ITTO20110884A1 - Membrana per nanocapsula, nanocapsula comprendente la stessa e suo uso - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
"MEMBRANA PER NANOCAPSULA, NANOCAPSULA COMPRENDENTE LA STESSA E SUO USO"
La presente invenzione à ̈ relativa ad una membrana per nanocapsula e ad una nanocapsula comprendente la stessa per la veicolazione di farmaci lipofili.
Il successo di una terapia à ̈ legato alla correttezza della diagnosi e della scelta del farmaco. L'entità delle risposte ad un farmaco à ̈ funzione della sua concentrazione sul sito d'azione: un dosaggio troppo basso produrrà risposte inadeguate, mentre con uno troppo alto l'entità degli effetti indesiderati potrà essere tale da vanificare l'effetto della terapia. Solo tra questi due limiti (che definiscono la finestra terapeutica) l'intervento farmacologico à ̈ corretto. Il rapporto tra la concentrazione che dà luogo ad effetti tossici e la concentrazione efficace à ̈ definito indice terapeutico: più alto à ̈ l'indice terapeutico, più maneggevole à ̈ il farmaco.
A tal fine negli anni sono state studiate numerose soluzioni che permettano la veicolazione del farmaco al sito bersaglio mantenendo la sua concentrazione entro i limiti dell'efficacia e allo stesso tempo cercando di ridurre al minimo gli effetti collaterali eventualmente associati all'utilizzo del farmaco stesso.
Un esempio di farmaco che trova numerose applicazioni terapeutiche ma presenta anche elevati effetti collaterali à ̈ 1'Amfotericina B.
L'Amfotericina B ha un'azione fungicida molto rapida contro la Candida albicane e per molti anni à ̈ stato il farmaco di prima scelta per il trattamento di gravi infezioni sistemiche provocate da Candida albicans e da altri funghi. L'Amfotericina B à ̈ anche utilizzata come farmaco alternativo per il trattamento sintomatico della cistite, della pielonefrite , dell'osteomielite, dell'artrite settica e dell'endocardite provocate dalla Candida.
L'uso clinico di Amfotericina B à ̈ ostacolato dalla nefrotossicità dose-limitante e da altri effetti collaterali correlati all'infusione come febbre, brividi, cefalea, nausea e vomito. Si pensa inoltre che 1'Amfotericina B possa legare il colesterolo, un importante componente delle membrane cellulari dei mammiferi, portando ad un aumento di permeabilità della membrana e a conseguenti danni cellulari.
La sua formulazione clinica convenzionale à ̈ costituita da una sospensione micellare di Amfotericina B con un sale biliare, il sodio desossicolato, il cui nome commerciale à ̈ Fungizone. A causa del suo scarso assorbimento orale, 1'Amfotericina B à ̈ somministrata principalmente per via endovenosa o via inalatoria. Il farmaco à ̈ scarsamente solubile in acqua e presenta un'alta percentuale di legame con le proteine piasmatiche con un'emivita di circa 10 - 24 ore. Il farmaco raggiunge concentrazioni elevate negli organi solidi (fegato, milza, reni e polmoni) mentre nell'occhio raggiunge concentrazioni più elevate nell'umor acqueo piuttosto che in quello vitreo. L'Amfotericina B non attraversa efficacemente la barriera ematoencefalica anche in presenza di infiammazione e la sua concentrazione nel tessuto cerebrale e nel liquido cerebrospinale à ̈ bassa.
Ad oggi sono state sviluppate diverse formulazioni lipidiche di Amfotericina nel tentativo di ridurre gli effetti tossici sistemici del farmaco soprattutto a carico dei reni. Questi includono una dispersione colloidale di Amfotericina B (ABCD, Amfotericina B Colloidal Dispersion) , un complesso lipidico di AmB (ABLC Amfotericin B Lipid Complex) e Amfotericina B liposomale (L-AmB o AmBisome) .
Tuttavia, le formulazioni lipidiche attualmente in uso in ambito clinico, come l'AmBisome, l'Amphocil o l'Abelcet pur essendo meno tossiche richiedono somministrazioni ad alte dosi di Amfotericina B, un processo di sintesi altamente complesso, e conseguentemente, costi di preparazione elevati. In particolare, l'AmBisome porta ad una minore tossicità renale ma può dare epatotossicità ad alte dosi.
Pertanto, à ̈ sentita nell'arte la necessità di sviluppare formulazioni alternative per la veicolazione di farmaci come 1'Amfotericina B volte a migliorarne la tossicità , l'efficacia terapeutica ed il profilo farmacocinetico .
Scopo della presente invenzione à ̈ pertanto quello di fornire una formulazione farmaceutica per la veicolazione di farmaci che ne aumenti l'efficacia terapeutica riducendone gli effetti collaterali.
Tale scopo à ̈ raggiunto dalla presente invenzione, in quanto relativa ad una membrana per nanocapsula secondo la rivendicazione 1 ad una nanocapsula secondo la rivendicazione 8 al suo uso secondo la rivendicazione 16 ed ad una composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 18 .
Definizioni
A meno che non sia specificato esplicitamente il contrario, i seguenti termini presentano il significato indicato qui sotto.
Nel presente testo per "nanocapsula" si intende una particella formata da aggregati atomici o molecolari con un diametro compreso indicativamente fra i 2 e i 500 nm, di forma sostanzialmente sferica composta da una membrana o involucro e da una cavità , all'interno della quale si possono collocare le sostanze desiderate, come ad esempio farmaci in forma liquida, solida o come dispersione molecolare.
Nel presente testo per "alchile" si intende una catena alifatica satura (vale a dire un gruppo alifatico privo di doppi o tripli legami carbonio -carbonio) lineare o ramificata. Esempi non limitativi di alchili sono: npropil, t-butil, esil e octile
Nel presente testo, per "alchile sostituito" si intende un gruppo alchilico legato ad almeno un sostituente, il quale à ̈ vantaggiosamente scelto nel gruppo consistente di: alogeno, idrossi, alcossi Ci-C4, aromatico, nitro, ciano, alchilcarbossi Ci-C4, alcanoil Ci-C4.
Nel presente testo per "concentrazione molare", "concentrazione M", "molarità ", "M" si intende il rapporto tra il numero di moli di un composto ed il volume, in particolare i litri, di un solvente, in particolare acqua, senza che ciò implichi che il composto sia disciolto nel solvente .
Nel presente testo per "concentrazione normale", "concentrazione N", "normalità ", "N" si intende il rapporto tra il numero di equivalenti di un soluto ed il volume, in particolare i litri, di un solvente, in particolare acqua, senza che ciò implichi che il composto sia disciolto nel solvente .
Breve descrizione delle Figure
Per una migliore comprensione della presente innovazione, essa verrà nel seguito descritta anche con riferimento alle figure allegate, che illustrano quanto segue :
la Figura 1 illustra la retta di taratura di amfotericina in metanolo utilizzata per determinare la quantità di farmaco presente nelle nanocapsule;
- la Figura 2 illustra la retta di taratura in acqua acida a pH = 5,5 per lo studio della cinetica di rilascio in vitro a questo pH;
- la Figura 3 illustra la retta di taratura in acqua acida a pH = 7,4 per lo studio della cinetica di rilascio in vitro a questo pH;
la Figura 4 illustra la retta di rilascio dell' Amfotericina B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 5,5;
la Figura 5 illustra la retta di rilascio dell'Amfotericìna B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 7,4;
la Figura 6 illustra il confronto del rilascio dell'Amfotericina B dalle nanocapsule dell'invenzione a pH 5,5 e 7,4.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Secondo un primo aspetto dell'invenzione viene fornita una membrana per nanocapsula per incapsulare un agente terapeutico. Tale membrana comprende molecole anfifiliche costituite da una testa idrofila ed una coda lipofila.
In particolare, la testa idrofila à ̈ selezionata nel gruppo costituito da ciclodestrine naturali e loro derivati, più in particolare beta-ciclodestrina, gammaciclodestrina e 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina.
La coda lipofila à ̈ selezionata nel gruppo costituito un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente almeno 8 atomi di carbonio, da una catena polimerica poliestere, da una catena polimerica polianidride e da una catena polimerica dell'acriloilmorfolina .
In particolare, la coda lipofila può essere un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente da 10 a 22 atomi di carbonio, più in particolare un residuo dodecilcarbonilico .
Alternativamente la coda lipofila può essere una catena polimerica lipofila selezionata nel gruppo costituito da poli (4-acriloilmorf olina) , polilattati o poliglicolattati .
Le teste ciclodestriniche sono legate alle code lipofile attraverso i residui ossidrilici o eventuali loro derivati delle ciclodestrine, come ad esempio un derivato tiolico, mediante un legame covalente.
In una prima forma di realizzazione dell'invenzione la membrana comprende molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6 mercapto-beta-ciclodestrina (β-CD-SH) e la coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorf olina) (PACM).
In una seconda forma di realizzazione dell'invenzione la membrana comprende molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ gamma-ciclodestrina e la coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico .
Secondo un secondo aspetto dell'invenzione viene fornita una nanocapsula comprendente una membrana come sopra descritta. In particolare, la membrana delimita al suo interno una cavità nella quale può essere incapsulato un agente terapeutico, preferibilmente un farmaco lipofilo.
Tale agente terapeutico in particolare à ̈ Amfotericina B.
L'agente terapeutico può essere disciolto in un solvente opportuno, preferibilmente selezionato nel gruppo costituito da trigliceridi , mono-digliceridi , esteri, siliconi, perfluorocarburi o loro miscele più preferibilmente trigliceridi o loro miscele.
Secondo una forma di realizzazione dell'invenzione la nanocapsula comprende una membrana in cui la testa idrofila à ̈ una gamma ciclodestrina, la coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico e l'agente terapeutico à ̈ Amfotericina B disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione dell'invenzione la nanocapsula comprende una membrana in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6-mercapto-betaciclodestrina, la coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorf olina) e l'agente terapeutico à ̈ Amfotericina B disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico .
Le nanocapsule dell'invenzione contenenti amfotericina B possono essere utilizzate nel trattamento di una patologia associata ad infezioni fungine sistemiche in particolare selezionata nel gruppo costituito da infezioni fungine in pazienti neutropenici , meningite da Criptococco in pazienti infettati da HIV, infezioni da Aspergillus spp., Candida spp. e Cryptococcus spp. refrattarie al trattamento con Amfotericina B deossicolato, leishmaniosi viscerale .
Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione viene fornita una composizione farmaceutica comprendente nano capsule come sopra descritte ed un eccipiente farmacologicamente accettabile.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno dalla descrizione che segue di alcuni esempi meramente illustrativi e non limitativi. Le seguenti abbreviazioni sono usate nel seguito negli esempi sotto riportati: h (ora), g (grammi), mg (milligrammi), mmol (millimole) , mL (millilitro), MHz (megahertz) , Hz (hertz), p.fus. (punto di fusione), Rf (Ratio frontis) , UV (ultravioletto) , NMR (Risonanza Magnetica Nucleare) , MS (Spettroscopia di Massa) , Me (metile) , Mei (ioduro di metile), KOH (idrossido di potassio), HC1 (acido cloridico) , DMSO (dimetilsolf ossido) , CH2C12(cloruro di metilene) , Na2S04(solfato di sodio) , CDC13(cloroformio deuteriato) , Et3N (trietilammina) , THF (tetraidrofurano) , DME (dimetiletere) , Et20 (dietiletere) , NH4C1 (cloruro di ammonio) , NaCl (cloruro di sodio), K2C03(carbonato di potassio) , CH3CN (Acetonitrile), NBS (N-bromosuccinimmide) , H20 (acqua), EtOAc (acetato di etile).
Esempi
Esempio 1
Preparazione di molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina (β-CD-SH)_ e_ la_ coda_ lipofila_ à ̈_ poli (4-acriloilmorfolina) (PACM)(LED132)
La 6-desossi-6-mercapto-P-ciclodestrina (β-CD-SH) à ̈ preparata ed utilizzata come agente di trasferimento di catena nella polimerizzazione radicale della 4-acriloilmorfolina (Sigma, Aldrich, distillata prima dell'uso, bp 158°C at 50 mmHg). Il rapporto peso/peso β-CD/PACM à ̈ 32,7 ed il numero molecolare medio ed il peso molecolare medio sono rispettivamente 7860 e 13500.
Esempio 2
Attività emolitica e citotossicità della molecola anfifilica dell'esempio 1
La determinazione dell'attività emolitica del polimero à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.
2 mi di sangue sono stati diluiti con 8 mi di tampone fosfato a pH 7,4.
In una serie di provette sono state introdotte quantità crescenti di LED132, da 1 a 15 mg, solubilizzate in 500 Î1⁄4Î di tampone fosfato con l'aggiunta di 1 mi di sangue precedentemente diluito.
Le provette vengono lasciate per 90 minuti a 37 °C sotto incubazione. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 2000 rpm per 5 minuti.
Vengono prelevati 500 Î1⁄4Î di surnatante e diluiti con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.
Questi vengono sottoposti ad analisi UV-vis a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.
La percentuale di emolisi à ̈ calcolata dall'assorbanza dovuta alla presenza di emoglobina nel surnatante.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.
La molecola non ha mostrato attività emolitica. Si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che la molecola à ̈ biocompatibile.
Esempio 3
Preparazione_ della_ nanocapsula_ incapsulante Amfotericina B ottenuta con la molecola anfifilica dell'esempio 1
Si prepara una fase organica solubilizzando in etanolo assoluto 2 mi 1<1>Amfotericina (principio attivo circa 2 mg) a cui si addiziona il Miglyol 220 microlitri (olio) (Myritol 318) e LED132 (30-35 mg). La fase acquosa à ̈ una soluzione acquosa di 1 % Tween 80.
La solubilizzazione dei vari componenti viene facilitata dall'agitazione continua per 30 minuti.
Una volta solubilizzate le due fasi si fa gocciolare, sotto agitazione, la fase organica nella fase acquosa.
Si nota subito un rapido intorbidimento dovuto alla formazione delle nanocapsule.
La preparazione viene lasciata sotto continua agitazione per 24 ore lontano da fonti luminose (per via della fotosensibilità dell'Amfotericina) per l'evaporazione dell'etanolo.
Per proteggerla in modo adeguato, il beker utilizzato à ̈ stato completamente rivestito con carta stagnola per proteggere la preparazione dalle radiazioni luminose.
Nelle nanocapsule 1<1>Amfotericina si troverà disciolta in miglyol che costituisce un nucleo interno delimitato da una membrana di LEDI32.
Al termine delle 24 ore si sospende l'agitazione. La formulazione à ̈ centrifugata a 1000 rpm per 2 minuti per separare 1'Amfotericina rimasta libera da quella incapsulata.
Dopo la centrifugazione si preleva il surnatante (la sospensione di nanocapsule) e si procede alla caratterizzazione .
Esempio 4
Preparazione di molecole anfifiliche in cui la testa idrofila à ̈ gamma-ciclodestrina (γ-CD) e la coda lipofila à ̈ dodecilfosfato (NC12C)
In un pallone vengono miscelati l'alcool (ES, C12) e il diimidazoilchetone in rapporto molare 1:1.5 usando come solvente diclorometano privo di alcool. La miscela à ̈ lasciata sotto agitazione per due ore.
Si trasferisce in un imbuto separatore. Si eseguono tre lavaggi con acqua distillata. La fase organica à ̈ trasferita in una beuta, anidrificata con solfato di sodio anidro. Quindi si filtra e si concentra la fase organica mediante Rotavapor ottenendo l'imidazoil derivato dell'alcool (Prodotto 1). Contemporaneamente la gamma ciclodestrina viene essiccata in stufa fino a peso costante, si prepara il bagno di silicone a 80 C. In un pallone si pesa la gamma ciclodestrina, essiccata, il Prodotto 1 in rapporto molare 1:3, e piridina anidrificata in quantità da anidrificare la gamma ciclodestrina. Si riscalda a ricadere per 3 ore, quindi si filtra e si concentra al Rotavapor. Si addiziona etere di etilico e si lascia riposare per una notte. Quindi si filtra e si recupera 1'alchilcarbonato sul filtro stesso che viene lavato con etanolo.
Esempio 5
Saggio_ emolitico_ della_ molecola_ anfifilica dell'esempio 4
La determinazione dell'attività emolitica à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.
Ad una serie di provette contenenti 1 mi di sangue sono state addizionate quantità crescenti di NC12C, da 2,5 a 20 mg.
Le provette vengono lasciate ad incubare a 37 °C per 90 minuti. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 3000 rpm per 10 minuti.
Si prelevano 250 Î1⁄4Î di surnatante e si diluiscono con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.
Si analizzano i campioni allo spettrofotometro a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.
La molecola non ha mostrato attività emolitica. Si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che la molecola à ̈ biocompatibile.
Esempio 6
Preparazione_ delle_ nanocapsule_ incapsulanti Amfotericina B ottenuta con la molecola anfifilica dell'esempio 4
Le nanocapsule di NC12C sono preparate seguendo la procedura illustrata nell'esempio 3.
Esempio 7
Saggio emolitico sulle nanocapsule degli esempi 3 e 6 La determinazione dell'attività emolitica à ̈ stata eseguita tramite metodo spettrofotometrico.
2 mi di sangue umano sono stati diluiti con 8 mi di tampone fosfato a pH 7,4.
In una serie di provette sono state introdotte quantità crescenti di nanocapsule ottenute mediante le procedure degli esempi 3 e 6, da 1 a 15,mg, solubilizzate in 500 Î1⁄4Î di tampone fosfato con l'aggiunta di 1 mi di sangue precedentemente diluito.
Le provette vengono lasciate per 90 minuti a 37 °C sotto incubazione. Al termine dei 90 minuti si centrifuga a 2000 rpm per 5 minuti.
Vengono prelevati 500 Î1⁄4Î di surnatante e diluiti con 2,5 mi di tampone fosfato a pH 7,4.
Questi vengono sottoposti ad analisi UV-vis a 543 nm e viene calcolata la percentuale di emolisi.
La percentuale di emolisi à ̈ calcolata dall'assorbanza dovuta alla presenza di emoglobina nel surnatante.
Come bianco viene utilizzato sangue diluito in tampone fosfato mentre come riferimento del 100 % di emolisi viene utilizzato sangue con tampone fosfato e un eccesso di cloruro d'ammonio.
Entrambe le formulazioni non hanno mostrato attività emolitica .
In tutte e due i casi si à ̈ riscontrata un'assenza di emolisi e nessuna modificazione morfologica dei globuli rossi. Da questi risultati si evidenzia che le formulazioni sono biocompatibili.
Esempio 8
Determinazione quantitativa del efficienza di incapsulazione di Amfotericina B mediante analisi spettrofotometrica sulle nanocapsule degli esempi 3 e 6
Sono state eseguite diverse curve di calibrazione per poter determinare la cinetica di rilascio del principio attivo dalle nanocapsule ottenute come illustrato negli esempi 3 e 6 a diversi valori di pH.
Retta di taratura dell'Amfotericina
Sono state preparate tre diverse rette di taratura : • Amfotericina in metanolo
• Amfotericina in acqua filtrata a pH 5,5
• Amfotericina in tampone fosfato a pH 7,4
La retta di taratura à ̈ stata costruita tramite analisi UV-Vis utilizzando uno spettrofotometro Beckman Coulter DU<®>730.
Lo spettro à ̈ dovuto alla presenza di una porzione cromofora all'interno della struttura dell'Amfotericina (i 7 doppi legami coniugati).
In tutti e tre i casi à ̈ stata preparata una soluzione madre a concentrazione nota di Amfotericina esattamente pesata e solubilizzata in DMSO.
Da queste vengono preparate 6 soluzioni standard con opportune diluizioni di Amfotericina B rispettivamente in metanolo, acqua filtrata pH 5,5 e tampone fosfato a pH 7,4.
Una volta preparati gli standard questi vengono analizzati allo spettrofotometro tramite analisi con scansione (per visionare l'intero spettro) .
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza (A) in funzione della concentrazione (ppm) .
Retta di taratura in metanolo
É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 50 ppm.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:
• 500 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo : 5 ppm
• 375 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo: 3,75 ppm
• 250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 5 mi con metanolo : 2,5 ppm
250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 1,25 ppm
100 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 0,50 ppm
50 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con metanolo : 0,25 ppm
I sei standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 406 nm .
È stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in metanolo (riportata in Figura 1).
ppm Assorbanza
0,00 0,000
0,25 0,048
0,50 0,087
1,25 0,191
2,50 0,377
3,75 0,552
5,00 0,734
L'analisi à ̈ stata condotta allo spettrofotometro tenendo come riferimento il picco a 406 nm.
Gli standard sono stati preparati ad una concentrazione tale da avere valori di assorbanza inferiori a 1 (prima di effettuare le diluizioni à ̈ stata misurata 1'assorbanza della madre). Dal grafico illustrato in Figura 1 si può osservare una buona linearità con un coefficiente di determinazione (R2) pari a 1.
Retta di taratura in acqua acida pH 5,5
L'acqua acida à ̈ stata preparata portando a pH 5,5100 mi di Acqua filtrata MilliQ con acido cloridrico 0,1 M. É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 76 ppm.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:
• 7,9 mi di soluzione madre sono stati portati a 10 mi con acqua acida: 60 ppm
• 2,5 mi di soluzione madre sono stati portati a 5 mi con acqua acida: 38 ppm
• 1 mi di soluzione madre sono stati portati a 5 mi con acqua acida: 15,2 ppm
• 1 mi di soluzione madre sono stati portati a 10 mi con acqua acida: 7,6 ppm
I quattro standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 395 nm.
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in acqua acida pH 5,5.
Assorbanza
0,00 0,000
7,60 0,128
15,20 0,234
38,00 0,582
60,00 0,905
La retta à ̈ stata preparata tramite analisi allo spettrofotometro prendendo come riferimento il picco a 395 nm. La retta di taratura ottenuta à ̈ riportata in Figura 2.
Retta di taratura in tampone fosfato pH 7,4
Il tampone fosfato à ̈ stato preparato secondo Farmacopea.
250 mi di potassio fosfato monobasico 0,2 M vengono aggiunti a 393,4 mi di NaOH 0,1 M. Nel nostro caso sono stati preparati 100 mi apportando le necessarie diluizioni.
É stata preparata una soluzione madre in DMSO con una concentrazione di 300 ppm.
Da questa sono stati preparati gli standard effettuando le seguenti diluizioni:
• 1 mi di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 30 ppm
• 500 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 15 ppm
• 250 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 7,5 ppm
• 100 Î1⁄4Î di madre sono stati portati a 10 mi con tampone fosfato pH 7,4: 3 ppm
I quattro standard sono stati analizzati allo spettrofotometro e ne à ̈ stata misurata l'Assorbanza a 409 nm.
É stata costruita la retta di taratura Assorbanza in funzione della concentrazione espressa in ppm.
Nella tabella di seguito riportata sono indicati i valori di Assorbanza e le rispettive concentrazioni espresse in ppm utilizzate per il calcolo della retta di taratura in tampone fosfato pH 7,4.
ppm Assorbanza
0 0
30 0.769
15 0 .379
7.5 0 .185
3 0 .08
La retta à ̈ stata preparata tramite analisi allo spettrofotometro prendendo come riferimento il picco a 409 nm. La retta di taratura ottenuta à ̈ riportata in Figura 3.
Determinazione dell'efficienza di ineapsulazione La determinazione della quantità di Amfotericina incapsulata à ̈ stata effettuata tramite analisi UV-visibile.
1 mi delle nanocapsule preparate secondo quanto illustrato negli esempi 3 e 6 viene diluito 1:10 V/V con metanolo (per aprire le nanocapsule).
La soluzione preparata viene agitata al vortex per 5 minuti al riparo da fonti luminose vista la fotosensibilità dell'Amfotericina. Dopo la diluizione la preparazione appare limpida.
Viene infine eseguita analisi spettrofotometrica UV-visibile con metanolo come bianco e si va a determinare la percentuale di incorporazione del farmaco.
Qualora il valore di assorbanza risulti maggiore di 1 verrà effettuata un'ulteriore diluizione.
L'efficienza di incapsulazione dell'Amfotericina nelle nanocapsule à ̈ stata calcolata con la formula seguente:
Quantità di farmaco nelle nanocapsule
Efficienza di incapsulazione= _ X 100
Quantità totale di farmaco usata per la preparazione L'analisi viene eseguita in metanolo sfruttando la retta di taratura precedentemente preparata.
Con la retta osservando il valore di assorbanza del campione à ̈ facile ricavare la concentrazione di Amfotericina presente tenendo conto delle diluizioni effettuate .
Efficienza di incapsulazione
Efficienza di incapsulazione Nanocapsule 49,00%
Esempio 9
Determinazione dimensionale delle nanocapsule ottenute secondo gli esempi 3 e 6
La misura delle dimensioni delle nanocapsule à ̈ stata eseguita con lo strumento 90 Plus Instrument (Brookhaven) .
Questo strumento utilizza la tecnica del Dynamic Light Scattering (DSL).
Il DSL Ã ̈ una tecnica non invasiva chiamata anche PCS (Photon Correlation Spectroscopy) o QELS (Quasi-Elastic Light Scattering) e viene impiegata per la misura della dimensione delle molecole. Consente di misurare, ad esempio, il diametro di proteine, polimeri, liposomi.
Inoltre consente di ottenere una distribuzione dimensionale (nel caso fossero presenti più popolazioni di molecole) e la determinazione di possibili aggregati presenti nella preparazione.
Il campione viene illuminato da un raggio laser e viene misurato la variazione di intensità della luce diffusa dalle particelle in funzione del tempo.
Le variazioni di intensità sono dovute al movimento Browniano delle particelle.
A parità di viscosità e temperatura, le particelle piccole si muoveranno velocemente (creando variazioni rapide dell'intensità di scattering) mentre le particelle più grandi saranno più lente.
Grazie ad un autocorrelatore la velocità delle variazioni di intensità viene misurata e il coefficiente di diffusione à ̈ calcolato dalla funzione di correlazione.
Infine l'equazione di Stokes-Einstein converte il coefficiente di diffusione in diametro.
kT
D =
6πη R
Equazione di Stokes Einstein correla il coefficiente di diffusione (D) con il raggio idrodinamico (R). Gli altri parametri sono K (costante di Boltzmann), T (temperatura), e η ( viscosità ).
Raddoppiando il raggio idrodinamico si ottiene il valore del diametro.
Caratterizzazione nanocapsule non contenenti farmaco Diametro Errore Indice di (nm) standard Polidispersione Nanocapsule 348 6,8 0,07
Il basso valore dell'indice di polidispersione indica una distribuzione omogenea della popolazione di nanoparticelle
Caratterizzazione nanocapsule con Amfotericina Dimensioni
Diametro Errore Indice di ( nm ) standard Polidispersione Nanocapsule 392 6,9 0,07
La presenza di Amfotericina all'interno delle nanocapsule produce un aumento delle dimensioni medie delle nanocapsule indicando la presenza del farmaco all'interno del sistema, mentre non varia l'indice di polidispersione.
Esempio 10
Determinazione della carica superficiale (misura del Potenziale Zeta)
Il Potenziale Zeta à ̈ stato misurato utilizzando lo strumento Potenziale Z Plus Instrument (Brookhaven).
Una molecola superficialmente carica produce un movimento di ioni intorno a se stessa provocando un aumento della concentrazione di controioni (ioni di carica opposta alla molecola in esame) intorno alla superficie.
Lo strato liquido intorno alla molecola à ̈ diviso in due zone: una zona più interna detta strato di Stern dove gli ioni sono fortemente legati e una seconda zona più esterna detta strato diffuso dove le interazioni sono molto più deboli.
Lo strato Stern più lo strato diffuso vanno a formare un doppio strato elettrico intorno alla molecola.
All'interno dello strato diffuso à ̈ presente un limite teorico nel quale il movimento delle molecole à ̈ accompagnato dal movimento degli ioni (questo confine à ̈ detto slipping piane). Fuori da questo confine gli ioni non seguono il movimento della molecola.
Il potenziale in questa zona corrisponde al Potenziale zeta.
Un valore elevato del Potenziale Zeta à ̈ indice di elevata stabilità e ci dice che prevalgono le forze repulsive; viceversa valori molto bassi sono indice di poca stabilità e indicano una tendenza da parte delle molecole ad aggregarsi .
Valori medi di Potenziale Z
Conduttanza Potenziale Z Errore (pS ) (mV) standard Nanocapsule 231 -15,5 1,7 bianche
Nanocapsule con Amfotericina
Conduttanza Potenziale Z Errore (pS ) (mV) standard Nanocapsule 210 -14,16 1,7 La carica negativa indica la presenza dei residui ciclodestrinici all'esterno della nanocapsula.
Esempio 11
Determinazione della stabilità nel tempo
Una volta preparate, le nanocapsule sono state controllate nel tempo monitorando determinati parametri come il pH, le dimensioni, la % di incapsulazione , il Potenziale Zeta, e durante ogni controllo sono state visualizzate al microscopio.
Inoltre sono state effettuate prove di stabilità in plasma e in tampone fosfato.
1 mi di nanocapsule viene diluito, in matraccio da 10 mi, con tampone fosfato a pH 7,4 viene lasciato incubare per 3 e per 6 ore.
Al termine dei due intervalli le nanocapsule vengono visionate al microscopio ottico e vengono caratterizzate misurando le dimensioni e la carica superficiale.
Per la prova in plasma, invece, Ã ̈ stato precedentemente diluito il plasma in tampone fosfato a pH 7,4 (diluizione 1 : 5 V/V).
La variazione delle dimensioni delle nanocapsule nel tempo a temperatura ambiente à ̈ di seguito riportata. I risultati ottenuti sono la media di più valori corrispondenti a diverse analisi.
La stabilità à ̈ stata valutata nei 60 giorni successivi alla preparazione.
Dopo 1 Dopo 7 Dopo 14 Dopo 21 Dopo 60 giorno giorni giorni giorni giorni Nanocapsule 392 395 401 405 420 Esempio 12
Studio della cinetica di rilascio in vitro
Per determinare la cinetica di rilascio delle nanocapsule à ̈ stato utilizzato il metodo delle celle rotanti .
Questo sistema à ̈ costituito da un sistema multicompartimentale formato da due dischi di plexiglass ciascuno formato da pozzetti circolari.
Tra i pozzetti viene inserita una membrana da dialisi; la membrana utilizzata à ̈ stata una membrana da dialisi in cellulosa modificata con un cut-off di 12000-14000 Dalton.
I due dischi vengono fatti combaciare e aderire attraverso una chiusura a vite.
Nei pozzetti dei due dischi vengono introdotti la fase donatrice e la fase ricevente e le 2 due fasi sono appunto separate dalla membrana.
La membrana prima di essere utilizzata viene lasciata per 5 minuti in acqua bollente; questo viene fatto per eliminare il conservante così da attivarla.
Successivamente la membrana viene tagliata e posta tra i due pozzetti in modo che la parte interna della membrana sia a contatto con la fase donatrice.
Infine vengono riempiti i pozzetti con le due fasi. Ad ogni prelievo si raccoglie la fase ricevente e si sostituisce con 1 mi di fase ricevente frasca.
L'esperimento à ̈ stato eseguito per 48 ore.
Tutti i prelievi vengono tenuti al riparo dalla luce per via della fotosensibilità dell'Amfotericina. I vari prelievi vengono analizzati, insieme alla fase donatrice (per determinare 1'Amfotericina non rilasciata), allo spettrometro UV-visibile e viene costruita la curva di rilascio.
Determinazione rilascio Amfotericina a pH 5,5 La fase donatrice utilizzata à ̈ costituita da 1 mi di nanocapsule di amfotericina mentre la fase ricevente à ̈ costituita da 1 mi di acqua filtrata portata a pH 5,5.
Questa à ̈ stata preparata portando a pH 5,5 100 mi di acqua filtrata con acido cloridrico 0,1 M. Ad ogni intervallo di prelievo viene prelevata la fase ricevente e viene sostituita con 1 mi di acqua acida.
Tutti i prelievi e la fase donatrice vengono analizzati allo spettrofotometro e i loro valori di assorbanza vengono convertiti in concentrazione grazie alla retta di taratura dell'Amfotericina in acqua acida precedentemente preparata.
In questo modo si va a costruire la curva percentuale di rilascio in funzione del tempo dei singoli prelievi.
La percentuale di rilascio à ̈ data dal rapporto tra 1'Amfotericina rilasciata nei vari intervalli e 1 'Amfotericina totale moltiplicato per 100.
Determinazione rilascio Amfotericina a pH 7,4 La fase donatrice utilizzata à ̈ costituita da 1 mi di nanocapsule di Amfotericina mentre la fase ricevente à ̈ costituita da 1 mi di tampone fosfato a pH 7,4. Questo à ̈ stato preparato secondo Farmacopea.
250 mi di potassio fosfato monobasico 0,2 M vengono aggiunti a 393,4 mi di NaOH 0,1 M.
Sono stati preparati 50 mi effettuando le opportune diluizioni .
Ad ogni intervallo di prelievo viene prelevata la fase ricevente e viene sostituita con 1 mi di tampone fosfato.
Tutti i prelievi e la fase donatrice vengono analizzati allo spettrofotometro e i loro valori di assorbanza vengono convertiti in concentrazione grazie alla retta di taratura dell' Amfotericina in tampone fosfato precedentemente preparata.
In questo modo si costruisce la curva percentuale di rilascio in funzione del tempo.
Come si può notare dalle Figure 4-6, la cinetica di rilascio in vivo dell'Amfotericina B risulta prolungata nel tempo senza nessun tipo di rilascio immediato confermando l'incorporazione dell'Amfotericina nel compartimento centrale delle nanocapsule.
Esempio 13
Efficacia in vitro dell 'Amfotericina formulata in nanocapsule secondo gli esempi 3 e 6
Ceppi di Candida
Il ceppo ATCC 10231 di Candida albicans (acquistato presso 1'American Type Colture Collection) à ̈ stato utilizzato come ceppo di riferimento nell'ambito dei saggi di suscettibilità all'amfotericina B. Inoltre, un totale di sette ceppi isolati clinici di Candida spp. sono stati utilizzati: tre ceppi di Candida. albicane (due da emocoltura ed uno da tampone vaginale, denominati rispettivamente 424084, 402766 e 403553, gentilmente forniti dalla Professoressa Pianella Savoia, del Dipartimento di Scienze Cliniche e Biologiche dell'Ospedale San Luigi Gonzaga di Orbassano), uno di Candida glabrata, uno di Candida krusei, uno di Candida parapsilosis ed uno di Candida tropicalis (rispettivamente identificati dalle sigle UCSC3, UCSC16, UCSC8 e UCSC9, forniti dal Professor Sanguinetti, dell'Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma). Tutte le specie ed i ceppi sopra elencati sono stati coltivati su terreno semisolido Saboureaud dextrose agar (OXOID, Solaar House, 19 Merces Row, Cambridge, CB5 8BZ, UK) ad una temperatura di 37°C e sono stati conservati ad una temperatura di -80°C mediante l'utilizzo di una soluzione crio-preservante con glicerolo (ad una concentrazione finale del 50%), in grado di prevenire il danno cellulare dovuto al congelamento.
Saggio di suscettibilità delle Candide all'amfotericina
Il saggio à ̈ stato effettuato eseguendo il protocollo validato dal National Committee for Clinical and Laboratory Standards. In breve, sono state preparate diluizioni di Amfotericina B veicolata con nanocapsule di LED132 e NC12C ed Amfotericina B libera, in RPMI 1640 con L-glutamina tamponato a pH 7,4 (PAA, 4061 Pasching, Austria) ad una concentrazione di 2,5Î1⁄4Îœ di Amfotericina B; da questa concentrazione, in piastra da 96 pozzetti con fondo a "U", sono state effettuate diluizioni scalari 1:2, in un volume finale di ΙΟΟÎ1⁄4Ι, fino a giungere ad una concentrazione finale di 0,0012Î1⁄4Îœ.
L'inoculo à ̈ stato preparato in RPMI, al fine di dispensare in ogni pozzetto 5x104 CFU/ml; un ugual volume di inoculo (ΙΟΟÎ1⁄4Ι) à ̈ stato aggiunto ad ogni pozzetto contenente 1'Amfotericina libera o veicolata.
Al fine di discriminare l'effettiva efficacia dell'Amfotericina libera e veicolata, sono stati effettuati esperimenti di controllo trattando le Candide con diluizioni seriali di nanocapsule LED132 e NC12C vuote (ovvero, prive del contenuto di amfotericina).
Le piastre sono state dunque incubate a 35°C per 24, 48 e 72 ore.
A questi tempi à ̈ stata valutata la Minima Concentrazione Inibitoria (MIC), definita come la minima concentrazione di farmaco alla quale non à ̈ visualizzabile la crescita fungina, e la Minima Concentrazione Fungicida 50 (MFC50), ovvero la concentrazione di farmaco in grado di uccidere il 50% delle Candide. Al fine di rilevare questo ultimo parametro, campioni di Candide dai pozzetti trattati con differenti concentrazioni sono stati prelevati, opportunamente diluiti e piastrati su Saboureaud Dextrose Agar, al fine di quantificare le CFU/ml contenute nei pozzetti trattati, e costruire delle curve dose-risposta. Tale operazione à ̈ stata effettuata 24, 48 e 72 ore posttrattamento.
In un secondo gruppo di esperimenti, l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B formulata in nanocapsule à ̈ stata confrontata con quella dell'AmBisome (Gilead), una formulazione liposomale di Amfotericina B comunemente utilizzata in ambito clinico; in questo caso le due formulazioni sono state ricostituite nello stesso momento, ed i saggi di suscettibilità sono stati effettuati subito dopo.
L'efficacia in vitro dell'Amfotericina B incapsulata e dell'AmBisome (conservati entrambi a 4°C) à ̈ stata inoltre valutata dopo tre mesi dalla ricostituzione di entrambi, al fine di saggiare la stabilità delle formulazioni.
Saggio di suscettibilità del biofilm di C. albicans Il saggio di suscettibilità su biofilm à ̈ stato effettuato seguendo il protocollo descritto da Ramage e colleghi (Ramage et al., 2001); in breve, una provetta contenente 20ml di YPD brodo (1% p/v di estratto di lievito, 2% p/v di peptone, 2% p/v di destrosio) à ̈ stata inoculata con un'ansata di cellule da piastra di Saboureaud Dextrose Agar, ed incubata per tutta la notte a 30°C in agitazione (180 rpm).
Il giorno successivo, le cellule sono state lavate mediante centrifugazione in PBS sterile, e risospese in RPMI 1640 supplementato con L-glutamina e tamponato a pH 7,4.
I biofilm di C. albicans (ceppo ATCC 10231) sono stati preparati su piastre da 96 pozzetti con fondo piatto (Orange Scientific) inoculando ΙΟΟÎ1⁄4Ι di una sospensione di 106 cellule/ml in ogni pozzetto. I pozzetti della dodicesima colonna devono rimanere vuoti, andando a costituire un valore di background durante la seguente quantificazione del biofilm.
La piastra à ̈ stata dunque chiusa con l'apposito coperchio, sigillata con parafilm ed incubata a 37°C per 48 ore.
Dopo la formazione del biofilm, il terreno à ̈ stato aspirato e le cellule planctoniche o non aderenti sono state rimosse mediante due lavaggi con PBS IX (ΙΟΟÎ1⁄4Ι per pozzetto) .
I biofilm sono stati dunque trattati secondo il seguente protocollo: in primo luogo, sono state preparate diluizioni di Amfotericina B veicolata con nanocapsule LED 132 e NC12C, AmBisome ed Amfotericina B tal quale, in RPMI 1640 ad una concentrazione di 8Î1⁄4Îœ di Amfotericina B; in piastra da 96 pozzetti con fondo a "U", sono state effettuate diluizioni scalari 1:2, in un volume finale di ΙΟΟÎ1⁄4Ι, fino a giungere ad una concentrazione finale di 0,0078Î1⁄4Îœ.
Il PBS utilizzato per lavare i pozzetti contenenti i biofilm à ̈ stato rimosso ed i composti così diluiti sono stati aggiunti.
La piastra à ̈ stata nuovamente sigillata con parafilm ed incubata a 37°C per 48 ore.
L'effetto dei composti sul biofilm di C. albicane à ̈ stato valutato mediante un saggio metabolico basato sull'uso dei sali di tetrazolio (XTT sodium salt bioreagent, X4626, SIGMA-ALDRICH).
- Attività inibitoria dell'Amfotericina B incapsulata nei confronti di diverse specie di Candida
I risultati ottenuti durante la fase di sperimentazione in vitro hanno dimostrato che 1'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato (NC12C-Amf) (Tabella 1 e 2) o LED132 (Tabella 3 e 4) ha un'efficacia in vitro molto maggiore rispetto al principio attivo tal quale (Amf), nei confronti di tutti i ceppi e le specie in esame; inoltre, l'effetto inibitorio esercitato dall 'Amfotericina B formulata in nanocapsule, al contrario dell'Amfotericina B tal quale, risulta essere costante nell'arco di 72 ore. Le nanocapsule di dodecilcarbonato prive del contenuto di Amfotericina B (NC12C) non mostrano effetto inibitorio nei confronti della crescita fungina.
I medesimi risultati sono stati ottenuti confrontando l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato(NC12C-Amf) con l'AmBisome (Tabella 5 e 6); deve essere sottolineato infine che l'efficacia in vitro dell'Amfotericina B formulata con nanocapsule, anche dopo tre mesi dalla data di preparazione delle medesime, risulta invariata, mantenendo un'efficacia in vitro superiore di circa 10 volte rispetto a quella dell'AmBisome e dell'Amfotericina B tal quale.
Tabella 1: minime concentrazioni Inibitorie (MIC) ottenute sa vitro dell 'Amf otericina B tal guale (Amf), formulata con nanocaps (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C) .
24h 48h
Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C C. Albicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,02 >1 ATCC ceppo 10231
C. Albicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 Ceppo 402766
C. Albicans 0,15 0,02 >1 0,3 0, 02 >1 Ceppo 424084
C. Albicans 0,15 0,02 >1 0,6 0,02 >1 Ceppo 403553
C. glabrata 0,15 0,02 >1 C. tropicalis 0,15 0,08 >1 0,3 0,04 >1 C. parapsilosis 0,3 0,15 >1 1,25 0,15 >1 C. krusei 0,08 0,02 >1 0,08 0,02 >1 C. glabrata (ceppo resistente) 2 1 >2 2 1 >4 Tabella 2: Minime concentrazioni fungicide 50 (MFC50) ottenute sa vitro dell' Amfotericina B tal quale (Amf ), formulata con nanocaps (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C) .
24h 48h
Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C . Albicans 0,3026 0,01553 >1 0,2948 0,02298 >1 TCC ceppo 10231
. Albicans 0,02543 0,009819 >1 0,1178 0,01754 >1 eppo 402766
. Albicans 0,03003 0,004482 >1 0,0921 0 ,001016 >1 eppo 424084
. Albicans 0,1166 0,01486 >1 0,1551 0,005157 >1 eppo 403553
. glabrata >1 0,0913 0 ,01544 >1 . tropicalis 0,08965 0,01637 >1 0,1114 0,01501 >1 . parapsilosis 0,1601 0,1006 >1 0,314 0,06954 >1 . krusei 0,00996 0,02011 >1 0,0673 0,008306 >1 . glabrata (ceppo resistente) 1,2 0,4357 1,401 1,131 0 ,4784 0,943 Tabella 3: Minime concentrazioni inibitorie (MIC) ottenute saggian dell 'Amfotericina B tal quale (Ami), formulata con nanocapsule LED LED132
24h 4 8h
Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LEDI 32 lbicans 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 o 402766
lbicans 0,15 0,02 >1 0,3 0,02 >1 o 424084
lbicans 0,15 0,02 >1 0,3 0,02 >1 o 403553
Tabella 4: Minime concentrazioni fungicide 50 (MFC50) ottenute sa vitro dell'Amfotericina B tal quale (Ami), formulata con nanocapsul vuote LED132
24h 4 8h
Amf LED132-Amf LED132 Amf LED132 -Amf LED132 icans 0,02543 0,0052 >1 0,1178 0, 0089 >1 402766
icans 0,03003 0,0066 >1 0,09214 0, 0049 >1 424084
icans 0,1166 0,01 >1 0,1551 0, 0066 >1 403553
Tabella 5: Minime concentrazioni Inibitorie (MIC) ottenute sa vitro dell 'Amfotericina B tal quale (Amf), formulata con nanocapsu (NC12C-Amf) o nanocapsula vuota (NC12C), valutata subito dopo (t0) preparazione della formulazione
24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0,3 0,02 >1 0,6 0,04 >1 1,2 0 1,2 0,02 >1 1,2 0,04 >1 1,2 0 Tabella 6: Minime Concentrazioni Fungicide 50 (MFC50) ottenut in vitro dell'Amfotericina B tal quale (Amf), formulata con carbonato (NC12C-Amf ) o nanocapsula vuota (NC12C) , valutata subit dopo (t3) la preparazione della formulazione.
24h 48h 72h Amf NC12C-Amf NC12C Amf NC12C-Amf NC12C Amf 0,303 001553 >1 0,295 0, 02298 >1 0,101 0 0,668 0,01284 >1 0,781 0, 01367 >1 0,999 0 - Attività inibitoria dell'Amfotericina B incapsulata nei confronti del biofilm di Candida albicans
Data la rilevanza clinica dei biofilm di Candida, l'efficacia dell'Amfotericina B veicolata con nanocapsule di dodecilcarbonato à ̈ stata valutata anche nei confronti di cellule sessili (notoriamente più resistenti delle planctoniche) , in termini di Minima Concentrazione Inibitoria Sessile in grado di limitare del 50% la crescita del biofilm (SMIC50) , utilizzando un ceppo commerciale di Candida albicans (ATCC 10231); i valori ottenuti dimostrano, anche in questo caso, che l'efficacia dell 'Amfotericina B formulata in nanocapsule à ̈ superiore di 10 volte rispetto al farmaco tal quale e paragonabile a quella dell'AmBisome :
SMIC50 Amfotericina: 0,3129 Î1⁄4Îœ SMIC50 Amfotericina veicolata con nanocapsula di dodecilcarbonato: 0,05338 Î1⁄4Îœ SMIC50 Nanocapsule "vuote": >8 Î1⁄4Îœ
SMIC50 AmBisome: 0,02037 Î1⁄4Îœ
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1.- Membrana per nanocapsula per incapsulare un agente terapeutico, detta membrana essendo caratterizzata dal fatto di comprendere molecole anfifiliche costituite da una testa idrofila selezionata nel gruppo costituito da ciclodestrine naturali e loro derivati ed una coda lipofila selezionata nel gruppo costituito da un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente almeno 8 atomi di carbonio, da una catena polimerica poliestere, da una catena polimerica anidridica e da una catena polimerica dell'acriloilmorfolina. 2.- Membrana secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che dette ciclodestrine naturali sono beta-ciclodestrine o gamma-ciclodestrine. 3.- Membrana secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzata dal fatto che detta coda lipofila à ̈ un residuo alchilcarbonilico lineare o ramificato comprendente da 10 a 22 atomi di carbonio. 4.- Membrana secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che detta coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico. 5.- Membrana secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che detta coda lipofila à ̈ una catena polimerica poliestere selezionata nel gruppo costituito da polilattati e poliglicolattati. 6.- Membrana secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che detta testa idrofila à ̈ 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina e detta coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorfolina). 7.- Membrana secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che detta testa idrofila à ̈ gammaciclodestrina e detta coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilico . 8.- Nanocapsula comprendente una membrana secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti. 9.- Nanocapsula secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto di comprendere inoltre un agente terapeutico. 10.- Nanocapsula secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che detto agente terapeutico à ̈ Amfotericina B. 11.- Nanocapsula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 10 caratterizzata dal fatto che detto agente terapeutico à ̈ disciolto in un solvente opportuno. 12.- Nanocapsula secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che detto solvente à ̈ selezionato nel gruppo costituito da trigliceridi, mono-digliceridi, esteri, siliconi, perfluorocarburi o loro miscele. 13.- Nanocapsula secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che detto solvente à ̈ almeno un trigliceride o una miscela di trigliceridi. 14.- Nanocapsula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 13 caratterizzata dal fatto di comprendere una membrana in cui detta testa idrofila à ̈ una gamma-ciclodestrina e detta coda lipofila à ̈ un residuo dodecilcarbonilìco e 1'Amfoterìcina B à ̈ disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico. 15.- Nanocapsula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 13 caratterizzata dal fatto di comprendere una membrana in cui detta testa idrofila à ̈ una 6-desossi-6-mercapto-beta-ciclodestrina e detta coda lipofila à ̈ poli(4-acriloilmorfolina) e 1'Amfoterìcina B à ̈ disciolta in una miscela di trigliceridi dell'acido caprilico e dell'acido caprico. 16.- Nanocapsula secondo la rivendicazione 14 o 15 per l'uso nel trattamento di una patologia associata ad infezioni fungine sistemiche. 17.- Nanocapsula secondo la rivendicazione precedente caratterizzata dal fatto che detta patologia associata ad infezioni fungine sistemiche à ̈ selezionata nel gruppo costituito da infezioni fungine in pazienti neutropenici, meningite da Criptococco in pazienti infettati da HIV, infezioni da Aspergillus spp., Candida spp . e Cryptococcus spp. refrattarie al trattamento con Amfotericina B deossicolato, leishmaniosi viscerale. 18.- Composizione farmaceutica comprendente una nanocapsula secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 15 ed un eccipiente farmacologicamente accettabile.
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| IT000884A ITTO20110884A1 (it) | 2011-10-04 | 2011-10-04 | Membrana per nanocapsula, nanocapsula comprendente la stessa e suo uso |
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| IT (1) | ITTO20110884A1 (it) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5718905A (en) * | 1992-06-16 | 1998-02-17 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Preparation and use of novel cyclodextrin-based dispersible colloidal systems in the form of nanospheres |
-
2011
- 2011-10-04 IT IT000884A patent/ITTO20110884A1/it unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US5718905A (en) * | 1992-06-16 | 1998-02-17 | Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) | Preparation and use of novel cyclodextrin-based dispersible colloidal systems in the form of nanospheres |
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