ITMI20121562A1 - Utilizzo di g-csf nella coltura in vitro di embrioni - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Campo di applicazione
La presente invenzione riguarda riguarda l'utilizzo del fattore stimolante le colonie granulocitarie ("Granulocyte Colony Stimulating Factor" o G-CSF) nella coltura in vitro di embrioni, in particolare di embrioni umani.
Arte nota
Il G-CSF à ̈ una glicoproteina di 19,6 kilodalton in peso molecolare, composta da 174-180 aminoacidi, il cui gene à ̈ situato sul cromosoma 17 locus q11.2q12. Il suo recettore specifico di membrana sulle cellule à ̈ à ̈ il G-CSF-R o CD114, presente su neutrofili, cellule mieloidi e cellule staminali. Il G-CSF à ̈ secreto dalle cellule immunocompetenti, dalle cellule embrionali, dalle cellule della placenta, oltre che dalle cellule staminali.
II suo ruolo, ritenuto all’inizio fondamentalmente quello di attivare la produzione di neutrofili, à ̈ quello di promuovere l’attivazione, la crescita e la differenziazione delle cellule staminali e di altri tipi di cellule indifferenziate.
Il suo utilizzo terapeutico in un primo momento era stato riservato al trattamento della neutropenia post-chemioterapia nei pazienti oncologici, ma à ̈ stato poi esteso a tutti i pazienti trattati con trapianto di cellule staminali per favorirne la crescita e l’attecchimento, ai pazienti con infarto del miocardio trattati con le cellule staminali per favorire la rivascolarizzazione cardiaca, ai pazienti con lesioni del midollo spinale per favorire il recupero post traumatico e ai pazienti con Alzheimer.
Nel campo della riproduzione umana, à ̈ stato osservato come il G-CSF sia prodotto a livello del trofoblasto, che esprime anche il suo recettore specifico, già dalle primissime fasi della gravidanza. Inoltre à ̈ stato osservato che il G-CSF à ̈ presente nei follicoli ovarici e regola la maturazione ovocitaria e la rottura del follicolo al momento dell’ovulazione. Il G-CSF à ̈ anche prodotto dall’embrione nelle sue primissime fasi (stadio di 4-8 cellule); la sua presenza sarebbe segno di buona competenza ovocitaria e di well-being dell’embrione come evidenziano diversi autori.
In un lavoro dei Richiedenti del 2009 (Human Reproduction, Vol. 24, N. 11, pp. 2703-2708, 2009) à ̈ stato dimostrato che in donne con Aborto Ricorrente l’utilizzo terapeutico del G-CSF permetteva di ottenere gravidanze a termine in una percentuale significativamente più alta rispetto ai controlli. Inoltre la somministrazione di G-CSF nelle donne sottoposte a fecondazione in vitro aumentava le possibilità di gravidanza come dimostrato da altri autori.
E' noto inoltre che una delle fasi della procedura di fecondazione in vitro, che segue l'aspirazione follicolare degli ovociti ottenuti in seguito a stimolazione ovarica e la fertilizzazione di questi ultimi con gli spermatozoi, eventualmente mediante tecnica ICSI, Ã ̈ quella della coltura in vitro degli ovociti fecondati o embrioni, fino a che non raggiungono lo stadio di 8 cellule e vengono infine trasferiti nell'utero.
Questa fase di coltura in vitro viene eseguita con l’utilizzo di mezzi di coltura artificiali, che possono rimanere invariati durante l'intero periodo di coltura o essere variati sequenzialmente. Questi mezzi di coltura contengono tipicamente glucosio, piruvato e componenti atti a fornire energia ma possono essere aggiunti anche amminoacidi, nucleotidi, vitamine e colesterolo per migliorare la crescita e lo sviluppo dell'embrione.
Un tipico mezzo di coltura per embrioni à ̈ il mezzo IVF50, che contiene un tampone bicarbonato, glucosio, lattato, piruvato, sieroalbumina umana ed EDTA.
E’ stato proposto l'utilizzo di mezzi di coltura addizionati di GM-CSF ("Granulocyte-macrophage colony stimulating factor") per favorire lo sviluppo di embrioni umani in vitro (C. Sjöblom et al, "Granulocyte-macrophage colony- stimulating factor promotes human blastocyst development in vitro", Human Reproduction vol. 14, no. 12, pp3069-3076, 1999).
E' stato anche successivamente commercializzato un mezzo di coltura per embrioni umani da IVF, denominato Embryogen<®>, contenente GM-CSF.
Con l'utilizzo di tale mezzo di coltura si à ̈ ottenuto un significativo aumento del numero di embrioni impiantati in donne con una storia di aborto ricorrente.
Il problema alla base della presente invenzione à ̈ stato quello di mettere a disposizione un mezzo di coltura per embrioni in vitro, che consentisse di ottenere una maggiore percentuale di embrioni impiantati rispetto a quella ottenuta con i mezzi di coltura noti.
Sommario dell· invenzione
Il problema sopra menzionato à ̈ stato risolto mettendo a disposizione un mezzo di coltura per embrioni in vitro contenente G-CSF ad una concentrazione di almeno 0,5 ng/ml.
Il termine "embrioni" si riferisce, nella presente domanda, ad ovociti fecondati di mammiferi, in particolare ovociti umani fecondati.
Preferibilmente la concentrazione del G-CSF à ̈ compresa tra 1,0 e 5,0 ng/ml, vantaggiosamente à ̈ di circa 2 ng/ml.
Preferibilmente, il mezzo di coltura comprende un tampone fisiologicamente accettabile, in grado di mantenere il pH nell’ intervallo da 7,4 a 7,6. Convenientemente tale tampone à ̈ un tampone bicarbonato.
Preferibilmente, il mezzo di coltura contiene inoltre almeno un componente scelto dal gruppo comprendente glucosio, lattato, piruvato, sieroalbumina umana ed EDTA.
Un mezzo di coltura particolarmente preferito à ̈ costituito da un mezzo IVF addizionato di circa 2 ng/ ml di G-CSF.
In un suo ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per la coltura in vitro di embrioni comprendente le fasi di:
incubare una pluralità di embrioni in un mezzo di coltura in vitro contenente almeno 0,5 ng/ml di G-CSF e
far crescere gli embrioni fino al raggiungimento dello stadio di 8 cellule.
Preferibilmente il suddetto mezzi di coltura contiene tra 1,0 e 5,0 ng/ml, vantaggiosamente 2 ng/ml, di G-CSF.
Preferibilmente, il mezzo di coltura comprende un tampone fisiologicamente accettabile, in grado di mantenere il pH nell'intervallo da 7,4 a 7,6. Convenientemente tale tampone à ̈ un tampone bicarbonato.
Preferibilmente, il mezzo di coltura contiene inoltre almeno un componente scelto dal gruppo comprendente glucosio, lattato, piruvato, sieroalbumina umana ed EDTA.
Un mezzo di coltura particolarmente preferito à ̈ costituito da un mezzo IVF addizionato di circa 2 ng/ml di G-CSF.
Preferibilmente i suddetti embrioni sono ottenuti attraverso fertilizzazione in vitro mediante ICSI (iniezione intracitoplasmatica di spermatozoo) di ovociti.
Infine, la presente invenzione si riferisce all'uso di G-CSF nella produzione di mezzi di coltura di embrioni in vitro.
Breve descrizione dei disegni
La Figura 1 Ã ̈ una rappresentazione diagrammatica dei risultati delle sperimentazioni di cui all'esempio 1 riportato nel seguito della descrizione.
La Figura 2 Ã ̈ una rappresentazione diagrammatica dei risultati delle sperimentazioni di cui all'esempio 2 riportato nel seguito della descrizione.
La Figura 3 à ̈ una rappresentazione diagrammatica dei risultati delle sperimentazioni di cui all’esempio 3 riportato nel seguito della descrizione.
Descrizione dettagliata
Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dagli esempi forniti qui di seguito a titolo illustrativo e non limitativo.
ESEMPIO 1
In una serie di esperimenti condotti su 30 topi femmine, superovulate con gonadotropine di giumenta e poi fatte ovulare con gonadotropine corionica e fecondate da topi maschi, veniva valutata l’efficacia del G-CSF nel favorire la crescita e sviluppo embrionario. Questi topi femmina venivano sacrificati il giorno dopo la comparsa del tappo vaginale, segno dell’awenuta fecondazione, e dagli ovidutti venivano raccolti gli embrioni tramite flussaggio allo stadio di due cellule. Gli embrioni di ogni topo venivano divisi in due gruppi equipollenti così da ottenere due gruppi di embrioni ottenuti dagli stessi animali, in modo che uno fosse il controllo dell’altro. Un gruppo di embrioni (per un totale di 170 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiunto il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 1 ng/ml in microgocce di 10 microlitri l’una sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. L’altro gruppo di embrioni (per un totale di 173 embrioni), usato come controllo, veniva incubato in HTF da solo in microgocce di 10 microlitri sotto olio minerale in numero di tre embrioni per microgocce.
Gli embrioni venivano controllati giornalmente fino allo stadio di blastocisti (5 giornate di incubazione) ed al loro eventuale “hatching†ed adesione dell’embrione alla plastica della capsula di Petri.
L’analisi delle osservazioni sugli embrioni evidenziava (si veda la Figura 1) che l’utilizzo del G-CSF per la coltura degli embrioni consentiva a 133 embrioni su 170 di raggiungere lo stadio di blastocisti ed a 119 su 170 di subire hatching, mentre nel controllo solo 89 su 173 embrioni divenivano blastocisti e 72 di questi presentavano hatching (PcO.OOl).
ESEMPIO 2
In una serie di esperimenti condotti su 30 topi femmine, superovulate con gonadotropine di giumenta e poi fatte ovulare con gonadotropina corionica e fecondate da topi maschi, veniva valutata l’efficacia del G-CSF nel favorire la crescita e lo sviluppo embrionale a diverse concentrazioni, rispettivamente di 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml e 5 ng/ml. Questi topine venivano sacrificate il giorno dopo la comparsa del tappo vaginale, segno dell’ fecondazione, e dagli ovidutti venivano raccolti gli embrioni tramite flussaggio allo stadio di due cellule. Gli embrioni di ogni topo venivano divisi in sei gruppi equipollenti così da ottenere altrettanti gruppi di embrioni ottenuti dagli stessi animali, in modo che uno fosse il controllo dell’altro. Un gruppo di embrioni (per un totale di 70 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiunto il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 0,1 ng/ml in microgocce di 10 microlitri l’una sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. Un gruppo di embrioni (per un totale di 76 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiuno il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 0.5 ng/ml in microgocce di 10 microlitri Luna sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. Un gruppo di embrioni (per un totale di 75 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiuno il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 1 ng/ml in microgocce di 10 microlitri Luna sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. Un gruppo di embrioni (per un totale di 78 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiunto il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 2ng / ml in microgocce di 10 microlitri Luna sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. Un gruppo di embrioni (per un totale di 77 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiunto il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 5 ng/ml in microgocce di 10 microlitri l’una sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia.
Un altro gruppo di embrioni (per un totale di 73 embrioni), usato come controllo, veniva incubato in solo HTF in microgocce di 10 microlitri sotto olio minerale in numero di tre embrioni per microgoccia.
Gli embrioni venivano controllati giornalmente fino allo stadio di blastocisti (5 giornate di incubazione) ed al loro eventuale “hatching†ed adesione dell’embrione alla plastica della capsula di Petri.
L’analisi delle osservazioni sugli embrioni evidenziava (si veda la Figura 2) che l’utilizzo del G-CSF per la coltura degli embrioni alla concentrazione di 2 ng/ml consentiva uno sviluppo ottimale (P<0.001).
ESEMPIO 3
In una serie di esperimenti condotti su 20 topi femmine, superovulate con gonadotropine di giumenta e poi fatte ovulare con gonadotropina corionica venivano raccolti gli ovociti e fecondati in vitro con il seme di topo tramite FIVET per valutare il ruolo del G-CSF nel favorire lo sviluppo degli embrioni ottenuti in vitro. Questi topi femmina venivano sacrificati il giorno dopo la somministrazione della gonadotropina corionica, e dagli ovidutti venivano raccolti tramite flussaggio gli ovociti. Questi ultimi venivano messi a fecondare in microgocce di 5 microlitri con 100.000 spermatozoi dì topo. Il giorno dopo si valutava l'avvenuta fecondazione tramite l’osservazione dell'eventuale presenza dei pronuclei Gli embrioni di ogni topo cosi ottenuti venivano divisi in due gruppi equipollenti così da ottenere due gruppi di embrioni ottenuti dagli stessi animali, in modo che uno fosse il controllo dell’altro. Un gruppo di embrioni (per un totale di 98 embrioni) veniva incubato con un mezzo di coltura (HTF) in cui veniva aggiunto il G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione finale di 2 ng/ml in microgocce di 10 microlitri l’una sotto olio minerale (paraffina), con tre embrioni per microgoccia. L’altro gruppo di embrioni (per un totale di 101 embrioni), usato come controllo, veniva incubato in solo HTF in microgocce di 10 microlitri sotto olio minerale in numero di tre embrioni per microgoccia.
Gli embrioni venivano controllati giornalmente fino allo stadio di blastocisti (5 giornate di incubazione) ed al loro eventuale “hatching†ed adesione dell’embrione alla plastica della capsula di Petri.
L’analisi delle osservazioni sugli embrioni evidenziava (si veda la Figura 3) che l’utilizzo del G-CSF per la coltura degli embrioni consentiva una migliore resa in termini di embrioni che raggiungevano lo stadio di blastocisti e l hatching (P<0.001).
ESEMPIO 4
In questo esperimento à ̈ stato valutato il ruolo dell’aggiunta di G-CSF ad una concentrazione finale di 2 ng/ml nel mezzo di coltura per embrioni umani ottenuti con fertilizzazione in vitro tramite ICSI. Sono state selezionate 20 pazienti con ripetuti fallimenti di precedenti tentativi di fertilizzazione in vitro (almeno tre) di età inferiore a 38 anni, e sono state suddivise in due gruppi di 10 ciascuno. Dopo stimolazione ovarica standard nei due gruppi mediante somministrazione di Decapeptyl 0,1 mg giornalmente dal 21° giorno del ciclo precedente fino al giorno della somminstrazione di HCG e di 225 UI di Gonal-f dal primo giorno del ciclo fino ad ottenere una risposta ovarica ottimale, veniva indotta la maturazione ovocitaria con 10000 UI di HCG. Gli ovociti venivano prelevati 36 ore dopo tramite aspirazione follicolare ecoguidata per via trans vaginale. Gli ovociti così recuperati venivano trattati con ialuronidasi per rimuovere il cumulo ooforo e venivano fertilizzati tramite ICSI come descritto in letteratura (Palermo G. Joris H. Devroey P, Van Steirteghem AC. "Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte", Lancet 1992;340:17-8,). 18 ore dopo l’ICSI si valutava l’ fecondazione tramite l’osservazione dell’eventuale presenza dei pronuclei. A questo punto nel gruppo di studio (10 pazienti) gli ovociti fecondati venivano incubati nel mezzo IVF50 (prodotto da Vitrolife AB) supplementato con G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione di 2 ng/ml, mentre nel gruppo di controllo (10 casi) gli ovociti venivano incubati in IVF50 soltanto.
In terza giornata si valutava quanti embrioni erano arrivati allo stadio di 8 cellule e si effettuava il transfer in utero di 3 embrioni a paziente per entrambi i gruppi. Venivano valutati come risultati principali il numero di embrioni di classe A ottenuti in terza giornata, il numero di gravidanze ottenute, il numero di embrioni impiantati.
I risultati riportati nella seguente tabella 1 evidenziano che il mezzo supplementato con G-CSF permetteva un significativo aumento del numero di gravidanze, di embrioni impiantati e di embrioni di classe A ottenuti rispetto al controllo.
TABELLA 1
Mezzo con G-CSF Controllo P
N pazienti 10 10
N ovociti trattati 77 79
Fecondati 69 70
Embrioni classe A 51 41 0.0413
Gravidanze 7 3 0.086
Embrioni impiantati 11/30 3/30 0.0152
ESEMPIO 5
In questo esperimento à ̈ stato confrontato il mezzo di coltura secondo l’invenzione, contenente G-CSF ad una concentrazione finale di 2 ng/ml, con un nuovo mezzo messo recentemente in commercio contenente GM-CSF, un altro fattore di crescita che agisce sulle cellule staminali, nella coltura di embrioni umani ottenuti con fertilizzazione in vitro tramite ICSI.
Sono state selezionate 20 pazienti con ripetuti fallimenti di precedenti tentativi di fertilizzazione in vitro (almeno tre) di età inferiore a 38 anni, e sono state suddivise in due gruppi di 10 ciascuno. Dopo stimolazione ovarica standard nei due gruppi mediante somministrazione di Decapeptyl 0,1 mg giornalmente dal 21 “giorno del ciclo precedente fino al giorno della somministrazione di HCG e di 225 UI di Gonal-f dal primo giorno del ciclo fino ad ottenere una risposta ovarica ottimale, veniva indotta la maturazione ovocitaria con 10000 UI di HCG. Gli ovociti venivano prelevati dopo 36 ore dopo tramite aspirazione follicolare eco-guidata per via transvaginale. Gli ovociti così recuperati venivano trattati con ialuronidasi per rimuovere il cumulo ooforo e venivano fertilizzati tramite ICSI come descritto in letteratura (Palermo G, Joris H, Devroey P, Van Steirteghem AC. "Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte†, Lancet 1992;340:17-8.). 18 ore dopo l’ICSI si valutava l’ fecondazione tramite l’osservazione dell’eventuale presenza dei pronuclei. A questo punto nel gruppo di studio (10 pazienti ) gli ovociti fecondati venivano incubati nel mezzo IVF50 supplementato con G-CSF (Granulokyne) alla concentrazione di 2ng/ml, mentre nel gruppo di controllo (10 casi) gli ovociti venivano incubati nel mezzo Embryogen<®>, prodotto dalla ditta Origio (Danimarca), contenente GM-CSF.
In terza giornata si valutava quanti embrioni erano arrivati allo stadio di 8 cellule e si effettuava il transfer in utero di 3 embrioni a paziente per entrambi i gruppi. Venivano valutati come risultati principali il numero di embrioni di classe A ottenuti in terza giornata, il numero di gravidanze ottenute, il numero di embrioni impiantati.
I risultati riportati nella seguente tabella 2 evidenziano che il mezzo supplementato con G-CSF permetteva un significativo aumento del numero di gravidanze, di embrioni impiantati e di embrioni di classe A ottenuti rispetto al mezzo contenente GM-CSF (Embryogen<®>).
Tabella 2
Mezzo con G-CSF Embryogen<®>P
N pazienti 10 10
N ovociti trattati 72 71
Fecondati 66 65
Embrioni classe A 52 40 0.0242
Gravidanze 8 4 0.0849
Embrioni impiantati 12/30 4/30 0.0195
E' dunque evidente che il mezzo di coltura secondo la presente invenzione costituisce un significativo miglioramento rispetto al mezzo di coltura che ha finora fornito le migliori prestazioni nella coltura di embrioni, ovvero il mezzo Embryogen<®>.
Claims (14)
- RIVENDICAZIONI 1. Mezzo di coltura di embrioni in vitro contenente G-CSF ad una concentrazione di almeno 0,5 ng/ml.
- 2. Mezzo di coltura secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione di G-CSF Ã ̈ compresa tra 1,0 e 5,0 ng/ml.
- 3. Mezzo di coltura secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione di G-CSF Ã ̈ di circa 2 ng/ml.
- 4. Mezzo di coltura secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, comprendente un tampone fisiologicamente accettabile che mantiene il pH nell’ intervallo da 7,4 a 7,6.
- 5. Mezzo di coltura secondo la rivendicazione 3 o 4, comprendente ulteriormente almeno un componente scelto dal gruppo comprendente glucosio, lattato, piruvato, sieroalbumina umana ed EDTA.
- 6. Mezzo di coltura secondo la rivendicazione 3, costituito dal mezzo di coltura IVF50 addizionato di 2 ng/ml di G-CSF.
- 7. Metodo per la coltura in vitro di embrioni comprendente le fasi di: incubare una pluralità di embrioni in un mezzo di coltura in vitro contenente almeno 0,5 ng/ml di G-CSF e far crescere detti embrioni fino al raggiungimento dello stadio di 8 cellule.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui detto mezzo di coltura contiene da 1,0 a 5,0 ng/ml di G-CSF.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui detto mezzo di coltura contiene circa 2 ng / ml di G-CSF.
- 10. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detto mezzo di coltura comprende un tampone fisiologicamente accettabile che mantiene il pH nell'intervallo da 7,4 a 7,6.
- 11. Metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detto mezzo di coltura contiene inoltre almeno un componente scelto dal gruppo comprendente glucosio, lattato, piruvato, sieroalbumina umana ed EDTA.
- 12. Metodo secondo la rivendicazione 9, in cui detto mezzo di coltura à ̈ costituito dal mezzo di coltura IVF50 addizionato di 2 ng/ml di G-CSF.
- 13. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni da 7 a 12, in cui detti embrioni sono ottenuti attraverso fertilizzazione in vitro mediante ICSI (iniezione intracitoplasmatica di spermatozoo) di ovociti.
- 14. Uso di G-CSF nella produzione di mezzi di coltura di embrioni in vitro
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| IT001562A ITMI20121562A1 (it) | 2012-09-19 | 2012-09-19 | Utilizzo di g-csf nella coltura in vitro di embrioni |
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