ITMI20111905A1 - Protesi tubulare multistrato per chirurgia ricostruttiva - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Campo del invenzione

La presente invenzione riguarda il campo della ricostruzione o sostituzione in vivo di organi cavi o porzioni di essi; si descrivono protesi bioriassorbibili e biocompatibili tubulari a base di materiali polimerici di origine naturale, in particolare protesi tubulari multistrato, adatte alla adesione, proliferazione e colonizzazione cellulare, dotate di resistenza meccanica adeguata per la suturabilità chirurgica.

STATO DELLA TECNICA

Le protesi autologhe o eterologhe trovano largo impiego nella chirurgia riparativa e ricostruttiva sia in campo umano che veterinario. Nella maggior parte dei casi i prodotti attualmente disponibili sul mercato sono costituiti da polimeri sintetici tra i quali ad esempio siliconi, poliuterani, polimeri a base di acrilati amidici e politetrafluoroetileni. Una delle problematiche principali associata all’uso di detti polimeri à ̈ la possibilità che esse determinino una marcata riposta infiammatoria, la quale può condurre sino alla reazione di rigetto della protesi innestata. Al contrario l’obiettivo terapeutico à ̈ rappresentato dalla completa integrazione della protesi nel nuovo tessuto biologico in modo da rigenerare una struttura simile a quella che si intende sostituire o ricostruire. Da questo punto di vista, quindi, materiali polimerici che fungano da supporto temporaneo per la ricolonizzazione cellulare e vengano successivamente e in modo progressivo biodegradati, rappresenta un approccio largamente preferibile.

Negli ultimi anni sono state sviluppate protesi a base di polimeri sintetici biodegradabili come l’acido polilattico (PLA), l’acido poliglicolico o il policaprolactone (PCL). Alcune protesi (sotto forma di garze) costruite con questi materiali sono commercialmente disponibili come ad esempio il Vicrylâ„¢. La peculiarità di questi polimeri à ̈ rappresentata dalla loro scarsa immunogenicità che rende queste protesi tollerabili dall’organismo, associata ad una relativa assenza di effetti collaterali. Lo svantaggio principale di queste protesi eterologhe sintetiche à ̈ rappresentato dalla bassa capacità di integrazione biologica che ne determina un utilizzo temporaneo. In letteratura sono ben documentati altri problemi associati all’utilizzo di questo tipo di protesi tra cui i più importanti per la salute del paziente sono l’infezione batterica delle protesi e dei tessuti circostanti. Queste infezioni sono difficili da trattare e spesso conducono al fallimento dell’impianto protesico ed alla sua sostituzione. Un altro problema associato all’uso di protesi eterologhe sintetiche à ̈ la perdita graduale delle proprietà meccaniche della protesi.

Occorre ricordare, inoltre, che le protesi sintetiche sono inerti da un punto di vista biologico, quindi incapaci di indurre una risposta biologica che porta ad una progressiva integrazione e successiva sostituzione con tessuto biologico. Questa relativa inerzia à ̈ dovuta principalmente alla mancanza di biomimetismo.

Da questo punto di vista, i polimeri biodegradabili di origine naturale, in particolare quelli a struttura polisaccaridica, hanno suscitato grande interesse nell’ultimo decennio nelle applicazioni di ingegneria tessutale e medicina rigenerativa, in ragione della loro grande rassomiglianza con i componenti principali della matrice extraxellulare. Questa caratteristica li rende particolarmente adatti a svolgere una funzione di sostegno e di stimolo temporaneo alla ricostruzione di un tessuto o un organo danneggiato o malato ed a interfacciarsi positivamente con tessuti biologici. Una rassegna esaustiva di detti materiali e delle loro caratteristiche à ̈ fornita, ad esempio da J.F. Mano et al. (J. R. Soc. Interface, 2007, 4, 999-1030).

Tra detti polimeri il chitosano rappresenta, probabilmente, quello di maggiore interesse per l’impiego in medicina rigenerativa (C. Shi et al., J. Surgical Res., 2006, 133, 185-192). Una panoramica della letteratura scientifica al riguardo à ̈ riportata da A. Di Martino et al.

[Biomaterìals, 2005, 26, 5983-5990) e da J.-K. F. Suh and H. W.T. Matthew ( Biomaterìals , 2000, 21, 2589-2598).

II chitosano à ̈ un derivato parzialmente deacetilato della chitina, ad alto peso molecolare ed à ̈ il secondo polimero naturale più abbondante. E’ un polisaccaride lineare composto da JV-acetilglucosamina e glucosamina legate mediante legame β(1-4) glicosidico. Il rapporto tra le unità di glucosamina e IV-acetil-glucosammina viene definito come grado di deacetilazione. Il peso molecolare può variare tra 300 a oltre 2000 kD, mentre il grado di deacetilazione può variare tra il 30% ed il 98%.

Il chitosano risulta particolarmente indicato nella costruzione di supporti tridimensionali ad alto grado di porosità che permettano una agevole colonizzazione da parte delle cellule dell’organismo ospite.

Per quanto concerne la forma, alcune applicazioni, in particolare quelle che riguardano la rigenerazione di organi cavi quali intestino, tratto genito-urinario, vasi sanguigni o rami dell’albero respiratorio, richiedono la disponibilità di un supporto polimerico costituito da un cilindro internamente cavo, che possa essere colonizzato da cellule dell’ospite senza che questo determini una occlusione della cavità nella quale deve poter continuare a scorrere liberamente un fluido (sangue, bile, urina, succo pancreatico, liquido gastrointestinale ecc.) o, come nel caso dell’apparato respiratorio, un gas. Inoltre, detto fluido deve rimanere confinato nel lume di detta struttura cilindrica, senza che si abbia un suo passaggio nella parete del cilindro o perdita e versamento nelle zone circostanti.

A. Wang et al. ( Tsighua Science and Technology 2005, IO, 449-453) riportano la produzione di uno scaffold tubulare di chitosano mediante un processo di lavorazione a maglia combinato con una separazione di fase indotta termicamente. Lo stesso gruppo di autori (L. Zang et al., J. Biomed Mater. Res., 2006, 77 A, 277-284) riporta l’ulteriore rivestimento del tubo sopra citato mediante una soluzione di chitosano e chitosano gelatina. Il tutto viene quindi solidificato mediante liofilizzazione.

La domanda di brevetto CN 1404881 riporta un metodo per la preparazione di un tubo di chitosano poliporoso. Per la preparazione di detto tubo, una soluzione di chitosano in acido acetico à ̈ posta in uno stampo nel quale viene inserito un ulteriore cilindro centrale. Il tutto viene solidificato mediante liofilizzazione.

Il principale problema legato airottenimento di strutture porose a base di chitosano mediante liofilizzazione di una soluzione in acido acetico (o altro acido parzialmente volatile) riguarda la permanenza di residui di acido nello scaffold essiccato che possono risultare citotossici e determinare la parziale dissoluzione dello scaffold medesimo una volta che questo venga a contatto con soluzioni acquose come i fluidi biologici.

Un’alternativa per la produzione di scaffold cilindrici e’ rappresentata dall’elettospinning.

La domanda di brevetto CN 1944724 descrive un processo per la deposizione mediante elettrospinning di fibre nanometriche di proteine del collagene e di chitosano.

La domanda di brevetto KR20070024092 descrive uno scaffold tridimensionale e il metodo per la sua preparazione. Detto scaffold comprende fibre di materiali ad alto e/o basso peso molecolare alle quali viene data, mediante elettrospinning, la forma di una rete tridimensionale. Tra le sostanze ad altro peso molecolare di origine naturale sono riportati anche il chitosano o la chitina. La compatibilità biologica di detto materiale rimane comunque da dimostrare.

La domanda di brevetto W02008/077949 riporta una composizione adatta alla realizzazione di un gel stabile in forma di film o matrice tridimensionale ottenuta mescolando sali e zuccheri con una soluzione debolmente acida di chitosano e successivamente neutralizzando la soluzione risultante. I gel così ottenuti sono dotati di un’eccellente citocompatibilità, biocompatibilità e biodegradabilità e pertanto adatti a fungere da supporto per l’adesione e la proliferazione cellulare sia in vitro che in vivo. Tali caratteristiche rendono detti gel adatti alla costruzione di strutture tridimensionali complesse per applicazioni di ingegneria tissutale e d’organo, quali ad esempio protesi vascolari, protesi di dotti biliari, materiali di riempimento per difetti ossei, adiuvanti nella riparazione delle ferite, ricostruzione di organi parenchimatosi o tessuti emopoietici.

Tuttavia l’impiego di detti materiali risulta essere limitato dalla loro scarsa resistenza meccanica, in particolare per quanto concerne la saturabilità con i fili normalmente utilizzati in chirurgia umana e veterinaria.

La letteratura scientifica e brevettuale riporta numerosi esempi di scaffold ottenuti mediante reticolazione di gel di chitosano o di gel misti di chitosano e collagene al fine di aumentare la biostabilità, vale a dire di ridurre la velocità di degradazione biologica, e di migliorare la caratteristiche meccaniche. L. Ma et al. ( Biomaterials 2003, 24, 4833-4841) descrivono uno scaffold per ingegneria tessutale della pelle ottenuto liofilizzando una soluzione costituita da una miscela di collagene e chitosano e successivamente reticolando lo scaffold con glutaraldeide.

La domanda di brevetto CN 1394655 rivendica uno scaffold poroso con adeguata velocità di degradazione ottenuto dapprima liofilizzando una miscela di chitosano e collagene, quindi reticolando lo scaffold con un aldeide o una carbodiimide.

Similmente la domanda di brevetto CN 101596331 fornisce un metodo per preparare un rete tridimensionale di collagene e chitosano da impiegare come scaffold per la costruzione di una cornea artificiale. La preparazione si realizza aggiungendo come agente reticolante 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimmide e N-idrossisuccinimmide e liofilizzando la miscela così ottenuta.

La domanda di brevetto CN 1342722 descrive uno scaffold a due strati di chitosano-gelatina-acido ialuronico ottenuto aggiungendo una soluzione di acido ialuronico alla soluzione di chitosano e gelatina in acido acetico, quindi aggiungendo carbodiimmide come agente reticolante e liofilizzando la miscela dopo averla colata in uno stampo.

La domanda di brevetto CN 1012543 13 descrive uno scaffold bistrato di collagene e chitosano per applicazioni di ingegneria tessutale della pelle. Lo scaffold à ̈ una struttura bistrato a rete nella quale i due strati sono costituiti da film di chitosano-collagene che danno luogo a strutture porose con pori interconnessi. La soluzione dei due componenti viene congelata, reticolata e liofilizzata.

Tuttavia, l’impiego di scaffold che contengono un agente reticolante risulta essere criticabile per applicazioni biomediche, in particolare per rimpianto di scaffold in organismi viventi essenzialmente per tre motivi: 1) anzitutto la bio de gradazione dello scaffold determina la liberazione localizzata nel sito dell’impianto dell’agente reticolante che può esercitare una spiccata tossicità sia locale che sistemica; 2) in secondo luogo, la reticolazione riduce la possibilità che lo scaffold possa essere bioriassorbito; 3) in terzo luogo la reticolazione spesso coinvolge gruppi funzionali idrofili della catena polimerica principale o laterale.

Ciò riduce la possibilità che questi gruppi stabiliscano legami ad idrogeno con l’acqua dell’ambiente circostante. Ciò può determinare una riduzione della bio compatibilità.

Un approccio diverso per migliorare le caratteristiche meccaniche di gel di chitosano à ̈ rappresentato dall’accoppiamento di detti gel con strutture di supporto che in genere sono rappresentati da polimeri sintetici.

La domanda di brevetto CN 1785444 descrive uno scaffold bistrato per la rigenerazione tissutale costituito da uno scaffold di chitosano poroso per indurre la migrazione, riproduzione e differenziazione cellulare e da uno strato di silicone per prevenire l’evaporazione cutanea e l’intrusione di batteri.

Il brevetto US 7,241,498 rivendica un processo di fabbricazione di un supporto costituito da fibre organiche o inorganiche rivestito, su almeno una faccia, da uno strato a base di chitosano. Detto strato à ̈ costituito dal residuo secco (almeno 80% in peso) di una soluzione acquosa di chitosano pre-idrolizzato avente una massa molecolare inferiore a 130.000 g/mol ed in concentrazione compresa fra 6 e 30% p/p. Le fibre organiche possono essere fibre di cellulosa o fibre sintetiche (poliestere, poliammide, polietilene, polipropilene e polivinilcloruro), artificiali (viscosa, cellulosa acetato), naturali (cotone, lana, polpa di legno), fibre di carbone. Le fibre inorganiche possono essere fibre di vetro o ceramiche.

E’ di tutta evidenza che l’impiego di fibre non bioriassorbibili nella realizzazione dello strato dì supporto rende poco biocompatibile l’intera struttura descritta nel brevetto sopra riportato. Inoltre, i materiali citati tra quelli in grado di costituire le fibre di supporto non sempre posseggono proprietà meccaniche, quali flessibilità e conformabilità a tessuti molli, adatte all’applicazione chirurgica.

II brevetto EP 1 567 205 rivendica una protesi composita comprendente un tessuto di rinforzo su una faccia del quale à ̈ associato una matrice che consiste di un gel fisico di chitosano. Il materiale di rinforzo à ̈ un poliestere non tessuto. Anche in questo caso risulta questionabile la biocompatibilità del materiale di rinforzo in quanto anche impiegando poliesteri biodegradabili, la loro degradazione produce acidi che possono risultare localmente tossici.

La domanda di brevetto W02009/ 130414 descrive una composizione da impiegare come protesi costituita da un materiale di rinforzo biodegradabile che presenta su una delle facce di detto materiale un film di chitosano e da un gel di chitosano. La funzione del film di chitosano à ̈ quella di mantenere separato il materiale di rinforzo dal gel di chitosano. Il materiale di rinforzo può essere un materiale polimerico in particolare un polimero sintetico, preferibilmente polipropilene.

La domanda di brevetto WO00/ 16817 rivendica, tra l’altro, una spugna mista di chitosano e collagene che contiene una maglia di chitosano ottenuta tessendo fibre di chitosano.

In ogni caso, le strutture composite sopra riportate non sono in grado di costituire una guida adatta alla ricolonizzazione guidata spazialmente di differenti tipi cellulari al fine di rigenerare un organo, o parte di esso, dotato di una struttura complessa che richiede il posizionamento e la crescita di cellule in strati, settori, o zone spazialmente distinti tra loro.

SOMMARIO

Come risposta alle limitazioni presentate dai materiali attualmente proposti o disponibili per la realizzazione di strutture tubulari destinate all 'ingegneria di tessuti e organi sopra menzionate, oggetto della presente invenzione à ̈ una protesi a forma di un cilindro cavo internamente, la cui parete à ̈ una struttura polimerica multistrato comprendente: uno strato esterno formato da un gel di chitosano, uno strato intermedio formato da collagene, ed uno strato interno formato da un film non poroso di chitosano. Detti strati sono tra loro diversi per morfologia e struttura chimico-fisica, ed ognuno svolge una diversa funzione: lo strato di gel idratato esterno ha lo scopo di promuovere la colonizzazione da parte di fibroblasti e cellule deputate alla neoangiogenesi, il film non poroso posto nella parte luminale del cilindro svolge la funzione di contenimento per i fluidi che scorrono nel lume dopo anastomosi con organi cavi con funzioni di trasporto nell’organismo vivente; tale film non poroso ha anche caratteristiche di citocompatibilità tali da favorire lo sviluppo di tessuto epiteliale. Lo strato di collagene intermedio impartisce proprietà meccaniche adeguate alla sutura chirurgica.

La protesi oggetto della presente invenzione à ̈ bioriassorbibile, altamente citocompatibile, non permeabile ai comuni fluidi biologici che scorrono in organi cavi; inoltre à ̈ dotata di caratteristiche meccaniche quali flessibilità, conformabilità a tessuti molli, resistenza alla trazione ed al taglio, così da renderla agevolmente suturabile a porzioni di organi cavi e tale da resistere alle sollecitazioni meccaniche in vivo postimpianto. Il bioriassorbimento del materiale che costituisce la protesi à ̈ controllabile e non genera composti citotossici. Detta protesi può essere impiegata nella ricostruzione in vivo di organi cavi o di una porzione di essi.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1: protesi tubulare multistrato ottenuta neiresempio 3. Figura 2: Immagini SEM delle piastrine depositate sulla superficie della porzione luminale della protesi tubulare multistrato dell’esempio 6 (Pannello a), vetro borosilicato (Pannello b), plastica per colture cellulari (Pannello c).

Figura 3: Assorbenza (O.D.) di soluzioni proteiche dopo contatto con plastica, con vetro, o con la porzione luminale della protesi dell’esempio 6.

Figura 4: fasi dell’impianto di protesi sostitutiva biliare epatico-duodenale, senza conservazione della continenza papillare a seguito di resezione totale del coledoco associata a colecistectomia. Inizio della sutura epatico-protesica (pannello a); interposizione epaticoprotesica completata (pannello b)

Figura 5: impianto di protesi sostitutiva bilio-biliare retroperitoneale susseguente a resezione subtotale del coledoco associata a colecistectomia. Interposizione protesica coledoco-coledocica completata (Pannello a); Completamento della sintesi del foglietto glissoniano a protezione della protesi {Pannello b) .

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

La presente invenzione riguarda una protesi polimerica multistrato, di forma cilindrica, adatta ad essere impiegata nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o di porzioni di essi.

Il termine “chitosano†qui utilizzato include i polisaccaridi lineari di JV-acetil-glucosamina e glucosamina legate mediante legame p(l-4) glicosidico, così come i derivati della chitina o poli-N-acetil-D-glucosamina (comprese le poliglucosamine e gli oligomeri della glucosamina), nei quali il contenuto di gruppi N-acetilici à ̈ stato ridotto per idrolisi (deacetilazione). Il grado di deacetilazione, ovvero la percentuale di gruppi N-acetilici rimossi per deacetilazione, à ̈ preferibilmente compreso fra 40 e 98%, più preferibilmente fra 60 e 97% e ancor più preferibilmente fra 70 e 95%. Il peso molecolare di detto chitosano à ̈ preferibilmente compreso fra 1 e 2.000 kDa, più preferibilmente fra 3 e 1.000 kDa e ancor più preferibilmente fra 5 e 300 kDa. Detto chitosano à ̈ utilizzabile indifferentemente per la preparazione dello strato interno e/o esterno della protesi; i due strati possono contenere polimeri di chitosano diversi o, preferibilmente, uguali tra loro. La differenza nello stato fisico tra i due stradi dipende essenzialmente dal rispettivo procedimento di preparazione che, nel primo caso porta alla formazione di un gel tridimensionale e nel secondo caso ad una matrice sottile, compatta e non porosa.

Lo strato esterno della protesi à ̈ costituito da un gel acquoso di chitosano, parzialmente disidratato. Lo spessore di detto strato esterno à ̈ preferibilmente compreso fra 0, 1 e 1 mm e preferibilmente tra 0,2 e 0,6 mm. Tale gel à ̈ preparabile utilizzando tecniche in sé note. In particolare esso à ̈ ottenibile da una soluzione acquosa di detto chitosano, a concentrazione compresa fra 0,5 e 10% p/v, preferibilmente tra 1 e 6%, più preferibilmente tra 2 e 5%; la soluzione comprende un acido, ad es. acido acetico, acido borico, acido cloridrico, acido lattico o acido ascorbico; la concentrazione dell’acido à ̈ compresa fra 0,1 e 5 % p/v e preferibilmente fra 0,5 e 2,5 % p/v. Inoltre, la soluzione comprende anche sali inorganici e zuccheri, secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949: tra i possibili sali inorganici si possono citare fosfati e cloruri di metalli alcalini e alcalinoterrosi, ad es. cloruro di sodio, cloruro di potassio, fosfato monosodico di sodio, fosfato monosodico di potassio; gli zuccheri sono tipicamente di- e tri-saccaridi e loro idrati, ad es. raffìnosio pentaidrato, saccarosio, ecc. Detti sali inorganici e zuccheri permettono di ottenere gel che, dopo neutralizzazione, sono dotati di una elevata citocompatibilità; essa à ̈ significativamente superiore a quella ottenibile con gel di solo chitosano o gel ottenuti in assenza di detta combinazione di componenti. Il residuo acido contenuto nel gel viene convenientemente neutralizzato mediante aggiunta di un’opportuna quantità di alcali in soluzione idroalcolica.

Lo strato intermedio à ̈ costituito da collagene, preferibilmente non reticolato, mono o pluristratificato. Detto collagene à ̈ adatto ad essere usato in chirurgia umana o veterinaria. Si possono impiegare strati di collagene disponibili in commercio quali ad esempio Permacolâ„¢ (Covidien, USA) o Pegasusâ„¢ (Mediatek, Italy), Pericardial bioprostesis (Edwards Lifescience, Italia), TissueFleeceâ„¢ (Baxter, USA). Preferibilmente si impiega collagene non reticolato chimicamente disponibile in commercio in forma di fogli mono o multi stratificati ad esempio OsseoGuardâ„¢ (Collagen Matrix, USA), Surgisisâ„¢ (Cook Biotech Incorporated, USA), Lyoplantâ„¢ (Adr, Italia), Collagen-kleeâ„¢ (Colageno.com, Spagna), Bio-Gide® (Geistlich Pharma AG, Svizzera) . Lo spessore di questo strato della protesi à ̈ preferibilmente compreso fra 0,05 e 2 mm, più preferibilmente fra 0,08 e 1.5 mm.

La porzione luminale della protesi (strato interno) à ̈ costituita da un film di chitosano, compatto non poroso. Lo spessore di detto film à ̈ preferibilmente compreso fra 0,05 e 1,5 mm, e più preferibilmente tra 0,1 e 1 mm.

Il film à ̈ realizzabile utilizzando tecniche in sé note, ad es. portando a secco la soluzione di chitosano precedentemente descritta, preventivamente disposta su uno strato sottile. Lo strato ottenuto, esternamente liscio e regolare, presenta caratteristiche ideali di impermeabilità ai liquidi organici e di non trombogenicità. Detto film, opportunamente idratato, può essere curvato in forma tubolare.

II procedimento per preparare la protesi in accordo con la presente invenzione comprende quattro fasi generali:

(i) preparazione del film di chitosano e suo avvolgimento su un supporto cilindrico; (ii) applicazione, sulfassemblato ottenuto in (i), dello strato di collagene opportunamente idratato; (iii) formazione dello strato di gel di chitosano intorno all’assemblato ottenuto in (ii); (iv).

parziale disidratazione dell’assemblato ottenuto in (iii). Il supporto cilindrico utilizzato in (i) non fa parte della protesi e viene quindi rimosso, preferibilmente al termine della fase (iii).

Durante il suddetto procedimento, à ̈ preferibile applicare una soluzione di chitosano tra gli strati (a) e (b) e/o tra gli strati (b) e (c); tale soluzione, che può essere convenientemente uguale a quella utilizzata per preparare il gel, aumenta l’adesività tra gli strati coinvolti, e quindi la coesione della protesi nel suo insieme. Una modalità preferita e non limitativa per realizzare la protesi oggetto dell’invenzione à ̈ descritta come segue.

(i) Preparazione del film di chitosano.

Il film viene preparato a partire da una soluzione acquosa di chitosano in presenza di un acido, ad es. acetico, acido borico, acido cloridrico o acido lattico. Il grado di deacetilazione di detto chitosano à ̈ compreso fra 40 e 98% e preferibilmente fra 60 e 97% e ancor più preferibilmente fra 70 e 95%. Il peso molecolare di detto chitosano à ̈ compreso fra 1 e 2.000 kDa, e preferibilmente fra 3 e 1.000 kDa e ancor più preferibilmente fra 5 e 300 kDa. La concentrazione del chitosano in detta soluzione à ̈ compresa fra 0,5 e 10% p/v. La concentrazione dell’acido à ̈ compresa fra 0, 1 e 5 % p/v e preferibilmente fra 0,5 e 2,5 % p/v. Detta soluzione comprende sali inorganici e zuccheri secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949, qui incorporata per riferimento.

La soluzione acquosa così ottenuta viene depositata un uno stampo di forma adeguata (ad es. rettangolare o quadrata) a formare uno strato sottile di opportuno e uniforme spessore. La soluzione nello stampo viene quindi posta ad essiccare, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti. 11 film essiccato così ottenuto viene, quindi, posto in una soluzione acquosa alcalina il cui pH non sia inferiore a 8. Detta soluzione alcalina à ̈ preferibilmente una soluzione di un idrossido di un metallo alcalino o di un metallo alcalino terroso, più preferibilmente si tratta di una soluzione di idrossido di sodio o di idrossido di potassio in concentrazione sufficiente per neutralizzare l’eccesso di acido contenuto nel film. Preferibilmente la concentrazione dell’idrossido di sodio o di potassio à ̈ compresa fra 0,5 e 15 % p/v, ancor più preferibilmente tra 3 e 6 % p/v. Il film neutralizzato à ̈ lavato in acqua distillata almeno per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta.

(ii). Applicazione dello strato di collagene

Il film lavato viene posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano, preferibilmente uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso. Il volume di soluzione impiegata à ̈ compreso fra 1/4 e 4/4 del volume impiegato per la preparazione del film stesso, preferibilmente à ̈ compreso tra 1,5/4 e 3/4 ed ancor più preferibilmente à ̈ 1/2 del volume impiegato per la preparazione del film stesso.

Il film ricoperto di soluzione viene arrotolato completamente su un asta cilindrica rigida la cui lunghezza à ̈ circa del 20% superiore alla lunghezza finale della protesi ed il cui diametro à ̈ pari al diametro del lume della protesi che si vuole ottenere. Il film viene arrotolato intorno all’asta per una o più volte, preferibilmente fra 1 e 8 volte, più preferibilmente fra 2 e 6 volte, ed ancor più preferibilmente 4 volte. Detta asta à ̈ costituita di vetro, plexiglas, acciaio inossidabile, polivinilcloruro o teflon® rigido o altro materiale plastico rigido e dotato di superficie liscia. L’asta viene montata su un mandrino e posta in rotazione a tra 5 e 15 rpm e preferibilmente a 8 rpm, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti.

Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta viene arrotolato il foglio di collagene che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per almeno 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta aH’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume sono uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui viene effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano.

(iii) Applicazione dello strato di gel di chitosano

L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene viene montata su un mandrino e posta in rotazione tra 5 e 15 rpm e preferibilmente a 8 rpm, preferibilmente in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura compresa fra 35 e 50 °C e preferibilmente a 45 °C per un tempo compreso fra 30 e 90 minuti e preferibilmente tra 40 e 60 minuti ed ancor più preferibilmente per 45 minuti. Quindi, detta asta ricoperta viene inserita nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di dimensioni compatibili con l’organo tubulare cavo che si vuole ricostruire mediante la protesi oggetto della presente invenzione. In particolare, il diametro interno del cilindro sottratto del diametro dell’asta ricoperta à ̈ pari allo spessore dello strato esterno di gel di chitosano, il quale coincide all’incirca con lo spessore della parete dell’organo cavo che si vuole riparare o ricostruire mediante la protesi oggetto della presente invenzione.

Lo stampo può essere costituito da un unico pezzo oppure da due o più pezzi che opportunamente assemblati costituiscono un cilindro.

Il sistema così assemblato da luogo ad un’intercapedine cilindrica nella quale viene versata la soluzione acquosa di chitosano precedentemente descritta nella procedura di preparazione del gel. Il tutto viene posto ad una temperatura generalmente compresa tra -5 °C e -180 °C, preferibilmente fra -20 °C e -80 °C, più preferibilmente a -60°C, per un tempo variabile tra le 2 e le 24 ore, preferibilmente tra le 4 e le 10 ore e più preferibilmente per 6 ore.

Quindi, lo stampo cilindrico viene tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale à ̈ posta, per un tempo compreso tra 6 e 60 ore, preferibilmente tra 24 e 54 ore, più preferibilmente 48 ore e ancor più preferibilmente per 12 ore, in una soluzione idroalcolica alcalina con pH uguale o superiore a 8 preventivamente raffreddata ad una temperatura compresa tra 4°C ed -60°C, preferibilmente tra -10 °C e -40 °C, e più preferibilmente -20 °C. La concentrazione di alcool in detta soluzione à ̈ compresa tra 40 e 95% v/v, preferibilmente à ̈ 60% v/v; detta soluzione alcalina à ̈ preferibilmente una soluzione di un idrossido di un metallo alcalino o di un metallo alcalino terroso, più preferibilmente idrossido di sodio o di potassio, in quantità sufficiente per neutralizzare l’eccesso di acido contenuto nel gel. Preferibilmente la concentrazione dell’idrossido di sodio o di potassio à ̈ compresa fra 0,5 e 15 % p/v, più preferibilmente tra 3 e 6 % p/v, ancor più preferibilmente à ̈ 5% p/v.

Il tutto viene quindi lavato in soluzione fisiologica almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Con il termine soluzione fisiologica si intende una soluzione acquosa che presenti un’osmolarità pari a quella di liquidi fisiologici, tipicamente detta soluzione à ̈ una soluzione acquosa contenente 0,9 grammi di cloruro di sodio per 100 mL di acqua distillata. Il lavaggio comporta l’eliminazione dei sali inorganici e zuccheri contenuti nella soluzione usata per formare il gel; tali sali e zuccheri, benché necessari per la formazione degli strati di gel e film citocompatibili, non sono necessari per la funzionalità nella protesi finita.

(iv) parziale disidratazione

Quindi, si procede a sfilare l’asta centrale e si pone la protesi cilindrica così ottenuta ad una temperatura compresa fra 4 e 40 °C e preferibilmente fra 10 e 35 °C ed ancor più preferibilmente a 25 °C per un tempo compreso fra 5 e 180 minuti, preferibilmente fra 15 e 90 minuti ed ancor più preferibilmente per 30 minuti. Si ottiene così un grado di essiccamento intermedio in cui lo strato esterno à ̈ in uno stato gelificato a maggiore densità, dotato quindi di un grado di rigidità sufficiente per permettere la manipolazione della protesi da parte del chirurgo. La protesi viene quindi confezionata in un opportuno contenitore sigillato, così da mantenere costante il grado di disidratazione ottenuto, fino al momento dell’uso. Le operazioni sopradescritte sono condotte in un ambiente sterile ad esempio in una cappa a flusso laminare d’aria sterilizzata attraverso un filtro assoluto HEPA o in una stanza classificata come 100 secondo Federai Standard N. 209. In alternativa, dette operazioni possono essere condotte in un ambiente non sterile e la protesi viene sterilizzata in autoclave o mediante radiazioni ionizzanti in accordo con le procedure descritte dalla Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana (FU XII ed.) capitolo 5.1 pagina 678. Detto processo di sterilizzazione non comporta una modificazione delle caratteristiche della protesi.

La protesi in accordo con la presente invenzione possiede elevate caratteristiche di citocompatibilità e adeguata resistenza meccanica per essere suturata ad un tessuto vivente. Inoltre, la sua struttura a più strati permette una colonizzazione differenziata di diversi tipi di cellule e, quindi, una ricostruzione adeguata di organi cavi che riproduce la fisiologica stratificazione dei tessuti che esplicano una differente funzione.

Il particolare, l’impiego di un film o un gel tridimensionale di chitosano preparato secondo quanto descritto nella domanda di brevetto W02008/ 077949, opportunamente uniti tra loro mediante un foglio di collagene idratato, danno luogo ad un composito ad elevata citocompatibilità, ottimale per la crescita cellulare. Tali caratteristiche di citocompatibilità, unitamente ad una resistenza meccanica adeguata per la manipolazione e saturazione chirurgica, si riscontrano anche nella protesi ottenuta per parziale disidratazione del composito. La protesi cosi realizzata mantiene la struttura a tre strati sopra descritta, con la particolarità che foglio intermedio di collagene (b) risulta parzialmente interfuso all’interfaccia con gli strati (a) e (c).

Un’ulteriore caratteristica della presente invenzione riguarda la capacità dello strato interno non poroso di trattenere nel lume della protesi cilindrica i fluidi fisiologici che possono scorrere nella protesi stessa a seguito della sua anastomosi su un organo cavo deputato al trasporto di detti fluidi. Infatti, l’impiego di un tubo di solo collagene, costruito secondo la procedura impiegata per la costruzione della protesi multistrato ma senza il film di chitosano nella porzione luminale e il gel di chitosano nella porzione esterna, non à ̈ in grado di trattenere detti fluidi fisiologici all’interno della protesi e di evitarne lo sversamento (trasudamento) negli spazi circostanti.

La presente invenzione comprende l’utilizzo della suddetta protesi nella preparazione di protesi per la chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o porzioni di essi, in particolare per la ricostruzione o sostituzione di vie biliari, vasi arteriosi o venosi, dotti pancreatici, porzioni dell’intestino, dell’apparato respiratorio, dell’esofago, delle vie genito- urinarie, ecc. L’invenzione comprende inoltre l’uso delle suddette protesi nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva dei suddetti organi cavi o porzioni di essi. L’invenzione comprende inoltre un metodo di chirurgia ricostruttiva o sostitutiva dei suddetti organi cavi o porzioni di essi, comprendente rimpianto delle suddette protesi in un paziente che ne necessita.

A titolo esemplificativo, ma non limitativo vengono di seguito riportati alcuni esempi relativi alla preparazione e illustranti le caratteristiche dell’invenzione.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1 Preparazione della protesi tabulare multistrato tipo I

Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (Chitosan 95/50/A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono stati aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+) -raffino sio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).

5 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x10 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) avente pH pari a 10.

Il film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta.

Il film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta aU’arìa con 2.5 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso.

II film ricoperto di detta soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 90 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 4 volte.

L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti.

Quindi, sull’asta ricoperta dal film à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 3x7 cm (spessore, 0,2 mm) (Surgisis, lot. n, LB 409116 Cook Medicai, Irlanda) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta albana con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. L’assemblato così ottenuto (asta+film+foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico in plexiglas<®>di 99 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro. Nell’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 3,2 mL di una soluzione acquosa di chitosano di composizione uguale a quella impiegata per la preparazione del film sopra descritta.

Il tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore.

Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, il supporto cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposto la protesi cilindrica così ottenuto al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti.

La protesi così ottenuta à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiuso ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso.

Esempio 2 Preparazione della protesi tabulare multistrato tipo 2

Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (ACEF, Fiorenzuola d’Arda (PC) con peso molecolare di 10 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 90% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).

4 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x8 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) e avente pH pari a lO.

Il film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta.

II film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con 2 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso.

Il film ricoperto di soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 90 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 4 volte.

L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti.

Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 2x7 cm (Collagen-Klee, Collageno.com, Spagna) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti.

L’assemblato così ottenuto (asta+film+foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di 99 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro.

Nell’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 3,2 mL di una soluzione acquosa di chitosano ottenuta disciogliendo 2 g di chitosano (Chitosan 95/50/A1-P, batch no. 200-22409-03, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mi di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK), 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e 20 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).

II tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore.

Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, lo stampo cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposta la protesi cilindrica così ottenuta al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti. La protesi così ottenuta à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiuso ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso.

Esempio 3 Preparazione della protesi tubulare multistrato tipo 3

Il film à ̈ stato preparato sciogliendo 4.5 g di chitosano (Chitosan 75/50/A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC<+>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 75% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K32985617409, DBH, Poole, UK) A detta soluzione sono aggiunti 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) sono stati quindi aggiunti 19,9 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germany).

Circa 2 mL di detta soluzione sono stati colati in un uno stampo di forma rettangolare (5x4 cm) a formare uno strato di 1 mm di spessore. La soluzione nello stampo à ̈ stata posta in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti. Il film essiccato così ottenuto à ̈ stato, quindi, posto per 6 ore in una soluzione acquosa di idrossido di potassio con concentrazione pari a 5% (p/v) e avente pH pari a 10.

II film neutralizzato à ̈ stato lavato in acqua distillata per 3 volte, mantenendolo in acqua per almeno 10 minuti ogni volta.

Il film lavato à ̈ stato posto su una superficie piana e ricoperto sulla faccia esposta all’aria con 1 mL di una soluzione di chitosano di composizione uguale a quella utilizzata per la preparazione del film stesso.

Il film ricoperto di soluzione à ̈ stato arrotolato completamente su un asta cilindrica in plexiglas<®>di lunghezza 40 mm e diametro 5 mm. Il film à ̈ stato arrotolato intorno all’asta per 6 volte.

L’asta à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti.

Sull’asta ricoperta dal film così ottenuta à ̈ stata arrotolato il foglio di collagene di 1,5x2 cm (OsseoGuard, REF OG1520 lot.CM3N07E3 Collagen Matrix, USA) che preventivamente à ̈ stato idratato in acqua distillata per 1 ora e ricoperto sulla faccia esposta alfaria con un sottile strato di soluzione di chitosano la cui composizione ed il cui volume erano uguali a quelli utilizzati il rivestimento del film descritto in precedenza. La procedura con cui à ̈ stato effettuato l’arrotolamento del foglio di collagene à ̈ la medesima descritta per quanto riguarda il film di chitosano. L’asta rivestita dal film di chitosano e dal foglio di collagene à ̈ stata montata su un mandrino e posta in rotazione a 8 rpm in una stufa a circolazione d’aria ad una temperatura di 45 °C per 45 minuti.

L’assemblato così ottenuto (asta+film foglio di collagene) à ̈ stato inserito nella porzione centrale di uno stampo cilindrico di 50 mm di lunghezza e di 8 mm di diametro.

NeH’intercapedine dell’assemblato così ottenuto sono stati versati 1, 92 mL di una soluzione acquosa di chitosano ottenuta disciogliendo 2 g di chitosano (Chitosan 75/50/A1-P, batch no. 200-230409-02, HMC<H>, Halle, Germania) con peso molecolare di 150 kDa e grado di deacetilazione medio pari a 95% in 100 mL di una soluzione acquosa contenente 1% (v/v) di acido acetico (Lot. K329856 17409, DBH, Poole, UK), 800 mg di cloruro di sodio, 20 mg di cloruro di potassio, 115 mg di fosfato monosodico e 20 mg di fosfato monopotassico (tutti i sali erano di grado RPE, Carlo Erba, Milano, Italia) e 20 grammi di D-(+)-raffinosio pentaidrato (lot# 0001433730, Fluka, Steinheim, Germania).

Il tutto à ̈ stato posto in un frigorifero alla temperatura di -60°C per 6 ore.

Quindi, sotto una cappa a flusso laminare verticale, il supporto cilindrico à ̈ stato tolto e la soluzione di chitosano congelata intorno all’asta centrale é stata posta per 12 ore in una soluzione idroalcolica costituita da 60% (v/v) di etanolo (95 °) e 40% soluzione acquosa di idrossido di potassio (5% p/v) mantenuta alla temperatura di -20 °C. Dopo detto lasso di tempo, sempre sotto una cappa a flusso laminare verticale, il tutto à ̈ stato neutralizzato mediante lavaggi in soluzione fisiologica sterile (0,9% p/v di NaCl in acqua) almeno per 3 volte, mantenendolo in detta soluzione per almeno 10 minuti ogni volta. Quindi, sotto cappa a flusso laminare verticale, si à ̈ proceduto a sfilare l’asta centrale e si à ̈ esposta la protesi cilindrica così ottenuto al flusso dell’aria della cappa ad una temperatura di 25 °C per 30 minuti.

La protesi così ottenuta (Figura 1) à ̈ stata posta in un contenitore sterile, chiusa ermeticamente, e conservata a temperatura ambiente sino al momento dell’uso.

Esempio 4 Resistenza meccanica

La resistenza meccanica alla trazione ed alla sutura di un film di chitosano o della protesi preparati secondo quanto descritto nell’esempio 1 sono stati determinati applicando uno stress in trazione per mezzo di un dinamometro (Acquati AG MCI, Italia) su provini di 10x12 mm di dimensione e aventi spessore pari 0,4 mm e 3,2 mm per il film, e la protesi rispettivamente. Detti provini sono stati ottenuti ritagliando un film di chitosano o la protesi preparati secondo quanto descritto nell’esempio 1. I provini sono stati stirati sino alla rottura ad una velocità di trazione di 15mm/ min.

II segnale analogico corrispondente alla forza applicata dallo strumento à ̈ stato digitalizzato per mezzo di una scheda PowerLab 400 e registrato in funzione del tempo tramite un software Scope 3.5 software funzionante su un computer Macintosh Powerbook G3 (Apple, USA). La forza applicata, normalizzata per lo spessore del provino, à ̈ stata rappresentata in grafico in funzione della deformazione (allungamento). Quest’ultima à ̈ stata calcolata tenendo conto della velocità di allungamento applicata dallo strumento. La pendenza del tratto lineare della curva ottenuta à ̈ stata presa come valore del modulo elastico (Physical Pharmacy, A. Martin Ed.. 4<th>Edition, Lea Ss Febiger, Philadelphia, London, 1993, pp. 575-578) secondo l’equazione:

F JL -LA

— -E -4 V A) j

nella quale F à ̈ la forza applicata alla unità di area in sezione del provino, A, E rappresenta il modulo elastico e L e Lo rappresentano rispettivamente la lunghezza misurata e la lunghezza iniziale.

E’ stato inoltre registrato il valore percentuale di allungamento registrato alla rottura del provino.

In Tabella 1 sono riportati i valori di modulo elastico e di allungamento alla rottura per i campioni testati.

Tabella T. Modulo elastico e di allungamento alla rottura di provini di dimensione 10x12 mm ottenuti dal fìlm e dalla protesi preparati secondo quanto descritto nelVesempio 1. Deviazione standard in parentesi (n=3)-

Modulo Elastico, x IO<3>Allungamento alla rottura, N/m<2>%

Film di chitosano 257 (19) 17 (1)

Protesi > 1600

II valore di allungamento alla rottura nel caso della protesi à ̈ risultato superiore alla capacità di misura dello strumento e comunque maggiore di 100%, vale a dire almeno un ordine di grandezza superiore rispetto al valore registrato per il film. Si osserva che il film presentava un modulo elastico, e quindi una rigidità, significativamente più basso rispetto alla protesi.

Le caratteristiche di resistenza meccanica misurate per la protesi ne permettono un’efficace saturabilità ai tessuti del paziente, garantendo inoltre un’elevata resistenza allo stress funzionale in-vivo dopo rimpianto.

Esempio 5 Impermeabilità del film agli acidi biliari La permeabilità di soluzioni acquose di bile bovina alla concentrazione di 30 mg/mL attraverso il film {spessore 200 Î1⁄4ιη) di chitosano preparato a partire da una soluzione di chitosano alla concentrazione di 4,5%, come descritto nell’esempio 1, à ̈ stata determinata per mezzo di una cella di permeazione verticale tipo Resomat II (H.W. Dibbem et al, Arzeneim.-Forsch./Drug Res. (1969) 19, 1140-) Una porzione del film di superficie pari a 0,6 cm<2>à ̈ stata posta fra il compartimento donatore e quello ricevente della cella di permeazione. Il compartimento donatore conteneva 200 Î1⁄4Î ^di soluzione acquosa di bile bovina ricostituita (Sigma. Adrich, USA) mentre il compartimento ricevente conteneva 100 mL di acqua distillata. La cella era mantenuta alla temperatura costante di 37 °C.

Ad intervalli di tempo prefissati, 1,5 mL di soluzione sono stati prelevati dal compartimento ricevente, sostituiti con acqua distillata ed analizzati in spettroscopia UV visibile secondo il metodo colorimetrico descritto da Reihnold e Wilson ( J.G Reinhold and D.W. Wilson, J. Biol Chem, (1932) 96, 637) allo scopo di quantificare gli acidi colici permeati.

La percentuale di acidi colici permeata attraverso il film nel lasso di tempo di due giorni risultava inferiore al 3%, ottenendo così un grado di impermeabilità adeguato ai fini dell’invenzione .

Else m pio 6 Emocompatibilìtà in vitro, test di adesione piastrinica su film di chitosano

Campioni di sangue sono stati raccolti da donatori umani sani, evitando la stasi venosa prolungata, e posti in provette Vacutainer 3.5 mL contenenti K3EDTA come anticoagulante. Una prima provetta contenente sangue intero à ̈ stata centrifugata per 10 min a 500 g, ed il sovranatante ricentrifugato a 800 g. Il sovranatante ottenuto da una seconda provetta di sangue à ̈ stato sottoposto ad una nuova centrifugazione a 3000 g per 15 min. Nei due sovranatanti ottenuti, definiti “plasma ricco di proteine†(PRP) e “plasma povero di proteine (PPP), à ̈ stata determinata la concentrazione di piastrine. La concentrazione piastrinica del plasma utilizzato nel test di adesione à ̈ stata portata a l-3x 10<5>/Î1⁄4Α mescolando adeguate quantità di PPP e PRP. Il plasma é stato incubato a 37°C per 30 min prima di essere posto a contatto con i campioni di materiale da testare. Detti campioni erano costituiti da provini quadrati di 1 cm<2>ed erano rappresentati rispettivamente da un film di chitosano preparato secondo l’esempio 3, oppure vetro borosilicato, o plastica per colture cellulari (polistirene). Detti provini sono stati sterilizzati mediante immersione in una soluzione alcolica al 70% (v/v) per 60 minuti, quindi essiccati all’aria sterile in una cappa a flusso laminare per 120 minuti e, successivamente immersi in una soluzione di tampone fosfato, PBS, (pH 7,4) per 1 ora.

Successivamente, 40 pL di plasma sono state depositate in strato sottile sulla superficie di ciascun provino ed incubate in termostato per 5 ore. Al termine, i campioni sono stati lavati in PBS per eliminare le piastrine che non avevano aderito alla superficie. I campioni sono fissati con una soluzione di glutaraldeide al 2.5% (p/v) per 20 min, lavati in PBS e disidratati con successivi passaggi in soluzioni di etanolo a concentrazione via via crescente (30°, 50°, 70°, 90°, 96°). I campioni essiccati sono stati fissati su un supporto in vetro, metallizzati al carbonio e analizzati al microscopio elettronico a scansione (SEM).

In Figura 2 sono riportate le immagini SEM dei campioni dopo essiccamento e fissazione. Si osserva che sul film (Pannello A) le piastrine risultano adese alla mantenendo la forma rotondeggiante. Ciò indica mancanza di trombogenicità della superficie del film: esso può pertanto essere utilizzato come costituente della porzione luminale di protesi cilindriche nelle quale debba scorrere il sangue. Nel Pannello B (Vetro) e, maggiormente, nel pannello C (plastica per colture cellulari) si osserva una marcata attivazione delle piastrine caratterizzata dal cambiamento di forma (appiattimento del corpo cellulare) e presenza di pseudopodi allungati formanti un reticolo.

Esempio 7 Emocompatibilità in vitro, test di adsorbimento di proteine su film di chìtosano

E†̃ stato valutato l’adsorbimento di specifiche proteine piasmatiche o plasma umano su campioni costituiti da provini quadrati di 1 cm<2>rappresentati rispettivamente da un film preparato secondo l’esempio 3, oppure da vetro borosilicato o da plastica per colture cellulari (polistirene). Detti provini sono stati sterilizzati mediante immersione in una soluzione alcolica al 70% (v/v) per 60 minuti, quindi essiccati all’aria sterile in una cappa a flusso laminare per 120 minuti.

Sono state quindi preparate tre soluzioni proteiche dissolvendo albumina serica bovina, albumina umana, o plasma in un tampone fosfato salino a pH 7.4 ad una concentrazione finale di 0.1 mg/ mi. I campioni da analizzare sono stati immersi in tampone fosfato pH 7.4 per 12 ore prima del test e successivamente incubati con 3 mL di soluzione proteica per 3 ore in piastre multi pozzetto con superficie a basso adsorbimento. Allo scadere dell’incubazione i campioni sono stati lavati (2 min x 5 volte) con tampone fosfato e successivamente posti in bagno ad ultrasuoni in una soluzione contenente 1% (p/v) di sodio docecilsolfato per rimuovere le proteine adsorbite.

L’assorbanza della soluzione à ̈ stata misurata a 595 nm mediante uno spettrofotometro in accordo con il metodo di Bradford (Anal Biochem, 1976;72, 248-254). Sono state effettuate 3 repliche dello stesso punto sperimentale.

In Figura 3 sono riportati i risultati ottenuti dal test di adsorbimento proteico sulle diverse superfici testate. Di rilevanza ai fini dell’invenzione, solo il film realizzato secondo l’invenzione ha mostrato una scarsa o nulla attivazione proteica: tale fatto à ̈ indicativo di una ridotta o nulla trombogenicità.

Relativamente alla concentrazione di proteine trattenute, essa à ̈ risultata maggiore per la plastica per colture cellulari, in accordo con la sua peculiarità nota di formare un film proteico sulla superficie per aumentare l’adesione e la successiva proliferazione cellulare.

Esempio 8 Impianto di protesi sostitutiva biliare epaticoduodenale, senza conservazione della continenza papillare a seguito di resezione totale del coledoco associata a colecistectomia.

Sei suini ibridi commerciali (incroci suini Large White e Landrace) di sesso femminile e del peso di circa 40 kg sono stati stabulati per una settimana in ambiente a temperatura controllata (25°C). La sera prima dell’intervento sono stati mantenuti a digiuno e, la mattina dell’intervento sottoposti ad anestesia generale.

L’intervento chirurgico era costituito da una serie di fasi di seguito descritte: laparotomia mediana xifo-ombelicale. Isolamento della via biliare principale che veniva circondata con tourniquet. Parziale mobilizzazione del complesso duodeno-pancreatico nel quale veniva individuato esattamente, nella seconda porzione duodenale lo sbocco del coledoco. Legatura/ sezione dei vasi cistici, previa apertura del foglietto peritoneale glissoniano con distacco della fellea dal letto epatico mediante elettrocauterio, senza tuttavia sezionare il dotto cistico che rimaneva così coerente con la via biliare principale (VBP). Emostasi locale per elettrocoagulazione. Duplice sezione della VBP, al di sopra del dotto cistico neirimmediata prossimità dell’ilo epatico e distalmente a livello dello sbocco del coledoco in papilla, con rimozione en bloc del dotto epatico comune, dotto cistico-colecisti e del coledoco stesso. Sintesi con tre punti in Maxon 5.0 del moncone biliare distale rasente la parete della seconda porzione duodenale. Previo svuotamento dello stomaco per aspirazione tramite sonda endogastrica, posizionamento di enterostato distalmente al piloro ed esecuzione di duodenotomia trasversale di circa 0.5 cm attraverso cui si introduceva aspiratore che permetteva un totale svuotamento del viscere da residui alimentari. Disinfezione della breccia duodenale con soluzione all’1% di povidone iodio e posizionamento di endoprotesi sostitutiva del tipo descritto nell’esempio 1 (lunghezza 6 cm; diametro 0.5 cm) mediante confezione di duplice anastomosi, rispettivamente bilio- protesica termino-terminale (Figura 4a) e protesico-duodenale termino-laterale "a becco di flauto†, con duplice emisutura continua, anteriore e posteriore, in Maxon 6.0 (Figura 4b) .

La cavità addominale à ̈ stata quindi lavata ripetutamente con soluzione antisettica ed à ̈ stata effettuata una sintesi parietale a strati.

Esempio 9 Impianto di protesi sostitutiva bilio-biliare retroperitoneale (conservazione continenza papillare) susseguente a resezione subtotale del coledoco associata a colecistectomia.

Sei suini ibridi commerciali (incroci suini Large White e Landrace) di sesso femminile del peso di circa 40 kg sono stati stabulati per una settimana in ambiente a temperatura controllata (25°C). La sera prima deirintervento sono stati mantenuti a digiuno e, a mattina delFintervento sottoposti ad anestesia generale.

L’intervento chirurgico era costituito da una serie di fasi di seguito descritte: laparotomia mediana xifo-ombelicale. Previa apertura del foglietto glissoniano del ligamento epato-duodenale, isolamento in toto della via biliare principale che à ̈ stata circondata con tourniquet avendo cura di riconoscere e conservare i peduncoli vascolari, superiore ed inferiore diretti alle porzioni distale e prossimale della VBP. Parziale mobilizzazione del complesso duodeno-pancreatico nel quale à ̈ stato individuato esattamente, nella seconda porzione duodenale lo sbocco del coledoco. Legatura/ sezione dei vasi cistici, previa apertura del loro foglietto peritoneale con distacco della fellea dal letto epatico mediante elettrocauterio, senza tuttavia sezionare il dotto cistico che rimane così coerente con la via biliare principale (VBP). Emostasi locale per elettrocoagulazione. Duplice sezione della VBP, al di sopra del dotto cistico neU’immediata prossimità dell’ilo epatico e distalmente a livello del coledoco terminale avendo cura di far cadere la sezione biliare 0.5 cm al di sopra dello sbocco del coledoco in papilla,. Rimozione en bloc del dotto epatico comune, dotto cistico-colecisti e dei due terzi del coledoco distale. Detensione gastrica mediante svuotamento dello stomaco per aspirazione tramite sonda endogastrica.

Posizionamento di endoprotesi sostitutiva preparata secondo quanto descritto nell’esempio 3 {lunghezza 4 cm; diametro 0.5 cm) mediante confezione di duplice anastomosi, rispettivamente bilioprotesica termino-terminale e protesico-biliare termino-terminale, con duplice emisutura continua, anteriore e posteriore, in Maxon 6.0 (Figura 5a). Sintesi con sopraggitto continuo in Maxon 6.0 del foglietto glissoniano precedentemente aperto con ripristino della normale anatomia del ligamento epato-duodenale e conseguente posizionamento retroperitoneale dell’impianto protesico biliare {Figura 5b).

La cavità addominale à ̈ stata quindi lavata ripetutamente con soluzione antisettica ed à ̈ stata effettuata una sintesi parietale a strati.

Claims (16)

1. RIVENDICAZIONI 1. Protesi tubulare internamente cava, avente una parete multistrato comprendente: (a) uno strato esterno di gel di chitosano, (b) uno strato intermedio di collagene, e (c) uno strato interno costituito da un film non poroso di chitosano.
2. 2. Protesi secondo la rivendicazione 1, in cui il chitosano presente nella parete ha un peso molecolare tra 1 e 2000 KDa, e un grado di deacetilazione compreso tra 40 e 98%.
3. 3. Protesi secondo la rivendicazione 2, in cui il chitosano ha un peso molecolare tra 3 e 1000 KDa, e un grado di deacetilazione compreso tra 60 e 97%.
4. 4. Protesi secondo la rivendicazione 3, in cui il chitosano ha un peso molecolare tra 5 e 300 KDa, e un grado di deacetilazione compreso tra 70 e 95%.
5. 5. Protesi secondo le rivendicazioni 1-4, in cui lo strato (a) e/o (c) à ̈ ottenibile a partire da una soluzione comprendente detto chitosano ad una concentrazione tra 0.5 e 10% p/v, uno o più acidi ad una concentrazione complessiva tra 0.1 e 5% p/v, zuccheri e sali inorganici.
6. 6. Protesi secondo la rivendicazione 5, dove gli acidi sono scelti tra acido acetico, acido borico, acido cloridrico, acido lattico o acido ascorbico; i sali inorganici sono scelti tra fosfati e cloruri di metalli alcalini e alcalino-terrosi; gli zuccheri sono scelti tra di- e tri-saccaridi e loro idrati.
7. 7. Protesi tubolare secondo le rivendicazioni 1-6, utile nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o porzioni di essi.
8. 8. Protesi secondo la rivendicazione 7, nella forma di via biliare, vaso arterioso o venoso, dotto pancreatico, porzione di: intestino, apparato respiratorio, esofago, o vie genito -urinarie.
9. 9. Procedimento per la preparazione di una protesi secondo le rivendicazioni 1-8, comprendente i seguenti passaggi: (i). preparazione del film di chitosano e suo avvolgimento su un supporto cilindrico; (ii). applicazione, sull'assemblato ottenuto in (i)., dello strato di collagene opportunamente idratato; (iii). formazione dello strato di gel di chitosano intorno all’assemblato ottenuto in (ii); (iv). parziale disidratazione delPassemblato ottenuto in (iii).
10. 10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, comprendente l’applicazione di una soluzione di chitosano con funzione pro-adesiva tra gli strati (a) e (b) e/o tra gli strati (b) e (c), prima del contatto tra i rispettivi strati.
11. 11. Procedimento secondo le rivendicazioni 9-10, in cui il passaggio (iii). comprende la seguente metodologia: (iii)a. aH’intemo di un opportuno stampo cilindrico, contattare l’assemblato ottenuto nel passaggio (ii). con una soluzione comprendente: detto chitosano ad una concentrazione tra 0.5 e 10% p/v, uno o più acidi ad una concentrazione complessiva tra 0.1 e 5% p/v, zuccheri e sali inorganici. (iii)b. raffreddare l’assemblato ottenuto in (iii)a ad una temperatura compresa tra -20 e -80°C per un tempo compreso tra 2 e 24 ore. (iii)c. rimuovere lo stampo cilindrico e contattare l’assemblato risultante con una soluzione idroalcolica alcalina avente pH maggiore o uguale a 8, previamente raffreddata tra 4 e -60°C, in quantità tale da neutralizzare l’acido presente nello strato esterno. (iii)d. lavare l’assemblato ottenuto in (iii)c e rimuovere il supporto cilindrico centrale.
12. 12. Procedimento secondo le rivendicazioni 9-11, in cui il passaggio (iv). si effettua ponendo l’assemblato ottenuto in (iii) ad una temperatura compresa tra 4 e 40°C per un tempo compreso tra 5 e 180 minuti.
13. 13. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-12, in cui il passaggio (iv). si effettua ponendo l’assemblato ottenuto in (iii) ad una temperatura tra 4 e 40°C per un tempo compreso tra 15 e 90 minuti.
14. 14. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-13, in cui il passaggio (iv). si effettua ponendo l’assemblato ottenuto in (iii) ad una temperatura tra 10 e 35C°, preferibilmente a 25°C, per un tempo compreso tra 15 e 90 minuti.
15. 15. Utilizzo della protesi descritta nelle rivendicazioni 1-8, nella chirurgia ricostruttiva o sostitutiva di organi cavi o porzioni di essi.
16. 16. Utilizzo secondo la rivendicazione 15, nella preparazione di protesi per la ricostruzione o sostituzione di vie biliari, vasi arteriosi o venosi, dotti pancreatici, porzioni dell’intestino, dell’apparato respiratorio, dell’esofago, delle vie genito-urinarie.