ITPD20090177A1 - METHOD OF PREPARATION OF PURIFIED EXTRACT FROM CABBAGE LACINIATO NERO TOSCANO AND COMPOSITIONS OF THE SAME - Google Patents

Description

“METODO DI PREPARAZIONE DI ESTRATTI PURIFICATI DA CAVOLO LACINIATO NERO TOSCANO E COMPOSIZIONI DEGLI STESSI†⠀ œMETHOD OF PREPARATION OF PURIFIED EXTRACTS FROM TUSCAN BLACK LACINED CABBAGE AND COMPOSITIONS OF THE SAMEâ €

Campo dell’invenzione Field of invention

L’invenzione à ̈ relativa ad un metodo di preparazione di estratti purificati da germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) aventi un alto titolo in glucorafanina e a composizioni comprendenti tali estratti come tali o in combinazione con l’enzima mirosinasi purificato e/o estratto e purificato da senape (Sinapis alba L.). The invention relates to a method of preparation of purified extracts from shoots of Tuscan black kale (Brassica oleracea L. var. Acephala subvar. Laciniata L.) having a high glucoraphanin titer and to compositions comprising such extracts as such or in combination with the purified and / or extracted and purified mustard enzyme myrosinase (Sinapis alba L.).

Stato della tecnica State of the art

È noto che le piante appartenenti alla famiglia delle Crucifere o Brassicacee, come ad esempio cavolfiori, cavoli verza, cavoli cappuccio, broccoli, cavoletti di Bruxelles, rape, ravanelli, rucola, senape e rafano, sono ricche di composti solforati di cui sono note da tempo le importanti proprietà salutistiche. Queste piante sono, infatti, ricche di vitamine, in particolare acido ascorbico e acido folico, di sali minerali, carotenoidi, fitosteroli e polifenoli, ma sono soprattutto caratterizzate dalla presenza di particolari sostanze solforate, che conferiscono loro l’odore ed il sapore caratteristici. Si tratta di un ampio gruppo di sostanze idrosolubili, stabili e non volatili contenenti zolfo, noti con il termine generale di glucosinolati. Queste sostanze sono presenti in tutte le parti della pianta, benché con profili chimici e livelli di concentrazione diversi. In genere ogni pianta presenta fino a 4 glucosinolati principali, ma nella stessa pianta possono essere presenti fino a 15 glucosinolati diversi. In natura sono stati identificati circa 120 glucosinolati che, in base alla struttura della loro catena laterale sono stati suddivisi in 3 gruppi, glucosinolati alchilici, aromatici e indolici (Verkerk R. et al.: Glucosinolates in Brassica vegetables: the influence of the food supply chain on intake, bioavailability and human health. Mol. Nutr. Food Res. (2009), 53: DOI:10.1002/mnfr.200800065). L’importanza di questo gruppo di composti à ̈ immediatamente evidente se si considera che questi sono i precursori dei veri e propri principi attivi che caratterizzano le Brassicacee e cioà ̈ degli isotiocianati. Gli isotiocianati, infatti, sono composti tendenzialmente volatili di cui sono note le capacità di favorire nell’uomo le naturali difese antiossidanti dell’organismo e di promuovere l’attività degli enzimi detossificanti. La trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati in questi vegetali avviene ad opera di un enzima endogeno, la mirosinasi, che normalmente si trova segregato in specifici distretti cellulari, ma che si attiva quando l’integrità della pianta viene lesa (Bones A.M and Rossiter J.T.: The myrosinase-glucosinolate system, its organisation and biochemistry. Physiologia Plantarum (1996), 97: 194-208). Nell’uomo invece la trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati avviene, ma solo parzialmente, a livello intestinale ad opera degli enzimi della flora batterica residente (Fuller Z. et al.: Influence of cabbage processing methods and prebiotic manipulation of colonic microflora on glucosinolate breakdown in man. Br. J. Nutr. ( 2007), 98: 364-372). La degradazione dei glucosinolati da parte dell’enzima mirosinasi dà origine ad un intermedio instabile che prima perde il gruppo solfato e subito dopo va incontro ad un processo di riarrangiamento molecolare, da cui possono originare, a seconda delle condizioni in cui avviene la reazione, vari composti: isotiocianati, tiocianati, nitrili, epitionitrili, e ossazolidintioni (Johnson I.T.: Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int. J. Vitam. Nutr. Res. (2002), 72(1): 26-31). A pH = 6-7 la mirosinasi tende a formare preferenzialmente isotiocianati, mentre a un pH < 3 o in presenza di ioni Fe<2+>dà origine prevalentemente a nitrili (Bellostas N. et al.: Fe<2+>- catalyzed formation of nitriles and thioamides from intact glucosinolates. J. Nat. Prod.(2008), 71 (1): 76-80.); anche la presenza di una particolare proteina che si ritiene agisca come co-fattore della mirosinasi, la EpithioSpecifier Protein (ESP), indirizza la mirosinasi verso la produzione di nitrili oppure di epitionitrili nel caso di isotiocianati con un doppio legame terminale, come ad esempio l’allilisotiocianato. In particolare, à ̈ noto che durante la germinazione, per la presenza della proteina ESP, la mirosinasi tende a trasformare la glucorafanina prevalentemente in sulforafano nitrile (Williams D.J. et al.: Epithiospecifier protein activity in broccoli: the link between terminal alkenyl glucosinolates and sulphoraphane nitrile. Phytochemistry (2008), 69: 2765-2773). La formazione di tiocianati avviene invece solo a partire da tre specifici glucosinolati (benzil-, allil- e 4 metilsulfinilbutil-glucosinolato) e richiede l’intervento di proteine non ancora identificate (Halkier B.A. and Gershenzon J.: Biology and biochemistry of glucosinolates. Annu. Rev. Plant. Biol. (2006), 57: 303-333). It is known that plants belonging to the Cruciferous or Brassicaceae family, such as cauliflower, savoy cabbage, cabbage, broccoli, Brussels sprouts, turnips, radishes, rocket, mustard and horseradish, are rich in sulfur compounds of which they are known to time the important health properties. These plants are, in fact, rich in vitamins, in particular ascorbic acid and folic acid, in mineral salts, carotenoids, phytosterols and polyphenols, but are above all characterized by the presence of particular sulfur substances, which give them the characteristic smell and taste. . It is a large group of water-soluble, stable and non-volatile sulfur-containing substances known by the general term of glucosinolates. These substances are present in all parts of the plant, albeit with different chemical profiles and concentration levels. Typically each plant has up to 4 main glucosinolates, but up to 15 different glucosinolates can be present in the same plant. In nature, about 120 glucosinolates have been identified which, based on the structure of their side chain, have been divided into 3 groups, alkyl, aromatic and indole glucosinolates (Verkerk R. et al .: Glucosinolates in Brassica vegetables: the influence of the food supply chain on intake, bioavailability and human health. Mol. Nutr. Food Res. (2009), 53: DOI: 10.1002 / mnfr. 200800065). The importance of this group of compounds is immediately evident if we consider that these are the precursors of the real active principles that characterize the Brassicaceae and that is of the isothiocyanates. In fact, isothiocyanates tend to be volatile compounds which are known for their ability to favor the body's natural antioxidant defenses and to promote the activity of detoxifying enzymes. The transformation of glucosinolates into isothiocyanates in these plants occurs by an endogenous enzyme, myrosinase, which is normally segregated in specific cellular districts, but which is activated when the integrity of the plant is damaged (Bones A.M and Rossiter J.T .: The myrosinase-glucosinolate system, its organization and biochemistry. Physiologia Plantarum (1996), 97: 194-208). In humans, on the other hand, the transformation of glucosinolates into isothiocyanates occurs, but only partially, in the intestine by the enzymes of the resident bacterial flora (Fuller Z. et al .: Influence of cabbage processing methods and prebiotic manipulation of colonic microflora on glucosinolate breakdown in man. Br. J. Nutr. (2007), 98: 364-372). The degradation of glucosinolates by the enzyme myrosinase gives rise to an unstable intermediate that first loses the sulphate group and immediately after undergoes a process of molecular rearrangement, from which they can originate, depending on the conditions in which the reaction takes place, various compounds: isothiocyanates, thiocyanates, nitriles, epithionitriles, and oxazolidintions (Johnson I.T .: Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int. J. Vitam. Nutr. Res. (2002), 72 (1): 26-31). At pH = 6-7 myrosinase tends to preferentially form isothiocyanates, while at a pH <3 or in the presence of Fe <2+> ions it mainly gives rise to nitriles (Bellostas N. et al .: Fe <2 +> - catalyzed formation of nitriles and thioamides from intact glucosinolates. J. Nat. Prod. (2008), 71 (1): 76-80.); also the presence of a particular protein which is believed to act as a co-factor of myrosinase, the EpithioSpecifier Protein (ESP), directs the myrosinase towards the production of nitriles or epithionitriles in the case of isothiocyanates with a double terminal bond, such as € ™ allylisothiocyanate. In particular, it is known that during germination, due to the presence of the ESP protein, myrosinase tends to transform glucoraphane mainly into nitrile sulforaphane (Williams D.J. et al .: Epithiospecifier protein activity in broccoli: the link between terminal alkenyl glucosinolates and sulphoraphane nitrile. Phytochemistry (2008), 69: 2765-2773). The formation of thiocyanates instead occurs only starting from three specific glucosinolates (benzyl-, allyl- and 4 methylsulfinylbutyl-glucosinolate) and requires the intervention of proteins not yet identified (Halkier B.A. and Gershenzon J .: Biology and biochemistry of glucosinolates. Annu. Rev. Plant. Biol. (2006), 57: 303-333).

Gli isotiocianati esercitano i loro effetti benefici stimolando, tramite traslocazione del fattore Nrf2 dal citoplasma al nucleo cellulare, la sintesi di enzimi specifici; alcuni facilitano l’eliminazione delle sostanze tossiche, altri combattono i radicali liberi dell’ossigeno e favoriscono la riparazione di eventuali danni cellulari. Tra le importanti attività biologiche degli isotiocianati, la più studiata e significativa à ̈ certamente l’attività chemoprotettiva, essendo suffragata da studi epidemiologici e da numerose evidenze sperimentali (Johnson I.T., 2002, ref. cit.; Higdon J.V. et al.: Cruciferous vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and mechanistic basis. Pharmacol. Res. (2007), 55: 224-236). Isothiocyanates exert their beneficial effects by stimulating the synthesis of specific enzymes through the translocation of the Nrf2 factor from the cytoplasm to the cell nucleus; some facilitate the elimination of toxic substances, others fight free oxygen radicals and help repair any cell damage. Among the important biological activities of isothiocyanates, the most studied and significant is certainly the chemoprotective activity, being supported by epidemiological studies and numerous experimental evidences (Johnson I.T., 2002, ref. Cit .; Higdon J.V. et al .: Cruciferous vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and mechanistic basis. Pharmacol. Res. (2007), 55: 224-236).

In particolare, l’azione chemoprotettiva à ̈ data dall’azione di questi composti su enzimi intracellulari coinvolti in processi di detossificazione da agenti carcinogeni in genere attraverso una duplice meccanismo d’azione: i) da una parte esercitando un controllo inibitorio sull’attività degli enzimi di fase 1 (Citocromi P-450); ii) dall’altra stimolando l’espressione e l’attività degli enzimi di fase 2. E’ noto che l’attività degli enzimi di fase 1 può favorire la liberazione di sostanze potenzialmente cancerogene da precursori inattivi, mentre quella degli enzimi di fase 2 tende a proteggere l’organismo favorendo l’eliminazione delle sostanze tossiche, la neutralizzazione dei radicali liberi dell’ossigeno e la riparazione di eventuali danni cellulari (Talalay P and Fahey J.W.: Phytochemicals from Cruciferous plants protect against cancer by modulating carcinogen metabolism. J. Nutr. (2001), 131: 3027-3033 S). Ciò si traduce in un aumento delle difese organiche che giustifica non solo l’attività chemopreventiva, ma anche parte degli effetti antinfiammatori, immunomodulanti e detossificanti esercitati in genere dagli isotiocianati. In particular, the chemoprotective action is given by the action of these compounds on intracellular enzymes involved in detoxification processes from carcinogenic agents in general through a double mechanism of action: i) on the one hand by exercising an inhibitory control on € ™ activity of phase 1 enzymes (Cytochromes P-450); ii) on the other hand by stimulating the expression and activity of phase 2 enzymes. It is known that the activity of phase 1 enzymes can favor the release of potentially carcinogenic substances from inactive precursors, while of phase 2 enzymes tends to protect the organism by promoting the elimination of toxic substances, the neutralization of oxygen free radicals and the repair of any cellular damage (Talalay P and Fahey J.W .: Phytochemicals from Cruciferous plants protect against cancer by modulating carcinogen metabolism. J. Nutr. (2001), 131: 3027-3033 S). This translates into an increase in organic defenses which justifies not only the chemopreventive activity, but also part of the anti-inflammatory, immunomodulating and detoxifying effects generally exercised by isothiocyanates.

La capacità degli isotiocianati di inibire lo sviluppo di eventuali tumori può dipendere, oltre che dal controllo dell’attività degli enzimi di fase 1 e 2, anche dalla loro capacità di inibire la proliferazione delle cellule tumorali e di indurne la morte per apoptosi, come dimostrato per l’isotiocianato derivato dalla glucorafanina, il sulforafano (Clarke J.D. et al.: Multi-targeted prevention of cancer sulforaphane. Cancer Letters (2008), 269 (2): 291-304). The ability of isothiocyanates to inhibit the development of any tumors may depend not only on the control of the activity of phase 1 and 2 enzymes, but also on their ability to inhibit the proliferation of tumor cells and induce their death by apoptosis, such as demonstrated for isothiocyanate derived from glucoraphane, sulforaphane (Clarke J.D. et al .: Multi-targeted prevention of cancer sulforaphane. Cancer Letters (2008), 269 (2): 291-304).

Pertanto à ̈ evidente che i glucosinolati presenti nelle Brassicaeee possono esercitare i loro benefici effetti solo quando sono in grado di rendere biodisponibili, per trasformazione enzimatica ad opera della mirosinasi, gli isotiocianati. La biodisponibilità degli isotiocianati di origine vegetale à ̈ però fortemente influenzata dai processi di cottura, a cui vengono di solito sottoposte queste piante per gli scopi alimentari, i quali, inattivando la mirosinasi, impediscono la trasformazione enzimatica dei glucosinolati (Rungapamestry V. et al.: Effect of meal composition and cooking duration on the fate of sulforaphane following consumption of broccoli by healthy human subjects. Br. J. Nutr. (2007), 97: 644-652). In questo caso gli effetti benefici esercitati da queste piante dipendono dall’intervento della flora batterica intestinale che rende, in parte, disponibili in vivo i principi attivi (Shapiro T.A. et al.: Chemoprotective glucosinolates and isothiocyanates of broccoli sprouts: metabolism and excretion in humans. Cancer Epidemiol., Biomarkers & Prev. (2001), 10: 501-508). Therefore it is evident that the glucosinolates present in the Brassicaeee can exert their beneficial effects only when they are able to make the isothiocyanates bioavailable, by enzymatic transformation by the myrosinase. The bioavailability of isothiocyanates of plant origin is however strongly influenced by the cooking processes to which these plants are usually subjected for food purposes, which, by inactivating the myrosinase, prevent the enzymatic transformation of glucosinolates (Rungapamestry V. et al. : Effect of meal composition and cooking duration on the fate of sulforaphane following consumption of broccoli by healthy human subjects. Br. J. Nutr. (2007), 97: 644-652). In this case, the beneficial effects exerted by these plants depend on the intervention of the intestinal bacterial flora which makes the active principles available in part (Shapiro T.A. et al .: Chemoprotective glucosinolates and isothiocyanates of broccoli sprouts: metabolism and excretion in humans. Cancer Epidemiol., Biomarkers & Prev. (2001), 10: 501-508).

Studi di fisiologia vegetale hanno dimostrato che i livelli di glucosinolati variano nel tempo in funzione delle diverse fasi di sviluppo della pianta e in alcuni casi sono più elevati nei germogli che nella pianta adulta. Questo à ̈ stato chiaramente dimostrato in particolare per i germogli di broccolo, che sono risultati contenere fino a 100 volte i livelli di glucosinolati presenti nella piante mature (Fahey J.W. et al.: Broccoli sprouts: an exceptionally rich source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997), 94: 10367-10372.). I germogli pertanto costituiscono non solo un alimento dotato di notevole proprietà salutistiche, ma anche un ottimo materiale di partenza per la preparazione di estratti titolati da utilizzare sia in campo farmaceutico che per la preparazione di supplementi nutrizionali. E’ stato, infatti, dimostrato che estratti di germogli di broccolo ricchi in glucorafanina, messi a contatto con l’enzima mirosinasi possono liberare una quantità di sulforafano tale da ridurre in vivo, nel ratto, l’attività carcinogenica del dimetilbenzatracene (Fahey J.W. et al. 1997, ref. cit.). E’ noto inoltre che in gastriti indotte da Helicobacter pylori, l’assunzione orale di germogli di broccolo riduce la colonizzazione batterica e l’infiammazione della mucosa gastrica (Yanaka et al.: Dietary sulforaphane-rich broccoli sprouts reduce colonization and attenuate gastritis in Helicobacter pylori-infected mice and humans. Cancer Prev. Res. (2009),2 (4): 353-360). Plant physiology studies have shown that glucosinolate levels vary over time according to the different stages of plant development and in some cases they are higher in shoots than in the adult plant. This has been clearly demonstrated in particular for broccoli sprouts, which were found to contain up to 100 times the levels of glucosinolates found in mature plants (Fahey J.W. et al .: Broccoli sprouts: an exceptionally rich source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. (1997), 94: 10367-10372.). The sprouts therefore constitute not only a food with remarkable health properties, but also an excellent starting material for the preparation of titrated extracts to be used both in the pharmaceutical field and for the preparation of nutritional supplements. In fact, it has been shown that extracts of broccoli sprouts rich in glucoraphanin, put in contact with the enzyme myrosinase, can release a quantity of sulforaphane such as to reduce in vivo, in rats, the carcinogenic activity of dimethylbenzatracene ( Fahey J.W. et al. 1997, ref. Cit.). It is also known that in gastritis induced by Helicobacter pylori, the oral intake of broccoli sprouts reduces bacterial colonization and inflammation of the gastric mucosa (Yanaka et al .: Dietary sulforaphane-rich broccoli sprouts reduce colonization and attenuate gastritis in Helicobacter pylori-infected mice and humans. Cancer Prev. Res. (2009), 2 (4): 353-360).

La possibilità di utilizzare estratti contenenti glucosinolati, arricchiti in particolare di glucorafanina, come precursore degli isotiocianati o isotiocianati pre-formati da varie varietà di Brassica per la preparazione principalmente di integratori alimentari idonei ad incrementare l’apporto di isotiocianati con scopi chemopreventivi, ha portato alla messa a punto di metodi di preparazione degli stessi a partire da diverse varietà vegetali appartenenti alle Crucifere. The possibility of using extracts containing glucosinolates, enriched in particular with glucoraphanin, as a precursor of isothiocyanates or isothiocyanates pre-formed from various varieties of Brassica for the preparation of mainly food supplements suitable for increasing the intake of isothiocyanates for chemopreventive purposes, has led to the development of methods of preparation of the same starting from different plant varieties belonging to the Cruciferae.

La preparazione di estratti arricchiti in isotiocianati pre-formati à ̈ però da ritenersi poco utile allo scopo di preparare supplementi nutrizionali, poiché gli isotiocianati sono poco stabili e quindi tali estratti risultano di difficile maneggiabilità sotto il profilo di processi industriali di preparazioni farmaceutiche o di supplementi nutrizionali. Sono quindi generalmente da preferirsi preparazioni di estratti contenenti glucosinolati con una sostanziale inattivazione della mirosinasi endogena per limitare, se non bloccare, sia la conversione non controllata dei glucosinolati in isotiocianati sia la trasformazione di tali precursori in nitrili o epitionitrili durante le procedure di preparazione. I nitrili e gli epitionitrili sono, infatti, ritenuti dotati di una certa tossicità (Tanii H. et al : Allylnitrile: generation from cruciferous vegetables and behavioral effects on mice of repeated exposure. Food Chem. Toxicol. (2004), 42: 453-458; Boadas-Vaello P et al.: Allylnitrile metabolism by CYP2E1 and other CYPs leads to distinct lethal and vestibulotoxic effects in the mouse. Toxicol Sci. (2009),107 (2):461-472). In tal caso però i glucosinolati possono essere trasformati in isotiocianati solo dalla flora batterica intestinale. L’apporto di isotiocianati a scopo chemopreventivo à ̈ quindi notevolmente limitato se non insufficiente per questi scopi. The preparation of extracts enriched in pre-formed isothiocyanates is however to be considered of little use for the purpose of preparing nutritional supplements, since isothiocyanates are not very stable and therefore these extracts are difficult to handle under the profile of industrial processes of pharmaceutical preparations or nutritional supplements. Preparations of extracts containing glucosinolates with a substantial inactivation of endogenous myrosinase are therefore generally preferable to limit, if not block, both the uncontrolled conversion of glucosinolates into isothiocyanates and the transformation of these precursors into nitriles or epithionitriles during the preparation procedures. Nitriles and epithionitriles are, in fact, considered to have a certain toxicity (Tanii H. et al: Allylnitrile: generation from cruciferous vegetables and behavioral effects on mice of repeated exposure. Food Chem. Toxicol. (2004), 42: 453- 458; Boadas-Vaello P et al .: Allylnitrile metabolism by CYP2E1 and other CYPs leads to distinct lethal and vestibulotoxic effects in the mouse. Toxicol Sci. (2009), 107 (2): 461-472). In this case, however, the glucosinolates can only be transformed into isothiocyanates by the intestinal bacterial flora. The contribution of isothiocyanates for chemopreventive purposes is therefore considerably limited if not insufficient for these purposes.

Pertanto per preparare prodotti, integratori alimentari o medicamenti, con un effetto chemopreventivo, gli estratti arricchiti in glucosinolati sono preparati in via generale da materiali vegetali di piante (parti o pianta intera) della famiglia delle Brassicacee previa inattivazione della mirosinasi endogena ed eventuale successiva addizione di mirosinasi esogena. Anche in questo caso però rimane il problema di limitare, se non impedire la trasformazione di glucosinolati in nitrili e/o epitionitrili a livello gastrico dove il pH acido e la eventuale presenza di ioni Fe<2+>possono indirizzare la trasformazione dei glucosinolati verso la produzione di nitrili e di epitionitrili anche in assenza di mirosinasi. Therefore, to prepare products, food supplements or medicaments, with a chemopreventive effect, the extracts enriched in glucosinolates are generally prepared from plant materials of plants (parts or whole plants) of the Brassicaceae family after inactivation of the endogenous myrosinase and possible subsequent addition of exogenous myrosinase. Even in this case, however, the problem remains of limiting, if not preventing the transformation of glucosinolates into nitriles and / or epithionitriles in the stomach where the acid pH and the possible presence of Fe <2+> ions can direct the transformation of glucosinolates towards the production of nitriles and epithionitriles even in the absence of myrosinase.

EP0772976 descrive un integratore alimentare a base di isotiocianati contenente alti livelli di sulforafano (almeno 50µg, preferibilmente 100µg e più preferibilmente1000µg) e bassi livelli di sulforafano-nitrile (al massimo 50µg, preferibilmente 20µg e più preferibilmente10µg) ed il prodotto à ̈ ottenuto da Brassicacee, e preferibilmente da fiori di broccoli, per: i) inattivazione della mirosinasi per scottatura in acqua bollente o cottura a vapore o immersione in etanolo; ii) miscelazione e macinazione in acqua per un tempo di 0,5-3 ore del materiale vegetale scottato con una mirosinasi esogena; iii) centrifugazione dell’omogenato così ottenuto; iv) concentrazione dell’omogenato in vuoto; v) aggiunta di un veicolo (amido, maltodestrina, saccarosio, destrosio e gomme vegetali); abbassamento del pH a 3,5 ed essicazione della miscela sino all’ottenimento di una polvere per la successiva preparazione di un integratore alimentare, preferibilmente in forma di compressa o bevanda. Preferibilmente l’inattivazione della mirosinasi à ̈ per scottatura a vapore a temperature tra 80-100°C (preferibilmente tra 90-100°C e più preferibilmente a 100°C) per un tempo di 0,5-15 min. (preferibilmente. 2-8 min., più preferibilmente 3-5 min.). La mirosinasi esogena può essere di provenienza commerciale, ma à ̈ preferibilmente da fonti naturali ed in particolare da vegetali della famiglia delle Brassicacee (preferibilmente da rafano). La fonte vegetale di mirosinasi à ̈ aggiunta fresca al materiale vegetale scottato in una quantità compresa tra 3-10%, i rapporti preferiti e più preferiti sono rispettivamente 4-6% e 5%. EP0772976 describes a food supplement based on isothiocyanates containing high levels of sulforaphane (at least 50µg, preferably 100µg and more preferably 1000µg) and low levels of sulforaphane-nitrile (at most 50µg, preferably 20µg and more preferably 10µg) and the product is obtained from Brassicaceae , and preferably from broccoli flowers, for: i) inactivation of myrosinase by blanching in boiling water or steaming or immersion in ethanol; ii) mixing and grinding in water for a time of 0.5-3 hours of the plant material scalded with an exogenous myrosinase; iii) centrifugation of the homogenate thus obtained; iv) concentration of the homogenate in vacuum; v) addition of a vehicle (starch, maltodextrin, sucrose, dextrose and vegetable gums); lowering of the pH to 3.5 and drying of the mixture until obtaining a powder for the subsequent preparation of a food supplement, preferably in the form of a tablet or drink. Preferably the inactivation of myrosinase is by steam scalding at temperatures between 80-100 ° C (preferably between 90-100 ° C and more preferably at 100 ° C) for a time of 0.5-15 min. (preferably. 2-8 min., more preferably 3-5 min.). The exogenous myrosinase can be of commercial origin, but it is preferably from natural sources and in particular from vegetables of the Brassicaceae family (preferably from horseradish). The plant source of myrosinase is freshly added to the blanched plant material in an amount between 3-10%, the preferred and most preferred ratios are 4-6% and 5% respectively.

WO 97/09889 descrive la preparazione di un supplemento alimentare ottenuto da semi germinanti di Crucifere in generale o germogli di Crucifere di 1-14 giorni (Brassica oleracea, varietà acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia, ramosa, sabauda, sabellica e selensia) o combinazioni di semi e germogli, in cui tali materiali vegetali contengono livelli non tossici di glucosinolati indolici e loro prodotti di degradazione come gli idrossibutilglucosinolati. Tali semi o germogli possono essere usati tal quali, dopo opportuni trattamenti (i. e. congelamento, essiccamento, cottura in forno o per bollitura, liofilizzazione) per arrestarne la crescita. Tali trattamenti permettono di preservare l’enzima mirosinasi endogeno (liofilizzazione) o di inattivarlo (per esempio bollitura). Si prevede inoltre che i glucosinolati o gli isotiocianati contenuti nei materiali vegetali dopo i vari trattamenti, a cui sono sottoposti, possano anche essere estratti con un solvente non tossico o facilmente rimovibile ed in particolare i solventi previsti per l’estrazione sono l’acqua bollente, anidride carbonica liquida, etanolo, l’estrazione con acqua calda o bollente à ̈ quella preferita e descritta poiché ritenuta in grado di inattivare o denaturare la mirosinasi. In caso di inattivazione della mirosinasi, questa può essere aggiunta sia in forma purificata che in forma di materiale vegetale che la contiene (ad esempio germogli di rafano). Secondo questo processo si ottengono materiali che contengono sia glucosinolati che isotiocianati. WO 97/09889 describes the preparation of a food supplement obtained from germinating seeds of Cruciferae in general or Cruciferous shoots of 1-14 days (Brassica oleracea, variety acephala, alboglabra, botrytis, costata, gemmifera, gongylodes, italica, medullosa, palmifolia , ramosa, sabauda, sabellica and selensia) or combinations of seeds and sprouts, in which such plant materials contain non-toxic levels of indole glucosinolates and their degradation products such as hydroxybutylglucosinolates. These seeds or sprouts can be used as they are, after suitable treatments (eg freezing, drying, cooking in the oven or by boiling, freeze-drying) to stop their growth. These treatments allow to preserve the endogenous myrosinase enzyme (lyophilization) or to inactivate it (for example boiling). It is also expected that the glucosinolates or isothiocyanates contained in the plant materials after the various treatments to which they are subjected, can also be extracted with a non-toxic or easily removable solvent and in particular the solvents required for the extraction are the boiling water, liquid carbon dioxide, ethanol, extraction with hot or boiling water is the preferred and described one as it is considered capable of inactivating or denaturing myrosinase. In case of inactivation of myrosinase, this can be added both in purified form and in the form of plant material that contains it (eg horseradish sprouts). According to this process, materials are obtained that contain both glucosinolates and isothiocyanates.

WO 02/45527 descrive una composizione contenente glucosinolati e isotiocianati, ottenuti da Brassicacee, in particolare da broccoli e da rafano in combinazione tra di loro, in cui il materiale vegetale di partenza à ̈ tagliato a pezzi, in modo che la conversione dei glucosinolati in isotiocianati sia minima (meno del 5-10%), e scottato blandamente in modo che la mirosinasi sia preservata (inattivazione prevista del 5-10%). Successivamente il materiale vegetale così trattato à ̈ disidratato in due fasi per riscaldamento con temperature non superiori a 137,78°C per 40-60 min. nella prima fase e meno di 26,67°C per 35-45 min. nella seconda fase. Il materiale vegetale disidratato à ̈ quindi macinato sino a polvere. WO 02/45527 describes a composition containing glucosinolates and isothiocyanates, obtained from Brassicaceae, in particular from broccoli and horseradish in combination with each other, in which the starting plant material is cut into pieces, so that the conversion of glucosinolates into isothiocyanates is minimal (less than 5-10%), and blanched lightly so that myrosinase is preserved (expected inactivation of 5-10%). Subsequently, the vegetable material thus treated is dehydrated in two phases by heating with temperatures not exceeding 137.78 ° C for 40-60 min. in the first phase and less than 26.67 ° C for 35-45 min. in the second phase. The dehydrated plant material is then ground to a powder.

DE 10308298 descrive un metodo di preparazione di estratti da piante intere di Brassicacee che prevede l’inattivazione della mirosinasi endogena, l’estrazione dei glucosinolati e la concentrazione dell’estratto per congelamento, con specifica esclusione della liofilizzazione. È previsto un ulteriore step di idrolisi enzimatica con mirosinasi esogena dei glucosinolati a isotiocianati almeno per il 50%. È descritto inoltre un kit consistente sostanzialmente in due preparazioni separate da mescolare, di cui una consiste nel materiale vegetale preparato contenente glucosinolati o glucosinolati+isotiocianati, e la seconda consiste in una preparazione contenente mirosinasi. Lo scopo à ̈ di avere preparazioni ad alto contenuto di glucosinolati privi di gluconapina e/o progoitrina e con un contenuto massimo di nitrati di 100mg/kg. L’inattivazione della mirosinasi endogena à ̈ per riscaldamento, ed i mezzi citati sono con acqua calda, a vapore o irradiazione con microonde, preferibilmente l’inattivazione della mirosinasi à ̈ per scottatura in acqua a temperature di 95-100°C per 1-15 min.. Dopo l’inattivazione il materiale vegetale à ̈ tagliato e trattato con acqua o altro mezzo acquoso e sottoposto ad estrazione a temperature di 0-8°C e centrifugazione a oltre 5000 rpm. Secondo gli inventori l’estrazione in acqua o con altro mezzo acquoso rispetto ad altri solventi à ̈ da preferirsi trattandosi di un prodotto per uso alimentare. DE 10308298 describes a method of preparing extracts from whole Brassicaceae plants which involves the inactivation of endogenous myrosinase, the extraction of glucosinolates and the concentration of the extract by freezing, with specific exclusion of lyophilization. A further step of enzymatic hydrolysis with exogenous myrosinase of glucosinolates to isothiocyanates is foreseen for at least 50%. Also described is a kit consisting substantially of two separate preparations to be mixed, one of which consists of the plant material prepared containing glucosinolates or glucosinolates + isothiocyanates, and the second consists of a preparation containing myrosinase. The aim is to have preparations with a high content of glucosinolates free of gluconapine and / or progoitrin and with a maximum nitrate content of 100mg / kg. The inactivation of endogenous myrosinase is by heating, and the aforementioned means are with hot water, steam or microwave irradiation, preferably the inactivation of myrosinase is by scalding in water at temperatures of 95-100 ° C to 1-15 min .. After inactivation, the plant material is cut and treated with water or other aqueous medium and subjected to extraction at temperatures of 0-8 ° C and centrifugation at over 5000 rpm. According to the inventors, the extraction in water or with other aqueous medium compared to other solvents is to be preferred since it is a product for food use.

Tutti i metodi di preparazione qui citati appaiono non idonei all’ottenimento di estratti da Brassicacee ad alto titolo in glucosinolati, ed in particolare glucorafanina, poiché non solo la degradazione specifica dei glucosinolati in isotiocianati dovuta alla mirosinasi non risulta adeguatamente controllata, ma anche degradazioni aspecifiche, e da escludere ab origine per la possibile formazione di nitrili e/o epitionitrili, non sono menzionate né prese in considerazione. La possibilità che si formino non solo isotiocianati, che in conseguenza della loro nota instabilità possono determinare una significativa perdita dei principi attivi degli estratti preparati, ma anche nitrili ed epitionitrili non à ̈ quindi esclusa. All the preparation methods mentioned here appear unsuitable for obtaining extracts from Brassicaceae with a high titre in glucosinolates, and in particular glucoraphanin, since not only the specific degradation of glucosinolates into isothiocyanates due to myrosinase is not adequately controlled, but also Non-specific degradations, and to be excluded from the start due to the possible formation of nitriles and / or epithionitriles, are neither mentioned nor taken into consideration. The possibility of forming not only isothiocyanates, which as a consequence of their known instability can cause a significant loss of the active ingredients of the prepared extracts, but also nitriles and epithionitriles is therefore not excluded.

La disponibilità di estratti ad alto titolo in glucosinolati, che siano stabili e che non vengano degradati in isotiocianati e/o nitrili ed epitionitrili durante il processo di preparazione, à ̈ quindi ancora una necessità sentita per la preparazione di composizioni impiegabili ad esempio come supplementi alimentari con proprietà chemoprotettive. The availability of high titre extracts in glucosinolates, which are stable and which are not degraded into isothiocyanates and / or nitriles and epithionitriles during the preparation process, is therefore still a felt need for the preparation of compositions that can be used for example as food supplements. with chemoprotective properties.

Sommario Summary

Come risulta evidente per quanto sopra riportato, tra gli isotiocianati che si originano dai glucosinolati una delle molecole biologicamente più interessanti à ̈ senz’altro il sulforafano. Si tratta di un isotiocianato che si forma per azione della mirosinasi dalla glucorafanina, un glucosinolato che si ritrova solo in alcune piante afferenti alla specie Brassica oleracea, in particolare nei broccoli. Infatti i broccoli dalla letteratura risultano essere uno dei vegetali preferiti per la preparazione di supplementi alimentari arricchiti in glucosinolati e/o isotiocianati. As is evident from the above, among the isothiocyanates that originate from glucosinolates, one of the most biologically interesting molecules is undoubtedly sulforaphane. It is an isothiocyanate that is formed by the action of myrosinase from glucoraphanin, a glucosinolate that is found only in some plants belonging to the Brassica oleracea species, in particular in broccoli. In fact, from the literature broccoli is one of the preferred vegetables for the preparation of food supplements enriched in glucosinolates and / or isothiocyanates.

Ora gli inventori hanno trovato che il cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.), pianta di difficile reperimento fuori dal territorio toscano, Ã ̈, rispetto ad altre Brassicacee anche coltivate sul territorio italiano, come ad es. il broccolo calabrese (Brassica oleracea var. italica), caratterizzato da semi contenenti alti livelli sia di glucosinolati totali che di glucorafanina. Hanno trovato inoltre che tale alto contenuto di glucosinolati nei semi si mantiene anche nel contenuto di questi composti nei germogli e che quindi i germogli di cavolo laciniato nero toscano costituiscono un materiale vegetale di elezione per la preparazione di estratti con un alto titolo in glucosinolati ed in particolare di glucorafanina. Now the inventors have found that the Tuscan black cabbage (Brassica oleracea L. var. Acephala subvar. Laciniata L.), a plant difficult to find outside the Tuscan territory, is, compared to other Brassicaceae also cultivated on the Italian territory, such as ex. Calabrian broccoli (Brassica oleracea var. italica), characterized by seeds containing high levels of both total glucosinolates and glucoraphanin. They also found that this high content of glucosinolates in the seeds is also maintained in the content of these compounds in the sprouts and that therefore the sprouts of Tuscan black kale constitute a plant material of choice for the preparation of extracts with a high titre in glucosinolates and in detail of glucoraphanin.

È quindi un primo scopo della presente invenzione fornire un metodo di preparazione di fitocomposti e/o estratti caratterizzati da elevato titolo in glucosinolati, ed in particolare di glucorafanina, da germogli di cavolo laciniato nero toscano, in cui la proteina EpithioSpecifier Protein (ESP) e la mirosinasi responsabili della degradazione dei glucosinolati non siano presenti o siano completamente disattivate. It is therefore a first object of the present invention to provide a method for preparing phytocompounds and / or extracts characterized by a high titre in glucosinolates, and in particular glucoraphanin, from Tuscan black kale sprouts, in which the EpithioSpecifier Protein (ESP) and the myrosinase responsible for the breakdown of glucosinolates are not present or are completely deactivated.

È ancora un altro scopo della presente invenzione fornire composizioni comprendenti tali estratti ad alto titolo preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena utilmente impiegabili per la preparazione di medicamenti o supplementi nutrizionali, in cui la glucorafanina sia convertita in sulforafano e lo stesso sia biodisponibile nel tratto gastrico e/o intestinale. It is still another object of the present invention to provide compositions comprising such high titer extracts preferably in combination with exogenous active myrosinase which can be usefully used for the preparation of medicaments or nutritional supplements, in which the glucoraphanine is converted into sulforaphane and the same is bioavailable in the gastric tract. and / or intestinal.

In un primo aspetto à ̈ pertanto oggetto dell’invenzione un metodo di preparazione di estratti di glucosinolati comprendente almeno le fasi di: In a first aspect, the object of the invention is therefore a method for preparing glucosinolate extracts comprising at least the steps of:

- irradiare germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. - radiate shoots of Tuscan black cabbage (Brassica oleracea L.

var. acephala subvar. Laciniata L.) raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con micronde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W; var. acephala subvar. Laciniata L.) harvested between 4 and 6 days from sowing with microwaves at a power between 450 and 800 W;

- congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C; - freeze at a temperature between -15 and -20 ° C;

- liofilizzare e macinare i germogli così trattati; - freeze-dry and grind the sprouts thus treated;

- sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica, e preferibilmente due, con etanolo al 70% p/p; - subjecting the freeze-dried and ground sprouts to at least one hydroalcoholic extraction, and preferably two, with 70% w / w ethanol;

- opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare. - optionally, dry the hydroalcoholic extract, resume in water and freeze-dry.

In un secondo aspetto sono oggetto dell’invenzione composizioni comprendenti estratti di germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.), preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena, in cui l’estratto ha un titolo in glucorafanina almeno del 10% p/p e quando l’estratto à ̈ combinato con mirosinasi i due componenti sono presenti in un rapporto estratto:enzima che potrà variare in funzione degli effetti che si vogliono ottenere, con un intervallo che varia tra 1:1 e 20:1 p/p. Preferibilmente tali rapporti sono compresi tra 10:1 e 5:1. In a second aspect, compositions are object of the invention comprising extracts of Tuscan black kale sprouts (Brassica oleracea L. var. Acephala subvar. Laciniata L.), preferably in combination with exogenous active myrosinase, in which the extract has a glucoraphanin titer of at least 10% w / w and when the extract is combined with myrosinase the two components are present in an extract: enzyme ratio that may vary according to the desired effects, with an interval that varies between 1: 1 and 20: 1 p / p. Preferably these ratios are comprised between 10: 1 and 5: 1.

Nelle composizioni secondo l’invenzione l’enzima mirosinasi à ̈ in forma di enzima purificato o preferibilmente in forma di liofilizzato di un estratto acquoso da senape (Sinapis alba L.). Quando tale estratto viene posto in un ambiente acquoso a 37°C ed a pH 6,5-7, l’enzima si attiva e opera la trasformazione della glucorafanina in sulforafano. In the compositions according to the invention, the myrosinase enzyme is in the form of a purified enzyme or preferably in the form of lyophilisate of an aqueous mustard extract (Sinapis alba L.). When this extract is placed in an aqueous environment at 37 ° C and pH 6.5-7, the enzyme is activated and transforms the glucoraphanin into sulforaphane.

Pertanto, le composizioni secondo l’invenzione sono in forme farmaceutiche adatte alla somministrazione per via orale e preferibilmente sono in forma di compresse o capsule gastroprotette e/o colon-specifiche, tranne nel caso in cui si voglia ottenere un effetto locale a livello gastrico, nel qual caso le compresse o le capsule dovranno, almeno parzialmente, rendere biodisponibile la glucorafanina in loco. Secondo un ulteriore aspetto l’invenzione ha per oggetto l’uso di tali composizioni per la chemoprotezione contro agenti tossici ambientali, di natura sia microbiologica che chimica. Un uso preferito delle composizioni secondo l’invenzione à ̈ nella chemoprotezione dell’apparato respiratorio. Per tali scopi preferibilmente l’uso di queste composizioni à ̈ come supplementi nutrizionali. Therefore, the compositions according to the invention are in pharmaceutical forms suitable for oral administration and preferably are in the form of gastroprotected and / or colon-specific tablets or capsules, except in the case in which a local effect on the gastric level is to be obtained. , in which case the tablets or capsules must, at least partially, make the glucoraphanin bioavailable on site. According to a further aspect, the invention relates to the use of such compositions for chemoprotection against environmental toxic agents, both of a microbiological and chemical nature. A preferred use of the compositions according to the invention is in the chemoprotection of the respiratory system. For these purposes, the use of these compositions is preferably as nutritional supplements.

Gli scopi e i vantaggi dei metodi di preparazione di estratti ad alto titolo in glucosinolati da germogli di cavolo laciniato nero toscano e delle composizioni che li comprendono oggetto della presente invenzione, saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell’invenzione, saranno descritti esempi di preparazione di tali estratti e di composizioni oltre che dati biologici dell’effetto di tali estratti. The purposes and advantages of the methods of preparation of high-titre extracts in glucosinolates from Tuscan black kale sprouts and of the compositions comprising them, object of the present invention, will be better understood in the course of the following detailed description where, by way of example but not of limitation of the invention, examples of preparation of such extracts and compositions will be described as well as biological data of the effect of such extracts.

Breve descrizione delle figure Brief description of the figures

Figura 1: Confronto tra cromatogrammi HPLC dei desulfo-glucosinolati prima (A) e dopo l’idrolisi con mirosinasi esogena (B). Figure 1: Comparison of HPLC chromatograms of desulpho-glucosinolates before (A) and after hydrolysis with exogenous myrosinase (B).

Figura 2: Cromatogrammi HPLC del contenuto di sulforafano prima (A) e dopo la liofilizzazione (B). Figure 2: HPLC chromatograms of sulforaphane content before (A) and after lyophilization (B).

Descrizione dettagliata dell’invenzione Detailed description of the invention

Definizioni Definitions

I glucosinolati sino ad ora identificati sono stati suddivisi in 3 gruppi: alchilici, aromatici e indolici, in base alla struttura della loro catena laterale indicata nella formula generale (I) sotto riportata come R (Verkerk R. et al.: 2009, ref. cit.). Essendo molecole dotate di carica negativa, in natura si presentano in genere sottoforma di sali di potassio. The glucosinolates identified so far have been divided into 3 groups: alkyl, aromatic and indole, based on the structure of their side chain indicated in the general formula (I) below as R (Verkerk R. et al .: 2009, ref. cit.). Being negatively charged molecules, in nature they generally occur in the form of potassium salts.

OH OH

O OR

HO I HAVE

HO S R HO S R

OH C OH C

N No.

-O3SO -O3SO

(I) (THE)

Con riferimento alla formula di struttura (I) i principali glucosinolati (qui indicati anche come GL) noti ed in parte menzionati nella descrizione dell’invenzione, e le abbreviazioni qui usate, sono come riportato di seguito: With reference to the structural formula (I) the main glucosinolates (here also referred to as GL) known and partly mentioned in the description of the invention, and the abbreviations used here, are as follows:

PM PM

Classe nome comune abbreviazione gruppo R Class common name abbreviation group R.

(sale di K) Glucoiberina GIB 3-metilsulfinil- 461.6 Progoitrina PRO 2-idrossi-3-butenil- 427.5 Glucorafanina GRA 4-metilsulfinil-butil- 475.6 Sinigrina SIN 2-propenil- 397.5 Glucoerucina GER 4-metiltio-butil- 459.6 Glucotropeolina GTL benzil- 447.5 Gluconasturtina GST fenil-etil- 461.5 Glucobrassicina GBS indolil-3-metil- 486.6 4-metossi- N-metossi-indolil-3-4-OM-GBS 516.6 glucobrassicina metil-Neo- 1-metossi-indolil-3-Neo-GBS 516.6 glucobrassicina metil-4-idrossi- 4-idrossi-indolil-3-4-OH-GBS 502.6 glucobrassicina metil-L’enzima mirosinasi à ̈ la β-tioglucoside glucoidrolasi (EC 3.2.1.147), che normalmente si trova segregata in specifici distretti cellulari della pianta. Per azione della mirosinasi e la concomitante presenza di proteina ESP, a pH 6-7 in ambiente acquoso dalla glucorafanina si ottiene sia l’isotiocianato sulforafano, di seguito indicato anche come SF, che il sulforafano nitrile secondo una reazione di idrolisi enzimatica che porta alla liberazione di un anione solfato e D-glucosio e successivo riarrangiamento molecolare (Matusheski N.V. et al: Comparison of the bioactivity of two glucoraphanin hydrolysis products found in broccoli, sulforaphane and sulforaphane nitrile. J. Agric. Food. Chem. (2001), 49: 5743-5749). (K salt) Glucoiberin GIB 3-methylsulfinyl- 461.6 Progoitrin PRO 2-hydroxy-3-butenyl- 427.5 Glucoraphanine GRA 4-methylsulfinyl-butyl- 475.6 Sinigrin SIN 2-propenyl- 397.5 Glucoerucine GER 4-methylthio-butyl- 459.6 benzyl- 447.5 Gluconasturtine GST phenyl-ethyl- 461.5 Glucobrassicin GBS indolyl-3-methyl- 486.6 4-methoxy- N-methoxy-indolyl-3-4-OM-GBS 516.6 glucobraxicin methyl-Neo- 1-methoxy-indolyl-3- Neo-GBS 516.6 glucobrassicin methyl-4-hydroxy- 4-hydroxy-indolyl-3-4-OH-GBS 502.6 glucobrassicin methyl-The enzyme myrosinase is the β-thioglucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.147), which normally occurs found segregated in specific cellular districts of the plant. By the action of myrosinase and the concomitant presence of ESP protein, at pH 6-7 in an aqueous environment from glucoraphanine, both the isothiocyanate sulforaphane, hereinafter also referred to as SF, and the nitrile sulforaphane are obtained according to an enzymatic hydrolysis reaction that leads to the liberation of a sulphate anion and D-glucose and subsequent molecular rearrangement (Matusheski N.V. et al: Comparison of the bioactivity of two glucoraphanin hydrolysis products found in broccoli, sulforaphane and sulforaphane nitrile. J. Agric. Food. Chem. (2001), 49: 5743-5749).

L’EpithioSpecifier Protein (ESP) à ̈ considerata un co-fattore non catalitico della mirosinasi che promuove la formazione di epitionitrili o nitrili semplici. L’ESP isolata dalla Brassica oleracea L. ssp. Italica à ̈ una proteina di 43kDa ed ha una omologia di sequenza con la ESP della Arabidopsis thaliana (NP_175806.3) (Matusheski N.V. et al: Epithiospecifier protein from broccoli (Brassica oleracea L. ssp. Italica) inhibits formation of the anticancer agent sulforaphane. J. Agric. Food. Chem. (2006), 54: 2069-2076; Wittstock U., Burrow M.: Tipping the scalesspecifier protein in glucosinolate hydrolysis. IUBMB Life (2007), 59 (12): 744-751). Recentemente in Arabidopsis thaliana sono state identificate delle nuove proteine, omologhe della ESP, la cui specifica funzione sembra essere quella di indirizzare la mirosinasi verso la trasformazione dei glucosinolati in nitrili, da cui il nome di Nitrile-Specifier Proteins (NSP); tali proteine sono in grado di favorire la trasformazione della glucorafanina in sulforafano nitrile (Burrow M. et al.: The genetic basis of constitutive and herbivory-induced ESP-independent nitrile formation in Arabidopsis. Plant Physiol. (2009), 149: 561-574; Kissem R. and Bones A.M.: Nitrile-specifier proteins involved in glucosinolate hydrolisis in Arabidopsis Thaliana. J. Biol. Chem. (2009), 284 (18):12057-12070). EpithioSpecifier Protein (ESP) is considered a non-catalytic co-factor of myrosinase which promotes the formation of simple epithionitriles or nitriles. ESP isolated from Brassica oleracea L. ssp. Italica is a 43kDa protein and has sequence homology with the ESP of Arabidopsis thaliana (NP_175806.3) (Matusheski N.V. et al: Epithiospecifier protein from broccoli (Brassica oleracea L. ssp. Italica) inhibits formation of the anticancer agent sulforaphane . J. Agric. Food. Chem. (2006), 54: 2069-2076; Wittstock U., Burrow M .: Tipping the scalesspecifier protein in glucosinolate hydrolysis. IUBMB Life (2007), 59 (12): 744-751) . Recently in Arabidopsis thaliana new proteins have been identified, homologous to ESP, whose specific function seems to be to direct myrosinase towards the transformation of glucosinolates into nitriles, hence the name of Nitrile-Specifier Proteins (NSP); these proteins are able to favor the transformation of glucoraphanin into sulforaphane nitrile (Burrow M. et al .: The genetic basis of constitutive and herbivory-induced ESP-independent nitrile formation in Arabidopsis. Plant Physiol. (2009), 149: 561- 574; Kissem R. and Bones A.M .: Nitrile-specifier proteins involved in glucosinolate hydrolisis in Arabidopsis Thaliana. J. Biol. Chem. (2009), 284 (18): 12057-12070).

Con cavolo nero toscano o cavolo laciniato nero toscano si indica sempre la Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L., da cui si ottengono gli estratti ad alto titolo in GL, ed in particolare in GRA, secondo l’invenzione. With Tuscan black cabbage or Tuscan black cabbage we always indicate Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L., from which the extracts with a high titer in GL, and in particular in GRA, are obtained, according to the invention.

Descrizione Description

L’enorme interesse manifestato nei confronti degli isotiocianati di derivazione vegetale in questi ultimi anni, ha moltiplicato le conoscenze sugli effetti e sul meccanismo d’azione di questa classe di sostanze facendo intravvedere la possibilità di molteplici applicazioni sia in campo medico che salutistico. The enormous interest shown in plant-derived isothiocyanates in recent years has multiplied the knowledge on the effects and the mechanism of action of this class of substances, suggesting the possibility of multiple applications both in the medical and health fields.

Ciononostante però à ̈ necessario porre particolare attenzione nella preparazione principalmente di supplementi nutrizionali arricchiti in questi composti. Da una parte bisogna, infatti, garantire che i materiali con cui questi sono preparati abbiano un adeguato ed elevato contenuto in principi attivi stabili, dall’altra che eventuali composti non voluti, come ad esempio i nitrili, siano minimi se non al limite della non rilevabilità. Nevertheless, it is necessary to pay particular attention in the preparation mainly of nutritional supplements enriched in these compounds. On the one hand, it is necessary, in fact, to ensure that the materials with which these are prepared have an adequate and high content of stable active ingredients, on the other hand that any unwanted compounds, such as nitriles, are minimal if not at the limit of undetectable.

Le Brassicaee, ed in particolare i broccoli, sono certamente una fonte vegetale da cui possono essere ottenuti estratti ad alto contenuto in glucosinolati, ma questo alto contenuto in glucosinolati à ̈ naturalmente associato anche ad un adeguato contenuto dell’enzima, la mirosinasi, e del suo co-fattore EpithioSpecifier Protein (ESP) in grado di degradarli ad isotiocianati, ma anche a nitrili ed a epitionitrili. Allo scopo di ottenere estratti ad elevato contenuto in glucosinolati stabili, gli inventori hanno focalizzato la loro attenzione su una particolare sottovarietà di Brassica oleracea, la Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L. comunemente nota come cavolo laciniato nero toscano, e su una parte specifica di questa brassicacea, e cioà ̈ sui germogli. Brassicaee, and in particular broccoli, are certainly a vegetable source from which extracts with a high content of glucosinolates can be obtained, but this high content of glucosinolates is naturally also associated with an adequate content of the enzyme, myrosinase, and of its co-factor EpithioSpecifier Protein (ESP) capable of degrading them to isothiocyanates, but also to nitriles and epithionitriles. In order to obtain extracts with a high content of stable glucosinolates, the inventors have focused their attention on a particular sub-variety of Brassica oleracea, Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L. commonly known as Tuscan black cabbage, and on a specific part of this brassicacea, namely on the shoots.

Partendo dai germogli di cavolo laciniato nero toscano sono state infatti ottenute, con adeguate procedure, preparazioni caratterizzate da un elevato contenuto di glucosinolati, in particolare glucorafanina, in grado di rilasciare quantità apprezzabili di sulforafano in condizioni opportune. Starting from the sprouts of Tuscan black cabbage, preparations characterized by a high content of glucosinolates, in particular glucoraphanin, capable of releasing appreciable quantities of sulforaphane under appropriate conditions, have been obtained with appropriate procedures.

In particolare, il metodo di preparazione degli estratti ad alto titolo in glucosinolati prevede almeno le fasi di: In particular, the method of preparation of high-titre extracts in glucosinolates includes at least the steps of:

- irradiare germogli di Brassica oleracea L. var. acephala subvar. - irradiate shoots of Brassica oleracea L. var. acephala subvar.

Laciniata L. raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con microonde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W per un tempo compreso tra 0,5 e 2 di minuti per strati di germogli aventi spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm , preferibilmente 1 minuto a 800 W. Laciniata L. harvested between 4 and 6 days from sowing with microwaves at a power between 450 and 800 W for a time between 0.5 and 2 minutes for layers of sprouts having a thickness between 0.5 and 2.0 cm , preferably 1 minute at 800 W.

- congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C; - freeze at a temperature between -15 and -20 ° C;

- liofilizzare e macinare i germogli così trattati; - freeze-dry and grind the sprouts thus treated;

- sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica, e preferibilmente due, con etanolo al 70% p/p; - subjecting the freeze-dried and ground sprouts to at least one hydroalcoholic extraction, and preferably two, with 70% w / w ethanol;

- opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare. - optionally, dry the hydroalcoholic extract, resume in water and freeze-dry.

Il processo di irraggiamento dei germogli à ̈ particolarmente significativo per gli scopi della presente invenzione, poiché à ̈ stato trovato che questo blando trattamento termico dei germogli permette di inattivare non tanto la mirosinasi, la cui inattivazione risulta molto limitata, ma la proteina ESP responsabile della trasformazione della glucorafanina in sulforafano nitrile. Infatti, l’attività della mirosinasi dopo trattamento con microonde rimane intorno all’80%. Si rende pertanto necessario procedere a bloccare l’idrolisi enzimatica dei GL mediante un trattamento specifico e cioà ̈ mediante congelamento. Dall’azione combinata del trattamento termico con microonde e successivo immediato trattamento a freddo con congelamento si ottiene quindi l’effetto perseguito di mantenere l’alto contenuto di glucosinolati presente nei germogli evitando da subito eventuali processi degradativi. The process of irradiation of the shoots is particularly significant for the purposes of the present invention, since it has been found that this mild thermal treatment of the shoots allows to inactivate not so much the myrosinase, whose inactivation is very limited, but the responsible ESP protein the transformation of glucoraphanine into nitrile sulforaphane. In fact, the activity of myrosinase after microwave treatment remains around 80%. It is therefore necessary to proceed to block the enzymatic hydrolysis of the GL by means of a specific treatment, that is by freezing. From the combined action of heat treatment with microwaves and subsequent immediate cold treatment with freezing, the desired effect is therefore obtained of maintaining the high content of glucosinolates present in the sprouts, immediately avoiding any degradation processes.

Inoltre, rispetto a quanto noto, si à ̈ verificato che l’estrazione con mezzi acquosi, benché utile, non permette di avere alti titoli in glucosinolati e che l’estrazione deve essere eseguita con un solvente idroalcolico in grado non solo di estrarre in maniera completa i glucosinolati, ma anche di inattivare una eventuale attività mirosinasica residua. Si ottiene così un estratto stabile che può essere opzionalmente portato a secco, ripreso in acqua e liofilizzato. In tale forma si trova nelle condizioni migliori per essere utilizzato a livello industriale per la messa a punto di composizioni per uso orale secondo l’invenzione. Furthermore, compared to what is known, it has been verified that the extraction with aqueous media, although useful, does not allow to have high titers in glucosinolates and that the extraction must be performed with a hydroalcoholic solvent capable not only of to completely extract glucosinolates, but also to inactivate any residual myrosinase activity. In this way a stable extract is obtained which can optionally be dried, taken up in water and freeze-dried. In this form it is in the best conditions to be used on an industrial level for the development of compositions for oral use according to the invention.

Secondo un metodo di preparazione generale gli estratti ad alto titolo in glucosinolati oggetto dell’invenzione sono preparati come di seguito descritto in dettaglio. According to a general preparation method, the high titre extracts in glucosinolates object of the invention are prepared as described in detail below.

A. semina e raccolta dei germogli di cavolo laciniato nero toscano A. sowing and harvesting of Tuscan black kale sprouts

In ogni ciclo di germogliazione i semi di cavolo laciniato nero toscano sono sterilizzati per 7 minuti in etanolo al 20%, risciacquati almeno tre volte con acqua deionizzata, e posti in germinatore con innaffiamento automatico regolato secondo necessità. Il giorno stabilito per la raccolta, i germogli sono sciacquati e privati delle cuticole. Per ottimizzare la crescita dei germogli sono stati testati diverse condizioni. I migliori risultati in termini di contenuto in glucosinolati sono stati ottenuti raccogliendo i germogli tra il 4° ed il 6° giorno dalla semina e preferibilmente al 5° giorno dalla semina; la luce o il buio non sembrano influenzare il livello di glucosinolati dei germogli. In each sprouting cycle, the Tuscan black kale seeds are sterilized for 7 minutes in 20% ethanol, rinsed at least three times with deionized water, and placed in a germinator with automatic watering adjusted as needed. On the day set for harvesting, the shoots are rinsed and cuticles removed. To optimize the growth of the shoots, different conditions were tested. The best results in terms of glucosinolate content were obtained by harvesting the sprouts between the 4th and 6th day from sowing and preferably on the 5th day from sowing; light or dark does not seem to affect the glucosinolate level of the sprouts.

B. trattamento dei germogli e preparazione del liofilizzato B. treatment of the sprouts and preparation of the lyophilisate

Subito dopo il raccolto i germogli, privi di cuticola, sono trattati con microonde a 450-800 W per un tempo di 0,5-2 minuti per strati omogenei di germogli di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm (preferibilmente a 800 W per 1 minuto) e subito congelati a temperature comprese tra -15 e -20°C per poi procedere alla liofilizzazione. Dopo la liofilizzazione i germogli sono macinati ottenendo una polvere di colore verde. Per una miglior conservazione e per bloccare eventuali processi degradativi residui la polvere può essere conservata in boccette chiuse sotto vuoto e poste a -18°C. Immediately after harvesting, the shoots, without cuticle, are treated with microwaves at 450-800 W for a time of 0.5-2 minutes for homogeneous layers of buds with a thickness of between 0.5 and 2.0 cm (preferably at 800 W for 1 minute) and immediately frozen at temperatures between -15 and -20 ° C and then proceed to freeze-drying. After freeze-drying, the sprouts are ground to obtain a green powder. For better conservation and to block any residual degradation processes, the powder can be stored in vacuum-sealed bottles placed at -18 ° C.

C. preparazione dell’estratto idroalcolico C. preparation of the hydroalcoholic extract

I germogli liofilizzati, vengono estratti almeno una volta e preferibilmente due volte con una soluzione di etanolo/acqua al 70% in un rapporto 1 (germogli liofilizzati):20 (solvente di estrazione) p/v a freddo ad una temperatura di 0°C o a temperatura ambiente (20-25°C). Le due estrazioni dei germogli liofilizzati sono eseguite nel seguente modo: a) aggiunta del mezzo di estrazione ai germogli liofilizzati, b) omogenizzazione, c) centrifugazione. The freeze-dried sprouts are extracted at least once and preferably twice with a 70% ethanol / water solution in a ratio of 1 (freeze-dried sprouts): 20 (extraction solvent) w / v cold at a temperature of 0 ° C or a room temperature (20-25 ° C). The two extractions of the freeze-dried shoots are performed as follows: a) addition of the extraction medium to the freeze-dried shoots, b) homogenization, c) centrifugation.

Infine i due supernatanti sono uniti, misurati e sottoposti ad eliminazione del solvente, preferibilmente per evaporazione del solvente a caldo a temperature di 40-45°C. Tale estratto può essere usato tal quale oppure, in alternativa, il residuo ottenuto dopo allontanamento del solvente di estrazione à ̈ poi ripreso in acqua in un volume pari a quello iniziale e centrifugato. Il supernatante à ̈ raccolto, riportato al volume iniziale e liofilizzato. Si ottiene in questo caso un estratto il cui peso à ̈ circa un quarto del peso iniziale dei germogli liofilizzati. Finally, the two supernatants are joined, measured and subjected to elimination of the solvent, preferably by evaporation of the solvent in hot conditions at temperatures of 40-45 ° C. This extract can be used as it is or, alternatively, the residue obtained after removal of the extraction solvent is then taken up in water in a volume equal to the initial one and centrifuged. The supernatant is collected, restored to the initial volume and freeze-dried. In this case an extract is obtained whose weight is about a quarter of the initial weight of the freeze-dried sprouts.

Gli estratti ottenuti con questo metodo di preparazione si sono dimostrati in grado di adempiere agli scopi dell’invenzione. The extracts obtained with this preparation method have proved capable of fulfilling the purposes of the invention.

Infatti, il liofilizzato di germogli raccolti a 4-6 giorni dalla semina, privati di cuticola e trattati con microonde contiene una quantità di glucorafanina pari al 3% p/p, a fronte di un contenuto totale in glucosinolati del 5% p/p. Il trattamento con microonde permette di degradare primariamente la proteina ESP che, se presente, indirizza la trasformazione della glucorafanina verso la formazione di sulforafano nitrile invece che di sulforafano. Tale trattamento risulta perciò essenziale per bloccare degradazioni non volute dei glucosinolati presenti. Dopo il trattamento con microonde l’attività dell’enzima mirosinasi, normalmente presente nei germogli di questa pianta, risulta essere solo parzialmente ridotta, essendo comunque sempre in grado di trasformare in sulforafano circa 80% della glucorafanina presente nel liofilizzato. In fact, the lyophilisate of shoots harvested 4-6 days after sowing, without cuticle and treated with microwaves, contains a quantity of glucoraphanin equal to 3% w / w, compared to a total content in glucosinolates of 5% w / w. The microwave treatment allows to degrade primarily the ESP protein which, if present, directs the transformation of glucoraphanin towards the formation of nitrile sulforaphane instead of sulforaphane. This treatment is therefore essential to block unwanted degradation of the glucosinolates present. After the treatment with microwaves, the activity of the enzyme myrosinase, normally present in the buds of this plant, is only partially reduced, being however always able to transform about 80% of the glucoraphanin present in the lyophilisate into sulforaphane.

D’altra parte l’inattivazione termica della mirosinasi richiede temperature elevate che possono alterare anche i livelli di glucosinolati presenti nella pianta. On the other hand, the thermal inactivation of myrosinase requires high temperatures which can also alter the levels of glucosinolates present in the plant.

Per bloccare una eventuale precoce e non voluta trasformazione dei glucosinolati in isotiocianati instabili da parte della mirosinasi à ̈ essenziale perciò la successiva fase di congelamento e la liofilizzazione, mentre nella successiva fase di estrazione idroalcolica l’enzima mirosinasi risulta completamente inibito. To block any early and unwanted transformation of glucosinolates into unstable isothiocyanates by myrosinase, the subsequent freezing and lyophilization phase is therefore essential, while in the subsequent hydroalcoholic extraction phase the myrosinase enzyme is completely inhibited.

Dalle estrazioni idroalcoliche, sia con una ulteriore liofilizzazione sia senza la stessa, si ottiene una polvere leggermente appiccicosa con un contenuto superiore al 10% p/p ed intorno al 13% p/p in glucorafanina, a fronte di un contenuto totale di glucosinolati intorno al 20% p/p. Per migliorare la lavorabilità dell’estratto, dopo la rimozione del solvente e prima della eventuale ulteriore liofilizzazione, alla polvere può essere aggiunta una certa quantità di trealosio (30% p/p); in questo caso l’estratto risulta meno appiccicoso mentre il titolo iniziale in glucorafanina cala dal 13% all’8%. From hydroalcoholic extractions, either with a further lyophilization or without the same, a slightly sticky powder is obtained with a content higher than 10% w / w and around 13% w / w in glucoraphanin, compared to a total content of glucosinolates around at 20% w / w. To improve the workability of the extract, after removing the solvent and before any further lyophilization, a certain amount of trehalose (30% w / w) can be added to the powder; in this case the extract is less sticky while the initial glucoraphanin titer drops from 13% to 8%.

Questo estratto non contiene l’enzima mirosinasi o lo contiene in forma disattivata e perciò la liberazione di sulforafano in vivo può verificarsi mediante un meccanismo parziale e graduale ad opera della flora batterica intestinale. Preferibilmente però, per ottenere un effetto più marcato di liberazione di sulforafano dalla glucorafanina in essi contenuta, agli estratti così ottenuti può essere addizionata una mirosinasi esogena di origine vegetale o altamente purificata o in forma di estratto vegetale liofilizzato. Preferibilmente per gli scopi della presente invenzione la mirosinasi esogena à ̈ in forma di estratto acquoso ottenuto da altre varietà di Crucifere, come ad esempio il rafano, la senape o la colza, più preferibilmente à ̈ impiegata quella da senape (Sinapis alba L.). Più preferibilmente oltre all’estrazione con acqua a temperatura ambiente e successiva centrifugazione e filtrazione, l’estratto filtrato contenente mirosinasi à ̈ ulteriormente sottoposto a dialisi. La dialisi viene eseguita con un cut-off di 12-14 kD per un massimo di due giorni. Alla fine il dializzato può essere congelato e liofilizzato con o senza l’aggiunta di trealosio all’1% come stabilizzante. This extract does not contain the enzyme myrosinase or contains it in a deactivated form and therefore the release of sulforaphane in vivo can occur through a partial and gradual mechanism by the intestinal flora. Preferably, however, to obtain a more marked effect of liberation of sulforaphane from the glucoraphanine contained in them, an exogenous myrosinase of vegetable origin or highly purified or in the form of lyophilized vegetable extract can be added to the extracts thus obtained. Preferably for the purposes of the present invention the exogenous myrosinase is in the form of an aqueous extract obtained from other varieties of Cruciferae, such as for example horseradish, mustard or rapeseed, more preferably that from mustard (Sinapis alba L.) is used. . More preferably, in addition to extraction with water at room temperature and subsequent centrifugation and filtration, the filtered extract containing myrosinase is further subjected to dialysis. Dialysis is performed with a cut-off of 12-14 kD for up to two days. Eventually the dialysate can be frozen and lyophilized with or without the addition of 1% trehalose as stabilizer.

L’estratto di germogli di cavolo nero toscano avente un titolo in glucorafanina non inferiore al 10%, ottenuto con il metodo di preparazione oggetto dell’invenzione qui descritto, può essere utilmente impiegato, per la preparazione di composizioni somministrabili per via orale, adatte a permettere che la glucorafanina compresa nell’estratto sia convertita in sulforafano e che lo stesso sia biodisponibile nel tratto gastrico e/o intestinale. Per questi scopi l’estratto di germogli di cavolo nero toscano à ̈ preferibilmente in combinazione con mirosinasi attiva esogena in un rapporto estratto:enzima variabile e compreso tra 1:1 e 20:1 p/p (preferibilmente compreso tra 5:1 e 10:1). Tali composizioni possono essere nelle forme note nel settore farmaceutico e/o parafarmaceutico nutrizionale per uso orale e possono quindi essere secondo quanto noto ad un esperto del settore composizioni comprendenti un estratto di cavolo nero avente un titolo almeno del 10% in glucorafanina ed opzionalmente la mirosinasi in forma purificata o di estratto combinato con eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili o di grado alimentare adatti per ottenere tali composizioni in forma liquida, ad esempio soluzioni o sospensioni, o in forma solida, ad esempio bustine monodose, tavolette erodibili, compresse, capsule. Preferibilmente, tali composizioni sono scelte tra compresse o capsule, opzionalmente gastroprotette o colon-specifiche. In particolare, le composizioni gastroprotette sono necessarie quando si vuole evitare la liberazione nello stomaco dei principi attivi contenuti negli estratti, ed in particolare della glucorafanina, ed ottenere una liberazione di sulforafano a livello dell’intestino tenue, favorendo così un assorbimento sistemico con tutti gli effetti positivi chemoprotettivi indotti a livello generale da questo composto. La gastroprotezione sia delle capsule che delle compresse à ̈ ottenibile con metodologie di tecnica farmaceutica note ad un esperto del settore. Ad esempio compresse gastroprotette possono essere ottenute rivestendo la compressa con una soluzione acquosa di gomma lacca, ammonio carbonato e trietilcitrato. The extract of Tuscan black cabbage sprouts having a glucoraphanin title of not less than 10%, obtained with the preparation method object of the invention described here, can be usefully used, for the preparation of compositions that can be administered orally, suitable for allowing the glucoraphanin included in the extract to be converted into sulforaphane and for it to be bioavailable in the gastric and / or intestinal tract. For these purposes, the extract of Tuscan black cabbage sprouts is preferably in combination with exogenous active myrosinase in a variable extract: enzyme ratio and between 1: 1 and 20: 1 w / w (preferably between 5: 1 and 10: 1). These compositions can be in the forms known in the pharmaceutical and / or parapharmaceutical nutritional sector for oral use and can therefore be according to what is known to an expert in the field, compositions comprising a cabbage extract having a title of at least 10% in glucoraphanin and optionally myrosinase in purified form or extract combined with pharmaceutically acceptable or food-grade excipients and / or diluents suitable for obtaining such compositions in liquid form, for example solutions or suspensions, or in solid form, for example single-dose sachets, erodible tablets, tablets, capsules . Preferably, these compositions are selected from tablets or capsules, optionally gastroprotected or colon-specific. In particular, gastroprotected compositions are necessary when you want to avoid the release in the stomach of the active ingredients contained in the extracts, and in particular of glucoraphanin, and to obtain a release of sulforaphane in the small intestine, thus favoring systemic absorption with all the positive chemoprotective effects induced at a general level by this compound. The gastroprotection of both the capsules and the tablets can be obtained with pharmaceutical technique methods known to an expert in the field. For example, gastro-protected tablets can be obtained by coating the tablet with an aqueous solution of shellac, ammonium carbonate and triethyl citrate.

In un’altra soluzione prevista le composizioni possono essere in forma di compresse o capsule colon-specifiche, che permettono una liberazione dei principi attivi degli estratti localizzata nel colon, utili perciò quando si voglia ottenere un effetto specifico locale a livello del colon, come ad esempio una protezione preventiva in soggetti predisposti allo sviluppo di polipi intestinali o in caso di soggetti con infiammazioni croniche del crasso. Anche la formulazione colonspecifica può essere ottenuta con tecniche note ad un esperto del settore. Ad esempio può essere ottenuta rivestendo capsule di gelatina con due diversi strati protettivi; quello interno protegge la capsula dalla dissoluzione al pH 6,8 tipico dell’intestino tenue e si ottiene rivestendo la capsula di gelatina con una soluzione acquosa al 15% contenente gomma lacca (87,2%), ammonio carbonato (3,3%) e trietilcitrato (9,5%), quello esterno permette invece di superare il pH acido dello stomaco e viene depositato su quello interno, quando asciutto, utilizzando una soluzione acquosa a base di gomma lacca (84,2%), ammonio carbonato (6,3%) e trietilcitrato (9,5%). La doppia protezione permette perciò il rilascio degli attivi solo a pH 7,2 tipico del colon. In another solution provided, the compositions can be in the form of colon-specific tablets or capsules, which allow a release of the active ingredients of the extracts localized in the colon, therefore useful when you want to obtain a specific local effect at the level of the colon, such as for example a preventive protection in subjects predisposed to the development of intestinal polyps or in case of subjects with chronic inflammation of the large intestine. The colon-specific formulation can also be obtained with techniques known to an expert in the field. For example, it can be obtained by coating gelatin capsules with two different protective layers; the internal one protects the capsule from dissolution at pH 6.8 typical of the small intestine and is obtained by coating the gelatin capsule with a 15% aqueous solution containing shellac (87.2%), ammonium carbonate (3.3% ) and triethyl citrate (9.5%), the external one allows to overcome the acid pH of the stomach and is deposited on the internal one, when dry, using an aqueous solution based on shellac (84.2%), ammonium carbonate ( 6.3%) and triethyl citrate (9.5%). The double protection therefore allows the release of the active ingredients only at pH 7.2 typical of the colon.

Inoltre, le composizioni possono essere in forma di compresse o capsule a rapida dissoluzione per un effetto locale a livello gastrico, utili per il trattamento delle gastriti indotte da Helicobacter pylori, contrastandone anche la proliferazione e l’infiammazione indotta. Furthermore, the compositions can be in the form of fast dissolving tablets or capsules for a local effect at the gastric level, useful for the treatment of gastritis induced by Helicobacter pylori, also counteracting its proliferation and induced inflammation.

Non si possono inoltre escludere forme farmaceutiche o parafarmaceutiche nutrizionali in cui sono combinate sia una rapida dissoluzione a livello gastrico sia una dissoluzione a livello intestinale (tenue o colon): esempi di tali forme possono essere tavolette erodibili o polveri micronizzate e trattate per ottenere granuli con rivestimenti differenziati a seconda del tipo di rilascio voluto. Furthermore, pharmaceutical or parapharmaceutical nutritional forms cannot be excluded in which both a rapid dissolution in the gastric level and a dissolution in the intestine (small intestine or colon) are combined: examples of these forms can be erodible tablets or micronized powders and treated to obtain granules with different coatings according to the type of release desired.

Per gli scopi della chemoprevenzione i dosaggi giornalieri dell’estratto avente un titolo in glucorafanina (senza l’aggiunta di trealosio) di almeno il 10% p/p possono essere compresi tra 200 e 1000mg/die e preferibilmente tra 200 e 800 mg/die e più preferibilmente 200-400 mg/die. For the purposes of chemoprevention, the daily dosages of the extract having a glucoraphanine titer (without the addition of trehalose) of at least 10% w / w can be between 200 and 1000mg / day and preferably between 200 and 800 mg / day and more preferably 200-400 mg / day.

Sono qui sotto riportati alcuni esempi, non esaustivi né limitativi, di possibili composizioni impiegabili per via orale. Below are some examples, not exhaustive or limiting, of possible compositions that can be used orally.

A. Compresse gastroprotette (in mg) A. Gastro-protected tablets (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 400 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 40 Cellulosa microcristallina 400 Dicalciofosfato anidro 300 Magnesio stearato vegetale 10 Silice colloidale anidra 8 Sodio croscarmellose 18 Colorante 0,2 Gomma lacca 36,30 Ammonio carbonato 2,72 Trietil citrato 4,08 Acqua purificata 388,0 B. Capsule colon-specifiche (in mg) Tuscan black cabbage dry extract ± trehalose 400 Mustard lyophilized extract (myrosinase) 40 Microcrystalline cellulose 400 Anhydrous di-calcium phosphate 300 Vegetable magnesium stearate 10 Colloidal anhydrous silica 8 Croscarmellose sodium 18 Color 0.2 Shellac 36.30 Ammonium carbonate 2.72 Triethyl citrate 4, 08 Purified water 388.0 B. Color-specific capsules (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 200 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 10 Cellulosa microcristallina 200 Magnesio stearato vegetale 7 Silice colloidale anidra 10 Sepifilm SN<TM>24,24 (gomma lacca decerata 20-30%, polivinil pirrolidone K 30 < 5%, mono e di gliceridi acetilati 7-11%, etanolo 60-70%) Gomma lacca 36,30 Ammonio carbonato 2,72 Trietil citrato 4,08 Acqua purificata 388,0 C. Compresse filmate a rapida dissoluzione (in mg) Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 300 Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 50 Cellulosa microcristallina 300 Dicalciofosfato anidro 225 Magnesio stearato vegetale 7,5 Silice colloidale anidra 6 Sodio croscarmellose 13,5 Polivinilpolipirrolidone 15 Tuscan black cabbage dry extract ± trehalose 200 Mustard lyophilized extract (myrosinase) 10 Microcrystalline cellulose 200 Vegetable magnesium stearate 7 Colloidal anhydrous silica 10 Sepifilm SN <TM> 24.24 (dewaxed shellac 20-30%, polyvinyl pyrrolidone K 30 <5% , mono and acetylated glycerides 7-11%, ethanol 60-70%) Shellac 36.30 Ammonium carbonate 2.72 Triethyl citrate 4.08 Purified water 388.0 C. Fast dissolving film-coated tablets (in mg) Black cabbage Tuscan dry extract ± trehalose 300 Mustard lyophilized extract (myrosinase) 50 Microcrystalline cellulose 300 Anhydrous di-calcium phosphate 225 Vegetable magnesium stearate 7.5 Colloidal anhydrous silica 6 Croscarmellose sodium 13.5 Polyvinylpolypyrrolidone 15

Sepifilm LP<TM>22,8 (Idrossipropilmetilcellulosa, cellulosa microcristallina, Sepifilm LP <TM> 22.8 (Hydroxypropylmethylcellulose, microcrystalline cellulose,

acido stearico vegetale, pigmenti e lacche) vegetable stearic acid, pigments and lacquers)

Gomma lacca 7 Shellac 7

Colorante 0,4 Dye 0.4

D. Capsule (in mg) D. Capsules (in mg)

Cavolo nero toscano estratto secco ± trealosio 400 Tuscan black cabbage dry extract ± trehalose 400

Senape estratto liofilizzato (mirosinasi) 80 Freeze-dried mustard extract (myrosinase) 80

Cellulosa microcristallina 200 Microcrystalline cellulose 200

Magnesio stearato vegetale 7 Vegetable magnesium stearate 7

Silice colloidale anidra 10 Anhydrous colloidal silica 10

Sodio croscarmellose 12 Polivinilpolipirrolidone 24 Croscarmellose sodium 12 Polyvinylpolypyrrolidone 24

Per quanto già esposto risulta chiaro che le composizioni realizzabili con l’estratto di cavoli nero toscano secondo l’invenzione si prestano a molteplici applicazioni sia sottoforma di medicamenti che di supplementi alimentari utilmente impiegabili sia a scopi preventivi che curativi nella chemoprevenzione e/o chemoprotezione: - nei soggetti a rischio di sviluppare tumori o per familiarità o per età o per esposizione ambientale ad elementi tossici e/o a raggi UV; From what has already been explained, it is clear that the compositions that can be made with the Tuscan black cabbage extract according to the invention lend themselves to multiple applications both in the form of medicaments and food supplements that can be usefully used for both preventive and curative purposes in chemoprevention and / or chemoprotection: - in subjects at risk of developing tumors either due to familiarity or age or environmental exposure to toxic elements and / or UV rays;

- a livello del colon in soggetti già sottoposti a polipectomia allo scopo di prevenire eventuali recidive o in soggetti con infiammazioni ricorrenti dell’intestino crasso; - per ridurre l’infiammazione gastrica in presenza di gastriti indotte da Helicobacter pylori; - at the level of the colon in subjects already subjected to polypectomy in order to prevent possible relapses or in subjects with recurrent inflammation of the large intestine; - to reduce gastric inflammation in the presence of gastritis induced by Helicobacter pylori;

- per proteggere i polmoni dallo stress ossidativo indotto dal fumo di sigaretta, dallo smog o da esposizioni ad agenti chimici pro-ossidanti di varia natura, contrastando così lo sviluppo di un eventuale enfisema polmonare; - to protect the lungs from oxidative stress induced by cigarette smoke, smog or exposure to pro-oxidant chemical agents of various kinds, thus counteracting the development of any pulmonary emphysema;

- per aumentare i sistemi di difesa delle prime vie aeree facilitando la risoluzione di disturbi di tipo catarrale anche di origine batterica o virale. - to increase the defense systems of the upper airways, facilitating the resolution of catarrhal disorders, including those of bacterial or viral origin.

L’uso preferito si orienta però verso la protezione dell’apparato respiratorio, che per la sua fisiologica funzione si trova costantemente a contatto con microrganismi di varia natura e con un gran numero di sostanze chimiche pro-ossidanti, tossiche e cancerogeniche. However, the preferred use is oriented towards the protection of the respiratory system, which due to its physiological function is constantly in contact with microorganisms of various kinds and with a large number of pro-oxidant, toxic and carcinogenic chemicals.

Parte Sperimentale Experimental Part

Il contenuto in glucosinolati negli esempi riportati, anche quando non specificamente menzionato, à ̈ stato misurato mediante analisi HPLC in accordo con il metodo ufficiale ISO 9167-1 adottato dall'UE (EEC Regulation N°1864/90, 1990), descritto in dettaglio all’esempio 1. The glucosinolate content in the examples shown, even when not specifically mentioned, was measured by HPLC analysis in accordance with the official method ISO 9167-1 adopted by the EU (EEC Regulation N ° 1864/90, 1990), described in detail to example 1.

Il contenuto in sulforafano à ̈ stato valutato mediante cromatografia a fase inversa utilizzando come standard il sulforafano stesso, ottenuto per idrolisi a partire da una glucorafanina ad alto grado di purezza (>95% in HPLC) preparata in laboratorio. L’idrolisi à ̈ stata effettuata in tampone fosfato 0,1 M pH 7 con l’enzima mirosinasi, anch’esso purificato in laboratorio. Il sulforafano standard à ̈ stato prima estratto con acetato di etile in colonne EXtrelut NT1, poi portato a secco in rotovapor, risolubilizzato in diclorometano e aliquotato in boccetti pre-tarati per procedere alla completa evaporazione del solvente in corrente di azoto. Per preparare la curva di calibrazione il sulforafano à ̈ stato sciolto in acetonitrile al 10% a diversi livelli di concentrazione (da 1 a 0,1 mg/ml) e sottoposto ad analisi HPLC con rilevatore DAD (diode array detector) ad una lunghezza d’onda di assorbimento massimo UV di 240 nm. La validazione del metodo ha messo in evidenza che la procedura utilizzata può determinare una sottostima del contenuto in sulforafano inferiore al 10%. The sulforaphane content was evaluated by reverse phase chromatography using the sulforaphane as standard, obtained by hydrolysis starting from a high-purity glucoraphanin (> 95% in HPLC) prepared in the laboratory. The hydrolysis was carried out in phosphate buffer 0.1 M pH 7 with the enzyme myrosinase, also purified in the laboratory. The standard sulforaphane was first extracted with ethyl acetate in EXtrelut NT1 columns, then dried in rotovapor, resolubilized in dichloromethane and aliquoted in pre-calibrated bottles to proceed with the complete evaporation of the solvent in a nitrogen stream. To prepare the calibration curve, the sulforaphane was dissolved in 10% acetonitrile at different concentration levels (from 1 to 0.1 mg / ml) and subjected to HPLC analysis with DAD (diode array detector) at a length of € ™ wave of maximum UV absorption of 240 nm. The validation of the method has highlighted that the procedure used can determine an underestimation of the sulforaphane content of less than 10%.

I campioni da valutare sono stati estratti con acetato di etile in colonne EXtrelut NT1, portati a secco per eliminare completamente il solvente e risolubilizzati in una soluzione di acetonitrile al 50%. The samples to be evaluated were extracted with ethyl acetate in EXtrelut NT1 columns, dried to completely eliminate the solvent and resolubilized in a 50% acetonitrile solution.

Esempio 1: analisi del contenuto in glucosinolati di semi di diverse varietà di Brassica oleracea Example 1: analysis of the glucosinolate content of seeds of different varieties of Brassica oleracea

Per individuare la specie a più alto titolo di glucorafanina (GRA) à ̈ stato confrontato il contenuto di glucosinolati (GL) in semi di diverse varietà di Brassica oleracea forniti da Suba&Unico: To identify the species with the highest titer of glucoraphanin (GRA), the content of glucosinolates (GL) in seeds of different varieties of Brassica oleracea supplied by Suba & Unico was compared:

- broccolo calabrese biologico (OD22), - organic Calabrian broccoli (OD22),

- broccolo calabrese convenzionale (OD22), - conventional Calabrian broccoli (OD22),

- broccolo calabrese tardivo biologico (OD161), - organic late Calabrian broccoli (OD161),

- cavolo laciniato nero toscano convenzionale (OD74). - conventional Tuscan black kale (OD74).

Il contenuto in glucosinolati nei vari campioni à ̈ stato misurato mediante analisi HPLC in accordo con il metodo ufficiale ISO 9167-1 adottato dall'UE (EEC Regulation N°1864/90, 1990). I glucosinolati vengono estratti dai semi con etanolo 70% ad 80°C in rapporto 1:50-1:100 p/v. The glucosinolate content in the various samples was measured by HPLC analysis in accordance with the official method ISO 9167-1 adopted by the EU (EEC Regulation N ° 1864/90, 1990). The glucosinolates are extracted from the seeds with 70% ethanol at 80 ° C in a ratio of 1: 50-1: 100 w / v.

L’analisi consiste nella separazione dei desulfo-GL, ottenuti per desulfatazione enzimatica, mediante HPLC a fase inversa C-18 ed impiegando sinigrina come standard interno. Il riconoscimento dei GL à ̈ stato effettuato sulla base del tempo di ritenzione e dello spettro di assorbimento UV grazie al confronto con una libreria costruita nel laboratorio contenente i dati di più di 30 GL di riferimento. The analysis consists in the separation of the desulfo-GL, obtained by enzymatic desulfation, by means of C-18 reverse phase HPLC and using sinigrin as an internal standard. The recognition of the GL was carried out on the basis of the retention time and the UV absorption spectrum thanks to the comparison with a library built in the laboratory containing the data of more than 30 reference GL.

Le analisi HPLC effettuate sui campioni sopra elencati mostrano che i semi di cavolo nero toscano OD74 convenzionale presentano il contenuto totale di GL e la quantità percentuale di GRA più alti (tabelle 1 e 2). The HPLC analyzes carried out on the samples listed above show that conventional OD74 black cabbage seeds have the highest total GL content and percentage of GRA (Tables 1 and 2).

Tabella 1 - Confronto del contenuto di GL in semi di Brassica oleracea di diverse cultivar forniti da Suba&Unico (raccolto 2007) Table 1 - Comparison of the GL content in Brassica oleracea seeds of different cultivars supplied by Suba & Unico (2007 harvest)

GL (µmol*g<-1>) GL (µmol * g <-1>)

4-OH- GL Semi GIB PRO GRA SIN GER GBS 4-OH- GL Semi GIB PRO GRA SIN GER GBS

GBS totali Total GBS

1,01 0,83 23.7 2,3 16 1.01 0.83 23.7 2.3 16

OD22 Bio - - 43,84 OD22 Bio - - 43.84

± 0,06 ± 0,01 ± 0,3 ± 0,1 ± 1 ± 0.06 ± 0.01 ± 0.3 ± 0.1 ± 1

6,1 3,03 17 1,1 3,5 10 0,49 6.1 3.03 17 1.1 3.5 10 0.49

OD22 Conv 41,22 OD22 Conv 41.22

± 0,5 ± 0,06 ± 1 ± 0,1 ± 0,7 ± 1 ± 0,03 ± 0.5 ± 0.06 ± 1 ± 0.1 ± 0.7 ± 1 ± 0.03

8 3,8 21 1,3 3,2 13 0,39 OD161 Bio 50,69 8 3.8 21 1.3 3.2 13 0.39 OD161 Bio 50.69

± 1 ± 0,9 ± 1 ± 0,3 ± 0,9 ± 3 ± 0,01 ± 1 ± 0.9 ± 1 ± 0.3 ± 0.9 ± 3 ± 0.01

4,1 55 3,3 13 0,64 4.1 55 3.3 13 0.64

OD74 Conv - - 76,04 OD74 Conv - - 76.04

± 0,4 ± 4 ± 0,6 ± 1 ± 0,07 ± 0.4 ± 4 ± 0.6 ± 1 ± 0.07

Tabella 2 - Confronto del contenuto di GRA in semi di Brassica oleracea di diverse cultivar forniti da Suba&Unico (raccolto 2007). Table 2 - Comparison of the GRA content in Brassica oleracea seeds of different cultivars supplied by Suba & Unico (2007 harvest).

<GRA>GRA GL totali µmol GRA / Semi <GRA> GRA GL total µmol GRA / Seeds

(µmoli*g<-1>(mg*g<-1>seme) (µmoli*g<-1>µmol GL tot OD22 Bio 23,7 ± 0.3 11,3 43,84 54% (µmol * g <-1> (mg * g <-1> seed) (µmol * g <-1> µmol GL tot OD22 Bio 23.7 ± 0.3 11.3 43.84 54%

OD22 Conv 17 ± 1 8,1 41,22 41% OD22 Conv 17 ± 1 8.1 41.22 41%

OD161 Bio 21 ± 1 10,0 50,69 41% OD161 Bio 21 ± 1 10.0 50.69 41%

OD74 Conv 55 ± 4 26.2 76.04 72% OD74 Conv 55 ± 4 26.2 76.04 72%

Esempio 2: analisi del contenuto in glucosinolati di germogli di diverse varietà di Brassica oleracea Example 2: analysis of the glucosinolate content of sprouts of different varieties of Brassica oleracea

Semi di broccolo calabrese OD22 biologico e cavolo nero toscano OD74 sono stati fatti germogliare per verificare il loro contenuto in GL. In ogni ciclo di germogliazione 50 g di semi sono stati dapprima sterilizzati immergendoli per 7 minuti in etanolo al 20%, poi lavati tre volte con acqua deionizzata e posti in germinatore Vitaseed Suba&Unico che permette un’innaffiatura temporizzata ogni 2 ore. Il giorno stabilito (4° e 6° giorno dalla semina) per la raccolta i germogli sono stati brevemente lavati, privati delle cuticole e posti a -18°C. Dopo liofilizzazione sono stati macinati e la polvere à ̈ stata suddivisa in contenitori chiusi sotto vuoto e posti a -18°C. Organic OD22 Calabrian broccoli seeds and OD74 Tuscan black cabbage were sprouted to check their GL content. In each sprouting cycle, 50 g of seeds were first sterilized by immersing them for 7 minutes in 20% ethanol, then washed three times with deionized water and placed in the Vitaseed Suba & Unico germinator which allows timed watering every 2 hours. On the day established (4th and 6th day from sowing) for harvesting, the shoots were briefly washed, cuticles removed and placed at -18 ° C. After lyophilization they were ground and the powder was divided into vacuum sealed containers and placed at -18 ° C.

Il contenuto in GL misurati come descritto all’esempio 1 delle diverse varietà considerate à ̈ riportato in tabella 3. The GL content measured as described in example 1 of the different varieties considered is shown in table 3.

Tabella 3 - Confronto del contenuto di GL in germogli di Brassica oleracea. Table 3 - Comparison of GL content in Brassica oleracea sprouts.

GL (µmoli*g<-1>) GL (µmoles * g <-1>)

eo-Germogli GIB GRA<4-OH->GER GBS<4-OM->N eo-Sprouts GIB GRA <4-OH-> GER GBS <4-OM-> N

GL totali GBS GBS GBS OD22 Bio 20 2,4 15,1 0,9 1,09 2,8 Total GL GBS GBS GBS OD22 Bio 20 2.4 15.1 0.9 1.09 2.8

- 42,29 6 giorni ± 2 ± 0,2 ± 0,2 ± 0,3 ± 0,08 ± 0,4 - 42.29 6 days ± 2 ± 0.2 ± 0.2 ± 0.3 ± 0.08 ± 0.4

OD22 Bio 25,8 3,5 23 1,2 0,4 2,5 OD22 Bio 25.8 3.5 23 1.2 0.4 2.5

- 56,4 4 giorni ± 0,9 ± 0,3 ± 1 ± 0,1 ± 0,1 ± 0,2 - 56.4 4 days ± 0.9 ± 0.3 ± 1 ± 0.1 ± 0.1 ± 0.2

OD74 OD74

4,6 80 5,5 16,1 1,71 1,89 2,0 4.6 80 5.5 16.1 1.71 1.89 2.0

conv 111,8 conv 111.8

± 0,1 ± 2 ± 0,4 ± 0,6 ±0,07 ± 0,07 ± 0,4 ± 0.1 ± 2 ± 0.4 ± 0.6 ± 0.07 ± 0.07 ± 0.4

4 giorni* 4 days*

* privati di cuticola * without cuticle

Sono stati anche raccolti germogli di cavolo nero toscano OD74 di 5 giorni, ottenuti in tre cicli di germogliazione. I germogli sono stati liofilizzati, macinati e conservati a -18°C e sul materiale ottenuto à ̈ stato misurato il contenuto in GL (tabella 4). 5-day OD74 Tuscan black cabbage sprouts were also collected, obtained in three sprouting cycles. The sprouts were freeze-dried, ground and stored at -18 ° C and the GL content was measured on the material obtained (table 4).

Tabella 4 - Contenuto di GL nei germogli liofilizzati di OD74 di 5 giorni (media di otto determinazioni HPLC) Table 4 - GL content in 5 day OD74 lyophilized sprouts (mean of eight HPLC determinations)

GL µmoli*g<-1>mg*g<-1>p/p GL µmoles * g <-1> mg * g <-1> w / w

GIB 4,41 2,0 GIB 4.41 2.0

GRA 72,31 34,4 3,4% GRA 72.31 34.4 3.4%

4-OH-GBS 4,86 2,4 4-OH-GBS 4.86 2.4

GER 15,45 7,1 JER 15.45 7.1

GBS 1,10 0,5 GBS 1.10 0.5

4-OM-GBS 0,68 0,4 4-OM-GBS 0.68 0.4

Neo-GBS 1,65 0,9 Neo-GBS 1.65 0.9

TOTALI 100,47 47,7 4,8% TOTAL 100.47 47.7 4.8%

È stato anche verificato se la crescita in condizioni di luce o di buio potesse influenzare il contenuto in GL in germogli di cavolo nero toscano OD74. Il liofilizzato ottenuto dai germogli cresciuti al buio risulta di colore giallo anziché verde a causa della minor presenza di clorofilla; il contenuto di glucosinolati questi due preparati non mostra significative differenze. I dati analitici sono riportati in Tabella 5. It was also tested whether growth in light or dark conditions could affect the GL content in OD74 Tuscan black cabbage sprouts. The freeze-dried product obtained from sprouts grown in the dark is yellow instead of green due to the lower presence of chlorophyll; the glucosinolate content of these two preparations does not show significant differences. The analytical data are reported in Table 5.

Tabella 5 - Confronto tra il contenuto di GL nei germogli liofilizzati di OD74 cresciuti in luce naturale o al buio Table 5 - Comparison between the GL content in the freeze-dried sprouts of OD74 grown in natural light or in the dark

GL Luce Buio Luce/Buio µmoli* g<-1>µmoli* g<-1>% GL Light Dark Light / Dark µmoles * g <-1> µmoles * g <-1>%

GIB 4,41 4,61 96 GIB 4.41 4.61 96

GRA 72,31 71,63 101 GRA 72.31 71.63 101

4-OH-GBS 4,86 5,67 86 4-OH-GBS 4.86 5.67 86

GER 15,45 19,84 78 GER 15.45 19.84 78

GBS 1,10 1,00 110 GBS 1.10 1.00 110

4-OM-GBS 0,68 2,24 31 4-OM-GBS 0.68 2.24 31

Neo-GBS 1,65 2,72 61 Neo-GBS 1.65 2.72 61

TOTALI 100,47 107,70 93 TOTAL 100.47 107.70 93

Esempio 3: analisi del contenuto in glucosinolati di germogli di cavolo nero toscano dopo trattamento con microonde Example 3: analysis of the glucosinolate content of Tuscan black cabbage sprouts after treatment with microwaves

Le prove sono state condotte utilizzando un comune microonde da cucina e i germogli (circa 35 gr) sono stati trattati con tre diverse potenze di microonde, per raggiungere differenti valori di temperatura, rispetto al campione di controllo non trattato: 150 W per 1 minuto; 450 W per 1 minuto; 800 W per 1 minuto. I germogli sono poi stati congelati, liofilizzati e macinati. Sulla polvere sono state effettuate analisi dei glucosinolati e prove di autoidrolisi ad opera della mirosinasi endogena. Il contenuto in GL misurato con HPLC come descritto all’esempio 1 ha dato i risultati riportati in tabella 6. The tests were carried out using a common kitchen microwave and the sprouts (about 35 g) were treated with three different microwave powers, to reach different temperature values, compared to the untreated control sample: 150 W for 1 minute; 450 W for 1 minute; 800 W for 1 minute. The sprouts were then frozen, freeze-dried and ground. Glucosinolate analyzes and autohydrolysis tests by endogenous myrosinase were carried out on the powder. The GL content measured with HPLC as described in example 1 gave the results shown in table 6.

Tabella 6 – Contenuto di GL in germogli OD74 non trattati e trattati con microonde a 450 e 800 W Table 6 - GL content in untreated and microwaved OD74 sprouts at 450 and 800 W

GL Controllo 450 W 800 W GL Control 450 W 800 W

GIB 0,66 0,00 0,97 GIB 0.66 0.00 0.97

GRA 72,23 72,19 65,30 GRA 72.23 72.19 65.30

4-OH-GBS 4,80 4,73 3,70 4-OH-GBS 4.80 4.73 3.70

GER 12,42 13,00 11,38 JER 12.42 13.00 11.38

1,26 1,22 1.26 1.22

GBS 1,43 GBS 1.43

4-OM-GBS 1,16 1,83 1,84 4-OM-GBS 1.16 1.83 1.84

Neo-GBS 2,12 3,14 2,57 Neo-GBS 2.12 3.14 2.57

TOTALI 94,81 96,15 86,98 TOTAL 94.81 96.15 86.98

Esempio 4: determinazione dell’attività mirosinasica in germogli di cavolo nero toscano di 5 giorni con e senza trattamento con microonde in diverse condizioni a) attività mirosinasica totale Example 4: determination of myrosinase activity in Tuscan black cabbage sprouts of 5 days with and without treatment with microwaves in different conditions a) total myrosinase activity

L’attività totale (solubile insolubile) della mirosinasi à ̈ stata misurata con il metodo pH Stat Assay (pHSA). L’attività si determina misurando la quantità di ione H<+>rilasciato nel corso della reazione di idrolisi enzimatica del substrato sinigrina per mezzo di una titolazione con NaOH 1mM. The total activity (soluble insoluble) of myrosinase was measured with the pH Stat Assay (pHSA) method. The activity is determined by measuring the quantity of H <+> ion released during the enzymatic hydrolysis reaction of the sinigrin substrate by means of a titration with 1mM NaOH.

Questo saggio si effettua direttamente sui germogli liofilizzati con e senza pretrattamento con microonde e permette perciò di determinare l’attività totale della mirosinasi data dalla somma delle forme solubile ed insolubile. I risultati sono riportati in tabella 7. This test is carried out directly on freeze-dried sprouts with and without pre-treatment with microwaves and therefore allows to determine the total activity of myrosinase given by the sum of the soluble and insoluble forms. The results are reported in table 7.

Tabella 7 – Attività mirosinasica totale determinata con pHSA in germogli OD74 Table 7 - Total myrosinase activity determined with pHSA in OD74 sprouts

5gg 5 days

Germogli OD74 Attività* (U*g<-1>) Controllo (germogli da semi 2007) 12,2 ± 0,8 Controllo (germogli da semi 2008) 9,7 ± 0,4 Sprouts OD74 Activity * (U * g <-1>) Control (2007 seed sprouts) 12.2 ± 0.8 Control (2008 seed sprouts) 9.7 ± 0.4

Trattati 800 W per 1 minuto Treated 800W for 1 minute

<1,8 ± 0,2><1.8 ± 0.2>

(germogli da semi 2008) (sprouts from seeds 2008)

*1U = enzima in grado di idrolizzare 1 µmole SIN/min a 37°C a pH 7 Confrontando questi dati con quelli relativi all’attività della sola forma solubile dell’enzima, che ha dato risultati negativi, (dati non riportati) si à ̈ concluso che i germogli liofilizzati contengono l’enzima mirosinasi in una forma insolubile, ma attiva e che il trattamento termico con microonde causa una inattivazione solo parziale della mirosinasi. * 1U = enzyme able to hydrolyze 1 µmole SIN / min at 37 ° C at pH 7 Comparing these data with those relating to the activity of the soluble form of the enzyme alone, which gave negative results, (data not shown) It was concluded that the freeze-dried sprouts contain the enzyme myrosinase in an insoluble but active form and that the microwave heat treatment causes only partial inactivation of the myrosinase.

Su campioni di germogli di cavolo nero toscano trattati con microonde e e liofilizzati si à ̈ misurata successivamente l’autoidrolisi della GRA in sulforafano (SF). The autohydrolysis of GRA in sulforaphane (SF) was subsequently measured on samples of Tuscan black cabbage sprouts treated with microwaves and freeze-dried.

b) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in tampone fosfato b) glucoraphanine autohydrolysis into sulforaphane in phosphate buffer

Germogli liofilizzati di OD74 trattati con microonde sono stati omogeneizzati in tampone fosfato 25 mM pH 7 e lasciati per 2 ore in agitazione a 37°C. Il controllo à ̈ costituto da germogli liofilizzati non trattati. I risultati sono riportati in tabella 8. Freeze-dried sprouts of OD74 treated with microwaves were homogenized in phosphate buffer 25 mM pH 7 and left under stirring for 2 hours at 37 ° C. The control consists of untreated freeze-dried sprouts. The results are reported in table 8.

Tabella 8 – Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in tampone fosfato 25 mM pH 7 Table 8 - Conversion of GRA into SF following autohydrolysis in phosphate buffer 25 mM pH 7

% conversione in % conversion to

% SF (p/p Campione µmoli SF * g<-1>SF della GRA % SF (w / w Sample µmol SF * g <-1> SF of the GRA

germogli) iniziale* sprouts) initial *

Controllo 6,9 10% 0,1% Control 6.9 10% 0.1%

150 W 40,0 55% 0,7% 150 W 40.0 55% 0.7%

450 W 55,5 77% 1,0% 450 W 55.5 77% 1.0%

800 W 60,5 84% 1,1% 800 W 60.5 84% 1.1%

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>* reference value of 72 µmoles * g <-1>

L’autoidrolisi di germogli trattati con microonde ad 800 W per 1 minuto e liofilizzati ha fornito una resa in sulforafano dell’84%, valore più elevato rispetto all’idrolisi in acqua riportata in seguito in tabella 9. The auto-hydrolysis of sprouts treated with microwaves at 800 W for 1 minute and freeze-dried gave a sulforaphane yield of 84%, a higher value than the hydrolysis in water shown below in table 9.

c) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in acqua c) glucoraphanine autohydrolysis to sulforaphane in water

Sono state eseguite due prove trattando con microonde i germogli in “piccole quantità†(A) ed in “grande quantità†(B). Nella prova A sono stati trattati circa 35 g di germogli, nella B circa 300 g. La prova di autoidrolisi à ̈ stata condotta omogeneizzando il campione in acqua e lasciandolo per 2 ore in agitazione a 37°C. Two tests were carried out by treating the sprouts in â € œsmall quantitiesâ € (A) and in â € œlarge quantitiesâ € (B) with microwaves. In test A about 35 g of sprouts were treated, in B about 300 g. The autohydrolysis test was carried out by homogenizing the sample in water and leaving it stirred for 2 hours at 37 ° C.

Tabella 9 - Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in acqua % conversione in Table 9 - Conversion of GRA into SF following autohydrolysis in water% conversion into

Campione µmoli SF * g<-1>% SF (p/p SF della GRA Sample µmoles SF * g <-1>% SF (w / w SF of the GRA

germogli) iniziale* sprouts) initial *

800 W prova A 46,2 64% 0,8% 450 W prova B 14,7 20% 0,3% 800 W prova B 34,4 48% 0,6% *valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>800 W test A 46.2 64% 0.8% 450 W test B 14.7 20% 0.3% 800 W test B 34.4 48% 0.6% * reference value of 72 µmoles * g <- 1>

L’idrolisi in acqua dei germogli trattati a 800 W (prova A) ha fornito una quantità di sulforafano inferiore a quella ottenuta con la prova analoga eseguita in soluzione tamponata a pH 7. E’ risultata una trasformazione del 64% della GRA presente nei germogli di partenza. L’autoidrolisi del campione prova B ha evidenziato un recupero in sulforafano minore rispetto a quella A. Questo risultato à ̈ presumibilmente da imputare al fatto che la quantità elevata di germogli all’interno del forno a microonde non ha consentito al vegetale di raggiungere una temperatura uniforme e la completa disattivazione della proteina ESP. Hydrolysis in water of the sprouts treated at 800 W (test A) provided a quantity of sulforaphane lower than that obtained with the similar test carried out in a buffered solution at pH 7. A transformation of 64% of the GRA present resulted. in the starting shoots. The autohydrolysis of test sample B showed a lower recovery in sulforaphane than that of A. This result is presumably due to the fact that the high quantity of sprouts inside the microwave oven did not allow the vegetable to reach a uniform temperature and complete deactivation of the ESP protein.

Al fine di valutare una prima stabilità del sulforafano ottenuto, il campione di germogli trattati a 800 W, relativo alla prova B, dopo autoidrolisi à ̈ stato congelato e liofilizzato. Su questo campione liofilizzato à ̈ stata effettuata una analisi del sulforafano dopo 6 giorni di conservazione a 4° C. Dal confronto tra le tabelle 9 e 10 si nota che dopo 6 giorni nel campione analizzato à ̈ ancora presente tutto il sulforafano. In order to evaluate an initial stability of the sulforaphane obtained, the sample of sprouts treated at 800 W, relating to test B, was frozen and freeze-dried after autohydrolysis. An analysis of sulforaphane was carried out on this lyophilized sample after 6 days of storage at 4 ° C. From the comparison between tables 9 and 10 it is noted that after 6 days all the sulforaphane is still present in the sample analyzed.

Tabella 10 – Contenuto di sulforafano in germogli OD74 trattati a 800W, Table 10 - Sulforaphane content in OD74 sprouts treated at 800W,

autoidrolizzati, liofilizzati e conservati per sei giorni. self-hydrolyzed, freeze-dried and stored for six days.

% conversione % conversion

% SF (p/p Campione µmoli SF * g<-1>in SF della % SF (w / w Sample µmoles SF * g <-1> in SF of

germogli) GRA iniziale* sprouts) initial GRA *

800 W 34,4 48% 0,6% 800 W 34.4 48% 0.6%

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>* reference value of 72 µmoles * g <-1>

d) autoidrolisi glucorafanina in sulforafano in ambiente acido d) glucoraphanine autohydrolysis into sulforaphane in an acid medium

I germogli, sia non trattati che pre-trattati con microonde, se posti in autoidrolisi in soluzione acida per HCl a pH 3 mostrano una bassa resa in sulforafano (tabella 11). Per questo motivo à ̈ necessario evitare che l’idrolisi della GRA avvenga in un ambiente acido, come ad esempio quello dello stomaco, a meno che non si voglia effettivamente far idrolizzare la glucorafanina a livello gastrico per ottenere una specifica attività a livello locale . The sprouts, both untreated and pre-treated with microwaves, if placed in autohydrolysis in acid solution for HCl at pH 3 show a low yield in sulforaphane (table 11). For this reason it is necessary to avoid that the hydrolysis of GRA takes place in an acid environment, such as that of the stomach, unless you actually want to hydrolyze glucoraphanin in the stomach to obtain a specific activity at the local level.

Tabella 11 – Conversione della GRA in SF in seguito ad autoidrolisi in soluzione acida per HCl a pH 3 Table 11 - Conversion of GRA into SF following autohydrolysis in acid solution for HCl at pH 3

% conversione in % conversion to

Germogli Sprouts

SF OD74 SF OD74

della GRA iniziale* of the initial GRA *

Controllo 12 % Control 12%

Trattati 800 W 7,5 % Treated 800 W 7.5%

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>* reference value of 72 µmoles * g <-1>

Da prove eseguite in precedenza era emerso che nei germogli trattati al microonde l’enzima mirosinasi mantiene un’attività ridotta, ma tale da permettere la completa idrolisi della GRA presente inizialmente in soli 10 minuti. Per questo motivo germogli trattati con microonde e lasciati anche solo brevemente a temperatura ambiente presentano un contenuto di GRA minore di quello atteso (vedi tabella 12). Al fine di ottenere un prodotto liofilizzato al maggior contenuto di GRA à ̈ quindi necessario procedere, dopo trattamento con microonde, ad un immediato congelamento. Si può operare con un congelatore oppure, in scala di laboratorio, immergendo i germogli in azoto liquido. Il miglior prodotto si ottiene pertanto da germogli trattati con microonde 800 W per 1 minuto e immersi in azoto liquido o congelati rapidamente. Previous tests had shown that the myrosinase enzyme maintains a reduced activity in microwaved sprouts, but such as to allow complete hydrolysis of the GRA initially present in just 10 minutes. For this reason, sprouts treated with microwaves and left even only briefly at room temperature have a lower GRA content than expected (see table 12). In order to obtain a freeze-dried product with the highest content of GRA it is therefore necessary to proceed, after treatment with microwaves, to an immediate freezing. You can operate with a freezer or, on a laboratory scale, by immersing the sprouts in liquid nitrogen. The best product is therefore obtained from sprouts treated with 800 W microwaves for 1 minute and immersed in liquid nitrogen or quickly frozen.

Su questo prodotto liofilizzato in polvere, à ̈ stata eseguita la valutazione della quantità di GRA e del sulforafano ottenuto in seguito alla reazione operata dall’enzima residuo endogeno, sia in soluzione tamponata, sia in acqua. I risultati sono riportati in Tabella 12. The quantity of GRA and sulforaphane obtained following the reaction carried out by the endogenous residual enzyme, both in buffered solution and in water, was evaluated on this lyophilized product in powder form. The results are reported in Table 12.

Tabella 12 – Sulforafano ottenuto per autoidrolisi in acqua ed in tampone fosfato di germogli OD74 trattati 800 W per 1 min, immersi in azoto liquido e liofilizzati % conversione Germogli OD74 trattati 800 W GRA SF Table 12 - Sulforaphane obtained by autohydrolysis in water and phosphate buffer of OD74 sprouts treated 800 W for 1 min, immersed in liquid nitrogen and freeze-dried% conversion Sprouts OD74 treated 800 W GRA SF

in SF della per 1 min (µmoli * g<-1>) (µmoli * g<-1>) in SF of the for 1 min (µmoles * g <-1>) (µmoles * g <-1>)

GRA* Campione trattato, lasciato a T. GRA * Treated sample, left to T.

38 (1,8% p/p) nd nd amb. e liofilizzato 38 (1.8% w / w) na na amb. and freeze-dried

Campione trattato, congelato Processed, frozen sample

immediatamente con N2liquido 61 (2,9% p/p) nd nd e liofilizzato immediately with liquid N2 61 (2.9% w / w) na na and lyophilisate

Autoidrolizzati 30 min in H2O - 47,7 66 Autoidrolizzati 30 min in Auto-hydrolyzed 30 min in H2O - 47.7 66 Auto-hydrolyzed 30 min in

- 53,9 75 tampone fosfato 30 mM pH 7,8 - 53.9 75 30 mM phosphate buffer pH 7.8

*valore di riferimento di 72 µmoli * g<-1>* reference value of 72 µmoles * g <-1>

Complessivamente dalle prove di idrolisi della GRA con la mirosinasi endogena si evince che: a) la resa in sulforafano dipende dal pH a cui avviene la reazione ed in particolare pH 3 < pH 5 (acqua) < pH 7 (tampone fosfato); b) la trasformazione della glucorafanina in sulforafano aumenta in seguito ad un trattamento con microonde grazie all’inattivazione del cofattore enzimatico ESP, con rese di conversione del 75-85% in ambiente tamponato a pH 7. Overall, from the hydrolysis tests of GRA with endogenous myrosinase it is clear that: a) the sulforaphane yield depends on the pH at which the reaction takes place and in particular pH 3 <pH 5 (water) <pH 7 (phosphate buffer); b) the transformation of glucoraphanin into sulforaphane increases following a treatment with microwaves thanks to the inactivation of the enzymatic cofactor ESP, with conversion yields of 75-85% in a buffered environment at pH 7.

Esempio 5: preparazione di estratti da germogli di cavolo nero toscano OD74 liofilizzati con alto titolo in glucorafanina. Example 5: preparation of extracts from freeze-dried Tuscan black cabbage sprouts OD74 with a high titer in glucoraphanine.

a) estrazione in acqua a freddo di germogli liofilizzati di OD74 a) cold water extraction of freeze-dried OD74 sprouts

La liofilizzazione di un estratto idroalcolico deve essere preceduta da una fase di evaporazione del solvente e comunque comporta alcune difficoltà dovute alla presenza di residui di etanolo. Si à ̈ deciso pertanto di eseguire un’estrazione in acqua in bagno di ghiaccio. L’analisi HPLC dei glucosinolati presenti nell’estratto acquoso a freddo mostra però una perdita del 90% dei composti. Il risultato negativo à ̈ da attribuire all’enzima mirosinasi endogeno che à ̈ in grado di agire anche a basse temperature durante le fasi di omogeneizzazione e separazione solido-limpido. Le estrazioni acquose sono quindi da escludere per la preparazioni di estratti ad alto titolo in GL dai germogli liofilizzati di OD74. The freeze-drying of a hydroalcoholic extract must be preceded by an evaporation phase of the solvent and in any case involves some difficulties due to the presence of ethanol residues. It was therefore decided to perform an extraction in water in an ice bath. However, the HPLC analysis of the glucosinolates present in the aqueous cold extract shows a loss of 90% of the compounds. The negative result is to be attributed to the endogenous myrosinase enzyme which is able to act even at low temperatures during the phases of homogenization and solid-clear separation. Aqueous extractions are therefore to be excluded for the preparation of high-titre extracts in GL from freeze-dried sprouts of OD74.

b) estrazioni idroalcolica in etanolo 70% a diverse temperature b) hydroalcoholic extractions in 70% ethanol at different temperatures

Sono state effettuate delle prove di estrazione con etanolo al 70% a diverse temperature (tabella 13): Extraction tests were carried out with 70% ethanol at different temperatures (table 13):

- 80°C; - 80 ° C;

- freddo (etanolo 70% pre-raffreddato a -20°C, omogeneizzazione in bagno di ghiaccio); - cold (70% ethanol pre-cooled to -20 ° C, homogenization in an ice bath);

- temperatura ambiente. - room temperature.

Le analisi non evidenziano nessuna differenza significativa nell’efficienza di estrazione e non sono state riscontrate perdite di GL per idrolisi enzimatica a carico della mirosinasi endogena presente nei germogli. Sembra quindi che la sola presenza dell’alcol sia sufficiente ad inibire attività enzimatica. The analyzes did not show any significant difference in the extraction efficiency and no losses of GL were found due to enzymatic hydrolysis by the endogenous myrosinase present in the sprouts. It therefore seems that the mere presence of alcohol is sufficient to inhibit enzymatic activity.

Tabella 13 - Confronto tra il valore di GL dei germogli liofilizzati di OD74 ottenuto mediante estrazione a 80°C, a freddo e a temperatura ambiente 80°C Freddo T ambiente Table 13 - Comparison between the GL value of the freeze-dried sprouts of OD74 obtained by extraction at 80 ° C, cold and at room temperature 80 ° C Cold T room

GL GL

(µmoli*g<-1>) (µmoli*g<-1>) (µmoli*g<-1>)* (µmol * g <-1>) (µmol * g <-1>) (µmol * g <-1>) *

GIB 4,4 4,0 0,0 GIB 4.4 4.0 0.0

GRA 72,3 71,9 77,4 GRA 72.3 71.9 77.4

4-OH-GBS 4,9 3,3 4,4 4-OH-GBS 4.9 3.3 4.4

GER 15,4 17,1 11,8 GER 15.4 17.1 11.8

GBS 1,1 0,9 1,5 GBS 1.1 0.9 1.5

4-OM-GBS 0,7 0,8 1,1 4-OM-GBS 0.7 0.8 1.1

Neo-GBS 1,7 1,2 2,4 Neo-GBS 1.7 1.2 2.4

TOTALI 100,5 99,2 98,6 TOTAL 100.5 99.2 98.6

*Germogli ottenuti da semi del 2008 * Sprouts obtained from 2008 seeds

c) estratto idroalcolico da germogli liofilizzati OD74 ad elevato contenuto di GRA Germogli liofilizzati di OD74 sia non trattati che trattati con microonde, sono stati impiegati per la preparazione di un estratto idroalcolico (etanolo al 70%) a freddo. In base ai risultati sopra menzionati si à ̈ proceduto con due estrazioni successive con Ultraturrax in bagno di ghiaccio perché le analisi hanno evidenziato, nella seconda estrazione, una percentuale non trascurabile di GL. Dopo evaporazione dell’etanolo in rotovapor a 45°C, il campione à ̈ stato diluito con acqua ad un volume circa pari a quello iniziale e liofilizzato. Il peso dell’estratto liofilizzato ottenuto à ̈ risultato circa 1/4 del peso iniziale di germogli liofilizzati. L’estratto secco à ̈ stato analizzato per il contenuto dei GL mediante analisi HPLC dei desulfo-derivati e la concentrazione di GL rispetto ai germogli à ̈ risultata maggiore di circa 4 volte, con la GRA che raggiunge il 13% in peso. c) hydroalcoholic extract from OD74 freeze-dried sprouts with high GRA content Both untreated and microwaved freeze-dried OD74 sprouts were used for the preparation of a cold hydroalcoholic extract (70% ethanol). On the basis of the above-mentioned results, two successive extractions were carried out with Ultraturrax in an ice bath because the analyzes showed, in the second extraction, a non-negligible percentage of GL. After evaporation of the ethanol in rotovapor at 45 ° C, the sample was diluted with water to a volume approximately equal to the initial one and lyophilized. The weight of the freeze-dried extract obtained was approximately 1/4 of the initial weight of freeze-dried sprouts. The dry extract was analyzed for the GL content by HPLC analysis of the desulfo-derivatives and the concentration of GL with respect to the sprouts was found to be approximately 4 times higher, with the GRA reaching 13% by weight.

Le analisi HPLC del prodotto liofilizzato ottenuto sono riportati di seguito (tabella 14). The HPLC analyzes of the lyophilized product obtained are shown below (table 14).

Tabella 14 - Contenuto di GL nell’estratto idroalcolico liofilizzato ottenuto dai germogli di OD74 (media di quattro determinazioni HPLC) GL µmoli*g<-1>mg*g<-1>% p/p Table 14 - GL content in lyophilized hydroalcoholic extract obtained from OD74 sprouts (average of four HPLC determinations) GL µmoles * g <-1> mg * g <-1>% w / w

GIB 17,5 8,1 0,8 GIB 17.5 8.1 0.8

GRA 273,4 130,1 13,0 GRA 273.4 130.1 13.0

4-OH-GBS 23,5 11,8 1,1 4-OH-GBS 23.5 11.8 1.1

GER 91,5 42,0 4,2 GER 91.5 42.0 4.2

GBS 6,0 2,9 0,3 GBS 6.0 2.9 0.3

4-OM-GBS 5,5 2,8 0,3 4-OM-GBS 5.5 2.8 0.3

Neo-GBS 9,2 4,7 0,5 Neo-GBS 9.2 4.7 0.5

TOTALI 426,6 202,5 20 TOTAL 426.6 202.5 20

d) estratto liofilizzato addizionato con trealosio d) lyophilized extract added with trehalose

L’estratto idroalcolico liofilizzato che à ̈ stato ottenuto à ̈ risultato possedere una buona dotazione di glucosinolati totali e di GRA in particolare, ma si presenta appiccicoso causa l’elevata igroscopicità. Per ridurre l’inconveniente, si à ̈ deciso quindi di provare ad addizionare trealosio all’estratto, prima della liofilizzazione. Di seguito si riportano in dettaglio i risultati delle relative analisi. The lyophilized hydroalcoholic extract that has been obtained has a good supply of total glucosinolates and GRA in particular, but is sticky due to its high hygroscopicity. To reduce the inconvenience, it was therefore decided to try adding trehalose to the extract, before freeze-drying. The results of the related analyzes are detailed below.

Tabella 15 – Contenuto di GRA in estratti idroalcolici liofilizzati di germogli di OD74 Table 15 - GRA content in freeze-dried hydroalcoholic extracts of OD74 sprouts

Estratto liofilizzato Lyophilized extract

GRA (µmoli * g<-1>) GRA % (p/p) GRA (µmoles * g <-1>) GRA% (w / w)

da germogli OD74 from OD74 sprouts

Controllo (da semi 2007) 273 13,0 Control (from 2007 seeds) 273 13.0

Con âˆ1⁄430% Trealosio<173 8,2>With âˆ1⁄430% Trehalose <173 8.2>

Il trealosio ha ridotto notevolmente l’igroscopicità dell’estratto liofilizzato, ma ha inciso ovviamente sul contenuto % in peso di GRA. Trehalose significantly reduced the hygroscopicity of the lyophilized extract, but obviously affected the% by weight content of GRA.

L’estratto liofilizzato ottenuto presenta una buona dotazione di GRA, ma à ̈ completamente privo dell’enzima mirosinasi necessario per la trasformazione del composto in sulforafano. Di conseguenza à ̈ stato messo a punto un procedimento per preparare un estratto di senape arricchito in mirosinasi che, opportunamente miscelato all’estratto liofilizzato contenente GRA, ne permetta l’idrolisi. The lyophilized extract obtained has a good amount of GRA, but is completely devoid of the enzyme myrosinase necessary for the transformation of the compound into sulforaphane. Consequently, a procedure has been developed to prepare a mustard extract enriched in myrosinase which, when suitably mixed with the lyophilized extract containing GRA, allows its hydrolysis.

Esempio 6: preparazione di un estratto liofilizzato di mirosinasi attiva per la trasformazione della glucorafanina in sulforafano Example 6: preparation of a lyophilized extract of active myrosinase for the transformation of glucoraphanin into sulforaphane

Semi di senape (Sinapis alba L.) sono stati estratti con acqua deionizzata in rapporto 1:10 p/p a temperatura ambiente, data la stabilità termica della mirosinasi. Dopo centrifugazione e filtrazione, una parte dell’estratto à ̈ stato posto per due giorni in dialisi con tubo di cut-off 12-14 kD, contro acqua deionizzata. Sia il campione filtrato, sia quello dializzato sono stati posti a -20°C e successivamente liofilizzati, con e senza l’aggiunta di trealosio all’1% come stabilizzante. Mustard seeds (Sinapis alba L.) were extracted with deionized water in a ratio of 1:10 w / w at room temperature, given the thermal stability of myrosinase. After centrifugation and filtration, a part of the extract was placed for two days in dialysis with a 12-14 kD cut-off tube, against deionized water. Both the filtered and dialyzed samples were placed at -20 ° C and subsequently lyophilized, with and without the addition of 1% trehalose as stabilizer.

Dopo la liofilizzazione à ̈ stato effettuato su ogni campione solido il saggio spettrofotometrico diretto di attività mirosinasica come descritto all’esempio 4. After lyophilization, the direct spectrophotometric assay of myrosinase activity was carried out on each solid sample as described in example 4.

Tabella 16 – Attività mirosinasica in estratti di senape liofilizzati prima e dopo dialisi e in presenza o assenza di trealosio all’1%. Table 16 - Myrosinase activity in freeze-dried mustard extracts before and after dialysis and in the presence or absence of 1% trehalose.

Liofilizzato di Attività Activity Lyophilisate

Estratto filtrato(A) 50 U/g Filtered extract (A) 50 U / g

Estratto filtrato trealosio 1% (B) 40 U/g Trehalose filtered extract 1% (B) 40 U / g

Estratto dializzato (C) 500 U/g Dialysate extract (C) 500 U / g

Estratto dializzato trealosio 1% (D) 100 U/g Trehalose dialyzed extract 1% (D) 100 U / g

Il prodotto indicato con la lettera C à ̈ risultato possedere la più elevata attività enzimatica riferita al peso ed à ̈ da preferire per la preparazione di formulati con l’estratto idroalcolico liofilizzato. The product indicated with the letter C was found to have the highest enzymatic activity related to weight and is preferable for the preparation of formulations with lyophilized hydroalcoholic extract.

Esempio 7: idrolisi dei GL di germogli di cavolo nero toscano con estratto di senape dializzato e liofilizzato Example 7: hydrolysis of the GL of Tuscan black cabbage sprouts with dialyzed and freeze-dried mustard extract

a) idrolisi in acqua a) hydrolysis in water

A 2 ml di estratto idroalcolico liofilizzato e risolubilizzato in acqua, con una concentrazione di GRA di 28 µmoli/ml, sono stati aggiunti 2,0 mg di liofilizzato di estratto di senape dializzato di tipo C, corrispondenti ad 1 U. 2.0 mg of dialysate type C mustard extract lyophilisate, corresponding to 1 U, was added to 2 ml of lyophilized and resolubilized hydroalcoholic extract in water, with a GRA concentration of 28 µmol / ml.

Dopo 30 minuti la soluzione à ̈ risultata torbida a causa della formazione di sulforafano, scarsamente solubile in acqua. Dopo 3 ore il campione à ̈ stato analizzato come segue: After 30 minutes the solution was cloudy due to the formation of sulforaphane, which is poorly soluble in water. After 3 hours the sample was analyzed as follows:

- analisi dei glucosinolati per determinare la percentuale di GRA idrolizzata; - analisi del sulforafano: tramite estrazione in colonna EXtrelut e analisi HPLC; - analysis of glucosinolates to determine the percentage of hydrolyzed GRA; - sulforaphane analysis: by extraction in EXtrelut column and HPLC analysis;

- analisi della presenza di isotiocianati coniugati a proteine con il metodo del benzeneditiolo (del tione); - analysis of the presence of isothiocyanates conjugated to proteins with the benzenedithiol (del thione) method;

- analisi del sulforafano dopo che un’aliquota di campione à ̈ stata liofilizzata e risolubilizzata in un uguale volume di acqua. - sulforaphane analysis after an aliquot of sample has been lyophilized and resolubilized in an equal volume of water.

I risultati sono di seguito riportati in figura 1 e 2: The results are shown below in figure 1 and 2:

- dopo le tre ore di reazione il cromatogramma HPLC presenta un piccolo picco corrispondente alla GRA (figura 1). L’idrolisi à ̈ avvenuta al 95%, indicando l’uso di una quantità di mirosinasi leggermente scarsa; - after the three hours of reaction the HPLC chromatogram shows a small peak corresponding to the GRA (figure 1). The hydrolysis occurred at 95%, indicating the use of a slightly scarce quantity of myrosinase;

- il sulforafano à ̈ risultato essere 18,9 µmoli/ml di soluzione corrispondente a circa il 67% della quantità di µmoli/ml di GRA iniziale; - the sulforaphane was found to be 18.9 µmoles / ml of solution corresponding to approximately 67% of the quantity of µmoles / ml of initial GRA;

- l’analisi con il metodo del Tione ha fornito un dato che corrisponde a una quantità totale di isotiocianati di 17,6 µmoli/ml, ad indicare che tutto il sulforafano che si à ̈ formato dall’idrolisi enzimatica dell’estratto rimane in forma libera e non si coniuga a proteine; - the analysis with the Tione method provided a data that corresponds to a total quantity of isothiocyanates of 17.6 µmoles / ml, indicating that all the sulforaphane that is formed by the enzymatic hydrolysis of the extract remains in free form and does not combine with proteins;

- dopo la liofilizzazione del campione idrolizzato, il sulforafano à ̈ risultato essere corrispondente a 16,7 µmoli/ml (figura 2), con una perdita di circa il 5-10%. - after lyophilization of the hydrolyzed sample, the sulforaphane was found to correspond to 16.7 µmoles / ml (figure 2), with a loss of about 5-10%.

b) idrolisi in tampone fosfato b) hydrolysis in phosphate buffer

275 mg di estratto idroalcolico liofilizzato sono stati solubilizzati in 25 ml di tampone fosfato 25 mM pH 7 (concentrazione GRA di circa 3 µmoli/ml). Ad essi sono stati aggiunti 12,6 mg di liofilizzato di estratto di senape dializzato “tipo C†(circa 6 U di mirosinasi). 275 mg of lyophilized hydroalcoholic extract were solubilized in 25 ml of phosphate buffer 25 mM pH 7 (GRA concentration of about 3 µmol / ml). To these were added 12.6 mg of dialysate mustard extract lyophilisate â € œtype Câ € (about 6 U of myrosinase).

Al termine dell’idrolisi enzimatica del campione (over night), sono state eseguite le analisi HPLC del sulforafano prima e dopo la liofilizzazione. 1 ml di ciascuno dei due campioni à ̈ stato estratto in colonna EXtrelut ed eluito con 6 ml di Acetato di Etile, ottenendo un volume di eluato di 5,0 e 5,2 ml rispettivamente. Di questi 300 µl sono stati portati a secco e risolubilizzati in un uguale volume di acetonitrile al 10% per l’esecuzione dell’analisi HPLC. I risultati ottenuti mostrano che: At the end of the enzymatic hydrolysis of the sample (over night), HPLC analyzes of the sulforaphane were performed before and after lyophilization. 1 ml of each of the two samples was extracted in the EXtrelut column and eluted with 6 ml of Ethyl Acetate, obtaining an eluate volume of 5.0 and 5.2 ml respectively. Of these 300 µl were brought to dryness and resolubilized in an equal volume of 10% acetonitrile for the execution of the HPLC analysis. The results obtained show that:

- il valore di concentrazione del sulforafano à ̈ risultato superiore a 3 µmoli/ml, indicando una completa trasformazione della GRA dell’estratto idroalcolico liofilizzato; - the concentration value of sulforaphane was higher than 3 µmol / ml, indicating a complete transformation of the GRA of the lyophilized hydroalcoholic extract;

- il campione idrolizzato e liofilizzato ha fornito un valore di sulforafano di circa il 68% rispetto a quello presente prima del processo di liofilizzazione. La concentrazione di GRA risulta stabile in tutti i preparati liofilizzati (germogli o estratto idroalcolico), se tenuti al riparo dall’umidità, almeno per sei mesi a temperatura ambiente, e per anni a -20°C. - the hydrolyzed and lyophilized sample gave a sulforaphane value of about 68% compared to that present before the lyophilization process. The concentration of GRA is stable in all lyophilized preparations (sprouts or hydroalcoholic extract), if kept away from humidity, at least for six months at room temperature, and for years at -20 ° C.

Esempio 8: effetto su enzimi detossificanti ed antiossidanti di Fase 2 di estratti idroalcolici di Brassica oleracea L. var. acephala subivar. Laciniata L. in combinazione con estratti di Sinapis alba L. in epatociti di ratto Example 8: effect on Phase 2 detoxifying and antioxidant enzymes of hydroalcoholic extracts of Brassica oleracea L. var. acephala subivar. Laciniata L. in combination with Sinapis alba L. extracts in rat hepatocytes

Le colture di epatociti primari di ratto sono un ottimo modello in vitro per studi farmaco-tossicologici. Per mimare una situazione paragonabile a quella in vivo à ̈ importante utilizzare una coltura tridimensionale di epatociti messi in coltura tra due strati di collagene che permettono il ripristino della polarità cellulare, la secrezione di sostanze come albumina, transferrina, fibrinogeno, urea e sali biliari ed il mantenimento di alcune funzioni cellulari come l’adesione, la migrazione, la differenziazione, la regolazione della crescita, l’espressione genica se mantenute per più di sei settimane in queste condizioni. Cultures of primary rat hepatocytes are an excellent in vitro model for pharmaco-toxicological studies. To mimic a situation comparable to that in vivo, it is important to use a three-dimensional culture of hepatocytes cultured between two layers of collagen that allow the restoration of cell polarity, the secretion of substances such as albumin, transferrin, fibrinogen, urea and bile salts and the maintenance of some cellular functions such as adhesion, migration, differentiation, growth regulation, gene expression if maintained for more than six weeks in these conditions.

Isolamento di epatociti di ratto: Isolation of rat hepatocytes:

Ratti maschi Sprague Dawley del peso di circa 200 g, sono stati anestetizzanti mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di sodio pentobarbitale (0,1 ml/100g), dopodiché à ̈ stata effettuata un’incisione ad U sull’addome dell’animale. L’apertura della cavità addominale ha permesso l’estrazione del fegato che à ̈ stato sottoposto a perfusione in un apparato termostatato a 42°C con 5% CO2e 95% O2. La perfusione à ̈ stata effettuata in due fasi, mediante l’utilizzo di una cannula di vetro inserita nella vena porta. Nel primo passaggio à ̈ stata perfusa una soluzione tampone Krebs-Henseleit buffer (KHB) priva di calcio (soluzione sterile a pH 7,4 contenente NaHCO30,154 M, NaCl 0,154 M, KH2PO40,154 M,MgSO40,154 M), per la totale rimozione del sangue dall’organo; in un secondo momento, à ̈ stata utilizzata una soluzione tampone KHB contenente calcio (soluzione sterile a pH 7,4 contenente Ca2<+>-free KHB e CaCl20,11 M) e collagenasi (50 mg/100ml), per indurre la digestione della matrice di collagene. Dopo 40 minuti di perfusione, sono state purificate le cellule. Gli epatociti sono stati sospesi in mezzo Leibovitz contenente albumina sierica bovina al 0,2% (BSA) e filtrati in modo da ottenere un sedimento cellulare. Dopo la rimozione del sopranatante, le cellule sono state lavate in HEPES (soluzione sterile a pH 7,65 contenente 0,8% NaCl, 0,01% NaH2PO4.12H2O, 0,02% KCl,0,038% HEPES) per tre volte a 700 rpm per 2 minuti. Il pellet cellulare ottenuto à ̈ stato risospeso in terreno di coltura William’s denominato T0(terreno William’s supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS), antibiotici quali penicillina, streptomicina, kanamycina, ampicillina e 0,5 U/ml di insulina). Prima di utilizzare gli epatociti per studi in vitro à ̈ stato necessario determinarne la vitalità mediante conta cellulare con il Trypan Blue, un colorante vitale. Male Sprague Dawley rats weighing about 200 g, were anesthetized by intraperitoneal injection of a sodium pentobarbital solution (0.1 ml / 100g), after which a U-shaped incision was made on the abdomen of the ™ animal. The opening of the abdominal cavity allowed the extraction of the liver which was subjected to perfusion in an apparatus thermostated at 42 ° C with 5% CO2 and 95% O2. The perfusion was carried out in two phases, using a glass cannula inserted into the portal vein. In the first step, a calcium-free Krebs-Henseleit buffer (KHB) solution (sterile solution at pH 7.4 containing NaHCO30.154 M, NaCl 0.154 M, KH2PO40.154 M, MgSO40.154 M) was perfused, to the total removal of blood from the organ; subsequently, a KHB buffer solution containing calcium (sterile solution at pH 7.4 containing Ca2 <+> - free KHB and CaCl20.11 M) and collagenase (50 mg / 100ml) was used to induce digestion of the collagen matrix. After 40 minutes of perfusion, the cells were purified. Hepatocytes were suspended in Leibovitz medium containing 0.2% bovine serum albumin (BSA) and filtered to obtain cellular sediment. After removal of the supernatant, the cells were washed in HEPES (sterile solution at pH 7.65 containing 0.8% NaCl, 0.01% NaH2PO4.12H2O, 0.02% KCl, 0.038% HEPES) three times to 700 rpm for 2 minutes. The cell pellet obtained was resuspended in William's medium called T0 (William's medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FCS), antibiotics such as penicillin, streptomycin, kanamycin, ampicillin and 0.5 U / ml of insulin). Before using hepatocytes for in vitro studies it was necessary to determine their viability by cell counting with Trypan Blue, a vital dye.

Trattamento epatociti Hepatocyte treatment

24 ore dopo l’aggiunta del secondo strato di collagene, le cellule sono state sottoposte al trattamento per 48 ore alla dose di 20µM, 40 µM e 60µM di estratto idroalcolico di germogli di cavolo laciniato nero toscano ottenuti da semi OD74 (di seguito indicato come OD74), cambiando il terreno ogni 24 ore. Questo estratto non contiene mirosinasi, che à ̈ stata aggiunta come estratto di senape preparato “ad hoc†. L’estratto OD74 e la mirosinasi avente una concentrazione iniziale di 30 U/ml sono stati incubati per mezz’ora a 37°C. Ogni volta, prima di iniziare il trattamento à ̈ stato osservato lo stato delle cellule al microscopio ottico. 24 hours after the addition of the second layer of collagen, the cells were subjected to treatment for 48 hours at a dose of 20µM, 40 µM and 60µM of hydroalcoholic extract of Tuscan black cabbage sprouts obtained from OD74 seeds (indicated below such as OD74), changing the terrain every 24 hours. This extract does not contain myrosinase, which has been added as an "ad hoc" mustard extract. The OD74 extract and the myrosinase having an initial concentration of 30 U / ml were incubated for half an hour at 37 ° C. Each time, before starting the treatment, the state of the cells was observed under an optical microscope.

Digestione collagenasi Collagenase digestion

Il giorno dopo la fine del trattamento, à ̈ stato rimosso il mezzo dalle piastre, per aggiungere 5-6 ml/piastra di una soluzione tampone KHB contenente glucosio (5,5 g/l), Ca<2+>mM e collagenasi (50 mg/100 ml). Per garantire l’azione della collagenasi, le piastre sono state incubate a 37°C per 30 minuti e agitate manualmente per 2-3 volte. Il contenuto delle piastre à ̈ stato recuperato e centrifugato a 1200 rpm per 5 minuti a 4°C. Il pellet ottenuto à ̈ stato risospeso in 10 ml di tampone di omogenizzazione. L’omogenato à ̈ stato poi centrifugato nelle stesse condizioni descritte precedentemente ed il pellet risultante à ̈ stato sospeso in un volume pari a 5 ml di tampone di omogeneizzazione e sonicato per 3 volte con intervalli della durata di 10 secondi. Da questo punto in poi si prosegue con la classica preparazione utilizzata per le frazioni microsomiali e citosoliche necessarie alla determinazione delle attività di fase 1 e 2. The day after the end of the treatment, the medium was removed from the plates, to add 5-6 ml / plate of a KHB buffer solution containing glucose (5.5 g / l), Ca <2+> mM and collagenase ( 50 mg / 100 ml). To ensure collagenase action, the plates were incubated at 37 ° C for 30 minutes and manually shaken 2-3 times. The contents of the plates were recovered and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The pellet obtained was resuspended in 10 ml of homogenization buffer. The homogenate was then centrifuged under the same conditions described above and the resulting pellet was suspended in a volume equal to 5 ml of homogenization buffer and sonicated 3 times with intervals of 10 seconds. From this point on we continue with the classic preparation used for the microsomal and cytosolic fractions necessary for the determination of phase 1 and 2 activities.

Preparazione della frazione citosolica e microsomiale Preparation of the cytosolic and microsomal fraction

L’omogenato ottenuto à ̈ stato centrifugato a 10.000 x g per 25 min a 4°C per ottenere la separazione tra precipitato, contenente nuclei e mitocondri, e sopranatante contenente la frazione microsomiale e citosolica. Il sopranatante à ̈ stato recuperato e ultracentrifugato a 33.000 rpm per 1 ora e 10 min a 4°C. Il nuovo sopranatante à ̈ stato stoccato in aliquote, congelato in N2liquido, conservato a –80 °C ed in seguito utilizzato per saggi enzimatici di fase 2. Il pellet ottenuto dalla stessa centrifugazione à ̈ stato nuovamente omogeneizzato ed ultracentrifugato per 50 min alle stesse condizioni, per separare le proteine microsomiali da quelle non microsomiali. Il precipitato à ̈ stato risospeso in un volume di tampone fosfato pH 7,4 pari al doppio del peso dei fegati. Il tampone di risospensione utillizzato conteneva K2HPO4100 mM ed EDTA 0,1 mM. Dopo un†̃ultima omogeneizzazione, le frazioni microsomiali sono state suddivise in aliquote, rapidamente congelate e conservate a –80 °C fino al loro utilizzo in saggi enzimatici di fase1. The homogenate obtained was centrifuged at 10,000 x g for 25 min at 4 ° C to obtain the separation between the precipitate, containing nuclei and mitochondria, and the supernatant containing the microsomal and cytosolic fraction. The supernatant was recovered and ultracentrifuged at 33,000 rpm for 1 hour and 10 min at 4 ° C. The new supernatant was stored in aliquots, frozen in liquid N2, stored at â € “80 ° C and subsequently used for phase 2 enzymatic assays. The pellet obtained from the same centrifugation was homogenized again and ultracentrifuged for 50 min at same conditions, to separate microsomal proteins from non-microsomal ones. The precipitate was resuspended in a volume of phosphate buffer pH 7.4 equal to double the weight of the livers. The resuspension buffer used contained K2HPO4100 mM and 0.1 mM EDTA. After a final homogenization, the microsomal fractions were divided into aliquots, quickly frozen and stored at â € “80 ° C until their use in phase 1 enzymatic assays.

Determinazione del contenuto di proteine microsomiali e citosoliche Determination of the content of microsomal and cytosolic proteins

Le proteine sono state determinate secondo il metodo descritto da Lowry in cui à ̈ stata utilizzata l’albumina sierica bovina come standard (Lowry OH et al.: Protein measurement with the Folin reagent. J. Biol. Chem. (1951), 193 (1): 265-275). Saggi di attività enzimatiche citosoliche The proteins were determined according to the method described by Lowry in which bovine serum albumin was used as the standard (Lowry OH et al .: Protein measurement with the Folin reagent. J. Biol. Chem. (1951), 193 (1): 265-275). Cytosolic enzyme activity assays

Catalasi (CAT) Catalase (CAT)

La reazione di decomposizione dell’acqua ossigenata catalizzata dall'enzima catalasi à ̈ monitorata spettrofotometricamente a 240 nm in funzione del tempo. L’attività à ̈ calcolata attraverso la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 43,6 M<-1>x cm<1>. The decomposition reaction of hydrogen peroxide catalyzed by the enzyme catalase is monitored spectrophotometrically at 240 nm as a function of time. The activity is calculated through the law of Lambert and Beer, the molar extinction coefficient is 43.6 M <-1> x cm <1>.

Glutatione reduttasi (GSSH reduttasi) Glutathione reductase (GSSH reductase)

In presenza del substrato glutatione ossidato e NADPH, l’enzima glutatione reduttasi catalizza la formazione di glutatione ridotto. Il consumo di NADPH à ̈ seguito spettrofotometricamente a 340 nm. L’attività à ̈ calcolata attraverso la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 6,22 mM<-1>x cm<-1>Glutatione S-trasferasi (GST) In the presence of the oxidized glutathione substrate and NADPH, the glutathione reductase enzyme catalyses the formation of reduced glutathione. The consumption of NADPH is followed spectrophotometrically at 340 nm. The activity is calculated through the law of Lambert and Beer, the molar extinction coefficient is 6.22 mM <-1> x cm <-1> Glutathione S-transferase (GST)

L’enzima glutatione S-trasferasi coniuga il substrato 1-cloro-2,4-dinitrobenzene con il glutatione ridotto. La reazione di coniugazione à ̈ seguita allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 340 nm. Il calcolo dell’attività à ̈ effetuato secondo la legge di Lambert e Beer, il coefficiente di estinzione molare à ̈ di 9,6 mM<-1>x cm<-1>(Habib W.H. et al.:Glutatione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. (1974), 249 (22): 7130-7139). The glutathione S-transferase enzyme combines the substrate 1-chloro-2,4-dinitrobenzene with reduced glutathione. The conjugation reaction is followed by a spectrophotometer at a wavelength of 340 nm. The calculation of the activity is carried out according to the law of Lambert and Beer, the molar extinction coefficient is 9.6 mM <-1> x cm <-1> (Habib W.H. et al.:Glutathione S-transferases . The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. (1974), 249 (22): 7130-7139).

NAD(P)H:chinone ossidoreduttasi (NQO1) o DT-diaforasi NAD (P) H: quinone oxidoreductase (NQO1) or DT-diaphorase

L’attività di questo enzima si determina nel comparto citosolico seguendo la riduzione del DCPIP (2,6-fenolodicloroindofenolo) da parte del NADPH. Tale riduzione comporta una riduzione dell’intensità della colorazione del DCPIP, misurata spettrofotometricamente a 600 nm. Il ε à ̈ pari a 22,1 mM<-1>cm<-1>(Benson AM et al.: Increase of NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. (1980), 77 (9): 5216-5220). The activity of this enzyme is determined in the cytosolic compartment following the reduction of DCPIP (2,6-phenolodichloroindophenol) by NADPH. This reduction leads to a reduction in the intensity of the DCPIP staining, measured spectrophotometrically at 600 nm. The ε is equal to 22.1 mM <-1> cm <-1> (Benson AM et al .: Increase of NAD (P) H: quinone reductase by dietary antioxidants: possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc . Natl. Acad. Sci. (1980), 77 (9): 5216-5220).

Gli esperimenti evidenziano la capacità degli estratti di OD74 di indurre alcuni enzimi detossificanti ed antiossidanti. Come si può vedere dalla tabella 17 gli estratti di OD74 provocano una induzione della DT-diaforasi, Catalasi, Glutatione trasferasi (GST) glutatione reduttasi (GSSH reduttasi). I dati riportati in tabella sono quelli relativi alla concentrazione di 60 µM di OD74 e dopo 48 ore di trattamento. La DT-diaforasi à ̈ aumentata rispetto al controllo di circa 4 volte, la GST e la Catalasi di circa 1,5 volte mentre la GSSH reduttasi di 1,4 volte. Come controllo positivo à ̈ stata utilizzata la glucorofanina (GRA) pura a 20 µM e i risultati in termini di capacità induttiva hanno mostrato valori simili. The experiments highlight the ability of OD74 extracts to induce some detoxifying and antioxidant enzymes. As can be seen from table 17, the OD74 extracts induce an induction of DT-diaphorase, Catalase, Glutathione transferase (GST) glutathione reductase (GSSH reductase). The data shown in the table are those relating to the concentration of 60 µM of OD74 and after 48 hours of treatment. DT-diaphorase increased with respect to the control by about 4 times, GST and catalase by about 1.5 times and GSSH reductase by 1.4 times. Pure glucorophanin (GRA) at 20 µM was used as a positive control and the results in terms of inductive capacity showed similar values.

Tabella 17 – attività dell’estratto di germogli di cavolo laciniato nero toscano OD74 (60 µM) su enzimi di fase 2 in confronto con glucorafanina pura (20 µM) Table 17 - activity of OD74 black cabbage sprout extract (60 µM) on phase 2 enzymes in comparison with pure glucoraphanin (20 µM)

DT- GST CAT GSSH diaforasi (nmol/min/m (µmol/min/m reduttasi (nmol/min/ g prot) g prot) (nmol/min/m mg prot) g prot) Controllo 26,95 141,51 119,44 89,18 DT- GST CAT GSSH diaphorase (nmol / min / m (µmol / min / m reductase (nmol / min / g prot) g prot) (nmol / min / m mg prot) g prot) Control 26.95 141.51 119 , 44 89.18

GRA 98,52 208,38 185,94 126,29 GRA 98.52 208.38 185.94 126.29

OD74 99,67 230,61 173,59 124,72 OD74 99.67 230.61 173.59 124.72

Claims (15)

Rivendicazioni 1. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati comprendente almeno le fasi di: a) irradiare germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) raccolti tra 4 e 6 giorni dalla semina con microonde ad una potenza compresa tra 450 e 800 W; b) congelare ad una temperatura tra -15 e -20°C; c) liofilizzare e macinare i germogli congelati; d) sottoporre i germogli liofilizzati e macinati ad almeno una estrazione idroalcolica con un solvente di estrazione consistente in una soluzione di etanolo:acqua in cui l’etanolo à ̈ al 70% p/p; e) opzionalmente, portare a secco l’estratto idroalcolico, riprendere in acqua e liofilizzare. Claims 1. Method of preparing glucosinolate extracts comprising at least the steps of: a) irradiate shoots of Tuscan black kale (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) harvested between 4 and 6 days from sowing with microwaves at a power between 450 and 800 W; b) freezing at a temperature between -15 and -20 ° C; c) freeze-drying and grinding the frozen sprouts; d) subject the freeze-dried and ground sprouts to at least one hydroalcoholic extraction with an extraction solvent consisting of an ethanol solution: water in which ethanol is 70% w / w; e) optionally, dry the hydroalcoholic extract, resume in water and freeze-dry. 2. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui l’irraggiamento con microonde dei germogli della fase a) à ̈ eseguito per un tempo compreso tra 0.5 e 2 minuti per strati degli stessi di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm. 2. Method for preparing glucosinolate extracts according to claim 1, wherein the microwave irradiation of the shoots of step a) is carried out for a time ranging from 0.5 to 2 minutes for layers of thickness ranging from 0, 5 and 2.0 cm. 3. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui l’irraggiamento con microonde dei germogli della fase a) à ̈ a 800W per un tempo di 1 minuto per strati degli stessi di spessore compreso tra 0,5 e 2,0 cm. 3. Method of preparation of glucosinolate extracts according to claim 1, wherein the microwave irradiation of the shoots of step a) is at 800W for a time of 1 minute for layers of thickness between 0.5 and 2.0 cm. 4. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui alla fase d) i germogli liofilizzati e macinati sono sottoposti a due estrazioni idroalcoliche con un solvente di estrazione consistente in una miscela etanolo:acqua in cui l’etanolo à ̈ al 70% p/p. 4. Method for preparing glucosinolate extracts according to claim 1, wherein in step d) the freeze-dried and ground sprouts are subjected to two hydroalcoholic extractions with an extraction solvent consisting of an ethanol mixture: water in which the ethanol is ̈ at 70% w / w. 5. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo le rivendicazioni 1 e 4, in cui l’estrazione idroalcolica à ̈ eseguita in un rapporto 1 (germogli):20 (solvente di estrazione) p/v ad una temperatura compresa tra 0 e 25°C. 5. Method of preparation of glucosinolate extracts according to claims 1 and 4, wherein the hydroalcoholic extraction is performed in a ratio of 1 (buds): 20 (extraction solvent) w / v at a temperature between 0 and 25 ° C. 6. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui un ulteriore step di rimozione della cuticola ai germogli à ̈ aggiunto prima dell’irraggiamento con microonde della fase a). 6. Method for preparing glucosinolate extracts according to claim 1, wherein a further step of removing the cuticle from the shoots is added before the microwave irradiation of step a). 7. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo la rivendicazione 1, in cui alla fase e) dopo la rimozione del solvente e prima dell’ulteriore liofilizzazione opzionale à ̈ aggiunto trealosio. 7. Method of preparing glucosinolate extracts according to claim 1, wherein trehalose is added in step e) after removal of the solvent and before the further optional lyophilization. 8. Metodo di preparazione di estratti di glucosinolati secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui gli estratti idroalcolici hanno un titolo in glucorafanina almeno del 10% p/p. 8. Method for preparing glucosinolate extracts according to one of claims 1 to 6, wherein the hydroalcoholic extracts have a glucoraphanin titer of at least 10% w / w. 9. Composizioni per uso orale comprendenti estratti di germogli di cavolo laciniato nero toscano (Brassica oleracea L. var. acephala subvar. Laciniata L.) aventi un titolo in glucorafanina di almeno il 10% p/p in combinazione con eccipienti e/o diluenti di grado farmaceutico e/o alimentare. 9. Compositions for oral use comprising extracts of Tuscan black kale sprout (Brassica oleracea L. var. Acephala subvar. Laciniata L.) having a glucoraphanin titer of at least 10% w / w in combination with excipients and / or diluents pharmaceutical and / or food grade. 10. Composizioni per uso orale secondo la rivendicazione 9, in cui agli estratti à ̈ aggiunta mirosinasi in un rapporto estratto:enzima compreso tra 1:1 e 20:1 p/p. 10. Compositions for oral use according to claim 9, wherein myosinase is added to the extracts in an extract: enzyme ratio between 1: 1 and 20: 1 w / w. 11. Composizioni per uso orale secondo la rivendicazione 10, in cui il rapporto estratto:enzima compreso tra 5:1 e 10:1 p/p. 11. Compositions for oral use according to claim 10, wherein the extract: enzyme ratio is between 5: 1 and 10: 1 w / w. 12. Composizioni per uso orale secondo una delle rivendicazioni 9-11, in cui tali composizioni sono in forma di compresse o capsule opzionalmente gastroprotette e/o colon-specifiche. Compositions for oral use according to one of claims 9-11, wherein said compositions are in the form of optionally gastro-protected and / or colon-specific tablets or capsules. 13. Composizioni per uso orale secondo una delle rivendicazioni 9-11 in forma di supplementi nutrizionali. 13. Compositions for oral use according to one of claims 9-11 in the form of nutritional supplements. 14. Uso delle composizioni secondo le rivendicazioni da 9 a 13 per la chemoprevenzione e/o chemoprotezione. 14. Use of the compositions according to claims 9 to 13 for chemoprevention and / or chemoprotection. 15. Uso secondo la rivendicazione 14 per la chemoprevenzione e/o chemoprotezione dell’apparato respiratorio.15. Use according to claim 14 for chemoprevention and / or chemoprotection of the respiratory system.