ITGE20120084A1

ITGE20120084A1 - TISSUE DERIVATIVE OF NON-EMBRYONIC ORIGIN ENRICHED WITH STEM AND MULTIPOTENT ELEMENTS AND METHOD OF PREPARATION OF A MEDICATION WITH SUCH A DERIVATIVE

Info

Publication number: ITGE20120084A1
Application number: IT000084A
Authority: IT
Inventors: Carlo Tremolada; Carlo Ventura
Original assignee: Carlo Tremolada
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2014-02-25

Description

DESCRIZIONE dell'Invenzione Industriale dal titolo: "derivato tessutale di origine non embrionale arricchito di elementi staminali e multipotenti e metodo di preparazione di un medicamento con tale derivato" DESCRIPTION of the Industrial Invention entitled: "tissue derivative of non-embryonic origin enriched with stem and multipotent elements and method of preparation of a drug with this derivative"

TESTO DELLA DESCRIZIONE TEXT OF THE DESCRIPTION

La presente invenzione ha per oggetto un derivato tissutale arricchito di elementi staminali e multipotenti, il metodo di preparazione di un medicamento con detto derivato ed l'uso di tale derivato, di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali. The present invention relates to a tissue derivative enriched with stem and multipotent elements, the method of preparing a medicament with said derivative and the use of such derivative, of non-embryonic stem cells obtained from said derivative or of cells differentiated from said cells non-embryonic stem cells.

E' noto che il tessuto adiposo contiene elementi multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali . Adipose tissue is known to contain multipotent elements, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells.

La possibilità di un utilizzo in medicina clinica di elementi multipotenti è ostacolata dalla bassa sopravvivenza di questi elementi in lipoaspirati crioconservati, dalla difficoltà di una espansione ex vivo, e dalla difficoltà di seguire la normativa corrente del Good Manufacturing Practice (cGMP) per cellule espanse. The possibility of using multipotent elements in clinical medicine is hindered by the low survival of these elements in cryopreserved lipoaspirates, by the difficulty of ex vivo expansion, and by the difficulty of following the current Good Manufacturing Practice (cGMP) regulations for expanded cells.

E' nota in medicina l'importanza di avere un prodotto biologico ottenuto da una "manipolazione minima", non-enzimatica , del tessuto di origine, quale lipoaspirato che può essere prontamente utilizzato nella pratica clinica, senza che detto prodotto ricada nella normativa "Farmaco- Major manipulation" (regolamento EC n. 1394/2007 del PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO del 13 novembre 2007 sui medicinali per terapie avanzate). In medicine, the importance of having a biological product obtained from a "minimal manipulation", non-enzymatic, of the tissue of origin, as a lipoaspirate that can be readily used in clinical practice, without this product falling under the "Medication" legislation, is well known. - Major manipulation "(EC regulation no. 1394/2007 of the EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 13 November 2007 on advanced therapy medicinal products).

Con la definizione di "manipolazione minima" delle cellule si intende che le cellule (staminali e non) non vengono espanse (coltivate e fatte proliferare in vitro in coltura) e non vengono sottoposte ad una serie di "lavorazioni" quali estrazione e dissociazioni enzimatiche, centrifugazioni e separazioni di popolazioni cellulari, arricchimento di alcune popolazioni cellulari a scapito di altre (ad esempio separazione con citofluorometria a flusso) ed altre lavorazioni simili. The definition of "minimal manipulation" of the cells means that the cells (stem and non-stem cells) are not expanded (cultured and made to proliferate in vitro in culture) and are not subjected to a series of "processes" such as extraction and enzymatic dissociation, centrifugations and separations of cell populations, enrichment of some cell populations at the expense of others (for example separation with flow cytometry) and other similar processes.

Il fatto che il tessuto o le cellule siano sottoposte a manipolazione minima consente che il procedimento ed il prodotto ottenuto tramite detto procedimento non ricada nella normativa "Farmaco-Major manipulation" e che il prodotto non sia considerato come ATMPs (Adanced Therapy Medicinal Products) e di conseguenza sottoposto alla nomativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice): infatti la possibilità che cellule staminali non embrionali possano essere utilizzate in ambito clinico, se sottoposte ad una manipolazione estensiva, compresa l'espansione ex vivo, è ritardata nel tempo in modo considerevole a causa della necessità di trattare il prodotto secondo la normativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice) . The fact that the tissue or cells are subjected to minimal manipulation means that the procedure and the product obtained by this procedure does not fall under the "Drug-Major manipulation" legislation and that the product is not considered as ATMPs (Adanced Therapy Medicinal Products) and consequently subjected to the standard of cGMPs (current Good Manufacturing Practice): in fact the possibility that non-embryonic stem cells can be used in the clinical setting, if subjected to extensive manipulation, including ex vivo expansion, is considerably delayed over time due to the need to treat the product according to the cGMPs (current Good Manufacturing Practice) regulations.

E' noto che il trapianto in vivo di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) isolate da membrane fetali di placenta a termine (FMhMSC) nel cuore di ratti sottoposti a infarto del miocardio non ha mostrato rigetto immunitario e non ha avuto bisogno di procedure di immunosoppressione. In vivo transplantation of human mesenchymal stem cells (hMSC) isolated from fetal term placenta membranes (FMhMSC) into the heart of rats undergoing myocardial infarction did not show immune rejection and did not require immunosuppression procedures. .

E' stato dimostrato che il trapianto di FMhMSC in maiali sottoposti a infarto è stato ben tollerato senza nessun effetto immunologico indesiderato e senza il bisogno di immunosoppressori. FMhMSC transplantation in pigs undergoing heart attack was shown to be well tolerated without any undesirable immunological effects and without the need for immunosuppressants.

Queste scoperte, e altre osservazioni hanno dimostrato che: These findings, and other observations have shown that:

le FMhMSC non inducono proliferazione di linfociti allogenici o xenogenici, sopprimendo in modo attivo la capacità di risposta dei linfociti, il trapianto di FMhMSC in maiali e ratti neonatali ha dato come risultato il microchimerismo umano in vari organi e tessuti, indicando che, le hMSC, oltre a possedere un potenziale rigenerativo/riparativo , presentano anche proprietà tollerogeniche essenziali che possono preparare il terreno per lo sviluppo di una terapia cellulare allogenica su grande scala. FMhMSCs do not induce proliferation of allogeneic or xenogenic lymphocytes, actively suppressing the responsiveness of lymphocytes, transplantation of FMhMSC into neonatal pigs and rats resulted in human microchimerism in various organs and tissues, indicating that, hMSCs, in addition to possessing regenerative / restorative potential, they also exhibit essential tolerogenic properties that can pave the way for the development of large-scale allogeneic cell therapy.

E' evidente quindi l'importanza biomedica e clinica che può avere un prodotto cellulare arricchito di cellule mesenchimali e periciti che sia stato sottoposto a cosiddetta "manipolazione minima". The biomedical and clinical importance of a cellular product enriched with mesenchymal cells and pericytes that has been subjected to so-called "minimal manipulation" is therefore evident.

Il brevetto internazionale WO 2011/145075 descrive un metodo ed un dispositivo per trattare tessuto adiposo lipoaspirato , senza l'utilizzo di enzimi, ed ottenere un derivato di tessuto adiposo, non espanso, che contiene cellule staminali non embrionali (hASCs) che, come è noto, mostrano un'espressione fenotipica e genetica simile alle cellule umane staminali mesenchimali estratte dal midollo osseo e da altre fonti alternative, la cui multipotenzialità , che comprende la possibilità di riparare tessuto miocardio infartuato, la possibilità di differenziarsi in adipociti, osteociti, condrociti, elementi neuronali, epatociti, miociti pancreatici e scheletrici, le rende adatte all'utilizzo in medicina rigenerativa. The international patent WO 2011/145075 describes a method and a device for treating lipoaspirated adipose tissue, without the use of enzymes, and obtaining a derivative of non-expanded adipose tissue, which contains non-embryonic stem cells (hASCs) which, as is known, show a phenotypic and genetic expression similar to human mesenchymal stem cells extracted from bone marrow and other alternative sources, whose multipotentiality, which includes the possibility of repairing infarcted myocardial tissue, the possibility of differentiating into adipocytes, osteocytes, chondrocytes, neuronal elements, hepatocytes, pancreatic and skeletal myocytes, makes them suitable for use in regenerative medicine.

Il dispositivo descritto nella domanda internazionale W02011/145075 permette di agire sul lipoaspirato attraverso lievi forze meccaniche, in un sistema completamente chiuso, fornendo un derivato tissutale, in particolare un derivato di tessuto adiposo, non espanso, altamente arricchito di cellule staminali mesenchimali e periciti che può essere immediatamente utilizzato. The device described in the international application W02011 / 145075 allows to act on the lipoaspirate through slight mechanical forces, in a completely closed system, providing a tissue derivative, in particular a derivative of adipose tissue, not expanded, highly enriched with mesenchymal stem cells and pericytes which can be used immediately.

Oggetto della presente invenzione è quindi un metodo per la preparazione di un medicamento da utilizzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive che prevede la preparazione di un derivato tissutale, in particolare un derivato del tessuto adiposo, o la preparazione di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato. The object of the present invention is therefore a method for the preparation of a medicament to be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures which involves the preparation of a tissue derivative, in particular a derivative of adipose tissue, or the preparation of non-embryonic stem cells obtained from said derivative.

Il metodo prevede: The method involves:

riduzione del detto tessuto adiposo in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati, in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculostromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro, reduction of said adipose tissue into cellular agglomerates smaller than the size of said macroagglomerates, so that said cellular and / or vasculostromal agglomerates have dimensions equal to or smaller than a certain value, and in such a way that said dimensions are on average equal between them,

lavaggio con soluzioni sterili del tessuto adiposo ridotto ed emulsione delle componenti fluide del tessuto adiposo sottoposto a riduzione delle dimensioni dei macroagglomerati cellulari, washing with sterile solutions of the reduced adipose tissue and emulsion of the fluid components of the adipose tissue subjected to a reduction in the size of the cellular macroagglomerates,

essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite un dispositivo provvisto al suo interno di mezzi di riduzione quale una rete od una serie di lamine o fili taglienti e mezzi di generazione di una emulsione quali sfere o simili, ed essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo . said reduction, washing and emulsion steps being performed mechanically by means of a device provided internally with reduction means such as a network or a series of blades or cutting wires and means for generating an emulsion such as spheres or the like, and being said reduction, washing and emulsion carried out in conditions of absence of air inside said device.

Il tessuto adiposo può essere ottenuto tramite aspirazione di tessuto da donatore vivo o donatore cadavere, ed è costituito da una componente fluida, comprendente almeno una componente oleosa ed una componente ematica, e da una componente solida comprendente strutture vasculo-stromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali e multipotenti. The adipose tissue can be obtained by aspiration of tissue from live donor or cadaver donor, and consists of a fluid component, comprising at least an oily component and a blood component, and a solid component comprising vasculo-stromal structures, cellular fragments and / or one or more cellular macro-agglomerates of heterogeneous dimensions and including stem and multipotent cells.

L'aspirazione del tessuto adiposo può essere preceduta da un passo di infiltrazione nel tessuto del donatore di una soluzione contenente una sostanza o composto vasocostrittore quale adrenalina o simili. The aspiration of the adipose tissue can be preceded by an infiltration step into the donor tissue of a solution containing a vasoconstrictor substance or compound such as adrenaline or the like.

Il derivato tissutale ottenuto con il metodo oggetto della presente invenzione può essere utilizzato direttamente in medicina clinica a scopi ricostruttivi e rigenerativi per veicolare nel paziente cellule multipotenti in grado di differenziarsi e costituire una fonte di cellule per la riparazione di tessuti ossei, cartilaginei, vascolari, cardiaci, neuronali ed endocrini, grazie al fatto che: The tissue derivative obtained with the method object of the present invention can be used directly in clinical medicine for reconstructive and regenerative purposes to carry multipotent cells in the patient capable of differentiating and constituting a source of cells for the repair of bone, cartilage and vascular tissues, cardiac, neuronal and endocrine, thanks to the fact that:

- è un prodotto che può non essere sottoposto ad espansione cellulare, - it is a product which may not be subjected to cell expansion,

- è minimamente manipolato, - is minimally manipulated,

può essere crioconservato senza perdere la vitalità della sua intrinseca popolazione di cellule staminali non embrionali. it can be cryopreserved without losing the viability of its inherent population of non-embryonic stem cells.

Il metodo di preparazione di detto derivato tissutale secondo la presente invenzione, può prevedere che prima dell'utilizzo su paziente possa essere sottoposto a crioconservazione e/o ad eventuale espansione in vitro, ossia coltivazione e proliferazione numerica in vitro in coltura. The method of preparation of said tissue derivative according to the present invention can provide that before use on the patient it can be subjected to cryopreservation and / or possible expansion in vitro, ie cultivation and numerical proliferation in vitro in culture.

In particolare il metodo può prevedere un passo di espansione numerica cellulare degli elementi staminali e multipotenti compresi nel derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo aspirato e trattato con detto dispositivo, ossia del derivato fresco, o scongelato, dopo il passo di crioconservazione, essendo detto passo di espansione numerica delle cellule staminali e multipotenti eseguito su terreno di coltura. In particular, the method can provide a step of cellular numerical expansion of the stem and multipotent elements included in the tissue derivative obtained from aspirated adipose tissue and treated with said device, i.e. of the fresh or thawed derivative, after the cryopreservation step, being said step of numerical expansion of stem and multipotent cells performed on culture medium.

Le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato possono essere differenziate in vitro in una o più linee cellulari quali adipociti, condrociti od osteociti. The non-embryonic stem cells obtained from said derivative can be differentiated in vitro into one or more cell lines such as adipocytes, chondrocytes or osteocytes.

Inoltre il metodo oggetto dell'invenzione può prevedere l'applicazione di detto derivato tissutale o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate a partire da dette cellule staminali, su supporti solidi o semisolidi biocompatibili, quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato, la quale applicazione avviene in vitro su substrati successivamente impiantati su paziente o su substrati già innestati in vivo su paziente. Furthermore, the method object of the invention can provide for the application of said tissue derivative or of non-embryonic stem cells obtained from said derivative or of cells differentiated starting from said stem cells, on solid or semi-solid biocompatible supports, such as porous ceramic substrates, substrates polymers, foils, hyaluronic gel, or lyophilized human dermis, which application takes place in vitro on substrates subsequently implanted on the patient or on substrates already grafted in vivo on the patient.

La presente invenzione sfrutta quindi le proprietà tollerogeniche del prodotto ottenuto tramite il dispositivo descritto nella domanda internazionale W02011/145075, che lo rendono adatto a trapianto autologo, allogenico o xenogenico, senza che si abbiano effetti immunologici indesiderati o infiammazione e senza il bisogno di agenti immunosoppressori . The present invention therefore exploits the tolerogenic properties of the product obtained through the device described in the international application W02011 / 145075, which make it suitable for autologous, allogeneic or xenogenic transplantation, without undesirable immunological effects or inflammation and without the need for immunosuppressive agents. .

Il derivato tessutale oggetto della presente invenzione può essere utilizzato come vettore cellulare per il trasferimento nel tessuto di paziente in vivo di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali. The tissue derivative object of the present invention can be used as a cell vector for the transfer into patient tissue in vivo of stem and multipotent elements of non-embryonic origin, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells.

In particolare dette cellule staminali mesenchimali non embrionali esprimono in situ sul paziente un set di geni coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari, quali geni per il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), per il fattore di crescita epatocitaria (HGF), ed il gene KDR che codifica per un recettore essenziale del VEGF. In particular, said non-embryonic mesenchymal stem cells express in situ on the patient a set of genes involved in vasculogenesis and capillary formation, such as genes for vascular endothelial growth factor (VEGF), for hepatocyte growth factor (HGF), and KDR gene encoding an essential VEGF receptor.

Il derivato tissutale ottenuto dal trattamento del lipoaspirato con il dispositivo descritto nel brevetto WO 2011/145075 presenta numerosi vantaggi rispetto al lipoaspirato semplice, non trattato con il dispositivo oggetto dell'invenzione, il quale lipoaspirato semplice: The tissue derivative obtained from the treatment of the lipoaspirate with the device described in the patent WO 2011/145075 has numerous advantages compared to the simple lipoaspirate, not treated with the device object of the invention, which simple lipoaspirate:

presenta bassa sopravvivenza cellulare dopo la crioconservazione ed il congelamento, has low cell survival after cryopreservation and freezing,

- è difficilmente espandibile in vivo, - it is difficult to expand in vivo,

- ha una bassa efficienza di rilascio (meno del 5% delle cellule trapiantate si conservano dopo il trapianto) , - has a low release efficiency (less than 5% of transplanted cells are preserved after transplantation),

- non è chiaro il destino di queste cellule in vivo. - the fate of these cells in vivo is not clear.

Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo e comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali perici ti e/o cellule staminali mesenchimali , o le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, o le cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, possono essere usate in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, essendo detto derivato, dette cellule staminali non embrionali o dette cellule differenziate ottenute con il metodo sopra descritto. The tissue derivative obtained from adipose tissue and comprising a vascular-stromal fraction enriched with stem and multipotent elements, such as perice and / or mesenchymal stem cells, or non-embryonic stem cells obtained from said derivative, or cells differentiated from said stem cells non-embryonic, can be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures, for the execution of autoiogenic, allogeneic or xenogenic transplants, being said derivative, called non-embryonic stem cells or called differentiated cells obtained with the method described above.

Oggetto dell'invenzione è anche l'uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, di un medicamento per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici, essendo detto medicamento ottenuto con il metodo sopra descritto. The object of the invention is also the use, in regenerative medicine and in reconstructive procedures, of a medicament for carrying out autoiogenic, allogeneic or xenogenic transplants, said medicament being obtained with the method described above.

Queste ed altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno più chiaramente dalla seguente descrizione di alcuni esempi esecutivi illustrati nei disegni allegati in cui: These and other characteristics and advantages of the present invention will become clearer from the following description of some executive examples illustrated in the attached drawings in which:

la fig.l illustra schematicamente il dispositivo ed i passi di trattamento del lipoaspiato tramite detto dispositivo; Fig. 1 schematically illustrates the device and the steps for treating the lipoaspiate by means of said device;

la fig. 2a illustra il confronto istologico tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo di figura 1 ed il derivato tissutale fresco ottenuto con il dispositivo di figura 1; la fig. 2b illustra i risultati dell'analisi immunoistochimica tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo di figura 1 ed il derivato tessutale fresco ottenuto con il dispositivo di figura 1; fig. 2a illustrates the histological comparison between lipoaspirated adipose tissue not treated with the device of Figure 1 and the fresh tissue derivative obtained with the device of Figure 1; fig. 2b illustrates the results of the immunohistochemical analysis between lipoaspirated adipose tissue not treated with the device of Figure 1 and the fresh tissue derivative obtained with the device of Figure 1;

la fig. 3 riporta i risultati delle analisi di citometria a flusso di marcatori di cellule staminali in una frazione cellulare non espansa di un lipoaspirato e nel derivato tessutale ottenuto con il dispositivo di figura 1, dopo digestione enzimatica per ottenere la frazione vasculo-stromale (media±SE; n=4 differenti donatori); fig. 3 reports the results of the flow cytometry analyzes of stem cell markers in an unexpanded cell fraction of a lipoaspirate and in the tissue derivative obtained with the device of figure 1, after enzymatic digestion to obtain the vasculo-stromal fraction (mean ± SE ; n = 4 different donors);

la fig.4 illustra le differenze nell'espressione dei markers nel lipoaspirato non trattato e nel derivato tissutale ottenuto con il dispositivo di figura 1, 180x116 mm (300x300DPI); Fig. 4 illustrates the differences in the expression of the markers in the untreated lipoaspirate and in the tissue derivative obtained with the device of figure 1, 180x116 mm (300x300DPI);

la fig.5 illustra l'espansione delle cellule staminali adipose umane, 160x132mm (300X300 DPI); Fig. 5 illustrates the expansion of human adipose stem cells, 160x132mm (300X300 DPI);

la fig.6 illustra l'espansione cellulare a partire da derivato tissutale crioconservato e messo in coltura per 10 giorni, 180X145mm (300X300DPI); Fig. 6 illustrates cellular expansion starting from cryopreserved tissue derivative and cultured for 10 days, 180X145mm (300X300DPI);

la fig.7 illustra l'analisi di citometria a flusso di cellule espanse a partire dal derivato tissutale ottenuto da cadavere o da donatore vivo con il dispositivo di figura 1; i dati sono espressi come medie della percentuale di cellule vive totali positive per i marcatori indicati. Fig.7 illustrates the flow cytometry analysis of expanded cells starting from the tissue derivative obtained from a cadaver or from a live donor with the device of Figure 1; the data are expressed as means of the percentage of total positive live cells for the indicated markers.

Il dispositivo 1 descritto nel brevetto WO 2011/145075 consente di prelevare tessuto da paziente vivo o da cadavere, umano o animale, preferibilmente tessuto adiposo, di processarlo senza l'utilizzo di enzimi e di reiniettarlo nel paziente. The device 1 described in the patent WO 2011/145075 allows to take tissue from a living patient or from a corpse, human or animal, preferably adipose tissue, to process it without using enzymes and to re-inject it into the patient.

Nel presente testo con derivato tessutale si intende un aggregato o cluster cellulare, comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , ottenuto da tessuto adiposo trattato con il metodo ed il dispositivo 1 descritto di seguito e nel documento WO 2011/145075. In the present text, a tissue derivative means a cellular aggregate or cluster, comprising a vasculo-stromal fraction enriched with stem and multipotent elements, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells, obtained from adipose tissue treated with the method and device 1 described in below and in WO 2011/145075.

Il dispositivo 1 può essere utilizzato da qualsiasi medico, rendendo le procedure chirurgiche semplici ed efficienti. Device 1 can be used by any physician, making surgical procedures simple and efficient.

Il dispositivo 1, grazie alla presenza di almeno una rete di riduzione 101 delle dimensioni del lipoaspirato e di elementi agitatori 103 che consentono di ottenere una emulsione delle componenti liquide del lipoaspirato, riduce progressivamente le dimensioni dei clusters o agglomerati cellulari del tessuto adiposo lipoaspirato, da clusters di forma sferoidale con un diametro da 1 a 3,5 mm a clusters di 0,2-0,8 mm, eliminando contemporaneamente i residui liquidi costituiti principalmente da olio e sangue. The device 1, thanks to the presence of at least one network 101 for reducing the size of the lipoaspirate and of stirring elements 103 which allow to obtain an emulsion of the liquid components of the lipoaspirate, progressively reduces the size of the clusters or cellular agglomerates of the lipoaspirate adipose tissue, from spheroidal-shaped clusters with a diameter from 1 to 3.5 mm in clusters of 0.2-0.8 mm, simultaneously eliminating liquid residues consisting mainly of oil and blood.

Il metodo di trattamento del lipoaspirato prevede il lavaggio e la riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari in completa immersione in un liquido, quale una soluzione fisiologica sterile di lavaggio, per minimizzare l'azione traumatica del dispositivo 1 sulle cellule. The lipoaspirate treatment method involves washing and reducing the size of the cell clusters in complete immersion in a liquid, such as a sterile physiological washing solution, to minimize the traumatic action of the device 1 on the cells.

I passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite il dispositivo 1 sono eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo 1. The reduction, washing and emulsion steps performed mechanically by means of the device 1 are performed in conditions of absence of air inside said device 1.

Il dispositivo 1 consente di ottenere agglomerati cellulari di dimensioni ridotte che migliorano integrazione cellulare post-trapianto. The device 1 allows to obtain cellular agglomerates of reduced dimensions which improve post-transplant cell integration.

La riduzione delle dimensioni, nell'arte nota, è ottenuta riducendo il calibro delle cannule da aspirazione o i loro fori, ma questo allunga i tempi di azione sul paziente e peggiora qualitativamente il lipoaspirato rendendolo ricco di oli e di frammenti cellulari, dovuti alla rottura degli adipociti nel corso del passo di aspirazione. The reduction of the dimensions, in the known art, is obtained by reducing the caliber of the suction cannulas or their holes, but this lengthens the action times on the patient and worsens the quality of the lipoaspirate making it rich in oils and cellular fragments, due to the breaking of the adipocytes during the aspiration step.

Usando un dispositivo 1 delle dimensioni di 225 mi è possibile in meno di 20 minuti trattare circa 100-130 mi di lipoaspirato ed ottenere circa 60-100 mi di derivato tissutale arricchito di elementi staminali e multipotenti. Using a device 1 having a size of 225 ml it is possible in less than 20 minutes to treat about 100-130 ml of lipoaspirate and obtain about 60-100 ml of tissue derivative enriched with stem and multipotent elements.

La procedura di ottenimento del lipoaspirato prevede due passi: infiltrazione ed aspirazione, e la stessa tecnica può essere utilizzata su donatori vivi o su cadavere. The procedure for obtaining the lipoaspirate involves two steps: infiltration and aspiration, and the same technique can be used on live donors or on a corpse.

Nel passo di infiltrazione una soluzione salina con adrenalina (2 pg/ml concentrazione finale) è infiltrata usando cannule, preferibilmente usa e getta, con punta smussata. In the infiltration step a saline solution with adrenaline (2 pg / ml final concentration) is infiltrated using cannulae, preferably disposable, with blunt tip.

La vasocostrizione in combinazione con la punta smussata della cannula evita ogni accidentale iniezione intravascolare e facilita la successiva lipoaspirazione . Vasoconstriction in combination with the blunt tip of the cannula avoids any accidental intravascular injection and facilitates subsequent lipoaspiration.

E' possibile aggiungere alla miscela una sostanza anestetica quale lidocaina. An anesthetic substance such as lidocaine can be added to the mixture.

Il kit di infiltrazione comprendente una siringa ed una valvola può essere collegato direttamente ad una sacca di infusione per facilitare il passo di infiltrazione e creare un sistema completamente chiuso, ideale per il trattamento di pazienti anche in ambito ambulatoriale. The infiltration kit comprising a syringe and a valve can be connected directly to an infusion bag to facilitate the infiltration step and create a completely closed system, ideal for treating patients even in the outpatient setting.

Il passo di aspirazione viene ottenuto con una cannula a punta smussata collegata ad una siringa con attacco luer-lock. The aspiration step is obtained with a blunt tip cannula connected to a syringe with a luer-lock connection.

Preferibilmente la cannula presenta 5 fori ovali delle dimensioni di 1X2 mm. Preferably the cannula has 5 oval holes 1X2 mm in size.

Il vuoto durante l'aspirazione può essere ottenuto manualmente o bloccando lo stantuffo della siringa in un dispositivo a morsetto. Vacuum during aspiration can be achieved manually or by locking the syringe plunger into a clamp device.

Un dispositivo 1 da 225 mi consente di trattare da 40 a 130 mi di lipoaspirato, preferibilmente 100 mi. A 225 ml device 1 allows me to treat from 40 to 130 ml of lipoaspirate, preferably 100 ml.

Per evitare la rottura delle cellule, non deve essere presente aria all'interno del dispositivo 1 durante tutti i passi di trattamento del lipoaspirato . To avoid cell rupture, there should be no air inside the device 1 during all the lipoaspirate treatment steps.

Il dispositivo 1 è quindi riempito, prima dell'introduzione al suo interno del lipoaspirato, di una soluzione sterile, preferibilmente una soluzione salina. The device 1 is then filled, before the lipoaspirate is introduced inside it, with a sterile solution, preferably a saline solution.

La prima riduzione degli agglomerati cellulari è ottenuta spingendo il lipoaspirato contento nella siringa di aspirazione nel dispositivo 1 attraverso la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni, mentre una corrispondente quantità di soluzione salina esce dal dispositivo 1 e viene accumulata in una sacca di raccolta (figura 1A). The first reduction of the cell agglomerates is achieved by pushing the content lipoaspirate into the suction syringe in the device 1 through the first size reduction net 101, while a corresponding amount of saline solution exits the device 1 and is accumulated in a collection bag (figure 1A).

Quando la quantità desiderata di lipoaspirato è stata inserita nel dispositivo 1, mantenuto verticale, con la prima rete 101 di riduzione delle dimensioni in alto, lo strato galleggiante di tessuto adiposo, preferibilmente, non deve occupare più della metà superiore del dispositivo 1. When the desired amount of lipoaspirate has been inserted into the device 1, kept vertical, with the first size reduction net 101 at the top, the floating layer of adipose tissue, preferably, should not occupy more than the upper half of the device 1.

Gli elementi agitatori 103 presenti nel dispositivo 1, ad esempio sfere in metallo o simili, consentono, durante l'agitazione del dispositivo 1 (figura 1B), di formare una emulsione, tra l'olio, sangue e soluzione di lavaggio che è rimossa, dall'interno del dispositivo 1, grazie ad un flusso contro gravità di soluzione salina, mentre gli agglomerati cellulari con dimensioni ridotte si muovono verso la parte superiore del dispositivo 1 considerato in posizione verticale (figura 1B). The stirring elements 103 present in the device 1, for example metal balls or the like, allow, during the stirring of the device 1 (Figure 1B), to form an emulsion, between the oil, blood and washing solution which is removed, from inside the device 1, thanks to a flow against gravity of the saline solution, while the cellular agglomerates with reduced dimensions move towards the upper part of the device 1 considered in a vertical position (Figure 1B).

Quando la parte liquida all'interno del dispositivo 1 appare chiara ed il lipoaspirato giallo, il flusso di soluzione salina viene interrotto, ed il dispositivo 1 viene ruotato di 180° (figura 1C). When the liquid part inside the device 1 appears clear and the lipoaspirate yellow, the flow of saline solution is stopped, and the device 1 is rotated 180 ° (Figure 1C).

La seconda riduzione delle dimensioni dei clusters cellulari è ottenuta facendo passare gli agglomerati cellulari attraverso una seconda rete 102 di riduzione delle dimensioni spingendo all'interno del dispositivo 1 ulteriore liquido attraverso l'apertura inferiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura le) , utilizzando ad esempio una siringa. The second reduction in the size of the cell clusters is obtained by passing the cellular agglomerates through a second size reduction network 102 by pushing further liquid into the device 1 through the lower opening of the device (considered in a vertical position as in figure le) , for example using a syringe.

Il derivato tissutale ottenuto attraverso il trattamento del lipoaspirato con il dispositivo 1 sopra descritto è raccolto in siringhe collegate all'apertura superiore del dispositivo (considerato in posizione verticale come in figura 1C) ed è pronto ad essere utilizzato o conservato. The tissue derivative obtained by treating the lipoaspirate with the device 1 described above is collected in syringes connected to the upper opening of the device (considered in a vertical position as in figure 1C) and is ready to be used or stored.

Il prodotto ottenuto tramite il dispositivo sopra descritto costituisce quindi un derivato tissutale non espanso comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali in particolare costituisce una "nicchia vascolare stromale naturale" costituita da una rete di adipociti a guisa di impalcatura legati a vasi altamente conservati, contenente una notevole quantità di cellule staminali mesenchimali e periciti . The product obtained through the device described above therefore constitutes an unexpanded tissue derivative comprising a vascular-stromal fraction enriched with stem and multipotent elements, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells, in particular it constitutes a "natural stromal vascular niche" consisting of a network of scaffold-like adipocytes linked to highly conserved vessels, containing a significant amount of mesenchymal stem cells and pericytes.

La figura 2a illustra il confronto istologico tra tessuto adiposo lipoaspirato non trattato con il dispositivo sopra descritto ed il derivato tissutale fresco: il derivato tissutale mostra un miglior mantenimento della nicchia vasculo-stromale costituita da capillari disposti tra adipociti e peduncoli stromali contenenti canali vascolari con evidente lumina. Al contrario il tessuto adiposo non trattato mostra microcanali compressi e distorti. Figure 2a illustrates the histological comparison between lipoaspirated adipose tissue not treated with the device described above and the fresh tissue derivative: the tissue derivative shows a better maintenance of the vasculo-stromal niche consisting of capillaries arranged between adipocytes and stromal peduncles containing vascular channels with evident lumina. Conversely, untreated adipose tissue shows compressed and distorted microchannels.

Come illustrato in figura 2b, per valutare le differenze quantitative nella frazione vasculostromale è stata eseguita una analisi immunoistochimica contro cellule endoteliali (CD34 e CD146), cellule murali (CD146 e ASMA), adipociti e preadipociti (proteina S-100): l'espressione quantitativa di CD34 non mostra differenze significative; l'espressione di CD146 è significativamente incrementata nel derivato tissutale . As shown in Figure 2b, immunohistochemical analysis was performed against endothelial cells (CD34 and CD146), mural cells (CD146 and ASMA), adipocytes and preadipocytes (protein S-100) to evaluate the quantitative differences in the vasculostromal fraction: the expression quantitative of CD34 shows no significant differences; CD146 expression is significantly increased in the tissue derivative.

Poiché CD146 è co-espresso da cellule endoteliali e periciti mentre CD34 è un marker della differenziazione di cellule endoteliali, questi risultati indicano che i periciti (cellule mesenchimali che si suppone abbiano le proprietà delle cellule staminali) contribuiscono in modo significativo all'incremento dell'espressione di CD146 rilevata nel derivato tessutale. Since CD146 is co-expressed by endothelial cells and pericytes while CD34 is a marker of endothelial cell differentiation, these results indicate that pericytes (mesenchymal cells that are supposed to have the properties of stem cells) contribute significantly to the increase in CD146 expression detected in the tissue derivative.

In accordo con questa osservazione, il trattamento tramite il dispositivo decritto in WO 2011/145075 incrementa l'espressione di ASMA, un marker delle cellule murali. In accordance with this observation, treatment by the device described in WO 2011/145075 increases the expression of ASMA, a marker of mural cells.

Il numero di cellule che esprimono la proteina S-100 è simile nel lipoaspirato e nel derivato tissutale . The number of cells expressing the S-100 protein is similar in the lipoaspirate and the tissue derivative.

Come descritto nella domanda di brevetto italiana GE2010A000057 ed internazionale WO 2011/145075, il dispositivo 1 permette di agire sul lipoaspirato tramite lievi forze meccaniche in un sistema completamente chiuso, evitando l'impiego di enzimi e qualsiasi altra sostanza, ed eliminando i problemi legati alla digestione enzimatica e la relativa manipolazione, ovvero centrifugazione separativa e raccolta sub-frazionata. As described in the Italian patent application GE2010A000057 and international patent WO 2011/145075, the device 1 allows to act on the lipoaspirate through slight mechanical forces in a completely closed system, avoiding the use of enzymes and any other substance, and eliminating the problems related to enzymatic digestion and related manipulation, i.e. separative centrifugation and sub-fractional collection.

Queste caratteristiche ossia un prodotto cellulare non espanso e minimamente manipolato consentono l'utilizzo diretto in terapia clinica, in particolare in medicina rigenerativa per applicazioni e trapianti con cellule autologhe e allogeniche. These characteristics, ie an unexpanded and minimally manipulated cellular product, allow direct use in clinical therapy, in particular in regenerative medicine for applications and transplants with autologous and allogeneic cells.

Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo o le cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, o le cellule differenziate a partire da dette cellule staminali non embrionali, secondo il metodo di preparazione della presente invenzione, possono essere usate in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici. Il derivato tissutale può essere ottenuto sia da donatori vivi che da donatori cadavere, infatti cellule vitali possono essere ottenute anche da cadaveri (≤30 ore post-mortem) . The tissue derivative obtained from adipose tissue or the non-embryonic stem cells obtained from said derivative, or the cells differentiated starting from said non-embryonic stem cells, according to the preparation method of the present invention, can be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures for the execution of autoiogenic, allogeneic or xenon gene transplants. The tissue derivative can be obtained from both live and cadaver donors, in fact viable cells can also be obtained from cadavers (≤30 hours post-mortem).

Le analisi di citometria a flusso mostrano che, dopo coltura, il numero di cellule che esprimono i marcatori per le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) sono presenti in circa l'80% della popolazione cellulare ed i dati ottenuti da tessuto di cadavere sono simili ai dati ottenuti da cellule isolate da un donatore vivente, come illustrato in figura 7. Flow cytometry analyzes show that, after culture, the number of cells expressing markers for human adipose tissue stem cells (hASCs) are present in approximately 80% of the cell population and data obtained from cadaver tissue they are similar to data obtained from cells isolated from a living donor, as illustrated in figure 7.

Secondo una prima forma esecutiva della presente invenzione il derivato tissutale sopra descritto è direttamente utilizzato sul paziente, senza ulteriori trattamenti, a scopo ricostruttivo e rigenerativo in vari contesti clinici tra cui malattie cardiovascolari , neurodegenerative, endocrine/metaboliche . According to a first embodiment of the present invention, the tissue derivative described above is used directly on the patient, without further treatments, for reconstructive and regenerative purposes in various clinical contexts including cardiovascular, neurodegenerative, endocrine / metabolic diseases.

Gli elementi staminali e multipotenti , quali perici ti e/o cellule staminali mesenchimali , contenuti all'interno del derivato tissutale potranno quindi essere trapiantati con le tecniche cliniche tradizionali e differenziarsi in specifiche cellule mantenendo e ripararando gli organi ed i tessuti in cui sono state trapiantate. The stem and multipotent elements, such as pericides and / or mesenchymal stem cells, contained within the tissue derivative can then be transplanted with traditional clinical techniques and differentiate into specific cells while maintaining and repairing the organs and tissues in which they were transplanted. .

Questa forma esecutiva prevede l'utilizzo del derivato cellulare non espanso ossia un aggregato di cellule del tessuto estratto da paziente, vivo o cadavere, che non viene messo in coltura e pertanto gli elementi cellulari (staminali e non) in esso contenuti non vengono sottoposti a proliferazione (definita anche espansione) in vitro. This embodiment provides for the use of the unexpanded cellular derivative, i.e. an aggregate of cells from the tissue extracted from the patient, alive or cadaver, which is not cultured and therefore the cellular elements (stem and non-stem cells) contained therein are not subjected to proliferation (also called expansion) in vitro.

Ad esempio il derivato tessutale può essere utilizzato in interventi di trapianto con iniezione diretta nell'area da trattare ossia può essere utilizzato ad esempio per iniezioni nel tessuto sottocutaneo, nel tessuto muscolare e nell'osso, il quale avendo natura porosa si comporta come substrato di sostegno e sviluppo del materiale cellulare iniettato: l'espansione cellulare avverrà quindi in vivo sul paziente. For example, the tissue derivative can be used in transplant operations with direct injection in the area to be treated, i.e. it can be used, for example, for injections into the subcutaneous tissue, muscle tissue and bone, which, having a porous nature, acts as a substrate for support and development of the injected cellular material: cell expansion will then take place in vivo on the patient.

In combinazione od alternativa il derivato tissutale, le cellule staminali ottenute da detto derivato o le cellule differenziate a partire da dette cellule staminali non embrionali, possono essere utilizzate per la preparazione di innesti ossia per applicazioni su supporti solidi o semisolidi biocompatibili (cosiddetti scaffolds) quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato i quali substrati possono essere successivamente utilizzati per trapianti a scopo rigenerativo di tessuti e/o organi, quale rigenerazione di derma, cartilagine, osso o strutture simili. In combination or alternatively, the tissue derivative, the stem cells obtained from said derivative or the cells differentiated from said non-embryonic stem cells, can be used for the preparation of grafts, i.e. for applications on solid or semi-solid biocompatible supports (so-called scaffolds) such as porous ceramic substrates, polymeric substrates, foils, hyaluronic gel, or lyophilized human dermis which substrates can subsequently be used for tissue and / or organ regenerative transplants, such as regeneration of dermis, cartilage, bone or similar structures.

Secondo una ulteriore forma esecutiva il derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1 oggetto del brevetto WO 2011/145075 può essere crioconservato . According to a further embodiment, the tissue derivative obtained with the device 1 object of the patent WO 2011/145075 can be cryopreserved.

Preferibilmente il passo di crioconservazione viene eseguito sul derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1. Preferably the cryopreservation step is performed on the tissue derivative obtained with the device 1.

Ovviamente è possibile prevedere che il passo di crioconservazione venga eseguito subito dopo il passo di lipoaspirazione o asportazione di materiale adiposo da donatore, paziente o cadavere, essendo possibile prevedere detto primo passo di crioconservazione in alternativa od in combinazione ad un secondo passo di crioconservazione eseguito dopo il passo di trattamento del tessuto adiposo nel dispositivo 1 sopra descritto. Obviously it is possible to provide that the cryopreservation step is performed immediately after the lipoaspiration or removal step of adipose material from the donor, patient or corpse, it being possible to provide said first cryopreservation step as an alternative or in combination with a second cryopreservation step performed after the step of treating the adipose tissue in the device 1 described above.

Il metodo oggetto della presente invenzione prevede quindi almeno un passo di posizionamento e mantenimento della componente cellulare, preferibilmente come derivato tissutale ottenuto tramite il dispositivo 1, da sola od in combinazione con un supporto di innesto, in un dispositivo che ne consente la crioconservazione. The method object of the present invention therefore provides at least one step for positioning and maintaining the cellular component, preferably as a tissue derivative obtained by means of the device 1, alone or in combination with a grafting support, in a device which allows its cryopreservation.

La temperatura di conservazione può ad esempio essere compresa tra -80°C e -180°C. The storage temperature can for example be between -80 ° C and -180 ° C.

L'analisi morfologica del derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo sopra descritto, fresco, o del derivato tissutale scongelato dopo la crioconservazione (-180 °C in presenza di DMSO) ha dimostrato un ambiente di adipociti notevolmente conservati circondato da una architettura vascolare/stromale chiaramente evidente ed intatta. The morphological analysis of the tissue derivative obtained through the method and device described above, fresh, or of the thawed tissue derivative after cryopreservation (-180 ° C in the presence of DMSO) has shown an environment of remarkably preserved adipocytes surrounded by a vascular architecture / stromal clearly evident and intact.

L'analisi dell 'immunofluorescenza ha mostrato che tale rete vascolare/stromale conteneva elementi con identità pericita/perivascolare e cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Immunofluorescence analysis showed that this vascular / stromal network contained elements with pericyte / perivascular identity and human mesenchymal stem cells (hMSC).

Al contrario, l'analisi immunoistochimica del lipoaspirato raccolto dai medesimi pazienti e non sottoposto al trattamento con il dispositivo 1 come sopra descritto ha dimostrato uno squilibrio largamente distribuito della citoarchitettura con la scomparsa della rete stromale vascolare nella maggior parte dei campi esaminati. On the contrary, the immunohistochemical analysis of the lipoaspirate collected from the same patients and not subjected to the treatment with the device 1 as described above showed a widely distributed imbalance of the cytoarchitecture with the disappearance of the vascular stromal network in most of the fields examined.

E' stata altresì eseguita un'analisi di citometria a flusso della composizione cellulare del derivato tissuale. A flow cytometric analysis of the cellular composition of the tissue derivative was also performed.

Il derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo descritto nel brevetto WO 2011/145075 fresco, il derivato precedentemente immagazzinato a 4°C per 24 h, o il derivato scongelato dopo 7 giorni di crioconservazione a The tissue derivative obtained through the method and the device described in the patent WO 2011/145075 fresh, the derivative previously stored at 4 ° C for 24 h, or the derivative thawed after 7 days of cryopreservation at

180°C sotto azoto liquido, sono stati trattati attraverso la digestione delle collagenasi per il rilascio della frazione vasculo-stromale e per la rimozione degli adipociti. 180 ° C under liquid nitrogen, were treated through the digestion of collagenases for the release of the vasculo-stromal fraction and for the removal of adipocytes.

In tutti i campioni, si è osservata una vitalità cellulare prossima al 100%, come dedotto tramite il test di esclusione del colorante blu tripano, senza nessuna variazione tra ciascun gruppo. In all samples, cell viability close to 100% was observed, as inferred by the trypan blue dye exclusion test, with no variation between each group.

La figura 3 riporta i risultati delle analisi di citometria a flusso di marcatori di cellule staminali in una frazione cellulare non espansa di un lipoaspirato e nel derivato tissutale. Figure 3 reports the results of flow cytometric analyzes of stem cell markers in an unexpanded cell fraction of a lipoaspirate and in the tissue derivative.

Per l'analisi di citometria a flusso le cellule sono state incubate con 1 pg/10<6>cellule di anticorpi fluorescenti per 40 min a 4 °C al buio. For flow cytometry analysis cells were incubated with 1 pg / 10 <6> fluorescent antibody cells for 40 min at 4 ° C in the dark.

Sono stati utilizzati gli anticorpi anti-CD105, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD29 anti-CD166, anti-CD14, anti-CD34, anti-CD44, e anti-CD45. Anti-CD105, anti-CD73, anti-CD90, anti-CD29 anti-CD166, anti-CD14, anti-CD34, anti-CD44, and anti-CD45 antibodies were used.

Dopo il lavaggio, le cellule sono state analizzate su un citofluorimetro (FACSAria, BD Biosciences) raccogliendo 10.000 eventi, e i dati sono stati analizzati utilizzando il software FACSDiva (BD Biosciences). After washing, the cells were analyzed on a flow cytometer (FACSAria, BD Biosciences) collecting 10,000 events, and the data were analyzed using the FACSDiva software (BD Biosciences).

Il derivato tessutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo sopra descritto ed oggetto del brevetto WO 2011/145075 è differente in misura significativa dal lipoaspirato, non trattato con il dispositivo 1, esibendo una proporzione significativamente più alta di elementi simili a periciti identificati sulla base della marcatura doppia positiva CD34/CD146 (circa 20% nel derivato tissutale ottenuto con il dispositivo sopra descritto, meno dell' 8% nel lipoaspirato non trattato con il dispositivo sopra descritto; risultati ripetutamente osservati da sei campioni individuali) . The tissue derivative obtained through the method and the device described above and object of the patent WO 2011/145075 is significantly different from the lipoaspirate, not treated with the device 1, exhibiting a significantly higher proportion of elements similar to pericytes identified on the basis of the double positive labeling CD34 / CD146 (about 20% in the tissue derivative obtained with the device described above, less than 8% in the lipoaspirate not treated with the device described above; results repeatedly observed from six individual samples).

La positività per PDGFR-β è inferiore nel derivato tissutale ottenuto tramite il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto in confronto al lipoaspirato, un risultato che è conforme ad un declino di tale marcatore precoce nei periciti maturi. The positivity for PDGFR-β is lower in the tissue derivative obtained by the method and device 1 described above compared to the lipoaspirate, a result which is consistent with a decline of this early marker in mature pericytes.

La percentuale di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) è anch'essa maggiore nel derivato tissutale, quando confrontata con il semplice lipoaspirato . The percentage of human mesenchymal stem cells (hMSCs) is also higher in the tissue derivative, when compared with the simple lipoaspirate.

In particolare, la quantità di elementi CD90<+>/CD29<+>/CD34<”>, che identificano in modo evidente una popolazione mesenchimale, è tre volte maggiore nel derivato tissutale rispetto al lipoaspirato (circa 30% nel derivato tissutale, circa 10% nel lipoaspirato; risultati ripetutamente osservati da sei campioni individuali). In particular, the quantity of CD90 <+> / CD29 <+> / CD34 <"> elements, which clearly identify a mesenchymal population, is three times greater in the tissue derivative than in the lipoaspirate (approximately 30% in the tissue derivative, approximately 10% in lipoaspirate; results repeatedly observed from six individual samples).

La figura 4 illustra le differenze nell'espressione dei markers nel lipoaspirato non trattato e nel derivato tissutale. Figure 4 illustrates the differences in the expression of markers in the untreated lipoaspirate and the tissue derivative.

La percentuale di elementi simili a ematopoietici è significativamente ridotta nel derivato tessutale in confronto al lipoaspirato (l'espressione di CD14, CD34, e CD45 è due-tre volte minore nel derivato tessutale confrontato al lipoaspirato; risultati osservati ripetutamente da sei campioni individuali). The percentage of hematopoietic-like elements is significantly reduced in the tissue derivative compared to the lipoaspirate (the expression of CD14, CD34, and CD45 is two to three times lower in the tissue derivative compared to the lipoaspirate; results observed repeatedly from six individual samples).

Tutti questi tratti distintivi sono stati mantenuti anche nel derivato tessutale scongelato dopo la crioconservazione. All these distinctive traits were also retained in the thawed tissue derivative after cryopreservation.

Al contrario, la ripresa di elementi vitali dal lipoaspirato crioconservato è stata osservata solo saltuariamente . On the contrary, the recovery of vital elements from the cryopreserved lipoaspirate has been observed only occasionally.

Secondo la presente invenzione il derivato tessutale ottenuto con il dispositivo 1 ed il metodo sopra descritto può essere trasferito, senza manipolazioni, in un terreno di coltura per ottenere facilmente l'espansione numerica delle cellule staminali (hMSC) contenute nel derivato del tessuto adiposo . According to the present invention, the tissue derivative obtained with the device 1 and the method described above can be transferred, without manipulation, to a culture medium to easily obtain the numerical expansion of the stem cells (hMSC) contained in the adipose tissue derivative.

Il derivato tessutale può essere semplicemente trasferito senza qualsivoglia manipolazione nel terreno di coltura tessutale (α-MEM, contenente 20% FCS e antibiotici). The tissue derivative can be simply transferred without any manipulation into the tissue culture medium (α-MEM, containing 20% FCS and antibiotics).

Come illustrato in figura 5 le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) vengono precocemente rilasciate dal derivato, a partire dal secondo-terzo giorno, attaccandosi alla plastica per colture tissutali, e raggiungendo una confluenza del 70-80% in 7-10 giorni. As illustrated in Figure 5, human adipose tissue stem cells (hASCs) are early released from the derivative, starting from the second-third day, attaching themselves to the tissue culture plastic, and reaching a confluence of 70-80% in 7-10 days. .

Di conseguenza anche nell'ambito di un prodotto cellulare che deve seguire la normativa delle cGMPs (current Good Manufacturing Practice), il derivato tissutale può essere immediatamente trasferito ad un ambiente di coltura tissutale per l'espansione, mentre nello stesso ambito, un tradizionale trattamento enzimatico del lipoaspirato , e il relativo lavaggio di olio e sangue da detto lipoaspirato richiedono periodi considerevolmente più lunghi (solitamente 40-50 min per campione), prima di poter porre le cellule rilasciate nel terreno di coltura . Consequently, even in the context of a cellular product that must follow the cGMPs (current Good Manufacturing Practice) regulations, the tissue derivative can be immediately transferred to a tissue culture environment for expansion, while in the same context, a traditional treatment lipoaspirate, and the relative washing of oil and blood from said lipoaspirate require considerably longer periods (usually 40-50 min per sample), before being able to place the released cells in the culture medium.

Una ulteriore complicazione nell'utilizzo di un semplice lipoaspirato nasce anche dalle procedure GMP richieste per la separazione e scarto dei rifiuti. A further complication in the use of a simple lipoaspirate also arises from the GMP procedures required for the separation and rejection of waste.

Le cellule staminali da tessuto adiposo umano ottenute dal derivato tissutale possono essere anche facilmente espanse dal detto derivato crioconservato. Stem cells from human adipose tissue obtained from the tissue derivative can also be easily expanded from said cryopreserved derivative.

E' stato infatti dimostrato che i clusters cellulari ottenuti con il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto possono essere criopreservati come fonte di tessuto che può essere successivamente usato per isolare ed espandere numericamente le cellule staminali umane da tessuto adiposo. It has in fact been shown that the cell clusters obtained with the method and the device 1 described above can be cryopreserved as a tissue source which can subsequently be used to isolate and numerically expand human stem cells from adipose tissue.

Il derivato tissutale è stato lavato e sospeso in un mezzo per la crioconservazione (medium contenente 10% di DMSO,dimetilsolfossido) e congelato a -80°C. The tissue derivative was washed and suspended in a cryopreservation medium (medium containing 10% DMSO, dimethyl sulfoxide) and frozen at -80 ° C.

Successivamente è stato trasferito e mantenuto congelato in azoto liquido. It was then transferred and kept frozen in liquid nitrogen.

Dopo 10 giorni le cellule sono state scongelate e messe in coltura per ottenere la crescita e l'espansione di ogni cellula vitale. After 10 days the cells were thawed and cultured to achieve the growth and expansion of each viable cell.

La figura 6 illustra che dopo 10 giorni in coltura le cellule erano in grado di crescere ed espandersi numericamente a partire dal derivato tessutale crioconservato. Figure 6 illustrates that after 10 days in culture the cells were able to grow and expand numerically starting from the cryopreserved tissue derivative.

E' stato dimostrato che le cellule staminali da tessuto adiposo umano (hASCs) messe in coltura per ottenere specifiche linee cellulari (quali adipociti, osteociti, condrociti) mostrano il potenziale di sviluppo tipico delle cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs). It has been shown that human adipose tissue stem cells (hASCs) cultured to obtain specific cell lines (such as adipocytes, osteocytes, chondrocytes) show the typical development potential of human mesenchymal stem cells (hMSCs).

Al fine di indurre la differenziazione adipogenica, 10 x IO<3>cellule/cm<2>sono state messe a coltura in α-MEM addizionato con 10% FBS (siero fetale di bovino), 0,5 mM isobutil-metil xantina (IBMX), 200 μΜ indometacina, 1 mM desametasone e 10 pg/ml insulina (tutti Sigma) in camere di coltura (NUNC, Naperville, IL, USA). In order to induce adipogenic differentiation, 10 x 10 <3> cells / cm <2> were cultured in α-MEM supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 0.5 mM isobutyl-methyl xanthine ( IBMX), 200 μΜ indomethacin, 1 mM dexamethasone and 10 pg / ml insulin (all Sigma) in culture chambers (NUNC, Naperville, IL, USA).

Le cellule sono state sottoposte a coltura, sostituendo il terreno ogni 2-3 giorni. The cells were cultured, replacing the medium every 2-3 days.

Dopo 2-3 settimane di coltura le cellule contenevano lipidi neutri in vacuoli adiposi; esse sono stai fissate in formalina al 10% e colorate con soluzione oil red-0 fresco (Sigma). After 2-3 weeks of culture the cells contained neutral lipids in adipose vacuoles; they were fixed in 10% formalin and stained with fresh oil red-0 solution (Sigma).

Al fine di indurre la differenziazione osteogenica, 10 x IO<3>cellule/cm<2>sono state piastrate in camera di coltura (NUNC) in a-MEM addizionato con 10% FBS, 10 mM β-glicerofosfato, 0,2 mM acido ascorbico, e 10 nM desametasone, e messe a coltura per 3-4 settimane, sostituendo il terreno ogni 2-3 giorni. In order to induce osteogenic differentiation, 10 x 10 <3> cells / cm <2> were plated in a-MEM culture chamber (NUNC) supplemented with 10% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 0.2 mM ascorbic acid, and 10 nM dexamethasone, and cultured for 3-4 weeks, replacing the medium every 2-3 days.

Per dimostrare la differenziazione osteogenica, le colture sono state fissate e colorate con von Kossa. To demonstrate osteogenic differentiation, cultures were fixed and stained with von Kossa.

Al fine di indurre la differenziazione condrogenica, aliquote di 5 x IO<5>cellule sono state fatte precipitare in tubi conici di polipropilene in 0,5 mi di α-MEM contenente 6,25 pg/ml di insulina, 6,25 pg/ml transferrina, 6,25 pg/ml acido selenioso, 5,33 pg/ml acido linolenico, 1,25 mg/ml BSA, 0,35 mM prolina, 1 mM piruvato di sodio, 0,1 mM desametasone, 0.1 mM L-acido ascorbico-2-fosfato, addizionato con 10 ng/ml Fattore di Crescita Trasformante-p3 (TGF-p3 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). In order to induce chondrogenic differentiation, aliquots of 5 x 10 <5> cells were precipitated in conical polypropylene tubes in 0.5 ml of α-MEM containing 6.25 pg / ml of insulin, 6.25 pg / ml transferrin, 6.25 pg / ml selenious acid, 5.33 pg / ml linolenic acid, 1.25 mg / ml BSA, 0.35 mM proline, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM dexamethasone, 0.1 mM L -ascorbic acid-2-phosphate, added with 10 ng / ml Transforming Growth Factor-p3 (TGF-p3 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Questo terreno è stato sostituito ogni 3-4 giorni per 3-4 settimane. This medium was replaced every 3-4 days for 3-4 weeks.

I precipitati sono stati fissati con formalina, racchiusi in paraffina, esaminati morfologicamente e sottoposti a immunocolorazione per il collagene Tipo II, utilizzando il kit Vectastain elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) (Chemicon Int, Tamecula, CA, USA). The precipitates were formalin-fixed, paraffin-encased, morphologically examined and immunostained for Type II collagen, using the Vectastain elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) (Chemicon Int, Tamecula, CA, USA) .

La messa a coltura delle cellule alle condizioni specifiche di cui sopra ha dimostrato che le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) del derivato tissutale, ottenuto con il dispositivo 1 sopra descritto, possono essere assegnate alla differenziazione osteogenica, condrogenica e adipogenica, dimostrando quindi che possono essere differenziate nelle classiche linee cellulari di derivazione mesenchimale. Culturing the cells under the specific conditions above demonstrated that human mesenchymal stem cells (hMSCs) of the tissue derivative, obtained with the device 1 described above, can be assigned to osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation, thus demonstrating that they can be differentiated into the classic cell lines of mesenchymal derivation.

E' stato altresì dimostrato che le hMSCs contenute nel derivato tissutale presentano un notevole potenziale vasculogenico, esprimono spontaneamente un set di geni vasculogenici, incluso 11 fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), KDR, codificante per un recettore essenziale del VEGF, ed il fattore di crecita epatocitaria (HGF). It has also been shown that the hMSCs contained in the tissue derivative have a remarkable vasculogenic potential, spontaneously express a set of vasculogenic genes, including the vascular endothelial growth factor (VEGF), KDR, coding for an essential VEGF receptor, and the factor of hepatocyte growth (HGF).

La trascrizione dei geni di VEGF, KDR e HGF è significativamente maggiore nelle cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) contenute nel derivato tissutale rispetto alle cellule staminali mesenchimali umane ottenute da lipoaspirati digeriti enzimaticamente per ottenere cellule staminali (hASCs) . The transcription of VEGF, KDR and HGF genes is significantly higher in human mesenchymal stem cells (hMSC) contained in the tissue derivative compared to human mesenchymal stem cells obtained from enzymatically digested lipoaspirates to obtain stem cells (hASCs).

Come sopra descritto il derivato tissutale ottenuto con il metodo ed il dispositivo 1 descritto nel documento WO 2011/145075 può essere utilizzato in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per eseguire trapianti con cellule autologhe, allogeniche o per trapianti xenogenici. As described above, the tissue derivative obtained with the method and device 1 described in WO 2011/145075 can be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures to perform transplants with autologous, allogeneic or xenogenic cells.

Il derivato tissutale umano non espanso può essere sottoposto in modo sicuro al trapianto xenogenico in ratti sottoposti a ischemia cronica dell'arto posteriore. The unexpanded human tissue derivative can be safely subjected to xenogenic transplantation in rats subjected to chronic hind limb ischemia.

L'arteria femorale è stata legata in vivo nei ratti ed è stato tagliato un tratto dell'arteria compreso tra due legature adiacenti. The femoral artery was ligated in vivo in rats and a section of the artery between two adjacent ligatures was cut.

Il giorno seguente tale intervento, un derivato tissutale umano, raccolto 24 ore prima dai pazienti sottoposti a liposuzione, è stato iniettato tramite una siringa da insulina nell'arto ischemico sia a livello intramuscolare (muscolo gracile) che a livello sottocutaneo. The day following this operation, a human tissue derivative, collected 24 hours earlier from patients undergoing liposuction, was injected via an insulin syringe into the ischemic limb both intramuscularly (gracilis muscle) and subcutaneously.

A 7 e 14 giorni dopo tale trapianto xenogenico, è stata valutata la perfusione vascolare sia nell'arto ischemico che in quello normale opposto mediante l'aiuto di un flussometro laser doppler (Transonic System). At 7 and 14 days after this xenogenic transplant, vascular perfusion was assessed both in the ischemic limb and in the opposite normal one with the help of a Doppler laser flow meter (Transonic System).

Il trapianto di derivato tissutale xenogenico era privo di effetti collaterali, è stato ben tollerato dai ratti riceventi. Dopo 14 giorni, non si sono osservati segni di rigetto immunitario, né infiltrati infiammatori sia all'esame fisico che istologico . The xenogenic tissue derivative transplant was free of side effects and was well tolerated by the recipient rats. After 14 days, there were no signs of immune rejection, nor inflammatory infiltrates on both physical and histological examination.

Si è quindi dimostrato che il trapianto xenogenico di un derivato tissutale ottenuto con il dispositivo 1 permette un'efficiente rivascolarizzazione e il recupero funzionale. It has therefore been shown that xenogenic transplantation of a tissue derivative obtained with device 1 allows efficient revascularization and functional recovery.

Nei ratti sottoposti a ischemia cronica dell'arto inferiore e al trapianto xenogenico del derivato tissutale, la flussimetria laser Doppler ha evidenziato una riperfusione completa dell'arto, l'assenza di amputazione spontanea delle dita, e il completo recupero della mobilità delle dita, piede, e zampa così come la normalizzazione dell'elasticità e trofismo della pelle. In rats subjected to chronic ischemia of the lower limb and xenogenic transplantation of the tissue derivative, laser Doppler flowmetry revealed complete reperfusion of the limb, the absence of spontaneous amputation of the fingers, and complete recovery of the mobility of the toes, foot , and paw as well as the normalization of elasticity and trophism of the skin.

L'analisi istologica ha confermato un aumento considerevole nella rete vascolare e della densità capillare nell'arto trapiantato con detto derivato tissutale . Histological analysis confirmed a considerable increase in the vascular network and capillary density in the transplanted limb with said tissue derivative.

Una notevole proporzione di cellule vascolari (ovvero cellule muscolari lisce ed endoteliali) , così come elementi che conservano caratteristiche immunofeno tipi che distintive tipiche delle linee di perici ti, erano di origine umana. Questi ritrovati indicano un homing e un'integrazione favorevole dell'innesto dopo il trapianto. A substantial proportion of vascular cells (i.e. smooth muscle and endothelial cells), as well as elements retaining immunopheno-like characteristics typical of hazard lines, were of human origin. These findings indicate homing and favorable graft integration after transplantation.

Notevole era anche la densità della rete capillare a cui mancava l'espressione degli antigeni specifici umani, rivelando il coinvolgimento del ricevente in un circuito paracrino di rivascolarizzazione e riparazione tissutale. Also noteworthy was the density of the capillary network which lacked the expression of specific human antigens, revealing the recipient's involvement in a paracrine circuit of tissue revascularization and repair.

Un'altra caratteristica dell'arto iniettato con il derivato tisutale era la mancanza del tessuto cicatriziale . Another feature of the limb injected with the tissue derivative was the lack of scar tissue.

Al contrario, l'arto ischemico sottoposto all'iniezione di PBS non ha dimostrato un recupero spontaneo agli stessi intervalli temporali, con la totale soppressione della mobilità delle dita/piede, insieme ad aree necrotiche estese, formazione di cicatrici, e frequente auto-amputazione delle dita. In contrast, the ischemic limb subjected to PBS injection did not demonstrate spontaneous recovery at the same time intervals, with total suppression of toe / foot mobility, along with extensive necrotic areas, scar formation, and frequent self-amputation. of the fingers.

Nell'insieme, si sono riscontrati risultati sovrapponibili dopo il trapianto del derivato tissutale crioconservato. Overall, comparable results were found after transplantation of the cryopreserved tissue derivative.

Il derivato tissutale può essere ottenuto da tessuti adiposo sia di cadaveri che di donatori vivi ed è una fonte, pressoché infinita, pronta all'uso, di cellule staminali mesenchimali non embrionali da utilizzare nelle procedure ricostruttive e in medicina rigenerativa. The tissue derivative can be obtained from adipose tissues from both cadavers and live donors and is an almost infinite, ready-to-use source of non-embryonic mesenchymal stem cells to be used in reconstructive procedures and in regenerative medicine.

Il derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo può essere, in maniera rapida e veloce, utilizzato per trapianti, senza richiedere espansione cellulare e manipolazione, che lo renderebbero soggetto alla normativa restrittiva imposta dalle linee guida cGMP. The tissue derivative obtained from adipose tissue can be quickly and quickly used for transplants, without requiring cell expansion and manipulation, which would make it subject to the restrictive legislation imposed by the cGMP guidelines.

Inoltre a differenza di un lipoaspirato tradizionale, il derivato tissutale sopra descritto può essere conservato, in particolare crioconservato, senza perdere la capacità di ottenere cellule staminali mesenchimali altamente funzionali e vitali, dopo scongelamento. Furthermore, unlike a traditional lipoaspirate, the tissue derivative described above can be preserved, in particular cryopreserved, without losing the ability to obtain highly functional and viable mesenchymal stem cells, after thawing.

Anche se detto derivato tissutale, fresco o crioconservato, viene sottoposto ad espansione cellulare, la procedura per ottenere cellule multi potenti risulta essere veloce e semplice: la sola azione richiesta è infatti il trasferimento del derivato tissutale in un ambiente di coltura senza nessun passo aggiuntivo. Even if said tissue derivative, fresh or cryopreserved, is subjected to cell expansion, the procedure for obtaining multi-potent cells is quick and simple: the only action required is in fact the transfer of the tissue derivative into a culture environment without any additional step.

Il derivato tissutale posto in coltura permette di ottenere una popolazione pura di cellule staminali mesenchimali umane, non embrionali, con caratteristiche simili alle cellule staminali mesenchimali isolate da altre fonti, inclusa la capacità di differenziamento in linee osteogeniche, condrogeniche e adipogeniche. The tissue derivative placed in culture allows to obtain a pure population of human mesenchymal stem cells, non-embryonic, with characteristics similar to mesenchymal stem cells isolated from other sources, including the ability to differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic lines.

Inoltre in maniera equivalente alle cellule staminali mesenchimali ottenute da altre fonti, le cellule staminali da tessuto adiposo contenute nel derivato tissutale mantengono la capacità di esprimere un set di geni, quali VEGF, KDR e HGF, coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari . Furthermore, in a manner equivalent to mesenchymal stem cells obtained from other sources, the adipose tissue stem cells contained in the tissue derivative maintain the ability to express a set of genes, such as VEGF, KDR and HGF, involved in vasculogenesis and capillary formation.

Dette cellule possono essere differenziate in coltura in una o più linee cellulari da utilzzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenotrapianti . These cells can be differentiated in culture into one or more cell lines to be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures for the execution of autoiogenic, allogeneic or xenograft transplants.

Contrariamente ad un semplice lipoaspirato che mostra un'ampia distruzione della citoarchitettura, il derivato tissutale ottenuto con il metodo ed il dispositivo 1 sopra descritto, mostra un'architettura vasculo stromale altamente preservata, con elementi con identità di cellula pericita/perivascolare. Contrary to a simple lipoaspirate which shows a wide destruction of the cytoarchitecture, the tissue derivative obtained with the method and the device 1 described above, shows a highly preserved stromal vascular architecture, with elements with pericyte / perivascular cell identity.

Il trattamento meccanico del tessuto adiposo eseguito con il dispositivo 1 produce una popolazione di cellule staminali con tratti chiaramente distinti se comparato con un lipoaspirato semplice. Mechanical treatment of adipose tissue performed with device 1 produces a stem cell population with clearly distinct traits when compared with a simple lipoaspirate.

In particolare il dispositivo 1 permette di ottenere un derivato da tessuto adiposo pronto per il trapianto comprendente una elevata percentuale di periciti maturi e cellule staminali mesenchimali umane HMSCs, con una bassa quantità di elementi simili ad ematopoietici. In particular the device 1 allows to obtain a derivative from adipose tissue ready for transplantation comprising a high percentage of mature pericytes and human mesenchymal stem cells HMSCs, with a low quantity of elements similar to hematopoietic.

Queste caratteristiche sono mantenute inalterate anche nel derivato tissutale crioconservato. These characteristics are also maintained unchanged in the cryopreserved tissue derivative.

Il dispositivo 1, evitando l'uso di collagenasi ed altri enzimi, tipicamente utilizzati nel trattamento di un lipoaspirato, permette di mantenere inalterato l'ambiente cellulare di superficie e la composizione del glicocalice, in maniera ottimale rispetto agli ai metodi di trattamento di tessuto adiposo tradizionali basati sulla dissociazione enzimatica . The device 1, avoiding the use of collagenases and other enzymes, typically used in the treatment of a lipoaspirate, allows to maintain the surface cellular environment and the composition of the glycocalyx unaltered, in an optimal way with respect to the methods of treatment of adipose tissue. traditional based on enzymatic dissociation.

Detto derivato, le cellule staminali mesenchimali non embrionali ottenute da detto derivato o le cellule differenziate possono quindi essere usate per la preparazione di un medicamento da utilizzare in terapia cellulare per trattamenti estetici, per rimpiazzare un tessuto od un organo, o indurre o accelerare la riparazione o la rigenerazione di tessuti. Said derivative, the non-embryonic mesenchymal stem cells obtained from said derivative or the differentiated cells can therefore be used for the preparation of a medicament to be used in cell therapy for aesthetic treatments, to replace a tissue or an organ, or to induce or accelerate the repair. or tissue regeneration.

Possono ad esempio essere utilizzati per uno o più dei seguenti trattamenti e/o procedimenti: For example, they can be used for one or more of the following treatments and / or procedures:

trattamenti estetici, quali trattamento di deficit volumetrici del corpo e del volto, di miglioramento del trofismo della cute, e/o di stimolazione biologica, aesthetic treatments, such as the treatment of volumetric deficits of the body and face, improvement of the trophism of the skin, and / or biological stimulation,

- il trattamento di patologie cardiache, - the treatment of heart diseases,

- la rigenerazione del sistema nervoso, - regeneration of the nervous system,

- i procedimenti di ricostruzione tissutale, i procedimenti di rigenerazione di tessuti dentali compresi osso e gengiva, - tissue reconstruction procedures, procedures for the regeneration of dental tissues including bone and gingiva,

i procedimenti antinfiammatori e/o di immunomodulazione , anti-inflammatory and / or immunomodulation procedures,

- i procedimenti di rivascolarizzazione/crescita di nuovi vasi sanguigni, - procedures for revascularization / growth of new blood vessels,

- i procedimenti di antiapoptosi cellulare. - cellular antiapoptosis procedures.

Il detto derivato, le cellule staminali mesenchimali non embrionali ottenute da detto derivato possono anche essere utilizzate da sole od in combinazione con altre sostanze per la preparazione di un medicamento da utilizzare per l'attenuazione o l'eliminazione del dolore nei trattamenti estetici o terapeutici . The said derivative, the non-embryonic mesenchymal stem cells obtained from said derivative can also be used alone or in combination with other substances for the preparation of a medicament to be used for the alleviation or elimination of pain in aesthetic or therapeutic treatments.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di un medicamento da utilizzare in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive caratterizzato dal fatto che prevede la preparazione di un derivato tissutale comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , o la preparazione di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato, essendo detto derivato o dette cellule staminali non embrionali utilizzate per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, detta preparazione del derivato tissutale prevede i seguenti passi: - riduzione del detto tessuto adiposo ottenuto da donatore vivo o donatore cadavere, costituito da una componente fluida, comprendente almeno una componente oleosa ed una componente ematica, e da una componente solida comprendente strutture vasculostromali, frammenti cellulari e/o uno o più macroagglomerati cellulari di dimensioni eterogenee tra loro e comprendenti cellule staminali e multipotenti, in agglomerati cellulari di dimensioni minori rispetto alle dimensioni dei detti macroagglomerati , in modo tale che detti agglomerati cellulari e/o vasculo-stromali abbiano dimensioni pari o minori rispetto ad un determinato valore, e in modo tale che dette dimensioni siano mediamente uguali tra loro, lavaggio con soluzioni sterili del tessuto adiposo ridotto ed emulsione delle componenti fluide del tessuto adiposo sottoposto a riduzione delle dimensioni dei macroagglomerati cellulari, essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti meccanicamente tramite un dispositivo (1) provvisto al suo interno di mezzi di riduzione quale una rete od una serie di lamine o fili taglienti (101,102) e mezzi di generazione di una emulsione quali sfere (103) o simili, ed essendo detti passi di riduzione, lavaggio ed emulsione eseguiti in condizioni di assenza di aria all'interno di detto dispositivo (1). CLAIMS 1. Method for the preparation of a drug to be used in regenerative medicine and in reconstructive procedures characterized in that it involves the preparation of a tissue derivative comprising a vascular-stromal fraction enriched with stem and multipotent elements of non-embryonic origin, such as pericytes and / o mesenchymal stem cells, or the preparation of non-embryonic stem cells obtained from said derivative, being said derivative or said non-embryonic stem cells used for the execution of autoiogenic, allogeneic or xenogenic transplants, said preparation of the tissue derivative involves the following steps: - reduction of said adipose tissue obtained from live donor or cadaver donor, consisting of a fluid component, comprising at least one oily component and a blood component, and of a solid component comprising vasculostromal structures, cell fragments and / or one or more cellular macro-agglomerates of heterogeneous dimensions between them and including stem and multipotent cells, in cellular agglomerates smaller than the size of said macroagglomerates, so that said cellular and / or vascular-stromal agglomerates have dimensions equal to or smaller than a given value, and in so that said dimensions are on average equal to each other, washing with sterile solutions of the reduced adipose tissue and emulsion of the fluid components of the adipose tissue subjected to a reduction in the size of the cellular macroagglomerates, the reduction, washing and emulsion steps being performed mechanically by means of a device (1) provided internally with reduction means such as a net or a series of blades or cutting wires (101,102) and means for generating an emulsion such as spheres (103 ) or the like, and the reduction, washing and emulsion steps being performed in conditions of absence of air inside said device (1).

2. Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di crioconservazione del derivato tissutale. 2. Method according to claim 1 characterized in that it provides a cryopreservation step of the tissue derivative.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzato dal fatto che prevede un passo di espansione numerica cellulare, in particolare degli elementi staminali e multipotenti compresi nel derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo aspirato e trattato con detto dispositivo (1), ossia del derivato fresco, o scongelato, dopo il passo di crioconservazione, essendo detto passo di espansione numerica delle cellule staminali e multipotenti eseguito su terreno di coltura. 3. Method according to claim 1 or 2 characterized in that it provides a step of cellular numerical expansion, in particular of the stem and multipotent elements included in the tissue derivative obtained from aspirated adipose tissue and treated with said device (1), i.e. of the fresh derivative , or thawed, after the cryopreservation step, being said step of numerical expansion of stem and multipotent cells performed on culture medium.

4. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede il passo di differenziazione in vitro di dette cellule staminali non embrionali in una o più linee cellulari quali adipociti, osteociti, condrociti. 4. Method according to one or more of the preceding claims characterized in that it provides for the in vitro differentiation step of said non-embryonic stem cells into one or more cell lines such as adipocytes, osteocytes, chondrocytes.

5. Metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni caratterizzato dal fatto che prevede l'applicazione di detto derivato tissutale o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, su supporti solidi o semisolidi biocompatibili, quali substrati porosi ceramici, substrati polimerici, lamine, gel ialuronico, o derma umano liofilizzato, la quale applicazione avviene in vitro su substrati successivamente impiantati su paziente o su substrati già innestati in vivo su paziente. 5. Method according to one or more of the preceding claims characterized in that it provides for the application of said tissue derivative or of non-embryonic stem cells obtained from said derivative or of cells differentiated from said non-embryonic stem cells, on solid or semi-solid biocompatible supports, such as porous ceramic substrates, polymeric substrates, foils, hyaluronic gel, or lyophilized human dermis, which application takes place in vitro on substrates subsequently implanted on the patient or on substrates already grafted in vivo on the patient.

6. Derivato tessutale comprendente una frazione vasculo-stromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , ottenuto da trattamento di tessuto adiposo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5. 6. Tissue derivative comprising a vascular-stromal fraction enriched with stem and multipotent elements, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells, obtained from the treatment of adipose tissue according to one or more of the preceding claims 1 to 5.

7. Vettore cellulare per il trasferimento nel tessuto di paziente in vivo di elementi staminali e multipotenti di origine non embrionale, quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali caratterizzato dal fatto che detto vettore è costituito da un derivato tissutale ottenuto secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5. 7. Cell vector for the transfer into patient tissue in vivo of stem and multipotent elements of non-embryonic origin, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells, characterized in that said vector consists of a tissue derivative obtained according to one or more of the above claims 1 to 5.

8. Vettore cellulare secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che dette cellule staminali mesenchimali non embrionali esprimono in situ sul paziente un set di geni coinvolti nella vasculogenesi e formazione di capillari, quali geni per il fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF), per il fattore di crescita epatocitaria (HGF), gene KDR codificante per un recettore essenziale del VEGF. 8. Cell vector according to claim 7 characterized in that said non-embryonic mesenchymal stem cells express in situ on the patient a set of genes involved in vasculogenesis and capillary formation, such as genes for the vascular endothelial growth factor (VEGF), for the hepatocyte growth factor (HGF), the KDR gene encoding an essential VEGF receptor.

9. Uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive, di un derivato tissutale ottenuto da tessuto adiposo e comprendente una frazione vasculostromale arricchita di elementi staminali e multipotenti , quali periciti e/o cellule staminali mesenchimali , o di cellule staminali non embrionali ottenute da detto derivato o di cellule differenziate da dette cellule staminali non embrionali, per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xeno genici, essendo detto derivato, dette cellule staminali non embrionali o dette cellule differenziate ottenute con il metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5. 9. Use, in regenerative medicine and in reconstructive procedures, of a tissue derivative obtained from adipose tissue and comprising a vasculostromal fraction enriched with stem and multipotent elements, such as pericytes and / or mesenchymal stem cells, or of non-embryonic stem cells obtained from said derivative or of cells differentiated from said non-embryonic stem cells, for the execution of autoiogenic, allogeneic or xenogenic transplants, being said derivative, said non-embryonic stem cells or said differentiated cells obtained by the method according to one or more of the preceding claims from 1 to 5.

10. Uso, in medicina rigenerativa ed in procedure ricostruttive di un medicamento per l'esecuzione di trapianti autoioghi, allogenici o xenogenici, essendo detto medicamento ottenuto con il metodo secondo una o più delle precedenti rivendicazioni da 1 a 5.10. Use, in regenerative medicine and in reconstructive procedures, of a medicament for carrying out autoiogenic, allogeneic or xenogenic transplants, said medicament being obtained with the method according to one or more of the preceding claims 1 to 5.