ITPD20080219A1 - Materiali nanocompositi basati su nanoparticelle metalliche stabilizzate con polisaccaridi a struttura ramificata. - Google Patents
Materiali nanocompositi basati su nanoparticelle metalliche stabilizzate con polisaccaridi a struttura ramificata.Info
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Classifications
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
“MATERIALI NANOCOMPOSITI BASATI SU NANOPARTICELLE METALLICHE STABILIZZATE CON POLISACCARIDI A STRUTTURA RAMIFICATAâ€
Campo dell'invenzione
La presente invenzione à ̈ relativa a materiali nanocompositi formati da nanoparticelle metalliche stabilizzate in una matrice di polisaccaridi basici a struttura ramificata, alla loro preparazione ed al loro uso per applicazioni in campo biomedico, farmaceutico ed alimentare.
Stato della tecnica
La preparazione di nanoparticelle metalliche à ̈ un'area di ricerca di grande interesse nanotecnologico; infatti molti metalli possiedono particolari proprietà ottiche, antimicrobiche e catalitiche associate proprio alla nano-scala. In particolare l'attività antimicrobica ad ampio spettro di metalli, come ad esempio l'argento, ha un notevole interesse applicativo. D'altra parte infezioni batteriche, fungine e virali rappresentano un serio problema in molte situazioni e quindi la messa a punto di prodotti con un ampio spettro antimicrobico à ̈ un'esigenza molto sentita. Infatti, l'utilizzo di metalli come argento, oro, rame, zinco e nichel nel campo dei materiali antimicrobici sta avendo un forte impatto sul mercato soprattutto per il trattamento di lesioni topiche, tanto che, ad esempio, aziende come Johnson&Johnson® e Convatec® hanno recentemente commercializzato medicazioni che si basano sulle proprietà antibatteriche di nanoparticelle di argento.
Generalmente le nanoparticelle vengono ottenute a partire da soluzioni di un sale metallico in presenza di un agente riducente e di un agente stabilizzante che ha lo scopo di impedire l'aggregazione delle nanoparticelle. Al fine di stabilizzare le nanoparticelle vengono largamente utilizzate opportune soluzioni polimeriche diluite, che permettono di ottenere sistemi nanocompositi in cui le particelle metalliche risultano essere omogeneamente disperse. Per le applicazioni sopra portate sono risultate particolarmente efficaci soluzioni di polielettroliti come polifosfato, poliacrilato, poli (vinil solfato), poli (allilammina) (Henglein, A., J. Phys. Chem. 1993, 97 (21), 5457-5471), poli-(etilenimmina) (Kuo, P. L.; Chen, W. F. J. Phys. Chem. B 2003, 107 (41), 11267-11272).
In generale i componenti necessari per ottenere la formazione di nanoparticelle metalliche sono: un opportuno sale del metallo, un agente riducente ed un polimero che funga da stabilizzante per la sospensione colloidale.
Il brevetto US 2007/00036031 (Karandikar et al.) descrive metodologie di formazione di nanoparticelle di argento in presenza di un solvente, un agente stabilizzante, un agente surfattante, un agente riducente e l'utilizzo di calore. Tra gli agenti stabilizzanti sono menzionati polimeri come la poliacrilamide ed il polisorbato 20.
Nel brevetto WO2007/147094A2 (Sambhy V. et al.) sono descritti sistemi nanocompositi in matrici polimeriche cationiche di sintesi caratterizzate da un atomo di azoto ternario o quaternario, in cui il polimero stabilizzante le nanoparticelle à ̈ un derivato della poli(4-vinil piridina) ed il bromuro di argento à ̈ impiegato per la formazione di tali nanoparticelle di argento.
Il brevetto WO2007/017901A2 (Omray P. et al.) riporta formulazioni di nanoparticelle di argento disperse ad esempio attraverso l'uso di polisorbato, propilene glicole, e propil gallato.
Nel brevetto WO2007/096606A1 (Crowther N. et al.) vengono descritte tecniche per il rilascio di nanoparticelle metalliche preparate in presenza di polimeri stabilizzanti per applicazioni antimicrobiche. Tra i polimeri menzionati vi sono: acido polimetacrilico, poliimmidi, poli(vinilalcool) e loro copolimeri.
Nel brevetto WO2007/001453 (Yacaman M. et al.) viene riportata la sintesi di nanoparticelle di argento in presenza di polioli e polimeri per applicazioni antimicrobiche utilizzando glicerina o glicole etilenico sia come riducente sia come solvente della nanostruttura e utilizzando poli(vinilpirrolidone) come agente di rivestimento delle nanoparticelle. Si nota che il meccanismo chimico di riduzione degli ioni argento à ̈ basato sull'ossidazione dei gruppi ossidrilici presenti nei polioli e rottura dei legami C-C.
Per applicazioni in campo biomedico risultano particolarmente interessanti sistemi a base di polisaccaridi in quanto questi polimeri sono in generale biocompatibili e come tali ideali per applicazioni che prevedono diretto contatto con tessuti biologici.
Tra i polisaccaridi di origine naturale uno dei più studiati ed impiegati commercialmente à ̈ il chitosano. Questo à ̈ un polisaccaride basico, di peso molecolare compreso tra 50 e 1'500 kDa, costituito da una catena lineare di residui di D-glucosamina (GlcNH2) uniti da legami β1→ 4 con interdisperse unità di N-acetil-glucosammina residue dalla non completa de-acetilazione della chitina. E' normalmente insolubile in soluzioni acquose neutre o basiche; in soluzioni acide con un pH 5, l'amino gruppo libero viene protonato rendendo il polimero solubile. Questo polimero à ̈ già ampiamente impiegato nel settore medico in quanto mostra una bassa risposta immunologica, patologica o infettiva (Suh Francis J.K., Matthew H.W.T. Biomaterials, 2000, 21, 2589-2598; Miyazaki S. et al. Chem. Pharm. Bull.,1981, 29, 3067-3069). Il chitosano ha tutte le caratteristiche ideali per essere impiegato come biomateriale per le sue proprietà chimico-fisiche, quali l'elevata densità di carica cationica in soluzione acida, la sua elevata processabilità e la capacità di originare strutture porose in cui ad esempio impiantare cellule. Infatti del chitosano sono noti molti usi sia in campo biomedico che alimentare. Per queste sue proprietà sia il chitosano che suoi derivati sono stati anche utilizzati allo scopo di stabilizzare nanoparticelle. Dai et al. (Nano Lett.
2002, 2 (5), 497-501) hanno descritto la preparazione di nanoparticelle di argento in soluzioni polielettrolitiche (poli(etilen-imina) e acido poliacrilico) in presenza di sodio boroidruro, mentre nel brevetto WO2007/025917A1 (Schmid H. et al.) si riportano preparazioni di nanoparticelle di argento in presenza di chitosano nonché di derivati e sali del chitosano come carbossimetilchitosano, acetato di chitosano e lattato di chitosano.
Molte ricerche recenti si sono focalizzate sulla messa a punto di metodologie per potenziare gli effetti biologici del chitosano. In particolare la maggior parte degli sforzi à ̈ stata volta ad aumentare la cationicità del polimero o a modificarne le caratteristiche chimiche e di biodisponibilità attraverso modificazioni (bio)chimiche. In particolare, la modificazione del chitosano con gruppi saccaridici laterali, ad esempio tramite l'inserzione di unità di lattosio ottenuta attraverso una reazione di aminazione riduttiva, ha comportato, come riportato nel brevetto US 4,424,346 (Hall, L.D. e Yalpani, M.), una maggior solubilità dei derivati del polisaccaride in acqua ed à ̈ proprio in queste sue forme derivatizzate che il chitosano assume le proprietà più favorevoli per l'utilizzo come biomateriale di elevata biocompatibilità .
Sommario
Un primo scopo della presente invenzione à ̈ l'ottenimento un sistema nanocomposito, in cui nanoparticelle metalliche siano stabilizzate e di dimensione controllata e le cui proprietà si prestino particolarmente ad applicazioni in campo biomedico ed ottiche (biosensori).
Un ulteriore scopo à ̈ che tale nanocomposito sia ottenibile attraverso un approccio chimico non complesso ed economicamente conveniente, ed in particolare mediante soluzioni colloidali in cui nanoparticelle metalliche vengono stabilizzate da opportune soluzioni polisaccaridiche.
È un ulteriore scopo mettere a punto tali sistemi con l'impiego di polisaccaridi facilmente disponibili in commercio e senza che tali polisaccaridi siano soggetti a manipolazioni chimiche, come pure senza che siano necessarie complesse manipolazioni preparative di tali sistemi.
Per il conseguimento degli scopi sopra menzionati gli inventori hanno sviluppato opportuni sistemi polisaccaridici in soluzione basati su polisaccaridi basici a struttura ramificata che consentono di ottenere nanoparticelle metalliche stabili e di dimensione controllata. Le procedure si basano sulla miscelazione di soluzioni acquose polimeriche e soluzioni acquose di sali metallici in presenza o assenza di agenti riducenti esogeni.
In un primo aspetto sono quindi oggetto della presenta invenzione materiali nanocompositi caratterizzati dal fatto di comprendere una matrice polimerica consistente in polisaccaridi cationici a struttura ramificata e nanoparticelle metalliche disperse in tale matrice polimerica.
I polisaccaridi cationici ramificati preferiti sono derivati alditolici od aldonici del chitosano in cui unità di D-glucosammina formanti la catena lineare del chitosano legano mediante il gruppo funzionale –NH– residui uguali o diversi tra di loro mono od oligosaccaridici rappresentati dalla formula generale (I)
(I)
in cui:
- R può essere –CH2– oppure –CO–;
- R1può essere idrogeno, un monosaccaride scelto tra galattosio, glucosio o N-acetilglucosammina, un oligosaccaride;
- R2può essere -OH oppure -NHCOCH3.
I metalli delle nanoparticelle sono invece preferenzialmente argento, oro, platino, palladio, rame, zinco o nichel e miscele degli stessi.
I materiali nanocompositi secondo l'invenzione possono essere preparati in opportune condizioni con soluzioni acquose di tali polisaccaridi in presenza ed assenza di agenti riducenti esogeni.
Pertanto, secondo un altro aspetto l'invenzione ha per oggetto un metodo di preparazione di tali materiali nanocompositi caratterizzati dal fatto di comprendere:
a) la preparazione di soluzioni acquose di polisaccaridi cationici a struttura ramificata ad una concentrazione sino al 2% (p/V);
b) la preparazione di soluzioni acquose di sali di metalli ad una concentrazione compresa tra 0,1mM e 20mM;
c) addizione di tali soluzioni di sali alle soluzioni di polisaccaridi e miscelazione sino all'ottenimento di soluzioni colloidali in cui nanoparticelle metalliche sono omogeneamente disperse.
Opzionalmente alle soluzioni colloidali ottenute à ̈ aggiunto un agente riducente. Secondo un ulteriore aspetto l'invenzione ha per oggetto l'uso di tali materiali nanocompositi in campo biomedico, farmaceutico ed alimentare ad esempio come agenti antimicrobici od in biosensori molecolari.
Breve descrizione delle figure
Figura 1. La figura mostra la stabilizzazione di nanoparticelle di argento nel derivato del chitosano con lattosio (Chitlac): le catene polimeriche del Chitlac permettono la coordinazione e stabilizzazione delle nanoparticelle metalliche. Le immagini TEM, ottenute attraverso un microscopio Philips EM 208, dimostrano che le nanoparticelle di argento (particelle nere) sono situate esattamente sulle catene polimeriche (strutture ramificate grigie). Campione preparato utilizzando chitlac (0,2%) e AgNO31mM (Es.7).
Figura 2. La figura mostra: (A) Spettri UV-Vis di nanoparticelle di argento formate in presenza di chitosano (linea tratteggiata, Es.22) e di Chitlac (linea continua, Es.
7) nelle stesse condizioni (polimero 0,2 % (p/V) ; AgNO31 mM; acido ascorbico (C6H8O6) 0,5 mM); (B) Effetto delle concentrazioni di Chitlac e AgNO3sugli spettri UV-Vis: 0,4% Chitlac/ 1mM AgNO3(linea continua Es. 9); 0,2% Chitlac/ 1mM AgNO3(linea tratteggiata --- Es. 7); 0,1% Chitlac/ 1mM AgNO3(linea a puntini distanziati<. . .>Es. 5); 0,1% Chitlac/0,5mM AgNO3(linea a puntini ravvicinati<…>Es.4); 0,2% Chitlac/ 0,5mM AgNO3(linea a tratto-punto<-.-.->Es. 6); 0,4% Chitlac/ 0,5mM AgNO3(linea a tratto-punto-punto<-..-..>Es. 8);. In ogni campione il rapporto AgNO3/C6H8O6à ̈ pari a 2, secondo la stechiometria della reazione. La misura à ̈ stata eseguita tramite uno spettrofotometro CaryE4 UV-visibile alla temperatura di 25 °C.
Figura 3. La figura mostra lo spettro UV-Vis di nanoparticelle di oro formate in Chitlac in assenza di agenti riducenti esogeni (polimero 0,2 % (p/V); HAuCl41mM, Es. 18). La misura à ̈ stata eseguita come descritto in precedenza alla Figura 2. Figura 4. La figura mostra gli spettri UV-Vis di campioni di Chitlac 0,2% (p/V)/Agn(con nanoparticelle di argento) a diverse concentrazioni di argento in presenza e assenza di acido ascorbico. I campioni sono stati preparati secondo le procedure descritte negli esempi 7 (1mM AgNO3/0,5mM C6H8O6, linea continua), 10 (5mM AgNO3, linea -·-·-), 11 (10mM AgNO3, linea -··-··-), 25 (Chitlac 0,2% (p/V), AgNO3 1mM, linea ---). Le misure sono state eseguite come descritto in precedenza alla Figura 2.
Figura 5. Immagine TEM di nanoparticelle di argento formate in Chitlac in assenza di agenti riducenti esogeni (Chitlac 0,4% (p/V), AgNO314 mM, Es.15).
Figura 6. La figura mostra l'immagine TEM di nanoparticelle di oro disperse nel Chitlac (Chitlac 0,2% (p/V) HAuCl41mM, Es. 18) in assenza di agenti riducenti esogeni. La misura à ̈ stata eseguita come descritto in precedenza alla Figura 1. Figura 7. La figura mostra la distribuzione dimensionale delle nanoparticelle di oro in disperse in Chitlac (Chitlac 0,2% (p/V) HAuCl41mM, Es.18). La misura à ̈ stata eseguita utilizzando un sistema Nanosight LM20. La dimensione delle particelle à ̈ tra 10 e 150 nm e la massima parte delle particelle ha una dimensione attorno a 50 nm.
Figura 8. La figura mostra l'immagine TEM di nanoparticelle di rame disperse in Chitlac (Chitlac 0,2% (p/V), CuSO41mM, NaBH40,2mM, Es. 19). La misura à ̈ stata eseguita come descritto in precedenza alla Figura 1.
Figura 9. La figura mostra le immagini TEM (A, B) e la distribuzione dimensionale (C)di nanoparticelle di argento disperse nel Chitlac (Chitlac 0,2% (p/V) AgNO31 mM, C6H8O60,5 mM, Es. 7). La misura à ̈ stata eseguita come descritto in precedenza alla Figura 1.
Figura 10. La figura mostra: (A) Cinetica di crescita batterica di E. coli ATCC 25922 in mezzo di coltura Mueller-Hinton al 20% (20% Mueller-Hinton; controllo, triangoli) o in presenza di Chitlac 0,2% (p/V) (cerchi, Es.1) o in Chitlac 0,2% (p/V) AgNO31mM C6H8O60,5 mM (quadrati, Es.7), rispettivamente. I dati riportati si riferiscono a tre esperimenti indipendenti con risultati comparabili; (B) Conta delle colonie di E. coli ATCC 25922 in Chitlac 0,2% (p/V) AgNO31mM C6H8O60,5 mM (linea continua, Es. 7). La linea tratteggiata indica i controlli in assenza di Chitlac-nAg. I risultati sono le medie (±SD) di almeno 4 esperimenti indipendenti. Figura 11. La figura mostra la cinetica di crescita batterica di E. coli ATCC 25922 in mezzo di coltura Mueller-Hinton (20% Mueller-Hinton; controllo, cerchi) o in Chitlac 0,2% (p/V) HAuCl41mM (Chitlac-nAu, quadrati, Es.18).
Figura 12. La figura mostra la conta delle colonie di E. coli ATCC 25922 in 20% Mueller-Hinton (controllo, cerchi) o in presenza di nanoparticelle di oro disperse in Chitlac (Chitlac 0,2% (p/V) HAuCl41mM, Es. 18) (quadrati). CFU sono le Unità Formanti le Colonie batteriche.
Figura 13. La figura mostra lo spettro Raman di Chitlac (Es.1) alla concentrazione di 4% (p/V) (linea tratteggiata) in confronto allo spettro SERS di Chitlac con nanoparticelle di argento (Chitlac 0,4% (p/V), AgNO314 mM, Es. 15) (linea continua).
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Definizioni
Soluzione colloidale (o colloide): ha il significato di sistema in cui particelle di dimensioni comprese tra 1 e 1'000 nm, sono disperse in un mezzo solvente continuo.
Nanocomposito: ha il significato di sistema costituito da particelle di dimensioni nanometriche (filler) all'interno di un materiale macroscopico (matrix). Nella presente descrizione dell'invenzione con il termine “nanocomposito†si intende indicare un materiale in cui nanoparticelle metalliche sono disperse in una matrice polisaccaridica. In particolare si indica un materiale in cui le nanoparticelle metalliche sono sostanzialmente ridotte quindi hanno per lo più carica zero, senza però escludere la presenza di cluster di pochi atomi con carattere ionico (ad esempio Ag4<+>).
Gli scopi e i vantaggi dei materiali nanocompositi comprendenti nanoparticelle metalliche interdisperse in una matrice di polisaccaridi basici a struttura ramificata oggetto della presente invenzione, saranno meglio compresi nel corso della descrizione dettagliata seguente dove, a titolo esemplificativo ma non limitativo dell'invenzione, saranno descritti alcuni esempi di preparazione di nanocompositi secondo l'invenzione e la loro caratterizzazione chimico-fisica oltre che i test biologici di valutazione della loro attività antibatterica.
Descrizione
I materiali nanocompositi oggetto della presenta invenzione comprendono in una matrice polimerica, consistente in polisaccaridi cationici per la presenza di atomi di azoto primari e secondari a struttura ramificata, nanoparticelle metalliche disperse in tale matrice polimerica in modo omogeneo e stabile.
Per gli scopi della presente invenzione i polisaccaridi a struttura ramificata preferenziali sono derivati alditolici od aldonici del chitosano in cui unità di D-glucosammina formanti la catena lineare del chitosano legano mediante il gruppo funzionale –NH– residui uguali o diversi tra di loro mono od oligosaccaridici rappresentati dalla formula generale (I) in precedenza riportata, in cui R può essere –CH2– oppure –CO– ed R1può essere idrogeno oppure un monosaccaride scelto tra galattosio, glucosio o N-acetilglucosammina oppure un oligosaccaride, preferibilmente comprendente sino a 3 unità glicosidiche ed R2può essere -OH oppure -NHCOCH3.
Di seguito per brevità tali derivati saranno identificati anche come derivati alditolici od aldonici mono od oligosaccaridici del chitosano.
Allo scopo di rappresentazione le unità di D-Glucosamina sostituite con residui mono od oligosaccaridici nei derivati del chitosano oggetto dell'invenzione sono rappresentabili dalla formula generale (II)
Nel brevetto WO2007/025917A1 (Schmid H. et al.) prima citato si riportano preparazioni di nanoparticelle di argento in presenza di derivati e sali del chitosano come carbossimetilchitosano, acetato di chitosano e lattato di chitosano. A differenza del brevetto sopra citato, nel presente caso la derivatizzazione à ̈ realizzata con strutture mono od oligosaccaridiche che, attraverso una reazione di amminazione riduttiva, portano all'inserimento di bracci laterali legati allo scheletro polimerico tramite gruppi amminici secondari. Questo permette che i) i gruppi amminici rimangano disponibili per la coordinazione del metallo e che ii) non venga alterata la carica complessiva del polisaccaride.
Infatti, la matrice polimerica à ̈ formata da derivati aldonici od alditolici del chitosano legante mediante il gruppo amminico residui mono od oligosaccaridici di formula generale (I) oligosaccaridi comprendenti preferibilmente da 1 a 3 unità glicosidiche e secondo un aspetto più preferito tali oligosaccaridi comprendono da 2 a 3 unità glicosidiche e ancora più preferibilmente sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maltotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, mannobiosio nonché dei loro corrispondenti acidi aldonici Per gli scopi della presente invenzione il derivato oligosaccaridico del chitosano più preferito à ̈ il derivato con il lattosio (qui di seguito indicato anche come Chitlac; CAS registry number 85941-43-1).
Inoltre, per gli scopi della presente invenzione il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con tali oligosaccaridi deve essere almeno del 20%. Preferibilmente, il grado di sostituzione dei gruppi amminici del chitosano con gli oligosaccaridi à ̈ compreso nell'intervallo da 50% a 80% e più preferibilmente à ̈ del 70%.
Il peso molecolare medio (di seguito codificato in MW) del chitosano impiegabile per l'ottenimento dei derivati oligosaccaridici menzionati può arrivare sino a 1'500kDa ed essere preferibilmente compreso nell'intervallo da 400kDa a 700kDa. Le nanoparticelle incorporate nella matrice polimerica costituita da tali i polisaccaridi basici a struttura ramificata sono di metalli scelti preferenzialmente tra argento, oro, platino, palladio, rame, zinco, nichel e miscele degli stessi.
Le nanoparticelle incluse nella matrice polimerica costituita dai derivati oligosaccaridici del chitosano hanno una dimensione media controllata attorno a 50nm, ed in particolare la dimensione delle nanoparticelle metalliche à ̈ compresa tra 5 nm e 150nm.
Una caratteristica essenziale di tali nanoparticelle, come sarà evidente nel seguito della descrizione dettagliata dell'invenzione, à ̈ il fatto che tali nanoparticelle sono per lo più metalli nella loro forma ridotta, senza peraltro escludere la presenza residuale di cluster di pochi atomi con carattere ionico, e che nella loro dispersione/stabilizzazione nella matrice polisaccaridica sono coinvolte le catene laterali degli oligosaccaridi in prossimità dei gruppi amminici del chitosano stesso. Pur senza essere vincolati a questi, i rapporti preferiti tra polisaccaridi della matrice e metalli sono riferiti a nanocompositi in forma di soluzioni colloidali, benché questi materiali nanocompositi possano essere anche in forma di film o polvere disidratati ed anche dializzati per eliminare i contro-ioni residui della preparazione dei materiali stessi. Nei nanocompositi secondo l'invenzione in forma di soluzioni acquose colloidali i rapporti tra concentrazione, espressa in % (p/V) del polisaccaride e concentrazione, espressa in molarità , del sale metallico di partenza sono compresi tra 0,0025 e 20 e preferibilmente à ̈ di 0,2.
Pertanto, la massa di argento, espressa in mg, che si può incorporare per grammo di polisaccaride può essere compresa tra 3'000mg/g e 0,3 mg/g e preferenzialmente à ̈ di 50mg di argento incorporati per grammo di polisaccaride. Per gli scopi perseguiti si à ̈ affrontato l'aspetto relativo alla preparazione e caratterizzazione di un sistema a base di polisaccaridi in cui si sfruttano proprietà associate alla dimensione nanometrica dei metalli (antimicrobiche, ottiche, catalitiche ed altre peculiari dei metalli stessi) di nanoparticelle metalliche contenute nei nanocompositi oggetto dell'invenzione. Tali aspetti sono riportati di seguito in dettaglio.
Preparazione dei derivati oligosaccaridici del chitosano
Il processo di preparazione di tali derivati oligosaccaridici del chitosano à ̈ quello noto descritto nel brevetto US 4,424,346 (Hall, L.D. e Yalpani, M.) e prevede il trattamento di una soluzione di chitosano in acido acetico (pH 4,5) in metanolo con l'oligosaccaride scelto in presenza di sodio cianoboroidruro. L'interazione tra i gruppi amminici del chitosano e il gruppo aldeidico dell'oligosaccaride porta alla formazione di un intermedio instabile chiamato base di Schiff. Questa in presenza del boroidruro viene ridotta portando alla formazione di una ammina secondaria stabile. Il risultante polisaccaride ramificato à ̈ il derivato oligosaccaridico del chitosano e può essere ad esempio il Chitlac precedentemente menzionato quando l'oligosaccaride à ̈ il lattosio. Nel caso dei derivati con acidi aldonici degli oligosaccaridi la reazione viene condotta in presenza di una opportuna carbo-diimmide e porta alla formazione di una ammide.
Preparazione delle nanoparticelle
Le nanoparticelle da incorporare nella matrice polimerica possono essere preparate sia in presenza o assenza di agenti riducenti.
Nel primo caso, le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con opportuni riducenti in soluzioni acquose di polisaccaridi a struttura ramificata consistenti nei derivati oligosaccaridici del chitosano precedentemente menzionati secondo la seguente procedura: si preparano soluzioni acquose di tali derivati del chitosano a diverse concentrazioni (fino al 2% (p/V), preferibilmente comprese nell'intervallo da 0,05% (p/V) a 1% (p/V) e più preferibilmente sono dello 0,2%. Le soluzioni di polisaccaridi vengono in seguito miscelate a soluzioni di sali di metalli scelti tra argento, oro, platino, palladio, rame, zinco, nichel, preferibilmente scelti tra cloruri perclorati e nitrati (ad esempio AgNO3, HAuCl4, CuSO4, ZnCl2, NiCl2), in modo da ottenere concentrazioni finali comprese nell'intervallo tra 0,1mM e 20mM, più preferibilmente comprese nell'intervallo 1mM – 14mM e ancora più preferibilmente di 1 mM di tali metalli. Opzionalmente si possono aggiungere alle soluzioni opportuni agenti riducenti noti, preferibilmente scelti tra acido ascorbico, citrato di sodio, sodio boroidruro e sodio cianoboroidruro, per ottenere nanoparticelle allo stato metallico. L'agente riducente à ̈ aggiunto a concentrazioni comprese tra 0,05mM e 10mM e preferibilmente la concentrazione à ̈ di 0,5mM.
Si à ̈ però trovato che diversamente che per altri sistemi polimerici i nanocompositi secondo l'invenzione possono essere preparati anche in assenza di agenti riducenti, poiché le catene laterali di oligosaccaride agiscono di per sé da agente riducente per gli ioni metallici e consentono la formazione di nanoparticelle disperse nella matrice polimerica. In questo caso le nanoparticelle metalliche sono ottenibili per semplice miscelazione di soluzioni di derivati del chitosano con soluzioni di sali del metallo scelto in opportune concentrazioni. Le concentrazioni di polisaccaridi e sali di metalli sono anche in questo caso come in precedenza riportato.
Alcuni esempi di preparazione di nanocompositi secondo l'invenzione su cui sono state eseguite le caratterizzazioni chimico-fisiche e test biologici per valutare la loro attività antibatterica sono di seguito descritti.
Esempio 1: sintesi del derivato del chitosano contenente lattosio (Chitlac)(1a) e del derivato del chitosano contenente cellobiosio (Chitcell) (1b)
1a) Il chitosano (1,5g grado di acetilazione 11%) viene disciolto in 110 mL di una soluzione di metanolo (55mL) e un tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (55mL). Si aggiungono 60 mL di una soluzione di metanolo (30mL) e di tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (30mL) contenente lattosio (2,2 g) e sodio cianoboroidruro (900mg). La miscela viene lasciata in agitazione per 24 ore, trasferita in tubi da dialisi (cut off 12'000Da) e dializzata contro NaCl 0,1M (2 cambi) e contro acqua deionizzata fino ad avere una conducibilità di 4µS a 4°C. Infine, la soluzione viene filtrata su filtri Millipore 0,45µm e liofilizzata.
1b) Il chitosano (1,5g grado di acetilazione 11%) viene disciolto in 110 mL di una soluzione di metanolo (55mL) e un tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (55mL). Si aggiungono 60 mL di una soluzione di metanolo (30mL) e di tampone di acido acetico all'1% a pH 4,5 (30mL) contenente cellobiosio (2,2 g) e sodio cianoboroidruro (900mg). La miscela viene lasciata in agitazione per 24 ore, trasferita in tubi da dialisi (cut off 12'000Da) e dializzata contro NaCl 0,1M (2 cambi) e contro acqua deionizzata fino ad avere una conducibilità di 4µS a 4°C. Infine, la soluzione viene filtrata su filtri Millipore 0,45µm e liofilizzata.
Esempio 2: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac alla concentrazione di 0,05 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 0,5 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,25 mM. Esempio 3: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,05 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 4: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,1 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 0,5 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,25 mM.
Esempio 5: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,1 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 6: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 0,5 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,25 mM.
Esempio 7: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 8: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 0,5 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,25 mM.
Esempio 9: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 10: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 5 mM.
Esempio 11: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 10 mM.
Esempio 12: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 14 mM.
Esempio 13: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac alla concentrazione del 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 5 mM.
Esempio 14: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 10 mM.
Esempio 15: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 14 mM.
Esempio 16: Preparazione delle nanoparticelle di oro in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con sodio boro idruro in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di acido tetracloroaurico in modo da ottenere una concentrazione finale di HAuCl4pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di sodio boroidruro in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,3 mM.
Esempio 17: Preparazione delle nanoparticelle di oro in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con sodio boro idruro in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di acido tetracloroaurico in modo da ottenere una concentrazione finale di HAuCl4pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di sodio boro idruro in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,3 mM.
Esempio 18: Preparazione delle nanoparticelle di oro in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di acido tetracloroaurico in modo da ottenere una concentrazione finale di HAuCl4pari a 1 mM.
Esempio 19: Preparazione delle nanoparticelle di rame in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con sodio boro idruro in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni solfato di rame in modo da ottenere una concentrazione finale di CuSO4pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di sodio boroidruro in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,2 mM.
Esempio 20: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitcell (chitosano+cellobiosio) in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitcell secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chicell a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitcell viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 14 mM.
Esempio 21: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitgluc (chitosano+glucosio) in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitgluc secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitgluc a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitgluc viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 14 mM.
Esempio 22: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitosano in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitosano secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitosano a concentrazione 0,2 % (p/V). Le soluzioni di Chitosano vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 23: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 1 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 24: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in presenza di agenti riducenti
Le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici con acido ascorbico in soluzioni di Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 2 % (p/V). Le soluzioni di Chitlac vengono in seguito miscelate a soluzioni di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM. Successivamente viene aggiunta una soluzione di acido ascorbico in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,5 mM.
Esempio 25: Preparazione delle nanoparticelle di argento in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,2 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di nitrato di argento in modo da ottenere una concentrazione finale di AgNO3pari a 1 mM.
Esempio 26: Preparazione delle nanoparticelle di oro in Chitlac in assenza di agenti riducenti
I nanocompositi comprendenti le nanoparticelle si ottengono in seguito alla riduzione degli ioni metallici ad opera del polisaccaride Chitlac secondo la seguente procedura: si prepara una soluzione acquosa di Chitlac a concentrazione 0,4 % (p/V). La soluzione di Chitlac viene in seguito miscelata a una soluzione di acido tetracloroaurico in modo da ottenere una concentrazione finale di HAuCl4pari a 1 mM.
Di seguito sono riportati le caratterizzazioni chimico-fisiche e biologiche dei nanocompositi secondo l'invenzione ottenuti con il derivato del chitosano con il lattosio, Chitlac, con nanoparticelle di diversi metalli, ed in particolare Ag ed Au. Risultati analoghi sono stati ottenuti con tutti i derivati oligosaccaridici oggetto della presente invenzione.
Stabilizzazione delle nanoparticelle
Per verificare la formazione di nanoparticelle e la loro stabilizzazione nella matrice polimerica secondo gli scopi dell'invenzione, il nanocomposito di esempio 7 à ̈ stato sottoposto alla microscopia elettronica di trasmissione. Come evidenziato in figura 1 la presenza di numerosi gruppi funzionali (gruppi amminici, gruppi ossidrilici) favorisce interazioni di coordinazione con gli ioni metallici, mentre la presenza delle catene laterali degli oligosaccaridi, ad esempio lattosio, offre un efficace impedimento sterico tale da ostacolare la naturale tendenza delle nanoparticelle ad aggregare. Infatti, quando una soluzione di AgNO3viene aggiunta ad una soluzione di Chitlac, si instaurano interazioni di coordinazione tra gli ioni Ag<+>ed i gruppi amminici; in seguito alla riduzione, le catene laterali di lattosio in prossimità dei gruppi amminici sono coinvolte nella stabilizzazione delle nanoparticelle metalliche.
Caratterizzazione UV-Vis
La formazione delle nanoparticelle à ̈ testimoniata dalla comparsa negli spettri di assorbimento UV-Vis di bande di assorbimento a lunghezze d'onda che variano a seconda del metallo considerato; queste bande sono note con il nome di bande di risonanza plasmonica di superficie (surface plasmon resonance band) e sono dovute ad un'oscillazione collettiva degli elettroni liberi sulla superficie delle nanoparticelle. Ad esempio nel caso dell'argento si osserva un'intensa banda a circa 400 nm (Figura 2A); il fatto che la banda plasmonica sia simmetrica e molto stretta suggerisce che sono presenti nanoparticelle ben disperse e prevalentemente di forma sferica. Il paragone tra gli spettri di assorbimento delle nanoparticelle formate nel Chitlac e nel chitosano a parità di condizioni evidenzia il diverso comportamento dei due polisaccaridi. Infatti, nel caso del Chitlac la banda plasmonica à ̈ molto più intensa, simmetrica, stretta e spostata verso lunghezze d'onda minori il che suggerisce la presenza di particelle più piccole e meglio disperse (Figura 2A). Le migliori proprietà del Chitlac rispetto al chitosano possono venire attribuite alle proprietà chimico-fisiche delle catene laterali di lattosio situate sulla catena polimerica. Il sistema à ̈ modulabile a seconda delle concentrazioni utilizzate, come testimoniato dalle caratterizzazioni spettrofotometriche effettuate (Figura 2B). La banda di risonanza plasmonica risulta particolarmente significativa e diagnostica.
Gli spettri confermano inoltre che le particelle metalliche incluse nella matrice polimerica hanno per lo più carica zero; possono però anche essere presenti cluster di pochi atomi con carattere ionico (es. Ag4<+>), come evidenziato dalla spalla a ca.260 nm nello spettro di assorbimento UV dei nostri sistemi (Figura 2, A e B). Lo studio delle variazioni degli spettri UV-Vis in funzione delle concentrazioni e dei tempi di reazione ha permesso di mettere a punto una metodologia di preparazione ottimale in termini di resa, riproducibilità e stabilità nel tempo.
Analogamente, nel caso dell'oro si rileva un'intensa banda plasmonica attorno a 530 nm che testimonia l'avvenuta formazione delle nanoparticelle d'oro disperse nel Chitlac (Figura 3).
Proprietà riducenti del Chitlac:
Sorprendentemente si à ̈ riscontrato che in opportune condizioni si possono formare nanoparticelle metalliche anche in assenza di agenti riducenti aggiunti; ad esempio nel caso dell'argento il Chitlac à ̈ in grado di ridurre gli ioni Ag<+>senza l'ausilio di, ad esempio, acido ascorbico. Gli spettri UV-Vis (Figura 4) e le immagini TEM (Figura 5) confermano l'avvenuta formazione di nanoparticelle metalliche stabili e ben disperse. E' inoltre opportuno notare che, in opportune condizioni, il sistema a base di Chitlac e nanoparticelle di argento privo di agenti riducenti à ̈ in grado di formare idrogeli senza l'aggiunta di ulteriori agenti chimici. Inoltre questi gel si degradano nel tempo (circa 1 settimana).
Anche nel caso dell'oro, il Chitlac privo di agenti riducenti aggiunti permette la riduzione degli ioni Au<3+>allo stato metallico, come testimoniato dagli spettri UV-Vis in Figura 3 dove si osserva il picco plasmonico dell'oro e dalle immagini TEM in Figura 6 in cui si osservano nanoparticelle di dimensioni medie attorno a 50 nm.
Caratterizzazione TEM e analisi dimensionale:
La forma, la distribuzione e le dimensioni delle nanoparticelle formate in presenza ed assenza di agenti riducenti sono state valutate tramite Microscopia a Trasmissione Elettronica (TEM), Nanoparticle Tracking Analysis (Nanosight<R>) e tecniche di analisi di immagine. Le immagini relative a nanoparticelle di oro (Figure 6 e 7) mostrano la presenza di nanoparticelle di dimensione media attorno ai 50nm. Anche nel caso del rame si osserva chiaramente l'avvenuta formazione delle nanoparticelle metalliche (Figura 8). In Figura 9 sono riportate immagini TEM di nanoparticelle di argento di forma rotondeggiante e dimensioni medie attorno ai 30 nm.
Dai risultati ottenuti con queste caratterizzazione dei materiali nanocompositi oggetto dell'invenzione si può concludere che sorprendentemente a parità di condizioni i derivati oligosaccaridi del chitosano, ed in particolare il Chitlac, si sono rivelati essere più adatti per la formazione delle nanoparticelle metalliche rispetto ad altri polisaccaridi come ad esempio il chitosano, come testimoniato anche dall'intensità e forma degli spettri di assorbimento UV-Vis nei diversi casi.
Lo studio spettrofotometrico à ̈ stato affiancato da indagini di Microscopia a Trasmissione Elettronica (TEM) che hanno permesso di visualizzare le nanoparticelle metalliche che risultano essere ben disperse grazie alle interazioni con le catene polimeriche che ne impediscono l'aggregazione. Le micrografie TEM hanno inoltre permesso di effettuare un'analisi sulla distribuzione dimensionale delle nanoparticelle che risulta essere estremamente regolare con dimensione media inferiore ai 50 nm.
Sorprendentemente à ̈ stato anche riscontrato che à ̈ possibile ottenere nanoparticelle metalliche anche in assenza di un agente riducente esogeno. E' stato messo a punto un sistema in cui si ottengono nanoparticelle metalliche omogeneamente disperse nella matrice polimerica sfruttando la capacità riducente propria dei sostituenti laterali del polisaccaride, quindi in assenza di agenti riducenti esogeni. Anche questa seconda metodologia di preparazione à ̈ stata caratterizzata tramite spettroscopia UV-Vis e microscopia TEM. I picchi plasmonici in Figura 4 e le immagini TEM in Figura 5 confermano l'avvenuta formazione di nanoparticelle metalliche di forma tondeggiante e dimensioni medie inferiori ai 10nm.
Questo approccio metodologico risulta essere particolarmente vantaggioso in quanto una singola componente del sistema offre contemporaneamente capacità riducenti, di dispersione e di stabilizzazione delle nanoparticelle.
Al fine di valutare l'attività antimicrobica, i sistemi nanocompositi sono stati testati con diversi ceppi batterici Gram+ e Gram-; test di cinetica di crescita e test di conta delle colonie batteriche hanno dimostrato una potente e rapida azione battericida.
Attività antibatterica:
Sono stati svolti test di inibizione di crescita su diversi ceppi batterici (Gram negativi: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, e Gram positivi: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis) in presenza di soluzioni di Chitlac con e senza nanoparticelle metalliche. E' stato riscontrato che la crescita batterica in soluzioni di Chitlac prive di nanoparticelle à ̈ comparabile alla crescita nel controllo (brodo Mueller-Hinton); al contrario, si verifica una marcata inibizione della crescita batterica in presenza di Chitlac con nanoparticelle metalliche, come riportato ad esempio nel caso dell'argento e dell'oro (Figure 10, 11 e 12) in cui à ̈ possibile osservare la diminuzione del numero di colonie batteriche in funzione del tempo di incubazione. Questo processo à ̈ estremamente rapido, infatti già dopo poche ore si riscontra una efficace inibizione delle cellule batteriche.
Il fatto che tali materiali esibiscano ancora l'attività antimicrobica del metallo che incorporano à ̈ molto significativo ai fini applicativi in campo biomedico farmaceutico. Infatti, l'utilizzo di metalli come argento, oro, rame, zinco e nichel nel campo dei materiali antimicrobici sta avendo un forte impatto sul mercato soprattutto per il trattamento di lesioni topiche sia in campo umano che veterinario. I materiali oggetto della presente potrebbero essere impiegati tal quali, ovvero in miscela con altri polisaccaridi neutri o anionici non gelificanti scelti nel gruppo consistente in destrano, acido ialuronico, carbossimetilcellulosa, galattomannani in soluzione acquosa sia diluita che concentrata con ottenimento di particolari caratteristiche di viscoelasticità , per la preparazione in combinazione con adatti eccipienti e/o diluenti di composizioni con attività antimicrobica impiegabili per il trattamento di infezioni di pelle, mucose ed epiteli, sia integri che lesionati, di diversi distretti anatomici. Tali materiali anche in composizione con altri polisaccaridi neutri o anionici non gelificanti come precedentemente menzionato possono anche trovare applicazione nello sviluppo di dispositivi medicati quali garze, bendaggi, cerotti con attività antimicrobica ad ampio spettro da impiegarsi nello stesso settore terapeutico sopra menzionato.
Inoltre i nanocompositi secondo l'invenzione possono essere utilizzati come aggraffanti polisaccaridici (polymer grafts) - chelanti nano particelle metalliche ad attività antimicrobica - su superfici attivate di materiale polimerico per contenitori in impieghi nel settore farmaceutico ed alimentare. Il vantaggio previsto potrebbe consistere nella sostituzione delle attuali procedure di sterilizzazione (es. dry heat) che producono disomogeneità , talora anche notevoli, nel grado di sterilità finale dei contenitori vuoti pre-riempimento. Inoltre la ricopertura di materiali polimerici può portare all'ottenimento di sistemi dotati di attività antimicrobica per applicazioni in campo biomedico.
Ancora i materiali nanocompositi secondo l'invenzione possono essere utilizzati in miscele polimeriche (polymer blends) con altri polisaccaridi (es: pullulano) per l'ottenimento di film per imballaggi “antimicrobici†, in particolare nel settore alimentare.
E' stato inoltre riscontrato un forte aumento del segnale spettroscopico Raman del polisaccaride attribuibile alla presenza delle nanoparticelle metalliche che quindi possiedono dimensioni e distribuzione adatte per sfruttare l'effetto SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) sul quale si basa il funzionamento di molti biosensori molecolari. Infatti come si evince dalla figura 13 lo spettro Raman di una soluzione del polisaccaride non riporta nessun picco, mentre una soluzione del polisaccaride (anche più diluita) in presenza di nanoparticelle metalliche fornisce uno spettro Raman intenso e definito, testimonianza dell'aumento del segnale dovuto alle nanoparticelle (effetto SERS).
In queste applicazioni nanoparticelle metalliche possono venire utilizzate come sonde/marcatori dotati di funzionalità molecolare e quindi sono considerate ideali per applicazioni di “bioimaging†ottico, essendo esse rilevabili tramite tecniche di microscopia TEM, confocale e Raman. I nanocompositi secondo l'invenzione possono quindi essere impiegati nello sviluppo di nuovi sensori per analisi di biomolecole e cellule sfruttando la presenza sui derivati oligosaccaridici del chitosano di segnali specifici riconosciuti da diversi tipi cellulari (Donati, I. et al., Biomaterials 26, 2005, 987–998).
L'utilizzo dei polisaccaridi ramificati per la formazione di nanoparticelle metalliche secondo la presente invenzione introduce i seguenti vantaggi:
- la presenza dei gruppi amminici sulla catena polimerica permette un'efficace coordinazione degli ioni e, successivamente, delle particelle metalliche;
- le catene laterali oligosaccaridiche costituiscono un ingombro sterico tale da impedire l'aggregazione delle particelle di metallo e garantirne una dispersione omogenea e stabile nel tempo;
- a parità di condizioni, i derivati ramificati del chitosano con oligosaccaridi alditolici – quali il Chitlac – od aldonici si sono rivelati essere molto più efficaci per la formazione delle nanoparticelle rispetto al chitosano in termini di omogeneità dimensionale e dispersione delle particelle (come testimoniato dall'intensità e forma degli spettri di assorbimento UV-Vis nei due casi);
- in assenza di ulteriori agenti riducenti, le catene laterali di oligosaccaride agiscono da agente riducente per gli ioni metallici e consentono la formazione di nanoparticelle disperse nella matrice polimerica;
- la capacità di “autoriduzione†del complesso derivato oligosaccaridico ramificato del chitosano-nanoparticelle di metallo permette di ridurre il numero di componenti chimiche costituenti il sistema;
- semplicità di preparazione e riproducibilità dei risultati;
- vaste applicazioni dei nanocompositi sia per la loro attività antimicrobica ad ampio spettro sia per le particolari proprietà ottiche in applicazioni di spettroscopia Raman (SERS);
- possibilità di utilizzazione in miscele polimeriche (“polymer blends†) con altri polisaccaridi (es: pullulano) per l'ottenimento di film per imballaggi “antimicrobici†, in particolare nel settore alimentare.
Claims (26)
- Rivendicazioni 1 . Materiali nanocompositi caratterizzati dal fatto di comprendere una matrice polimerica consistente in polisaccaridi cationici a struttura ramificata scelti tra derivati alditolici od aidonici del chitosano, in cui unità di D-giucosammina -formanti la catena lineare del chitosano legano mediante il gruppo funzionale — NH- resìdui uguali o diversi Ira di loro mono- od oligosaccaridici rappresentati dalla formula generale (I) in cui: - R può essere — CH2- oppure -CO-; - Ri può essere idrogeno oppure un monosaccaride scelto Ira galattosio, glucosio o N-acetilgiucosammina oppure un oligosaccaride; - R2può essere -OH oppure -NHCOCH3; e nanoparticelle metalliche disperse in tale matrice polimerica.
- 2. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1 , in cui le nanoparticelle sono di metalli scelti tra argento, ora, platino, palladio, rame, zinco, nichel e miscele degli stessi.
- 3. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1 , in cui i residui oligosaccaridici sono scelti nel gruppo consistente in lattosio, cellobiosio, cellotriosio, maltosio, maltotriosio, maltotetraosio, chitobiosio, chitotriosio, mannobiosio ed acidi aidonici degli stessi.
- 4. Materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni 1 , in cui i derivati alditolici od Bidonici del chitosano hanno un grado di sostituzione del gruppo amminico dell'unità D-Glucosammina superiore al 20%.
- 5. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 4, in cui il grado di sostituzione à ̈ compreso tra 50% e 80%.
- 6. Materiali nanocompositi secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui il chitosano ha un peso molecolare medio sino a 1'500kDa.
- 7. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 6, in cui il chitosano ha un peso molecolare medio compreso tra 400kDa e 700kDa.
- 8. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui le nanoparticelle hanno una dimensione media compresa tra 5 e 150 nm.
- 9. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 8, in cui le nanoparticelle hanno una dimensione media di 50nm.
- 10. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1, in cui la massa di metallo in mg incorporata nella matrice polisaccaridica in g di polisaccaride à ̈ compresa tra 3'000mg/g e 0,3 mg/g.
- 11. Materiali nanocompositì secondo la rivendicazione 10, in cui la massa di metallo in mg incorporata nella matrice polisaccaridica in g di polisaccaride à ̈ di 50mg/g.
- 12. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1 aventi proprietà antimicrobiche.
- 13. Materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 1 aventi effetto SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy).
- 14. Metodo di preparazione di materiali nanocompositi secondo una delle rivendicazioni 1-11 caratterizzato dal fatto di comprendere almeno: a) la preparazione di soluzioni acquose di polisaccaridi cationici a struttura ramificata ad una concentrazione sino al 2% ( p/V ); b) la preparazione di soluzioni acquose di sali di metalli ad una concentrazione compresa tra 0,1 mM e 14mM; c) l'addizione di tali soluzioni di sali alle soluzioni di polisaccaridi e miscelazione sino all'ottenimento di soluzioni colloidali in cui nanoparticelle metalliche sono omogeneamente disperse.
- 15. Metodo di preparazione secondo la rivendicazione 14 caratterizzato dal fatto di comprendere l'uiteriore addizione di una soluzione acquosa di un agente riducente in una concentrazione compresa tra 0,05mM e 10mM,
- 16. Metodo di preparazione secondo ia rivendicazione 14, in cui le concentrazioni dei polisaccaridi sono comprese Ira 0,05 e 1 % (p/V) -e le concentrazioni dei sali sono comprese tra 1 mM e 14mM.
- 17. Metodo di preparazione secondo la rivendicazione 16, in cui fe concentrazioni dei polisaccaridi sono di 0,2% (p/V) e le concentrazioni dei sali sono di 1mM.
- 18. Metodo di preparazione secondo la rivendicazione 15, in cui la concentrazione dell'agente riducente à ̈ di 0,5mM.
- 19. Uso dei materiaii nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 come agenti antimicrobici.
- 20. Uso dei materiali nanocompositi secondo la rivendicazione 19 in combinazione con eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili .per il trattamento di infezioni di pelle, mucose ed epiteli, sia integri che lesionati, di diversi distretti anatomici.
- 21. Uso dei materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 in biosensori molecolari.
- 22. Uso dei materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 come aggraffanti poi isacca ridici su superfici attivate di materiali polimerici.
- 23. Uso dei materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 in miscele con altri polisaccaridi per l'ottenimento di film per imballaggi.
- 24. Composizioni comprendenti materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 per uso nel trattamento di infezioni di pelle, mucose ed epiteli, sia integri che lesionati, di diversi distretti anatomici.
- 25. Composizioni secondo la rivendicazione 24, in cui i nanocompositi sono in miscela con polisaccaridi neutri o anionici non gelifìcanti scelti nel gruppo consistente in destrano, acido ialuronico, carbossimetilcellulosa, galattomannani.
- 26. Dispositivi comprendenti materiali nanocompositi secondo le rivendicazioni da 1 a 11 per uso nel trattamento di infezioni di pelle, mucose ed epiteli, sia integri che lesionati, di diversi distretti anatomici. 27. .Dispositivi secondo la rivendicazione ,26, in cui i nanocompositi sono in miscela con polisaccaridi neutri o anionici non gelificanti scelti nel gruppo consistente in destrano, acido ialuronico, carbossimetilcellulosa, galattomannani.
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