ITRM20100329A1 - Modulazione del recettore nucleare per i farnesoidi (fxr) con molecole agoniste per la prevenzione e trattamento di fenomeni aterosclerotici indotti da somministrazione di inibitori delle proteasi - Google Patents

Description

Descrizione dell'Invenzione Industriale avente per titolo:

"Modulazione del recettore nucleare per i farnesoidi (FXR) con molecole agoniste per la prevenzione e trattamento di fenomeni aterosclerotici indotti da somministrazione di inibitori delle p roteasi”

a nome di: Fiorucci Stefano, Andrea Mencarelli, Franco Baldelli, Eleonora Distrutti, Sabrina Cipriani, Daniela Francisci, Barbara Renga

tutti di nazionalità italiana, domiciliati come segue:

Stefano Fiorucci Via Assisi 7, 06100 Perugia

Sabrina Cipriani Via della libertà 125, 06068 Tavernelle (PG) Andrea Mencarelli Via A. Renzini, 12, 06083 Bastia Umbra (PG) Franco Baldelli Via dei Filosofi 14, 06126 Perugia

Barbara Renga Via Sr. Madona di campagna 4S, 06135 Collestrada (PG)

Eleonora Distrutti Via Assisi 70, 06100 Perugia

Daniela Francisci Via Pitagora 15°, 06135 Perugia

Inventori: Fiorucci Stefano, Andrea Mencarelli,

Franco Baldelli, Eleonora Distrutti, Sabrina Cipriani, Daniela Francisci, Barbara Renga

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Camno dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce alla modulazione del recettore dei farnesoidi (FXR) con molecole agoniste per l'attenuazione di fenomeni aterosclerotici. In particolare, l'invenzione si riferisce all'impiego dei composti agonisti del recettore nucleare per i farnesoidi (Farnesoid-X-Receptor; FXR) per la prevenzione della formazione ed il trattamento di placche ateromatose e per la regolazione del profilo lipidico nel sangue, in particolare nei portatori di infezione da HIV e sottoposti a terapia con farmaci antiretrovirali appartenenti alla classe degli inibitori delle proteasi.

Arte Nota

Il ruolo bilanciato fra il recettore nucleare dei bpidi (LXR) e il recettore nucleare dei farnesoidi (FXR) nel mantenimento delTomeostasi del colesterolo, trighceridi e acidi bibari è ben noto (Sinai et al., Celi (2000) 102:731-744; Kalaany N. e Mangelsdorf DJ. Annu. Rev Physiol. (2006) 68:159-191).

In breve, FXR è presente nel nucleo cellulare come componente di un dimero con il recettore dell'acido retinoico (RXR) legato a determinate sequenze geniche regolatrici sul DNA. Questo complesso ospita anche delle molecole co-repressore, che mantengono "silenzioso" il dimero. Al legarsi di una molecola effettrice su uno dei due elementi del dimero, i co-repressori si allontanano e il gene a valle può essere trascritto. Sono noti numerosi geni che sono regolati positivamente o negativamente in modo diretto o indiretto da FXR (si vedano Kalaany N. e Mangelsdorf DJ. supra; Fiorucci S. et al. Progr Lipid Res (2010) 49:171-185). FXR è espresso nel tessuto entero- epatico dove agisce come sensore per la concentrazione intracellulare di acidi biliari. In particolare, quando aumenta la concentrazione intracellulare di acidi biliari, FXR viene attivato, si lega al suo recettore e forma un complesso con il recettore partner RXR Retinoid-X-Receptor). L’eterodimero così costituito si lega a elementi di risposta (Responsive Elements; RE) specifici localizzati sul promotore di geni responsivi. L’effetto cumulativo della modificazione co-ordinata dell'espressione di questi geni conduce ad una ridotta captazione di acidi biliari dal circolo portale, ad una riduzione della loro sintesi endogena e ad una loro aumentata secrezione attraverso il polo biliare dell’epatocita nella bile. Alcuni degli effetti qui ricordati sono mediati dall’attivazione di un recettore nucleare chiamato “small heterodimer partner” o SHP, che è un recettore nucleare atipico in quanto non possiede un dominio di legame al DNA. Il promotore di SHP contiene un elemento di risposta per FXR ed è attivato direttamente da FXR. Una volta attivato, SHP si comporta come un co-repressore di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo degli acidi biliari. Infatti, SHP inibisce la trascrizione di due geni CYP7A1 (cholesterol 7a-hydroxylase) e CYP8B1 (sterol 12P-hydroxylase), che rispettivamente regolano la quantità e l'idrofobicità degli acidi biliari prodotti. Di conseguenza, quando il livello degli acidi biliari è elevato, il sistema che fa capo a FXR/SHP funziona come regolatore negativo riportando la quantità degli acidi biliari al livello appropriato. Inoltre, SHP regola negativamente l’attività di NTCP, una proteina che importa acidi biliari nell’epatocita, spiazzando dal promoter di questo gene il suo induttore positivo, HNF-1 (Lu L., et al., Mol Celi (2000) 6:507-515.; Goodwin B. et al., Mol Celi (2000) 6: 517-526).

FXR è espresso ad alti livelli, coerentemente con il proprio ruolo riconosciuto di regolazione del metabolismo dei lipidi, nel fegato e nell'intestino. In questi tessuti FXR regola direttamente o indirettamente l’espressione di vari geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico e glucidico. Uno dei geni regolato negativamente da FXR è SREPBlc (Sterol Regulatory Element-Binding Protein-lc). SREPBlc a sua volta controlla l'espressione del gene FAS per la sintasi degli acidi grassi (Fatty Acid Synthase; FAS), il principale gene coinvolto nella sintesi dei trigliceridi. SREBP1 è un fattore trascrizionale che fa parte della famiglia delle proteine SREBP, in grado di legare sequenze specifiche di DNA chiamate SRE (Sterol Regulatory Element). Le proteine SREBP sono generalmente legate alla membrana nucleare o a quella del reticolo endoplasmatico in forma inattiva.

In seguito al legame con steroli specifici, le proteine SREBP subiscono un taglio enzimatico nella loro porzione N-terminale, entrano nel nucleo e si legano alle sequenze SRE, così attivando la trascrizione dei loro geni bersaglio (Watanabe M. et al., J Clin Invest. (2004) 113:1408-18).

La produzione di trigliceridi nel fegato è determinata dalla quantità di acidi grassi sintetizzati, la quale è a sua volta controllata a livello trascrizionale sia da PPARa, il quale stimola la β-ossidazione, sia da SREBPlc, il quale regola la sintesi degli acidi grassi. La famiglia dei fattori di trascrizione SREBP è conosciuta per il suo ruolo nel controllo di geni che regolano la biosintesi del colesterolo e dei recettori che ne mediano l’assorbimento dalle LDL (hpoproteine a bassa densità; low density bpoproteins).

Gb SREBP, e in particolare SREBPlc, controllano anche l’espressione di geni coinvolti nella lipogenesi come acetil-CoA carbossilasi, (ACC), sintasi degli acidi grassi (FAS), acetil-CoA sintetasi (AceCS), e glicerol-3-fosfato acetiltransferasi. Inoltre, la famigba degli SREBPs può indurre l’espressione ATP-citrato basi, deb’enzima mabco (ME), deba glucosio 6-fosfato deidrogenasi e deba 6-fosfogluconato deidrogenasi, questi enzimi generano NADPH e acetil-CoA, i quab sono essenziab per la bpogenesi. L’espressione di SREBPlc è aumentata dab insulina, e questo spiega la sua capacità di convertire il glucosio ad acidi grassi. Gb acidi bibari attivando FXR, inducono la produzione di SHP, il quale a sua volta inibisce SREBPlc e di conseguenza la sintesi degb acidi grassi [Watanabe M, et al. supra; Brown MS, Goldstein JL. Celi (1997);89(3):33 1-40.]

FXR è espresso ad elevati hvelh anche nei reni e nebe ghiandole surrenah ed a hvelh più bassi nel cuore e tessuto vascolare. È stato di recente dimostrato che FXR è presente anche in cehule immunitarie quab i macrofagi. In queste cehule l’attivazione di FXR regola negativamente l'espressione del recettore delle LDL ossidate, CD36 (si veda Mencarelli et al., Am J Physiol Heart Ciro Physiol (2009) 296:H272-281).

A scopo puramente esemplificativo alcuni agonisti naturali, semi-sintetici e sintetici di FXR sono descritti nella Tabella 1 con a fianco i rispettivi riferimenti bibliografici la cui descrizione si intende incorporata per riferimento nella sua interezza.

Tabella 1:

Lista di molecole agoniste naturali, sintetiche e semi-sintetiche o modulatrici di FXR.

Referenza Bibliografica

CDCA Schoenfield et al, 198; Leiss et al, 1982

GW4064 Maloney et al, 2000; Liu et al, 2003

6ECDCA Pellicciari et al, 2002

MFA-1 Soisson et al, 2008

AGN29- AGN31 Dussalt I et al, 2003

XL335 Harnish et al. 2007; Flatt et al, 2009; Feng et al, 2009; (WAY- 362540 eFXR450) Evans et al, 2009

Fexaramine Downes et al, 2003; Cai et al, 2007

NIHS700, MeCA e MeDCA Suzuki et al, 2008

T0901317 Collins et al, 2002; Houck et al, 2004 modulatori FXRa

AGN-34 Dussault I et al, 2003

Fra gli agonisti naturali di FXR ci sono l'acido colico (CA) e i suoi derivati della formula [I] seguente:

1 CDCA R<1>= OH, R<2>= H

2 DCA R<1>= H, R<2>= OH

3 LCA R<1>= H, R<2>= H

L'acido colico corrisponde alla struttura di cui sopra in cui R<3>è OH e Ri R2 sono H. Le strutture degli acidi chenodesossicolico (CDCA) (1), desossicolico (DCA) (2) e litocolico (3) (LCA) sono illustrate sopra. Detti effettori naturali sono dotati di una bassa affinità per l'FXR, ragione per cui sono stati sintetizzati nuovi derivati basati sulla struttura centrale dei ligandi naturali (derivati steroidei). Fra questi ricordiamo il derivato dell'acido chenodesossicolico 6 -etil-CDCA (6-ECDCA 0 INT-747) descritto in WO02072598 e in WO2005082925 (incorporati per riferimento nella loro interezza), corrispondente alla seguente formula [II]

6-ECDCA [II]

Altri derivati steroidei sono descritti in WO2008002573 (incorporato per riferimento nella sua interezza), in particolare il composto UPF-987 della seguente formula [III] è risultato un agonista di FXR particolarmente attivo.

UPF-987[III]

Fra gli agonisti di FXR la cui struttura non deriva dagli acidi biliari, che non hanno cioè una struttura steroidea, il più noto è GW-4064 (Maloney et al. J Med Chem (2000) 43:2971-2974) avente la formula [IV] riportata qui di seguito:

GW-4064 [IV]

Altri derivati di GW-4064 con azione agonista su FXR sono descritti in W02004007521 e in US20050080064 (incorporati per riferimento nella loro interezza).

È stata pubblicata inoltre, tutta una serie di studi e brevetti in cui vengono descritti composti derivati del GW-4064 (si vedano, per esempio, la domande di brevetto internazionale W02007092751, W02007140174; W02007140183, W02009012125 e W02009 149795, incorporati per riferimento nella loro interezza) .

Altri composti agonisti noti dell'FXR sono derivati delle azepine e dell'azepindolo (si vedano W02005009387, W02007070796 e US20050054634). Le azepine sono genericamente rappresentate dalla seguente formula [V] :

dove i sostituenti sono descritti nelle domande di brevetto sopracitate, che si intendono incorporati per riferimento nella loro interezza.

Uno dei composti appartenenti a questa classe di agonisti di FXR derivati delle azepine è descritto in Lundquist et al. J Med Chem (2010) 53:1774-1787 come modulatore dei livelli di lipidi nei primati.

Altri agonisti di FXR con una struttura di tipo benzimidazolico sono noti e descritti in una serie di domande di brevetto internazionale già pubblicate, per esempio W02008000643, W02009062874 e corrispondono alla seguente formula generale [VI] :

dove i sostituenti sono descritti nelle domande di brevetto sopracitate e si intendono incorporati per riferimento nella loro interezza.

Inoltre, in Deng G. et al. Bioorg Med Chem Lett (2008) 18:5497-5502 sono descritti derivati pirazolidino-3-5-dione agonisti di FXR della seguente formula generale [VII] :

In cui i sostituenti Ri, R2 0 R3 sono indicati nella tabella 2 che

segue:

Tabella 2:

Sostituenti del composto di formula [Vili]

Ri R2 R3

3-CHs fenile H

3-F fenile H

3-CFs fenile H

4-CFs fenile H

3-CH32-nitrofenile H

3-CH34-fluorobenzoile H

3-CH34-metossilbenzoile H

3-CH3 naftalene- 1 -carbonile H

3-CH3tiofene - 1 -carbonile H

3-CH3pirimidina-4-carbonile H

3-CH3CH3CH3

3-CH3H H

H fenile H

H benzoile H

2-clorobenzoile H

4-clorobenzoile H

4-bromobenzoile H

4-metossilbenzoile H

naftalene- 1-carbonil H

H 2-furoile H

H fenile fenile mentre in W02006020680 sono descritti altri derivati dei composti

eterociclici della seguente formula generale [IX] :

dove i sostituenti sono descritti nelle domande di brevetto sopracitate e si intendono incorporati per riferimento nella loro interezza.

Tutti questi agonisti di FXR sono noti genericamente per il trattamento delle dislipidemie.

La variazione del metabolismo lipidico nel senso della comparsa di dislipidemia e di una variazione dei livelli di lipoproteine piasmatiche nei pazienti soggetti a terapia con terapia antiretrovirale è ormai nota da qualche tempo e sono già stati pubblicati i risultati di alcuni studi clinici mirati all'osservazione di questo fenomeno (Calza et al. J. Antimicrob. Chemother. (2003) 53:10-14; Stein JH. et al. J Clin Lipidol. (2008) 2:464-471; Worm SW et al. J Infect Dis. (2010) 201:318-330). In particolare, in quest'ultimo lavoro l'analisi statistica dei dati provenienti dai pazienti infetti da virus HIV e sottoposti a trattamento con gli inibitori della proteasi (ad esempio lopinavir, ritonavir o indinavir) ha evidenziato che il rischio di infarto del miocardio è significativamente superiore in questi pazienti rispetto a quello di pazienti trattati con altri farmaci antiretrovirali. Inoltre, questo studio ha confermato che questo rischio non è completamente spiegato dall'aumento del rischio di dislipidemia con il progredire del tempo di somministrazione di questi farmaci. In altri termini, il solo trattamento della dislipidemia sembrerebbe non portare ad una corrispondente riduzione del rischio d'infarto.

Nonostante l'accumulo di quella che ormai sta diventando una notevole mole di dati clinici ed epidemiologici riguardanti l'effetto dei farmaci antiretrovirali sullo sviluppo di dislipidemia e di malattie cardiovascolari, non è ancora chiaro come sia possibile intervenire in modo quanto più selettivo possibile su questo fenomeno. E’ infatti ipotizzabile che sia l'infezione di HIV per se sia gli effetti collaterali della terapia con inibitori delle proteasi contribuiscano sinergicamente ad aumentare il rischio di comparsa di eventi cardiovascolari gravi nei pazienti affetti da AIDS.

A questo riguardo, è noto che gli inibitori delle proteasi possono causare nel fegato e nei tessuti adiposi un accumulo della proteina SREBP-1 che, come descritto precedentemente, è una delle proteine di regolazione fondamentali per il metabolismo del colesterolo e dei lipidi e che questo accumulo è dovuto all'inibizione del meccanismo di eliminazione di detta proteina da parte della cellula (si vedano Riddle TM et al., J Biol Chem (2001) 5:337-343 e Parker RA et al., Mol Pharmacol (2005) 67:1909-1919). Si sa anche che questi farmaci antivirali intervengono sulla formazione delle placche ateromatose intervenendo direttamente su varie attività proprie dei macrofagi (si vedano Zhou H et al., Mol Pharmacol (2005) 68:690-700 e Dressman J. et al., J Clin Invest (2003) 111:389-397), che sono i principali attori nella formazione delle placche ateromatose, come è ben noto agli esperti del ramo.

Al momento, la pratica clinica è orientata verso la cosomministrazione di farmaci antilipidemici, quali fibrati o statine, insieme alla terapia antiretrovirale per il trattamento dei pazienti che presentano dislipidemia secondaria al trattamento con antivirali inibitori della proteasi. Questa pratica, tuttavia, non è priva di problemi e causa di ulteriori effetti collaterali, come discusso in Ray GM Cardiol Rev (2009) 17:44-47.

Da quanto sopra emerge come esista la necessità di individuare metodiche di trattamento che possano prevenire gli effetti cardiovascolari avversi causati dalla terapia antiretrovirale, in particolare causati dagli inibitori della proteasi di HIV. Questo permetterebbe di mantenere l'utilizzo di farmaci inibitori della proteasi, quali il ritonavir e l'atazanavir, che hanno mostrato una efficacia antivirale ed a cui per il momento è impossibile rinunciare nella terapia contro HIV.

Sommario dell'invenzione

È stato ora trovato che molecole agoniste del recettore nucleare FXR sono in grado di proteggere dagli effetti collaterali della terapia con farmaci inibitori della proteasi virale di HIV, non presentando gli effetti collaterali tipici legati all'utilizzo dei farmaci antilipemizzanti in uso sino ad oggi.

È quindi oggetto della presente invenzione l'utilizzo di detti agenti agonisti di FXR per il trattamento dell'aterosclerosi e della dislipidemia che si presentano come effetto collaterale della terapia con antivirali inibitori della proteasi di HIV. Dal punto di vista farmacologico, una caratteristica saliente degli agonisti di FXR finora saggiati, è la mancanza di effetti collaterali nei primati, che ne rende interessante ed innovativa l'applicazione clinica ove eventualmente indicata.

In particolare, l'invenzione ha per oggetto l'utilizzo di derivati naturali, semisintetici e sintetici degli acidi biliari per rinibizione della formazione di placche ateromatose e la riduzione degh eventi cardiovascolari nel quadro del trattamento con agenti antiretrovirah di pazienti infetti da HIV.

Ulteriore oggetto della presente invenzione sono le composizioni comprendenti agonisti di FXR e farmaci inibitori della proteasi di HIV.

Ulteriori oggetti risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettaghata dell'invenzione.

Breve Descrizione delle Figure

Figura 1. Sono mostrati in modo diagrammatico gli effetti della somministrazione di un agonista di FXR ed in particolare del CDCA, acido chenodeossicolico, in topi ΑροΕ<Λ>(nuli) trattati con un inibitore delle proteasi (ritonavir) per 12 settimane. L’esperimento in oggetto è stato ripetuto tre volte con set diversi di animah ed i dati mostrati fanno riferimento ad uno dei tre set sperimentah, essendo i risultati degh altri due analoghi a quello mostrato. A: area delle placche misurate nei vari gruppi sperimentah. B: livelli di trigliceridi, LDL, HDL, colesterolo totale, glicemia e ALT nei topi wild type e Apo-nuU trattati o meno con ritonavir oppure con ritonavir CDCA. Come si vede il CDCA riduce in maniera significativa l’estensione delle placche ateromatose in topi esposti a ritonavir.

Figura 2. Livelli di mRNA per diverse proteine che regolano la produzione di lipidi e colesterolo (si veda Esempio 1) nel fegato di topi ApoE-null trattati con ritonavir oppure con ritonavir CDCA per 12 settimane. L’esperimento in oggetto è stato ripetuto tre volte con set diversi di animali ed i dati mostrati fanno riferimento ad uno dei tre esperimenti, essendo i risultati degli altri due analoghi a quello mostrato.

Figura 3. L’attivazione di FXR protegge dallo sviluppo di dislipidemia causata dal ritonavir in animali wild type. Sono mostrati in modo diagrammatico i parametri di funzionalità epatica e i livelli ematici di lipidi, colesterolo, acidi grassi Uberi, triacilglicerolo, HDL, LDL e glucosio in topi C57BL/J wild type e wild type trattati con ritonavir per 2 settimane (si veda Esempio 1) o con ritonavir in combinazione con l'agonista di FXR, CDCA.

Figura 4. Sono mostrati i risultati a UveUo epatico deU'esperimento mostrato in Figura 3, condotto in topi wild type C57BL/J trattati con ritonavir da solo o ritonavir più l'agonista di FXR, CDCA per 2 settimane. A e B: variazione del peso del fegato e del contenuto in triacilgliceroli dei fegati dei topi wild type trattati o meno con ritonavir CDCA. C: colorazione H&E; D: colorazione con Red Oil; E: anafisi deUa espressione di geni (Uvelli di mRNA) codificanti per proteine coinvolte nel metabohsmo dei Upidi in topi wild type trattati con ritonavir da solo o in combinazione con l'agonista di FXR, CDCA.

Figura 5. L'assenza di FXR in topi geneticamente modificati aggrava la dislipidemia causata da ritonavir indicando un ruolo essenziale di FXR nella controregolazione degli affetti avversi causati da inibitori delle proteasi. Dislipidemia in topi FXR<7>- (nuli) (si veda Esempio 1). A-F: livelli ematici dei lipidi in topi trattati o meno con ritonavir. G: effetto del trattamento con ritonavir sul peso del fegato. H: istologia H&E del fegato dei topi wild type e FXR-null trattati o meno con ritonavir. I: analisi della espressione di geni (livelli di mRNA) codificanti per di proteine coinvolte nel metabolismo dei lipidi in topi wild type e FXR-null trattati o meno con ritonavir.

Figura 6. Espressione di CD36 su monociti/macrofagi circolanti e in coltura e sua modulazione a seguito del trattamento con ritonavir oppure con ritonavir in combinazione con l'agonista di FXR, CDCA. A: livelli di CD36 presente su monociti/macrofagi in topi ApoE nuli. B: livelli di CD36 presenti su macrofagi RAW264.7 in coltura trattati con concentrazioni scalari di ritonavir. C: effetto del cotrattamento con CDCA dei macrofagi RAW264.7 in coltura con ritonavir. D: profili in citometria di flusso di macrofagi RAW264.7 trattati con ritonavir e effetto del co-trattamento con CDCA. E: captazione di delle LDL acetilate da parte di macrofagi RAW264.7 trattati con ritonavir e effetto del co-trattamento con CDCA.

Figura 7. Espressione di geni codificanti per proteine coinvolte nel metabolismo lipidico in macrofagi in coltura. L’esposizione di macrofagi (RAW264.7) al ritonavir incrementa l’espressione di CD36 e SREBP1. Il co-trattamento con l'agonista naturale di FXR, CDCA inibisce l’induzione di CD36 e di SREPBlc. Inoltre l’attivazione di CD36 con CDCA induce l’espressione di PPAR e SHP. Siccome SHP è un gene regolato direttamente da FXR, la sua induzione è un indice dell’ attivazione di FXR nel macrofago.

Figura 8. Un diverso inibitore delle proteasi (atazanavir) incrementa in vitro l’espressione di CD36 in macrofagi RAW264.7. Figura 9. Rappresentazione diagrammatica dell’effetto degli agonisti di FXR sulle vie metaboliche modificate dagli inibitori della proteasi del virus HIV.

Figura 10. Visione schematica del saggio per la verifica della presenza di un sito di legame (SRE) specifico per SREBP-1 nella sequenza del promotore di CD36 di topo dell'Esempio 2 (esperimento di transattivazione).

Descrizione Dettagliata delflnvenzione Nell'ambito della presente invenzione, con il termine "agonista di FXR" si intende un composto naturale, semisintetico o sintetico, che agisce attivando direttamente il recettore FXR. Gli agonisti di FXR di interesse secondo la presente invenzione sono composti che, caratterizzati mediante saggio di transattivazione (si veda l'Esempio 2), sono in grado di indurre l’attività trascrizionale del recettore nucleare di FXR con una dose efficace al 50% (EC)so uguale o inferiore a quella che si osserva per il ligando naturale CDCA (acido chenodeossicolico) la cui EC50 è uguale a 10 M.

Nell'ambito dell'invenzione sono compresi gli agenti agonisti di FXR, i loro corrispondenti derivati e sali farmaceuticamente accettabili, nelle loro forme racemiche 0 otticamente attive, impiegabih da sob 0 in miscela tra loro.

Gli inventori, nell 'intraprendere lo studio dell'influenza della modulazione di FXR sugb effetti collaterah cardiovascolari indotti dall’esposizione a farmaci antivirali inibitori della proteasi (IP) del virus HIV hanno inaspettatamente trovato che composti agonisti di FXR hanno la capacità di prevenire, modulando in modo selettivo le vie molecolari attivate da inibitori delle proteasi, l'insorgenza e la formazione di placche ateromatose che si sviluppano in particolare nei soggetti sottoposti a trattamento con farmaci antivirali IP.

Infatti è stato trovato che l'effetto del ritonavir, un IP ampiamente utilizzato nella cura dell'AIDS, sulla presenza e trascrizione di CD36 nei macrofagi RAW2647 in coltura, è dipendente da SREBPlc (Figure 6 e 7) e che l'esposizione dei macrofagi a ligandi agonisti naturali e sintetici di FXR riduce fino al 50% i livelli cellulari della proteina SREBPlc, del suo mRNA (si veda la Figura 7) e della sua traslocazione nucleare, evento questo che è ritenuto importante nel regolare l’espressione di CD36. In Figura 8 è inoltre mostrato l'effetto dell'utilizzo di un diverso IP (atazanavir) sull'espressione di CD36 sulla superficie dei macrofagi di topo in coltura. Come si può osservare, anche atazanavir produce un aumento dose-dipendente della presenza di CD36 sulla superficie cellulare. Inoltre, un diverso agonista di FXR, GW4064, inibisce l’induzione di CD36 causata sia da ritonavir che da atazanavir, dimostrando che tutti gli agonisti di FXR sia sintetici che naturali inibiscono l’attivazione di macrofagi causata da inibitori delle proteasi (dati non mostrati).

Contemporaneamente alla riduzione di SREBPlc, come illustrato in Figura 7, l'utilizzo di agonisti di FXR su macrofagi di topo in vitro causa l'induzione della proteina SHP proponendo una situazione speculare a quella creata dal ritonavir (vale a dire aumentati livelli di SREBPlc e bassi livelli di SHP).

A conferma della osservata regolazione degli agonisti di FXR sulla trascrizione di CD36, è stata anche verificata la presenza di un sito di legame (SRE) specifico per SREBP-1 nella sequenza del promotore di CD36 di topo (Esempio 2 e Figura 10).

Attivazione di FXR e protezione contro l'aterosclerosi provocata da ritonavir in un modello animale specifico (topi AnoE nuli)

I topi ApoE-null sono un modello di topo dislipidemico che sviluppa aterosclerosi nel corso della propria vita. La somministrazione di ritonavir per tre mesi (12 settimane) ad un gruppo questi topi, da solo o in co-trattamento con CDCA non causava alcun effetto sul peso e sulla mortalità degli animali. Tuttavia, gli animali trattati con il solo ritonavir mostravano un drammatico aumento dell'estensione delle placche aortiche, effetto che veniva significativamente ridotto dal co-trattamento con CDCA (Figura 1A).

Il fatto che il CDCA sia in grado di proteggere dalla formazione delle placche nei topi ApoE-null, nonostante non abbia alcun effetto nel modificare il profilo lipidico di questi animali (Figura 1B), indica che l’attivazione di FXR è in grado di regolare negativamente l’espressione dei mediatori pro-infiammatori (CDllb, MCP-1, IL-6 and IL-Ιβ) coinvolti nella formazione delle placche aortiche. L’espressione di questi geni è aumentata negli animali ApoE-null, è esacerbata dal trattamento con ritonavir e viene revertita dalla somministrazione con agonisti di FXR (dati non mostrati). Come è noto all'esperto nel ramo, l’attivazione dei geni infiammatori nelle pareti dei vasi porta alla adesione, chemoattrazione, migrazione e attivazione di cellule immunitarie quali monociti e linfociti T, inducendo la formazione e progressione delle placche aortiche.

Per quanto riguarda i parametri ematici dei topi ApoE-null, i livelli base di colesterolo e trigliceridi erano pari a due volte quelli degli animali wild type, mentre le LDL erano quattro volte i livelli normali e le HDL erano tre volte inferiori rispetto alla norma. Né il trattamento con ritonavir, né il co-trattamento con CDCA o gemfibrozil erano in grado di fare variare questi parametri (Figura 1B). Il fatto che l'azione dell'agonismo di FXR fosse priva di effetto sul quadro lipidico negli animali ApoE nuli è un'osservazione inaspettata. Per verificare l'influenza del ritonavir su questo fenomeno, è stato osservato l'effetto del solo CDCA sulla dislipidemia dei topi ApoE-null. In questo caso la dislipidemia poteva essere corretta dal ligando di FXR, indicando che il modo di azione dell'IP era nuovo (risultati non mostrati). Quanto osservato a livello ematico veniva confermato a livello dell'espressione genica di proteine coinvolte nel metabolismo lipidico e del colesterolo.

Per potere chiarire in che modo il CDCA esercitasse l'effetto di riduzione delle placche da ritonavir osservato nei topi ApoE-null, si è proceduto allo studio dell'espressione di CD36 nei monociti circolanti (si veda la Figura 6A). A questo scopo furono rilevati i livelli di CD36 sulla superficie dei monociti di topi ApoE-null e di cellule RAW2647 trattati con ritonavir da solo o insieme a CDCA. Fu osservato che il co-trattamento causava un ritorno ai livelli di base della presenza di CD36 sulla superficie dei monociti sia in vivo che in vitro (si veda Figura 6A-D) e che questo rientro dei livelli di CD36 coincideva con una riduzione dell'assorbimento di ac-LDL da parte dei monociti RAW2647 trattati (Figura 6E). L'effetto esercitato da CDCA era collegato con una diminuzione dei livelli di SREBP-1 nel nucleo (si veda la Figura 7A). L'analisi dei livelli di mRNA per SREBPlc, inoltre mostrava che solo il trattamento con CDCA era capace di ridurne i livelli mentre causava un aumento dei livelli di mRNA per PPARy e SHP (si veda Figura 7B).

In questo esperimento si è anche osservato che il ritonavir causava un beve rialzo dei livelli dell'mRNA per CD36 nei macrofagi RAW2647 in coltura, e che solo il trattamento con il CDCA era capace di abolire completamente questo aumento (Figura 7B).

Gli studi effettuati dagli inventori permettono quindi di confermare che gh agonisti di FXR possono essere utilizzati per la prevenzione e il trattamento delle complicazioni cardiovascolari e dei fenomeni aterosclerotici causati da farmaci antivirali IP in soggetti infettati da HIV. Gh agonisti FXR secondo la presente invenzione possono essere usati in somministrazione antecedente, contemporanea o successiva a queha di detti farmaci antivirali.

Il dosaggio somministrabile può variare fra 0,1 mg/kg e 10 mg/kg/die.

Le vie di somministrazione sono quehe note all'esperto del ramo e possono essere la via endovenosa, intramuscolare, intraperitoneale, orale, topica, spray, vaginale o rettale. La via orale è preferita.

Le formulazioni farmaceutiche per la somministrazione orale possono essere formulate utilizzando i carrier farmaceuticamente accettabili noti nel ramo in dosaggi adeguati alla somministrazione orale. Le forme di dosaggio possono essere compresse, pillole, polveri, capsule dure e capsule morbide, pasticche, oppure possono essere formulazioni liquide, quali spray, gel, sciroppi, sospensioni, e simih.

Le formulazioni possono anche comprendere la contemporanea presenza di un farmaco IP e deh'agonista di FXR.

Gli eccipienti utilizzabili sono quelli noti all'esperto nel ramo, quali carboidrati o proteine, includendo, ma non limitandosi a, zuccheri (per esempio, lattosio, saccarosio, mannosio o sorbitolo); amido di mais, di riso, etc.; cellulose, quali, per esempio, metilcellulosa e idrossipropilmetil cellulosa; gomme, proteine quali gelatina e collagene. Le formulazioni orali possono anche contenere agenti solubilizzanti o disintegranti noti all'esperto nel ramo, quali acido alginico e polivinil pirrolidone o loro sali.

Le sospensioni acquose possono contenere agenti di sospensione noti all'esperto nel ramo, quale l'idrossimetil cellulosa o l'alginato di sodio, e agenti umettanti, per esempio agenti naturali quali le lecitine, oppure di origine sintetica, quali il poliossietilene stearato e il poliossietilene sorbitan mono-oleato.

Nelle sospensioni acquose possono essere anche presenti dei conservanti farmaceuticamente accettabili, quale l'etil pidrossibenzoato, o dei coloranti, degli aromatizzanti e dei dolcificanti, quali aspartame e saccarosio. Se necessario, le soluzioni possono venire aggiustate per la osmolarità.

Le sospensioni oleose possono contenere olio di origine naturale, quale l'olio di arachidi, o un olio minerale, quale la paraffina liquida. Possono inoltre contenere addensanti, quali la cera d'api o l'alcol cetilico, dolcificanti e antiossidanti, quale l'acido ascorbico. Le sospensioni olio-in-acqua possono, oltre ai componenti sopra descritti, contenere emulsionanti come quelli già descritti in precedenza, e dolcificanti.

Gli sciroppi possono contenere dolcificanti, conservanti e/o coloranti.

Le formulazioni farmaceutiche per la somministrazione endovenosa possono consistere in una preparazione iniettabile sterile, acquosa o oleosa. Questa sospensione può essere formulata secondo metodi noti all'esperto nel ramo, utilizzando adeguati agenti disperdenti o umettanti e agenti di sospensione già menzionati sopra. La preparazione sterile iniettabile può anche essere una sospensione o una soluzione in un diluente non tossico per via parenterale, quah l'acqua o la soluzione fisiologica. Oh fissi sterih possono essere impiegati in modo convenzionale quali solvente o mezzo di sospensione, quali mono- e di gliceridi di sintesi. Infine, acidi grassi quale l'acido oleico possono essere anch'essi impiegati nella formulazione di farmaci iniettabili.

Gli esempi seguenti sono forniti a titolo esemplificativo del'invenzione e non sono da considerarsi come limitativi della portata della medesima.

Esempi

Esempio 1, Effetti del trattamento con ritonavir in topi ApoE-null per 12 settimane e in topi wild type per 2 settimane. Protocollo sperimentale.

I topi ApoE-/- sono stati suddivisi in 3 gruppi:

gruppo 1: non trattati

gruppo 2: somministrazione intra-peritoneale di ritonavir (5mg/kg) gruppo3: somministrazione intra-peritoneale di ritonavir (5mg/kg) più somministrazione intr agastrica di CDCA (15 mg/kg).

Tutti i farmaci sono stati somministrati una volta al giorno (5 giorni a settimana) per dodici settimane. Alla fine dell’esperimento gli animali sono stati messi a digiuno per dodici ore, anestetizzati con pentobarbital sodico. È stato prelevato il sangue per la determinazione della concentrazione di colesterolo, trigliceridi, HDL, LDL, glucosio, AST, ALT e per l’isolamento dei monociti/macrofagi, in cui è stata effettuata la misurazione dell’espressione del CD36. 1 fegati prelevati sono stati utilizzati per l’isolamento dell’RNA e le aorte sono state processate per l'istologia e per la colorazione specifica delle lesioni aterosclerotiche e per l’isolamento dell’RNA (si vedano le Figure 1, 2, 6A).

Quantificazione delle lesioni aterosclerotiche

Il cuore e l’aorta furono rimossi dall’animale, il grasso periferico fu rimosso e l’aorta (incluso l’arco ascendente, e i segmenti toracico e addominale) fu poi sezionata longitudinalmente, fissata ad un supporto e poi colorata con il colorante Sudan IV per evidenziare le lesioni. Le lesioni aortiche furono fotografate e l’area delle lesioni (in pixel) è stata calcolata usando il free software Image J 1.33u (Rasband W., National Institutes of Health; Bethesda, MD).

Analisi Real-time PCR

La quantificazione dell’espressione genica nei tessuti è stata eseguita tramite l’uso della tecnica qRT-PCR. L’RNA totale fu estratto dai fegati e dalle aorte con Trizol (Invitrogen), incubato con DNAase I e retrotrascritto con Supescript II (Invitrogen). Per la RT-PCR furono usati 100 ng di cDNA in 25μ1 di reazione contenente 0,3 μΜ degli inneschi senso e antisenso e 12,5 μΐ di 2x SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tutte le reazioni furono eseguite in triplicato usando il seguente protocollo: 2 min a 95°C, seguiti da 50 cicli di 95°C per 10 secondi e 60°C per 30 secondi usando iCycler iQ instrument (Bio-Rad Laboratoires).

I primers sono stati disegnati usando il software PRIMER3-OUTPUT usando le sequenze pubblicate sul database NCBI. Di seguito sono riportate le sequenze dei primers utilizzati: mSREBPlc, SEQ ID NO.l: gatcaaagaggagccagtgc; mSREBPlc, SEQ ID NO.2: tagatggtggctgctgagtg; mSREBP2, SEQ ID NO.3: acagatgccaagatgcacaa;

mSREBP2, SEQ ID NO.4: ttcagcaccatgttctcctg;

mFAS, SEQ ID NO.5: tgggttctagccagcagagt;

mFAS, SEQ ID NO.6: accaccagagaccgttatgc;

mHMGCoAS, SEQ ID NO.7: ggtggatgggaagctgtcta; mHMGCoAS, SEQ ID NO.8: acatcatcgagggtgaaagg; mHMGCoAR, SEQ ID NO.9: ccgaattgtatgtggcactg; mHMGCoAR, SEQ ID NO. 10: ggtgcacgttccttgaagat;

PPARy, SEQ ID NO. 11: gccagtttcgatccgtagaa;

PPARy, SEQ ID NO. 12: aatccttggccctctgagat;

mFXR, SEQ ID NO.13: tgtgagggctgcaaaggttt;

mFXR, SEQ ID NO. 14: acatccccatctctctgcac;

mSHP, SEQ ID NO. 15: tctcttcttccgccctatca;

mSHP, SEQ ID NO. 16: aagggcttgctggacagtta;

mCDllb, SEQ ID NO. 17: aaggattcagcaagccagaa;

mCDllb, SEQ ID NO. 18: tagcaggaaagatgggatgg;

mIL6, SEQ ID NO. 19: ccggagaggagacttcacag

mIL6, SEQ ID NO.20: tccacgatttcccagagaac;

mCD36, SEQ ID NO.21: cggagacatgcttattgagaa

mCD36, SEQ ID NO.22: actctgtatgtgtaaggacct

mTNFa, SEQ ID NO.23: acggcatggatctcaaagac

mTNFa, SEQ ID NO.24: gtgggtgaggagcacgtagt;

mGAPDH, SEQ ID NO.25: tgagtatgtcgtggagtctac

mGAPDH, SEQ ID NO.26: gttggtggtgcaggatgcattg;

ml8S, SEQ ID NO.27: accgcagctaggaataatgga

ml8S, SEQ ID NO.28: gcctcagttccgaaaacc.

Modulazione positiva di FXR sulla dislipidemia indotta da ritonavir in topi wild type.

Si è cercato di replicare in un modello animale il quadro clinico tipico dei pazienti sottoposti a terapia con IP.

Topi C57BL6/J wild type sono stati sottoposti alla somministrazione i.p. di 5 mg/kg di ritonavir per 2 settimane. I risultati ottenuti (si vedano le Figure 3 e 4) indicano che la somministrazione di ritonavir fa aumentare i livelli ematici di triacilgliceroli, acidi grassi liberi (Free Fatty Acids; FFA), colesterolo e LDL, come atteso. Sempre in questo quadro, sono stati eseguiti diversi tipi di analisi a livello epatico come già fatto con i topi ApoE-null.

La somministrazione di ritonavir causava 1'accumulo di trigliceridi all'interno degli epatociti (Figura 4B, C e D) e anche un considerevole aumento dei livelli di espressione di geni coinvolti nella omeostasi dei lipidi e del colesterolo (Figura 4E), quali SREBPlc, SREBP2, FAS e HMCoA sintasi, sebbene questo fosse statisticamente significativo solo nel caso di SREBPlc e FAS. Il cotrattamento con CDCA causava una significativa diminuzione dei livelli di espressione di FAS e SREBPlc e una significativa stimolazione dell'espressione di SHP negb epatociti.

Dislipidemia indotta da ritonavir in topi FXR-null

Topi FXR-null, cioè privi del gene FXR, e topi wild type sono stati trattati con ritonavir per 2 settimane (Figura 5). Come illustrato in Figura 5A-F, i topi FXR nuli e FXR nuli trattati con ritonavir presentavano una dislipidemia marcata, superiore a quella dei corrispondenti topi wild type. Inoltre mostravano una statosi epatica più evidente (5H) ed il profilo dell'espressione epatica di geni coinvolti nella produzione di lipidi e colesterolo era caratterizzato da una marcata disregolazione dei geni coinvolti nella sintesi degb acidi grassi, in particolare della sintasi degb acidi grassi (FAS) (51).

Esempio 2, Identificazione di un ligando di FXR mediante metodica di transattivazione

I saggi di transattivazione vengono utilizzati in biologia molecolare per studiare eventi cellulari come il legame di fattori trascrizionali a particolari sequenze di DNA chiamati elementi di risposta (response elements; RE) che possono avere funzione di esaltatori (enhancer) o di inibitore (silencer) della trascrizione e/o per valutare l’efficacia di potenziali agonisti nell’indurre l’attività trascrizionale di determinati fattori trascrizionali (per uno schema si veda Figura 10).

Nel presente caso, il saggio di trans attivazione per un identificare un ligando di FXR è stato eseguito in cellule di fegato umano (HepG2) transfettate con un vettore virale di espressione che contiene un sito di legame canonico per FXR rappresentato da una sequenza di basi definita con il termine generico di IR-1 (inverted repeat-1; sequenza ripetuta invertita- 1). La sequenza in oggetto è AGGTCA ni TGACCT.

II protocollo sperimentale è diviso nelle seguenti tre fasi principali:

(a) Trasfezione transiente di cellule target (HepG2)

Secondo quanto descritto in precedenza (Fiorucci et al. Gastroenterology (2004) 127: 1497-1512), le cellule HepG2 furono transfettate con:

(i) un plasmide contenente il cDNA umano di FXR (pCMVSPORT-FXR);

(ii) un plasmide contente il cDNA umano di RXR (pSG5-RXR);

(iii) un plasmide contente il gene reporter luciferasi a monte del quale viene clonato l’elemento responsivo di FXR;

(iv) un plasmide contenente il cDNA dell’enzima β-galattosidasi che viene utilizzato come controllo interno di transfezione.

(b) Stimolazione delle cellule con potenziali agonisti

48 ore dopo la transfezione le cellule furono stimolate con potenziali ligandi/agonisti del recettore nucleare FXR. In particolare, le cellule transfettate furono incubate con concentrazioni crescenti di agonista di FXR a partire da 1 nM (IO<9>) fino a 100 μΜ (10-4);

(c) Lisi delle cellule ed analisi della luminescenza al luminometro e normalizzazione dei valori di luciferasi.

Il saggio luminescente fu eseguito utilizzando il Luciferase Assay System della ditta Promega.

Dopo 24 ore di stimolazione, le cellule furono lisate con 100 1 di tampone di lisi freddo secondo le istruzioni del fabbricante, agitate su vortex e centrifugate per 1 minuto a 14000 rpm. 20 1 di sovranatante cellulare furono letti al luminometro utilizzando 100 1 di substrato della luciferasi. La normahzz azione dei valori di luciferasi fu effettuata anahzzando l’attività dell’enzima βgalattosidasi sui medesimi bsati cellulari. Tale attività viene di prassi saggiata aggiungendo al Usato cefiulare il substrato dell’enzima orto-nitrofenil-galatto-piranoside (ONPG) ed incubando la miscela a 37°C finché non vira al giallo. Le unità di enzima furono misurate allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 420 nm.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di agenti agonisti di FXR per la preparazione di farmaci per la prevenzione e il trattamento dell'aterosclerosi, della dislipidemia e delle complicazioni cardiovascolari in soggetti, quali l'uomo o l'animale, sottoposti a trattamento con farmaci antiretrovirali.
2. 2. Uso secondo la riv. 1 in cui i soggetti sono infetti da HIV.
3. 3. Uso secondo le riv. 1-2 in cui i farmaci antiretrovirali sono farmaci inibitori della proteasi di HIV, in particolare lopinavir, ritonavir, indinavir, atanazavir e relative combinazioni fra loro e/o con altri farmaci antiretrovirali.
4. 4. Uso secondo le riv. 1-3 in cui gli agenti agonisti di FXR sono scelti fra composti naturali, semisintetici o sintetici, che, nel corso di un saggio di transattivazione, sono in grado di indurre l’attività trascrizionale del recettore nucleare di FXR con una dose efficace al 50% (EC50) uguale 0 inferiore a quella per il ligando naturale acido chenodeossicolico.
5. 5. Uso secondo le riv. 1-4 in cui l’attivazione di FXR regola negativamente l’espressione dei mediatori pro-infiammatori CDllb, MCP-1, IL-6 e IL-Ιβ.
6. 6. Uso secondo le rivendicazioni 1-5 in cui gli agenti agonisti di FXR sono scelti nel gruppo dei derivati naturali, semi-sintetici 0 sintetici degli acidi biliari, in particolare acido chenodesossicolico, derivati steroidei e non steroidei degli acidi biliari, derivati delle azepine, degli azepindoli, derivati benzilimidazolici e pirazolidinici e corrispondenti derivati e sali, nelle loro forme racemiche o otticamente attive, da soli o in miscela tra loro.
7. 7. Uso secondo le rivendicazioni 1-6 in cui il dosaggio somministrabile varia fra circa 0,1 mg/kg e 10 mg/kg/die.
8. 8. Composizione farmaceutica comprendente uno o più agenti agonisti di FXR in combinazione con farmaci antiretrovirali, in particolare ritonavir, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
9. 9. Composizione farmaceutica secondo la riv. 8 formulata per somministrazione endovenosa, intramuscolare, intraperitoneale, orale, topica, spray, vaginale o rettale.
10. 10. Prodotto comprendente un agente agonista di FXR e un farmaco antiretrovirale come preparazione combinata per uso simultaneo, separato o sequenziale nella prevenzione e trattamento dell'aterosclerosi, della dislipidemia e delle complicazioni cardiovascolari in soggetti, quali l'uomo o l'animale, sottoposti a trattamento con farmaci antiretrovirali.
11. 11. Prodotto secondo la riv. 10 in cui i farmaci antiretrovirali sono farmaci inibitori della proteasi di HIV, in particolare lopinavir, ritonavir, indinavir, atanazavir e relative combinazioni fra loro e/o con altri farmaci antiretrovirali.