ITRM20120224A1

ITRM20120224A1 - USE OF STATINES IN THE PREVENTION OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS IN PROGENIA AT RISK OF DEVELOPING THE DISEASE.

Info

Publication number: ITRM20120224A1
Application number: IT000224A
Authority: IT
Inventors: Mauro Congia; Francesco Cucca; Sandro Muntoni
Original assignee: Mauro Congia; Francesco Cucca; Sandro Muntoni
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2012-05-18
Publication date: 2013-11-19

Description

Uso di statine nella prevenzione del diabete mellito di tipo 1 nella progenie a rischio di sviluppare la malattia Use of statins in the prevention of type 1 diabetes mellitus in offspring at risk of developing the disease

La presente invenzione concerne l'uso di statine per la prevenzione del diabete mellito di tipo 1 (T1D) nella progenie a rischio di sviluppare tale malattia. In particolare, l'effetto preventivo viene ottenuto somministrando dette statine alla madre della progenie durante il periodo compreso tra il concepimento e la fine dell'allattamento. The present invention relates to the use of statins for the prevention of type 1 diabetes mellitus (T1D) in offspring at risk of developing this disease. In particular, the preventive effect is obtained by administering said statins to the mother of the progeny during the period between conception and the end of breastfeeding.

Il T1D è una malattia autoimmune cellulo-mediata. La malattia è caratterizzata da un infiltrato linfomonocellulare a carico delle isole di Langerhans che producono l'insulina [1]. Questo infiltrato determina una "insulite". La patogenesi autoimmune è inoltre suggerita dalla presenza nel siero di questi pazienti di auto anticorpi indirizzati verso antigeni pancreatici [2]. Gli anticorpi anti-insula pancreatica (ICA) rilevati con 1'immunofluorescenza sono stati i primi autoanticorpi ad essere scoperti e sono diretti contro vari antigeni beta cellulari. Gli ICA sono i marcatori anticorpali più sensibili del rischio futuro di sviluppare T1D. T1D is a cell-mediated autoimmune disease. The disease is characterized by a lymphomonocellular infiltrate affecting the islets of Langerhans that produce insulin [1]. This infiltrate determines an "insulite". The autoimmune pathogenesis is also suggested by the presence in the serum of these patients of auto antibodies addressed to pancreatic antigens [2]. Antibodies to pancreatic islet (ICA) detected by immunofluorescence were the first autoantibodies to be discovered and are directed against various beta cellular antigens. HAIs are the most sensitive antibody markers of the future risk of developing T1D.

Autoanticorpi contro l'acido glutamico decarbossilasi (GAD), IA-2 e ΙΑ-2β (phogrin), costituiscono la maggior parte della fluorescenza rilevata con gli ICA. La GAD è 1'autoantigene betacellulare meglio caratterizzato; gli autoanticorpi sono diretti contro 1'isoforma di 64 kDa dell'enzima trovato nelle beta-cellule e nel cervelletto. Il ruolo della GAD nell'insula non è stato ancora chiarito. Gli autoanticorpi contro IA-2 e ΙΑ-2β sono diretti contro una proteina transmembrana tirosina fosfatasi presente nella beta-cellula. La funzione di queste proteine non è nota, ma è stato suggerito un loro possibile ruolo come messaggeri intracellulari. Gli anticorpi antiinsulina sono diretti contro l'ormone insulina e sono indistinguibili dagli anticorpi prodotti dai pazienti in terapia insulinica somministrata per via esogena. La prevalenza degli anticorpi anti-insulina diminuisce rapidamente con l'incremento dell'età di esordio del diabete e così la loro presenza è considerata come il più fedele predittore del diabete con esordio precoce [3]. Autoantibodies against glutamic acid decarboxylase (GAD), IA-2 and ΙΑ-2β (phogrin), make up the majority of the fluorescence detected with ICAs. GAD is the best characterized beta-cell autoantigen; the autoantibodies are directed against the 64 kDa isoform of the enzyme found in beta-cells and cerebellum. The role of GAD in the insula has not yet been clarified. Autoantibodies against IA-2 and ΙΑ-2β are directed against a transmembrane protein tyrosine phosphatase present in the beta-cell. The function of these proteins is unknown, but their possible role as intracellular messengers has been suggested. Insulin antibodies are directed against the hormone insulin and are indistinguishable from antibodies produced by patients on exogenously administered insulin therapy. The prevalence of insulin antibodies decreases rapidly with increasing age of onset of diabetes and thus their presence is considered to be the most faithful predictor of early onset diabetes [3].

La riduzione nella prevalenza degli anticorpi anti-insulina e IA-2 con l'età di esordio del diabete rende i GAD e gli ICA i marcatori più utili delle forme più tardive di diabete autoimmune. The reduction in the prevalence of insulin and IA-2 antibodies with the age of onset of diabetes makes GADs and ICAs the most useful markers of later forms of autoimmune diabetes.

L'utilizzo combinato dei vari anticorpi massimalizza la sensibilità e la specificità nella predizione del T1D [3]. The combined use of the various antibodies maximizes the sensitivity and specificity in the prediction of T1D [3].

Nei parenti di I grado di pazienti con T1D gli autoanticorpi non sono presenti alla nascita ma spesso appaiono entro il primo anno di vita [4]. La maggior parte degli individui che sviluppano il diabete di tipo 1 hanno anticorpi multipli (3 autoanticorpi nel 33-60% dei casi) e solo il 5% non possiede autoanticorpi. I parenti con 3 o più autoanticorpi hanno un rischio di sviluppare il T1D del 70-100% in un periodo di 5-8 anni In Grade I relatives of T1D patients, autoantibodies are not present at birth but often appear within the first year of life [4]. Most individuals who develop type 1 diabetes have multiple antibodies (3 autoantibodies in 33-60% of cases) and only 5% do not have autoantibodies. Relatives with 3 or more autoantibodies have a 70-100% risk of developing T1D over a 5-8 year period

[4]. Così l'autoimmunità si genera molto precocemente nell'individuo seguita da un periodo dinamico nella prima infanzia nel quale le combinazioni degli autoanticorpi si stabilizzano. Dopo tale periodo comunque il profilo autoanticorpale tende a rimanere stabile. Le attuali evidenze suggeriscono che i parenti che non hanno sviluppato autoanticorpi entro i 5-10 anni di età difficilmente manifesteranno la malattia [5]. [4]. Thus autoimmunity is generated very early in the individual followed by a dynamic period in early childhood in which the combinations of autoantibodies stabilize. After this period, however, the autoantibody profile tends to remain stable. Current evidence suggests that relatives who have not developed autoantibodies by 5-10 years of age are unlikely to manifest the disease [5].

Comunque non sembra che tali autoanticorpi siano coinvolti nella distruzione delle beta-cellule [6]. Infatti, è generalmente accettato che questa distruzione sia dovuta ad un infiltrato mediato da cellule controllate dai linfociti T. Tale ipotesi è coerente con le caratteristiche istologiche viste nelle isole beta-pancreatiche nei bambini diabetici all'esordio. L'infiltrato è infatti caratterizzato da linfomonociti in cui predominano i T citotossici CD8+, CD4+, macrofagi; si rinvengono inoltre immunocomplessi, depositi di complemento, e una iperespressione di molecole HLA di classe I nelle beta-cellule. L'interazione tra l'immunità umorale e cellulo-mediata nel processo autoimmune resta in parte da chiarire. However, such autoantibodies do not appear to be involved in beta-cell destruction [6]. Indeed, it is generally accepted that this destruction is due to an infiltrate mediated by cells controlled by T lymphocytes. This hypothesis is consistent with the histological features seen in beta-pancreatic islets in diabetic children at onset. The infiltrate is in fact characterized by lymphomonocytes in which the cytotoxic T CD8 +, CD4 +, macrophages predominate; there are also immune complexes, complement deposits, and an overexpression of HLA class I molecules in beta-cells. The interaction between humoral and cell-mediated immunity in the autoimmune process remains partly to be elucidated.

Il T1D è tipicamente una malattia da interazione gene-ambiente, con fattori genetici che interagiscono con fattori ambientali [2]. Per quanto riguarda la genetica, gli aplotipi di alto rischio sono l'HLA DR3/DR4, mentre l'HLA-DR2 normalmente conferisce una protezione dominante [2]. Non sono ancora completamente noti i fattori ambientali che favoriscono lo sviluppo della malattia in chi è geneticamente predisposto; probabilmente giocano un ruolo importante alcune infezioni virali e la dieta nei primi anni di vita [7]. Il fatto che la concordanza tra gemelli identici non sia del 100% ma di circa il 50% indica la presenza di fattori ambientali (fattori dietetici, infettivi etc.) [2]. T1D is typically a gene-environment interaction disease, with genetic factors interacting with environmental factors [2]. As for genetics, the high-risk haplotypes are HLA DR3 / DR4, while HLA-DR2 normally confers dominant protection [2]. The environmental factors that favor the development of the disease in those who are genetically predisposed are not yet fully known; some viral infections and diet in the first years of life probably play an important role [7]. The fact that the concordance between identical twins is not 100% but about 50% indicates the presence of environmental factors (dietary, infectious factors, etc.) [2].

A tutt'oggi l'unica terapia indiscussa ed efficace nel T1D è la terapia ormonale sostitutiva praticata con l'iniezione sottocute d'insulina ricombinante; l'individuo insulino-dipendente dovrà pertanto seguire uno schema terapeutico che normalmente prevede la somministrazione sottocute d'insulina rapida tre volte al giorno (colazione-pranzo-cena) più la somministrazione notturna di insulina lenta. Nonostante numerosi studi abbiano cercato con differenti approcci (dalla induzione di una tolleranza orale verso gli antigeni pancreatici, alla immunosoppressione, all'utilizzo di anticorpi monoclonali anti-CD3, etc.) di arrestare il processo della distruzione autoimmune delle beta-cellule, a tutt'oggi non c'è alternativa alla terapia sostitutiva che andrà protratta per il resto della vita del paziente diabetico [8]. To date, the only undisputed and effective therapy in T1D is hormone replacement therapy practiced with subcutaneous injection of recombinant insulin; the insulin-dependent individual must therefore follow a therapeutic scheme that normally involves subcutaneous administration of rapid insulin three times a day (breakfast-lunch-dinner) plus nighttime administration of slow insulin. Although numerous studies have tried with different approaches (from the induction of oral tolerance towards pancreatic antigens, to immunosuppression, to the use of anti-CD3 monoclonal antibodies, etc.) to stop the process of autoimmune destruction of beta-cells, to all 'today there is no alternative to replacement therapy which will continue for the rest of the diabetic patient's life [8].

È pertanto evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi metodi per la prevenzione del diabete di tipo 1. There is therefore a clear need for new methods for the prevention of type 1 diabetes.

Le statine sono inibitori dell'enzima 3-idrossi-3-metilglutaril coenzima A reduttasi (HMGCoA), farmaci correntemente utilizzati per il trattamento delle ipercolesterolemie e delle malattie cardiovascolari Statins are inhibitors of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCoA), drugs currently used for the treatment of hypercholesterolemia and cardiovascular diseases

[9]. Gli effetti benefici delle statine, tuttavia, non sono ascrivibili solamente alle loro capacità di ridurre la morbilità e la mortalità cardiovascolare. E' stato, infatti, dimostrato che le statine possiedono proprietà anti-infiammatorie [10, il] e potenziali capacità terapeutiche per il trattamento di alcune malattie autoimmuni [12, 13, 14, 15, 16]. L'atorvastatina è stata usata con successo in due differenti modelli murini di autoimmunità: il primo modello riguarda 1'encefalomielite autoimmune sperimentale [17] ed un modello di artrite collagenoindotta [18]. Viceversa, studi sugli effetti della atorvastatina in diversi modelli animali di T1D hanno mostrato che questa statina non è in grado di diminuire o posticipare l'esordio del diabete mellito tipo 1 (T1D) [19, 20]. Comunque, in entrambi gli studi, il trattamento con 1'atorvastatina venne instaurato dopo 4-5 settimane di vita mentre è noto che 1'insulite inizia ad apparire a 3-4 settimane e che è ben presente alla 6-8 settimana di vita. Nel topo Non Obese Diabetic (NOD), il primo evento è associato con l'inizio dell'insulite ed è attivo prima delle 3 settimane di vita, mentre il secondo evento esercita la sua attività alla 8-12° settimana di vita controllando il passaggio dalla insulite non distruttiva a quella distruttiva e il successivo sviluppo della malattia conclamata [21, 22]. [9]. The beneficial effects of statins, however, are not solely attributable to their ability to reduce cardiovascular morbidity and mortality. In fact, statins have been shown to possess anti-inflammatory properties [10, il] and potential therapeutic capacities for the treatment of some autoimmune diseases [12, 13, 14, 15, 16]. Atorvastatin has been used successfully in two different mouse models of autoimmunity: the first model concerns experimental autoimmune encephalomyelitis [17] and a collagen-induced arthritis model [18]. Conversely, studies on the effects of atorvastatin in various animal models of T1D have shown that this statin is unable to decrease or delay the onset of type 1 diabetes mellitus (T1D) [19, 20]. However, in both studies, atorvastatin treatment was started after 4-5 weeks of life while insulitis is known to begin to appear at 3-4 weeks and is well present at 6-8 weeks of life. In the Non Obese Diabetic (NOD) mouse, the first event is associated with the onset of insulitis and is active before 3 weeks of life, while the second event exerts its activity at 8-12 weeks of life controlling the passage from non-destructive to destructive insulitis and the subsequent development of the overt disease [21, 22].

Tra gli eventi precoci nel diabete T1D umano si riscontra la comparsa di autoanticorpi tipicamente durante i primi due anni di vita [23]. Nonostante allo stato attuale non sia possibile trarre chiare conclusioni [24], gli eventi che si verificano nel periodo della gravidanza sembrano essere associati ad un incremento [25, 26, 27, 28, 29] o a una riduzione del rischio [30] di T1D. Early events in human T1D diabetes include the appearance of autoantibodies typically during the first two years of life [23]. Although it is not currently possible to draw clear conclusions [24], events occurring during pregnancy appear to be associated with an increase [25, 26, 27, 28, 29] or a reduction in the risk [30] of T1D. .

Gli inventori della presente invenzione hanno ora trovato che la somministrazione di statine nelle madri di progenie a rischio di sviluppare la malattia è in grado di prevenire l'insorgenza del T1D in detta progenie. In particolare, gli inventori hanno testato le statine più utilizzate nell'uomo, ossia atorvastatina, lovastatina, fluvastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, inclusa la più recente statina la pitavastatina, nel topo NOD durante la gravidanza ed il periodo neonatale. Dai dati ottenuti da questo studio si evince che è possibile modificare la storia naturale del T1D nel topo NOD utilizzando le statine. In questo modello sperimentale si dimostra che il periodo perinatale ha un'importanza cruciale. Infatti, la somministrazione di qualunque tipo di statina alle madri, soprattutto per tutto il periodo compreso tra il concepimento e l'allattamento, ha causato una riduzione significativa della prevalenza del T1D nella progenie. Il meccanismo d'azione più probabile sembra essere di tipo immunologico con un aumento delle cellule T regolatorie (Treg) e una ridotta funzione delle cellule T effettrici (Teff) misurabili anche a distanza di diverse settimane dalla conclusione dell'utilizzo del farmaco. Il periodo di somministrazione delle statine sembra essere il fattore più importante; infatti, le stesse molecole somministrate dalla 4° settimana di vita sono totalmente inefficaci nel prevenire il T1D a dispetto della presenza comunque di effetti immunologici misurabili [19]. Una simile osservazione può essere fatta anche per quanto riguarda il T1D nell'uomo; infatti nello studio DIATOR, l'utilizzo dell'atorvastatina non preservava la funzione beta cellulare in pazienti con nuova diagnosi di T1D [31]. La presente invenzione apre, pertanto, nuovi scenari di prevenzione del T1D nell'uomo utilizzando protocolli di somministrazione simili a quelli dell'animale. The inventors of the present invention have now found that the administration of statins in mothers of progeny at risk of developing the disease is able to prevent the onset of T1D in said progeny. In particular, the inventors tested the most widely used statins in humans, namely atorvastatin, lovastatin, fluvastatin, pravastatin, rosuvastatin, simvastatin, including the most recent statin pitavastatin, in NOD mice during pregnancy and the neonatal period. The data obtained from this study suggests that it is possible to modify the natural history of T1D in the NOD mouse using statins. In this experimental model it is shown that the perinatal period is of crucial importance. In fact, the administration of any type of statin to mothers, especially for the entire period between conception and breastfeeding, caused a significant reduction in the prevalence of T1D in offspring. The most probable mechanism of action seems to be of an immunological type with an increase in regulatory T cells (Treg) and a reduced function of effector T cells (Teff) which can be measured even several weeks after the end of the use of the drug. The period of administration of statins appears to be the most important factor; in fact, the same molecules administered from the 4th week of life are totally ineffective in preventing T1D despite the presence of measurable immunological effects [19]. A similar observation can also be made with regard to T1D in humans; in fact in the DIATOR study, the use of atorvastatin did not preserve beta cell function in patients with newly diagnosed T1D [31]. The present invention therefore opens up new scenarios for the prevention of T1D in humans using administration protocols similar to those of animals.

Formano, pertanto, oggetto specifico della presente invenzione una o più statine per l'uso nella prevenzione della malattia del diabete di tipo 1 nella progenie a rischio di sviluppare detta malattia, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie nel periodo compreso dal concepimento alla fine dell'allattamento. Therefore, the specific object of the present invention is one or more statins for use in the prevention of type 1 diabetes disease in progeny at risk of developing said disease, in which said one or more statins are administered to the mother of said progeny in the period from conception to the end of breastfeeding.

In particolare, dette una o più statine possono essere somministrate alla madre di detta progenie durante: In particular, said one or more statins can be administered to the mother of said progeny during:

a) tutto il periodo compreso dal concepimento alla fine dell'allattamento; b) tutto il periodo compreso dal concepimento sino alla nascita; c) tutto il periodo compreso dalla nascita sino alla fine dell'allattamento . a) the entire period from conception to the end of breastfeeding; b) the entire period from conception to birth; c) the entire period from birth to the end of breastfeeding.

Le statine che possono essere impiegate secondo la presente invenzione sono le seguenti: atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, pitavastatina. Dette una o più statine possono essere somministrate per via orale nell'animale in dose che varia da 0.1 mg/Kg/die a 10 mg/Kg/die per i periodi temporali sopra descritti. La modalità di somministrazione utilizzata nella sperimentazione è per via orale alla dose di 1 mg/Kg/die. The statins which can be used according to the present invention are the following: atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin, simvastatin, pitavastatin. Said one or more statins can be administered orally to the animal in a dose ranging from 0.1 mg / kg / day to 10 mg / kg / day for the time periods described above. The method of administration used in the experimentation is orally at a dose of 1 mg / kg / day.

Le suddette dosi sperimentate nell'animale se impiegate nell'uomo variano da 4 a 70 mg/die in rapporto alla statina utilizzata e al peso corporeo della madre. L'intervallo di dose preferito per una madre di circa 60 Kg nel caso si utilizzassero atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, simvastatina corrisponde a 30-40 mg/die. Mentre per la rosuvastatina e la pitavastatina i dosaggi da utilizzare nella madre variano da 5 a 10 mg/die e da 1 a 4 mg/die rispettivamente. Si sottolinea che tale dose corrisponde a quella normalmente utilizzata nella pratica clinica per la terapia delle iperlipidemie. The above doses tested in animals when used in humans vary from 4 to 70 mg / day in relation to the statin used and the body weight of the mother. The preferred dose range for a mother of about 60 kg when using atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, simvastatin is 30-40 mg / day. While for rosuvastatin and pitavastatin the dosages to be used in the mother vary from 5 to 10 mg / day and from 1 to 4 mg / day respectively. It is emphasized that this dose corresponds to that normally used in clinical practice for the therapy of hyperlipidemias.

In particolare, dette una o più statine possono essere somministrate alla madre durante il periodo compreso dal concepimento alla fine dell'allattamento e, in particolare, durante: In particular, these one or more statins can be administered to the mother during the period from conception to the end of breastfeeding and, in particular, during:

La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui: Figura 1 mostra la frequenza del T1D in 161 topi NOD nati da madri di controllo, in 76 topi NOD del gruppo A, in 19 del gruppo B ed in 23 del gruppo C. Figura 2 mostra il peso degli animali comprendenti 161 topi NOD nati da madri di controllo, 76 NOD del gruppo A, 19 del B e 23 del C. The present invention will now be described by way of illustration, but not of limitation, according to its preferred embodiments, with particular reference to the figures of the attached drawings, in which: Figure 1 shows the frequency of T1D in 161 NOD mice born from control mothers, in 76 NOD mice from group A, 19 from group B and 23 from group C. Figure 2 shows the weight of animals including 161 NOD mice born from control mothers, 76 NODs from group A, 19 from B and 23 from C .

Figura 3 mostra le cellule T regolatorie spleniche CD4+/CD25+/FOXP3+ analizzate a 2, 3 e 4 settimane in animali del gruppo A e nei controlli. Figure 3 shows CD4 + / CD25 + / FOXP3 + splenic regulatory T cells analyzed at 2, 3 and 4 weeks in group A animals and controls.

Figura 4 mostra l'incidenza del diabete di Tipo 1 in 3 gruppi di topi composti ciascuno da 6 animali dopo trasferimento di cellule T spleniche diabetogeniche (T1D+), di un mix di cellule diabetogeniche e derivate da animali trattati con atorvastatina (T1D+ and ATV+), e T cellule derivate unicamente da animali trattati con atorvastatina (ATV+). Figure 4 shows the incidence of Type 1 diabetes in 3 groups of mice each consisting of 6 animals after transfer of diabetic splenic T cells (T1D +), a mix of diabetic and atorvastatin-treated animal derived cells (T1D + and ATV +) , and T cells derived solely from animals treated with atorvastatin (ATV +).

Figura 5 mostra il trasferimento adottivo di cellule T diabetogeniche e regolatorie in 7 differenti categorie di riceventi Figure 5 shows the adoptive transfer of diabetic and regulatory T cells in 7 different recipient categories

ESEMPIO 1: Studio sugli effetti delle statine nella progenie di topi NOD EXAMPLE 1: Study on the effects of statins in the progeny of NOD mice

Materiali e Metodi Materials and methods

Topi Mice

I topi NOD sono stati acquistati dalla Charles-River (Charles River Italia S.p.A. Italy), riprodotti ed allevati presso lo stabulario di Monserrato, Università degli Studi di Cagliari, Italia. The NOD mice were purchased from Charles-River (Charles River Italia S.p.A. Italy), reproduced and reared at the Monserrato animal enclosure, University of Cagliari, Italy.

Dal momento che l'incidenza del T1D nella femmina NOD può variare in diversi stabulari a causa di differenti condizioni ambientali [32], per prima cosa abbiamo stabilito l'incidenza della malattia nella nostra colonia. Le differenti statine sono state da noi acquistate presso una farmacia locale, disciolte in PBS (Phosphate Buffered Saline, euro clone, Pero, Italia) IX alla concentrazione di 0.125 mg/dl e somministrate giornalmente per gavage in un volume di 200 μΐ per topo corrispondenti a 1 mg/Kg. Tutte le differenti statine sono state testate nel topo NOD al fine di valutarne il potenziale effetto nel ridurre l'incidenza del T1D: atorvastatina (Torvast 40, PFIZER ITALIANA S.p.A. Borgo San Michele; Latina); fluvastatina (Lescol 40, Novartis Farma Spa, Origgio, Varese); lovastatina (Rextat 40, Recordati Spa, Milano) pravastatina (Pravaselect, Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite, Firenze; rosuvastatina (Crestor 40, AstraZeneca Spa, Basiglio, Milano) e simvastatina (Sinvacor 40, Msd Italia, Spa, Roma); pitavastatina, (Livaio 4 mg, Kowa Pharmaceutical America, Ine. and Lilly USA). Since the incidence of T1D in female NOD can vary in different enclosures due to different environmental conditions [32], we first established the incidence of the disease in our colony. The different statins were purchased by us at a local pharmacy, dissolved in PBS (Phosphate Buffered Saline, euro clone, Pero, Italy) IX at a concentration of 0.125 mg / dl and administered daily by gavage in a volume of 200 μΐ per mouse. at 1 mg / Kg. All the different statins were tested in NOD mice in order to evaluate their potential effect in reducing the incidence of T1D: atorvastatin (Torvast 40, PFIZER ITALIANA S.p.A. Borgo San Michele; Latina); fluvastatin (Lescol 40, Novartis Farma Spa, Origgio, Varese); lovastatina (Rextat 40, Recordati Spa, Milan) pravastatina (Pravaselect, Menarini Industrie Farmaceutiche Riunite, Florence; rosuvastatina (Crestor 40, AstraZeneca Spa, Basiglio, Milan) and simvastatina (Sinvacor 40, Msd Italia, Spa, Rome); pitavastatina, ( Livaio 4 mg, Kowa Pharmaceutical America, Ine. And Lilly USA).

La atorvastatina (ATV), che abbiamo considerato come il prototipo, è stata testata a differenti dosaggi di 0.1 mg/Kg e 10 mg/Kg, senza però registrare alcuna variazione nell'incidenza della malattia rispetto a 1 mg/Kg; pertanto, tutti i nostri esperimenti sono stati effettuati usando la atorvastatina al dosaggio di 1 mg/kg. Atorvastatin (ATV), which we considered as the prototype, was tested at different dosages of 0.1 mg / kg and 10 mg / kg, without however recording any variation in the incidence of the disease compared to 1 mg / kg; therefore, all of our experiments were performed using atorvastatin at a dosage of 1 mg / kg.

I topi NOD sono stati alimentati con una dieta base standard (Mucedola, Settimo Milanese, Italy). Le femmine NOD sono state trattate con ATV o PBS secondo il seguente protocollo: i) dal primo giorno di accoppiamento fino a fine allattamento (gruppo A) con 1 mg/kg di ATV o con 200 μl di PBS; ii) dal primo giorno di accoppiamento fino al parto (gruppo B); iii) dal parto fino alla fine dell'allattamento (gruppo C). Tutte le femmine nate sono state monitorate per il peso e per lo sviluppo di diabete settimanalmente fino alla 30° settimana di vita; dopo questo periodo l'esperimento è stato considerato concluso e gli animali sopravissuti sono stati sacrificati. Vista la modalità di somministrazione delle statine la progenie è stata esaminata anche per monitorare eventuali effetti teratogeni delle statine. NOD mice were fed a standard basic diet (Mucedola, Settimo Milanese, Italy). NOD females were treated with ATV or PBS according to the following protocol: i) from the first day of mating until the end of lactation (group A) with 1 mg / kg of ATV or with 200 μl of PBS; ii) from the first day of mating until delivery (group B); iii) from childbirth to the end of breastfeeding (group C). All the females born were monitored for weight and diabetes development weekly until the 30th week of life; after this period the experiment was considered concluded and the surviving animals were sacrificed. Given the method of administration of the statins, the progeny was also examined to monitor any teratogenic effects of the statins.

Valutazione del diabete Assessment of diabetes

I topi NOD sono stati esaminati settimanalmente per la glicosuria con Clinistix (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germany) a partire dalla ottava settimana di vita; la glicemia è stata misurata in tutti gli animali positivi per glicosuria e la diagnosi di diabete è stata fatta con glicemie superiori a 11.1 mmol/1 in due test consecutivi (Ortho-Clinical Diagnostic, VITROS® 5,1 FS Chemistry System; Johnson & Johnson; Italy). NOD mice were examined weekly for glycosuria with Clinistix (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germany) starting at the eighth week of life; blood glucose was measured in all animals positive for glycosuria and the diagnosis of diabetes was made with blood sugar levels above 11.1 mmol / 1 in two consecutive tests (Ortho-Clinical Diagnostic, VITROS® 5,1 FS Chemistry System; Johnson &Johnson; Italy).

Analisi al citofluorimetro delle cellule dei linfonodi periferici, timo e milza Cytofluorimeter analysis of the cells of the peripheral lymph nodes, thymus and spleen

L'analisi al citofluorimetro è stata effettuata esclusivamente sul gruppo A e confrontata coi controlli perché il trattamento con ATV durante la gravidanza e l'allattamento ha conferito la protezione più alta verso la malattia. Le cellule timiche, spleniche e linfonodali sono state marcate usando i seguenti anticorpi monoclonali (mAbs): PerCP-Conjugated Hamster Anti-Mouse CD3e, R-PE-conjugated rat anti-mouse CD4 (L3T4), FITC-Conjugated Rat Anti-Mouse CD8a, (Becton, Dickinson, Milano Italia); Mouse Regulatory T Celi Staining Kit (eBioscience, San Diego, CA, USA); APC antimouse CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) e analizzate mediante FacsCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA). The flow cytometric analysis was performed exclusively on group A and compared with controls because treatment with ATV during pregnancy and lactation conferred the highest protection against the disease. Thymic, splenic and lymph node cells were labeled using the following monoclonal antibodies (mAbs): PerCP-Conjugated Hamster Anti-Mouse CD3e, R-PE-conjugated rat anti-mouse CD4 (L3T4), FITC-Conjugated Rat Anti-Mouse CD8a , (Becton, Dickinson, Milan Italy); Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (eBioscience, San Diego, CA, USA); APC antimouse CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) and analyzed by FacsCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA).

Trasferimento adottivo del diabete Foster transfer of diabetes

Diciotto femmine NOD di 12 settimane di vita suddivise in 3 gruppi da 6 animali, furono irradiate con 700 rad 12 ore prima dell'esperimento. Il trasferimento della malattia venne effettuato inoculando nel seno oculare venoso 2 X IO<6>cellule spleniche provenienti da animali diabetici. Il primo gruppo ricevette esclusivamente 2 X IO<6>cellule spleniche da animale diabetico, il secondo gruppo 1 X IO<6>cellule spleniche da animale diabetico e 1 X IO<6>cellule spleniche da topi NOD di sedici settimane nati da madri trattate con ATV ed un terzo gruppo ricevette 2 X IO<6>cellule spleniche provenienti esclusivamente da NOD di sedici settimane nati da madri trattate con ATV. I topi furono analizzati per glicosuria con Clinistix (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germania) settimanalmente per 8 settimane. In tutti gli animali che presentavano glicosuria la diagnosi di diabete è stata confermata da valori glicemici ematici superiori a 11.1 mmol/1 in due misurazioni consecutive. Eighteen 12-week-old NOD females divided into 3 groups of 6 animals were irradiated with 700 rads 12 hours prior to the experiment. Disease transfer was accomplished by inoculating 2 X 10 <6> splenic cells from diabetic animals into the venous ocular sinus. The first group received exclusively 2 X 10 <6> splenic cells from diabetic animals, the second group 1 X 10 <6> splenic cells from diabetic animals and 1 X 10 <6> splenic cells from sixteen week old NOD mice born to treated mothers with ATV and a third group received 2 X 10 <6> splenic cells exclusively from sixteen-week-old NODs born to mothers treated with ATV. Mice were analyzed for glycosuria with Clinistix (Bayer Diagnostics, Leverkusen, Germany) weekly for 8 weeks. In all animals presenting with glycosuria, the diagnosis of diabetes was confirmed by blood glucose values above 11.1 mmol / 1 in two consecutive measurements.

Trasferimento adottivo di cellule T diabetogeniche (Teff) e Regolatorie (Treg). Adoptive transfer of diabetic (Teff) and regulatory (Treg) T cells.

Trentacinque NOD riceventi di 12 settimane di vita, 5 per ogni gruppo, vennero preirradiati con 700 rad 12 ore prima dell'esperimento. Il trasferimento di cellule regolatorie e diabetogeniche, ottenute mediante CD4+CD25+ Regulatory T Celi Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), venne effettuato iniettando nel seno venoso oculare 2 X IO<6>di cellule spleniche ottenute da topi diabetici. Trenta animali di 4 settimane di vita, di cui 15 NOD di controllo (WT) e 15 NOD nati da madri trattate (ATV), vennero utilizzati come donatori sia di T cellule CD4+/CD25- e CD4+/CD25+ mentre 5 NOD diabetici vennero utilizzati come donatori di Teff diabetogeniche CD4+/CD25-. Thirty-five 12-week-old recipient NODs, 5 for each group, were pre-irradiated with 700 rads 12 hours prior to the experiment. The transfer of regulatory and diabetic cells, obtained by CD4 + CD25 + Regulatory T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), was carried out by injecting 2 X 10 <6> spleen cells obtained from diabetic mice into the ocular venous sinus. Thirty 4-week-old animals, including 15 control NODs (WTs) and 15 NODs born to treated mothers (ATVs), were used as donors of both CD4 + / CD25- and CD4 + / CD25 + T cells while 5 diabetic NODs were used. as diabetic CD4 + / CD25- Teff donors.

Sette gruppi composti da 5 animali ciascuno sono stai trattati come segue: 1) il gruppo di controllo ricevette 2 X IO<6>CD4+/CD25- di Teff; 2) il secondo gruppo ricevette un mix di 0.5 X IO<6>CD4+/CD25- di Teff diabetogeniche e di 0.5 X IO<6>CD4+/CD25+ di Treg da NOD WT; 3) Il terzo gruppo ricevette un mix di 0.5 X IO<6>CD4+/CD25- Teff diabetogeniche e 0.5 X IO<6>CD4+/CD25+ di Treg da topi ATV; 4) il quarto gruppo ricevette 0.5 x IO<6>CD4+/CD25+ da T cellule WT Treg; 5) il quinto gruppo ricevette 0.5 x IO<6>CD4+/CD25+ Treg da topi ATV; 6) il sesto gruppo ricevette 2 x IO<6>CD4+/CD25- Teff da topi WT; 7) il settimo gruppo ricevette 2 x IO<6>CD4+/CD25- Teff da topi ATV. Seven groups consisting of 5 animals each were treated as follows: 1) the control group received Teff's 2 X 10 <6> CD4 + / CD25-; 2) the second group received a mix of 0.5 X IO <6> CD4 + / CD25- of diabetic Teff and 0.5 X IO <6> CD4 + / CD25 + of Treg from NOD WT; 3) The third group received a mix of 0.5 X 10 <6> CD4 + / CD25- Teff diabetogenic and 0.5 X 10 <6> CD4 + / CD25 + of Treg from ATV mice; 4) the fourth group received 0.5 x 10 <6> CD4 + / CD25 + from T cells WT Treg; 5) the fifth group received 0.5 x 10 <6> CD4 + / CD25 + Treg from ATV mice; 6) the sixth group received 2 x 10 <6> CD4 + / CD25- Teff from WT mice; 7) the seventh group received 2 x IO <6> CD4 + / CD25- Teff from ATV mice.

I topi vennero esaminati per glicosuria settimanalmente per 16 settimane; la glicemia è stata misurata in tutti gli animali che presentavano glicosuria e la diagnosi di diabete è stata effettuata quando la glicemia superava 11.1 mmol/1 in due misurazioni consecutive. Mice were tested for glycosuria weekly for 16 weeks; blood glucose was measured in all animals presenting with glycosuria and the diagnosis of diabetes was made when blood glucose exceeded 11.1 mmol / 1 in two consecutive measurements.

Risultati Results

Incidenza del diabete Incidence of diabetes

La frequenza del T1D in 161 nati da madri trattate con 200 μΐ di PBS (controlli) era del 75,4 % e non differiva dall'incidenza della malattia nella nostra colonia (75,0 %). L'incidenza della malattia in 76 NOD femmine nate da madri trattate con 1 mg/kg di ATV dal primo giorno del concepimento fino alla fine dell'allattamento (gruppo A) era del 36,8 % mentre l'incidenza in 19 animali nati da madri trattate dal primo giorno del concepimento fino al parto (gruppo B) ed in 23 animali nati da madri trattate dal parto fino a fine allattamento (gruppo C) era rispettivamente del 47,3 % e del 47,8 % (figura 1). Queste differenze in incidenza sono risultate statisticamente significative; in particolare, il gruppo A ha mostrato la significatività più elevata (p=2.2<~8>; OR= -5) quando paragonata con il gruppo di controllo, mentre il gruppo B ed il gruppo C mostravano rispettivamente una significatività di p=0.0082 (OR= -3.3) e di p=0.013 (OR= -3.2). The frequency of T1D in 161 births to mothers treated with 200 μΐ of PBS (controls) was 75.4% and did not differ from the incidence of the disease in our colony (75.0%). The incidence of the disease in 76 female NODs born to mothers treated with 1 mg / kg of ATV from the first day of conception to the end of lactation (group A) was 36.8% while the incidence in 19 animals born from mothers treated from the first day of conception until delivery (group B) and in 23 animals born to mothers treated from delivery to the end of lactation (group C) it was respectively 47.3% and 47.8% (figure 1). These differences in incidence were statistically significant; in particular, group A showed the highest significance (p = 2.2 <~ 8>; OR = -5) when compared with the control group, while group B and group C respectively showed a significance of p = 0.0082 (OR = -3.3) and of p = 0.013 (OR = -3.2).

Non vi era una differenza statisticamente significativa tra il gruppo A, B e C. Per quanto riguarda il peso degli animali, non abbiamo riscontrato alcuna differenza tra i gruppi (figura 2). There was no statistically significant difference between group A, B and C. Regarding the weight of the animals, we found no difference between the groups (Figure 2).

I dati di incidenza ottenuti con le altre statine sono mostrati in Tabella 1; similmente alla ATV, un effetto statisticamente significativo sulla diminuzione dell'incidenza del T1D è stato ottenuto anche per tutte le altre statine analizzate (Tabella 1). Inoltre, dati preliminari sull'incidenza del T1D nella progenie delle madri trattate con la Pitavastatina sono in linea con quelli ottenuti con le altre statine (dato non mostrato). Infine, in nessun animale abbiamo rilevato effetti teratogeni. Anche nell'uomo recenti studi di meta analisi suggeriscono che sia poco probabile un effetto teratogeno delle statine durante la gravidanza [33]. The incidence data obtained with the other statins are shown in Table 1; similarly to ATV, a statistically significant effect on the decrease in the incidence of T1D was also obtained for all the other statins analyzed (Table 1). Furthermore, preliminary data on the incidence of T1D in the offspring of mothers treated with pitavastatin are in line with those obtained with the other statins (data not shown). Finally, we did not detect any teratogenic effects in any animal. In humans, recent meta-analysis studies also suggest that a teratogenic effect of statins during pregnancy is unlikely [33].

Tabella 1 Table 1

Numero di NOD T1D Incidenza % P Number of NODs T1D Incidence% P

Atorvastatin 76 28 37,0 1.2 x 1CT<8>Atorvastatin 76 28 37.0 1.2 x 1CT <8>

Fluvastatin 22 9 40,9 8.9 x 1CT<4>Fluvastatin 22 9 40.9 8.9 x 1CT <4>

Lovastatin 28 7 25,0 1.6 x 1CT<7>Lovastatin 28 7 25.0 1.6 x 1CT <7>

Pravastatin 36 8 22,2 1.5 x 1CT<9>Pravastatin 36 8 22.2 1.5 x 1CT <9>

Rosuvastatin 26 6 23,1 1.3 x 1CT<7>Rosuvastatin 26 6 23.1 1.3 x 1CT <7>

Simvastatin 21 10 47,6 8.2 x 1CT<3>Simvastatin 21 10 47.6 8.2 x 1CT <3>

Controls 161 121 75,4 Controls 161 121 75.4

Analisi al FACS dei linfonodi periferici, cellule timiche e spleniche FACS analysis of peripheral lymph nodes, thymic and splenic cells

Non sono state riscontrate differenze tra animali del gruppo A ed i controlli a 2, 3 e 4 settimane nel timo, milza e linfonodi per l'espressione degli antigeni CD3e, CD4, CD8a e CCR7. Al contrario quando le cellule spleniche e linfonodali vennero marcate per le T regolatorie, riscontrammo un incremento delle CD4+/CD25+/FOXP3+ nel gruppo A rispetto ai controlli. No differences were found between group A animals and controls at 2, 3 and 4 weeks in the thymus, spleen and lymph nodes for the expression of CD3e, CD4, CD8a and CCR7 antigens. Conversely, when splenic and lymph node cells were labeled for regulatory T, we found an increase in CD4 + / CD25 + / FOXP3 + in group A compared to controls.

Questo incremento venne osservato a 2, 3 e 4 settimane raggiungendo la significatività statistica (p= 0.000693079) a 3 settimane, epoca della massima esposizione alla ATV (figura 3 e tabella 1). This increase was observed at 2, 3 and 4 weeks reaching statistical significance (p = 0.000693079) at 3 weeks, the time of maximum exposure to ATV (figure 3 and table 1).

Trasferimento adottivo del diabete mellito tipo 1 Tra i sei animali del gruppo che ricevettero solo cellule spleniche diabetogeniche (T1D+), 2 divennero diabetici dopo 16 giorni e i restanti 4 dopo 30 giorni. Nel gruppo che ricevette un mix di cellule spleniche sia diabetogeniche che derivate da animali trattati con ATV (T1D+ e ATV+), la malattia esordì dopo 19 giorni e tutti divennero diabetici dopo 37 giorni. Nell'ultimo gruppo che ricevette solo cellule spleniche di animali trattati con ATV (ATV+), la malattia insorse dopo 24 giorni e solo il 50 % risultò diabetico dopo 64 giorni (figura 4). Adoptive transfer of type 1 diabetes mellitus Among the six animals in the group that received only diabetic splenic cells (T1D +), 2 became diabetic after 16 days and the remaining 4 after 30 days. In the group that received a mix of both diabetic and ATV-treated spleen cells (T1D + and ATV +), the disease began after 19 days and all became diabetic after 37 days. In the latter group that received only spleen cells from ATV-treated animals (ATV +), the disease arose after 24 days and only 50% were diabetic after 64 days (Figure 4).

Trasferimento adottivo di T cellule diabetogeniche e regolatorie Adoptive transfer of diabetic and regulatory T cells

Gli animali del primo gruppo, che ricevettero Teff diabetogeniche CD4+/CD25-, divennero tutti diabetici dopo 16 settimane (100 %); nel secondo gruppo, che ricevette un mix di Teff diabetogeniche CD4+/CD25- e Treg CD4+/CD25+ da topi WT, 3 animali su 5 divennero diabetici (60 %); lo stesso numero di animali (3 su 5; 60%) si ammalò nel terzo gruppo che ricevette Teff diabetogeniche CD4+/CD25- e Treg CD4+/CD25+ da ATV; nei rimanenti 4 gruppi (riceventi di: CD4+/CD25+ WT Treg, CD4+/CD25+ ATV Treg, CD4+/CD25- WT Teff, e CD4+/CD25- ATV Teff) nessuno degli animali divenne diabetico (0%); figura 5. The animals of the first group, which received diabetic CD4 + / CD25- Teffs, all became diabetic after 16 weeks (100%); in the second group, which received a mix of diabetic Teff CD4 + / CD25- and Treg CD4 + / CD25 + from WT mice, 3 of 5 animals became diabetic (60%); the same number of animals (3 out of 5; 60%) became ill in the third group which received diabetic Teff CD4 + / CD25- and Treg CD4 + / CD25 + from ATV; in the remaining 4 groups (recipients of: CD4 + / CD25 + WT Treg, CD4 + / CD25 + ATV Treg, CD4 + / CD25- WT Teff, and CD4 + / CD25- ATV Teff) none of the animals became diabetic (0%); figure 5.

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33 Kusters DM, Lahsinoui HH, van de Post JA, Wiegman A, Wijburg FA, Kastelein JJ, et al. Statin use during pregnancy: a systematic review and meta-analysis . Expert Rev Cardiovasc Ther 2012;10:363-78. 33 Kusters DM, Lahsinoui HH, van de Post JA, Wiegman A, Wijburg FA, Kastelein JJ, et al. Statin use during pregnancy: a systematic review and meta-analysis. Expert Rev Cardiovasc Ther 2012; 10: 363-78.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Una o più statine per l'uso nella prevenzione della malattia del diabete di tipo 1 nella progenie a rischio di sviluppare detta malattia, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie nel periodo compreso dal concepimento alla fine dell'allattamento. CLAIMS 1) One or more statins for use in the prevention of type 1 diabetes disease in offspring at risk of developing said disease, in which said one or more statins are administered to the mother of said offspring in the period from conception to the end of 'feeding time.

2) Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie durante tutto il periodo compreso dal concepimento alla fine dell'allattamento . 2) One or more statins for use according to claim 1, wherein said one or more statins are administered to the mother of said progeny during the whole period from conception to the end of lactation.

3) Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie durante tutto il periodo compreso dal concepimento sino alla nascita della progenie. 3) One or more statins for use according to claim 1, wherein said one or more statins are administered to the mother of said progeny during the whole period from conception to birth of the progeny.

4) Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie durante tutto il periodo compreso dalla nascita della progenie sino alla fine dell'allattamento. 4) One or more statins for use according to claim 1, in which said one or more statins are administered to the mother of said progeny during the whole period from the birth of the progeny to the end of lactation.

5) Una o più statine per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui dette una o più statine sono scelte nel gruppo che consiste in atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina, pitavastatina. 5) One or more statins for use according to any one of claims 1-4, wherein said one or more statins are selected from the group consisting of atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin, simvastatin, pitavastatin.

6) Una o più statine per l'uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-5, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie in dose che varia da 4 a 70 mg/die in rapporto alla statina utilizzata e al peso corporeo della madre. 7)Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 6, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie nella dose da 30 a 40 mg/die quando il peso di detta madre è di circa 60 Kg e dette una o più statine sono scelte tra atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, simvastatina. 8) Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 6, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie nella dose da 5 a 10 mg/die quando il peso di detta madre è di circa 60 Kg e dette una o più statine è la rosuvastatina . 9) Una o più statine per l'uso secondo la rivendicazione 6, in cui dette una o più statine sono somministrate alla madre di detta progenie nella dose da 1 a 4 mg/die quando il peso di detta madre è di circa 60 Kg e dette una o più statine è la pitavastatina .6) One or more statins for use according to each of claims 1-5, in which said one or more statins are administered to the mother of said progeny in a dose ranging from 4 to 70 mg / day in relation to the statin used and the body weight of the mother. 7) One or more statins for use according to claim 6, wherein said one or more statins are administered to the mother of said offspring in the dose from 30 to 40 mg / day when the weight of said mother is about 60 kg and said one or more statins are selected from atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, simvastatin. 8) One or more statins for use according to claim 6, wherein said one or more statins are administered to the mother of said offspring in the dose from 5 to 10 mg / day when the weight of said mother is about 60 kg and said one or more statins is rosuvastatin. 9) One or more statins for use according to claim 6, wherein said one or more statins are administered to the mother of said offspring in the dose from 1 to 4 mg / day when the weight of said mother is about 60 kg and said one or more statins is pitavastatin.