ITUD20120028A1 - Camera di perfusione, relativa apparecchiatura utilizzante tale camera di perfusione e procedimento per l'analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"CAMERA DI PERFUSIONE, RELATIVA APPARECCHIATURA UTILIZZANTE TALE CAMERA DI PERFUSIONE E PROCEDIMENTO PER

L’ANALISI DELLA PATOLOGIA TROMBOTICO-ISCHEMICA ED EMORRAGICA"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad una camera di perfusione, una relativa apparecchiatura che utilizza tale camera di perfusione ed un procedimento per l’analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica, ed in particolare permette Io studio “in vitro” dell’emostasi primaria e della formazione di un trombo. In particolare l’apparecchiatura secondo il presente trovato prevede l’analisi di un fluido, quale un fluido biologico, quale ad esempio sangue od altri fluidi ematici, siano essi animali o umani, e miscele di detto fluido con sostanze additive, oppure un fluido non biologico.

STATO DELLA TECNICA

Il processo coagulativo è il meccanismo fisiologico che porta all’arresto della perdita di sangue dai vasi sanguigni danneggiati ed è essenziale per garantire l’integrità di un individuo in caso di emorragie.

La trombosi è una formazione indesiderata di un tappo emostatico o di un trombo all’interno di un vaso sanguigno o del sistema cardiovascolare.

Com’è noto, la capacità adesiva ed aggregativi delle piastrine e la formazione di fibrina controllano normalmente la riparazione dei danni tessutali. L’attivazione delle piastrine porta alla formazione di una massa di piastrine aggregate che formano un tappo per l’arresto di eventi emorragici.

A volte, le piastrine possono esasperare il processo di riparazione, essendo attivate in maniera inappropriata se c’è un cambiamento patologico nel processo emostatico, ad esempio l’aterosclerosi che può dare seguito ad un evento drammatico che porta all’occlusione del vaso ematico: la trombosi.

Un evento emostatico patologico, sia esso trombotico-ischemico, dovuto ad improvvisa mancanza di flusso ematico in un vaso sanguigno, come nel caso delle coronarie nell’infarto del miocardio, od emorragico, rappresenta un severo problema a carico del sistema cardiovascolare. Questi problemi derivano da alterazioni cardiovascolari acquisite nel tempo, come manifestazioni arteriosclerotiche, aneurismi, “shunts” atero-venosi, vasculiti, anomalie delle valvole cardiache, fibrillazioni atriali e malattie di conduzione, trombosi venose e arteriose o altro.

Inoltre, queste manifestazioni patologiche sono difficilmente diagnosticabili in quanto presenti anche in soggetti che nella normale vita di relazione non hanno mai evidenziato eventi patologici e che, ad esempio, in occasione di interventi chirurgici, possono incorrere in gravi manifestazioni emorragiche o trombotiche -ischemiche.

A tale scopo risulta di fondamentale importanza dotarsi, in ambito clinico, di un test funzionale “ex vivo” che permetta di identificare potenziali rischi trombotici ed emorragici in soggetti “silenti” per manifestazioni patologiche cardiovascolari. A tal fine è nota la domanda di brevetto europeo 06819957.9 a nome della Richiedente che si riferisce ad un’apparecchiatura per la diagnosi, prognosi e monitoraggio farmacologico della patologia trombotico-ischemica ed emorragica a carico dell’apparato cardio-vascolare.

In particolare, l’apparecchiatura nota di cui sopra comprende una camera, anche chiamata camera di perfusione, di passaggio o flusso di liquidi ematici. La camera di perfusione è provvista di microcanali nei quali, mediante mezzi di pompaggio, viene fatto fluire il sangue precedentemente prelevato dal paziente in una provetta, ed opportunamente trattato con anticoagulanti come ad esempio eparina, citrato o simili, e con sonde fluorescenti che fungono da marcatori ottici, come ad esempio quinacrina, ficoeritrina, o simili.

Mezzi di acquisizione ottica coordinati con detti marcatori per analisi di fluorescenza acquisiscono immagini relative all’avanzamento dei processi emostatici che portano alla formazione di trombi all’interno dei microcanali.

Un’unità di elaborazione elabora le immagini acquisite e fornisce indicazioni relative al comportamento dell’emostasi del paziente.

Di fondamentale importanza per l’acquisizione, l’analisi e per poter effettuare misure con elevati gradi di affidabilità è la conformazione della camera di perfusione. La camera di perfusione è tipicamente realizzata in materiale trasparente, sostanzialmente non auto fluorescente, per permettere l’acquisizione delle immagini da parte dei mezzi di acquisizione ottica. La sua geometria deve essere adatta a simulare le condizioni fluidodinamiche desiderate come ad esempio il grado di scorrimento, o “share rate”, e il flusso laminare.

In particolare, la camera di perfusione deve garantire un’elevata tenuta idraulica, al fine di conservare le condizioni fluido-dinamiche volute e non inficiare l’attendibilità dell’analisi.

Uno scopo del presente trovato è quello di realizzare un’apparecchiatura e procedimento che consenta di effettuare in modo affidabile lo screening completo del processo coagulativo e di monitorare in modo dinamico, il processo di formazione e stabilizzazione del trombo, ai fini della predizione, diagnosi e prevenzione degli eventi trombotico-ischemici che stanno alla base delle patologie cardiovascolari.

Altro scopo è realizzare un’apparecchiatura e mettere a punto un relativo procedimento che consenta la diagnosi “in vitro” della patologia tromboticoischemica ed emorragica, ottimizzando le operazioni di monitoraggio farmacologico delle terapie anti aggreganti ed anticoagulanti messe in atto.

Un ulteriore scopo del presente trovato è quello di realizzare un’apparecchiatura che consenta di acquisire sostanzialmente in tempo reale ed analizzare, contestualmente o successivamente, il processo coagulativo nella sua globalità e complessità con un elevato grado di affidabilità e precisione.

Un ulteriore scopo è quello di mettere a punto un procedimento di analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica che sia affidabile e preciso, e permetta di monitorare, acquisire in tempo reale ed analizzare in modalità dinamica la formazione di trombi.

Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti mentre le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

In accordo con i suddetti scopi, una camera di perfusione, secondo il presente trovato, comprende almeno un microcanale, vantaggiosamente una pluralità di microcanali, in cui è atto a scorrere un fluido, quale un fluido biologico, tipo sangue od altri fluidi ematici, siano essi animali od umani o miscele di detti fluidi con sostanze additive, tra cui possibili marcatori ottici per analisi di fluorescenza, oppure un fluido non biologico ed in cui è presente almeno un substrato reattivo, finalizzato all’analisi da eseguire, quale un substrato citoadesivo, tipo collagene, che simula una superficie vasale lesionata.

La camera di perfusione è realizzata con un materiale che consente l’acquisizione ottica di immagini o video, di qualità idonea, del flusso di fluido aH’interno dell’almeno un microcanale mediante mezzi di acquisizione ottica di immagini o video, tipicamente coordinati con i possibili marcatori ottici presenti nel fluido che scorre.

In forme di realizzazione, si utilizza un materiale trasparente e sostanzialmente non autofluorescente come vetro o plastica, tipo COC (copolimeri ciclici a base olefinica), COP (polimeri ciclici a base olefinica), polistirene convenzionale, policarbonato PC ad elevato grado ottico. Tali materiali, anche detti materiali super-ottici, sono selezionati per soddisfare preferibilmente i requisiti di spessore omogeneo, sostanzialmente aberrazione ottica nulla, alta trasparenza, idoneità ad analisi di microscopia a fluorescenza, in particolare auto-fluorescenza trascurabile o nulla rispetto alla qualità d’immagine desiderata, e l’acquisizione in tempo reale. Altra proprietà fondamentale è l’alta capacità dei suddetti materiali di legare le sostanze reattive da utilizzare quale substrato per l’adesione piastrinica.

La camera di perfusione è quindi studiata per riprodurre fenomeni e processi di emostasi, simulando efficacemente le condizioni fluidodinamiche del sangue in vasi sanguigni di calibro differente.

Secondo il presente trovato, la camera di perfusione comprende un elemento di base avente almeno una prima superficie sulla quale, in uso, è adatta ad essere disposta, con una sua seconda superficie, una piastra di copertura. Inoltre, almeno una microscanalatura, dell’ordine dimensionale micrometrico, è ricavata aperta superiormente su almeno una fra la prima superfìcie e la seconda superficie ed è provvista di due estremità rispettivamente di ingresso e di uscita per il collegamento fluidico ad un circuito di alimentazione/evacuazione del fluido. La seconda e/o la prima superficie richiudono l’almeno una microscanalatura e delimitano il microcanale attraverso cui viene fatto passare il fluido da analizzare. In particolare, risulta vantaggioso prevedere che le superfici su cui vengono cosparse le sostanze reattive siano opportunamente trattate per conferire alle stesse proprietà idrofile e favorevoli al legame, ed alla ripetibilità dello stesso, con il substrato citoadesivo, tipo collagene. E’ preferibile, infatti, che il legame del substrato citoadesivo, tipo collagene, sia stabile nel tempo, affidabile e quantificabile. Ad esempio è possibile prevedere che le suddette superfici siano trattate con etilene il quale ha buone capacità sgrassanti e rende la superficie idrofila.

Secondo una forma di realizzazione, la microscanalatura è ricavata sulla prima superficie dell’elemento di base e la seconda superficie della piastra di copertura richiude superiormente la microscanalatura.

In una variante di realizzazione, le due estremità di ingresso e di uscita sono collegate fluidicamente al suddetto circuito mediante rispettivi canali ricavati almeno trasversalmente attraverso lo spessore dell’elemento di base.

In una forma di realizzazione, uno dei canali, ovvero il canale che è direttamente collegato all’estremità di ingresso, è associato ad un condotto ausiliario ricavato nell’elemento di base per l’immissione di sostanze additive nel fluido da analizzare che possono essere biomarcatori, calcio o altro.

In un ulteriore forma di realizzazione, il canale che è direttamente collegato all’estremità di ingresso della microscanalatura, è provvisto di almeno un serbatoio di miscelazione del fluido da analizzare con le sostanze additive. In particolare, il serbatoio di miscelazione determina un allargamento di sezione il quale genera una turbolenza che favorisce il rimescolamento del fluido con le sostanze additive. Risulta vantaggioso prevedere, in alcune forme di realizzazione, che la microscanalatura, ottenuta vantaggiosamente per asportazione di materiale, sia definita da pareti che si estendono sostanzialmente ortogonali e parallele rispetto alla prima superficie. Questa soluzione realizzativa permette di limitare gli effetti di distorsione o di riflessione ottica che si possono verificare durante l’acquisizione di immagini.

È di tutta evidenza comunque che, in altre forme di realizzazione, la o le microscanalature possono essere definite da pareti che si estendono trasversalmente rispetto alla prima superficie. Non si esclude, infatti, che le microscanalature possano avere una forma della sezione ad esempio trapezoidale.

Vantaggiosamente, la prima superficie e la seconda superficie sono sostanzialmente complanari fra loro e geometricamente coniugate per ottenere un accoppiamento complanare delle stesse, sia per incrementare la tenuta idraulica della camera di perfusione, sia per ridurre gli effetti ottici di disturbo durante l’acquisizione di immagini.

In un’altra forma di realizzazione, l’elemento di base è provvisto, almeno parzialmente integrato in esso, di un dispositivo di pompaggio disposto a valle del canale che è direttamente collegato all’estremità di uscita della microscanalatura. Il dispositivo di pompaggio comprende almeno un elemento di contenimento del fluido analizzato ed un elemento di aspirazione previsto per aspirare il fluido facendolo passare attraverso il microcanale, e per mantenere aderenti fra loro la prima superficie dell’elemento di base e la seconda superficie della piastra di copertura mediante un effetto ventosa che garantisce la tenuta idraulica della camera di perfusione.

Questa soluzione realizzativa permette di ottenere una camera di perfusione di tipo monouso che non richiede il lavaggio della stessa dopo l’utilizzo, e che evita qualsiasi condizioni in cui l’operatore possa andare a contatto con il fluido.

In ulteriori forme di realizzazione, la camera di perfusione comprende mezzi di pressione integrati che sono adatti a mantenere la prima superficie dell’elemento di base a contatto contro la seconda superficie della piastra di copertura.

Il vantaggio di tali mezzi di pressione è che favoriscono l’aderenza fra la prima e seconda superficie, per ottenere una tenuta idraulica tra elemento di base e piastra di copertura della camera di perfusione.

Ad esempio è possibile prevedere che detti mezzi di pressione comprendano dispositivi per ammorsare meccanicamente o elementi magnetici che, per attrazione reciproca, mantengono un contatto coordinato fra la piastra di copertura e l’elemento di base.

Il presente trovato è anche relativo ad un’apparecchiatura per l’analisi dinamica ed in tempo reale della patologia trombotico-ischemica ed emorragica che comprende una camera di perfusione del tipo sopra descritta.

L’apparecchiatura comprende inoltre un circuito in cui è atto a scorrere il suddetto fluido, ed eventualmente un dispositivo di pompaggio, nel caso in cui non sia almeno in parte integrato nella camera di perfusione, per movimentare il fluido attraverso il circuito ed il microcanale in condizioni fluidodinamiche controllate e selettivamente variabili.

Il circuito, per come qui riferito, è da intendersi chiuso rispetto aH’ambiente esterno ovvero tale da impedire qualsiasi fuoriuscita o perdita di fluidi, che potrebbero generare contaminazioni, o andare a contatto con l’operatore.

Sono previsti, inoltre, mezzi di acquisizione ottica di immagini o video e mezzi di elaborazione elettronica adatti rispettivamente ad acquisire, vantaggiosamente ad elevata frequenza nell’ordine di circa 25-30 frame/secondo, ed elaborare immagini del flusso in movimento dall’almeno un microcanale della camera di perfusione. In alcune forme di realizzazione, i mezzi di acquisizione ottica di immagini o video comprendono vantaggiosamente almeno un modulo ottico per microscopia in fluoroescenza, collegato in serie a mezzi di ripresa, ad esempio una telecamera o macchina fotografica. I mezzi di ripresa sono ad esempio, ma non solo, del tipo CCD, e presentano integrato un sistema di registrazione/acquisizione, collegato ai mezzi di elaborazione elettronica, quale un sistema computerizzato digitale che reca memorizzato un programma per computer. Il programma, quando eseguito nella memoria del sistema computerizzato, è in grado di analizzare, acquisendo in tempo reale, le variazioni morfologiche, cinetiche, biochimiche interne ed esterne alle piastrine e la formazione del trombo e sua stabilizzazione, in risposta a differenti forze di scorrimento applicate e differenti superfici citoadesive.

Secondo un’ulteriore forma di realizzazione possono essere previsti ulteriori mezzi di pressione adatti a premere ed a mantenere premuti fra loro la piastra di copertura contro l’elemento di base per garantire la tenuta idraulica della camera di perfusione.

Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, i mezzi di pressione comprendono un elemento di appoggio associato ad un elemento elastico ed un elemento di copertura. La camera di perfusione viene disposta in uso sull’elemento elastico e l’elemento di copertura è predisposto per mantenere premuto rispettivamente la piastra di copertura contro l’elemento di appoggio, e l’elemento di appoggio contro l’elemento elastico assorbendo, in questo modo, eventuali non parallelismi fra le superfici di contatto e garantendo un’aderenza sostanzialmente continua fra le due superfici di cartuccia e piastra.

In un’ulteriore forma di realizzazione, in cui il dispositivo di pompaggio non è previsto integrato nella camera di perfusione, esso è disposto a valle della camera di perfusione ed è configurato per aspirare il fluido facendolo passare attraverso il suddetto almeno un microcanale. Il vantaggio di operare in aspirazione è che, quando il dispositivo di pompaggio è in funzione, esso determina l’aspirazione della piastra di copertura contro l’elemento di base, generando un effetto ventosa che garantisce la tenuta idraulica della camera di perfusione.

Con il presente trovato è, quindi, possibile eseguire un test della funzionalità piastrinica e del processo coagulativo in condizioni dinamiche che non possono essere valutate dai dispositivi esistenti nella tecnica. A differenza delle apparecchiature comunemente utilizzate nel settore, il presente trovato consente di simulare l’ambiente vascolare del corpo umano o animale e di acquisire in tempo reale le informazioni relative alla formazione di trombi.

Infatti, il presente trovato restituisce un’informazione dinamica sul test di formazione del trombo, al contrario dell’informazione puntuale (analisi end point) restituita dalla maggioranza dei dispositivi diagnostici che studiano la funzionalità piastrinica e/o la coagulazione.

Al fine di emulare con la massima fedeltà le condizioni fisiologiche durante il test, lo “shear rate” del flusso ematico è vantaggiosamente noto e controllato in tutti i microcanali della camera di perfusione, così come la temperatura di lavoro che deve essere vantaggiosamente pari alla temperatura fisiologica, (37°C nel caso del corpo umano). Ciò è particolarmente importante ed efficace per il monitoraggio delle terapie anti-coagulanti o anti-aggreganti.

Inoltre, con il presente trovato è possibile l’uso di sangue intero e senza aggiunta di sostanze che inducano artificialmente l’aggregazione. La presenza di tutte le componenti ematiche e l’assenza di un’induzione chimica dell’aggregazione rende il test più accurato (ovvero più vicino al valore vero) e, al tempo stesso, riduce il rischio biologico cui sono sottoposti gli operatori, dal momento che il campione ematico subisce meno manipolazioni.

Il presente trovato si riferisce anche ad un procedimento per l’analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica che comprende una prima fase in cui un fluido, quale sangue, fluidi ematici, biologici, siano essi animali od umani e miscele di detti fluidi con sostanze additive, viene immesso e movimentato in condizioni fluidodinamiche controllate e variabili, attraverso un circuito mediante un dispositivo di pompaggio. In particolare, il fluido biologico viene fatto passare attraverso almeno un microcanale di una camera di perfusione in cui è presente un substrato reattivo, finalizzato all’analisi da eseguire, quale un citoadesivo, atto a simulare una superficie vasale lesionata e a riprodurre fenomeni e processi di emostasi. Il procedimento comprende anche almeno una seconda fase di acquisizione e di elaborazione delle immagini acquisite, dall’almeno un microcanale, mediante mezzi di acquisizione ottica di immagini o video, ed elaborate mediante mezzi di elaborazione elettronica. La camera di perfusione è vantaggiosamente realizzata con un materiale che consente l’acquisizione ottica di immagini o video del flusso ematico all<*>interno dell’almeno un microcanale mediante i mezzi di acquisizione ottica di immagini o video.

Secondo un aspetto del procedimento, durante la prima fase il fluido viene introdotto nella camera di perfusione la quale comprende almeno un elemento di base avente almeno una prima superficie sulla quale viene disposta, con una sua seconda superficie, una piastra di copertura per richiudere una microscanalatura e definire detto microcanale. La microscanalatura è ricavata aperta superiormente su almeno una fra la prima e la seconda superficie, ha una voluta profondità, nell’ordine dimensionale micrometrico, che si estende longitudinalmente per un voluto tratto parziale e presenta almeno due estremità rispettivamente di ingresso e di uscita collegate fluidicamente con il suddetto circuito.

In alcune forme di realizzazione, il flusso di liquido biologico viene immesso mediante aspirazione nel circuito, in modo da creare un effetto ventosa tra piastra di copertura ed elemento di base, incrementando sia l’aderenza fra la prima superficie e la seconda superficie sia la tenuta idraulica.

Secondo un’ulteriore aspetto del procedimento, durante la prima fase la piastra di copertura viene compressa mediante mezzi di pressione contro l’elemento di base facendo aderire sia la prima che la seconda superficie per garantire la voluta tenuta.

Secondo un’ulteriore aspetto, prima della prima fase di scorrimento del fluido biologico è prevista una fase di avvinamento (priming) in cui una soluzione di liquido biologicamente inerte, tipicamente soluzione fisiologica, viene introdotta attraverso il circuito e fatta passare attraverso il microcanale della camera di perfusione per allagare il microcanale ed le regioni circostanti il microcanale. Tale fase di avvinamento determina la formazione di una guarnizione di tenuta liquida tra piastra di copertura ed elemento di base, per generare una tenuta idraulica fra esse e garantire, in questo modo, che successivamente, durante l’attraversamento del fluido biologico attraverso i microcanali, quest’ultimo rimanga confinato all’interno della microscanalatura senza pericolo di fuoriuscita dalla camera di perfusione, contaminazioni degli altri microcanali presenti o influenza sull’affidabilità della misura dello shear-rate.

L’abbinamento dell’effetto ventosa di cui sopra con la realizzazione di una guarnizione liquida, con la complanarità tra piastra di copertura ed elemento di base e con la pressione esercitata dai mezzi di pressione, consente di garantire un’elevata tenuta idraulica, idonea alle analisi da eseguire, consentendo, quindi, un’elevata affidabilità e riproducibilità delle stesse.

Il presente trovato si riferisce, inoltre, anche ad un procedimento per la diagnosi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica che utilizza un’apparecchiatura ed un procedimento di analisi come con riferimento alle rivendicazioni annesse.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:

- la fig. 1 è una rappresentazione schematica di un’apparecchiatura per l’analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica che utilizza una camera di perfusione secondo il presente trovato;

- la fig. 2 è una rappresentazione schematica in pianta di un particolare di fig. 1; - la fig. 3 è una vista frontale di una parte di fig. 2;

- la fig. 4 è una vista in sezione di fig. 2 lungo la linea IV-IV;

- la fig. 5 è una vista laterale parzialmente sezionata di fig. 1 ;

- la fig. 6 è una vista ingrandita di un particolare di fig. 1 ;

- la fig. 7 è un particolare ingrandito di fig. 5;

- la fig. 8 è un particolare ingrandito di fig. 6;

- la fig. 9 è una vista in pianta di fig. 5;

- la fig. 10 è un grafico dell’andamento della percentuale di trombi che coprono la superficie di adesione del microcanale in funzione del tempo, in accordo con tre diversi comportamenti clinici;

- la fig. 11 è una vista laterale di una variante di fig. 4;

- la fig. 12 è una vista in pianta di una variante di fig. 2;

- la fig. 13 è una vista di una camera di perfusione secondo una variante realizzativa;

- la fig. 14 è una vista prospettica di una camera di perfusione secondo un’ulteriore variante.

Per facilitare la comprensione, numeri di riferimento identici sono stati utilizzati, ove possibile, per identificare elementi comuni identici nelle figure. DESCRIZIONE DI ALCUNE FORME PREFERENZIALI DI REALIZZAZIONE

Con riferimento a fig. 1, un’apparecchiatura per l’analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica viene indicata nel suo complesso con il numero di riferimento 10 e comprende un dispositivo di alimentazione fluidi 11 verso una camera di perfusione 12 mediante un circuito idraulico 13, una pressa 14, un dispositivo di acquisizione ottica 15 di immagini o video ed un’unità di elaborazione 16 delle immagini acquisite dal dispositivo di acquisizione ottica 15. II dispositivo di alimentazione fluidi 11 comprende un primo condotto 19 di introduzione di un fluido da analizzare, nel caso di test coagulativo del sangue, un secondo condotto 20 associato ad un primo contenitore 21 contenente una soluzione di liquido biologicamente inerte, tipicamente soluzione fisiologica, ad esempio, fisiologica ed un terzo condotto 22 associato ad un secondo contenitore 23 contenente una soluzione di lavaggio.

Il fluido da analizzare può essere fluido biologico, sangue, fluidi ematici siano essi animali o umani, e miscele di detto fluido con sostanze additive, oppure un fluido non biologico.

Ciascuno dei tre condotti 19, 20, 22 è provvisto di valvole di intercettazione, tipo elettrovalvole, 25, vantaggiosamente servocomandate, per la selettiva introduzione del fluido da analizzare, della soluzione fisiologica, o della soluzione di lavaggio verso la camera di perfusione 12.

Il primo, secondo e terzo condotto 19, 20, 22 convergono in un nodo di distribuzione 26 dal quale si dipartono tre derivazioni 27.

In altre forme di realizzazione è possibile prevedere un unico condotto per l’introduzione sia della soluzione fisiologica e sia della soluzione di lavaggio. Le valvole di intercettazione 25 fungono da selettori del passaggio o meno del flusso, ed inoltre evitano un riflusso del fluido che si sta immettendo da un condotto, verso gli altri due condotti.

Ciascuna derivazione 27 è provvista di una valvola di intercettazione, tipo elettrovalvola, 31 controllata dall’unità di elaborazione 16 per permettere il selettivo scorrimento, attraverso essa, del sangue, della soluzione fisiologica, o della soluzione di lavaggio.

In particolare ciascuna valvola di intercettazione 31 è del tipo “clamping” realizzata con materiali biocompatibili, e tali da non indurre nel fluido che lo attraversa un incremento della temperatura che potrebbe inficiare la validità dell’analisi.

Le derivazioni 27 si connettono alla camera di perfusione 12 in prossimità di rispettive sedi di entrata 32, con le modalità che verranno descritte nel seguito. La camera di perfusione 12 comprende un elemento di base, anche chiamato cartuccia 36 ed una piastra di copertura (anche detta slide) 37 della cartuccia 36 e che in uso viene disposta a contatto contro una prima superficie, in seguito riportata superficie di adesione 39 della cartuccia 36.

La cartuccia 36 (figg. 2 - 4) ha forma sostanzialmente parallelepipeda ed è provvista, in un suo primo lato 41, delle suddette sedi di entrata 32 e in un suo secondo lato 42, contrapposto al primo lato 41, di corrispondenti tre sedi di uscita 43.

Sia le sedi di entrata 32 sia le sedi di uscita 43 sono filettate internamente e ad esse si connettono direttamente e rispettivamente le derivazioni 27, e condotti di evacuazione 45 dei fluidi.

Le sedi di entrata 32 e di uscita 43 sono ricavate sostanzialmente cieche, ed hanno superfici di riscontro 33 che terminano sostanzialmente ortogonali rispetto alle loro superfici laterali.

Inoltre, le filettature, alfinterno delle sedi di entrata 32 e di uscita 43 si estendono sostanzialmente per l’intera lunghezza di queste ultime di modo che quando le derivazioni 27, e i condotti di evacuazione 45 vengono connessi alle sedi di entrata 32 e rispettivamente alle sedi di uscita 43, le loro estremità vanno in battuta contro la superficie di riscontro 33 evitando che si generino, sul fondo delle sedi, zone di ristagno del fluido da analizzare, in cui si possono generare fenomeni indesiderati, come ad esempio la formazione di coaguli.

Questa particolare conformazione delle sedi 32 e 43 è tale da garantire la tenuta idraulica fra la camera di perfusione 12 e il circuito idraulico 13, di permettere una pulizia ottimale della stessa dopo l’esecuzione delle prove, e di evitare che il fluido da analizzare vada a contatto ad esempio con parti metalliche o altri materiali non biocompatibili.

In altre forme di realizzazione preferenziali, la connessione fra le derivazioni 27 e le sedi di entrata 32 e di uscita 43 sono realizzate mediante opportuni connettori a vite, o a scatto.

In prossimità delle superfici di riscontro 33 delle sedi 32 e 43 sono ricavati canali 46 comprendenti ciascuno un primo tratto 47 che si estende sostanzialmente parallelo alla direzione di estensione delle sedi 32 e 43 ed un secondo tratto 48 che si estende sostanzialmente ortogonale rispetto al primo tratto 47 e termina superiormente verso la superficie di adesione 39 con una svasatura 49 che si apre verso Γ esterno.

I canali 46 possono avere sezione qualsiasi e dimensioni di circa 1 mm di diametro, anche se il dimensionamento di tali canali 46 è realizzato per evitare la formazione di ristagni ed accumuli indesiderati di fluido, e nel contempo compatibile con le diminuzioni di sezione dei canali di ingresso. In particolare è necessario evitare che il flusso del fluido non venga ostacolato causa la brusca diminuzione di sezione.

La superficie di adesione 39 presenta tolleranze geometriche di planarità molto ristrette, per cooperare efficacemente con la piastra di copertura 37 sì da ottenere la voluta tenuta idraulica.

Nel caso di specie, tre microscanalature 51, chiuse perifericamente, sono ricavate internamente alla superficie di adesione 39 in corrispondenza delle svasature 49 e ciascuna di esse collega fra loro, in prossimità di una estremità di ingresso 5 la e di una estremità di uscita 51 b, rispettivamente una delle sedi di entrata 32 con una delle corrispondenti sedi di uscita 43. A tal fine le sedi di entrata 32 sono disposte sul primo lato 41 in posizione contrapposta rispetto alle sedi di uscita 43 disposte sul secondo lato 42.

La piastra di copertura 37, disposta a contatto contro la superficie di adesione 39, richiude le tre microscanalature 51 definendo rispettivi microcanali 54 chiusi attraverso i quali in opera vengono fatti passare i fluidi da analizzare, garantendo la tenuta idraulica della camera di perfusione 12.

Le tre microscanalature 51 sono disposte parallele fra loro, hanno uguali lunghezze e larghezze, e profondità diverse fra loro.

In particolare, la lunghezza delle microscanalature 51 è inferiore a quella dell’elemento di base 36, estendendosi per un voluto tratto parziale dell’elemento di base 36 stesso, in modo che, quando la piastra di copertura 37 viene posizionata, vada a cooperare direttamente e con continuità contro la superfìcie di adesione 39 dell’elemento di base 36, ottenendo la tenuta idraulica su tutto il profilo perimetrale che circonda la regione in cui sono ricavate le microscanalature 51.

In altre forme di realizzazione, le microscanalature 51 possono avere delle estensioni curve, o di intersezione fra loro a seconda del tipo di fenomeno che si vuole simulare.

La geometria delle singole microscanalature 51 ed il ‘disegno’ che esse formano nella camera di perfusione 12 dipende dal tipo di fenomeno che si vuole simulare e dal tipo di test che si desidera eseguire.

Le microscanalature 51 hanno dimensioni caratteristiche di tipo micrometrico, ad esempio profondità e larghezza fra loro differenti e possono variare da circa 100 μηι a circa 2000 μηι.

La forma della sezione trasversale delle tre microscanalature 51 è vantaggiosamente rettangolare, o quadrata per ottimizzare l’acquisizione di immagini da parte del dispositivo di acquisizione ottica 15, e assieme alla pressione con la quale viene immesso il fluido da analizzare, definiscono il tasso di scorrimento del fluido all’interno delle microscanalature 51.

Risulta vantaggioso prevedere che le pareti laterali delle microscanalature 51 si estendano sostanzialmente parallele fra loro, ed ortogonali rispetto alla superficie di adesione 39, per evitare fenomeni di riflessione durante l’acquisizione di immagini.

Inoltre, la sezione trasversale delle microscanalature 51 ha dimensioni sostanzialmente costanti lungo l’intera estensione per mantenere il flusso del fluido in una condizione di flusso laminare ed evitare fenomeni di turbolenza che possono portare alla formazione di trombi e quindi inficiare la validità delle prove. La piastra di copertura 37 è costituita sostanzialmente da una piastra avente uno spessore che a solo titolo esemplificativo è compresa fra 0,1 e 4 mm, vantaggiosamente fra 0,1 e 2 mm, e comunque compatibile con la capacità di profondità di campo del dispositivo di acquisizione ottica 15.

La piastra di copertura 37 è provvista di una prima faccia 52, ovvero di una seconda superficie che in uso è a contatto contro la superficie di adesione 39, e di una seconda faccia 53 contrapposta alla prima faccia 52.

La prima faccia 52, analogamente alla superficie di adesione 39, ha una tolleranza geometrica di planarità molto ristretta per rendere, in uso, la piastra di copertura 37 ad essa aderente.

Inoltre, per evitare problemi di riflessione durante l’acquisizione delle immagini, la prima 52 e la seconda faccia 53 sono realizzate sostanzialmente complanari fra loro.

Al fine di non creare effetti di distorsione ottica e/o rumore durante l’acquisizione delle immagini sia la cartuccia 36 che la piastra di copertura 37 sono realizzate con materiale avente un elevato grado di trasparenza ed un ridotto livello di auto-fluorescenza durante le condizioni analitiche di utilizzo.

Il materiale utilizzato per la realizzazione della cartuccia 36 e della piastra di copertura 37 è scelto in un gruppo comprendente vetro, COC (copolimeri ciclici a base olefinica), COP (polimeri ciclici a base olefinica), policarbonato ad elevato grado ottico o simili.

In una forma realizzazione, la cartuccia 36 viene ottenuta partendo da un blocco di policarbonato e mediante successive lavorazioni per asportazione di materiale, si provvede alla realizzazione delle sedi di entrata 32, uscita 43, dei canali 46 e delle microscanalature 5 1. Le lavorazioni per asportazione di materiale, rispetto ad altre tipologie di lavorazioni, infatti consentono di ottenere in modo agevole le volute proprietà di planarità e coplanarità delle superfici, di parallelismo fra le facce delle microscanalature 51, nonché le volute proprietà ottiche suddette per un’accurata analisi delle prove. Nello specifico le suddette lavorazioni per asportazione di materiale devono essere tali da non alterare le proprietà ottiche del materiale.

II circuito idraulico 13 disposto a valle della camera di perfusione 12 comprende almeno un dispositivo di pompaggio 55 predisposto per creare un’aspirazione attraverso la camera di perfusione 12 dei fluidi, ed un serbatoio di scarico 56 predisposto per accogliere i fluidi processati dopo l’esecuzione delle prove.

In particolare il dispositivo di pompaggio 55 esercita un’azione di depressione che aspira il fluido dalle derivazioni 27 e lo fa passare attraverso i microcanali 54 con una pressione definita e controllata. Il dispositivo di pompaggio 55 oltre a garantire il flusso del fluido da analizzare esercita sulla piastra di copertura 37 un effetto ventosa che la rende aderente alla cartuccia 36.

Un’ulteriore azione di pressione viene esercitata dalla pressa 14 la quale provvede a mantenere la piastra di copertura 37 in pressione contro la superficie di adesione 39 della cartuccia 36, e quindi garantire in modo certo la tenuta idraulica della camera di perfusione 12.

In alcune forme di realizzazione, l’azione di depressione esercitata dal dispositivo di pompaggio 55 è sufficiente a mantenere ben aderenti la piastra di copertura 37 con la cartuccia 36, non ritenendo necessario l’utilizzo della pressa 14.

La pressa 14 (figg. da 5 a 9) comprende un elemento di appoggio o portacartuccia 59, un elemento elastico 60 disposto sul fondo dell’elemento portacartuccia 59 e sul quale, in uso, viene disposta la cartuccia 36, ed un elemento di copertura 62 che in uso è disposto a contatto contro la piastra di copertura 37. L’elemento di copertura 62 comprende mezzi di attuazione, non rappresentati nei disegni, che provvedono ad esercitare una pressione sulla piastra di copertura 37 e mantenere quest’ultima aderente contro la superficie di adesione 39 della cartuccia 36.

L’elemento elastico 60 permette di compensare eventuali differenti inclinazioni della cartuccia 36 dovute all’azione dei mezzi di attuazione per ottenere un voluto parallelismo tra le varie facce di adesione.

L’elemento di copertura 62 (fig. 9) può essere realizzato in materiale metallico o plastico non trasparente alle radiazioni ed è provvisto di un’apertura 63 per permettere il passaggio delle radiazioni luminose, luce visibile e/o luce di fluorescenza, per la rilevazione delle immagini dalla camera di perfusione 12. In particolare, l’acquisizione delle immagini avviene sostanzialmente nel tratto rettilineo ovvero in zone in cui il flusso del fluido non è turbolento, come ad esempio in prossimità delle svasature 49 di entrata e di uscita del fluido nei microcanali 54.

Il dispositivo di acquisizione ottica 15 può essere una macchina fotografica od una telecamera associati a moduli ottici per microscopia.

Il dispositivo di acquisizione ottica 15 può essere ad esempio un’apparecchiatura per l’analisi di epifluorescenza per evidenziare le piastrine e la fibrina marcate con un’opportuna sonda fluorescente che aderiscono al substrato citoadesivo, oppure un’apparecchiatura per un’altra tipologia di test basata su un diverso biomarcatore.

Il dispositivo di acquisizione ottica 15 può comprendere un modulo ottico 65 per rilevare l’immagine dei trombi adesi al substrato citoadesivo, il quale nel caso di specie è scorrevole lungo una guida 66 (figg. 5 e 6) per portarsi in prossimità di uno dei microcanali 54 ed acquisire le immagini.

Il modulo ottico 65 comprende sorgenti di radiazione luminosa di tipo a mercurio, o xenon o lampade a led.

In forme di realizzazione preferenziali, il modulo ottico 65 comprende lampade a led di tipo stroboscopio che viene selettivamente alimentata per emettere radiazioni luminose solo in determinati istanti temporali di acquisizione delle immagini. In questo modo si riduce notevolmente l’energia termica irradiata ed allo stesso tempo si riducono i rischi di attivazione e coagulazione del sangue. Nello specifico il modulo ottico 65 è predisposto per acquisire una sequenza di fotogrammi, vantaggiosamente ad alta frequenza nell’ordine di circa 25 - 30 frame/secondo, o un filmato video, che permettono l’analisi della cinetica di formazione di trombi od emorragica.

L’unità di elaborazione 16 è predisposta per elaborare i fotogrammi o il filmato acquisito dal modulo ottico 65 per determinare l’evoluzione della prova.

L’apparecchiatura 10 del presente trovato può comprendere vantaggiosamente mezzi di termostatazione per mantenere la camera di perfusione 12 ad una voluta temperatura vantaggiosamente alla temperatura fisiologica che nel caso del corpo umano è di circa 37 °C.

II procedimento per l’analisi della patologia trombotico-ischemica ed emorragica utilizzante un’apparecchiatura 10 come sopra decritta viene di seguito descritto.

Il procedimento comprende almeno una fase in cui un campione di fluido ematico viene prelevato da un paziente ed opportunamente preparato secondo modalità che variano in funzione delle prove che si vogliono ottenere.

Nello specifico è richiesto almeno un prelievo di sangue venoso correttamente eseguito ovvero senza stravasi ematici, rotture di vene o simili, la conservazione temporanea del sangue in una provetta contenente sostanze anticoagulanti come ad esempio eparina, citrato o simili, e l’aggiunta di sostanze fluorescenti ad esempio Quinacrina, anticorpo antifibrina ficoeritrinato e, a seconda delle tipologie di prove di ulteriori biomarcatori o anche detti biomarkers.

L’apparecchiatura 10 si trova nella configurazione rappresentata in fig. 1 ovvero nella condizione in cui la camera di perfusione 12 è disposta sull’elemento portacartuccia 59, la pressa 14 mantiene in pressione la piastra di copertura 37 contro la cartuccia 36 e le derivazioni 27 e i condotti di evacuazione 45 sono connessi alla cartuccia 36 rispettivamente nelle sedi di entrata 32 e nelle sedi di uscita 43.

La piastra di copertura 37 ed eventualmente anche la superficie di adesione 39 o le microscanalture 51 sono rivestite con sostanze collageni, ovvero sostanze citoadesive del tutto simili a quelle presenti normalmente in un vaso sanguigno lesionato. Il contatto fra il sangue e la sostanza citoadesiva comportano la formazione e stabilizzazione di un trombo. Le sostanze citoadesive utilizzabili possono essere ad esempio quelle riportate nella suddetta domanda di brevetto europeo 06819957.9, qui interamente incorporata come riferimento.

In questa condizione è prevista una fase preparatoria della camera di perfusione 12, anche detta fase di avvinamento (priming), in cui la soluzione fisiologica contenuta nel primo contenitore 21 viene aspirata, mediante il dispositivo di pompaggio 55, attraverso i canali 46 per riempire per capillarità i microcanali 54 ed allagare parzialmente le zone circostanti i microcanali stessi 54.

La soluzione fisiologica, sia per effetto dell’azione aspirante dei dispositivi di pompaggio 55, sia per effetto dell’azione dei dispositivi di attuazione della pressa 14, entrambi i quali garantiscono l’adesione della piastra di copertura 37 con la superficie di adesione 39, genera fra la prima faccia 52 della piastra di copertura 37 e la superficie di adesione 39 della cartuccia 36 un effetto guarnizione liquida che garantisce la tenuta idraulica ed evita contaminazioni ematiche fra un microcanale 54 e l’altro.

Successivamente è prevista una fase di introduzione del fluido contenuto nella provetta all’interno della camera di perfusione 12, attraverso il primo condotto 19. Il fluido viene aspirato mediante i dispositivi di pompaggio 55 ed attraversa i microcanali 54 entrando in contatto con la sostanza citoadesiva in essa presente.

Non appena inizia il processo di aggregazione piastrinica, quando il sangue viene in contatto con la sostanza citoadesiva e le piastrine si attivano e cominciano ad aggregarsi, viene avviata una fase di acquisizione delle immagini in cui il modulo ottico 65 acquisisce in tempo reale un filmato e/o una sequenza di fotogrammi che permetteranno l’analisi della cinetica di formazione dei trombi sull’evoluzione del processo da parte dell’unità di elaborazione 16.

Nello specifico le sostanze fluorescenti introdotte nel fluido vengono evidenziate tramite le lampade suddette per fornire una immagine che viene opportunamente raccolta dal modulo ottico 65.

II test di formazione del trombo può essere eseguito in luce visibile e in luce di fluorescenza. Tuttavia, modificando opportunamente il modulo ottico 65, la stessa camera di perfusione 12 può essere utilizzata anche per test differenti che utilizzano illuminazione con lunghezze d’onda differenti da quelle attuali. E possibile, inoltre, condurre un’analisi contemporanea del segnale a più lunghezze d’onda.

Una successiva fase di elaborazione prevede che l’unità di elaborazione 16, mediante software dedicati, valuti in modo dinamico l’evoluzione del processo di aggregazione piastrinica e del processo coagulativo nel tempo determinando due curve primarie che rappresentano la percentuale di area dei microcanali 54 coperta da trombi nonché la dimensione di trombi in funzione del tempo di acquisizione. In particolare, la comparazione della curva rappresentante la copertura dell’area da parte di trombi è necessaria per discriminare, a parità d’area coperta, la presenza di tanti trombi di piccole dimensioni o la presenza di pochi trombi di grosse dimensioni, che danno informazioni cliniche diverse.

L’unità di elaborazione 16 fornisce una serie di dati, informazioni e/o grafici dell’andamento del processo di coagulazione anche in funzione del tempo.

A solo titolo esemplificativo, in fig. 10 è riportato un grafico riportante l’andamento della percentuale di copertura di aggregati piastrinici della superficie di adesione del microcanale in funzione del tempo, in tre differenti comportamenti clinici.

In particolare: la curva indicata con A ha un andamento sostanzialmente rettilineo ed identifica un paziente con valori nella norma, la curva B ha un andamento sostanzialmente esponenziale ed identifica un paziente avente una predisposizione a patologie “trombotiche”, e la curva C ha un andamento sostanzialmente logaritmico ed identifica un paziente avente una predisposizione a patologie “emorragiche”.

È chiaro che all’apparecchiatura per l’analisi della patologia tromboticoischimica ed emorragica fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall’ambito del presente trovato.

Ad esempio, con riferimento a fig. 11 viene illustrata un’ulteriore forma di realizzazione di una camera di perfusione 12, ed in particolare di una cartuccia 136 sostanzialmente analoga a quanto descritto in precedenza e comprendente inoltre, un serbatoio di miscelazione 169 che è disposto in una posizione intermedia lungo il canale 46, direttamente collegato all’estremità di ingresso 5 la della microscanalatura 51, ed un dispositivo di pompaggio 155 integrato nella cartuccia 136 e direttamente collegato all’altro canale 46.

Il serbatoio di miscelazione 169 genera un allargamento di sezione del canale 46 e quindi una turbolenza del fluido da analizzare che permette la miscelazione di sostanze additive che possono essere aggiunte attraverso un condotto 170. Il condotto 170 è collegabile con l’esterno mediante connessioni analoghe a quelle previste per le sedi di entrata 32 oppure con tappi perforabili da siringhe con le quali viene immessa la sostanza additiva. Le sostanze additive aggiunte possono essere biomarcatori, sostanze anticoagulanti come ACD oppure soluzioni di calcio che attivano reazioni enzimatiche nel fluido da analizzare.

Sull’altro canale 46, anziché prevedere le sedi di uscita 43, il fluido analizzato e passato attraverso il microcanale 54 rimane integrato all’interno del dispositivo di pompaggio 155. Nello specifico il dispositivo di pompaggio 155 comprende una camicia cilindrica 171 all’interno della quale viene fatto scorrere uno stantuffo 172 selettivamente scorrevole vantaggiosamente mediante opportuni mezzi di attuazione, non rappresentati nelle figure.

Azionando lo stantuffo 172 viene generata una depressione all’interno del microcanale 54 che oltre ad aspirare il fluido dalla sede di entrata 32, genera un effetto ventosa fra la superficie di adesione 39 della cartuccia 36 e la prima faccia 52 della slide 37 per garantire la tenuta idraulica ed evitare qualsiasi contatto dell’operatore con il fluido analizzato.

In altre forme di realizzazione (fig. 12), anziché prevedere il serbatoio 169 per la miscelazione del fluido con le sostanze additive, la cartuccia 136 è provvista di un ulteriore condotto ausiliario 175 che si connette con una sua convergenza 176 in prossimità del primo tratto 47 del canale 46 di immissione del fluido da analizzare. Attraverso il condotto ausiliario 175 è quindi possibile provvedere all’immissione delle suddette sostanze additive.

In un’altra forma di realizzazione semplificata della camera di perfusione 12 (fig. 13), si può prevedere che la microscanalatura 51 sia stata ricavata longitudinalmente attraverso tutta la sua superficie di adesione 39 e che le estremità di ingresso 5 la e di uscita 5 lb terminino, aperte verso l’esterno, in prossimità dei lati 41, 42 della cartuccia 36 stessa. Opportune svasature, o sedi di alloggiamento, ricavate in prossimità delle estremità di ingresso 51a e di uscita 51 b permettono il collegamento di condotti per l’immissione/evacuazione del fluido. In ulteriori forme di realizzazione ancora, anziché prevedere l’utilizzo di una pressa 14 per mantenere fra loro aderenti la slide 37 con la cartuccia 36, è possibile prevedere che fra essi vengano interposti mezzi di pressione che esercitano un’azione di compressione fra le suddette due parti garantendo al tempo stesso la tenuta idraulica. In una particolare forma di realizzazione (fig. 14) si può prevedere che i suddetti mezzi di pressione comprendano magneti 68 che sono associati, vantaggiosamente in prossimità degli angoli della cartuccia 36 e della slide 37, e disposti fra loro in posizioni coniugate per esercitare un’azione attrattiva fra queste ultime due parti.

Risulta vantaggioso prevedere di combinare quanto descritto con riferimento a fig. 11 con quanto descritto con riferimento a fig. 14 per realizzare kit già preconfezionati, pronti per l’uso, e di tipo usa e getta. In particolare, la superficie di adesione 39 della cartuccia 136 e la prima faccia 52 della slide 37 vengono opportunamente pretrattate per renderle idrofile, sulla superficie di adesione 39 viene riportato un substrato reattivo, finalizzato all’analisi da eseguire, quale citoadesivo, per simulare una superfìcie vasale lesionata, e mediante i magneti 68 è possibile accoppiare fra loro la cartuccia 136 con la slide 37 a costituire la camera di perfusione 12 pronta per l’uso. La camera di perfusione 12 così ottenuta può essere opportunamente confezionata in ambiente controllato per renderla disponibile al bisogno senza richiedere ulteriore operazioni di preparazione della stessa.

Dopo l’utilizzo la camera di perfusione 12 può essere opportunamente smaltita senza richiedere operazioni di lavaggio o di pulizia ed evitando che l’operatore entri in contatto con il fluido processato. Infatti, il fluido analizzato rimane confinato all’interno della camicia cilindrica 171 del dispositivo di pompaggio 155.

Claims (17)

1. RIVENDICAZIONI 1. Camera di perfusione per l’analisi dinamica della patologia tromboticoischemica ed emorragica, comprendente almeno un microcanale (54) atto ad essere collegato ad un circuito (13) ed in cui è atto a scorrere un fluido quale un fluido biologico, tipo sangue od altri fluidi ematici, siano essi animali od umani e miscele di detti fluidi con sostanze additive, oppure un fluido non biologico, ed in cui è presente almeno un substrato reattivo, finalizzato all’analisi da eseguire, quale un substrato citoadesivo, per simulare una superficie vasale lesionata e riprodurre fenomeni e processi di emostasi, detta camera di perfusione essendo realizzata con un materiale che consente l’acquisizione ottica in fluorescenza e non di immagini o video del flusso di fluido all’interno di detto almeno un microcanale (54), caratterizzata dal fatto che comprende un elemento di base (36) avente almeno una prima superficie (39) sulla quale, in uso, è adatta ad essere disposta, con una sua seconda superficie (52), una piastra di copertura (37), e che almeno una microscanalatura (51), dell’ordine dimensionale micrometrico, è ricavata aperta superiormente su almeno una fra detta prima superficie (39) e detta seconda superficie (52), è provvista di due estremità rispettivamente di ingresso (5 la) e di uscita (51 b) per il collegamento fluidico ad un circuito (13) di alimentazione/evacuazione di detto fluido; detta seconda (52) e/o prima superficie (39) richiudendo detta almeno una microscanalatura (51) e delimitando detto microcanale (54).
2. 2. Camera di perfusione come nella rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detta microscanalatura (51) è ricavata su detta prima superficie (39) di detto elemento di base (36) e detta seconda superfìcie (52) della piastra di copertura (37) richiude superiormente detta microscanalatura (51).
3. 3. Camera di perfusione come nella rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che dette due estremità di ingresso (5 la) e di uscita (51 b) sono collegate fluidicamente a detto circuito (13) mediante rispettivi canali (46) ricavati almeno trasversalmente attraverso lo spessore dell’elemento di base (36).
4. 4. Camera di perfusione come nella rivendicazione 3, caratterizzata dal fatto che il canale (46) che è direttamente collegato a detta estremità di ingresso (51a), è associato ad un condotto ausiliario (170; 175) ricavato in detto elemento di base (36) per l’immissione di sostanze additive nel fluido da analizzare.
5. 5. Camera di perfusione come nella rivendicazione 4, caratterizzata dal fatto che detto canale (46) che è direttamente collegato a detta estremità di ingresso (5 la) è provvisto di almeno un serbatoio di miscelazione (169) di detto fluido da analizzare con dette sostanze additive.
6. 6. Camera di perfusione come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detta microscanalatura (51) è definita da pareti che si estendono sostanzialmente ortogonali e parallele rispetto alla prima superficie (39).
7. 7. Camera di perfusione come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detta prima superficie (39) e detta seconda superficie (52) sono sostanzialmente complanari fra loro.
8. 8. Camera di perfusione come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che detto elemento di base (36) è provvisto di un dispositivo di pompaggio (155), almeno parzialmente integrato, il quale è disposto a valle del canale (46) che è direttamente collegato a detta estremità di uscita (5 lb), e che comprende almeno un elemento di contenimento (171) del fluido analizzato ed un elemento di aspirazione (175) adatto ad aspirare il fluido facendolo passare attraverso detto microcanale (54), ed a mantenere aderenti fra loro detta prima superficie (39) dell’elemento di base (136) e detta seconda superficie (52) della piastra di copertura (37).
9. 9. Camera di perfusione come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che comprende mezzi di pressione (68) integrati adatti a mantenere la prima superficie (39) dell’elemento di base (36) a contatto contro la seconda superficie (52) della piastra di copertura (37).
10. 10. Apparecchiatura per l’analisi dinamica della patologia trombotico-ischemica ed emorragica comprendente: - un circuito (13) in cui è atto a scorrere un fluido quale sangue, fluidi ematici, biologici, siano essi animali od umani e miscele di detti fluidi con sostanze additive; - una camera di perfusione (12) come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, collegata a detto circuito (13); - un eventuale dispositivo di pompaggio adatto a movimentare il fluido attraverso il circuito (13) ed il microcanale (54) in condizioni fluidodinamiche controllate e selettivamente variabili; - mezzi di acquisizione ottica (15) di immagini o video e mezzi di elaborazione elettronica (16) adatti ad acquisire in tempo reale e ad elaborare immagini del flusso di fluido da detto almeno un microcanale (54) della camera di perfusione (12).
11. 11. Apparecchiatura come nella rivendicazione 10, caratterizzata dal fatto che il dispositivo di pompaggio (55) è disposto a valle di detta camera di perfusione (12) ed è predisposto per aspirare il fluido facendolo passare attraverso detto microcanale (51), e per mantenere aderenti fra loro detta prima superfìcie (39) dell’elemento di base (36) e detta seconda superficie (52) della piastra di copertura (37).
12. 12. Apparecchiatura come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzata dal fatto che comprende mezzi di pressione (14; 68) adatti a mantenere la prima superficie (39) dell’elemento di base (36) a contatto contro la seconda superficie (52) della piastra di copertura (37).
13. 13. Apparecchiatura come nella rivendicazione 12, caratterizzata dal fatto che detti mezzi di pressione (14) comprendono un elemento di appoggio (59) associato ad un elemento elastico (60) predisposto per accogliere detta camera di perfusione (12), ed un elemento di copertura (62) predisposto per mantenere premuti rispettivamente detta piastra di copertura (37) contro detto elemento di appoggio (59), e detto elemento di appoggio (59) contro detto elemento elastico (60).
14. 14. Procedimento per l’analisi dinamica della patologia trombotico-ischemica ed emorragica comprendente una prima fase in cui un fluido quale un fluido biologico, tipo sangue od altri fluidi ematici, siano essi animali od umani e miscele di detti fluidi con sostanze additive, oppure un fluido non biologico, viene fatto scorrere, in condizioni fluidodinamiche controllate e variabili, attraverso un circuito (13) mediante un dispositivo di pompaggio (55; 155), detto fluido venendo fatto passare attraverso almeno un microcanale (54) di una camera di perfusione (12) in cui è presente un substrato reattivo, finalizzato all’analisi da eseguire, quale un substrato citoadesivo, per simulare una superficie vasale lesionata e per riprodurre fenomeni e processi di emostasi, ed almeno una seconda fase di acquisizione ottica e di elaborazione di immagini o video acquisite, da detto almeno un microcanale (54) mediante mezzi di acquisizione ottica di immagini o video (15), ed elaborate mediante mezzi di elaborazione elettronica, ed in cui detta camera di perfusione (12) è realizzata con un materiale che consente l’acquisizione ottica di immagini o video del flusso di fluido all’interno di detto almeno un microcanale (54) mediante detti mezzi di acquisizione ottica di immagini o video (15), caratterizzato dal fatto che durante detta prima fase detto fluido viene introdotto in detta camera di perfusione (12) la quale comprende almeno un elemento di base (36) avente almeno una prima superficie (39) sulla quale viene disposta, con una sua seconda superficie (52), una piastra di copertura (37) per richiudere una microscanalatura (51) e definire detto microcanale (54), detta microscanalatura (51) essendo ricavata aperta superiormente su almeno una fra la prima (39) e la seconda superficie (52), avente una voluta profondità, nell’ordine dimensionale micrometrico, che si estende longitudinalmente per un voluto tratto parziale e presentante almeno due estremità rispettivamente di ingresso (5 la) e di uscita (51 b) collegate fluidicamente con detto circuito (13).
15. 15. Procedimento come nella rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che il flusso di fluido viene immesso e movimentato attraverso detto almeno un microcanale (54) per aspirazione, mediante detto dispositivo di pompaggio (55; 155) il quale provvede anche a mantenere detta prima superficie (39) dell’elemento di base (36) e detta seconda superficie (52) della piastra di copertura (37) aderenti fra loro.
16. 16. Procedimento come nella rivendicazione 14 o 15, caratterizzato dal fatto che durante detta prima fase la piastra di copertura (37) viene compressa mediante mezzi di pressione (14; 68) contro l’elemento di base (36) per far aderire detta prima superficie (39) e detta seconda superficie (52).
17. 17. Procedimento come in una qualsiasi delle rivendicazioni da 14 a 16, caratterizzato dal fatto che prima di detta prima fase di scorrimento del fluido è prevista una fase di avvinamento in cui una soluzione di liquido biologicamente inerte, tipicamente soluzione fisiologica, viene introdotta attraverso detto circuito (13) e fatta passare attraverso detto microcanale (54) della camera di perfusione (12) per allagare detto microcanale (54) e le regioni circostanti il microcanale (54) stesso.