ITPD970064A1 - N-SULPHATED COMPOUNDS OF HYALURONIC ACID AND ITS DERIVATIVES WITH ANTICOAGULANT AND NON-THROMBOGENIC ACTIVITY AND PROCESS FOR THEIR - Google Patents
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Description
Descrizione di una domanda di brevetto per invenzione industriale dai titolo "Composti N-solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad attività anticoagulante e non-trombogenica e processo per la loro preparazione", Description of a patent application for industrial invention entitled "N-sulfated compounds of hyaluronic acid and its derivatives with anticoagulant and non-thrombogenic activity and process for their preparation",
OGGETTO DELL’INVENZIONE OBJECT OF THE INVENTION
La presente invenzione descrive nuovi composti solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad attività anticoagulante e nontrombogenica per la preparazione di formulazioni farmaceutiche, di biomateriali e per il rivestimento di oggetti biomedicali ed il processo per la loro preparazione. The present invention describes new sulphated compounds of hyaluronic acid and its derivatives with anticoagulant and non-thrombogenic activity for the preparation of pharmaceutical formulations, biomaterials and for the coating of biomedical objects and the process for their preparation.
CAMPO DELL’INVENZIONE FIELD OF THE INVENTION
L'eparina è il glicosamminoglicano solfatato con maggiore attività biologica. Sono ben conosciute le sue proprietà antitrombotica e anticoagulante. Infatti è usata nel trattamento di patologie cardiovascolari a rischio trombotico e ha dato notevoli contributi nel successo della chirurgia a cuore aperto. Heparin is the sulfated glycosaminoglycan with the greatest biological activity. Its antithrombotic and anticoagulant properties are well known. In fact, it is used in the treatment of cardiovascular pathologies at thrombotic risk and has made significant contributions to the success of open heart surgery.
La struttura dell'eparina non è interamente conosciuta. The structure of heparin is not fully known.
L'eparina commerciale comprende uno spettro di 21 eparine (Nader et al., 1974, Biochem. Biophys; Res. Commun. 57:488), con peso molecolare compreso tra 3.000 e 37.500 Da, con attività anticoagulante variabile. Commercial heparin comprises a spectrum of 21 heparins (Nader et al., 1974, Biochem. Biophys; Res. Commun. 57: 488), with molecular weight between 3,000 and 37,500 Da, with variable anticoagulant activity.
L'attività anticoagulante dell'eparina è dovuta alle sue caratteristiche strutturali, ad esempio, al grado di solfatazione, al grado di dissociazione, alla sequenza dei gruppi COO- e SO3", alla forma e alla grandezza della molecola. Questi fattori sono importanti per la formazione dei legami ionici responsabili dell'attività biologica dell'eparina (Stivala et al., 1967, Arch. Biochem. Biophys. 122:40). The anticoagulant activity of heparin is due to its structural characteristics, for example, the degree of sulfation, the degree of dissociation, the sequence of the COO- and SO3 "groups, the shape and size of the molecule. These factors are important for the formation of ionic bonds responsible for the biological activity of heparin (Stivala et al., 1967, Arch. Biochem. Biophys. 122: 40).
A causa dell'alta densità di carica negativa, l'eparina ha una forte affinità per i cationi e la sua attività è pH dipendente. Due to the high negative charge density, heparin has a strong affinity for cations and its activity is pH dependent.
In particolare, il gruppo N-solfatato del residuo glucosamminico ha un ruolo fondamentale nell'interazione con i fattori che regolano i processi coagulativi. In particular, the N-sulfated group of the glucosamine residue plays a fundamental role in the interaction with the factors that regulate coagulation processes.
Una riduzione significativa dei gruppi N-solfatati riduce drasticamente le attività anticoagulante e antitrombotica. A significant reduction of the N-sulfated groups drastically reduces the anticoagulant and antithrombotic activities.
Molti polisaccaridi naturali sona stati solfatati allo scopo di ottenere prodotti analoghi dell'eparina (Hoffman et al., 1982, Carbohydrate Res. Many natural polysaccharides have been sulphated in order to obtain heparin analogs (Hoffman et al., 1982, Carbohydrate Res.
2:115; Kindness et al., 1980, Brit. J. Pharmac. 69:675; Horton et al., 1973, Carbohydrate Res. 30:349; Okada et al., 1979, Makromol. Chem. 2: 115; Kindness et al., 1980, Brit. J. Pharmac. 69: 675; Horton et al., 1973, Carbohydrate Res. 30: 349; Okada et al., 1979, Makromol. Chem.
180:813; Kikuchi et al., 1979, Nippon Kagaku Kaishi 1:127; Manzac et al., 1981, Proc. Third M.I.S.A.O. 5:504). Inoltre, gruppi solforici, carbossilici o solfonati sono stati attaccati a polimeri sintetici come il polistirene (Kanmaugue et al., 1985, Biomaterials, 6:297) e i poliuretani Gto et al., 1992, Biomaterials, 13:131). 180: 813; Kikuchi et al., 1979, Nippon Kagaku Kaishi 1: 127; Manzac et al., 1981, Proc. Third M.I.S.A.O. 5: 504). Furthermore, sulfuric, carboxyl or sulfonate groups have been attached to synthetic polymers such as polystyrene (Kanmaugue et al., 1985, Biomaterials, 6: 297) and polyurethanes Gto et al., 1992, Biomaterials, 13: 131).
Tuttavia, l'attività anticoagulante di questi materiali è molto più bassa rispetto a quella dell'eparina e dipende dal tipo di sostituente, dal tipo di legame, dal grado di sostituzione e dalla sequenza. However, the anticoagulant activity of these materials is much lower than that of heparin and depends on the type of substituent, the type of bond, the degree of substitution and the sequence.
Sono note, infine, alcune reazioni chimiche di solfatazione di polisaccaridi (WO 88/00211; EP 0340628; Carbohydrate Research, 158. Finally, some chemical reactions of sulfation of polysaccharides are known (WO 88/00211; EP 0340628; Carbohydrate Research, 158.
183-190,1986) ma non sono stati ottenuti derivati che, oltre alle caratteristiche chimico-fisiche peculiari dei polisaccaridi, possedessero nuove caratteristiche, come ad esempio l'attività anticoagulante. 183-190,1986) but no derivatives have been obtained which, in addition to the specific chemical-physical characteristics of the polysaccharides, possessed new characteristics, such as anticoagulant activity.
Nella domanda di brevetto della Richiedente No. PCT/EP95/01111 viene descritto un processo di solfatazione non selettivo deU'arìdo ialuronico e dei suoi derivati per ottenere composti ad attività antitrombotica. In the Applicant's patent application No. PCT / EP95 / 01111 a non-selective sulfation process of the hyaluronic acid and its derivatives is described to obtain compounds with antithrombotic activity.
La loro capacità di inattivare la trombina dipende dalla formazione di interazioni elettrostatiche dipendenti dalla densità di carica che aumenta in funzione del grado di solfatazione, mentre l'attività della eparina è conseguenza di una interazione diretta con l'antitrombina HI (T. W. Barrowdiffe et al., Journal of Pharmaceutical & Biomedicai Analysis, Voi. 7, No. 2, pp. 217-226, 1989; Peter D.J. Grootenhuiis et al., J. Am. Chem. Soc., 113, 2743-2747, 1991). Their ability to inactivate thrombin depends on the formation of electrostatic interactions dependent on the charge density which increases as a function of the degree of sulfation, while the activity of heparin is the consequence of a direct interaction with antithrombin HI (T. W. Barrowdiffe et al. , Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, Vol. 7, No. 2, pp. 217-226, 1989; Peter D.J. Grootenhuiis et al., J. Am. Chem. Soc., 113, 2743-2747, 1991).
Nonostante il largo impiego dell'eparina, questa presenta effetti collaterali quali, ad esempio, effetti emorragici, che ne impediscono un uso indiscriminato o non monitorato da personale medico. Despite the wide use of heparin, it has side effects such as, for example, haemorrhagic effects, which prevent its indiscriminate use or not monitored by medical personnel.
Inoltre, a causa delle sue caratteristiche chimico-fisiche, l'eparina non può essere usata come biomateriale ma semplicemente come strato di ricopertura di altri materiali e in quantità tali da non provocare sanguinamelo locale. Furthermore, due to its chemical-physical characteristics, heparin cannot be used as a biomaterial but simply as a covering layer of other materials and in such quantities as not to cause local bleeding.
Infine, agendo direttamente sui fattori dèlia coagulazione, l'azione anticoagulante dell'eparina avviene in tempi molto rapidi e la durata di azione, dipendente dalla dose, è in genere altrettanto breve. Questi problemi ne limitano l’applicabilità in settori chirurgici, come ad esempio quello cardiovascolare, in cui può essere necessario rimpianto di dispositivi per i quali l'assenza di trombogenicità deve essere garantita per tempi sufficientemente lunghi. Finally, by acting directly on the coagulation factors, the anticoagulant action of heparin occurs very quickly and the duration of action, depending on the dose, is generally just as short. These problems limit its applicability in surgical sectors, such as cardiovascular, where it may be necessary to regret devices for which the absence of thrombogenicity must be guaranteed for a sufficiently long time.
La presente invenzione, invece, descrive un processo chimico che utilizza un prodotto di partenza ben caratterizzato, quale l'acido ialuronico, e permette la solfatazione selettiva del gruppo amminico della glucosammina o, anche, del gruppo ossidrilico in posizione 6, ottenendo nuovi derivati solfatati dell'acido ialuronico, con distribuzione di peso molecolare non alterata, ad attività anticoagulante paragonabile a quella dell'eparina. The present invention, on the other hand, describes a chemical process that uses a well-characterized starting product, such as hyaluronic acid, and allows the selective sulfation of the amino group of glucosamine or, also, of the hydroxyl group in position 6, obtaining new sulphated derivatives of hyaluronic acid, with an unchanged molecular weight distribution, with anticoagulant activity comparable to that of heparin.
Mentre la capacità dei polisaccaridi iper-soifatati di inattivare la trombina è conseguenza della formazione di interazioni elettrostatiche dipendenti dalla densità di carica, che aumenta in funzione del grado di solfatazione, i derivati N-solfatati descritti nella presente invenzione sembrano agire con meccanismo specifico, simile a quello dell'eparina, sui fattori della coagulazione. While the ability of hyper-soiphated polysaccharides to inactivate thrombin is a consequence of the formation of electrostatic interactions dependent on the charge density, which increases as a function of the degree of sulfation, the N-sulfated derivatives described in the present invention seem to act with a specific mechanism, similar to that of heparin, on coagulation factors.
Ulteriori vantaggi della presente invenzione sono rappresentati dalle caratteristiche chimico-fìsiche dei derivati N-solfatati, rispetto a quelle dei derivati iper-solfatati, che li rendono adatti per la preparazione di biomateriali da impiegare nel settore biomedico-sanitario e farmaceutico. Further advantages of the present invention are represented by the chemical-physical characteristics of the N-sulphated derivatives, with respect to those of the hyper-sulphated derivatives, which make them suitable for the preparation of biomaterials to be used in the biomedical-sanitary and pharmaceutical sector.
Inoltre, la possibilità di ottenere un composto ad attività anticoagulante e non-trombogenica operando una solfatazione selettiva solo dei gruppi amminici e dei gruppi ossidrilici in 6, riduce notevolmente i costi del processo rispetto alla preparazione di acido ialuronico con tutti i gruppi ossidrilici omogeneamente solfatati. Furthermore, the possibility of obtaining a compound with anticoagulant and non-thrombogenic activity by carrying out a selective sulfation only of the amino groups and of the hydroxyl groups in 6, considerably reduces the costs of the process compared to the preparation of hyaluronic acid with all the homogeneously sulphated hydroxyl groups.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invenzione descrive nuovi composti solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati, eventualmente salificati, ad attività anticoagulante e non-trombogenica, in cui le glucosammine risultano parzialmente N-solfatate o parzialmente N-solfatate e totalmente O-solfatate in posizione 6, per la preparazione di formulazioni farmaceutiche, di biomateriali biocompatibili e bioassorbibili con attività anticoagulante e per il rivestimento di oggetti biomedicali ed il processo per la loro preparazione. The present invention describes new sulphated compounds of hyaluronic acid and its derivatives, possibly salified, with anticoagulant and non-thrombogenic activity, in which the glucosamines are partially N-sulfated or partially N-sulfated and totally O-sulphated in position 6, for the preparation of pharmaceutical formulations, of biocompatible and bioabsorbable biomaterials with anticoagulant activity and for the coating of biomedical objects and the process for their preparation.
Per derivato parzialmente 2-N-solfatato dell'acido ialuronico si intende un prodotto ottenuto in seguito alla reazione di solfatazione controllata del gruppo amminico della glucosammina dell'acido ialuronico, preventivamente N-de-acetilato in accordo alla procedura descritta da P. Shaklee (1984) Biochem. J. 217, 187-197. Schematicamente la reazione procede nel seguente modo: By partially 2-N-sulfated derivative of hyaluronic acid we mean a product obtained following the controlled sulfation reaction of the amino group of the glucosamine of the hyaluronic acid, previously N-de-acetylated according to the procedure described by P. Shaklee ( 1984) Biochem. J. 217, 187-197. Schematically, the reaction proceeds as follows:
Schema 1 Scheme 1
Per derivati parzialmente 2-N-solfatati e 6-0- solfatati si intendono quei prodotti generati dalla reazione chimica illustrata nello schema 1, in cui, oltre al gruppo amminico della glucosammina, nel processo di solfatazione viene coinvolta totalmente o parzialmente la funzione ossidrilica primaria dello stesso residuo, secondo lo schema: By partially 2-N-sulphated and 6-0- sulphated derivatives we mean those products generated by the chemical reaction illustrated in scheme 1, in which, in addition to the amino group of glucosamine, the primary hydroxyl function is totally or partially involved in the sulphation process of the same residue, according to the scheme:
I derivati generati secondo gli schemi 1 e 2 possono essere impiegati come intermedi di reazione per la preparazione di composti, in accordo alla procedura descritta nel brevetto Europeo 0216453 Bl, in cui la funzione carbossilica del residuo glucuronico dell’acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato o parzialmente 2-N-solfatato e 6-0- solfatato, viene fatta reagire parzialmente o completamente con alcoli delle serie alifatica, aromatica, arilalifatica, dcloalifatica, eterociclica originando i rispettivi esteri parziali o totali: The derivatives generated according to schemes 1 and 2 can be used as reaction intermediates for the preparation of compounds, according to the procedure described in the European patent 0216453 B1, in which the carboxylic function of the glucuronic residue of the partially 2-N- hyaluronic acid sulphated or partially 2-N-sulfated and 6-0- sulfated, it is partially or completely reacted with alcohols of the aliphatic, aromatic, arylaliphatic, dcloaliphatic, heterocyclic series, giving rise to the respective partial or total esters:
Inoltre, é possibile impiegare i derivati sintetizzati secondo gli schemi 1 e 2 come intermedi per la preparazione di composti reticolati, in accordo alla procedura descritta nel brevetto Europeo 0341745 Bl, in cui una parte o la totalità dei gruppi carbossilid appartenenti al residuo D-glucuronico sono: i) fatti reagire, mediante l'impiego di agenti condensanti, con le funzioni alcoliche della stessa catena polisaccaridica o di altre catene, generando esteri interni (o lattonid) e esteri intermolecolari; ii) fatti reagire con poli-alcoli della serie alifatica, aromatica, arilalifatica , dcloalifatica, eteroddica, generando delle reticolazioni mediante catene spaziatrici. Furthermore, it is possible to use the derivatives synthesized according to schemes 1 and 2 as intermediates for the preparation of crosslinked compounds, according to the procedure described in the European patent 0341745 B1, in which part or all of the carboxylic groups belonging to the D-glucuronic residue they are: i) made to react, through the use of condensing agents, with the alcoholic functions of the same polysaccharide chain or of other chains, generating internal esters (or lactonides) and intermolecular esters; ii) reacted with poly-alcohols of the aliphatic, aromatic, arylaliphatic, dcloaliphatic, heteroddic series, generating crosslinks by means of spacer chains.
I composti cosi ottenuti possono essere impiegati per la preparazione di biomateriali da applicare in area vascolare o, comunque, in tutti gli usi che implicano contatti con il sangue o con i tessuti corporei altamente vascolarizzati in cui, oltre alle caratteristiche di biocompatibilità e biodegradabilità, dovute all’impiego dei derivati esterei dell’acido ialuronico, sia necessaria la totale non trombogenicità del biomateriale usato. The compounds thus obtained can be used for the preparation of biomaterials to be applied in the vascular area or, in any case, in all uses involving contact with blood or with highly vascularized body tissues in which, in addition to the characteristics of biocompatibility and biodegradability, due for the use of ester derivatives of hyaluronic acid, the total non-thrombogenicity of the biomaterial used is necessary.
Oltre alle suddette proprietà non-trombogenica e anticoagulante, e alle caratteristiche di biocompatibilità i derivati N-solfatati, di cui alla presente invenzione, possono anche essere impiegati vantaggiosamente come agenti antivirali (anche contro il virus dell'HIV), e antiinfiammatori, nei processi di crescita cellulare, nei sistemi di rilascio controllato dei farmaci e, più in generale, nella preparazione di composizioni farmaceutiche, in chirurgia interna, nella chirurgia os teoarticolare, in emodialisi, in cardiologia, in dermatologia, in oftalmologia, in otorinolaringoiatria, in odontologia, in ginecologia, in urologia, nella circolazione ed ossigenazione extra-corporea, nella prevenzione delle adesioni post-chirurgiche e, in particolare, nella prevenzione delle adesioni in seguito alla chirurgia endoscopia dei seni paranasali o alla chirurgia laparoscopica, negli impianti permanenti e biodegradabili, per il trattamento di infiammazioni, per accelerare la cicatrizzazione di ferite, ustioni, piaghe, ulcere della pelle. In addition to the aforementioned non-thrombogenic and anticoagulant properties, and the characteristics of biocompatibility, the N-sulfated derivatives, of the present invention, can also be used advantageously as antiviral agents (also against the HIV virus), and anti-inflammatory agents, in the processes of cell growth, in controlled drug delivery systems and, more generally, in the preparation of pharmaceutical compositions, in internal surgery, in os theoarticular surgery, in hemodialysis, in cardiology, in dermatology, in ophthalmology, in otolaryngology, in odontology, in gynecology, in urology, in extra-corporeal circulation and oxygenation, in the prevention of post-surgical adhesions and, in particular, in the prevention of adhesions following endoscopy surgery of the paranasal sinuses or laparoscopic surgery, in permanent and biodegradable implants, for the treatment of inflammations, to accelerate wound healing you, burns, sores, skin ulcers.
Questi biopolimeri possono anche essere impiegati nei processi di rivestimento di oggetti utilizzati sia in campo medico sia in altri settori dell'industria, fornendo nuove caratteristiche biologiche alla superficie del materiale impiegato come supporto. These biopolymers can also be used in the coating processes of objects used both in the medical field and in other industrial sectors, providing new biological characteristics to the surface of the material used as a support.
Gli oggetti che possono essere rivestiti sono ad esempio cateteri, tubicini, sonde, valvole cardiache, tendini artificiali, protesi ossee e cardovascolari, lenti a contatto, protesi di tessuto molle, ossigenatoli di sangue, reni, cuore, pancreas, fegato artificiali, sacche per sangue, siringhe, strumenti chirurgici, sistemi di filtrazione, strumenti da laboratorio, contenitori per colture e per la rigenerazione di cellule e tessuti, supporti per peptidi, proteine, anticorpi. Objects that can be coated are, for example, catheters, tubes, probes, heart valves, artificial tendons, bone and cardovascular prostheses, contact lenses, soft tissue prostheses, blood oxygenators, kidneys, heart, pancreas, artificial liver, bags for blood, syringes, surgical instruments, filtration systems, laboratory instruments, containers for cultures and for the regeneration of cells and tissues, supports for peptides, proteins, antibodies.
Il processo di rivestimento della superficie di tali oggetti, mediante la tecnica del Plasma Coating, è descritto nella domanda di brevetto internazionale W096/24392, depositata dallo stesso titolare della presente, e più in seguito illustrata in un esempio di preparazione. The process of coating the surface of such objects, by means of the Plasma Coating technique, is described in the international patent application W096 / 24392, filed by the same owner hereof, and illustrated later in an example of preparation.
I nuovi derivati N-solfatati possono essere resi disponibili in forma di gel, creme o unguenti o costituire biomateriali nelle forme di spugne, pellicole, fili, tamponi, tessuto non tessuto, microsfere, tubicini a seconda degli usi terapeutici cui sono destinati. The new N-sulfated derivatives can be made available in the form of gels, creams or ointments or constitute biomaterials in the forms of sponges, films, threads, pads, non-woven fabric, microspheres, tubes depending on the therapeutic uses for which they are intended.
Infine, i composti solfatati ottenuti secondo il processo della presente invenzione possono essere utilizzati per la preparazione di sali con i metalli pesanti, dove per metalli pesanti si intendono gli elementi del 4°, 5°, 6° periodo della tavola periodica come, ad esempio, l'argento, il ferro, cobalto, il rame, lo zinco, l’arsenico, lo stronzio, lo zirconio, l’antimonio, l'oro, il cerio, il tungsteno, il selenio. Tali sali possono essere utilizzati in dermatologia, in oftalmologia, in odontostomatologia, in reumatologia, in urologia, in ginecologia, in chirurgia interna, come integratori alimentari, agenti anti-ossidanti, antireumatici, antitumorali, antiinfiammatori, analgesici, antiulcera. Il processo per la preparazione dei composti di cui alla presente domanda di brevetto consiste essenzialmente di due fasi, la prima delle quali é relativa alla N-de-acetilazione controllata del polisaccaride nativo, mentre la successiva è riferita alle reazioni di solfatazione specifica delle funzioni amminiche libere o ossidriliche primarie della glucosammina. Finally, the sulphated compounds obtained according to the process of the present invention can be used for the preparation of salts with heavy metals, where by heavy metals we mean the elements of the 4th, 5th, 6th period of the periodic table such as, for example , silver, iron, cobalt, copper, zinc, arsenic, strontium, zirconium, antimony, gold, cerium, tungsten, selenium. These salts can be used in dermatology, ophthalmology, odontostomatology, rheumatology, urology, gynecology, internal surgery, as food supplements, antioxidant, antirheumatic, antitumor, anti-inflammatory, analgesic, anti-ulcer agents. The process for the preparation of the compounds referred to in the present patent application essentially consists of two phases, the first of which relates to the controlled N-de-acetylation of the native polysaccharide, while the subsequent relates to the specific sulfation reactions of the amino functions free or primary hydroxyls of glucosamine.
Frazioni di acido ialuronico di fonte biologica e fermentativa di peso molecolare compreso tra 5.000 Da e 5.000.000 Da, preferibilmente tra 50.000 Da e 300.000 Da, sono solubilizzati in idrazina idrossido di purezza non inferiore al 98%, in concentrazione compresa tra 1 e 50 mg/ml, preferibilmente tra il 5 e 25 mg/ml. Alla soluzione viene, quindi, aggiunta l'idrazina solfato in concentrazione peso/ volume variabile tra 0.1 e 3%, preferibilmente 1%. Fractions of hyaluronic acid from biological and fermentation sources with a molecular weight between 5,000 Da and 5,000,000 Da, preferably between 50,000 Da and 300,000 Da, are solubilized in hydrazine hydroxide of purity not less than 98%, in a concentration between 1 and 50 mg / ml, preferably between 5 and 25 mg / ml. Hydrazine sulphate is then added to the solution in a weight / volume concentration varying between 0.1 and 3%, preferably 1%.
La reazione viene condotta alle temperature comprese tra 40 e 90 °C, preferibilmente 60°C, sotto agitazione, per un tempo che é dipendente dal grado di N-de-acetilazione desiderato. The reaction is carried out at temperatures between 40 and 90 ° C, preferably 60 ° C, under stirring, for a time which depends on the desired degree of N-de-acetylation.
La seguente tabella 1 riporta la resa espressa dalla percentuale di gruppi amminid liberi, in funzione del tempo espresso in ore di reazione: The following table 1 shows the yield expressed by the percentage of free amino groups, as a function of the time expressed in hours of reaction:
La reazione viene- quindi bloccata mediante precipitazione con un solvente polare,’ preferibilmente etanolo. Il precipitato, seccato parzialmente sotto vuoto, é trattato con una soluzione di addo iodico di molari tà compresa tra 0,1 e 1M, preferibilmente 0,5M e, infine, con addo iodidrico alla concentrazione di 57% (p/v). n pH della soluzione é mantenuto tra 5 e 7 mediante aggiunte di una soluzione di sodio acetato a 10% p/v. The reaction is then stopped by precipitation with a polar solvent, preferably ethanol. The precipitate, partially dried under vacuum, is treated with an iodine solution having a molarity of between 0.1 and 1M, preferably 0.5M and, finally, with hydrogen iodide at a concentration of 57% (w / v). The pH of the solution is maintained between 5 and 7 by adding a 10% w / v sodium acetate solution.
La fase acquosa contenente il polisaccaride modificato é estratta per ripetuti trattamenti con dietiletere e quindi, dopo completa scomparsa del colore giallo, la soluzione viene trattata ancora con etanolo. The aqueous phase containing the modified polysaccharide is extracted by repeated treatments with diethyl ether and then, after complete disappearance of the yellow color, the solution is treated again with ethanol.
Il precipitato formatosi, dopo ulteriore essiccamento a 40°C, é solubilizzato in acqua ad una concentrazione compresa tra 10 e 40 mg/ml, preferibilmente 25 mg/ml, e la soluzione é fatta percolare attraverso una colonna contenente una resina a scambio ionico attivata con un tetralchilammonio idrossido, dove il residuo alchilico del'ammonio quaternario é costituito da una catena di atomi di carbonio compresa tra 1 e 4; preferibilmente viene impiegato il tetrabutilammonio idrossido. The precipitate formed, after further drying at 40 ° C, is solubilized in water at a concentration between 10 and 40 mg / ml, preferably 25 mg / ml, and the solution is percolated through a column containing an activated ion exchange resin. with a tetralkylammonium hydroxide, where the alkyl residue of the quaternary ammonium consists of a chain of carbon atoms comprised between 1 and 4; tetrabutylammonium hydroxide is preferably used.
Il percolato, rappresentato dal sale di ammonio quaternario del polisaccaride modificato, viene quindi liofilizzato. " The leachate, represented by the quaternary ammonium salt of the modified polysaccharide, is then lyophilized. "
Preparazione del derivato parzialmente 2-N-soÌfatató: metodo A Il sale d'ammonio quaternario, preferibilmente di tetrabutìlammònio, del polisaccaride parzialmente N-de-acetilato, viene solubilizzato in un solvente apolare come dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide, N-metil-pirrolidòne, preferibilmente dimetilformammide (DMFA), alla concentrazione compresa tra 5 e 50 mg/ml, (preferibilmente 25 mg/ml). Preparation of the partially 2-N-sulfated derivative: method A The quaternary ammonium salt, preferably of tetrabutylammonium, of the partially N-de-acetylated polysaccharide, is solubilized in an apolar solvent such as dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-pyrrolidone , preferably dimethylformamide (DMFA), at a concentration ranging from 5 to 50 mg / ml, (preferably 25 mg / ml).
Alla soluzione organica viene aggiunta una seconda soluzione ottenuta solubilizzando il complesso solfatante, costituito da dimetilformammide solfotriossido (DMFA-SO3), in DMFA, in concentrazione variabile tra 50 e 200 mg/ml e preferibilmente 100 mg/ml. La quantità di complesso da usare, espressa come moli di SO3, risulta sorprendentemente equivalente alle moli di gruppi amminici liberati attraverso la reazione di N-de-acetilazione. A second solution is added to the organic solution obtained by solubilizing the sulfating complex, consisting of dimethylformamide sulfotroxide (DMFA-SO3), in DMFA, in a concentration varying between 50 and 200 mg / ml and preferably 100 mg / ml. The amount of complex to be used, expressed as moles of SO3, is surprisingly equivalent to the moles of amino groups released through the N-de-acetylation reaction.
La reazione di solfatazione procede a temperature comprese tra 0° e 20°C, preferibilmente a 4°C per un tempo non inferiore a 4 ore; e viene infine bloccata per aggiunta di acqua distillata fredda. The sulphation reaction proceeds at temperatures between 0 ° and 20 ° C, preferably at 4 ° C for a time of not less than 4 hours; and is finally blocked by adding cold distilled water.
Una prima purificazione dal solvente di reazione é ottenuta precipitando l'addo ialuronico parzialmente 2-N-solfatato con etanolo e sottoponendo, quindi, il prodotto risolubilizzato a dialisi contro acqua distillata. A first purification from the reaction solvent is obtained by precipitating the partially 2-N-sulfated hyaluronic addus with ethanol and then subjecting the resolubilized product to dialysis against distilled water.
Infine, la soluzione viene liofilizzata e il prodotto solido ottenuto é sottoposto a caratterizzazione chimico-analitica per determinare il grado di N-solfatazione e il peso molecolare medio (Tabella 2). Finally, the solution is lyophilized and the solid product obtained is subjected to chemical-analytical characterization to determine the degree of N-sulfation and the average molecular weight (Table 2).
Preparazione del derivato parzialmente 2-N-solfatato, 6-O-solfatato: metodo B Preparation of the partially 2-N-sulfated, 6-O-sulfated derivative: method B
Il sale d'ammonio quaternario, preferibilmente di tetrabutilammonio, del polisaccaride parzialmente N-de-acetilato, viene solubilizzàto in un solvente apolare come dimetilsolfossido, dimetilformammide, dimetilacetammide, N-metil-pirrolidonè, preferibilmente dimetilformammide (DMFA), alla concentrazione compresa tra 5 e 50 mg /mi, preferibilmente 30 mg/ mi. The quaternary ammonium salt, preferably of tetrabutylammonium, of the partially N-de-acetylated polysaccharide, is solubilized in an apolar solvent such as dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-pyrrolidone, preferably dimethylformamide (DMFA), at a concentration ranging from 5 and 50 mg / ml, preferably 30 mg / ml.
Alla soluzione organica viene aggiunta un'altra soluzione ottenuta solubilizzando il complesso solfatante, costituito da dimetilformammide solfotriossidò (DMFA-S03), in DMFA, in concentrazione variabile tra 50 e 200 mg/ml e preferibilmente 100 mg/ mi. La quantità di complesso utilizzato, espressa come moli di SO3, risulta sorprendentemente equivalente alle moli di gruppi amminici liberi dopo la reazione di N-de-acetilazione: To the organic solution is added another solution obtained by solubilizing the sulfating complex, consisting of sulfotriioxidized dimethylformamide (DMFA-S03), in DMFA, in a concentration varying between 50 and 200 mg / ml and preferably 100 mg / ml. The amount of complex used, expressed as moles of SO3, is surprisingly equivalent to the moles of free amino groups after the N-de-acetylation reaction:
La reazione di solfatazionè procede a temperature comprese tra 0° e 20°C, preferibilmente a 4°C- per 4 ore. Viene quindi aggiunta una soluzione preparata solubilizzando il complesso piridino-solfòtriòssido in dimetilsolfossido in quantità tale che il rapporto tra le moli di SO3 dell'agente solfatante e le moli di -CH2OH sia compréso tra 1,1 e 1,3. Quantità più elevate di reagente potrebbero favorire eventuali reazioni di sostituzione in altri gruppi alcoolici (secondari) della catena polisaccaridica. The sulfation reaction proceeds at temperatures between 0 ° and 20 ° C, preferably at 4 ° C - for 4 hours. A solution prepared by solubilizing the pyridino-sulphorus oxide complex in dimethylsulfoxide is then added in a quantity such that the ratio between the SO3 moles of the sulfating agent and the moles of -CH2OH is compressed between 1.1 and 1.3. Higher quantities of reagent could favor possible substitution reactions in other (secondary) alcohol groups of the polysaccharide chain.
La reazione procede, quindi, ulteriormente per almeno 16 ore e viene bloccata per aggiunta di acqua distillata fredda. The reaction then proceeds further for at least 16 hours and is stopped by adding cold distilled water.
Tutte le fasi successive riguardanti la purificazione del polisaccaride modificato sono quelle descritte nel 'metodo A'. All subsequent steps concerning the purification of the modified polysaccharide are those described in 'method A'.
La caratterizzazione analitica eseguita sui derivati ottenuti, conferma che il metodo di solfatazione porta sorprendentemente non solo a sostituire tutti i gruppi amminici ottenuti dalla parziale N-deacetilazione, ma anche alla completa sostituzione del gruppo alcolico primario del residuo glucosamminico dell'acido ialuronieo (Tabella^). - The analytical characterization performed on the derivatives obtained confirms that the sulfation method surprisingly leads not only to the replacement of all the amino groups obtained from the partial N-deacetylation, but also to the complete replacement of the primary alcoholic group of the glucosamine residue of the hyaluronic acid (Table ^ ). -
11 'metodo B' permette, inoltre, variando le quantità molari del complesso piridin-S03 in funzione dei gruppi ossidrilici primari (rapporto molare compreso tra 0,1 e 1), di poter ottenere una serie di derivati parzialmente 2-N-solfatati e parzialmente 6-O-solfatati. Furthermore, by varying the molar quantities of the pyridine-S03 complex as a function of the primary hydroxyl groups (molar ratio between 0.1 and 1), the 'method B' allows to obtain a series of partially 2-N-sulphated derivatives and partially 6-O-sulfated.
Attività biologica Biological activity
I composti preparati come precedentemente descritto sono caratterizzati dal punto di vista biologico in modo tale da determinarne l'attività anticoagulante. Come prodotti di riferimento sono stati considerati i derivati solfatati del'acido ialuronico ottenuti secondo il metodo descritto nella domanda di brevetto PCT/EP95/01111 della Richiedente, dove i gruppi ossidrilid, primari e secondari, della catena polimerica vengono sostituiti con gruppi -SO3· in funzione della quantità di agente solfatante impiegata. Inoltre, come ulteriore prodotto di riferimento, viene impiegata l'eparina non-frazionata (Hep UF), il cui utilizzo come farmaco anticoagulante é da molti decenni largamente riconosduto. The compounds prepared as described above are characterized from the biological point of view in such a way as to determine their anticoagulant activity. The sulphated derivatives of hyaluronic acid obtained according to the method described in the Applicant's patent application PCT / EP95 / 01111 were considered as reference products, where the primary and secondary hydroxylid groups of the polymeric chain are replaced with -SO3 groups. depending on the amount of sulphating agent used. Furthermore, as a further reference product, non-fractionated heparin (Hep UF) is used, whose use as an anticoagulant drug has been widely recognized for many decades.
E' stato quindi determinato il tempo di trombina (TT test) e il tempo di coagulazione del sangue intero (WBCT) per i seguenti composti: Thrombin time (TT test) and whole blood clotting time (WBCT) were then determined for the following compounds:
La capacità dei derivati N-solfatati di aumentare il tempo di coagulazione del sangue viéné misurata mèdiante il tèst del tèmpo di trombina condótto utilizzando un coàgulometro.- Viene determinato il tempo necessario per trasformare il fibrinogeno in fibrina dopo aggiunta di trombina in un campione di sangue in presenza, però, del polimero usato come materiale di partenza. Oltre i 120 secondi la prova non è più significativa. Il tempo di coagulazióne viene' determinato semplicemente andando a vedere il tempo impiegato per coagulare un campione di sangue umano in presenza del materiale da testare. Un tempo superiore alle due ore non viene considerato. The ability of N-sulfated derivatives to increase blood clotting time is measured by means of thrombin tea time conducted using a coagulometer - The time required to transform fibrinogen into fibrin after addition of thrombin in a blood sample is determined in the presence, however, of the polymer used as starting material. Beyond 120 seconds the test is no longer significant. The coagulation time is determined simply by looking at the time taken to coagulate a human blood sample in the presence of the material to be tested. A time exceeding two hours is not considered.
I risultati dei tests sono riportati nella seguente tabella 4: The results of the tests are reported in the following table 4:
Sorprendentemente, appare chiaro come la modifica chimica coinvolgente il gruppo amminico del residuo glucosamminico della catena polisaccaridica, induca un notevole effetto sul tempo di coagulazione. Questo identico risultato può essere ottenuto solo modificando drasticamente la struttura chimica di HA, sostituendo cioè tutti gli ossidrili disponibili per unità, monomerica (quattro) con altrettanti gruppi solfonici. . Surprisingly, it is clear that the chemical modification involving the amino group of the glucosamine residue of the polysaccharide chain induces a notable effect on the coagulation time. This identical result can only be obtained by drastically modifying the chemical structure of HA, replacing all the hydroxyls available per monomeric unit (four) with as many sulphonic groups. .
Dai dati risulta evidente che é sufficente un grado di solfatazione 0,25, derivante dalla preventiva N-de-acetilazione e successiva N-solfatazione, per agire in modo specifico con i fattori coinvolgenti la parte terminale della cascata coagulativa, inibendo quindi il processo di trasformazione del fibrinogeno in fibrina (attività anticoagulante). La presenza del gruppo solforico in posizione 6-0 del residuo glucosamminico, sembra non essere determinante per esplicare questa attività. Esso, tuttavia, in associazione con gruppi 2-N solfatati, può avere un ruolo determinante nell'inibizione del fattore Xa attraverso l'interazione con ΑΊΊΠ (attività antitrombotica) e nell'inibizione del fattore Villa (o di wWF) per regolare l'attivazione piastrinica e la proliferazione di esse. From the data it is evident that a 0.25 degree of sulfation is sufficient, deriving from the preventive N-de-acetylation and subsequent N-sulfation, to act specifically with the factors involving the terminal part of the coagulation cascade, thus inhibiting the process of transformation of fibrinogen into fibrin (anticoagulant activity). The presence of the sulfuric group in the 6-0 position of the glucosamine residue does not seem to be decisive for carrying out this activity. However, in association with sulfated 2-N groups, it may play a decisive role in the inhibition of factor Xa through the interaction with ΑΊΊΠ (antithrombotic activity) and in the inhibition of the factor Villa (or wWF) to regulate the platelet activation and their proliferation.
.Caratterizzazione analitica . Analytical characterization
Tutti di derivati preparati e descritti nella presente invenzione sono stati caratterizzati sotto il profilo chimico-analitico. A tal proposito sono state applicate le seguenti metodologie analitiche: All of the derivatives prepared and described in the present invention have been characterized under the chemical-analytical profile. In this regard, the following analytical methodologies were applied:
- grado di solfatazione (% di zolfo): il prodotto, dopo completa combustione in ambiente ricco di ossigeno, viene analizzato in HPLC utilizzando la tecnica della cromatografìa ionica. - degree of sulphation (% sulfur): the product, after complete combustion in an oxygen-rich environment, is analyzed in HPLC using the ion chromatography technique.
- percentuale di 2-N-solfatazione: viene determinata indirettamente mediante la misura dei gruppi solfonici totali presenti e la determinazione degli stessi dopo N-de-solfatazione del prodotto utilizzando il metodo descritto da Nagasawa (Carbohy. Res. 1977, 58, pag. 47-55). La differenza tra i due valori rappresenta la quantità di gruppi SO3" legati al gruppo amminico della glucosammina. - percentage of 2-N-sulfation: it is determined indirectly by measuring the total sulphonic groups present and determining them after N-de-sulfation of the product using the method described by Nagasawa (Carbohy. Res. 1977, 58, p. 47-55). The difference between the two values represents the quantity of SO3 "groups bound to the amino group of glucosamine.
- percentuale di N-de-acetilazione: viene determinata con il metodo descritto da J. Riesenfeld (Analy. Bioch. 1990, voi; 188, pagg. 383-389). - percentage of N-de-acetylation: it is determined with the method described by J. Riesenfeld (Analy. Bioch. 1990, vol; 188, pp. 383-389).
- Peso molecolare medio: viene determinato mediante GPC, utilizzando un set di colonne Shadex B-803 e B-806, un rilevatore MALLS (muti-angle-laser-light-scattering) e un rivelatore RI (indice di rifrazione). - Average molecular weight: determined by GPC, using a set of Shadex B-803 and B-806 columns, a MALLS (muti-angle-laser-light-scattering) detector and an RI (refractive index) detector.
ESEMPI EXAMPLES
Esempio 1 Example 1
Prpparagione di addo ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui cali 5% dei gruppi N-acetilid sono sostituiti da gruppi solfato) Partially 2-N-sulfated hyaluronic addus (in which 5% drops of the N-acetylid groups are replaced by sulfate groups)
1.00 gr di HA ottenuto da creste di gallo di peso molecolare medio 181.000 Da, vengono solubilizzati in 50 ml di idrazina monoidrato insieme a 0,5 gr di idrazina solfato. 1.00 g of HA obtained from cockscombs of average molecular weight 181,000 Da, are solubilized in 50 ml of hydrazine monohydrate together with 0.5 g of hydrazine sulphate.
La reazione procede per 8 ore a 60°C mantenendo la soluzione sotto agitazione, ed é quindi bloccata dall'aggiunta di 100 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridotta. The reaction proceeds for 8 hours at 60 ° C keeping the solution under stirring, and is then stopped by the addition of 100 ml of ethanol. The formed gelatinous precipitate is washed with ethanol and then dried at room temperature under reduced pressure.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 50 ml di acqua e 20 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 25 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasdato reagire, sotto continua agitazione, per arca 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 5 ml di una soluzione al 57% di addo iodidrico. Quest'ultitma operazione é preferibilmente condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiaccio. La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 30 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Infine, quest'ultima viene concentrata -a pressione ridotta e alla temperatura di 40°C- fino ad un volume di ca. 40 mi. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 20 ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido. The intermediate is solubilized in a mixture consisting of 50 ml of water and 20 ml of a 10% sodium acetate solution, and finally treated with 25 ml of an iodine solution of 0.5 M concentration. reacting, under continuous stirring, for about 30 min, the excess iodine is titrated with 5 ml of a 57% solution of iodide. This last operation is preferably carried out by keeping the reaction container cold by means of ice. The solution, of intense brown color, is then treated for at least 5 times, with aliquots of 30 ml of diethyl ether in order to extract the reaction residues from the aqueous solution containing the modified polymer. Finally, the latter is concentrated - at reduced pressure and at a temperature of 40 ° C - up to a volume of approx. 40 mi. and percolated through a pre-filled column with 20 ml of ion-exchange sulphonic resin activated with a 40% w / v solution of tetrabutylammonium hydroxide.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta e quindi sottoposta a ciclo di liofilizzazione. The aqueous solution containing the modified polysaccharide in the form of tetrabutylammonium salt (HATBA) is collected and then subjected to a freeze-drying cycle.
1,30 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 45 ml di dimetilformammide e alla soluzione, così ottenuta, vengono aggiunti 0,6 ml di soluzione ala concentrazione di 50 mg/ ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 5 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione ed é infine bloccata per aggiunta di 45 ml di acqua distillata fredda. Dopo aver neutralizzato la soluzione con NaOH 2 M, portandola a pH compresi tra 7,5 e 8, essa viene filtrata attraverso un gooch di porosità G2 e trattata con 250 ml di etanolo. Il precipitato formatosi, dopo esser stato lavato con almeno 150 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 50 ml di acqua distillata e quindi dializzato contro 50 volumi di acqua. 1.30 g of lyophilized HA salt of TBA are solubilized in 45 ml of dimethylformamide and 0.6 ml of solution at a concentration of 50 mg / ml of N-N dimethylformamide sulphotroxide complex are added to the solution. The reaction proceeds for 5 hours at 4 ° C under continuous and moderate stirring and is finally stopped by adding 45 ml of cold distilled water. After neutralizing the solution with 2 M NaOH, bringing it to pH between 7.5 and 8, it is filtered through a gooch of porosity G2 and treated with 250 ml of ethanol. The precipitate formed, after having been washed with at least 150 ml of ethanol and dried for at least 16 hours under vacuum, is resolubilized in 50 ml of distilled water and then dialyzed against 50 volumes of water.
Infine, dopo liofilizzazione, il prodoto viene caraterizzato al fine di deterrminare la percentuale di gruppi amminici N-sostituiti e il peso molecolare medio. Finally, after lyophilization, the product is characterized in order to determine the percentage of N-substituted amino groups and the average molecular weight.
Peso del prodotto liofilizzato: 0,72 gr; resa: 85 % Weight of the lyophilized product: 0.72 gr; yield: 85%
moli di S03'/moli HA (unità monomerica): 0,045 moles of SO3 '/ moles HA (monomer unit): 0.045
moli di gruppi -NH2 liberi /mole di HA: 0,052 moles of free -NH2 groups / mol of HA: 0.052
% di de-N-acetilazione: 5,2% % de-N-acetylation: 5.2%
% di ri-N-solfatazione: 4,5% % re-N-sulfation: 4.5%
Resa reazione di N-solfatazione: 87% Yield of N-sulfation reaction: 87%
Peso molecolare medio: 174.000 Da Average molecular weight: 174,000 Da
Esempio 2 Example 2
Preparazione di acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui ca. il 25% dei gruppi N-acetilici sono sostituiti da gruppi solfato) Preparation of partially 2-N-sulfated hyaluronic acid (in which approx. 25% of the N-acetyl groups are replaced by sulphate groups)
1,2 gr di HA otenuto da creste di gallo di peso molecolare medio 181.000 Da, vengono solubilizzati in 60 ml di idrazina monoidrato insieme a 0,6 gr di idrazina solfato. 1.2 g of HA obtained from cockscombs with an average molecular weight of 181,000 Da, are solubilized in 60 ml of hydrazine monohydrate together with 0.6 g of hydrazine sulphate.
La reazione procede per 24 ore a 60°C mantenendo la soluzione soto agitazione, ed é quindi bloccata dall'aggiunta di 120 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridota. The reaction proceeds for 24 hours at 60 ° C keeping the solution under stirring, and is then stopped by the addition of 120 ml of ethanol. The formed gelatinous precipitate is washed with ethanol and then dried at room temperature under reduced pressure.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 60 ml di acqua e 25 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 30 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasciato reagire, sotto continua agitazione, per circa 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 6 ml di una soluzione al 57% di addo iodidrico. Quest'ultitma operazione viene, preferibilmente, condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiacrio. The intermediate is solubilized in a mixture consisting of 60 ml of water and 25 ml of a 10% sodium acetate solution, and finally treated with 30 ml of an iodine solution of 0.5 M concentration. reacting, under continuous stirring, for about 30 min, the excess iodine is titrated with 6 ml of a 57% solution of iodide. This latter operation is preferably carried out by keeping the reaction vessel cold by means of ice.
La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 40 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Quest'ultima viene, infine, concentrata, a pressione ridotta e alla temperatura di 40°C, fino ad un volume di ca. 50 mi. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 25 ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido. The solution, of intense brown color, is then treated for at least 5 times, with aliquots of 40 ml of diethyl ether in order to extract the reaction residues from the aqueous solution containing the modified polymer. The latter is finally concentrated, under reduced pressure and at a temperature of 40 ° C, up to a volume of approx. 50 mi. and percolated through a pre-filled column with 25 ml of ion-exchange sulphonic resin activated with a 40% w / v solution of tetrabutylammonium hydroxide.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta e quindi sottoposta a ciclo di liofilizzazione. The aqueous solution containing the modified polysaccharide in the form of tetrabutylammonium salt (HATBA) is collected and then subjected to a freeze-drying cycle.
1,65 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 55 ml di dimetilfonnammide e alla soluzione, così ottenuta, vengono aggiunti 3,0 ml di soluzione alla concentrazione di 50 mg/ ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 6 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione e, viene, infine, bloccata per aggiunta di 55 ml di acqua distillata fredda. Dopo aver neutralizzato la soluzione con NaOH 2 M, portandola a pH compresi tra 7,5 e 8, essa viene filtrata attraverso un gooch di porosità G2 e trattata con 300 ml di etanolo. 1.65 g of lyophilized HA salt of TBA are solubilized in 55 ml of dimethylphonnamide and 3.0 ml of solution at a concentration of 50 mg / ml of N-N dimethylformamide sulfotroxide complex are added to the solution. The reaction proceeds for 6 hours at 4 ° C under continuous and moderate stirring and is finally stopped by adding 55 ml of cold distilled water. After neutralizing the solution with 2 M NaOH, bringing it to pH between 7.5 and 8, it is filtered through a gooch of porosity G2 and treated with 300 ml of ethanol.
Il precipitato formatosi dopo essere stato lavato con almeno 150 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 50 ml di acqua distillata e quindi diefizzato contro 50 volumi di acqua. Infine, dopo liofilizzazione, il prodotto viene caratterizzato al fine di deterrminare la percentuale di gruppi amminici N-sostituiti e il peso molecolare medio. The precipitate formed after being washed with at least 150 ml of ethanol and dried for at least 16 hours under vacuum, is resolubilized in 50 ml of distilled water and then diephized against 50 volumes of water. Finally, after lyophilization, the product is characterized in order to determine the percentage of N-substituted amino groups and the average molecular weight.
Peso del prodotto liofilizzato: 0,98 gr; resa: 89 % Weight of the lyophilized product: 0.98 gr; yield: 89%
moli di SO 3"/moli HA (unità monomerica): 0,23 moles of SO 3 "/ moles HA (monomer unit): 0.23
moli di gruppi -NH2 liberi/mole di HA: 0,24 moles of free -NH2 groups / mol of HA: 0.24
% di de-N-acetilazione: 24 % % de-N-acetylation: 24%
% di ri-N-solfatazione: 23 % % re-N-sulfation: 23%
Resa reazione di N-solfatazione: 96 % Yield of N-sulfation reaction: 96%
Peso molecolare medio: 161.000 Da Average molecular weight: 161,000 Da
Esempio 3 Example 3
Preparazione di acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (in cui cali 25% dei gruppi N-acetilici sono sostituiti da gruppi solfato) e 6-0-solfatato Preparation of partially 2-N-sulfated hyaluronic acid (in which 25% drops of the N-acetyl groups are replaced by sulfate groups) and 6-0-sulfated
5.0 gr di HA ottenuto da fermentazione, di peso molecolare medio 195.000 Da, vengono solubilizzati in 250 ml di idrazina monoidrato insieme a 2,5 gr di idrazina solfato. 5.0 g of HA obtained from fermentation, with an average molecular weight of 195,000 Da, are solubilized in 250 ml of hydrazine monohydrate together with 2.5 g of hydrazine sulphate.
La reazione procede per 24 ore a 60°C mantenendo la soluzione sotto agitazione, e viene quindi bloccata dall'aggiunta di 500 ml di etanolo. Il precipitato gelatinoso formatosi viene lavato con etanolo e quindi seccato a temperatura ambiente a pressione ridotta. The reaction proceeds for 24 hours at 60 ° C while maintaining the solution under stirring, and is then stopped by the addition of 500 ml of ethanol. The formed gelatinous precipitate is washed with ethanol and then dried at room temperature under reduced pressure.
L'intermedio viene solubilizzato in una miscela cosituita da 250 ml di acqua e 105 ml di una soluzione di acetato di sodio al 10%, e infine trattato con 125 ml di una soluzione di addo iodico di concentrazione 0,5 M. Dopo aver lasdato reagire, sotto continua agitazione, per drca 30 min, si titola l'eccesso di iodio con 25 ml di una soluzione al 57% di acido iodidrico. Quest'ultima operazione viene, preferibilmente, condotta mantenendo il contenitore di reazione freddo mediante ghiacdo. The intermediate is solubilized in a mixture consisting of 250 ml of water and 105 ml of a 10% sodium acetate solution, and finally treated with 125 ml of an iodine solution of 0.5 M concentration. reacting, under continuous stirring, for about 30 min, the excess iodine is titrated with 25 ml of a 57% solution of hydrogen iodide. This latter operation is preferably carried out by keeping the reaction container cold by means of ice.
La soluzione, di colore bruno intenso, viene quindi trattata per almeno 5 volte, con aliquote di 150 ml di dietiletere allo scopo di estrarre i residui di reazione dalla soluzione acquosa contenente il polimero modificato. Quest'ultima viene infine concentrata, sotto pressione ridotta e alla temperatura di 40°C, fino ad un volume di ca. 200 ml. e fatta percolare attraverso una colonna preriempita con 10Ò ml di resina solfonica a scambio ionico attivata con una soluzione al 40% p/v di tetrabutilammonio idrossido. The solution, of an intense brown color, is then treated for at least 5 times, with aliquots of 150 ml of diethyl ether in order to extract the reaction residues from the aqueous solution containing the modified polymer. The latter is finally concentrated, under reduced pressure and at a temperature of 40 ° C, up to a volume of approx. 200 ml. and percolated through a pre-filled column with 10Ò ml of ion-exchange sulphonic resin activated with a 40% w / v solution of tetrabutylammonium hydroxide.
La soluzione acquosa contenente il polisaccaride modificato in forma di sale di tetrabutilammonio (HATBA) viene raccolta, e quindi sottoposta a ddo di liofilizzazione. The aqueous solution containing the modified polysaccharide in the form of tetrabutylammonium salt (HATBA) is collected, and then subjected to freeze drying.
6,0 gr di HA sale di TBA liofilizzato vengono solubilizzati in 300 ml di dimetilformammide, e alla soluzione così ottenuta vengono aggiunti 13 ml di soluzione alla concentrazione di 50 mg/ml di complesso N-N dimetilformammide solfotriossido. La reazione procede per 6 ore a 4°C sotto continua e moderata agitazione. 6.0 g of lyophilized HA salt of TBA are solubilized in 300 ml of dimethylformamide, and 13 ml of solution at a concentration of 50 mg / ml of N-N dimethylformamide sulfotroxide complex are added to the solution thus obtained. The reaction proceeds for 6 hours at 4 ° C under continuous and moderate stirring.
Una seconda soluzione, costituita da 40 ml di complesso piridinsolfotriossido solubilizzato in dimetilsolfossido alla concentrazione di 50 mg/ml, viene aggiunta alla miscela di reazione. A second solution, consisting of 40 ml of pyridinsulfotroxide complex solubilized in dimethylsulfoxide at a concentration of 50 mg / ml, is added to the reaction mixture.
Dopo circa 16 ore, vengono aggiunti 250 ml di acqua distillata fredda e in seguito alla neutralizzazione con NaOH 2 M, fino a pH 8, la soluzione viene filtrata attraverso un gooch di porosità G3 e trattata con 1.250 ml di etanolo. After about 16 hours, 250 ml of cold distilled water are added and following neutralization with 2 M NaOH, up to pH 8, the solution is filtered through a gooch of porosity G3 and treated with 1,250 ml of ethanol.
Il precipitato formatosi, dopo esser stato lavato con almeno 500 ml di etanolo e seccato per almeno 16 ore sotto-vuoto, viene risolubilizzato in 250 ml di acqua distillata e quindi dializzato contro 50 volumi di acqua. Infine, dopo liofilizzazione, il prodotto viene caratterizzato al fine di determinare la percentuale di gruppi amminid N-sostituiti, il grado di 6-O-solfatazione e il peso molecolare medio The precipitate formed, after having been washed with at least 500 ml of ethanol and dried for at least 16 hours under vacuum, is resolubilized in 250 ml of distilled water and then dialyzed against 50 volumes of water. Finally, after lyophilization, the product is characterized in order to determine the percentage of N-substituted aminid groups, the degree of 6-O-sulfation and the average molecular weight.
Peso del prodotto liofilizzato: 4,12 gr; resa: 82 % Weight of the lyophilized product: 4.12 gr; yield: 82%
moli di S03"/moli HA (unità monomerica): 1,24 moles of SO3 "/ moles HA (monomer unit): 1.24
moli di gruppi -NH2 liberi /mole di HA: 0,26 moles of free -NH2 groups / mol of HA: 0.26
% di de-N-acetilazione: 26 % % de-N-acetylation: 26%
% di ri-N-solfatazione: 24 % % re-N-sulfation: 24%
% di O-solfatazione: 100 % % O-sulfation: 100%
Peso molecolare medio: .000 Da Average molecular weight: .000 Da
Esempio 4 Example 4
Preparazione dell'estere benzilico di acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatato. Preparation of the benzyl ester of partially N-sulfated and O-sulfated hyaluronic acid.
2,00 gr del derivato ottenuto nell'esempio 3 vengono solubilizzati in 100 mi di acqua distillata e la soluzione viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 40 ml di resina a scambio ionico attivata con tetrabutilammonio idrossido (forma TBA+). Dopo liofilizzazione dell’eluato vengono ottenuti 3,3 gr di prodotto. 2.00 g of the derivative obtained in example 3 are solubilized in 100 ml of distilled water and the solution is percolated through a glass column pre-filled with 40 ml of ion exchange resin activated with tetrabutylammonium hydroxide (form TBA +). After lyophilization of the eluate, 3.3 g of product are obtained.
Questi , dopo solubilizzazione in una miscela costituita da 130 ml di N-metil pirrolidone e 1,3 ml di acqua, vengono fatti reagire a 4°C con 0,29 mi di benzil bromuro. La reazione procede per 48 ore a 28°C, mantenendo la soluzione sotto agitazione e al riparo dalla luce, al termine della quale vegono aggiunti 300 ml di etile acetato. These, after solubilization in a mixture consisting of 130 ml of N-methyl pyrrolidone and 1.3 ml of water, are reacted at 4 ° C with 0.29 ml of benzyl bromide. The reaction proceeds for 48 hours at 28 ° C, keeping the solution under stirring and protected from light, at the end of which 300 ml of ethyl acetate are added.
Il precipiato formatosi, costituito essenzialmente dal polisaccaride modificato, viene lavato con 100 ml di acetone e quindi, dopo una fase di pre-essiccamento sotto vuoto a temperatura ambiente, viene trattato con 100 ml di una soluzione al 10% p/v di sodio cloruro. The precipitate formed, essentially consisting of the modified polysaccharide, is washed with 100 ml of acetone and then, after a pre-drying phase under vacuum at room temperature, is treated with 100 ml of a 10% w / v sodium chloride solution. .
Al termine del trattamento salino (che dura circa 1 ora), il prodotto viene lavato con 150 ml di acqua/acetone 20:80 ed infine con 100 ml di acetone. At the end of the saline treatment (which lasts about 1 hour), the product is washed with 150 ml of water / acetone 20:80 and finally with 100 ml of acetone.
Dopo essiccamento per 48 ore a 30°C, si ottengono: 0,92 gr; resa: 80% Caratterizzazione: After drying for 48 hours at 30 ° C, the following are obtained: 0.92 g; yield: 80% Characterization:
% di esterificazione: 96% % esterification: 96%
Esempio 5 Example 5
Preparazione di acido ialuronico autoreticolato al 10%. parzialmente N-solfatato e O-solfatato. Preparation of 10% cross-linked hyaluronic acid. partially N-sulfated and O-sulfated.
2,00 gr del derivato ottenuto nell'esempio 3 vengono solubilizzati in 100 mi di acqua distillata e la soluzione viene fatta percolare attraverso una colonna di vetro pre-riempita con 40 ml di resina a scambio ionico attivata con tetrabutilammonio idrossido (forma TBA+). Dopo liofilizzazione dell'eluato vengono ottenuti 3,3 gr di prodotto. 2.00 g of the derivative obtained in example 3 are solubilized in 100 ml of distilled water and the solution is percolated through a glass column pre-filled with 40 ml of ion exchange resin activated with tetrabutylammonium hydroxide (form TBA +). After lyophilization of the eluate, 3.3 g of product are obtained.
Questi, dopo solubilizzazione in ima miscela formata da 165 ml di N-metil pirrolidone (NMP) , 0,8 ml di acqua e vengono fatti reagire con una soluzione ottenuta solubilizzando 205 mg di 2-cloro-l-metil piridin ioduro in 8,2 ml di NMP. La reazione procede per 18 ore, a -20°C, al termine dei quali vengono aggiunti 165 ml di una soluzione acquosa di ammonio acetato al 3%. These, after solubilization in a mixture formed by 165 ml of N-methyl pyrrolidone (NMP), 0.8 ml of water and are reacted with a solution obtained by solubilizing 205 mg of 2-chloro-1-methyl pyridine iodide in 8, 2 ml of NMP. The reaction proceeds for 18 hours, at -20 ° C, at the end of which 165 ml of a 3% aqueous solution of ammonium acetate are added.
La miscela é mantenuta in continua agitazione per circa 4 ore e quindi trattata con 650 ml di etanolo. B precipitato formatosi viene separato per filtrazione, lavato con etanolo e qundi seccato sotto vuoto per 24 ore. The mixture is kept under continuous stirring for about 4 hours and then treated with 650 ml of ethanol. The precipitate formed is separated by filtration, washed with ethanol and then dried under vacuum for 24 hours.
Il prodotto viene quindi trattato con 60 ml di una soluzione al 3% di sodio cloruro in modo tale da favorire lo scambio ionico e infine riprecipitato aggiungendo alla soluzione 180 ml di etanolo. Dopo eliminazione del sovranatante il prodotto viene lavato almeno tre volte con 50 ml di etanolo ed infine, prima di essere definitivamente seccato a 30°C per 48 ore, viene trattato con 100 ml di acetone. The product is then treated with 60 ml of a 3% sodium chloride solution in such a way as to favor ion exchange and finally re-precipitated by adding 180 ml of ethanol to the solution. After elimination of the supernatant, the product is washed at least three times with 50 ml of ethanol and finally, before being definitively dried at 30 ° C for 48 hours, it is treated with 100 ml of acetone.
Si ottengono 0,97 gr di derivato solfatato e parzialmente autoreticolato. Esempio 6 0.97 g of sulphated and partially cross-linked derivative are obtained. Example 6
Preparazione di un film di estere benzilico del'acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatàto. Preparation of a benzyl ester film of partially N-sulphated and O-sulphated hyaluronic acid.
Viene preparata una soluzione dell'estere benzilico del'acido ialuronico parzialmente N-solfatato e O-solfatato in dimetilsolfossido alla concentrazione di 180 mg/ml. A solution of the benzyl ester of partially N-sulfated and O-sulfated hyaluronic acid in dimethylsulfoxide at a concentration of 180 mg / ml is prepared.
Uno strato sottile di soluzione viene distribuito su una lastra di vetro; lo spessore dello strato di soluzione deve essere 10 volte maggiore rispetto allo spessore finale del film. La lastra di vetro viene immersa in etanolo il quale assorbe il dimetilsolfossido senza solubilizzare l'estere che diventa solido. Il film viene separato dalla lastra di vetro e ripetutamente lavato con etanolo, con acqua e poi ancora con etanolo. Il film ottenuto viene essiccato sotto pressione per 48 ore a 30° C. A thin layer of solution is spread over a glass plate; the thickness of the solution layer must be 10 times greater than the final thickness of the film. The glass plate is immersed in ethanol which absorbs the dimethyl sulfoxide without solubilizing the ester which becomes solid. The film is separated from the glass plate and repeatedly washed with ethanol, with water and then again with ethanol. The film obtained is dried under pressure for 48 hours at 30 ° C.
Esempio 7 Example 7
Preparazione del sale di argento del derivato deU'acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (25%) e 6-O-solfatato Preparation of the silver salt of the partially 2-N-sulfated (25%) and 6-O-sulfated hyaluronic acid derivative
0,50 gr di composto ottenuto secondo l'esempio 2, vengono solubilizzati in 25 ml di acqua distillata e la soluzione ottenuta viene fatta percolare attraverso una colonna pre-riempita con 16 cm3 di resina a scambio ionico forte in forma H+. L'eluato viene quindi raccolto e liofilizzato. L'intermedio in forma acida ottenuto dalla liofilizzazione, viene trattato con 20 ml di una soluzione 0,5 M di AgNO3 , per 60 minuti, mantenendo sotto agitazione e al riparo dalla luce. 0.50 g of compound obtained according to example 2, are solubilized in 25 ml of distilled water and the resulting solution is percolated through a column pre-filled with 16 cm3 of strong ion exchange resin in the H + form. The eluate is then collected and freeze-dried. The intermediate in acid form obtained from lyophilization is treated with 20 ml of a 0.5 M solution of AgNO3, for 60 minutes, keeping it under agitation and protected from light.
Dopo aver eliminato per filtrazione la fase liquida, il prodotto viene abbondantemente lavato con 150 ml di acqua distillata ed infine con 50 ml di etanolo assoluto. In seguito all'essicamento sotto vuoto a 40°C del derivato dell'acido ialuronico solfatato, sale di argento, vengono ottenuti 0,649 gr (resa 95%). After eliminating the liquid phase by filtration, the product is washed abundantly with 150 ml of distilled water and finally with 50 ml of absolute ethanol. Following the vacuum drying at 40 ° C of the sulphated hyaluronic acid derivative, silver salt, 0.649 g (yield 95%) are obtained.
Esempio 8 Example 8
Rivestimento di una valvola cardiaca di poliuretano con acido ialuronico parzialmente 2-N-solfatato (25%), e 6-O-solfatato Coating of a heart valve of polyurethane with partially 2-N-sulfated (25%), and 6-O-sulfated hyaluronic acid
Una valvola cardiaca di poliuretano viene trattata con plasma di ossigeno prodotto da un generatore di radiofrequenze. A polyurethane heart valve is treated with oxygen plasma produced by a radio frequency generator.
Le condizioni operative sono le seguenti: la pressione della camera di reazione viene regolata a 100 mtorr, la potenza del generatore di plasma è di 50 W, il flusso di ossigeno viene settato a 20 cm3/min e infine il tempo di trattamento risulta essere di 30 sec. The operating conditions are as follows: the pressure of the reaction chamber is adjusted to 100 mtorr, the power of the plasma generator is 50 W, the oxygen flow is set to 20 cm3 / min and finally the treatment time is of 30 sec.
Il dispositivo trattato è quindi immerso in 250 ml di una soluzione allo 0,65% di polietilenimmina di peso molecolare 500.000, e mantenuto nel bagno per 90 minuti. Dopo abbondante lavaggio con acqua bidistillata, il materiale viene messo a contatto con 250 ml di una soluzione acquosa ottenuta solubilizzando 2,5 gr di derivato parzialmente 2-N-solfatato e 6-O-solfatato, ottenuto secondo la descrizione dell'esempio 2. Inoltre, vengono aggiunti in quantità stechiometrica rispetto ai gruppi carbossilici appartenenti al polisaccaride modificato, rispettivamente: 0,76 gr di N-idrossisuccinimide (NHS) e 1,23 gr di 3-dimetilamminopropil-l-etil carbodimmide (EDC). La reazione procede per circa 16 ore a temperatura ambiente. The treated device is then immersed in 250 ml of a 0.65% solution of polyethyleneimine having a molecular weight of 500,000, and kept in the bath for 90 minutes. After abundant washing with bidistilled water, the material is put in contact with 250 ml of an aqueous solution obtained by solubilizing 2.5 g of partially 2-N-sulfated and 6-O-sulfated derivatives, obtained according to the description of Example 2. Furthermore, 0.76 g of N-hydroxy-succinimide (NHS) and 1.23 g of 3-dimethylaminopropyl-1-ethyl carbodimide (EDC) are added in stoichiometric quantities with respect to the carboxylic groups belonging to the modified polysaccharide, respectively. The reaction proceeds for about 16 hours at room temperature.
Infine, il dispositivo ricoperto superficialmente con il derivato di acido ialuronico solfatato, dopo un abbondante lavaggio con acqua bidistillata viene asciugato in corrente di aria a flusso laminare. Finally, the device covered on the surface with the sulphated hyaluronic acid derivative, after an abundant washing with bidistilled water is dried in a current of laminar flow air.
Essendo l'invenzione così descritta, è chiaro che questi metodi possono essere modificati in vari modi. Tali modificazioni non sono da considerarsi come divergenze dallo spirito e dalle prospettive dell'mvenzione e tutte quelle modificazioni che apparirebbero evidenti ad un esperto nel campo sono comprese nell’ambito delle seguenti rivendicazioni: Since the invention is thus described, it is clear that these methods can be modified in various ways. These modifications are not to be considered as divergences from the spirit and perspectives of the invention and all those modifications that would appear evident to an expert in the field are included within the scope of the following claims:
Claims (3)
Priority Applications (13)
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|---|---|---|---|
| ITPD970064 IT1291444B1 (en) | 1997-04-04 | 1997-04-04 | Novel sulphated hyaluronic acid derivatives - useful as coatings for bio-materials such as catheters, blood bags, syringes, and surgical instruments |
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| CA002285542A CA2285542C (en) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | N-sulphated hyaluronic acid compounds, derivatives thereof and a process for their preparation |
| JP54236598A JP4278716B2 (en) | 1997-04-04 | 1998-04-03 | N-sulfated hyaluronic acid compound, derivative thereof and production method |
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| US09/972,707 US6833363B2 (en) | 1997-04-04 | 2001-10-03 | N-sulphated hyaluronic acid compounds, derivatives thereof and a process for their preparation |
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| IT1291444B1 IT1291444B1 (en) | 1999-01-11 |
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1997
- 1997-04-04 IT ITPD970064 patent/IT1291444B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1291444B1 (en) | 1999-01-11 |
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| 0001 | Granted |