ITMI990652A1 - Procedimento per isolare cellule fetali presenti nel sangue periferico materno - Google Patents
Procedimento per isolare cellule fetali presenti nel sangue periferico maternoInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo :
"Procedimento per isolare cellule fetali presenti nel sangue periferico materno"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione è relativa ad un procedimento per isolare cellule fetali presenti nel sangue periferico materno attraverso modifica della densità delle cellule ematiche e separazione a mezzo di centrifugazione in gradiente di densità discontinuo.
STATO DELL’ARTE
Uno degli scopi delia moderna genetica medica risiede nello sviluppo di test diagnostici affidabili e, in particolare in campo prenatale, sicuri e che non costituiscano un rischio per la sopravvivenza del feto e della madre (anche se rarissimi, sono stati descritti casi di peritonite mortale a seguito di amniocentesi.
Oggigiorno la diagnosi prenatale si divide in due tipi di test:
a) un test non invasivo chiamato ‘Triplo test”, molto costoso e rimborsato dal servizio sanitario nazionale solo nei casi a rischio (vale a dire per donne al di sopra dei 36 anni 0 nel caso in cui i genitori presentino nell’anamnesi familiare malattie genetiche ereditarie); questo test ha un indice di affidabilità scarso, essendo rari i falsi negativi, ma numerosi i falsi positivi.
b) due test invasivi, che vengono proposti nel caso di positività al "Triplo test o attuati indipendentemente da esso;
- amniocentesi: è eseguibile solo dopo la 14<a >settimana; il rischio di decesso per il feto è dello 0,5-2% (dato dell’Organizzazione Mondiale della Sanità); è molto costoso;
- esame dei villi coriali: eseguibile solo dopo la 10<a >settimana; il rìschio di decesso per il feto è dello 0,5-5% (dato dell’Organizzazione Mondiale della Sanità).
Attualmente si effettuano ogni anno in Europa più di due milioni di test per la ricerca di comuni alterazioni cromosomiche. Alle donne gravide di 36 anni o più si propone solitamente l’amniocentesi o l’esame dei villi coriali con successivo cariogramma.
Uno dei potenziali approcci non invasivi per ottenere materiale utile alla diagnosi genetica del nascituro consiste nell'analisi di materiale cellulare fetale presente nel torrente circolatorio materno.
Dal 1989 la cosiddetta polymerase Chain reaction (da qui in poi PCR) è stata impiegata con successo per ricercare DNA fetale nel torrente circolatorio materno. In questo studio la PCR è stata usata per cercare bersagli Y altamente ripetitivi sul sito DYZ1 nel DNA di sangue periferico di 19 gestanti. Tutte e 12 le gestanti che avevano fornito campioni positivi a Y hanno poi dato alla luce maschi, mentre tutte e 7 le gestanti che avevano fornito campioni negativi hanno avuto femmine.
La tecnica di amplificazione delle sequenze cromosomiali fetali Y provenienti da sangue materno è stata avvalorata dà un certo numero di studi. In tutti i gruppi esaminati il DNA cromosomiale fetale Y è stato rilevato tramite PCR in sangue periferico materno che non era stato precedentemente arricchito con cellule fetali, già a far tempo dalla 7<a>-8<a >settimana di gestazione (Simpson J.L. e Sherman E., Ann. N.Y. Acad. Sci., 731:1-262, 1993).
Questi studi hanno pertanto fornito prove conclusive circa il fatto che cellule fetali sono sempre presenti nel sangue periferico materno. Parimenti si può dire delle cellule embrionali, col qual termine si intendono cellule di feto alio stadio primitivo, vaie a dire antecedente alla 14<a >settimana. E’ il caso di sottolineare che la letteratura intemazionale usa il termine “cellule fetali” per indicare sia le cellule pre-fetàli (embrionali) che fetali vere e proprie.
La cellula fetale che si presta con maggiori probabilità ad essere isolata ai fini dell’indagine genetica è l’eritroblasto (ER), che costituisce una porzione significativa delle cellule ematiche nel sàngue fetale, mentre è eccezionalmente raro nel sangue periferico dell’adulto. Di fatto gli eritroblasti circolanti costituiscono circa il 10% dei globuli rossi nel feto di 11 settimane e lo 0,5% in quello di 19 settimane, andamento che indica chiaramente la sua preponderanza nei primissjmi mesi di vita.
Per quanto riguarda i globuli bianchi embrionali embrionali, essi non sono prodotti in quantità significative durante il primo trimestre di gestazione, pertanto è altamente improbabile reperirle nel torrente circolatorio materno durante il periodo iniziale della gravidanza.
Un altro tipo cellulare che può costituire un’interessante candidato per l’indagine citogenetica è costituito dalle cellule staminali.
Un problema fondamentale è dato dalla quantità di cellule fetali ricuperabili da 20 mi di sangue materno, che devono essere almeno una ventina per poter effettuare la diagnosi genetica. Secondo i dati forniti dalla letteratura medica internazionale, in 20 mi di sangue materno periferico ci sono poche centinaia di cellule fetali frammiste a circa 120-150 milioni di altre cellule nucleate, un numero eccezionalmente basso, sopratutto in considerazione del fatto che ciascuna fase di manipolazione in laboratorio produce perdite anche consistenti di materiale cellulare. Pertanto è necessario sviluppare un metodo secondo il quale le manipolazioni in laboratorio producano una perdita minima di materiale cellulare, al fine di ottenere, dopo l’isolamento, quel minino di 20-25 cellule fetali per un’accurata analisi citogenetica.
Di solito i metodi di separazione cellulare impiegati per isolare le cellule fetali dal sangue materno impiegano sia strumenti molto semplici (provette e centrifuga) che procedure tecnicamente molto impegnative come l’elutriazione centrifuga, fluorescence activated celi sorter o charge flow separation.
La separazione cellulare in gradienti di densità preparati in comuni provette da centrifuga genera un’enorme perdita di materiale cellulare (solitamente del 50%) ed ha un'accuratezza insufficiente dal momento che si tratta di una procedura manuale. D'altro canto, ì metodi che usano tecnologie sofisticate, oltre ad essere costosi, necessitano operatori con una specifica preparazione e richiedono tempi lunghi (“Celi separation: methods and selected applications”, ed.: Pretlow T.G. and Pretlow T.P., New York, Academic Press, 1982).
Nel caso degli eritroblasti, alle difficoltà sopra dette si aggiunge il fatto che il profilo di distribuzione di densità degli queste cellule si sovrappone con quello di linfociti e monociti, come illustrato dalla Tabella 1 (Haematologica, Gen.-Feb. 1997), rendendo impossibile la loro separazione attraverso metodi di centrifugazione in gradiente di densità.
Tabella 1
SOMMARIO DELL INVENZIONE
E’ stato ora sorprendentemente scoperto un procedimento rapido, semplice, economico ed affidabile per isolare cellule embrionali presenti nel sangue periferico materno, procedimento atto a consentire un'analisi genetica non invasiva e pertanto priva di rischi per il feto, oltre che di disagi per la madre.
Pertanto la presente invenzione si riferisce ad un procedimento per isolare le cellule fetali presenti nel sangue materno periferico, procedimento che comprende le seguenti fasi:
a) il sangue periferico materno viene aggiunto ad un mezzo coltura tissutale non fisiologico;
b) vi si aggiunge una soluzione di acido citrico, sodio citrato e destrosio; c) il sangue proveniente dalle fasi a) e b) viene introdotto in un adatto apparecchio separatore nel quale viene successivamente introdotta una soluzione di densità maggiore contenente un aggregante eritrocitario; d) le cellule nucleate aventi una prestabilita densità vengono isolate tramite una singola centrifugazione in gradiente di densità discontinuo; e) le cellule nucleate vengono lavate con un mezzo da coltura tissutale e risospese in mezzo di coltura appropriato;
f) le cellule fetali vengono individuate quantitativamente e qualitativamente tramite adatti sistemi di riconoscimento.
BREVE DESCRIZIONE DELLA FIGURA
In Figura 1 è rappresentato l'apparecchio di separazione cellulare già descritto nella domanda di brevetto italiana MI97A002457 (a nome del richiedente) utile all'isolamento delle cellule embrionali tramite gradiente di densità. Questo apparecchio consiste in una camera allungata (1) la cui sezione trasversale decresce dalla base verso la sommità dell'apparecchio, camera nella quale sfocia almeno un primo canale (2). Uno dei termini di questo primo canale (2) si apre all'interno di detta camera in corrispondenza della base, e l'altro termine è collegabile ad una fonte di liquido pressurizzabile (non illustrato). Nella camera (1) sfocia uno dei termini di un secondo canale (3) in corrispondenza della sommità. Inoltre in detta camera (1) sfocia almeno un canale addizionale (4), uno dei termini del quale si apre sulla parete allungata della camera (1), e l'altro termine sbocca all’esterno dell’apparecchio.
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE
Oggetto della presente invenzione è un procedimento che consente di isolare cellule fetali dalle altre cellule nucleate presenti nel sangue materno, in particolare da linfociti e monociti.
Tra le cellule fetali che vengono isolate tramite il procedimento della presente invenzione, gli eritroblasti fetali sono i preferiti.
Questo procedimento si attua tramite modifica della densità delle cellule nucleate presenti nel sangue periferico materno, in particolare eritroblasti, monociti e linfociti, densità che sono sovrapponibili in condizioni fisiologiche.
Più specificamente il procedimento dell’invenzione porta ad una diminuzione della densità degli eritroblasti, e contemporaneamente aumenta la densità di monociti e linfociti.
La modifica dei parametri di densità permette un'efficiente separazione delle cellule attraverso una singola fase di centrifugazione in gradiente di densità discontinuo.
Al fine di ottenere questo risultato il sangue materno periferico viene trasferito da condizioni fisiologiche a condizioni non fisiologiche. Questa procedura rende gli eritroblasti più leggeri di 1 ,068 g/ml, mentre linfociti e monociti diventano più pesanti.
La ragione per cui la densità degli eritroblasti diminuisce mentre quella di linfociti e monociti aumenta non è compresa e costituisce una delle caratteristiche sorprendenti della presente invenzione.
Dopo aggiunta di un adatto aggregante eritrocitario quale, ad esempio Ficoll, gli eritroblasti vengono quindi isolati attraverso una singola centrifugazione in gradiente di densità discontinuo usando un adatto apparecchio separatore.
Il solo fatto di effettuare la centrifugazione in gradiente di densità in una singola fase diminuisce drammaticamente la perdita dì materiale cellulare utile alla successiva analisi.
Come apparecchio separatore utile agli scopi della presente invenzione possono essere citati quelli descritti dal brevetto US 4.424.132 (a nome Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha) e dalle domande di brevetto GB 2 075 376 (a nome The Institut of Medicai Sciences), FR 2 350 885 (a nome Baxter Travenol Laboratories, Ine.), WO 88/03045 (a nome North American Biologicals, Ine.), e MI97A002457 (a nome del richiedente). Tra questi apparecchi, risulta preferito quello descritto dalla domanda di brevetto MI97A002457, illustrato nella Fig. 1.
Dopo separazione, la frazione cellulare isolata contenente gli eritrobrasti fetali e non e/o le cellule staminali, unitamente ad un percentuale molto inferiore di altre cellule, quali piastrine e, in quantità neglegibile, monociti, viene lavata e messa in mezzo di coltura ad ambientarsi. Dopo circa 24 ore vengono effettuati adatti test di rilevazione per individuare qualitativamente e quantitativamente le cellule fetali sulle quali si effettua l’analisi genetica.
Nel caso particolare degli eritroblasti fetali, oltre ai comuni esami morfologici, essi possono essere distinti da quelli adulti attraverso la ricerca delle catene ε dell'emoglobina (emoglobina embrionaria). La catena ε è peculiare degli eritroblasti sino alla 12<a>-14<a >settimana di gestazione, mentre è del tutto assente negli eritroblasti adulti che sono invece caratterizzati dalla catena α e β,
Per quanto riguarda l'analisi genetica, si può utilizzare il test FISH (Fluorescent in situ hybridization) che viene diretto, ad esempio, all’individuazione del cromosoma Y, ovviamente assente nella madre, al fine di stabilire il sesso del nascituro. Un'alternativa consiste nel porre le cellule in coltura ed effettuarne il cariogramma, per cui oltre al numero di cromosomi si possono individuare eventuali alterazioni all’interno dei singoli cromosomi.
Come già detto sopra, il procedimento della presente invenzione consente di effettuare una diagnosi genetica dai molteplici vantaggi rispetto ai metodi del'arte nota in quanto il metodo è rapido, semplice, economico, affidabile e non invasivo. Fornendo un rapporto rischi/benefici assolutamente a favore dei secondi, questo metodo rappresenta non solo uno strumento diagnostico d’elezione per le gestanti attempate o gravate da rischi di malattie genetiche ereditarie, ma anche un mezzo di indagine genetica attendibile e sicuro dal punto di vista sanitario per quelle donne che pur essendo al di fuori del gruppo prima descritto desiderano garanzie circa lo stato di salute del nascituro.
Una caratteristica di estremo valore del metodo diagnostico effettuabile con le cellule fetali isolate secondo il metodo della presente invenzione, è che tale metodo può essere effettuato prima della 14<a >settimana di gestazione, in particolare, a partire dalla 7<a >settimana di gestazione.
Verrà ora fornito un esempio di attuazione della presente invenzione. ESEMPIO 1
Sangue materno periferico (20 mi), addizionato con eparina per prevenirne la coagulazione, è stato addizionato con un mezzo di coltura tissutale (25 mi) di avente la composizione illustrata nella Tabella 2.
Tabella 2
Quindi si sono aggiunti 5 mi di una soluzione acquosa contenente acido citrico monoidrato (2 g/250 mi), sodio citrato diidrato (5,5 g/250 mi) e destrosio monoidrato (6,125 g/250 mi), otenendo in tal modo le seguenti condizioni non fisiologiche:
Il sangue periferico così diluito è stato trasferito in una botiglia da coltura tissutale e lasciato per una note a 4°C, per consentire alle cellule di creare un nuovo equilibrio ionico nelle nuove condizioni non fisiologiche cui sono sotoposte.
Il sangue periferico materno così tratato è stato introdoto nell'apparecchio separatore di Fig. 1 atraverso il dotto (2), seguito da 40 mi di una soluzione di Ficoll-sodio diatrizoato avente una densità di 1 ,068 g/ml ed un’osmolarità di 290 mOsm. Quest'ultima soluzione è stata preparara con Ficoll (agente aggregante eritrocitario) e sodio diatrizoato per otenere la desiderata densità, sciolti in Tris-HCI e soluzione Tris-salina bilanciata. Tris-HCl è 0.175M a pH 7,4, mentre la Tris-salina bilanciata è composta da NaCI 125mM. KCI 5mM, MgS04 1,2mM, Tris 35mM e NaH2PO4 1mM. In tal modo il sangue materno si trova tuto sopra il livello corrispondente alle aperture dei dotti (4), mentre al di sotto di questo livello si trova la soluzione di Ficoli/sodio diatrizoato.
Nell'apparecchio separatore cellulare così caricato si è quindi effettuata una centrifugazione a 400g per 1 ora usando uno schema a bassa accelerazione e decelerazione. La migrazione differenziale durante la centrifugazione ha dato luogo alla formazione di strati contenenti i diversi tipi di cellule. Lo strato inferiore contiene gli eritrociti aggregati dal Ficoll e che perciò sedimentano completamente attraverso il mezzo di separazione. Lo strato intermedio, sovrastante quello degli eritrociti, contiene quasi tutte le altre cellule ematiche che nelle presenti condizioni sperimentali raggiungono un livello di densità tale da migrare attraverso il mezzo di separazione verso il fondo dell’apparecchio. A causa della loro bassa densità, si trovano all'interfaccia tra plasma e mezzo di separazione i soli eritroblasti, insieme ad altre particelle a bassa velocità di sedimentazione (piastrine e pochi monociti).
Per raccogliere la frazione cellulare che galleggia sulla superfìcie del mezzo separatore a livello dell'uscita, cioè dei dotti (4), viene introdotto un liquido molto denso e non miscibile con acqua (Fluorinert<®>, 3M Company; densità 1,8 g/ml) alla base della camera allungata attraverso il dotto (2), mentre simultaneamente si pompa aria dalla sommità dell'apparecchio separatore attraverso il dotto (3), usando la medesima polpa peristaltica a due canali (velocità di flusso: 2 ml/min).
il risultato è che le cellule galleggianti all' interfaccia tra il plasma e il mezzo separatore sono forzate attraverso i dotti laterali (4), e vengono raccolte in pochi minuti.
Gli eritroblasti vengono contati con un contaglobuli. Viene effettuata una conta differenziale su citocentrifugati con colorazione con May-Grunwald Giemsa (MGG).
La soluzione è stata sottoposta alle seguenti analisi:
a) ricerca immunologica in situ dell’emoglobina embrionaria (catena ε): le sospensioni di eritroblasti sono stati centrifugate a 200g per 5 minuti; i citocentrifugati ottenuti sono state trattate con un anticorpo monoclonale specifico che la catena ε dell’emoglobina per verificare la presenza di cellule fetali;
b) fluorescent in situ hybridization (FISH) per il cromosoma Y: gli stessi centrifugati del metodo a) sono state usate per ricercare i cromosomi del sesso attraverso un FISH che impiega la sonda specifica per il cromosoma Y digossigenata (Chromosome Y Cocktail DYZ3 DYZ1, Oncor Ine., Gaithersburg, MD) rilevata con il frammento Fab antidigossigenina coniugato con rodamina (Boehringer, Mannheim, Germania), e la sonda biotinilata specifica per il cromosoma X (Chromosome X a-Satellite, Oncor Ine., Gaithersburg, MD) rilevata con avidina coniugata con FITC; i nuclei sono stati contro-colorati_con DAPI.
Gli eritroblasti fetali isolati si sono dimostrati eccezionalmente adatti all’analisi FISH: l’efficienza di ibridizzazione è stata del 90% con le sonde X e Y combinate. I risultati del FISH hanno sempre confermato il sesso di tutti i feti maschi (sesso determinato tramite ecografia o altro metodo).
L’efficienza con la quale gli eritroblasti fetali sono stati isolati dai 20 mi di sangue periferico materno viene illustrata nella successiva Tabella 3.
Tabella 3
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per isolare le cellule fetali presenti nel sangue materno periferico, comprendente le seguenti fasi: a) il sangue periferico materno viene aggiunto ad un mezzo coltura tissutale non fisiologico; b) vi si aggiunge una soluzione di acido citrico, sodio citrato e destrosio; c) il sangue proveniente dalle fasi a) e b) viene introdotto in un adatto apparecchio separatore nel quale viene successivamente introdotta una soluzione di densità maggiore contenente un aggregante eritrocitario; d) le cellule nucleate aventi una prestabilita densità vengono isolate tramite una singola centrifugazione in gradiente di densità discontinuo; e) le cellule nucleate vengono lavate con un mezzo da coltura tissutale e risospese in mezzo di coltura appropriato; f) le cellule fetali vengono individuate quantitativamente e qualitativamente tramite adatti sistemi di riconoscimento.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 tramite il quale vengono isolati eritroblasti fetali.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 nel quale dopo la fase b) le condizioni non fisiologiche sono le seguenti:
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 3 nel quale dopo la fase b) le condizioni non fisiologiche sono le seguenti:
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui l’agente eritrocitario aggiunto nella fase c) è Ficoll.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui nella fase d) si preleva materiale corrispondente ad una valore di densità inferiore a 1,068.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 nel quale l’apparecchio separatore utilizzato nella fase c) è quello descritto nella Fig. 1.
- 8. Uso delle cellule embrionali isolate secondo il procedimento descritto dalla rivendicazione 1 , per effettuare diagnosi genetiche.
- 9. Uso secondo la rivendicazione 8 secondo il quale la diagnosi genetica può essere effettuata prima della 14<a >settimana di gestazione.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 8 secondo il quale la diagnosi genetica può essere effettuata a partire dalla 7<a >settimana di gestazione.
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