightened with a string
6. Il cordone à ̈ stato lavato con PBS usando la siringa da 50 ml 6. The cord was washed with PBS using the 50 ml syringe
7. La collagenasi (0,2% in PBS) à ̈ stata iniettata a un’estremità della vena con una siringa da 30 ml 7. Collagenase (0.2% in PBS) was injected into one end of the vein with a 30 ml syringe
8. La siringa à ̈ stata mantenuta e le estremità del cordone sono state protette con una pellicola "clean" in alluminio 8. The syringe has been maintained and the ends of the cord have been protected with a "clean" aluminum film
9. Il cordone à ̈ stato incubato nel siero fisiologico a 37 ° C per 10 min. 9. The cord was incubated in physiological serum at 37 ° C for 10 min.
10. Il cordone à ̈ stato delicatamente spremuto con l'involucro sterile di guanti, premendo delicatamente il cordone 10. The cord was gently squeezed with the sterile glove wrap by gently squeezing the cord
11. Un contenitore Falcon sterile da 50 ml à ̈ stato riempito con 10 ml di mezzo di coltura (M199) 12. Le cellule di questo Falcon sono state raccolte lavando la vena con 40 ml di PBS e centrifugate a 900 rpm per 10 min 11. A sterile 50 ml Falcon container was filled with 10 ml of culture medium (M199) 12. Cells from this Falcon were collected by washing the vein with 40 ml of PBS and centrifuged at 900 rpm for 10 min
13. Il supernatante à ̈ stato scartato con cura e le cellule sono state sospese in ~ 14 ml di mezzo di coltura 13. The supernatant was carefully discarded and the cells were suspended in ~ 14 mL of culture medium
14. Le cellule sono state dissociate (aspirazione e repulsione per tre volte) con la siringa da 30 ml e il suo ago 14. The cells were dissociated (aspiration and repulsion three times) with the 30 ml syringe and its needle
15. 2 ml di sospensione delle cellule sono stati aggiunti in ogni Petri rivestita di fibronectina 15. 2 mL of cell suspension was added to each fibronectin-coated Petri dish
16. Le cellule sono state coltivate e collocate in un’aria umidificata 95% e 5% di CO2 nell'atmosfera a 37° C. 16. The cells were cultured and placed in 95% humidified air and 5% CO2 in the atmosphere at 37 ° C.
17. Il giorno successivo, le cellule non aderenti sono state rimosse cambiando il mezzo di coltura. 17. The next day, non-adherent cells were removed by changing the culture medium.
18. Il mezzo di coltura à ̈ stato cambiato ogni due giorni. Tipicamente, la confluenza à ̈ stata raggiunta in 6-8 giorni (circa 1,10<6>celle / piatto). Le cellule derivate hanno mostrato l'aspetto caratteristico di ciottoli nel microscopio ottico. 18. The culture medium was changed every two days. Typically, confluence was achieved in 6-8 days (approximately 1.10 <6> cells / dish). The derived cells showed the characteristic appearance of pebbles in the light microscope.
Tutte le procedure sono state eseguite sotto la cappa laminare. All procedures were performed under the laminar hood.
Valutazione sperimentale Experimental evaluation
HUVEC e EPC al secondo passaggio sono state tripsinizzate raggiungendo l'80% della loro confluenza. Entro 8 min di centrifugazione a 1800 rpm la sospensione delle cellule à ̈ stata trasferita in 5 ml di mezzo di coltura. Le cellule sono state contate sotto microscopio invertito con emocitometro. I substrati per il controllo e i test sono stati inseriti nella parte inferiore del tessuto di cultura di piastre da 24 pozzetti. Tamponi contenenti la proteina albumina che di solito à ̈ usata come tampone bloccante non si à ̈ legato alla superficie di TiO2 a causa della mancanza della coda His-tag. Second pass HUVEC and EPC were trypsinized reaching 80% of their confluence. Within 8 min of centrifugation at 1800 rpm the cell suspension was transferred to 5 ml of culture medium. Cells were counted under inverted microscope with hemacytometer. Substrates for control and tests were placed in the bottom of the culture tissue of 24-well plates. Buffers containing the albumin protein which is usually used as a blocking buffer did not bind to the TiO2 surface due to the lack of the His-tagged tail.
Abbiamo utilizzato un ormone della crescita (GH), proteine contenenti residui di 6 His-tag per il blocco della superficie. Prima di caricare le cellule sulla superficie dei substrati, il PBS utilizzato nel passaggio del rivestimento delle proteine à ̈ stato completamente rimosso da pozzi e 1 ml di mezzo di coltura comprendente le cellule à ̈ stato aggiunto ai pozzetti in cui c'erano i substrati. Le piastre sono state incubate in condizioni di coltura standard delle cellule come temperatura 37,5 °C e di CO2 del 5%. Le cellule sono state utilizzate per la valutazione dell’attaccamento e la crescita e la proliferazione delle cellule. Per ogni valutazione delle cellule, i test sono stati eseguiti tre volte. Per ogni i test HUVECs e EPC sono stati utilizzati, ma dato che il metodo à ̈ lo stesso per entrambe le celle, la procedura sperimentale à ̈ spiegata in generale. We used a growth hormone (GH) protein containing 6 His-tag residues for surface blocking. Before loading the cells onto the substrate surface, the PBS used in the protein coating step was completely removed from the wells and 1 ml of the culture medium comprising the cells was added to the wells containing the substrates. Plates were incubated under standard cell culture conditions such as 37.5 ° C and 5% CO2. The cells were used for attachment assessment and cell growth and proliferation. For each cell evaluation, the tests were performed three times. For each the HUVECs and EPC tests were used, but since the method is the same for both cells, the experimental procedure is explained in general.
DAPI (attrazione delle cellule) DAPI (cell attraction)
Per la valutazione dell'attaccamento delle cellule ai substrati, sono stati utilizzati 5000 cellule/cm2. Dopo 4 ore, le piastre sono state rimosse e successivamente, il mezzo di coltura à ̈ stato rimosso. Ogni pozzetto à ̈ stato lavato tre volte per rimuovere le cellule senza legami. Dopo il lavaggio finale il PBS à ̈ stato completamente rimosso e le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4%. 1 ml di paraformaldeide al 4% à ̈ stato aggiunto in tutti i pozzetti e le piastre sono state mantenute a 4 ° C per 30 min. Sono state lavate con PBS due volte e 1 ml di DAPI (1µg/ml) à ̈ stato aggiunto in ciascun pozzetto. Dopo aver superato 10-15 minuti in camera oscura, i pozzi sono stati lavati con PBS per 5 volte. I pozzi sono stati studiati sotto microscopio invertito a fluorescenza, almeno in 10 campi diversi. Infine, i valori medi sono utilizzati per il rapporto. Il titanio non trattato e i tessuti per la cultura in polistirolo sono stati utilizzati come controllo negativo. For the evaluation of the attachment of the cells to the substrates, 5000 cells / cm2 were used. After 4 hours, the plates were removed and subsequently, the culture medium was removed. Each well was washed three times to remove unattached cells. After the final washing the PBS was completely removed and the cells were fixed with 4% paraformaldehyde. 1 ml of 4% paraformaldehyde was added to all wells and plates were held at 4 ° C for 30 min. They were washed with PBS twice and 1ml of DAPI (1µg / ml) was added to each well. After passing 10-15 minutes in the darkroom, the wells were washed with PBS 5 times. The wells were studied under an inverted fluorescence microscope, in at least 10 different fields. Finally, the average values are used for the report. Untreated titanium and polystyrene culture tissues were used as a negative control.
Attrazione delle piastrine Attraction of platelets
È stato preparato un plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione di sangue con EDTA-anticoagulante a 1000 rpm per 10 min. Lo strato superiore (PRP) à ̈ stato trasferito nella nuova provetta pulita e le piastrine sono state contate utilizzando un emocitometro. Le piastrine sono state diluite in PBS per un massimo di 200000-microlitri. Poi, 1 ml di PBS à ̈ stato aggiunto nei pozzetti. Dopo 1 ora di incubazione a 37 ° C, le cellule sono state lavate delicatamente con 1 ml di PBS. Le cellule sono state fissate is una soluzione contenente il 2,5% di Glutardeide per 1 ora a 37 ° C. In seguito, la fase di disidratazione à ̈ stata effettuata utilizzando 1 ml di concentrazione di etanolo accelerato (15 minuti in ogni concentrazione) come segue: Platelet-rich plasma was prepared by centrifugation of blood with EDTA-anticoagulant at 1000 rpm for 10 min. The top layer (PRP) was transferred to the new clean tube and the platelets were counted using a hemacytometer. Platelets were diluted in PBS to a maximum of 200,000-microliters. Then, 1 ml of PBS was added to the wells. After 1 hour of incubation at 37 ° C, the cells were gently washed with 1 ml of PBS. The cells were fixed in a solution containing 2.5% Glutardeide for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the dehydration step was carried out using 1 ml of accelerated ethanol concentration (15 minutes in each concentration). as follows:
50, 60, 70, 80, 90 e 100 50, 60, 70, 80, 90 and 100
Infine, i supporti contenenti le cellule sono stati asciugati a temperatura ambiente e studiati usando il microscopio elettronico a scansione. Il supporto non trattato à ̈ stato utilizzato come controllo negativo. Finally, the media containing the cells were dried at room temperature and studied using the scanning electron microscope. Untreated media was used as a negative control.
MTT (crescita della cellula, proliferazione, vitalità e citotossicità di superficie) MTT (cell growth, proliferation, viability and surface cytotoxicity)
Nei pozzetti delle piastre à ̈ stato aggiunto 1 ml di mezzo di coltura contenente le cellule (3500 cellule/cm2). Le piastre sono state incubate in condizioni di coltura standard delle cellule alla temperatura di 37,5 °C e a percentuali di CO2 del 5% per 48 ore. Il mezzo di coltura à ̈ stato rimosso dai pozzetti. Poi, 900 ml di un nuovo mezzo di coltura à ̈ stato aggiunto ai pozzetti. Successivamente, MTT (0,5 mg / ml) che à ̈ stata sterilizzata da un filtro 0,2 à ̈ stata aggiunta ai pozzetti, e le cellule sono state incubate in incubatrici di CO2 per 4 ore. Il mezzo di coltura à ̈ stato rimosso e 1 ml di acido di Isopropanolo à ̈ stato aggiunto alle piastre. Passando qualche minuto a temperatura ambiente, la cellula surnatante à ̈ stata trasferita nella provetta da 1,5 ml e la sospensione della cellula à ̈ stata effettuata mediante centrifugazione a 14000 rpm per 2 min. Il surnatante à ̈ stato utilizzato per l'analisi con il metodo del lettore ELISA a 570 nm. La lunghezza d'onda di riferimento era 630 nm. 1 ml of culture medium containing cells (3500 cells / cm2) was added to the wells of the plates. The plates were incubated under standard cell culture conditions at 37.5 ° C and 5% CO2 for 48 hours. The culture medium was removed from the wells. Then, 900 μl of a new culture medium was added to the wells. Subsequently, MTT (0.5 mg / mL) which was sterilized by a 0.2 filter was added to the wells, and the cells were incubated in CO2 incubators for 4 hours. The culture medium was removed and 1 ml of Isopropanol acid was added to the plates. Passing a few minutes at room temperature, the supernatant cell was transferred into the 1.5 ml tube and the cell suspension was carried out by centrifugation at 14000 rpm for 2 min. The supernatant was used for analysis by the ELISA reader method at 570 nm. The reference wavelength was 630 nm.
SEM SEM
5 × 10<3>cellule / ml sono state tenute in un incubatore su una piastra da 12-pozzetti con substrati per 48 ore. Poi, il mezzo di coltura à ̈ stato rimosso e lavato due volte con 1 ml di PBS. Le cellule sono state incubate a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di 1 ml di 2,5% Glutardeide. Dopo 2 ore, la Glutardeide à ̈ stata rimossa e i supporti sono stati lavati due volte con PBS. La fase di disidratazione à ̈ stata effettuata utilizzando 1 ml di concentrazione di etanolo accelerato (15 minuti in ogni concentrazione) come segue: 5 × 10 <3> cells / ml were kept in an incubator on a 12-well plate with substrates for 48 hours. Then, the culture medium was removed and washed twice with 1 ml of PBS. The cells were incubated at room temperature after the addition of 1 ml of 2.5% Glutardeide. After 2 hours, the Glutardeide was removed and the supports were washed twice with PBS. The dehydration step was carried out using 1 ml of accelerated ethanol concentration (15 minutes in each concentration) as follows:
50, 60, 70, 80, 90 e 100 50, 60, 70, 80, 90 and 100
Infine i substrati contenenti le cellule sono stati asciugati a temperatura ambiente e studiati al microscopio elettronico a scansione. Il substrato non trattato à ̈ stato utilizzato come controllo negativo. Finally, the substrates containing the cells were dried at room temperature and studied under the scanning electron microscope. The untreated substrate was used as a negative control.
Risultati: Results:
I dati nelle tabelle indicano i valori medi di esperimenti ripetuti tre volte. I dati mostrano che l'ormone della crescita ha bloccato la superficie e coperto le posizioni libere in modo appropriato. Lo abbiamo usato solo per un tipo di cellula per dimostrare che il rivestimento con le proteine à ̈ stato eseguito in modo appropriato. The data in the tables indicate the average values of experiments repeated three times. The data shows that the growth hormone blocked the surface and covered the free positions appropriately. We only used it for one cell type to show that the protein coating was done properly.
Tavola 5 Table 5
Attrazione/ L- VE- L- L- L- Titanio Titanio Cellule selectina caderina selectina selectina selectina non non più VE- più VE- più VE- trattato trattato caderina caderina caderina più (50/50) (25: 75) (75: 25) ormone della crescita EPC 63.99 66.99 73.7 68.57 59.64 43.60 58.75 HUVEC 67.38 72.92 89.33 68.71 68.75 58.21 - Attraction / L- VE- L- L- L- Titanium Titanium Cells selectin cadherin selectin selectin no more VE- plus VE- plus VE- treated treated cadherin cadherin more (50/50) (25: 75) (75: 25) EPC growth hormone 63.99 66.99 73.7 68.57 59.64 43.60 58.75 HUVEC 67.38 72.92 89.33 68.71 68.75 58.21 -
La figura 1 mostra i nuclei delle cellule attaccati alla superficie del substrato di titanio (L-selectina più VE-caderina (50/50). Figure 1 shows the cell nuclei attached to the surface of the titanium substrate (L-selectin plus VE-cadherin (50/50).
Il fissaggio piastrinico à ̈ stato valutato semi-quantitativamente mediante SEM. Tra le superfici rivestite con le proteine, la combinazione di L-selectina VE-caderina aventi concentrazione a metà e metà à ̈ quella che ha il più basso fissaggio piastrinico. L’ordine di fissaggio decrescente delle piastrine à ̈ stato il seguente: L-selectina VE-caderina (50:50), L-selectina, L-selectina VE-caderina (25:75), VE-caderina, L-selectina VE-caderina (75:25) e quadrati in titanio non trattato (Le figure 3-8 indicano l'attaccamento delle piastrine su varie superfici applicate con ingrandimento di 500 x). Platelet fixation was evaluated semi-quantitatively by SEM. Among the surfaces coated with proteins, the combination of L-selectin VE-cadherin having a half and half concentration is the one that has the lowest platelet fixation. The order of decreasing fixing of the platelets was the following: L-selectin VE-cadherin (50:50), L-selectin, L-selectin VE-cadherin (25:75), VE-cadherin, L-selectin VE-cadherin (75:25) and untreated titanium squares (Figures 3-8 indicate the attachment of the plates to various applied surfaces at 500 x magnification).
Così, la superficie rivestita con L-selectina VE-caderina (50:50) genera una superficie vasocompatibile per l’attaccamento delle EPC e delle cellule endoteliali con un minore attrazione delle piastrine. Questi tre fattori auspicabili hanno incontrato la necessità di un candidato ad un impianto di un dispositivo endovascolare: diminuzione nell'attaccamento delle piastrine, e aumentata attrazione dell'EPC e delle cellule endoteliali. Thus, the surface coated with L-selectin VE-cadherin (50:50) generates a vasocompatible surface for the attachment of EPCs and endothelial cells with less attraction of platelets. These three desirable factors met the need for a candidate for an endovascular device implant: decreased attachment of platelets, and increased attraction of EPC and endothelial cells.
Tavola 6 Table 6
dati L- VE- L- L- L- Titanio Titanio MTT / selectina caderina selectina selectina selectina non non Cellule più VE- più VE- più VE- trattato trattato caderina caderina caderina più (50/50) (25: 75) (75: 25) ormone della crescita<EPC>103 110 130.33 118.33 113.66 92 93.66<HUVEC>78.33 110 138.33 93.33 96.67 38.33 data L- VE- L- L- L- Titanium Titanium MTT / selectin cadherin selectin selectin selectin non Cells plus VE- plus VE- plus VE- treated cadherin cadherin plus cadherin (50/50) (25: 75) (75 : 25) growth hormone <EPC> 103 110 130.33 118.33 113.66 92 93.66 <HUVEC> 78.33 110 138.33 93.33 96.67 38.33
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Citations (2)
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| WO2001068158A1 (en) * | 2000-03-15 | 2001-09-20 | Orbus Medical Technologies Inc. | Coating that promotes endothelial cell adherence |
| WO2004005477A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Chiron Corporation | Protein microarrays on mirrored surfaces for performing proteomic analyses |
-
2011
- 2011-11-29 IT IT000310A patent/ITVI20110310A1/en unknown
Patent Citations (2)
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