ITMI941773A1 - STRAIN OF THE GENUS LACTOBACILLUS OF HUMAN ORIGIN AND ITS USES - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "CEPPO DEL GENERE LACTOBACILLUS DI ORIGINE UMANA E SUOI USI" Description of the industrial invention entitled: "LACTOBACILLUS STRAIN OF HUMAN ORIGIN AND ITS USES"

La presente invenzione ha per oggetto un nuovo ceppo del genere Lactobacillus e composizioni farmaceutiche che lo contengono. The present invention relates to a new strain of the genus Lactobacillus and pharmaceutical compositions containing it.

Più particolarmente, l'invenzione riguarda un nuovo ceppo di Lactobacillus acidophilus di origine umana siglato CNCM 1-1447 depositato ai sensi del Trattato di Budapest presso la Collezione CNCM dell'Institut Pasteur il 13.07.1994. More particularly, the invention relates to a new strain of Lactobacillus acidophilus of human origin signed CNCM 1-1447 deposited under the Budapest Treaty in the CNCM Collection of the Institut Pasteur on 13.07.1994.

L’utilizzazione dei fermenti lattici in terapia ha ima lunga e consolidata tradizione, che risale agli inizi di questo secolo ed agli studi che mettevano in evidenza i benefici effetti dell'uso di latte fermentato sulle condizioni di salute dei consumatori (Rif 1-5). The use of lactic ferments in therapy has a long and consolidated tradition, which dates back to the beginning of this century and to studies that highlighted the beneficial effects of the use of fermented milk on the health conditions of consumers (Ref 1-5) .

Da allora i fermenti lattici sono stati largamente utilizzati nell'industria farmaceutica e costituiscono il principio attivo di numerose formulazioni per la cura di malattie intestinali dovute per esempio alla presenza di patogeni e come coadiuvanti al termine di trattamenti con antibiotici (Rif 6-9). Since then, lactic ferments have been widely used in the pharmaceutical industry and constitute the active principle of numerous formulations for the treatment of intestinal diseases due for example to the presence of pathogens and as adjuvants at the end of treatments with antibiotics (Ref 6-9).

Nel corso di questi decenni, però, la ricerca microbiologica ha approfondito le conoscenze relative ai fermenti lattici in generale e ai lattobacilli in particolare, ottenendo una massa di informazioni di notevole entità. In the course of these decades, however, microbiological research has deepened the knowledge relating to lactic ferments in general and to lactobacilli in particular, obtaining a mass of information of considerable entity.

I prodotti attualmente in commercio, tuttavia, non risultano aver recepito le acquisizioni della più recente ricerca scientifica (Rif 10-11). The products currently on the market, however, do not appear to have incorporated the acquisitions of the most recent scientific research (Ref 10-11).

In particolare conviene sottolineare come da diversi anni numerose ricerche abbiano chiarito che: In particular, it should be emphasized that for several years numerous researches have clarified that:

i bacilli lattici svolgono un ruolo peculiare nella regolazione della microflora intestinale, sia mediante la produzione di acido lattico che mediante la produzione di specifiche sostanze antibatteriche (Rif 12-16); lactic bacilli play a particular role in the regulation of intestinal microflora, both through the production of lactic acid and through the production of specific antibacterial substances (Ref 12-16);

questi batteri devono essere provenienti dall’ambiente intestinale in cui si pensa poi di reinserirli (ad es., isolati dal sistema intestinale umano per essere utilizzati in essere umani ecc.) al fine di garantire l'insediamento, che rispetta le condizioni di "specificità d'ospite" (Rif 17); these bacteria must come from the intestinal environment in which they are then thought to be reinserted (eg, isolated from the human intestinal system to be used in humans, etc.) in order to ensure settlement, which respects the conditions of "specificity guest "(Ref 17);

i bacilli lattici sono coinvolti in numerose attività metaboliche di particolare interesse per il mantenimento di buone condizioni di salute e per la prevenzione dell'insorgenza di diversi stati patologici; si possono citare in particolare la deconiugazione degli addi biliari, la degradazione delle nitrosoamine, la neutralizzazione di tossine batteriche, l'attività anticancerogenica (Rif 18); lactic bacilli are involved in numerous metabolic activities of particular interest for the maintenance of good health conditions and for the prevention of the onset of various pathological states; we can mention in particular the deconjugation of biliary additives, the degradation of nitrosamines, the neutralization of bacterial toxins, the anticarcinogenic activity (Ref 18);

la capacità di aderire agli epiteli intestinali conferisce un forte vantaggio ai batteri intestinali (basti ricordare che diversi batteri patogeni perdono la loro virulenza in concomitanza con la perdita della capadtà di aderire alle mucose); anche per i batteri lattici la possibilità di colonizzare gli epiteli può quindi rivelarsi di particolare importanza, in particolare per conferire quella resistenza alla colonizzazione che tanta parte ha nel proteggere l’individuo dall'insediamento di batteri patogeni (Rif 10, 19); the ability to adhere to intestinal epithelia gives a strong advantage to intestinal bacteria (just remember that various pathogenic bacteria lose their virulence in conjunction with the loss of the ability to adhere to mucous membranes); also for lactic bacteria, the possibility of colonizing the epithelia may therefore prove to be of particular importance, in particular to confer that resistance to colonization that plays a great part in protecting the individual from the settlement of pathogenic bacteria (Ref 10, 19);

la collocazione tassonomica dei ceppi di origine intestinale é stata sottoposta a profonda revisione, non solo con il riconoscimento di nuove spede batteriche caratteristiche di quell'ecosistema, ma anche con la differenziazione di biotipi particolari aH'intemo di ogni specie (Rif 20); le proprietà "tecnologiche" dei ceppi (prima fra tutte la capadtà di resistere ai trattamenti di crio-conservazione) rivestono un particolare significato nel determinare una positiva utilizzazione dei ceppi di batteri lattici; i ceppi di lattobacilli usati a scopo probiotico sono infatti, generalmente, poco resistenti alla liofilizzazione (Rif 21). La capacità di adesione deve essere mantenuta dopo liofilizzazione (cosa che non sempre avviene). the taxonomic location of the strains of intestinal origin has been subjected to a profound revision, not only with the recognition of new bacterial species characteristic of that ecosystem, but also with the differentiation of particular biotypes within each species (Ref 20); the "technological" properties of the strains (first of all the ability to resist cryopreservation treatments) have a particular significance in determining a positive use of the strains of lactic bacteria; the strains of lactobacilli used for probiotic purposes are in fact generally not very resistant to lyophilization (Ref 21). The adhesion capacity must be maintained after freeze-drying (which is not always the case).

In particolare, nel tentativo di isolare ceppi di lattobacilli che presentino un’elevata capacità adesiva alle cellule della mucosa intestinale, sono state descritte strategie di isolamento da fonti che possono essere definite "omologhe", quali feci di individui sani. In particular, in an attempt to isolate strains of lactobacilli that have a high adhesive capacity to the cells of the intestinal mucosa, isolation strategies have been described from sources that can be defined as "homologous", such as the feces of healthy individuals.

Ad esempio US 4839281, EP-A-199535 e US 5032399 descrivono un ceppo di Lactobacillus acidophilus isolato da individui adulti e caratterizzato da elevate caratteristiche di adesione, quantificate come numero di cellule batteriche che aderiscono a una cellula di mucosa intestinale umana, in confronto a un ceppo di riferimento. L'esattezza della classificazione tassonomica di detto ceppo risulta però dubbia in quanto l'autore stesso nel corso dell'esame della domanda di brevetto da parte dell'ufficio brevetti americano sostiene sulla base dei dati sperimentali che il lattobacillo in questione appartiene ad una specie non acidofila (U.S. Patent 4839281, File History, risposta alla Office Action del 30 ottobre 1987, pagina 7, ultimo capoverso). For example US 4839281, EP-A-199535 and US 5032399 describe a Lactobacillus acidophilus strain isolated from adults and characterized by high adhesion characteristics, quantified as the number of bacterial cells adhering to a human intestinal mucosal cell, compared to a reference strain. The accuracy of the taxonomic classification of this strain is however doubtful as the author himself, during the examination of the patent application by the American patent office, argues on the basis of experimental data that the lactobacillus in question belongs to a non-species acidophilic (U.S. Patent 4839281, File History, response to the Office Action of October 30, 1987, page 7, last paragraph).

Si é ora trovato sorprendentemente che il ceppo Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1447 oltre a caratteristiche di adesività a cellule della mucosa intestinale spesso superiori a quelle dei ceppi finora noti, presenta anche le seguenti proprietà: It has now been surprisingly found that the Lactobacillus acidophilus CNCM 1-1447 strain in addition to adhesion characteristics to intestinal mucosal cells often superior to those of the so far known strains, also has the following properties:

capacità di inibire la crescita di patogeni intestinali umani; ability to inhibit the growth of human intestinal pathogens;

capacità di crescita in diverse condizioni sia in aerobiosi sia in anaerobiosi e a differenti pH, tali da conferire la possibilità di un buon adattamento a situazioni, sia fisiologiche che patologiche, che si possono verificare durante il transito nell'apparato gastrointestinale; growth capacity in different conditions both in aerobiosis and in anaerobiosis and at different pH, such as to give the possibility of a good adaptation to situations, both physiological and pathological, which can occur during transit in the gastrointestinal tract;

produzione di acido lattico in elevata quantità; production of lactic acid in high quantities;

resistenza elevata alla bile; high resistance to bile;

resistenza alla liofilizzazione, con conservazione della capacità di aderire a cellule intestinali. resistance to freeze-drying, with preservation of the ability to adhere to intestinal cells.

Si tratta quindi di un ceppo appartenente alla specie Lactobacillus acidophilus caratterizzato da una serie di proprietà che lo rendono particolarmente interessante nella profilassi e nella cura di una serie di patologie. It is therefore a strain belonging to the Lactobacillus acidophilus species characterized by a series of properties that make it particularly interesting in the prophylaxis and treatment of a series of pathologies.

L'invenzione fornisce pertanto composizioni farmaceutiche o veterinarie contenenti il ceppo CNCM 1-1447 preferibilmente in forma liofilizzata, in miscela con un veicolo opportuno. Tali composizioni possono essere somministrate per via orale, eventualmente in miscela con prodotti alimentari quali latte, yogurt o latticini, per il trattamento o la profilassi di patologie gastroenteriche in cui sia desiderabile la somministrazione di lattobacilli, quali ad esempio dismicrobismo intestinale, diarrea di varia origine, colite ulcerativa e patologie correlate. Le composizioni dell'invenzione possono inoltre essere somministrate in concomitanza a trattamenti antibiotici, allo scopo di preservare la flora batterica intestinale non patologica. Detto ceppo può essere formulato anche in miscela con altri ceppi aventi caratteristiche complementari allo scopo di ottenere preparati che presentano un bilancio ottimale delle caratteristiche probiotiche e tecnologiche sopra riportate. Esempi assolutamente non limitativi sono dati da composizioni contenenti detto ceppo in miscela con almeno uno dei ceppi CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 e CNCM 1-1392 descritti nella domanda di brevetto MI 94/A0Q1073. The invention therefore provides pharmaceutical or veterinary compositions containing the CNCM 1-1447 strain preferably in lyophilized form, in admixture with a suitable vehicle. These compositions can be administered orally, optionally in a mixture with food products such as milk, yogurt or dairy products, for the treatment or prophylaxis of gastrointestinal diseases in which the administration of lactobacilli is desirable, such as intestinal dysmicrobism, diarrhea of various origins. , ulcerative colitis and related diseases. The compositions of the invention can also be administered concomitantly with antibiotic treatments, in order to preserve the non-pathological intestinal bacterial flora. Said strain can also be formulated in mixture with other strains having complementary characteristics in order to obtain preparations which have an optimal balance of the probiotic and technological characteristics indicated above. Absolutely non-limiting examples are given by compositions containing said strain in mixture with at least one of the CNCM 1-1390, CNCM 1-1391 and CNCM 1-1392 strains described in patent application MI 94 / A0Q1073.

Ogni dose unitaria, tipicamente in forma di capsule, soluzioni o sospensioni bevibili, polvere in bustine e simili, conterrà generalmente da 10<6 >a 10<10 >cellule di ogni singolo ceppo. Each unit dose, typically in the form of drinkable capsules, solutions or suspensions, powder sachets and the like, will generally contain 10 <6> to 10 <10> cells from each individual strain.

Un'altra importante caratteristica del ceppo della presente invenzione è che è stato isolato dalle feci di neonato. È infatti noto che il tratto gastrointestinale dei mammiferi alla nascita è sterile; viene rapidamente colonizzato generalmente con la flora materna vaginale e perianale. Questa via naturale di trasferimento di microorganismi benefici manca in bambini nati attraverso taglio cesareo e questi sono in genere più soggetti a colonizzazioni di microorganismi meno favorevoli. Questo rischio può essere ridotto somministrando opportune formulazioni del ceppo della presente invenzione. Another important feature of the strain of the present invention is that it has been isolated from newborn feces. It is in fact known that the gastrointestinal tract of mammals is sterile at birth; it is rapidly colonized generally with the vaginal and perianal maternal flora. This natural route of transfer of beneficial microorganisms is lacking in children born by caesarean section and these are generally more prone to colonization by less favorable microorganisms. This risk can be reduced by administering suitable formulations of the strain of the present invention.

Si descrive di seguito l'isolamento del ceppo e la sua caratterizzazione. The isolation of the strain and its characterization are described below.

Isolamento del ceppo Strain isolation

Il ceppo è stato isolato a partire da soggetti neonati, dal primo giorno di vita fino al sesto. The strain was isolated from newborn subjects, from the first day of life to the sixth day.

Il campionamento veniva effettuato sulle feci dei soggetti, prelevate due volte al giorno dalla clinica, dove erano conservati in swabs sterili in condizioni anaerobiche. Le semine per l’evidenziazione della presenza di lattobacilli venivano effettuate in terreno selettivo LBS™ ( Lactobacillus Selection Agar, Oxoid) e successiva incubazione anaerobica (sistema Gas Pack, BBL) per 48 ore a 37°C. Le colonie così ottenute venivano isolate in terreno liquido MRS (de Man - Rogosa -Sharpe broth, Oxoid) e sottoposte alla prima serie di reisolamenti per ottenere una coltura pura (strisci successivi su terreno selettivo agarizzato e isolamento di singole colonie). Queste procedure rispecchiano la metodologia proposta da Sharpe (Rif 22). Sampling was performed on the subjects' feces, collected twice a day from the clinic, where they were stored in sterile swabs under anaerobic conditions. Sowing to highlight the presence of lactobacilli was carried out in LBS ™ selective medium (Lactobacillus Selection Agar, Oxoid) and subsequent anaerobic incubation (Gas Pack system, BBL) for 48 hours at 37 ° C. The colonies thus obtained were isolated in liquid MRS medium (de Man - Rogosa -Sharpe broth, Oxoid) and subjected to the first series of re-isolations to obtain a pure culture (subsequent smears on selective agar medium and isolation of single colonies). These procedures mirror the methodology proposed by Sharpe (Ref 22).

Caratterizzazione primaria Primary characterization

Dopo aver effettuato la procedura per la purificazione degli isolati, si é proceduto alla prima sommaria caratterizzazione dei ceppi così ottenuti, al fine di ritenere per lo studio solo quelli appartenenti al genere Lactobacillus. After carrying out the procedure for the purification of the isolates, the first summary characterization of the strains thus obtained was carried out, in order to consider only those belonging to the genus Lactobacillus for the study.

Sono stati quindi esaminati la morfologia (esame al microscopio ottico a contrasto di fase), la reazione alla colorazione di Gram (positiva per tutti i lattobacilli), la reazione per la presenza di catalasi (negativa in tutti i lattobacilli) e la determinazione della quantità dei due stereoisomeri di acido lattico presenti nel brodo di coltura dei singoli ceppi dopo 24 ore di incubazione (determinazione enzimatica con kit Boehringer). Questi tests consentono di assegnare al genere Lactobacillus gli isolati ottenuti dai terreni di selezione specifici e incubati come sopra descritto (Rif 22). The morphology (phase contrast optical microscope examination), the Gram stain reaction (positive for all lactobacilli), the reaction for the presence of catalase (negative in all lactobacilli) and the determination of the quantity were then examined. of the two stereoisomers of lactic acid present in the culture broth of the single strains after 24 hours of incubation (enzymatic determination with Boehringer kit). These tests allow to assign to the genus Lactobacillus the isolates obtained from the specific selection media and incubated as described above (Ref 22).

Identificazione del ceppo Identification of the strain

L'analisi del profilo plasmide, realizzato mediante una tecnica di estrazione alcalina (Rif 23), é stata quindi effettuata su tutti i ceppi identificati al punto precedente come lattobacilli; questa analisi permette di discriminare l'identità di isolati batterici (Rif 24). Inoltre é stato controllato il profilo delle proteine solubili citoplasmatiche (Rif 25), nonché il pattern delle antibiotico resistenze (Rif 26). The analysis of the plasmid profile, carried out by means of an alkaline extraction technique (Ref 23), was then carried out on all the strains identified in the previous point as lactobacilli; this analysis allows to discriminate the identity of bacterial isolates (Ref 24). Furthermore, the profile of cytoplasmic soluble proteins was checked (Ref 25), as well as the pattern of antibiotic resistance (Ref 26).

Caratterizzazione tassonomica fenotipica Phenotypic taxonomic characterization

Il ceppo di interesse è stato quindi analizzato per la sua collocazione tassonomica mediante i tests fenotipici standard, come la fermentazione degli zuccheri (sistema gallerie API CH 50, Biomerieux). The strain of interest was then analyzed for its taxonomic location by standard phenotypic tests, such as sugar fermentation (API CH 50 tunnel system, Biomerieux).

Si riportano di seguito la tassonomia e le caratteristiche del ceppo dell'invenzione : The taxonomy and characteristics of the strain of the invention are reported below:

Il ceppo dell'invenzione CNCM 1-1447 è stato paragonato a ceppi di riferimento per quanto riguarda la capacità di adesione alle cellule intestinali, la capacità di crescita a diverse condizioni di pH, di concentrazione di bile e di incubazione, la capacità di influire sulla crescita di patogeni intestinali. The CNCM 1-1447 strain of the invention has been compared to reference strains as regards the ability to adhere to intestinal cells, the ability to grow under different conditions of pH, bile concentration and incubation, the ability to affect the growth of intestinal pathogens.

I ceppi di riferimento utilizzati in questi studi sono stati: The reference strains used in these studies were:

Lactobacillus acidophilus ATCC 53103 Lactobacillus acidophilus ATCC 53103

Lactobacillus acidophilus ATCC 4357 Lactobacillus acidophilus ATCC 4357

Lactobacillus delbrueckii ATCC 7994 Lactobacillus delbrueckii ATCC 7994

Salmonella enteritidis IMM2 Salmonella enteritidis IMM2

Escherichia coli ATCC 35401 Escherichia coli ATCC 35401

Test di adesione a cellule epiteliali umane Human epithelial cell adhesion test

Il test di adesività è stato effettuato "in vitro” su una linea cellulare intestinale di collezione, Intestine 407 (cellule di intestino embrionale ottenute dall'Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Brescia). The adhesiveness test was carried out "in vitro" on an intestinal cell line from the collection, Intestine 407 (embryonic intestine cells obtained from the Experimental Zooprophylactic Institute of Brescia).

Le Intestine 407 sono state fatte crescere in Eagle’s Basai Medium in Hanks BSS contenente 10% di siero fetale bovino ed incubate a 37°C in atmosfera a 5% di CO2 per 48 ore. I monostrati formati sono stati tripsinizzati secondo le metodiche tradizionali (eliminazione del terreno di crescita, lavaggio del substrato con soluzione PBS (Phosphate Buffered Saline), addizione di 2 mL di tripsina-versene alla concentrazione dello 0,25%). La sospensione ottenuta é stata successivamente centrifugata a 1700 g per 10 min e lavata 2 volte in PBS. Le cellule sono state quindi diluite con soluzione PBS fino ad ottenere una concentrazione di 100 cellule/mL. Intestines 407 were grown in Eagle's Basai Medium in Hanks BSS containing 10% fetal bovine serum and incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2 for 48 hours. The monolayers formed were trypsinized according to traditional methods (elimination of the growth medium, washing of the substrate with PBS solution (Phosphate Buffered Saline), addition of 2 mL of trypsin-versene at a concentration of 0.25%). The suspension obtained was subsequently centrifuged at 1700 g for 10 min and washed twice in PBS. The cells were then diluted with PBS solution to obtain a concentration of 100 cells / mL.

Il test di adesività è stato eseguito aggiungendo 10<7 >batteri cresciuti nelle condizioni idonee a IO<5 >cellule epiteliali in PBS. La miscela è stata incubata per 30 minuti a 37° C in agitazione continua. Successivamente i batteri non adesi sono stati eliminati filtrando la sospensione attraverso un filtro di policarbonato (Sartorius) con pori di 5 pm di diametro. Dopo ripetuti lavaggi, le membrane sono state poste su vetrino, asciugate aH'aria, fissate con metanolo e colorate con cristalvioletto al fine di evidenziare il numero di batteri adesi. La media di batteri adesi per cellula (X) è stata determinata contando il numero di batteri adesi per 100 cellule. The adhesiveness test was performed by adding 10 <7> bacteria grown under suitable conditions to 10 <5> epithelial cells in PBS. The mixture was incubated for 30 minutes at 37 ° C with continuous stirring. Subsequently, the non-adherent bacteria were eliminated by filtering the suspension through a polycarbonate filter (Sartorius) with pores of 5 µm in diameter. After repeated washing, the membranes were placed on a slide, dried in air, fixed with methanol and stained with crystal violet in order to highlight the number of adherent bacteria. The average number of attached bacteria per cell (X) was determined by counting the number of attached bacteria per 100 cells.

È stata inoltre calcolata l'adesività relativa dei ceppi in esame rispetto al ceppo ATCC 53103 preso come riferimento dalla seguente equazione: The relative adhesiveness of the test strains was also calculated with respect to the ATCC 53103 strain taken as a reference by the following equation:

I risultati mostrano l'eccellente capacità del ceppo della presente invenzione CNCM 1-1447 di aderire alle cellule della mucosa intestinale, in alcuni casi ben maggiore di quella dei riferimenti. The results show the excellent ability of the strain of the present invention CNCM 1-1447 to adhere to the cells of the intestinal mucosa, in some cases much greater than that of the references.

Crescita a differenti pH Growth at different pHs

II ceppo CNCM 1-1447 e i ceppi di riferimento sono stati fatti crescere in terreno liquido MRS (Oxoid) a valori di pH 3 (ottenuto con l'aggiunta di HC1), a pH 5 (normale valore del brodo) e a pH 8 (ottenuto con 1'aggiunta di NaOH). The CNCM 1-1447 strain and the reference strains were grown in liquid MRS (Oxoid) medium at pH 3 (obtained with the addition of HC1), pH 5 (normal broth value) and pH 8 (obtained with the addition of NaOH).

I campioni sono stati incubati a 37° C in atmosfera al 5% di CO2 e a diversi intervalli di tempo (12 h, 24 h, 48 h) é stata effettuata la conta batterica. I risultati di questi esperimenti sono riportati in Tabella 2. The samples were incubated at 37 ° C in a 5% CO2 atmosphere and bacterial counts were carried out at different time intervals (12 h, 24 h, 48 h). The results of these experiments are reported in Table 2.

I risultati mostrano che il ceppo della presente invenzione CNCM 1-1447 è in grado di crescere in diverse condizioni di pH. In particolare il ceppo mostra una resistenza a pH acidi uguale o superiore a quella dei ceppi di riferimento. The results show that the strain of the present invention CNCM 1-1447 is capable of growing under different pH conditions. In particular, the strain shows resistance to acid pH equal to or greater than that of the reference strains.

Stabilità in presenza di bile Stability in the presence of bile

Il ceppo della presente invenzione e il ceppo di riferimento ATCC 53103 sono stati incubati per 48 h in terreno liquido MRS. Le brodocolture sono state diluite (10-7 CFU/mL) e seminate su MRS agar in presenza di 1,5 g/L e 3 g/L di bile (Oxgall powder, Sigma). Dopo 48 h di incubazione a 37’C in anaerobiosi é stata effettuata una conta batterica per osservare l'eventuale resistenza alla bile. I risultati sono riportati in Tabella 3. The strain of the present invention and the reference strain ATCC 53103 were incubated for 48 h in liquid MRS medium. The broth cultures were diluted (10-7 CFU / mL) and seeded on MRS agar in the presence of 1.5 g / L and 3 g / L of bile (Oxgall powder, Sigma). After 48 hours of incubation at 37'C in anaerobiosis, a bacterial count was carried out to observe any resistance to bile. The results are reported in Table 3.

I risultati dimostrano che il ceppo della presente invenzione possiede una buona resistenza alla bile anche ad elevate concentrazioni della stessa. The results show that the strain of the present invention has a good resistance to bile even at high concentrations of the same.

Crescita in condizioni di anaerobiosi e di aerobiosi Growth in anaerobic and aerobic conditions

Il ceppo della presente invenzione e i ceppi di riferimento sono stati inoculati in terreno liquido MRS a 37° C in condizioni di anaerobiosi (anaerobic system -model 1024) e aerobiosi per una notte e quindi si è proceduto alla conta batterica su piastra. I risultati riportati in Tabella 4 mostrano la capacità del ceppo della presente invenzione di crescere in condizioni sia di anaerobiosi che di aerobiosi. The strain of the present invention and the reference strains were inoculated in liquid MRS medium at 37 ° C under anaerobic system (model 1024) and aerobic conditions for one night and then the bacterial count was carried out on a plate. The results reported in Table 4 show the ability of the strain of the present invention to grow in both anaerobic and aerobic conditions.

Interferenza sulla crescita di patogeni intestinali Interference on the growth of intestinal pathogens

La capacità del ceppo della presente invenzione di inibire la crescita di patogeni intestinali è stata valutata in esperimenti di cocoltura con Escherichia coli (ATCC 35401 entero tossigenico) e Salmonella enteritidis (IMM2). The ability of the strain of the present invention to inhibit the growth of intestinal pathogens was evaluated in co-culture experiments with Escherichia coli (ATCC 35401 entero-toxigenic) and Salmonella enteritidis (IMM2).

In una prima serie di esperimenti, il ceppo della presente invenzione e i ceppi di riferimento sono stati fatti crescere per una notte, e quindi inoculati con i patogeni a 37° C in atmosfera al 5% di C02 un terreno di coltura costituito da una miscela 1 a 1 di terreno liquido MRS a doppia concentrazione e di terreno liquido Mueller-Hilton a doppia concentrazione. Dopo 24 h e 48 h sono state effettuate le conte batteriche sia dei patogeni che dei ceppi in esame. I ceppi cresciuti da soli nelle stesse condizioni sono stati utilizzati come controlli. I risultati di questi esperimenti sono riportati nelle Tabelle 5 e 6. In a first series of experiments, the strain of the present invention and the reference strains were grown overnight, and then inoculated with the pathogens at 37 ° C in an atmosphere at 5% C02, a culture medium consisting of a mixture 1 to 1 of double concentration MRS liquid medium and double concentration Mueller-Hilton liquid medium. After 24 h and 48 h the bacterial counts of both the pathogens and the strains under examination were carried out. Strains grown alone under the same conditions were used as controls. The results of these experiments are reported in Tables 5 and 6.

In un'altra serie di esperimenti, il ceppo della presente invenzione e i ceppi di riferimento sono stati inoculati contemporaneamente con i patogeni e sono stati fatti crescere nelle stesse condizioni indicate sopra. Dopo 24 h e 48 h di incubazione sono state effettuate le conte batteriche sia dei patogeni che dei ceppi in esame. Come controlli sono stati utilizzati i ceppi cresciuti nelle stesse condizioni ma singolarmente. I risultati di questi esperimenti sono riportati nelle Tabelle 7 e 8. In another series of experiments, the strain of the present invention and the reference strains were inoculated simultaneously with the pathogens and grown under the same conditions as indicated above. After 24 h and 48 h of incubation, bacterial counts of both the pathogens and the strains under examination were performed. Strains grown under the same conditions but individually were used as controls. The results of these experiments are reported in Tables 7 and 8.

I risultati degli esperimenti di crescita di patogeni in cocoltura con i ceppi in esame mostrano sorprendentemente che il ceppo della presente invenzione è efficace nell'inibire la crescita di microorganismi dannosi. Infatti, come riportato nelle Tabelle 5 e 6, la crescita sia di Escherichia coli che di Salmonella enteritidis è fortemente inibita quando una sufficiente quantità di lattobacillo viene inoculata con questi due patogeni (un valore <3, espresso come logaritmo decimale di CFU/mL, è stato trovato in tutti i casi). Il ceppo è in grado di inibire la crescita degli stessi patogeni anche quando viene inoculato simultaneamente (Tabelle 7 e 8). In particolare, nel caso di Salmonella enteritidis si è osservato una inibizione uguale a quella che si verifica quando il lattobacillo viene cresciuto per una notte e inoculato (confrontare Tabella 8 e Tabella 6). È, inoltre, interessante notare che la crescita del ceppo CNCM 1-1447 non viene minimamente influenzata dalla contemporanea presenza del patogeno. _ _ _ _ _ The results of the experiments of growth of pathogens in coculture with the strains under examination show surprisingly that the strain of the present invention is effective in inhibiting the growth of harmful microorganisms. In fact, as reported in Tables 5 and 6, the growth of both Escherichia coli and Salmonella enteritidis is strongly inhibited when a sufficient quantity of lactobacillus is inoculated with these two pathogens (a value <3, expressed as decimal log of CFU / mL, was found in all cases). The strain is able to inhibit the growth of the same pathogens even when it is inoculated simultaneously (Tables 7 and 8). In particular, in the case of Salmonella enteritidis an inhibition equal to that which occurs when the lactobacillus is grown overnight and inoculated was observed (compare Table 8 and Table 6). It is also interesting to note that the growth of the CNCM 1-1447 strain is not minimally affected by the simultaneous presence of the pathogen. _ _ _ _ _

Dai risultati sopra riportati risulta evidente come il ceppo della presente invenzione sia dotato di ima serie di caratteristiche che lo rendono particolarmente idoneo alla preparazione di medicamenti. Il ceppo della presente invenzione possiede una buona capacità di aderire alle cellule epiteliali umane (caratteristica importante per la colonizzazione), mostra una elevata resistenza alla bile ed è in grado di resistere a pH acidi, e di crescere in condizioni sia di anaerobiosi che di aerobiosi. Inoltre, il ceppo della presente invenzione mostra una sorprendente capacità di inibire la crescita di patogeni del tratto gastrointestinale. From the above results it is evident that the strain of the present invention is endowed with a series of characteristics which make it particularly suitable for the preparation of medicaments. The strain of the present invention has a good ability to adhere to human epithelial cells (an important feature for colonization), shows a high resistance to bile and is able to resist acid pH, and to grow in both anaerobic and aerobic conditions. . Furthermore, the strain of the present invention exhibits a surprising ability to inhibit the growth of pathogens of the gastrointestinal tract.

Il ceppo dell'invenzione mantiene inoltre tali proprietà anche dopo liofilizzazione, presenta alta velocità di crescita, e assenza di lisogenia. The strain of the invention also maintains these properties even after lyophilization, has a high growth rate, and an absence of lysogenicity.

Queste proprietà rendono il ceppo particolarmente adatto per la profilassi e il trattamento di disturbi che possono risultare da ingestione di cibo o acqua contaminata o che sono conseguenti a trattamenti con antibiotici o a condizioni generali di stress. Inoltre, il ceppo è particolarmente adatto per il trattamento di neonati in tutte quelle situazioni in cui si possono verificare condizioni di colonizzazione con microorganismi meno favorevoli (ad es., taglio cesareo). These properties make the strain particularly suitable for the prophylaxis and treatment of ailments that may result from the ingestion of contaminated food or water or which are consequent to treatments with antibiotics or general stressful conditions. Furthermore, the strain is particularly suitable for the treatment of newborns in all those situations in which colonization conditions with less favorable microorganisms may occur (eg, caesarean section).

Claims (10)

Rivendicazioni 1. Ceppo di Lactobacillus acidophilus depositato presso la collezione CNCM dell'Institut Pasteur al numero 1-1447. Claims 1. Lactobacillus acidophilus strain deposited in the CNCM collection of the Institut Pasteur at number 1-1447. 2. Composizioni farmaceutiche o veterinarie contenenti il ceppo di Lactobacillus acidophilus 1-1447 secondo la rivendicazione 1 in miscela con un veicolo compatibile. 2. Pharmaceutical or veterinary compositions containing the Lactobacillus acidophilus 1-1447 strain according to claim 1 in admixture with a compatible vehicle. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 2 in cui il ceppo 1-1447 è presente in forma liofilizzata. 3. Compositions according to claim 2 wherein the 1-1447 strain is present in lyophilized form. 4. Composizioni farmaceutiche comprendenti il ceppo 1-1447 in miscela con almeno un altro ceppo del genere Lactobacillus. 4. Pharmaceutical compositions comprising the 1-1447 strain in admixture with at least one other strain of the genus Lactobacillus. 5. Composizione secondo la rivendicazione 4 in cui detto o detti ceppi del genere Lactobacillus sono selezionati tra i seguenti CNCM 1-1390, CNCM I-1391 e CNCM 1-1392. 5. Composition according to claim 4 wherein said or said strains of the genus Lactobacillus are selected from the following CNCM 1-1390, CNCM I-1391 and CNCM 1-1392. 6. Composizioni secondo una qualunque delle rivendicazioni da 2 a 5 in forma di capsule, soluzioni o sospensioni bevibili, polvere in bustine. 6. Compositions according to any one of claims 2 to 5 in the form of drinkable capsules, solutions or suspensions, powder in sachets. 7. Composizioni secondo una qualunque delle rivendicazioni da 2 a 6 contenenti da 10<6 >a 10<10 >cellule di ogni singolo ceppo per dose unitaria. 7. Compositions according to any one of claims 2 to 6 containing from 10 <6> to 10 <10> cells of each single strain per unit dose. 8. Uso del ceppo di Lactobacillus acidophilus 1-1447 per la preparazione di medicamenti utili per il trattamento o la profilassi di patologie gastroenteriche in cui sia desiderabile la somministrazione di lattobacilli. 8. Use of the Lactobacillus acidophilus 1-1447 strain for the preparation of medicaments useful for the treatment or prophylaxis of gastrointestinal diseases in which the administration of lactobacilli is desirable. 9. Uso secondo la rivendicazione 8 per la preparazioni di medicamenti per il trattamento o la prevenzione di dismicrobismo intestinale, diarrea di varia origine, colite ulcerativa. Use according to claim 8 for the preparation of medicaments for the treatment or prevention of intestinal dysmicrobism, diarrhea of various origins, ulcerative colitis. 10. Uso del ceppo di Lactobacillus acidophilus 1-1447 per la preparazione di medicamenti utili per il trattamento di neonati in tutte quelle situazioni di colonizzazione non favorevole del tratto gastrointestinale. 10. Use of the Lactobacillus acidophilus 1-1447 strain for the preparation of medicaments useful for the treatment of newborns in all those situations of unfavorable colonization of the gastrointestinal tract.