ITFI20010114A1 - Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla - Google Patents
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Description
Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
Glicopeptidi, loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a glicopeptidi formati da 11 - 24 amminoacidi capaci di identificare anticorpi nella sclerosi multipla e quindi utili come mezzi diagnostici o per il trattamento terapeutico di detta patologia.
Stato dell'arte
La sclerosi multipla (SM) è una malattia demielinizzante infiammatoria del sistema nervoso centrale altamente invalidante e quindi di elevato impatto sociale. Essa causa la degradazione della materia bianca del sistema nervoso centrale (mielina) portando a gravi danni nella trasmissione del segnale nervoso.
L’eziopatogenesi della malattia non è stata ancora chiarita in modo definitivo, ma si ipotizza che un processo autoimmune diretto contro le principali proteine mieliniche sia un importante meccanismo patogenico della malattia. Il danno alla mielina è molto probabilmente dovuto ad un’azione sinergica della risposta cellulare T e della risposta anticorpale contro proteine e glicoproteine mieliniche. In particolare gli autoanticorpi possono giocare un ruolo chiave nell’attivazione dei macrofagi, nella demielinizzazione, e nel blocco della conduzione nervosa.
In un precedente studio [A.M. Papini et al., Proceedings of thè 10<th >International Congress of Immunology, Monduzzi Editore, International Proceeding Division Bologna, Italy (1998), pp. 1239-1244] è stata dimostrata la possibilità di identificare anticorpi nella SM specifici per mezzo di un peptide glicosilato costituito dalla sequenza di 21 amminoacidi della glicoproteina oligodendrocitica della mielina (MOG) (dalla posizione 30 alla 50), e indicato dalla formula Asn<31>(Glc)hMOG(30-50).
E’ evidente l'interesse a sviluppare nuovi peptidi glicosilati capaci di svolgere la funzione di identificazione degli anticorpi suddetti con maggiore efficienza e quindi utilizzabili sia per la diagnosi che per il trattamento della sclerosi multipla.
Sommario dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce a glicopeptidi di 11 - 24 amminoacidi contenenti un tetrapeptide di formula (I):
X-Asn(G)-Y-Z (I)
in cui:
X = amminoacido portante un gruppo amminico o carbossilico sulla catena laterale;
Y = Pro, Gly;
G è uno zucchero
Z = Ala, Val, Ile, His
Descrizione dettagliata dell’invenzione
E’ stato ora sorprendentemente trovato, ed è un oggetto della presente invenzione, che glicopeptidi corti, costituiti da 11 - 24 amminoacidi, contenenti il tetrapeptide come sopra definito svolgono un’azione di riconoscimento molto efficace degli anticorpi tipici della SM e sono quindi utili per la sua diagnosi o il suo trattamento terapeutico.
Preferiti secondo la presente invenzione sono glicopeptidi di formula (II):
A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II)
in cui:
Y e G sono come sopra definiti;
A = 2 - 5 amminoacidi o assente
B e C = amminoacidi trifunzionali formanti fra loro un ponte lattamico tramite le rispettive catene laterali o assenti;
D = 5 - 15 amminoacidi;
X = Giu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
Z = Ala, Val, Ile, His.
Per amminoacidi trifunzionali formanti fra loro un ponte lattamico come sopra definiti si intendono, ad esempio le coppie Dap-Asp o Asp-Dap, Dab-GIu o Glu-Dab, Orn-Asp o Asp-Orn e quelle formate da altri amminoacidi, ad esempio non naturali, aventi analoghe caratteristiche. Per zucchero si intende preferibilmente: mono e disaccaridi del tipo Glc, ecc.
Per amminoacidi, quando non diversamente definiti, si intendono amminoacidi naturali o non naturali.
Ovviamente i residui A, se presente, e D possono contenere un opportuno spaziatore alchilico per allungare la catena ove per spaziatori alchilici, nel senso qui utilizzato, si intendono co-amminoacidi a catena alchilica lineare ove n è 2 - 6.
Come si può notare la presenza del tetrapeptide di formula (I), come sopra definito, può indurre un ripiegamento nella conformazione del peptide che può perciò assumere una forma “ad uncino" (quando il tetrapeptide è presente nella parte terminale del peptide) o “a forcina" (quando il tetrapeptide è presente nella parte centrale del peptide). Queste conformazioni consentono un’ottimale legame degli autoanticorpi dei pazienti, fatto questo che è essenziale per le inaspettate proprietà dei peptidi secondo l'invenzione.
Particolarmente preferiti secondo l’invenzione sono i peptidi rappresentati dalle seguenti sequenze:
1 .
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
I peptidi come sopra definiti possono inoltre contenere un gruppo -HN- in C-terminale (ove n = 2-6) in modo da consentirne l’aggancio ad una resina come richiesto per il loro utilizzo pratico in diagnostica o per il trattamento terapeutico.
I peptidi secondo l’invenzione si possono preparare secondo le metodiche note per sintesi in fase solida o liquida.
Particolarmente utile risulta la tecnica in fase solida, ben nota agli esperti dell'arte, in base alla quale il residuo C-terminale è legato covalentemente ad un’opportuno supporto solido, ad esempio polistirene (resina di Wang), polistirene-poliossietilene (resina Tentagel o PEG-PS) oppure copolimeri di glicol polietilenico e poliacrilamide (resina PEGA), ed i successivi amminoacidi sono aggiunti sequenzialmente, tramite acilazione del gruppo amminico del residuo legato alla resina, ad es. tramite l’anidride simmetrica deN’amminoacido entrante, opportunamente protetto, ove necessario, sulla catena laterale. Al termine della sintesi il peptide grezzo è ottenuto per trattamento della resina con un opportuno acido, ad es. acido fluoridrico o trifluoroacetico, e separato per precipitazione da etere etilico e successiva liofilizzazione, il peptide è infine purificato ricorrendo a tecniche cromatografiche, quale ad es. HPLC preparativa. E’ inoltre possibile mantenere il peptide sintetico legato al supporto solido (ad es., polistirene-poliossietilene resina Tentagel o PEG-PS), procedendo alla deprotezione selettiva delle catene laterali con un opportuno reagente.
Alternativamente, sempre secondo tecniche note, si procede all’attacco dei peptidi agli opportuni supporti in modo da formare i corrispondenti coniugati utilizzabili praticamente in diagnostica o in terapia. I supporti preferiti a questo scopo includono le resine insolubili in acqua e completamente compatibili con fluidi organici come: il gel di silice, la cellulosa, il poliacrilato, il sefarosio ed analoghi, nonché le stesse resine normalmente utilizzate dagli esperti dell'arte per la preparazione di peptidi sintetici, quali esempio la resina di Wang, polistirenepoliossietilene (resina Tentagel o PEG-PS) oppure copolimeri di glicol polietilenico e poliacrilamide (completamente compatibili con acqua) tipo resina PEGA e analoghe più stabili quali POEPS (poliossietilenepolistirene), POEPOP (poliossietilene-poliossipropilene), così come resine macroporose descritte per il loro interesse per la glicosilazione in fase solida di peptidi, quali ad esempio SPOCC (PEG sostituito con ossetano) [Rademann, J; Grotli, M; Meldal, M; and Bock, K. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121 , 5459-5466] o suoi derivati tipo EXPO3000 (copolimero con tetrakis-[4-(3-metil-ossetan-3-ylmetil)-fenil]-silano) [Tornee, C.W.; and Meldal M. In: Peptides 2000, J. Martinez and J.A. Fehrentz (Eds.) EDK, Paris, France 2001].
Qui di seguito si riporta, a titolo esemplificativo, la preparazione di alcuni peptidi secondo l'invenzione.
Esempio 1. Sintesi di un peptide lineare
Preparazione di H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
La resina Fmoc-Lys(Boc)-NovaSyn (0.5 g, 0.11 mmol/g) è stata fatta rigonfiare in DMF per 1 h a temperatura ambiente ed impaccata in una colonna di vetro (150 x 15 mm) di un sintetizzatore semiautomatico a flusso continuo. Dopo deprotezione del gruppo amminico presente sulla resina con una soluzione di piperidina al 20% in DMF, per l'inserimento di ogni amminoacido è stata caricata in colonna una soluzione contenente Fmoc-amminoacido (2.5 eq., 0.137 mmol) sciolti in DMF (1.3 mi), e come reagenti attivanti HOBt (2.5 eq, 0.137 mmol), TBTU (2.5 eq, 0.137 mmol) e NMM (3.75 eq, 0.205 mmol).
Nell'ordine sono stati utilizzati i seguenti amminoacidi:
I ) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
I I ) Fmoc-Ser(tBu)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OH
glucopiranosil)-L-Asn-OPfp)
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH-17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH-20) Fmoc-Thr(tBu)-OH
Completata la sintesi, la resina è stata deprotetta con piperidina al 20% in DMF, filtrata, lavata con DMF, DCM ed etere, infine è stata essiccata sotto vuoto. Il peptide grezzo è stato ottenuto per trattamento della resina con una miscela di TFA/fenolo/anisolo/etanditiolo (94:2:2:2) (10 mi), mantenuta sotto agitazione per 30 min a 0 °C ed a temperatura ambiente per 1.5 h. La resina è stata filtrata e lavata con TFA ed il filtrato concentrato a metà volume sotto vuoto. Il peptide è stato precipitato per trattamento con etere a freddo. Il precipitato ottenuto è stato liofilizzato recuperando 112 mg di peptide grezzo.
La deacetilazione è stata ottenuta aggiungendo goccia a goccia una soluzione di NaOMe 0.1 M in MeOH, fino a pH = 12, ad una soluzione del peptide in MeOH anidro (15 ml) mantenuta sotto agitazione inl atmosfera di azoto. La soluzione di NaOMe era stata preparata aggiungendo sodio metallico (270 mg in ligroina, 117mmol) a MeOH distillato (11 ml) in atmosfera di azoto. Dopo 1 h alla miscela è stato aggiunto ghiaccio secco fino a neutralità. La soluzione è stata concentrata ottenendo il peptide grezzo, che è stato purificato tramite HPLC semipreparativa ( purezza HPLC superiore al 97%).
Caratterizzazione: ESI-MS: trovato: [M+3H]3+ m/z = 869.9, [M+2H]2+ m/z = 1304.2; calcolato: PM monoisotopico = 2605.38.
Gli altri peptidi lineari sono stati preparati seguendo la stessa metodica, ma utilizzando i necessari amminoacidi nell'opportuna sequenza.
Esempio 2. Sintesi di un peptide ciclico.
Preparazione di H-Thr-Pro-Arg-Val-ciclo[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
La resina TentaGel SPHB-Lys(Boc)-Fmoc (1.00 g, 0.22 mmol/g) è stata trattata come descritto nell’esempio 1. Per ogni accoppiamento sono stati utilizzati 4 eq di Fmoc-amminoacidi (0.88 mmol) sciolti in DMF (1.3 mi), e come reagenti attivanti HOBt (4 eq, 0.88 mmol) e TBTU (4 eq, 0.88 mmol,) e NMM (6 eq, 1.68 mmol,).
Nell’ordine sono stati utilizzati i seguenti amminoacidi:
1 ) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11 ) Fmoc-Asp(OAII)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OFI
14) Fmoc-Asn(Glc)-OPfp
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Dap(Alloc)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OFI
20) Fmoc-Thr(tBu)-OFI
Completata la sintesi, sono stati eliminati selettivamente i gruppi protettori allilici dalle catene laterali di Dap e Asp per trattamento con una soluzione di Pd(PPh3)4 (3 eq) in 7.5 mi di CHCI3/AcOH/ NMM 37:2:1 in atmosfera di Argon. La miscela di rezione è stata lasciata sotto agitazione al braccio meccanico per 3h a temperatura ambiente. La resina è stata quindi filtrata e lavata 3 volte con una soluzione di DIPEA 0.5 % in DMF, 3 volte con una soluzione di dietilcarbammato di Na 0.05% in DMF, 3 volte con DMF e 3 volte con DCM.
Per la successiva reazione di ciclizzazione, la resina è stata fatta rigonfiare in beuta in DMF per 1 h. E’ stata quindi aggiunta NMM (4 eq.) e dopo 10 minuti, PyBOP (4 eq.). La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione al braccio meccanico per 3 giorni a temperatura ambiente. La resina è stata filtrata e lavata più volte con DMF, DCM e Et20 e infine seccata sotto vuoto.
Successivamente, la resina è stata deprotetta da Fmoc con piperidina al 20% in DMF, procedendo poi al distacco del peptide ed al suo isolamento esattamente come descritto all’esempio 1 .
Esempio 3. Sintesi di un peptide legato alla resina.
Preparazione di H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-(βAla)3-PEG-PS
La resina base PEG-PS, in forma amminica (1 g, 0.09 eq) è stata fatta rigonfiare in DMF per 1 h a temperatura ambiente ed impaccata in una colonna di vetro (150 x 15 mm) di un sintetizzatore semiautomatico a flusso continuo. Per l’accoppiamento del primo amminoacido è stata caricata in colonna una soluzione contenente Fmoc- βAla-OH (4 eq., 0.36 mmol) sciolti in DMF (1.5 mi), e come reagenti attivanti HOBt (4 eq., 0.36 mmol), TBTU (4 eq., 0.36 mmol) e NMM (6 eq, 0.54 mmol). La reazione procede per 1 h e successivamente, dopo gli opportuni lavaggi, si procede alla deprotezione della funzione amminica, per trattamento con piperidina al 20% in DMF. Si ripete il ciclo di accoppiamento di βAla per altre due volte e quindi si procede con le stesse modalità ad accoppiare un residuo di Fmoc-Lys(Boc)-OH. Successivamente si procede alla costruzione dell'intera sequenza peptidica, esattamente come indicato nell’esempio 1. Dopo l’ultimo trattamento con piperidina, il peptide-resina viene deprotetto per trattamento con una miscela di TFA/fenolo/anisolo/etanditiolo (94:2:2:2) (10 ml), sotto agitazione per 30 min a 0 °C ed a temperatura ambiente per 1.5 h, lavato accuratamente e seccato a pressione ridotta.
Esempio 4. Coniugazione di un peptide alla resina.
Un peptide libero, lineare oppure ciclico, preparato come descritto negli esempi 1 e 2, rispettivamente, è coniugato alla resina sefarosio preattivata con CNBr, secondo gli usuali protocolli di reazione consigliati dalla ditta produttrice in modo da ottenere la coniugazione resina-peptide. Il prodotto così ottenuto è utilizzabile tal quale ad esempio per la preparazione di piastre per la diagnosi o il trattamento di pazienti affetti da SM [vedi anche qui di seguito].
Uso diagnostico
Per uso diagnostico i glicopeptidi oggetto della invenzione sono diluiti e adsorbiti a plastiche leganti in pozzetti di piastre per microtitolazione (sistemi ELISA). Il siero o plasma dei pazienti viene quindi aggiunto in una serie di concentrazioni (diluizioni) diverse. L’autoanticorpo specifico per i nostri prodotti si lega al peptide adsorbito alla plastica. Secondo la tecnica nota agli esperti deN’arte, ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay), le molecole di autoanticorpi legate ai glicopeptidi vengono quindi evidenziate con il legame di opportuni anticorpi rivelatori aggiunti alle piastre ELISA che riconoscono il frammento costante delle immunoglobuline. Tali anticorpi rivelatori, in quanto coniugati con opportuni enzimi, possono essere rivelati mediante una reazione colorimetrica: l’assorbanza sviluppata è proporzionale alla quantità di autoanticorpi specifici legati. Quantitativamente il risultato è espresso come titolo anticorpale, definito come il reciproco della diluizione a cui non si osserva più reazione.
Il titolo anticorpale, come sopra definito, è stato misurato in diversi pazienti affetti da Sclerosi multipla; i glicopeptidi secondo l’invenzione hanno rivelato titoli di anticorpi più elevati rispetto a quelli misurati con i glicopetidi noti.
Uso terapeutico
I peptidi secondo l'invenzione, in forma libera oppure legati alle opportune resine, possono essere utilizzati per il trattamento di pazienti affetti da sclerosi multipla in quanto, grazie alla loro elevata specificità di riconoscimento anticorpale, possono essere utilizzati per neutralizzare e/o allontanare selettivamente gli autoanticorpi.
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Glicopeptidi costituiti da 11 - 24 amminoacidi contenenti un tetrapeptide di formula (I):in cui: X = amminoacido portante un gruppo amminico o carbossilico sulla catena laterale ; Y = Pro, Gly; G = zucchero Z = Ala, Val, Ile, His 2. Glicopeptidi secondo la rivendicazione 1 in cui gli amminoacidi sono gli amminoacidi naturali o amminoacidi non naturali. 3. Glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 e 2 di formula (II):in cui: Y e G sono come sopra definiti; A è un gruppo di 2 - 5 amminoacidi o è assente; B e C sono amminoacidi trifunzionali capaci di formare tra loro un ponte lattamico tramite le rispettive catene laterali o sono entrambi assenti; D rappresenta un gruppo di 5 - 15 amminoacidi; X è un amminoacido scelto nel gruppo costituito da: Giu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap; Z è un amminoacido scelto nel gruppo costituito da: Ala, Val, Ile, His. 4. Glicopeptidi secondo la rivendicazione 3 in cui B e C rappresentano le coppie: Dap-Asp o Asp-Dap, Dab-GIu o Glu-Dab, Orn-Asp o Asp-Orn e quelle formate da altri amminoacidi, aventi analoghe caratteristiche. 5. Glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 4 in cui lo zucchero è scelto nel gruppo costituito da mono- e disaccaridi quali β-D-glucopiranosile (Glc), 2-acetilglucosammina (GIcNAc), cellobiosio e analoghi. 6. Glicopeptidi secondo la rivendicazione 5 in cui lo zucchero è β-D-glucopiranosile (Glc), 7. Glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 6 rappresentati dalle formule seguenti:8. Glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 7 contenenti, in posizione non terminale, uno spaziatore alchilico 9. Glicopeptidi secondo la rivendicazione 8 in cui detto spaziatore alchilico è un gruppo di formula ove n è compreso fra 2 e 6. 10. Glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 9 contenenti inoltre un gruppo H in C-terminale ove n è compreso fra 2 - 6. 1 1 . Processo per la preparazione in fase solida di glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 10 in cui. a) il residuo C-terminale è legato covalentemente ad un’opportuno supporto solido; b) i successivi amminoacidi sono aggiunti sequenzialmente, tramite acilazione del gruppo amminico del residuo legato alla resina; c) il peptide grezzo è raccolto per trattamento della resina con un opportuno acido; d) il peptide è purificato ricorrendo a tecniche cromatografiche; e) il peptide è eventualmente attaccato ad un opportuno supporto solido. 12. Processo secondo la rivendicazione 11 in cui il supporto solido dello stadio (a) è scelto nel gruppo costituito da: gel di silice, la cellulosa, il poliacrilato, il sefarosio ed analoghi, polistirene (resina di Wang), polistirene-poliossietilene (resina Tentagel o PEG-PS), copolimeri di glicol polietilenico e poliacrilamide (resina PEGA), POEPS (poliossietilene-polistirene), POEPOP (poliossietilenepoliossipropilene), SPOCC (PEG sostituito con ossetano) o suoi derivati. 13. Processo secondo la rivendicazione 12 in cui il supporto solido dello stadio (e), se presente, è scelto nel gruppo costituito da: gel di silice, cellulosa, poliacrilato, sefarosio. 14. Coniugati costituiti da una resina insolubile in acqua e completamente compatibile con fluidi organici ed un glicopeptide secondo le rivendicazioni 1 - 10. 15. Coniugati secondo la rivendicazione 14 in cui la resina è sefarosio, cellulosa e gel di silice. 16. Piastre per diagnosi contenenti i glicopeptidi secondo le rivendicazioni 1 - 10. 17. Metodo diagnostico in cui si utilizzano i glicopeptidi liberi secondo le rivendicazioni 1 - 10. 18. Metodo diagnostico in cui si utilizzano i coniugati secondo le rivendicazioni 14 e 15.
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