ITRM930343A1 - Proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi. - Google Patents
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Landscapes
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Description
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo: "Proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi"
La presente invenzione concerne proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi.
Pi? in particolare l'invenzione riguarda proteine chimeriche ricombinanti, comprendenti sequenze della proteina che si desidera produrre covalentemente legate alla sequenza della ferritina, 0 anche libere da detta sequenza a mezzo di digestione proteolitica specifica della proteina chimerica, ottenibili a seguito di trasformazione di un vettore comprendente le sequenze codificanti per esse, in un ospite.
La ferritina ? una proteina per l'immagazzinamento del ferro, ampiamente distribuita nel mondo vivente (per una recente review sull'argomento vedi Andrews, S.C. et al., 1992, J. Inorg. Biochem., 47, 161 -174). La ferritina ? composta da 24 subunit?, ? termostabile e pu? essere espressa con alte rese dopo trasformazione di vettori ricombinanti opportuni, in cellule di E. coli. (Levi, S. et al. (1987) Gene 51 , 269-274; Levi, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 18086-18092).
La proteina ottenuta per via ricombinante mantiene la struttura terziaria e quaternaria della proteina naturale ed ? in grado di incorporare il ferro.
La produzione di proteine per via ricombinante su larga scala ? spesso limitata dalle rese non ottimali del procedimento, dalia insolubilit? delle proteine e, ancora, dall'ottenimento di prodotti parzialmente o totalmente denaturati e, comunque, non in grado di esercitare la loro attivit? biologica.
Nel campo dell'immunologia, ed in particolare dell?allergologia, la produzione di proteine per via ricombinante, che conservino le propriet? antigeniche delle corrispondenti proteine naturali, ? indispensabile per l'allestimento di composizioni farmaceutiche, di vaccini e di saggi immunodiagnostici. Questa esigenza ? ancor pi? sentita in quei casi in cui la proteina antigenica naturale ? ottenibile in quantit? e/o qualit? insufficienti per un suo uso in farmacologia, in diagnostica o nella preparazione di vaccini.
Gli autori della presente invenzione hanno costruito un vettore di espressione in cellule batteriche di sequenze codificanti esogene. (I vettore comprende una sequenza codificante per una porzione della ferritina umana sotto il controllo del promotore P\_ del fago ? e, a valle di detta sequenza, siti di inserzione di un gene esogeno. Pertanto il vettore ? in grado di esprimere una proteina chimerica, dopo trasformazione in un ospite. Sorprendentemente le sequenze della ferritina non alterano le propriet? biologiche e immunoiogiche della proteina da produrre e rendono possibile la purificazione ad alte rese della proteina chimerica ottenuta. Inoltre, inserendo dei siti di attacco per proteasi specifiche tra la porzione ferritina e la porzione codificata dal gene esogeno, ? possibile separare la porzione ferritina da quella che si desidera produrre.
Gli autori hanno introdotto diverse sequenze geniche esogene ed hanno ottenuto alte rese delle proteine prodotte ed il mantenimento delle propriet? biologiche di esse. Uno dei geni utilizzati ? quello codificante per l'allergene Lol pii, estratto da polline di Lolium perenne. Il cDNA ? stato isolato e sequenziato dagli autori della presente invenzione. Dopo tentativi fallimentari di espressione della proteina Lol pii utilizzando diversi vettori, la sequenza di cDNA ? stata inserita in un vettore comprendente sequenze codificanti per una porzione della ferritina umana. L'espressione in cellule di E. coli dei vettore ricombinante cos? ottenuto, permette di ottenere con alte rese la proteina chimerica, in forma solubile e con una capacit? antigenica paragonabile a quella della proteina Lol pii naturale. La proteina chimerica ricombinante ? pertanto utilizzata nell'allestimento di saggi aliergenici. Gli autori hanno anche inserito sequenze codificanti per l'allergene Lol pi da L.
perenne e per il fattore di crescita epidermale umano (hEGF o urogastrone), con risultati soddisfacenti.
Formano pertanto oggetto delia presente invenzione proteine ricombinanti comprendenti una prima sequenza aminoacidica, compresa nella sequenza della ferritina, covalentemente legata a mezzo di legame peptidico ad una seconda sequenza aminoacidica, e di essere producibili ed estraibili ad alte rese da cellule ospiti, mantenendo almeno una propriet? fisiologica o antigenica di detta seconda sequenza aminoacidica, dette cellule trasformate con un vettore codificante per detta prima e detta seconda sequenza aminoacidica sotto il controllo di un promotore di trascrizione.
NeH'ambito della presente invenzione per propriet? fisiologica, o biologica, o antigenica si intende almeno una propriet? delia sequenza aminoacidica naturale; per alte rese si intendono rese superiori a 4-5 mg di proteina purificata per litro di coltura batterica, o uguali o superiori al 10% p/p delle proteine batteriche solubili totali.
Secondo un aspetto dell'invenzione detta prima sequenza aminoacidica comprende la sequenza dall'aminoacido 1 3 afl'aminoacido 158 della catena H della ferritina umana.
Sempre secondo l'invenzione detta prima sequenza aminoacidica pu? essere separata da detta seconda sequenza aminoacidica a mezzo di digestione proteolitica specifica.
In una forma preferita di attuazione dell'invenzione, detta seconda sequenza aminoacidica comprende una sequenza immunogena, preferibilmente una sequenza allergenica, pi? preferibilmente una sequenza allergenica di un allergene di L. perenne. Preferibilmente detta sequenza allergenica di L. perenne comprende sequenze dell'allergene Lol pii o porzioni di esse, sempre pi? preferibilemente la sequenza descritta nella figura 2, o porzioni di essa ad attivit? allergenica. Alternativamente detta sequenza allergenica di L. perenne comprende sequenze dell'allergene Lol pi o porzioni di esse.
in una forma alternativa dell' invenzione, detta seconda sequenza aminoacidica comprende una sequenza codificante per un fattore di crescita, preferibilmente il fattore di crescita epidermale o EGF, pi? preferibilmente l'EGF di origine umana.
Costituisce ulteriore oggetto dell'invenzione un vettore per l'espressione delie proteine chimeriche ricombinanti dell'invenzione.
Ulteriore oggetto delia presente invenzione ? l'uso delle proteine chimeriche ricombinanti dell'invenzione per la preparazione di composizioni farmacologiche, per vaccini o per fa preparazione di corredi diagnostici per la evidenziazione di anticorpi specifici per detta seconda sequenza aminoacidica da un campione.
La presente invenzione verr? ora descritta in suoi esempi illustrativi, facendo riferimento alle seguenti figure in cui:
- la figura 1 rappresenta la sequenza nucleotidica del vettore pVH e quella aminoacidica della catena H della ferritina;
- la figura 2 rappresenta la sequenza nucleotidica ed aminoacidica della porzione della proteina allergenica Lol pii, clonata nel vettore pVH-Loipil, ad attivit? allergenica;
- la figura 2B rappresenta la sequenza nucleotidica ed aminoacidica della proteina allergenica Lol pii, clonata nel vettore pVH-Lolpil/FX, insieme al sito di attacco della proteasi Xa;
- la figura 3 rappresenta una tabella di paragone delle sequenze aminoacidiche di Lol pi, Il e III;
- la figura 4 rappresenta un quadro elettroforetico in condizioni denaturanti (A) e non denaturanti (B) di estratti proteici di cellule di E. coli trasformate con il vettore pVH-Lol pii;
- la figura 5 rappresenta un'analisi per "western blot? della proteina ricombinante Ft-Lol pii, in condizioni non denaturanti (A) e denaturanti (B);
- la figura 6 rappresenta un grafico in cui sono riportati i risultati di un saggio ELISA per la determinazione di IgE anti-Lol pii nei siero (A) e (B);
- la figura 7 rappresenta un grafico in cui sono riportati i risultati di un saggio di rilascio di istamina in soggetti allergici a Lol pll;
- la figura 8 rappresenta una foto di un gel di proteine SDS-PAGE, in cui 1 ) Ceppo E. coli GC76 non indotto; 2) Ceppo E. coli GC76 indotto; 3) Ceppo E. coli GC76 con plasmide ricombinante Ft-Lol p I, indotto; 4) Ceppo E. coli GC76 con plasmide ricombinante, non indotto;
- la figura 9 rappresenta la sequenza del gene sintetico per hEGF, in cui le sequenze specifiche per gli enzimi Xbal, Kpnl e per la protessi fattore Xa sono indicate e il sito di taglio specifico per la protessi ? indicato da una freccia;
- la figura 10 rappresenta una foto di un gel di proteine SDS-PAGE, in cui : 1 ) Ceppo E. coli GC76; 2) Ceppo E. coli GC76, sonicato e scaldato a 65 ?C; 3) Ceppo GC76 con plasmide ricombinante Ft-hEGF; 4) Ceppo GC76 con plasmide ricombinante Ft-hEGF, sonicato e scaldato a 65 ?C. Gli stessi campioni sono trasferiti (western blotting) e incubati con un anticorpo monocfonale specifico anti-ferritina unama H: 5) Ceppo GC76 con plasmide ricombinante Ft-hEGF, sonicato e scaldato a 65?C; 6} Ceppo GC76 con plasmide ricombinante Ft-hEGF; 7) Ceppo E. coli GC76, sonicato e scaldato a 65?C; 8) Ceppo E. coli GC76; 9) Ferritina umana H ricombinante.
ESEMPIO 1 Costruzione del vettore di espressione DVH
Il vettore plasmidico pVH ? derivato dal vettore pEMBL8 (ATCC N. 37396), secondo metodiche note agli esperti del settore e descritte nei riferimenti bibliografici seguenti. Il plasmide pEMBL8 ? sostituito nel poivlinker come descritto in Sollazzo et al. Gene 37, 1 99-206, originando il vettore pEMBLex2; in questo vettore ? inserita la sequenza codificante per la catena H della ferritina, originando il vettore pEMBLex2-HFt (Levi et al., 1987 Gene 51 , 269-274), modificato per mutagenesi sito-diretta secondo metodiche convenzionali. Questo vettore codifica per un mutante delia catena H della ferritina umana denominato 222, che porta le sostituzioni K86Q, per ottenere la cristallizzazione della proteina; E62K e H65G che aboliscono l?attivit? ferrossidasica ed aumentano la stabilit? della ferritina, come dimostrato in Lawson, M.D. et al. (1991 ) Nature 349, 541-544 e in Santambrogio, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 14077-14083. Gli autori dell'Invenzione hanno inserito sequenze di riconoscimento per gli enzimi Xba I e Kpn I, per poter clonare, nella stessa cornice di lettura della catena della ferritina, geni esogeni codificanti per le proteine da produrre, i siti di restrizione sono ottenuti per mutagenesi sito diretta, come descritto in Levi, S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 18086-18092. L'innesco per la mutagenesi sito diretta attuato sul vettore pEMBLexHFT/222 ? il seguente:
innesco SH10: 5'-GAC-AAG-CAC-ACT-CTA-GAA-GAC-AGT-GGT-ACC-GAA-AGC-TAG-3?
L'inserzione dei due siti di restrizione nella regione del vettore induce le sostituzioni G176 a E, D179 a G e N180 a T alla estremit? C-terminale della catena H della ferritina.
La sequenza nucleotidica dei vettore pVH, insieme a quella aminoacidica della ferritina ? illustrata in figura 1 .
ESEMPIO 2 Isolamento del cDNA codificante oer la oroteina LOLPH
Tutti i reagenti chimici sono della BDH Biochemical Reagents (Dorset, U.K.), a meno che indicato diversamente. La catena H della ferritina umana ricombinante ? ottenuta per purificazione come descritto in Levi, S. et al. (1987) Gene 51 , 269-274. L'estratto crudo da polline di L. perenne (Allergon AB, Engelholm, S.) ? preparato seguendo le procedure descritte in Ansari, A. A., Sthenbagamurthi, P., and Marsh, D.G. (1 989) J. Biol. Chem. 264, 1 1 181 -1 1185.
Preparazione del RNA
Si macerano in un mortaio 5 g di polline da L. perenne sotto azoto liquido per 15 minuti. Si aggiungono 20 mi di soluzione di lisi di guanidina isotiocianato (GTC, 4M guanidina ?sotiocianato, 5mM EDTA, 25mM citrato trisodico, pH 7.0, 0.5% sodio N-laurilsarcosilato, 0.1 M 2-mercaptoetanolo) e si agita gentilmente la preparazione. Si filtra la soluzione attraverso una garza, e si centrifuga a 5000 rpm per 10 minuti. Si stratifica il sovranatante sopra una soluzione di 5.7 M cloruro di cesio in 25 mM acetato di sodio pH 5.4, 100 mM EDTA. Si centrifugano i campioni a 31.000 rpm per 20 ore a 20?C in un rotore SW40 (Beckman, Fullerton, CA). Si lava il centrifugato con 70% etanolo e si risospende in tampone TE {10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.0). Dopo una estrazione con c!oroformio:isoamilalcol (24:1 ), si precipita a freddo l'RNA con etanolo e si risospende in tampone TE.
Sintesi della prima elica e reazione PCR
Si ottiene una sintesi della prima elica di DNA da RNA totale con un innesco di oligo dT (Amersham cDNA Synthesis System Plus, Amersham U.K.). Una miscela di reazione tipica di 60 ?? contiene: trascrittasi inversa dal virus della leucemia murina di Moloney (MMLV) (0.2?/??), inibitori della ribonucleasi da placenta umana (HPRI) (0.45?/??), 1 x tampone per la trascrittasi inversa MMLV (50 mM TRIS-HCI pH 8.2, 70 mM KCI, 5 mM ditiotreitolo, 10 mM MgCl2), innesco oligo dT12-18 (8.33 ng/??), miscela di dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1 mM), RNA totale 10 ?g. Si incuba la reazione a 42?C per 40 minuti. Si utilizza il cDNA cosi ottenuto come stampo per la amplificazione. Gli inneschi per la amplificazione da PCR sono i seguenti:
LH/SP: innesco senso 5'-AAT-CTA-GA(A/G)-TT(T/C)-AC(T/G)-GT(T/G)-GA(A/G)-AA-3'
LII/AP: innesco antisenso
5?-TTG-GTA-CC{A/G/C/T)-AC(T/C)-TT{A/G)-AA(A/G)-TC-3' I due inneschi, corrispondenti ai terminali 5' e 3' sono progettati per amplificare la maggior parte della regione codificante e per inserire i siti di restrizione Xbai e Kpnl per il clonaggio in vettori opportuni, come il plasmide pVH. Questi oligonucleotidi contengono solo 2 degenerazioni per gli aminoacidi glieina, treonina e vaiina, considerando i legami ad alta energia tra le basi guanina e timina.
Si attua la reazione PCR in 50 ?? di una soluzione contenente: 2 ?? della prima elica dj cDNA; 1 x tampone di reazione (50 mM KCI, 10 mM TRIS-HCI pH 8.3, 1.5 mM MgCl2); miscela di dNTPs 1 mM; DNA polimerasi Taq (Perkin Elmer-Cetus, 50 mU/??) come descritto in Scharf, S.J., Horn, G.T., and Erlich, H.A. (1988) Science 233, 1076-1079 e in Saiki, R.K. et al. (1 988) Science 239, 487-492. Ciascuno stampo ? aggiunto ad una concentrazione finale di 8 ng/?? e la miscela ? sottoposta a 40 cicli di amplificazione PCR, utilizzando un apparecchio automatico (Perkin Elmer, USA). Le temperature per questa reazione sono le seguenti: 93?C, 45 sec.; 48?C, 45 sec.; 72?C, 90 sec. Si utilizzano gel di agarosio 1 ,2 %, colorati con bromuro di etidio, per analizzare e separare i frammenti di PCR.
Si produce dopo amplificazione un singolo frammento di DNA, di circa 300 bp, in accordo con la dimensione attesa dalla sequenza di 97 aminoacidi della proteina Lol pii, descritta in Ansari, A. A., Shenbagamurthi, P., and Marsh, D.G. (1989) J. Biol. Chem. 264, 11 181 -11 185.
Clonaaaio e sequenza del DNA
Si digeriscono i prodotti da PCR purificati su gei con gli enzimi di restrizione Xbal e Kpnl. Si ligano i frammenti nei vettori di sequenza M13 mp18 e mp19 come descritto in Messing, J. et al. (1981 ) ISIucl. Acids Res. 9, 309-321 e in Norrander, J., Kempe, T., and Messing, J. (1983) Gene 26, 101-106. Le reazioni di restrizione e di ligazione seguono protocolli abituali descritti in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY. Gli enzimi di restrizione e di modificazione sono forniti da Boehringer (Mannheim, Germany). La sequenza del cDNA ? ottenuta utilizzando il metodo "di-deossi? ed un sequenziatore Applied Biosystems 370A (Foster City, CA, USA). La sequenza nucleotidica e aminoacidica derivata ? mostrata in figura 2. A causa dei procedimenti di cfonaggio, la sequenza codifica per una proteina deleta per i primi quattro e per gli ultimi cinque aminoacidi, in riferimento alla sequenza gi? riportata in Ansari, A. A., Shenbagamurthi, P., and Marsh, D.G. (1989) J. Biol. Chem. 264, 1 1181-1 1185. La sequenza aminoacidica derivata dal cDNA ? in accordo completo con quella pubblicata da Ansari et al. (citato), eccetto che un residuo di triptofano al posto di uno di arginina ? in posizione 77, come mostrato in fig. 3.
ESEMPIO 3 Costruzione del sistema di espressione ricombinante dell'allergene Lol pii
Tentativi di esprimere la proteina matura Lol p II in L? coli a mezzo di altri vettori di espressione sono deludenti, probabilmente a causa della piccola quantit? di materiale espresso. Per ottenere grandi quantit? di proteina Lol p II, la sequenza ? stata fusa al C-terminale della catena H della ferritina umana, che ? una proteina espressa ad alte rese in coli e facile da purificare. Il frammento di DNA codificante per la proteina Lol pii (dall1 aminoacido 5 all'aminoacido 92) ? clonato nei siti di restrizione Xba I e Kpn I del plasmide pVH; il gene ottenuto codifica per una proteina di 266 aminoacidi, dei quali i primi 176 residui appartengono alla ferritina H, dal residuo 177 al residuo 264 alla proteina Lol pii, e gii ultimi 2 aminoacidi alla sequenza della ferritina. Il vettore ? denominato pVH-Lolpll.
Gli autori hanno anche a mezzo di amplificazione con PCR usando i seguenti oligonucleotidi originato un vettore comprendente anche la sequenza per i primi 4 e gli ultimi 5 aminoacidi dell?allergene Lol pii, nonch? per il sito di taglio del fattore proteolitico Xa, tra la sequenza della ferritina e quella dell'allergene Lol pii.
5'innesco: 5'-TTCACTCTAGACATTGAAGGTAGAGCTGCT CCGGTTGAGTTTACGGTGGAGAAG-3'
3' innesco: 5?-TGCAAGGTACCTTATTACTCCGGGTTATAA GTTGTGCCGACTTTGAAGTC-3'
Il DNA amplificato con tali inneschi, utilizzando il DNA di pVH-Lol pii, come stampo ? digerito con gli enzimi Xba I e Kpa I ed ? poi clonato nel frammento vettoriale Xba ?-??? I del piasmide pVH. il frammento clonato ha la sequenza mostrata in figura 2B. Il piasmide ? denominato pVH-Loipii Bis.
ESEMPIO 4 Espressione e purificazione della proteina chimerica ricombinante Lo! oli (Ft/Loll)
L'espressione dell'allergene ferritina-Lol pii ? sotto il controllo del promotore di X pj_, ed ? indotta aumentando la temperatura da 30?C a 42?C ed incubando per ulteriori 3 ore come descritto da Levi et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 18086-18092 e da Levi, S. (1989) Biochem. J. 264, 381-388. Il ceppo batterico utilizzato per l'espressione ? E. coli GC76 (ara strr ? lac-oro F'Iac IQ lacZ ? M15 ??? ). La fermentazione del ceppo ricombinante ? attuata in un fermentatore da 7 litri, seguendo condizioni abituali. Le cellule sono raccolte per centrifugazione e si ottengono da 4 litri di cultura circa 20 grammi di pasta cellulare (peso umido).
Si purificano le proteine ricombinanti con un procedimento utilizzato per le ferritine ricombinanti descritto in Levi, S. et al. (1987) Gene 51 , 269-274, Levi et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 18086-18092 e Levi, S. et al. (1989) Biochem. J. 264, 381 -388. Si distrugge la pasta cellulare per sonicazione e si evidenzia la presenza di proteine ricombinanti per elettroforesi su gel della frazione solubile dall'omogenato cellulare. Si analizzano i campioni per elettroforesi in SDS o in condizioni native su gel di poliacriiammide come descritto in Arosio, P., Adelman, T.G., and Drysdale, J.W. (1978) J. Biol. Chem. 253, 4451 -4458.
Si riscalda l'omogenato cellulare solubile a 65?C per 10 minuti, si chiarifica e si tratta con DNAsi e RNAsi. Si precipita poi il campione con solfato di ammonio (520 g/l), si risospende e si dializza contro 20 mM Tris HCI pH 7.4. Si carica poi il campione su una colonna di sefarosio 6B, si frazionano i picchi, si concentrano e si conservano a 4?C con aggiunta di 1 mM EDTA, 0.1 % sodio azide, 1 mM PMSF, 1?? pepstatina A e 10 ?? leupeptina. La proteina ricombinante ha una purit? circa dell'80%, come evidenziabile da elettroforesi. Almeno 4 -5 mg della proteina modificata si ottengono da 1 litro di coltura cellulare.
La fig. 4A mostra che cellule di E. coli trasformate con il plasmide pVH-Lol p II esprimono ad alte rese una proteina di circa 30 Kdal (colonne 4-6), che non ? presente in cellule di E. coli non trasformate (colonne 2-3), e che ? pi? pesante della ferritina selvatica di circa 20 Kdal (colonna 1 ). Elettroforesi su gel in condizioni non denaturanti degli estratti cellulari solubili mostrano, come ? evidente in fig. 4B che i peptidi chimerici si assemblano in una proteina (colonne 4-6), con una mobilit? leggermente minore della ferritina naturale (colonna 1 ). La resa di proteina assemblata e solubile sembra comparabile a quella delia ferritina H selvatica.
La proteina di fusione ? assoggettata a saggi preliminari di termostabilit?, e mostra di essere resistente fino a riscaldamento a 65 ?C, mentre la ferritina selvatica resiste a 80 ?C. Si purifica la proteina chimerica con il procedimento utilizzato per le ferritine ricombinanti, coinvolgendo un trattamento a caldo a 65?C ed una filtrazione su gel di Sefarosio 6B. Le preparazioni cos? ottenute sono considerate sufficientemente pure (pi? dell'80% della proteina ricombinante), per una ulteriore caratterizzazione. Le rese sono di circa 10 mg/L di cultura, dando circa 5 mg/L di proteina purificata.
ESEMPIO 5 Caratterizzazione biochimica e immunoloqica della proteina ricombinante Lol oli (Ft/Loll)
Si attua una gel filtrazione su una colonna FPLC superosio 6 (Pharmacia) in 20 mM Tris HCI pH 7.4, 0.15 M NaCI, calibrata con standards adeguati. La proteina chimerica eluisce con un peso molecolare apparente di circa 700 Kdal ed ? resistente all'incubazione in 0.1 % SOS a temperatura ambiente. Si pu? pertanto concludere che la proteina chimerica si assembla in una proteina a 24 monomeri, analogamente alla ferritina. Una incubazione con enzimi proteolitici induce una riduzione del peso molecolare dei peptidi nella proteina di fusione mentre non influenza la dimensione del peptide selvatico ferritina H. Questo indica che l'estensione C-terminale con la porzione Lol pii ? esposta al solvente.
Le proteine di fusione ricombinanti, separate su gel in condizioni non denaturanti (Fig. 5A) o con SDS {Fig. 5B), vengono trasferite su membrane di nitrocellulosa come descritto in Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4358 e in Burnette, W.N. (1981 ) Anal. Biochem. 112, 195-203. Dopo trasferimento, i siti di legame non specifici sono bloccati con 5% di latte in polvere in tampone TBS (50 mM TRIS-HCI pH 7.5; 0.9% NaCI). Si incubano le membrane di nitrocellulosa per 2 ore a temperatura ambiente con diversi sieri umani gi? saggiati a mezzo di RAST (Radio Adergo Sorbent Test, Pharmacia). Dopo il lavaggio, si incubano le membrane per 2 ore a temperatura ambiente con immunogiobuline di coniglio anti-lgE umane, coniugate con perossidasi (diluizione 1 :250, Sigma). Lo sviluppo del colore si ottiene dopo aggiunta di 4-cloro-1 -naftolo (BioRad), seguendo le istruzioni della casa fornitrice.
Studi immunologie! mostrano che la proteina chimerica ? riconosciuta da anticorpi monoclonali anti ferritina H per doppia diffusione e in esperimenti di trasferimento come mostrato in fig. 5A, colonna 5.
i filtri sono incubati con sieri da pazienti allergici atopici e con sieri di controllo negativi, seguiti da incubazione con anticorpi marcati anti IgE. I risultati mostrano che la ferritina selvatica non ? riconosciuta dalle IgE dei pazienti {fig. 5A e B, colonna 4} e dai soggetti di controllo negativo (fig. 5A e B, colonna 8), mentre la proteina chimerica ? riconosciuta dalle IgE contenute nei sieri di pazienti allergici (fig. 5A e B, colonna 3) ma non dai soggetti di controllo negativo (fig. 3A e B, colonna 7).
Per valutare se la proteina chimerica sia utilizzabile per lo sviluppo di saggi immunologie! pi? semplici ? sviluppato un saggio ELISA.
Piastre da microtitolazione (Greiner) sono saturate per incubazione per 18 ore a 4?C in 50 mM sodio carbonato pH 9.6 con 1 ?g di proteina ricombinante purificata per pozzetto (100 ??). Si lavano le piastre in tampone fosfato salino pH 7.4 (PBS) e con 0.5% Tween 20. Si incubano poi le piastre per 2 ore a 37?C con diluizioni seriali di sieri da pazienti in 2% (atte magro in PBS, 0.5% Tween 20. Si incuba per 2 ore a 37?C con immunoglobuiine anti IgE coniugate con perossidasi diluite 1 :500 in 2% latte magro in PBS pH 7.4, 0.5% Tween 20. Si attua la reazione colorimetrica per aggiunta di O-fenilendiammina (OPD, Sigma) e si misura l'assorbanza a 492 nm utilizzando un lettore ELISA.
La figura 6A mostra che due sieri positivi ai RAST danno risposte dipendenti dalla diluizione, significativamente maggiori dei sieri di controllo normali e di un siero positivo preadsorbito con la proteina Lol pii ricombinante. Il segnale specifico sparisce a diluizioni di 1 su 16 e maggiori, e la diluizione 1 su 4 ? indicativa come quella a cui effettuare un'analisi su alcuni campioni clinici. I saggi hanno una buona riproducibilit?, i risultati dei saggio ELISA su sieri di 26 individui atopici classificati sulla base del saggio RAST e su 9 soggetti di controllo non allergici sono mostrati in fig. 6B. Tutti i sieri di controllo negativi danno risposte sotto 0.2 A, mentre la maggior parte dei sieri allergici produce dei segnali sopra 0.2 A. I valori medi maggiori sono osservati nei pazienti di classe 5 e 6. Utilizzando 0.2 A a 492 nm come limite di normalit?, solo 3 pazienti (12%) risultano negativi con il saggio ELISA.
ESEMPIO 6 Saggio di rilascio di istamina
Si attua un saggio per il rilascio di istamina su sangue intero con un corredo commerciale radioimmunologico (Immunotech International, Francia), seguendo le istruzioni della casa produttrice. Il saggio immunologico si basa sulla competizione tra la istamina modificata nel campione e l'istamina tracciante iodinata per il legame all'anticorpo legato su PB come descritto in More!, A.M., and Deiaage, M.A. (1988) J. Allergy Clin. Immunol. 82, 646-654. Si raccoglie il sangue in tubi eparinizzati e si attuano i saggi entro poche ore dalla raccolta. Le cellule vengono esposte a diverse diluizioni dell'estratto da polline di L. perenne e con l'allergene ricombinante purificato o come controllo con la ferritina H ricombinante selvatica. Dopo incubazione, si determina la quantit? di istamina rilasciata.
I risultati dei saggi di rilascio di istamina da basofili di un soggetto allergico sono mostrati in fig. 7. La proteina Lol pii ricombinante induce una significativa risposta allergica paragonata a quella indotta dall'estratto di polline, mentre la proteina ricombinante ferritina selvatica non produce alcun rilascio evidenziabile di istamina. Un paragone tra le potenze dei due campioni allergenici ? difficile, a causa della composizione eterogenea del campione naturale che contiene almeno un altro allergene maggiore (Lol pi). Inoltre, solo 1 /3 della proteina FT-Lol pii ricombinante ? rappresentato dalia proteina Lol pii.
ESEMPIO 7 Reazione allergica da puntura cutanea
L'attivit? biologica della proteina ricombinante ? anche analizzata su reazione allergica alla cute su volontari non allergici e sani, come mostrato in tabella 1 .
Tabella 1
Reazione allergica a
Paziente NaCI Istamina Estratto rFerritina Ft-Lolpll 10 mg/ml Crudo
A.S. 0 64 0/0/0 0/0/0 0/0/0 E.T. 0 81 144/25/16 0/0/0 49/9/0 a La superficie della reazione ? indicata in mm^. Sono riportati i risultati con concentrazioni di proteine di 1 600, 16 e 1.6 Mg/ml.
Il soggetto sano non reagisce con nessuna delle preparazioni proteiche, mentre il soggetto allergico d? dei risultati positivi con l'estratto di polline ad una concentrazione fino a 1.6 Mg/ml e con l'allergene ricombinante ad una concentrazione di 16 M9/ml. La ferritina H ricombinante come controllo non induce alcuna risposta allergica.
Esempio 8 Proteina chimerica Ferritina- Lol D I
Il gene (cDNA) codificante per ? allergene di L. perenne Lol p I ? clonato seguendo le stesse procedure sperimentali utilizzate per il clonaggio dell'allergene Lol pii. in particolare, gii inneschi oiigonucieotidici utilizzati per la reazione di amplificazione (PCR) dall' RNA estratto dal polline, sono, sulla base delle sequenze descritte in Perez M. et al. 1990 Journ. of Biol. Chem. 265, 16210-16215; Griffith I.J. et al. 1991 FEBS 279, 210-215; Singh M.B. et al. 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 1384-1388:
innesco senso pl/S , 25-mer
5'- ATGCACTGCAGAGTACGGGGACAAA -3'
Pst I
innesco anti-senso pl/A, 24-mer
5'- CGTAGGATCCGTGTCGGCTTTCCA -3'
Barn HI
La sequenza dei frammento amplificato, ottenuta dopo clonaggio in un vettore di sequenza, ? differente alle sequenze gi? note nelle posizioni indicate nella seguente Tabella 2.
Tabella 2
Posizione Isoforma isolata Isoforme descr?tte
45 Asp Asn (JBC, clone 5A)
144 Gly Asp (FEBS)
154 Gly Ala (JBC,cione 5A)
187 Ile Thr (JBC, clone 5A)
209 Ser Phe (FEBS e JBC, 5A e IA) 223 Val Phe (JBC, 5A)
Il clone ? poi riamplificato per il clonaggio nel vettore pVH per la fusione con la ferritina H. Gli inneschi utilizzati sono:
innesco senso Lpi, 31 mer
5?- ACCCGGTCTAGAAACTGCAGAGTACGGGGAC- 3?
Xba I
innesco anti-senso Lpl, 30 mer
5?- GCATGCGGTACCCGTGTCGGCTTTCCAGCC- 3?
Kpn I
il gene ottenuto codifica per una proteina monomerica di 405 aminoacidi, di cui i primi 1 76 appartengono alla ferritina H umana, gli aminoacidi 177-401 codificano per i' allergene Lol pi (corrispondenti agli aminoacidi 11 -235 delie sequenze pubblicate), e gli ultimi 4 residui corrispondono a due aminoacidi derivati dai clonaggio e a due residui della ferritina, prima dei codone di terminazione della traduzione.
La proteina chimerica ? espressa e purificata con le procedure applicate alla proteina ferritina-Lol p II. Le rese di espressione e di proteina purificata sono analoghe a quelle della ferritina non modificata. In figura 8 sono presentati i risultati dell' espressione in E. coli.
Analisi biochimiche indicano che la proteina chimerica ? riconosciuta da anticorpi per la ferritina, ? stabile e forma un multimero di 24 subunit?, analogamente alia ferritina naturale. Esempio 9 Proteina chimerica Ferritina- hEGF
Il frammento di DNA codificante per la sequenza dell' Epidermal Growth Factor umano (hEGF o urogastrone) (Gregory H. 1975 Nature , 257, 325-327; Scott J. et al. 1983 Science 221 , 236-240; Heath W.F. and Merrifield R.B., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 6367-6371 ;Smith J. et al.
1 982 Nucl. Acid Res. 10, 4467) ? prodotto per sintesi chimica ed ha la sequenza indicata in figura 9. Esso contiene siti di restrizione per gli enzimi Xbal e Kpnl per il clonaggio in opportuni vettori, ed un codone di terminazione di traduzione.
Si costruisce il plasmide per la superespressione della proteina chimerica ferritina- hEGF inserendo tale sequenza codificante nel vettore pVH. Il gene ottenuto codifica per una proteina monomerica di 236 aminoacidi: i primi 176 appartengono alla ferritina H, gli aminoacidi 177-182 fungono da collegamento e gii aminoacidi 183-236 codificano per la forma matura dell' EGF umano. E' possibile ottenere la forma matura del hEGF mediante trattamento della proteina con fattore Xa bovino, una protessi specifica per la sequenza aminoacidica IEGR, posta a valle della sequenza della ferritina. Tale proteina chimerica ? espressa e purificata con le procedure applicate alia proteina ferritina-Lol p II. Le rese di espressione e di proteina purificata sono analoghe a quelle della ferritina non modificata. Analisi biochimiche indicano che la proteina chimerica ? riconosciuta da anticorpi per la ferritina, come mostrato nella figura 10, ed ? stabile e forma un multimero di 24 subunit?, analogamente alla ferritina naturale. La proteina chimerica prodotta ? anche riconosciuta da anticorpi commerciali specifici anti-EGF.
Claims (15)
- RIVENDICAZIONI 1 . Proteine ricombinanti caratterizzate dal fatto di comprendere una prima sequenza aminoacidica, compresa nella sequenza delia ferritina, covalentemente legata a mezzo di legame peptidico ad una seconda sequenza aminoacidica, e di essere producibili ed estraibili ad alte rese da cellule ospiti, mantenendo almeno una propriet? fisiologica o antigenica di detta seconda sequenza aminoacidica, dette cellule trasformate con un vettore codificante per detta prima e detta seconda sequenza aminoacidica sotto il controllo di un promotore di trascrizione.
- 2. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 1 caratterizzate dal fatto che detta prima sequenza aminoacidica comprende la sequenza dall'aminoacido 13 all'aminoacido 158 della catena H della ferritina umana.
- 3. Proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzate dal fatto che detta prima sequenza aminoacidica pu? essere separata da detta seconda sequenza aminoacidica a mezzo di digestione proteolitica specifica.
- 4. Proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti caratterizzate dal fatto che detta seconda sequenza aminoacidica comprende una sequenza immunogena.
- 5. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 4 caratterizzate dal fatto che detta sequenza immunogena ? una sequenza allergenica.
- 6. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 5 caratterizzate dal fatto che detta sequenza allergenica ? una sequenza allergenica di un allergene di L. perenne.
- 7. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 6 caratterizzate dal fatto che detta sequenza allergenica ? una sequenza allergenica dell'allergene Loi pii di L perenne.
- 8. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 7 caratterizzate dal fatto che detta sequenza ? la sequenza mostrata nella Figura 2 o porzioni di essa ad attivit? allergenica.
- 9. Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 6 caratterizzate dal fatto che detta sequenza allergenica comprende una sequenza allergenica dell'allergene Lol pi di L. perenne, o porzioni di essa ad attivit? allergenica.
- 10. Proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 caratterizzate dal fatto che detta seconda sequenza aminoacidica comprende una sequenza codificante per un fattore di crescita.
- 1 1 . Proteine chimeriche ricombinanti secondo la rivendicazione 10 caratterizzate dal fatto che detta sequenza codificante per un fattore di crescita ? la sequenza codificante per il fattore di crescita epidermale o EGF, preferibilmente l?EGF di origine umana.
- 12. Vettore per l'espressione delle proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
- 13. Uso delle proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 1 1 per la preparazione di composizioni farmacologiche.
- 14. Uso delle proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 1 1 per la preparazione di composizioni immunogene.
- 15. Uso delle proteine chimeriche ricombinanti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 1 1 per la preparazione di corredi diagnostici per la evidenziazione di anticorpi specifici per detta seconda sequenza aminoacidica da un campione.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM930343A IT1261676B (it) | 1993-05-24 | 1993-05-24 | Proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITRM930343A IT1261676B (it) | 1993-05-24 | 1993-05-24 | Proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM930343A0 ITRM930343A0 (it) | 1993-05-24 |
| ITRM930343A1 true ITRM930343A1 (it) | 1994-11-24 |
| IT1261676B IT1261676B (it) | 1996-05-29 |
Family
ID=11401779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ITRM930343A IT1261676B (it) | 1993-05-24 | 1993-05-24 | Proteine ricombinanti, vettori per l'espressione e loro usi. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1261676B (it) |
-
1993
- 1993-05-24 IT ITRM930343A patent/IT1261676B/it active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1261676B (it) | 1996-05-29 |
| ITRM930343A0 (it) | 1993-05-24 |
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