ITCS20080019A1 - Molecola naturale estratta da un agrume, processo di estrazione e uso farmaceutico - Google Patents
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Description
Molecola naturale estratta da un agrume, processo di estrazione e uso farmaceutico Campo della tecnica dell’invenzione.
La presente invenzione riguarda una nuova molecola estratta da un agrume, in particolare dal bergamotto, il processo di estrazione e il suo uso come farmaco anti-colesterolemico.
Stato dell’arte
I flavonoidi sono presenti in maniera massiccia nelle specie vegetali, e possiedono doti nutrizionali e farmaceutiche notevoli; nel secolo scorso, studi epidemiologici hanno dimostrato che il consumo a lungo termine di vegetali e frutta offre una notevole protezione nei confronti di malattie croniche, come ad esempio il cancro.<1-7>Poichè la produzione incontrollata di radicali liberi è implicata nell’insorgenza del cancro,<8-11>si è focalizzata l’attenzione sul possibile ruolo dei nutrienti di questo tipo di dieta come soppressori e/o spazzini di radicali.<12-15>
Studi più recenti suggeriscono che l’assunzione di flavonoli e flavoni, o altri flavonoidi ha un effetto protettivo contro malattie vascolari o alcuni tipi di cancro.<16-26>
Nel documento US2008031861 è descritto un integratore che per abbassare il colesterolo in una persona utilizza un integratore contenente un flavonoide ed un enzima.
CN101073610 descrive un processo per ottenere dal biancospino sali organici acidi di calcio contenenti flavonoidi che possono essere usati per abbassare il colesterolo.
In US2006182823 viene descritto un metodo per estrarre componenti flavonoidi ed alcaloidi da foglie di loto.
Sommario della presente invenzione
La presente invenzione riguarda l’isolamento e la determinazione strutturale di alcuni composti presenti negli agrumi e particolarmente nel frutto della specie Bergamia appartenente al genere Citrus (Bergamotto). Essi sono presenti in quantità rilevanti (ca. 300-500 mg/kg) nelle diverse parti del frutto e appartengono alla classe dei flavonoidi. La caratteristica principale di questi nuovi composti è la presenza nella molecola del gruppo 3-idrossi-3-metil glutarile (HMG) sotto forma di estere sulla porzione zuccherina della molecola (schema 1).
Schema 1
Il gruppo HMG, presente nelle nuove molecole individuate, ha un ruolo fondamentale nella biosintesi del colesterolo, infatti esso, in vivo, viene biosintetizzato attraverso una serie di reazioni enzimatiche. Uno di questi passaggi chiave prevede la trasformazione (riduzione) dell’acido 3-idrossi-3-metil glutarico coniugato al coenzima-A (HMG-CoA) ad acido mevalonico. Normalmente per bloccare la biosintesi del colesterolo, si utilizzano farmaci denominati “statine”; questi hanno una struttura simile all’HMG-CoA e riescono a bloccare l’enzima HMG reduttasi responsabile della trasformazione (riduzione) descritta sopra. Le nuove molecole, trovate nel succo di bergamotto sono anche esse coniugate dell’HMG (Schema) e possono, quindi, inibire l’enzima reduttasi. Le prove in vitro descritte in fondo a questo abstract danno credito a questa ipotesi.
I composti sono stati isolati attraverso un procedimento estrattivo ed una separazione cromatografia. Il procedimento estrattivo consiste nell’aggiunta di una miscela di solventi (metanolo etanolo e cloroformio in rapporto volumetrico 65:30:5 (v/v/v)),ovvero gli stessi solventi puri od in diverse proporzioni, al frutto precedentemente sminuzzato in tutte le sue parti. Il preparato viene posto sotto agitazione per 2 ore. Alla fine il solvente viene filtrato e ridotto in volume fino a consistenza sciropposa. Il residuo, solubilizzato con acqua, viene sottoposto a estrazione in fase solida attraverso una cartuccia a fase inversa. La cartuccia viene prima attivata con metanolo ed acqua, poi il residuo viene versato sulla cartuccia ed eluito dapprima con acqua per rimuovere gli zuccheri e poi con metanolo o etanolo. Il residuo metanolico che contiene perlopiù flavonoidi viene evaporato a secchezza e sottoposto a separazione cromatografia. Il sistema cromatografico è un HPLC semipreparativo utilizzante una colonna in fase inversa ed un detector UV/MS oppure un sistema MPLC a fase inversa utilizzante gli stessi solventi di eluizione. Per isolare il composto si utilizza una corsa cromatografia con fase mobile acqua e metanolo o etanolo o acetonitrile. Le frazioni corrispondenti agli estratti ionici m/z 755 (composto 1) e m/z 725 (composto 2) vengono raccolte e separate dal solvente per evaporazione per ottenere i composti puri. Il composto 1 è stato caratterizzato attraverso esperimenti di spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) e risonanza magnetica ad alta risoluzione (NMR). Lo spettro HRMS in sorgente di 1 genera il picco pseudomolecolare [M+H]<+>con valore 755.2387 che corrisponde alla formula elementare C34H43O19con uno scarto di -0.80 ppm sul valore teorico. Lo spettro HRMSMS della specie [M+H]<+>genera una serie di picchi interpretabili attraverso lo schema 2.
3′′′ 3.59 (dd) 3.59 (dd)
4′′′ 3.62 (dd) 3.66 (dd)
5′′′ 3.90 (m) 3.90 (dd)
6′′′ 1.31 (d) 1.31 (d)
2′′′′ 2.65-2.52 (m) 2.65-2.52 (m)
4′′′′ 2.65-2.52 (m) 2.65-2.52 (m)
6′′′′ 1.26 (s) 1.26 (s)
La molecola è stata sottoposta a reazione di idrolisi basica per verificare l’esistenza di legami esterei. Dopo 4 ore di reazione con carbonato di sodio, si forma una specie avente ione molecolare a m/z 611. I tempi di ritenzione cromatografici del prodotto di reazione e dello standard neoesperidina, sono uguali per cui si arriva alla conclusione che il prodotto di reazione è proprio neoesperidina. La corsa mostra anche la formazione di un prodotto avente ione molecolare m/z 163, che corrisponde all’acido eliminato dalla reazione di idrolisi. Quest’ultimo prodotto viene separato tramite cromatografia preparativa e sottoposto ad esperimenti HRMS ed NMR (tabella 2), che indicano che esso corrisponde all’HMG.
Tabella 2. Dati NMR per l’acido 3-metil-3-idrossil glutarico (HMG) ottenuto dopo idrolisi basica.
<set>dati<1>H-NMR (δ (m)) dati<13>C-NMR (δ (m))
3-CH31.22 (s) 28 (q)
2,4-CH32.46 (m) 46.5 (t)
1,5-COOH 8.21 (s) 173 (s)
3-OH -- 69 (s)
Il risultato è che la molecola incognita 1 è una molecola di neosperidina coniugata attraverso un legame estereo in posizione 6 del glucosio all’HMG. La posizione del legame estereo è confermata dai dati NMR in tabella 1.
L’intera procedura viene ripetuta per il composto 2 che come risultato finale fornisce la struttura della naringina coniugata attraverso un legame estereo in posizione 6 del glucosio all’HMG.
Una volta isolate, le molecole 1 e 2 sono state sottoposte ad esperimenti in vitro per verificare il loro potenziale inibitorio del processo biosintetico di produzione del colesterolo. E’ stato utilizzato un kit enzimatico reperibile in commercio; Il kit risulta composto da: 10 ml di tampone 5x; 25 mg di NADPH, 2 ml di substrato (HMG-CoA); 200µl di HMGR (dominio catalitico) 0,55-0,65 mg/ml, 200µl di soluzione dell’inibitore Pravastatina. Il kit è progettato in modo da seguire la diminuzione di assorbanza alla lunghezza d’onda di 340 nm, che rappresenta l'ossidazione del NADPH ad opera della porzione catalitica di HMGR in presenza del substrato HMG-CoA ed eventualmente di un inibitore.
Il composto 1 già a concentrazioni di circa 300 µmol/L mostra un’inibizione dell’80% dopo 8 minuti (grafico 1)
Grafico 1
Il composto 2 nelle stesse condizioni mostra un inibizione del 75% dopo 8 minuti (grafico 2):
Grafico 2
I risultati mostrano che tutte e due le molecole derivate dell’HMG hanno una attività inibitoria simile, sebbene a concentrazioni molto maggiori, a quella delle statine utilizzate per combattere il colesterolo.
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Claims (1)
- Rivendicazioni 1. Molecola naturale estratta da un agrume caratterizzata dal fatto che la sua struttura è un flavonoide coniugato all’acido 3-idrossi-3-metil glutarile 2. Molecola naturale estratta da un agrume secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che la l’agrume è il bergamotto. 3. Molecola naturale estratta da un agrume secondo la rivendicazione 1 o 2 caratterizzata dal fatto che il flavonoide è coniugato con l’acido 3-idrossi-3-metil glutarile attraverso un legame estereo sulla porzione zuccherina della molecola. 4. Molecola naturale estratta da un agrume secondo la rivendicazione 1 o 2 o 3 caratterizzata dal fatto che il flavonoide è la neoesperidina. 5. Molecola naturale estratta da un agrume secondo la rivendicazione 1 o 2 o 3 caratterizzata dal fatto che il flavonoide è la naringina. 6. Processo di estrazione di una molecola naturale da un agrume secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui: - l’estrazione delle parti del frutto triturate viene eseguita in un solvente costituito da metanolo, etanolo e cloroformio puri od in diverse proporzioni per un tempo determinato - il filtrato è evaporato a secchezza - il residuo viene sottoposto ad estrazione in fase solida per purificare i flavonoidi dalle altre classi di composti. - La miscela di flavonoidi viene separata attraverso un sistema cromatografico HPLC preparativo. 7. Processo di estrazione di una molecola naturale da un agrume secondo la rivendicazione 6 in cui il solvente è costituito dalla miscela ternaria metanolo, etanolo e cloroformio in rapporto volumetrico 65/5/30. 8. Processo di estrazione di una molecola naturale da un agrume secondo la rivendicazione 6 in cui la miscela di flavonoidi viene separata attraverso un sistema cromatografico MPLC. 9. Uso farmaceutico di una molecola naturale estratta da un agrume secondo le rivendicazioni 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 come farmaco anti-colesterolemico.
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