IT8323028A1 - Metodo composizioni reattive adatti alla determinazione colorimetrica di metalli - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione avente per titolo:
"METODO E COMPOSIZIONI REATTIVE ADATTI ALLA DETERMINAZIONE COLORIMETRICA DI METALLI"
R iassunto
La domanda si riferisce ad una formulazione per un reattivo colorimetrico adatto, fra altre applicazioni, alla determinazione del ferro serico. Tale formulazione ? costituita da due sole soluzioni acquose una delle quali, funzionante da reattivo croniogeno, ? costituita da un tampone, un sale solubile di un metallo alcalino o alcalino terroso, cromazurolo S, un tensioattivo cationico o non ionico, l'altra, agendo da reattivo mascherante, essendo formata da un agente complessante, ed eventualmente dagli stessi componenti del reattivo croniogeno, in grado di impedire la formazione del complesso fra il cromazurolo, il tensioattivo e il ferro. L'agente complessante ? generalmente costituito da un acido organico policarbossilico e un suo sale.
Descrizione
La presente invenzione si riferisce ad un reattivo colorimetrico che permette di determinare la presenza, in fluidi di varia natura, di metalli che possono esistere in diversi stati di ossidazione, preferibilmente di quelli che possono diventare trivalenti.
Il reattivo colorimetrico,*oggetto dell'invenzione, ? particolarmente adatto alla determinazione quantitativa di metalli presenti in fluidi biologici e, fra gli altri, del ferro serico.
E' ferma convinzione della Richiedente che il reattivo descritto nelle righe seguenti, sia di impiego assolutamente generale per quanto riguarda le analisi di metalli trivalenti.
Tuttavia il grande interesse per il settore specifico della diagnosi di fluidi biologici ha costretto la Richiedente stessa a limitare l'esemplificazione e, per questo motivo, ci riferiamo, nel contesto della domanda, al solo reattivo adatto alla determinazione del ferro presente nel siero.
Sar? poi facile per gli esperti del ramo allargare la definizione del reattivo e i suoi usi, senza per? uscire dallo spirito dell'invenzione.
E' nota la possibilit? di determinare colorimetricamente il ferro (serico) mediante l'impiego di vari agenti complessanti cromogeni, o per assorbimento atomico. I complessanti cromogeni pi? in uso sono:
la Batofenantrolina sulfonata
il 3-(2-piridil)-5,6-bis-{acido 4-fenil solfonico)
la 2-4-6-Tripiridil-s-Triazina
il 2,2'-dipiridile, ecc.
I metodi che usano questi cromogeni prevedono tutti la liberazione del ferro serico dalla transferrina o mediante deproteinizzazione a pH acidi o mediante l'utilizzazione di opportuni tensioattivi.
II ferro liberato dalla transferrina viene poi ridotto allo stato ferroso da forti riducenti quali sodio ditionito, acido ascorbico etc. Il ferro ridotto viene complessato da uno dei vari reattivi cromogeni sopra elencati, formando dei complessi colorati la cui estinzione ? proporzionale alla concentrazione del ferro nel campione in esame. Horiuchi, Y e Nishida, H. (Jap. Analyst 17 (6) 756, 1968) segnalano che il cromazurolo S (C.I. 43825) in presenza di zephiramine (ammonio-benzil--dimetiltetradecil-cloruro) reagisce con il Fe (III) per formare un chelato colorato con un coefficiente di estinzione molare di circa
Recentemente A. Garcic "Clin. Chim. Acta 94, 115-119 (1979)" ha proposto un cromogeno assai sensibile per la determinazione del ferro-ferrico nel siero senza deproteinizzazione. Nel metodo descritto dall'autore viene impiegato il Cromazurolo B (C.I. 43830) in presenza di Cetiltrimetil-ammonio bromuro (CTMA).
Il coefficiente di estinzione molare del complesso Cromazurolo B-CTMA-Fe (III/II) a 630 nm ? stato indicato essere
Lo stesso autore, facendo, riferimento ai lavori di Horiuchi e Nishida, sostiene preferibile l'uso del Cromazurolo B al Cromazurolo S in quanto il primo ? pi? sensibile e mostra interferenze minori da parte degli altri componenti del siero.
A nome della stessa Richiedente esiste una domanda di brevetto (domanda di brevetto italiana N. 20177 A/80 del 26 febbraio 1980) relativa ad una composizione adatta alla determinazione colorimetrica di metalli impiegante Cromazurolo B. Tale composizione risulta tuttavia essere meno stabile di quella impiegante Cromazurolo S, infatti qualora si impieghi il Cromazurolo B nella forma acida bisogna aggiungere alcool etilico (per rendere stabile la composizione).
Noi abbiamo trovato che il Cromazurolo S (CAS) in presenza di CTMA ed in opportune condizioni, reagisce con il ferro (III/II) per dare un complesso intensamente colorato con un massimo di assorbimento a 630 nm e con un coefficiente di estinzione molare paragonabile a quello che in analoghe condizioni si ottiene col Cromazurolo B.
Inoltre, la maggiore solubilit? del Cromazurolo S permette, secondo le esigenze, l'ommissione dell'aggiunta del solvente organico utilizzata per la stabilizzazione del reattivo con Cromazurolo B.
Forma perci? un primo oggetto della presente invenzione una composizione che permette la formulazione di un reattivo colorimetrico adatto alla determinazione del ferro serico. Tale composizione ? costituita da due sole soluzioni, preferibilmente acquose, pronte per l'uso, una funzionante da reattivo croniogeno del ferro nel campione e l'altra da reattivo mascherante necessaria per eliminare l'interferenza con il Cromazurolo S di sostanze proteiche presenti nel siero.
Particolarmente, il reattivo cromogeno ? costituito da un tampone a pH acido, un sale organico e/o inorganico di un metallo alcalino o alcalino-terroso, Cromazurolo S (come tale o salificato), un tensioattivo cationico o non ionico ed eventualmente un solvente organico aggiuntivo; a sua volta, il reattivo mascherante ? costituito dagli stessi componenti e contiene inoltre un agente complessante in grado di impedire la formazione del complesso fra il Cromazurolo, il tensioattivo e il ferro, tale reattivo mascherante potendo contenere il solo agente complessante. I vari costituenti prima menzionati possono essere presenti a diverse concentrazioni: per quanto riguarda il Cromazurolo S, la sua quantit? varia da 0,01 mmoli/litro a 0,3 mmoli/litro; il tensioattivo, a sua volta, viene aggiunto in quantit? variabili da 0,1 a 400 volte la quantit? di Cromazurolo, in funzione della sua natura. Il sale del metallo alcalino o alcalino terroso, la cui funzione nel caso di analisi del siero ? quella di aiutare a liberare il ferro dalla transferrina, viene aggiunto alla soluzione fino al raggiungimento di un soddisfacente risultato, e comunque in quantit? superiori a 0,004 moli/litro; il pH variando tra 4,0 e 5,6. Infine, nel caso di impiego di un solvente aggiuntivo, la sua concentrazione pu? variare fino ad un massimo di 30% rispetto al volume della soluzione.
Circa, poi, la soluzione mascherante, l'agente complessante inibitore della formazione del complesso fra il Cromazurolo, il tensioattivo e il ferro viene aggiunto in quantit? variabili sempre in funzione della sua natura e delle sue capacit? complessanti, e, comunque, in quantit? molari non inferiori a quelle del Cromazurolo.
Fra tutti i costituenti possibili, il sale solubile ?, preferibilmente, un sale di magnesio e, fra gli altri, un alogenuro; il Cromazurolo S, come accennato, pu? essere presente come tale o salificato; il tensioattivo viene scelto tra gli alchil-ammonio alogenuri, ad esempio cetiltrimetilammonio bromuro, o tra i poliossialchileneteri; l'agente complessante, presente nel reattivo mascherante, ? a sua volta scelto fra gli acidi organici policarbossilici e i loro sali, ad esempio ? costituito da acido citrico monoidrato e sodio citrato tribasico biidrato.
Una formulazione standard, secondo la presente invenzione, ? la seguente:
I Reattivo Cromogeno
II Reattivo Mascherante
Le concentrazioni dei vari componenti il Reattivo Cromogeno rimangono inalterate nel Reattivo Mascherante.
Sono inoltre presenti:
Acido citrico monoidrato 5,48 gr/litro
Sodio citrato tribasico biidrato 11,29 gr/litro
Le soluzioni, conservate al riparo dalla luce fra 0?C e 37?C, presentano una stabilit? superiore all'anno, il metodo analitico, basato sull'impiego della formulazione secondo la presente invenzione, ? esposto nello schema di reazione qui citato.
Incubazione per 20 minuti a 37?C e lettura a 640 nm.
Forma un ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo impiegante la composizione sopramenzionata per la determinazione del ferro in fluidi biologici comprendente le seguenti operazioni:
i) aggiunta del reattivo cromogeno al fluido biologico; ii) incubazione-ad una temperatura variabile fra 0?C e 50?C;
iii) lettura della densit? ottica ad una determinata lunghezza d'onda contro una soluzione di "bianco reattivo cromogeno".
Qualora nel fluido biologico siano presenti sostanze interferenti, quali ad esempio ? -lipoproteine, si eseguono invece le seguenti operazioni
i) aggiunta del reattivo cromogeno al fluido biologico; ii) incubazione ad una temperatura compresa fra 0?C e iii) lettura della densit? ottica ad una determinata lunghezza d'onda contro una soluzione di "bianco reattivo croniogeno";
iv) aggiunta al fluido biologico contenente il reattivo colorimetrico di un agente complessante capace di impedire la formazione del complesso, o aggiunta ?i fuido biologico del reattivo mascherante contenente un agente complessante insieme agli stessi costituenti del reattivo colorimetrico.
i) incubazione ad una temperatura compresa fra 0?C e 50?C; vi) lettura della densit? ottica, alla stessa lunghezza d'onda di cui al punto iii), contro una soluzione di "bianco reattivo mascherante" e sottrazione del valore della densit? ottica dovuta alle sostanze interferenti dal valore ottenuto con il fluido biologico e il reattivo cromogeno.
Costituisce inoltre un ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso del reattivo precedentemente descritto nella determinazione del ferro.
Esempio 1
Utilizzando una composizione rispondente alla formulazione standard precedentemente riportata, abbiamo condotto una serie di prove per verificare le caratteristiche della stessa .
1) Accuratezza
Aggiungendo quantit? scalari e note di ad un siero, ? stato ottenuto un recupero medio del 98,5% lineare tra 0 e 100 ? g/100 mi di ferro aggiunto. Ci? significa che il ferro presente nel siero- ? stato leggermente sottodosato ma con un errore trascurabile, tanto ? vero che il coefficiente di correlazione tra la quantit? di ferro aggiunta e la quantit? di ferro ritrovata ? risultato essere di 0,999.
2) Linearit?
La correlazione fra l'estinzione a 640 nm e la concentrazione di ferro ? risultata lineare fino a 600 ?g/100 mi di ferro nel campione.
3) Confronto
Il nostro reattivo confrontato con il metodo descritto da Tabacco et al. (Clin.Chini.Acta, 114, 287, 1981) che utilizza quale croniogeno il Cromazurolo B, su 32 campioni di siero umano ha dato il seguente risultato: y confronto = 1.07x 14.5 ?g/dl con r (coefficiente di correlazione) uguale a 0,96.
4) Interferenze
Sono state saggiate le interferenze di ioni bi e trivalenti presenti normalmente o che possono essere presenti in condizioni patologiche nel sangue umano. Alle concentrazioni di ioni nel campione { ? mol/ litro) di seguito indicate le variazioni percentuali del R i v e n d i c a z i o n i
1) Metodo per la determinazione del ferro in fluidi biologici comprendente le seguenti operazioni:
i) aggiunta al fluido biologico del reattivo colorimetrico costituito da tampone a pH acido, un sale organico e/o inorganico di un metallo alcalino o alcalino- terroso, una forma solubile di Cromazurolo S un tensioattivo cationico o non ionico;
ii) incubazione ad una temperatura variabile fra 0?C e 50?C ;
iii) lettura della densit? ottica ad una determinata lunghezza d'onda contro una soluzione di "bianco reattivo cromogeno".
2) Metodo per la determinazione del ferro in fluidi biologici in cui sono presenti sostanze interferenti comprendente le seguenti operazioni:
i) aggiunta al fluido biologico del reattivo colorimetrico costituito da tampone a pH acido, un sale organico e/o inorganico di un metallo alcalino o alcalino- terroso, una forma solubile di Cromazurolo S un tensioattivo cationico o non ionico;
ii) incubazione ad una temperatura compresa fra 0?C e 50?C ,
iii) lettura della densit? ottica ad una determinata lunghezza d'onda contro una soluzione di "bianco reattivo croniogeno";
iv) aggiunta al fluido biologico contenente il reattivo colorimetrico di un agente complessante capace di impedire la formazione del complesso, o aggiunta al fluido biologico del reattivo mascherante contenente un agente complessante insieme agli stessi costituenti del reattivo colorimetrico.
v) incubazione ad una temperatura compresa fra 0?C e 50?C ;
vi) lettura della densit? ottica, alla stessa lunghezza d'onda di cui al punto iii), contro una soluzione di "bianco reattivo mascherante" e sottrazione del valore della densit? ottica dovuta alle sostanze interferenti dal valore ottenuto con il fluido biologico e il reattivo cromogeno.
3) Composizione per un reattivo colorimetrico adatta alla determinazione del ferro in fluidi biologici costituita da due sole soluzioni, la prima contenente un tampone a pH acido, un sale organico e/o inorganico di un metallo alcalino o alcalino- terroso, una forma solubile di Crornazurolo S, un tensioattivo cationico o non ionico, la seconda contenente un agente complessante capace di impedire la formazione del complesso, da solo o con gli stessi costituenti della prima soluzione.
4) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo la rivendicazione 3 nella quale la prima soluzione contiene Cromazurolo S opportunamente salificato.
5) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo la rivendicazione 3 nella quale la prima soluzione contiene Cromazurolo S in forma acida.
6) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a 5 nella quale la prima soluzione contiene Cromazurolo S in forma acida e un solvente aggiuntivo .
7) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a 6 nella quale la prima soluzione ? costituita da un tampone, un alogenuro di magnesio, Cromazurolo S in forma acida, cetiltrimet?lammoniobromuro .
8) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a 7 nella quale nella prima soluzione il Cromazurolo S ? presente in quantit? variabili da 0,04 mmoli/litro a 0,5 mmoli/litro.
9) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a 8 nella quale nella prima soluzione il tensioattivo ? presente in quantit? variabili da 0,1 a 400 volte la quantit? di Cromazurolo S.
10) Composizione pe un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a S nella quale nella prima soluzione il sale organico e/o inorganico del metallo alcalino o alcalino-terroso ? presente in quantit? superiori a 0,004 moli/litro.
11) Composizione per un reattivo colorimetrico secondo le rivendicazioni da 3 a 10 nella quale nella prima soluzione il tampone ha un pH variabile tra 4,0 e 5,6.
12) Composizione per un reattivo colorimetr?co secondo la rivendicazione 3, nella quale nella seconda soluzione l'agente complessante ? costituito da acido citrico e/o suoi sali, e/o acido etilendiammino tetraacetico e/o suoi sali.
13) Uso del reattivo colorirnetrico di cui alle rivendicazioni da 3 a 12 nella determinazione del ferro.
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