ITUA20164041A1 - Estratti di rami di Sambucus nigra L., procedimento per la loro produzione e loro impieghi - Google Patents
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Description
Estratti di rami di Sambucus nigra L, procedimento per la loro produzione e loro impieghi
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento per la preparazione di un estratto di rami di Sambucus nigra L, l’estratto così ottenuto e il suo impiego nella di una serie di preparati dermocosmetici. Gli estratti sono stati caratterizzati attraverso l’analisi chimica, consentendo l’identificazione di una serie di principi attivi in grado di attenuare significativamente alcune alterazioni cutanee, dovute a piccole ferite, infezioni batteriche, eritemi solari anche gravi e a punture di insetto, inoltre alcune di queste sostanze sono capaci di attenuare le macchie cutanee da malattie esantematiche. Sono state identificate le formulazioni per la preparazione di creme, gel, spray, colluttorio e sapone liquido anche per l’igiene intima.
Stato della tecnica
Esistono numerosi studi biochimici e chimici sui principi attivi del Sambucus nigra L; nella corteccia sono stati isolati α-amyrenone (URS-12-en-3-one), α-amyrin, betulin, acido oleanolico, beta-sitosterolo [3] , così come β-nigrina, una lectina simile alla ricina, e ad altre 2 altre proteine inattivanti i ribosomi (RIPs) che sono meno tossiche per le cellule e gli animali .[4]
I fiori / foglie contengono flavonoidi tra cui la quercetina (fino al 3%), rutina.iperoside [5], e gli antociani [6] , così come oli essenziali (origine del caratteristico aroma di moscato di fiori di sambuco) [7], mucillagini, tannini (3%), acidi organici, glucosidi (0,042% in percentuale), plastocianina [8], e sambunigrina (0,042% in percentuale). Quantità elevate di ammidi degli L-phenylpropenoyl ammino acidi sono stati trovati nei fiori di Sambucus nigra. [ 9]
II frutto di S. nigra contiene la proteina agglutinina FIV o SNAIVf, che è omologa della proteina tipo inattivante il ribosoma (RIP)[10] , mentre la corteccia contiene nuovamente una proteina di tipo 2 RIP (SNLRP), costituito da una A-catena con attività sulla N-glicosidasi e un B-catena con azione sui legami normalmente presenti sui carboidrati[1 1] , [12], Due RIP supplementari sono stati individuati nei corteccia (SNAI e SNAI ')[11], a dimostrazione della complessità del tipo 2 RIP delle lectine del S. nigra . La lectina isolata dalla corteccia è tetramerica con due subunità distinte ed è ricca di glutammina / acido glutammico, vaiina, leucina ecc. [13]
II frutto di Sambucus nigra e una lectina di tipo 2 RIP di 10 aminoacidi più lungo della lectina della corteccia. [14], La RIP predetta con azione sulla N-glicosidasi è indicata per inibire la sintesi delle proteine nei conigli, ma non nelle piante. [ 15], La quercetina è presente nel sambuco in buona concentrazione ed è stato provato che è un potente inibitore della xantina ossidasi. [16]
EP 0 699 443 B1 (“Elder-containing skin preparation” descrive l’uso di un estratto di sambuco, per la preparazione di un medicamento adatto al trattamento di lesioni, in particolare ustioni, piaghe, eritemi solari, sul corpo umano o animale. Tale estratto è ottenuto da rami trattati con acqua calda 80-100°C a pressione atmosferica generalmente per un tempo compreso tra 15 minuti e 10 ore, preferibilmente per tempi variabili tra 1 e 2 ore. Vengono riportati esempi di applicazioni su bruciature e su eritema solare.
WO 2007/113892 A2 (“L/se of Sambucus nigra L. decoction as antioxidant utilizza sostanzialmente l’estratto del precedente brevetto, riportando esperimenti che dimostrano l’attività antiossidante dell’estratto e rivendicandone l’uso come antiossidante medicamentoso per il trattamento della pelle nelle ferite, come protettivo dai raggi UV, come trattamento antiinfiammatorio, antiedematoso analgesico, come attivatore della ricrescita dei capelli e come anti età. Ne rivendica anche un uso dermocosmetico se viene stabilizzato con agenti ed eccipienti, non specificando ulteriormente.
I documenti citati si limitano a descrivere procedure che portano all’ottenimento di estratti che non contengono tutte le molecole attive dei materiali di partenza il chè provoca sia una insufficiente e limitata attività biologica dello stesso estratto e, conseguentemente, un utilizzo che si limita al lenimento delle ustioni e delle piaghe da decubito sia problemi di stabilizzazione degli estratti medesimi.
Era pertanto sentito nello stato della tecnica il bisogno di mettere a disposizione un estratto migliorato e stabile di sambuco che consentisse anche il trattamento di disturbi non trattabili con gli estratti della tecnica nota.
E’ stato ora sorprendentemente trovato che un procedimento di estrazione che prevede uno step di estrazione sotto pressione e ad alta temperatura in autoclave -senza esposizione all’aria - riesce a risolvere i problemi dello stato della tecnica.
Formano pertanto oggetto della presente invenzione
- un procedimento di ottenimento di un estratto di rami di Sambucus nigra L - l’estratto stabile ottenibile da tale procedimento
- l’estratto per uso nel trattamento di abrasioni e ferite, afte in bocca, placche in gola, eczema e funghi, emorroidi interne e ragadi, herpes zoster, herpes labiale simplex, piaghe da decubito, psoriasi, punture(zanzare/pappataci/pulci), punture di insetti, ustione di primo grado, irritazioni da contatto (tipo medusa), varicella-rosolia, arrossamento degli occhi, dermatite, fistole perianali o sacrococcigee, sfoghi in testa tra i capelli, prurito intimo e prurito anale, problemi gastrici;
- preparati dermocosmetici contenenti l’estratto per trattare acne e rughe, lenitivo post rasatura, ricrescita dei capelli, macchie della pelle, labbra screpolate, arrossamenti vari della pelle, eritema solare, screpolature e piaghe.
- il loro impiego in trattamenti dermocosmetici, lenitivi e di igiene personale L’estratto oggetto della presente invenzione è in grado, grazie alla sua maggiorata efficacia dovuta agli ulteriori composti attivi in esso contenuti, come ad esempio, i lignani, l’acido betulinico, l’acido salvianolico e i ginsenosidi, di agire in modo più efficace contro i disturbi trattati con gli estratti dello stato della tecnica e con sorprendente efficacia su tutta una serie di disagi cutanei e delle mucose non lenibili con i decotti descritti nella prior art. Inoltre, la differente composizione e l’aumentata potenza dell’azione bioattiva dell’estratto oggetto della presente invenzione ne ha consentito l’impiego anche in preparati cosmeceutici
L’estratto della presente invenzione può trovare impiego in
applicazioni cosmetiche quali acne e rughe, lenitivo post rasatura, ricrescita dei capelli, macchie della pelle, arrossamenti vari della pelle, labbra screpolate, dermatite e arrossamento da pannolino, eritema solare, screpolature e piaghe e applicazioni mediche quali abrasioni e ferite, afte in bocca, placche in gola, eczema e funghi, emorroidi interne e ragadi, herpes zoster, herpes labiale simplex, piaghe da decubito, psoriasi, punture(zanzare/pappataci/pulci), punture di insetti, ustioni, irritazioni da contatto tipo medusa, varicella-rosolia, arrossamento degli occhi, dermatiti, fistole perianali o sacro-coccigee, sfoghi in testa tra i capelli, prurito intimo e prurito anale, problemi gastrici.
Breve descrizione delle figure
Alla presente invenzione sono allegate quattro tavole che rappresentano:
la Figura 1 un estratto ottenuto utilizzando la procedura descritta in WO 2007/113892; la Figura 2 un estratto ottenuto in Metanolo;
la Figura 3 frazioni derivanti dalla ripartizione di un estratto metanolico acidificato di S. nigra L. (S1 = frazione acetato di etile; S2 = frazione butanolo; S3 = frazione acqua); la Figura 4 il cromatogramma HPLC dell’estratto ottenibile dal procedimento della presente invenzione.
Tutte le figure rappresentano il tracciato cromatografico degli estratti registrato a 280 nm di lunghezza d’onda.
Gli estratti ottenibili secondo il procedimento dell’invenzione sono stati tutti caratterizzati sia qualitativamente, sia quantitativamente. I principi attivi presenti sono stati valutati nelle loro proprietà biologiche e queste conoscenze hanno permesso di ottimizzare il procedimento secondo l’invenzione.
Descrizione dell’invenzione
Il procedimento secondo l’invenzione comprende le operazioni seguenti
a. predisposizione di rami di Sambucus nigra L di due anni di età (contenenti dal 20 al 50% in peso di rami più giovani in periodo vegetativo) ed eventuale loro triturazione;
b. aggiunta di acqua deionizzata e estrazione del materiale ottenuto dall’operazione a) in autoclave senza esposizione all’aria a pressione tra le 2 e le 5 atm, preferibilmente tra 3 e 4 atmosfere, per tempi variabili da 1 a 5 ore e ad una temperatura di 120 - 150°C, utilizzando un rapporto in peso materiale ottenuto dallo stadio a): acqua deionizzata da 1: 10 a 1:20;
c. raffreddamento a temperatura ambiente per un periodo di 5 - 24 ore e raccolta dell’estratto acquoso;
d. filtrazione su filtro a porosità tale da impedire il passaggio dei sedimenti vantaggiosamente da 1 micron a 10 micron e ottenimento di un estratto filtrato.
Confronto tra le metodologie di estrazione
Allo scopo di dimostrare l’unicità dell’estratto ottenibile secondo il procedimento dell’invenzione e la differenza dagli estratti noti dallo stato della tecnica sono state utilizzate le seguenti varie modalità di estrazione:
1. estrazione secondo WO 2007/113892, l’HPLC è riportato in figura 1
2. estrazione in metanolo (vedasi figura 2).
3. estrazione in Metanolo acidificato (1% HCI) ripartito in tre frazioni con solventi a diversa polarità (vedasi figura 3).
4. estrazione secondo il procedimento dell'invenzione (vedasi figura 4).
Dal confronto dei profili cromatografici dei vari metodi estrattivi nelle varie condizioni sperimentali possono essere tratte le seguenti conclusioni.
1. Estratto ottenuto utilizzando la procedura descritta in WO 2007/113892
Come è possibile osservare dal cromatogramma di figura 1 l’estrazione, che peraltro comporta anche difficoltà pratiche dovute a forti schiumeggiamenti, non ha permesso di ottenere molti dei principi attivi presenti nell’estratto relativo all’estrazione in autoclave sotto pressione. La classe di composti che viene ottenuta in maniera efficace per questa via si limita a quella dei polifenoli. E’ da notare che oltre alla differente composizione anche la quantità di estratto è molto inferiore rispetto a quella ottenuta con l’estrazione a pressione.
2. Estratto ottenuto in Metanolo
Come è possibile vedere dal cromatogramma di figura 2 si sono verificate alcune variazioni rispetto alla composizione dell’estratto sotto pressione (figura 4). In questo caso la frazione costituita dagli acidi fenolici non ha subito variazioni significative in confronto a quella presente nell’estratto sotto pressione, ma la frazione polifenolica, e in particolare i glicosilflavonoidi hanno evidenziato notevoli differenze di composizione sia qualitativa sia quantitativa.
In particolare, il composto principale presente nell’estratto secondo la presente invenzione (Apigenina 7-O-beta-D-glucoside), in queste condizioni sperimentali subisce una decisa decomposizione infatti è stata osservata la presenza di 4’, 5-diidrossiflavone (PM 254), derivante dalla sua decomposizione, con perdita di una molecola di glucosio.
Un po’ tutta la frazione polifenolica ha dimostrato una significativa variazione di composizione con la scomparsa di alcuni prodotti importanti per l’attività biologica dell’estratto, in particolare per l’attività antiinfiammatoria e antibiotica. E’ stata osservata anche la decomposizione dell’acido salvianolico B, così che possiamo ipotizzare una ulteriore perdita del potere antinfiammatorio e antitumorale del preparato.
3. Estrazione in Metanolo acidificato (1% HCI) ripartito in tre frazioni con solventi a diversa polarità
Questa modalità estrattiva è stata utilizzata per poter ripartire in diverse frazioni l’estratto metabolico, nell’ottica di ottenere frazioni con differenti attività biologiche, anche in questo caso abbiamo notato le stesse perdite di principi attivi verificatesi con l’estrazione in metanolo non acidificato, inoltre è stata verificata la presenza di prodotti non noti e estranei alle vie metaboliche vegetali, probabilmente dovuti ad artefatti sintetici causati dalla presenza di tracce di acido nel mezzo estrattivo.
4. Estrazione in autoclave sotto pressione (2-5 atm; 120-150°C) secondo la presente invenzione
Sorprendentemente il procedimento dell’invenzione, che prevede uno step di trattamento ad alta pressione in autoclave ha fornito i migliori risultati. In proposito va sottolineato come nell’estrazione di prodotti naturali da piante, l’esperto del ramo non è portato a pensare ad un aumento di temperatura. Difatti la maggior parte dei prodotti di origine glicosidica e fenolica contenuti nei prodotti naturali sono facilmente soggetti a processi decompositivi, che ne inficiano l’attività biologica. Questo fatto è talmente conosciuto che, nella procedura di concentrazione (eliminazione dell’acqua e/o del solvente) degli estratti naturali da prodotti vegetali, non si usano mai temperature superiori ai 50-60°C e si opera anche sotto leggera depressione. L’originalità del procedimento dell'invenzione risiede principalmente nel trattamento a temperatura innalzata e sotto pressione. Il lento raffreddamento senza che l’autoclave venga aperta e quindi senza che un eccesso d’ossigeno venga a contatto con l’estratto surriscaldato, consente di evitare processi di ossidazione e d’idrolisi che sono estremamente favoriti ad alta temperatura.
La degradazione termica dei polifenoli già a temperature prossime alla temperatura di ebollizione dell’acqua, è un dato noto in letteratura. A titolo di esempio l’articolo di I. Volf et. al. del 2014 [17] conferma quanto scientificamente è comunemente noto, vale a dire la degradazione termica del 30% a 100°C dei polifenoli, che sono essenzialmente i principi attivi dell’estratto della presente invenzione. Tra le altre numerose pubblicazioni che hanno affrontato lo stesso fenomeno si può citare un lavoro su coloranti estratti da bacche di sambuco, come riportato nell’articolo pubblicato da A. José et. al. nel 2013 [18], in cui si riferisce di una degradazione significativa delle antocianine già a 90°C. La Farmacopea Ufficiale XI ^edizione, nel caso di produzione degli estratti acquosi parla di “temperature adeguate: tali da permettere la non degradazione dei composti attivi”. Quanto sopra descritto, riportato in letteratura è stato da noi confermato con la presente invenzione, infatti l’estratto riportato nell’invenzione precedente da Solinas et. al., ottenuto alla temperatura di 80-100°C è molto più povero in principi attivi del nostro ottenuto con metanolo a 60°C, quindi ancora una volta è necessario sottolineare come sia sorprendente il fatto che quanto ottenuto nella presente invenzione a temperature ben più alte sia migliore in quantità e qualità di principi attivi, in pratica la pressione e il non contatto con l’ossigeno hanno permesso di ottenere un estratto completamente nuovo in composizione e attività. Alla luce di quanto sopra esposto è evidente che un esperto della tecnica, a conoscenza di quanto riportato in letteratura e in pubblicazioni di comune conoscenza generale (quali la Farmacopea), non avrebbe mai potuto pensare di ottenere un estratto acquoso di legno di Sambuco migliorato sotto il profilo della tipologia e quantità di sostanze antiossidanti, in particolare polifenoli (come scritto nella prior art, ma anche come ben definito dalle nostre analisi) e stabile aumentando - e in misura così significativa - la temperatura dell’acqua di estrazione.
Trattandosi di un procedimento diverso da quelli dello stato della tecnica anche l’estratto ottenuto (vedasi figura 4) deve essere considerato diverso da quelli dello stato della tecnica.
Vantaggi
I vantaggi della presente invenzione possono essere indicati come:
-Estrazione totale dei principi attivi con incremento di molecole attive rispetto al passato e conseguente possibilità di caratterizzazione molecolare precisa e standardizzazione degli estratti, che sono dotati una serie di effetti sorprendenti testimoniati dalla capacità non attesa di lenire e risolvere una serie di disagi cutanei e delle mucose come ad esempio acne, afte in bocca, placche in gola, emorroidi interne e ragadi, herpes zoester, herpes labiale simplex, macchie da varicella e rosolia, arrossamento degli occhi, fistole perianali o sacro-coccigee, sfoghi in testa tra i capelli, prurito intimo e prurito anale, problemi gastrici.
-Possibilità di sfruttare appieno le proprietà dei principi attivi dei rami di S. nigra attraverso preparati dermocosmetici mirati per il trattamento di acne e rughe, arrosamenti post rasatura, caduta dei capelli, macchie della pelle, arrossamenti della pelle di varia natura, labbra screpolate, dermatite e arrossamento da pannolino, eritemi solari, screpolature e piaghe cutanee;
-Stabilizzazione degli estratti sulla base del loro contenuto molecolare.
Caratterizzazione dei componenti dell’estratto secondo l'invenzione
L’estratto secondo il procedimento dell’invenzione è stato analizzato utilizzando una HPLC/MS. Come si può notare dal profilo riportato in figura 4, la composizione è abbastanza complessa, tuttavia sono stati identificati oltre il 90% dei prodotti presenti. Tali composti sono risultati molto interessanti e, come vedremo in seguito, rendono conto delle diverse attività biologiche attribuite alla pianta in esame, così come riportato in etnobotanica. I composti identificati sono riportati di seguito.
E’ da notare come alcune categorie di prodotti non siano tipicamente presenti in comuni estratti vegetali, ad esempio, nell’estratto secondo l’invenzione sono presenti una serie di molecole con attività antiproliferativa riconosciuta, come l’acido betulinico e forti antinfiammatori come i lignani, presenti in quantità decisamente importante e nelle loro forme attive.
Saponine
Acido salvianolico B (PM 718,15)
Lignani
lcariside E4 (PM 506,21)
8
Ugnano diglicoside (PM 684,68)
HjGO
Tianshanoside A (PM 684,68) Dimero Seicoisolarisiresinol (PM 722,81)
Polifenoli
Oleuropeina (PM 540,18)
Quercetin-3-0-(6”-0-malonil)-b-D-glucoside (PM 550,09)
14
Apigenin 7-O-b-D-glucoside (PM 432,37) Diisinina (PM 704,14)
16
15 Pelargonidin-3-O-acetilglucoside Derivato epicatechina gallato
(PM 47542)
Quercetin 3 O glucorunide (PM 550,09)
18 Kampferol-3-0-2”,6”-0-D-cumaroilglucoside (PM 740,17)
^<0H>
20
Derivato Catechina
19
Delfinidin-3-O-arabinoside (PM 435,09)
21
Isorhamnetina glucoside (PM 478,11) 22
Diinsinin diglucoside (PM 882,22)
23 24
Epicatechina-O-p-D-glucuronide (PM 466,11) Pelargonidin-3-O-arabinoso (PM 403,10)
26
Cianidina derivato
Trigalloilgucoside (PM 636,09)
Altri
27
Scopoletina (PM 192,04)
Metil chinato (PM 206,07)
29
Tangeritina (PM 372,12)
Composti identificati nell’estratto di Sambucus migra L. secondo l’invenzione
Nel paragrafo seguente viene analizzata ogni singola categoria di composti identificati nell’estratto della presente invenzione valutandone la potenziale attività biologica.
Saponine
Nell’estratto dell’invenzione sono state individuate 2 diverse saponine: Ginsenoside Rgì(1) e Thalicoside A (2), che costituiscono circa il 3 % dei composti identificati. Queste molecole sono riconducibili ai Ginsenosidi.
Acidi
Questa classe di composti presenti nell’estratto è rappresentata da acidi fenolici come l’acido siringico (3) e salvianolico B (6), dall’acido chinico (4) e dall’acido betulinico (5) che è un interessante antibiotico.
Lignani
Nell’estratto dell’invenzione sono presenti 4 molecole di questa classe di composti, che potenziano le difese immunitarie e costituiscono circa il 9% dei composti identificati: lcariside E4 (7), un Ugnano diglicoside (8), la Tianshanoside A (9) e un dimero del seicoiolarisiresinol (10).
Polifenoli
La frazione polifenolica costituisce la maggior parte dei composti contenuti nell’estratto con una percentuale superiore al 62%. La composizione relativa di questa frazione è
riportata nella Tabella seguente.
Polifenoli identificati nell’estratto di Sambucus nigra L.
N. composto Nome %
11 Oleuropeina 2,8 12 Quercetin-3-0-(6”-0-malonil)-b-D-glucoside 5,3 13 Apigenin 7-O-p-D-glucoside 37,9 14 Diisinina 5,8 15 Derivato epicatechina gallato 3,2 16 Pelargonidin-3-O-acetilglucoside 3,3 17 Quercetin-3-O-glucorunide 5,1 18 Kampferol-3-0-2”,6”-0-D-cumaroilglucoside 1,6 19 Delfinidin-3-O-arabinoside 1,3 20 Derivato Catechina 8,1 21 Isorhamnetina glucoside 6,2 22 Diinsinin di glucoside 7,5 23 Epicatechina-O-p-D-glucuronide 0,9 24 Pelargonidin-3-O-arabinoso 6,1 25 Trigalloilgucoside 4,0 26 Cianidina derivato 0,9
L’estratto secondo l’invenzione si distingue per la presenza di alcuni composti
particolari come l’oleuropeina (11) che è conosciuta come uno dei componenti
salutistici dell’olio d’oliva. Essa è classificata come polifenolo, ed è caratterizzata da
una componente glicosidica ed è considerata una sostanza "nutraceutica" con effetto
positivo contro la proliferazione di cellule tumorali.
L’apigenina glucoside (13), costituisce il maggior componente della miscela di polifenoli
nell’estratto con quasi il 40%. La Diisinina (14) è un biflavonoide glucoside con marcata
attività antiinfiammatoria. Inoltre è anche presente il corrispondente diglucoside (22) (circa 7,5%). La presenza di questi due composti rafforza in maniera significativa l’attività antiinfiammatoria dell’estratto. L’epigallocatechina (15) presente nell’estratto, potenzialmente, potrebbe agire sinergicamente con 13 come modulatore dei recettori GABA [32],
Altri composti
In questa categoria troviamo due interessanti composti: la scopoletina (27) e la tangeritina (29) (presenti rispettivamente intorno al 3 e all’1%).
Esempi
L’invenzione consiste nel nuovo e originale metodo estrattivo che ha consentito una diversa composizione dell’estratto e quindi la realizzazione di una serie di preparati cosmeceutici (oggetto anch’essi della presente invenzione) in grado di lenire molte lesioni cutanee non curabili con il decotto ottenuto secondo la procedura riportata nello stato della tecnica. Questo è dovuto alla presenza di lignani, saponine e antibiotici (vedi sezione V) non presenti in un semplice estratto ottenuto come descritto nei brevetti precedenti (vedi confronto cromatogrammi riportato in sezione V). La biomassa di Sambucus nigra L. da noi utilizzata è stata raccolta in Sardegna. Il campione è costituito da circa 1000 g di parte aerea formata da rami di non meno di due anni di età privati delle foglie e dei fiori.
Estrazione con acqua surriscaldata sotto pressione
In genere l’estrazione da matrici vegetali di principi attivi naturali in essi contenuti si realizza in condizioni blande di temperatura, onde evitare la degradazione delle componenti termolabili o sensibili ai fenomeni idrolitici.
In letteratura è descritto (PCT/IT2007/000246) l’estrazione di rami stagionati per 2 anni con solvente acquoso a riflusso; in base alla bibliografia consolidata nel campo dell’estrazione tale procedimento si dovrebbe attuare a temperatura inferiore affinchè siano preservate le sostanze facilmente degradabili. La presente invenzione è basata sulla sorprendentemente scoperta che la modifica dei parametri del processo estrattivo verso condizioni più drastiche, ma in assenza di aria e sotto pressione di vapore, ha invece portato all’ottenimento di un estratto le cui capacità antiossidanti sono inalterate; inoltre l’estratto ottenuto per trattamento con solvente acquoso a pressione mostra anche altre proprietà più spiccate o innovative.
Modalità operative di estrazione: In un’autoclave da 10 It sono stati introdotti 1000 gr di rami con più di due anni di vita (contenenti al massimo il 20-50% di rami più giovani in periodo vegetativo) in 8 It acqua deionizzata. L’acqua è stata surriscaldata (120-150 °C) sotto pressione (2-5 atm), l’estrazione è stata condotta per tempi variabili da 1 a 5 ore. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente (5 - 24 ore), mantenendo chiusa l’autoclave, l’estratto viene filtrato su filtro a porosità tale da impedire il passaggio dei sedimenti (porosità da 1 micron a 10 micron). I risultati della caratterizzazione sono descritti nella sezione V.
Analisi degli estratti
I cromatogrammi per la determinazione dei composti presenti nell’estratto sono stati ottenuti con un sistema Agilent Technologies (Palo Alto, CA, USA) 1100 series LC/MSD interfacciato con spettrometro di massa; Il controllo dello strumento e l’elaborazione dei dati sono stati effettuati tramite la Agilent ChemStation HP A.09.01 che in ambiente Windows gestisce il sistema. Al fine di poter determinare i composti presenti 300 pL di estratto acquoso sono stati destinati all’analisi LC/MS utilizzando il seguente sistema di solventi:
Eluente A: acetonitrile HPLC grade
Eluente B: soluzione acquosa di acido trifluoroacetico 0,01% (preparata diluendo 50 pL pi di TFA in 500 mi di acqua MilliQ).
La colonna utilizzata è una Phenomenex Luna C18 (2) 250 x 2,1 mm 5 pm con una precolonna C18 3 pm. Temperatura di 33°C. Volume di iniezione 25 pL. Il gradiente di separazione degli analiti in miscela è mostrato in Tabella:
Tempo (min) Eluente A (%) Eluente B (%) Flusso (mL/min)
0 10 90 0,5
20 30 70 0,5
35 43 57 0,5
40 50 50 0,5
60 90 10 0,5
Gradiente di eluizione
DAD Lettura a doppia lunghezza d’onda; λ = 280 nm - 320 nm
MSD Condizioni di ottimizzazione ESI; voltaggio di frammentazione CID di 120 V, capillare a 3400 V, “drying gas” N2a 350°C a un flusso di 10 L/min, con acquisizione in modalità negativa SCAN nel range 150 -800 m/z. Il cromatogramma è riportato in figura 4
Di questi usi sono riportati i seguito alcuni esempi di applicazione
Proprietà dell’estratto
Antibatterico e conservante
L’estratto acquoso ottenuto in condizioni sperimentali più drastiche mostra una spiccata attività antibatterica, superiore a quanto riportato nel brevetto internazionale PCT/IT2007/000246; infatti nel precedente brevetto era necessario aggiungere un agente stabilizzante (conservante) per poterlo usare nelle formulazioni dermatologiche, mentre questo estratto non ne ha bisogno grazie alla sua composizione chimica modificata dalle condizioni del processo estrattivo, che lo rendono stabile dal punto di vista microbliologico per almeno 2 anni. Tali proprietà lo rendono adatto all’uso nelle formulazioni dermocosmetiche in sostituzione dei tradizionali conservanti di derivazione chimica (quali i parabeni , fenossietanolo, ..).
Cura della stomatite aftosa e dell’infiammazione delle mucose orali
La mucosa orale è facilmente soggetta a lesioni e ferite provocate da fattori di diversa natura che ne mettono in pericolo l'integrità; se tali lesioni diventano più gravi, perchè coinvolgono gli strati più profondi della mucosa, si ha la stomatite aftosa, nota con il nome di "afta", la malattia ulcerativa più diffusa. L’estratto acquoso oggetto di questo brevetto si è mostrato adatto alla cura delle afte del cavo orale, quando usato come colluttorio con frequenza di 2 volte al giorno; la scomparsa delle afte è avvenuta dopo 3 giorni di applicazione topica.
Trattamento del bruciore degli occhi
Il bruciore agli occhi è un disturbo a carico degli organi preposti alla visione che si manifesta con una sensazione di bruciore all'interno e intorno agli occhi. La maggior parte delle volte il bruciore si accompagna ad altri sintomi come prurito, arrossamento, visione annebbiata, eccessiva lacrimazione, maggiore sensibilità alla luce, secrezioni oculari, sensazione di corpo estraneo.
Per irritazione degli occhi o, in termini medici, per congiuntivite si intende l’infiammazione della congiuntiva, ossia della membrana che riveste esternamente il bulbo oculare e la parte interna delle palpebre.
A prescindere dalle cause del bruciore agli occhi, l’estratto acquoso oggetto di questo brevetto si è mostrato adatto al trattamento del bruciore degli occhi quando depositato in gocce sull’occhio oppure nebulizzato tramite tramite un testa di spruzzagio fine. Il sollievo è quasi immediato ed il bruciore scompare rapidamente dopo una singola applicazione.
Trattamento della gastrite
Il reflusso gastroesofageo, che talvolta viene chiamato semplicemente reflusso gastrico o gastrite, è un disturbo causato dalla temporanea risalita del contenuto dello stomaco nell'esofago. Il reflusso gastroesofageo è, sostanzialmente, la risalita del contenuto acido nell'esofago, quel canale lungo 25-30 cm che collega la bocca con lo stomaco; in virtù della sua acidità tale materiale va ad irritare la mucosa esofagea scatenando i sintomi tipici del disturbo, quali bruciore di stomaco, acidità e rigurgito.
L’estratto acquoso oggetto di questo brevetto si è mostrato adatto al trattamento dei sintomi tipici della gastrite quando ingerito nella quantità di circa 50 cc per 3 volte al giorno prima dei pasti. Dopo il primo giorno di trattamento si manifestato sollievo e l’attenuazione dei fenomeni acidi, che sono scomparsi del tutto al terzo giorno di somministrazione per ROS.
Trattamento dell’irritazione delle mucose genitali
Le mucose genitali femminili sono particolarmente delicate e possono essere soggette ad attacchi di agenti esterni di varia natura; i sintomi generalmente presenti sono di solito bruciore e prurito, dolore e senso di tensione e, nei casi più gravi può emergere come qualsiasi agente esterno sia in grado di irritare la regione genitale.
Il trattamento topico delle mucose genitali femminili con l’estratto acquoso oggetto di questo brevetto ha avuto successo nell’attenuazione e scomparsa dei sintomatologia dopo un paio di giorni di applicazione locale a risciacquo.
Trattamento dei sintomi di malattie virali
l’Herpes labialis è la patologia più diffusa nel genere umano. L’agente responsabile è l’Herpes simplex virus di tipo 1 (HSV-1) ed il 90% della popolazione è portatrice di questa variante del virus; l’infezione si presenta con febbre ed una faringite erimatosa seguita da un’eruzione vescicolare nel cavo orale e sul labbro, in seguito poi le vescicole si uniscono ulcerandosi e formando chiazze aftoidi di colore grigio-giallastre. La varicella è una malattia infettiva altamente contagiosa provocata dal virus Varicella zoster (Vzv), della famiglia degli Herpes virus. Dopo un’incubazione di 2 o 3 settimane, la malattia esordisce con un esantema cutaneo (o rash), febbre non elevata e lievi sintomi generali come malessere e mal di testa. Per 3-4 giorni, piccole papule rosa pruriginose compaiono su testa, tronco, viso e arti, a ondate successive. Le papule evolvono in vescicole, poi in pustole e infine in croste granulari, destinate a cadere. Tipicamente l’esantema è costituito da 250-500 lesioni.
La varicella, una volta contratta, produce un'immunità permanente, ma a distanza di anni può essere seguita dall'herpes zoster. Il virus Varicella zoster (VZV), infatti, ha la capacità di rimanere latente nei gangli dei nervi spinali, invasi nel corso dell'infezione primaria, senza dare sintomi e, nel 10-20% dei casi, può riattivarsi, causando il cosiddetto "fuoco di Sant'Antonio" (Herpes zoster). Il soggetto, quindi, non ripresenterà la varicella, ma una manifestazione cutanea locale caratterizzata da grappoli di vescicole che provocano un dolore urente lungo il decorso del nervo, dove il virus ha stazionato. L’applicazione topica dell’estratto acquoso oggetto di questo brevetto sulle manifestazioni cutanee delle patologie di origine virale herpetica ha provocato nei pazienti una risoluzione dei sintomi quale bruciore, dolore e fastidio cutaneo; a questo si è associata una rimessione accelerata degli sfoghi cutanei.
Preparazione di prodotti a uso topico
Le preparazioni topiche, e quindi anche i preparati semisolidi per applicazione cutanea sono veicoli per principi attivi destinate a:
•Agire in superficie (creme solari, repellenti, idratanti, protettivi).
•Agire nelle appendici della pelle (anti-acne, disinfettanti, prodotti per la crescita dei capelli).
•Agire nei tessuti locali sottostanti (antifungini, antiinfiammatori, antistaminici).
Spray acquoso:
40-60% estratto acquoso di Sambucus nigra L.
5-10% acqua di camomilla
5-10% acqua di calendula
5-10% acqua di fiordaliso
5-10% acqua di rosa
5-10% acqua di fiori d’arancio
10-30% di Aloe
5-10% di glicerina
0,2-05% di olio essenziale di lavanda
0,1-02% di olio essenziale di timo
Gel
30-60% estratto acquoso di Sambucus nigra L.
5-10% acqua di camomilla
5-10% acqua di calendula
5-10% acqua di fiordaliso
5-10% acqua di rosa
5-10% acqua di fiori d’arancio
5-30% di Aloe
5-20% olio di elicriso
0,2-05% di olio essenziale di lavanda
0,1 -0,2% di olio essenziale di timo
0,1 -0,3% olio di rosmarino
Collutorio
50-80% estratto acquoso di Sambucus nigra L.
5-10% olio essenziale di eucalipto
5-10% olio essenziale di menta
5-10% olio essenziale di limone
1-4% olio essenziale timo
3-7% acqua di calendula
1-3% acqua di rosa
1-3% basilico
1-2% sandalo
Crema viso purificante
pelli miste e grasse
20-40% estratto acquoso di Sambucus nigra L.
7-10% Aloe
3-10% Butyrospermum parkii butter
5-10% Ethylhexyl palmitate
2-5% Cetearyl alcohol
2-5% Caprylic/capric trigliceride
2-5% Glycerin
2-5% Glyceryl stearate citrate
2-5% Sodium pca
2-5% Glyceryl stearate se
2-5% Hydrolyzed wheat protein
2-5% Argania spinosa kernel oil
2-5% Olea europaea oil
0,1 -0,3% Tetrasodium glutamate diacetate 0,1 -0,3% Tocopheryl acetate
0,1 -0,3% Sodium dehydroacetate
0,1- 0,20% Allantoin
0,1-0,20% Xanthan gum
0,1% Glyceryl caprylate
0,1% Squalane
0,1% Lecithin
0,1% Tocopheol
0,2-0, 7% Ascorbyl palmitate
0,2-0,75% Citric acid
1-2% Benzyl alcohol
0,2-0, 8% Dehydroacetic acid
0,2-0, 8% Lactic acid
1 -2%Olio essenziale limone
1-2% Olio essenziale bergamotto
1-4% Propoli
Crema viso nutriente elasticizzante
20-40% estratto acquoso di Sambucus nigra L.
7-10% Aloe
3-10% Butyrospermum parkii butter
5-10% Ethylhexyl palmitate
2-5% Cetearyl alcohol
2-5% Caprylic/capric trigliceride
2-5% Glycerin
2-5% Glyceryl stearate citrate
2-5% Sodium pca
2-5% Glyceryl stearate se
2-4% Hydrolyzed wheat protein
2-5% Argania spinosa kernel oil
2-5% Olea europaea oil
0,1 -0,4% Tetrasodium glutamate diacetate 0,1 -0,4% Tocopheryl acetate
0,1 -0,4% Sodium dehydroacetate
0,1 -0,4% Allantoin
0,1 -0,2% Xanthan gum
0,1 -0,2% Glyceryl caprylate
0,1 -0,2% Squalane
0,1 -0,2% Lecithin
0,3-0, 8% Tocopheol
0,3-0, 8% Ascorbyl palmitate
0,3-0, 8% Citric acid
0,5-2% Benzyl alcohol
0,3-0, 8% Dehydroacetic acid
0,3-0, 8% Lactic acid
3-8% Olio di mandorle dolci
0,3-0, 8% Olio essenziale lavanda
0,3-0, 8% Olio essenziale pino
Sapone liquido
Ingredienti per 2 litri circa (500 gr di grassi di base):
Olio di Oliva (50%) 250 gr
Olio di Sesamo (20%) 100 gr
Olio di Germe di Grano (20%) 100 gr
Olio di Mandorle dolci (10%) 50 gr
Miele 40 mi
Oli essenziali a scelta fino a 40 mi (anche meno o nessuno, se preferite) Idrossido di sodio (soda caustica) 62 gr (già scontata del 8%)
Estratto acquoso 180 gr
Sapone liquido intimo
Utilizzando il sapone liquido preparato come descritto è stata realizzata la seguente formulazione:
- 100 mi di detergente liquido pH 4.5D
- 15 gocce di olio essenziale di lavanda
- 15 gocce di olio essenziale di Tea TreeD
- 10 gocce di olio essenziale di sandalo
Sapone solido
- 1 kg di olio di oliva
- 128 grammi di soda caustica (NaOH)
- 300 ml_ di estratto acquoso
- 10 mi di olio essenziale di lavanda
- 1 cucchiaio di fecola di patate
- 1 cucchiaio di fiori secchi di lavanda o elicriso tritati
ESEMPI DI APPLICAZIONE DEI PREPARATI
Gli esempi di seguito riportati sono la descrizione di applicazione dei preparati da parte di volontari, che hanno descritto in modo spontaneo i benefici ricavati dal trattamento dermocosmetico.
ABRASIONI E FERITE
Detergere la parte interessata e applicare lo spray, lasciar agire senza coprire, una volta asciutto, applicare il gel per tre volte al giorno.
Chi ha utilizzato il prodotto ha risolto in 6/8 giorni
ACNE E RUGHE
Detergere il viso e il collo con il sapone e applicare la crema ogni 8 ore circa. Diverse persone hanno ottenuto ottimi risultati, rughe meno evidenti e acne scomparsa
AFTE IN BOCCA
Fare risciacqui con collusorio da 2 a 3 volte al giorno, al 3 risciacquo si risolve con la scomparsa delle pustole
PLACCHE IN GOLA
Fare gargarismi con collusorio lontano dai pasti da 2 a 3 volte la giorno.
II problema si risolve in meno due giorni.
Almeno venti persone testimoniano il successo del trattamento
DERMATITE VARIA - TOPICA
Applicare il gel o la crema ogni 3-4 ore, se la parte da trattare è molto delicata, utilizzare lo spray.
Il problema è stato risolto su 5 volontari.
DERMATITE EARROSSAMENTO DA PANNOLINO
Detergere con sapone e applicare la crema al cambio del panno, al cambio successivo ripetere il procedimento. Solitamente due applicazioni sono sufficienti, al primo trattamento si può utilizzare anche lo spray
ECZEMA E FUNGHI
Trattare ogni 8-10 ore con lo spray o con il gel
EMORROIDI INTERNE E RAGADI
Alcune persone hanno utilizzato il prodotto liquido mediante delle perette anali, facendo dei lavaggi oppure utilizzando la crema esternamente e hanno riscontrato un miglioramento immediato del dolore e una riduzione del volume emorroidi
HERPES ZOESTER
Applicare il liquido o il gel ogni 4 ore sulle parti interessate
HERPES LABIALE SIMPLEX
Applicare il liquido spray inizialmente e poi gel o crema ogni 6 ore
ERITEMA SOLARE
Nebulizzare il liquido all’inizio del trattamento e poi continuare con il gel fino a quando sparisce il fastidio (1-2 ore)
SCREPOLATURE E PIAGHE
Per screpolature causate da allergie a detersivi o per qualsiasi piaga delle mani, applicare il gel o la crema da 2 a 3 volte al giorno
PIAGHE DA DECUBITO
Come primo intervento nebulizzare il liquido sopra la piaga poi continuare il trattamento con la crema o il gel, lasciando le parti scoperte in molti casi è stato fornito il prodotto (a titolo gratuito) a case per anziani con pazienti allettati, le piaghe si rimarginano in periodi medio brevi, scompaiono immediatamente prurito e i fastidi.
PSORIASI
Nebulizzare il liquido come primo trattamento o quando le parti interessate risultano molto delicate, poi mettere il gel o la crema.
Diverse persone che avevano il problema ai gomiti, ginocchia, mani, testa, orecchie e anche in parti intime, hanno avuto benefici, elimina il prurito, ammorbidisce la crosta, cambia il colore della pelle e la rende più elastica
ARROSSAMENTI VARI DELLA PELLE
Nebulizzare il prodotto o applicare il gel ogni 6/8 ore.
Molte persone hanno risolto problemi di arrossamento cutaneo, non eliminabile con cure cortisoniche.
PUNTU RE(ZANZARE/PAPPATACI/PU LCI)
Dopo la puntura applicare il gel, sono sufficienti una o due applicazioni per ridurre gonfiore e il prurito scompare.
Il trattamento ha funzionato in modo straordinario, sorprendente sulla cute dei bambini, con scomparsa del prurito in pochi minuti.
PUNTURE DI INSETTI, VESPE E API
Applicare il gel da due a tre volte a distanza di pochi minuti dopo la puntura dell'insetto, rimuove il gonfiore, il prurito e il dolore. Ha funzionato sia su adulti che su bambini
MACCHIE DELLA PELLE
Schiarisce le macchie scure della pelle, applicare la crema due volte al giorno fino ad assorbimento. Macchie che rimangono dopo la gravidanza.
Alcune persone hanno provato il preparato seguendo le indicazioni e hanno constatato che le macchie schiariscono al punto tale da non essere più riconoscibili come tali.
USTIONE ANCHE GRAVI DI 1 GRADO
Sono state trattate ustioni di 1 grado, Nebulizzare il liquido inizialmente, dopo che la cute si è asciugata, applicare il gel coprendo tutto lo strato interessato dall'ustione, tenere sempre coperto con il gel, senza mai applicare garze o fasciature la parte ustionata si rimargina in circa 20/26 giorni
IRRITAZIONI DA CONTATTO TIPO MEDUSA
Applicare il liquido una o due volte, successivamente il gel, calma il bruciore all'istante e in poche ore sparisce tutto senza lasciare traccia. Il trattamento è stato testato in spiaggia da numerosi volontari che ne testimoniano la grande efficacia.
VARICELLA-ROSOLIA
Nebulizzare il liquido ogni 3-4 ore o applicare il gel, secca le pustole senza lasciare cicatrici tipiche delle patologie. Il trattamento è stato provato sia da adulti sia da bambini con efficacia sorprendente.
ARROSSAMENTO DEGLI OCCHI
Nebulizzare ad occhi aperti, toglie l'infiammazione e il prurito in pochi minuti. Una persona ha utilizzato il liquido per curare una congiuntivite virale, facendo impacchi da 2 a 3 volte al giorno con garze sterili, in una settimana ha risolto il problema, aveva una lesione della cornea causata dalla patologia che non è più stata riscontrata alla visita dello specialista;
LENITIVO POST RASATURA
Ottimo lenitivo e cicatrizzante post rasatura e tagli da rasoio.
Alcune donne che hanno utilizzato il sapone prima della depilazione, hanno riscontato ottimi risultati, pelle più morbida, nessun bruciore dopo la depilazione, inoltre donne che soffrivano di follicolite, hanno avuto benefici come antinfiammatorio.
FISTOLE PERIANALI O SACRO-COCCIGEE
Persone affette da fistole del coccige e perianali, hanno utilizzato il prodotto al posto del solito unguento per favorire la maturazione della fistola e la fuoriuscita del pus, calmando il dolore dell'infezione e portando a cicatrizzazione la parte interessata.
LABBRA SCREPOLATE
Applicare il gel o crema sulle labbra elimina le screpolature e gli arrossamenti. Molte persone hanno provato i prodotti con risultati rapidi e efficacissimi.
SFOGHI IN TESTA TRA I CAPELLI
Si applica il gel per lesioni cutanee in testa, dopo alcune applicazioni si seccano;
una signora che presentava delle lesioni non sensibili a trattamenti farmacologici, applicando il gel ha risolto il problema.
PRURITO INTIMO E PRURITO ANALE
Si nebulizza con lo spray, poi applica il gel e si effettuano lavaggi con il detergente intimo. Il prurito scompare dopo poco tempo dalla prima applicazione. Volontari testimoniano la scomparsa del prurito dopo pochi minuti dall’applicazione.
RICRESCITA DEI CAPELLI
Si nebulizza lo spray e si friziona la cute dove mancano i capelli, dopo venti giorni si ha l’inizio della ricrescita, ci sono numerosi esempi su volontari, specialmente di sesso femminile.
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Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di estratti di rami di Sambucus nigra L comprende le operazioni seguenti a. predisposizione di rami di Sambucus nigra L di due anni di età b. aggiunta di acqua deionizzata e estrazione del materiale ottenuto dall’operazione a) in autoclave a pressione tra le 2 e le 5 atm e in assenza di aria, per tempi variabili da 1 a 5 ore e ad una temperatura di 120 - 150°C, utilizzando un rapporto in peso materiale ottenuto dallo stadio a): acqua deionizzata da 1: 10 a 1:20; c. raffreddamento a temperatura ambiente per un periodo di 5 - 24 ore e raccolta dell’estratto acquoso; d. filtrazione su filtro a porosità tale da impedire il passaggio dei sedimenti da 1 micron a 10 micron e ottenimento di un estratto filtrato.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detti rami di due anni di Sambucus nigra L contengono dal 20 al 50% in peso di rami più giovani in periodo vegetativo.
- 3. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui detti rami di detto stadio a) vengono sottoposti a triturazione.
- 4. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui detta pressione è compresa tra 3 e 4 atmosfere.
- 5. Estratto ottenibile dal procedimento quale rivendicato in almeno una delle rivendicazioni da 1 a 4.
- 6. Estratto secondo la rivendicazione 5 caratterizzato dal cromatogramma di Figura 4.
- 7. Estratto secondo la rivendicazione 5 e, o 6 per uso nel trattamento di abrasioni e ferite, afte in bocca, placche in gola, eczema e funghi, emorroidi interne e ragadi, herpes zoster, herpes labiale simplex, piaghe da decubito, psoriasi, punture di insetti, ustioni, irritazioni da contatto, varicella-rosolia, arrossamento degli occhi, dermatite, fistole perianali o sacro-coccigee, sfoghi in testa tra i capelli, prurito intimo e prurito anale, problemi gastrici.
- 8. Composizioni contenenti l’estratto quale rivendicato nelle rivendicazioni 5 e, o 6 e uno o più additivi tollerabili per uso nel trattamento di abrasioni e ferite, afte in bocca, placche in gola, eczema e funghi, emorroidi interne e ragadi, herpes zoster, herpes labiale simplex, piaghe da decubito, psoriasi, punture di insetti, ustioni, irritazioni da contatto, varicella-rosolia, arrossamento degli occhi, dermatite, fistole perianali o sacro-coccigee, sfoghi in testa tra i capelli, prurito intimo e prurito anale, problemi gastrici.
- 9. Uso dell’estratto secondo la rivendicazione 5 e, o 6 per il trattamento cosmetico di acne e rughe, lenitivo post rasatura, ricrescita dei capelli, macchie della pelle, arrossamenti vari della pelle, labbra screpolate, arrossamenti vari della pelle, eritema solare, screpolature e piaghe.
- 10. Composizioni contenenti l’estratto secondo la rivendicazione 5 e, o 6 per il trattamento cosmetico di acne e rughe, lenitivo post rasatura, ricrescita dei capelli, macchie della pelle, arrossamenti vari della pelle, labbra screpolate, dermatite e arrossamento da pannolino, eritema solare, screpolature e piaghe.
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