IT202000031139A1 - Test sierologico per coadiuvare la diagnosi e il monitoraggio del glioblastoma multiforme - Google Patents
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Description
?TEST SIEROLOGICO PER COADIUVARE LA DIAGNOSI E IL MONITORAGGIO DEL GLIOBLASTOMA MULTIFORME?
Campo tecnico
La presente invenzione riguarda un test sierologico e relativo metodo per coadiuvare la diagnosi e il monitoraggio del glioblastoma multiforme che comprende l?utilizzo di nanoparticelle di ossido di grafene e una successiva analisi di immagini.
Arte nota
Il glioblastoma multiforme ? il pi? comune e aggressivo tumore primario a livello cerebrale con una incidenza globale di 10 ogni 100,000 persone, in crescita del 3% annuo. Il glioblastoma multiforme pu? comparire ad ogni et? ma il picco di incidenza ? compreso tra i 55 e i 60 anni. Nonostante sia un tumore raro, la sua prognosi infausta, con un tasso di sopravvivenza di 14-15 mesi dopo la diagnosi, lo rende un problema cruciale per la salute pubblica.
Al giorno d?oggi, la diagnosi e il monitoraggio di pazienti affetti da glioblastoma multiforme si basano sull?utilizzo di tecniche di imaging e sulla biopsia tissutale. Entrambe le metodiche mostrano delle limitazioni evidenti. La diagnosi iniziale di glioblastoma multiforme viene effettuata attraverso tecniche di imaging, principalmente imaging a risonanza magnetica (MRI), seguite da biopsia del tessuto tumorale per classificare e caratterizzare la neoplasia in maniera definitiva.
Tuttavia, la biopsia tumorale, che ad oggi rimane il gold-standard per la diagnosi di glioblastoma multiforme, presenta diverse limitazioni: i) il tumore potrebbe trovarsi in un sito inaccessibile; ii) l?intervento presenta un alto rischio per i pazienti in quanto possono verificarsi edemi cerebrali o alterazione delle normali funzioni neurologiche; iii) difficolt? a caratterizzare l?eterogeneit? dell?intera massa tumorale e a rappresentare l?attivit? della neoplasia in tempo reale.
Per avere informazioni pi? dettagliate sulla natura del tumore possono essere effettuati test immunoistochimici e di analisi molecolare alla ricerca di mutazioni genetiche (ad esempio mutazioni di TP53, IDH1 e IDH2) o alterazioni epigenetiche (ipermetilazione di MGMT).
Il monitoraggio dei pazienti dopo l?intervento viene effettuato attraverso scansioni MRI. Purtroppo, in circa il 15-30% dei pazienti si sviluppano lesioni post-trattamento, dette pseudo-progressioni, che non possono essere distinte dal reale progredire della malattia. Queste compaiono generalmente entro i primi tre mesi dall?intervento, possono risolversi spontaneamente e non necessariamente sono associate a un contesto di peggioramento clinico; oltretutto in molti casi sono indice di alta sopravvivenza, probabilmente perch? la loro comparsa ? associata a una forte risposta al trattamento.
Le tecniche di imaging non possono distinguere le lesioni provocate dalla reale progressione del tumore rispetto alle pseudo-progressioni, ovvero lesioni correlate alla terapia che possono risolversi spontaneamente. Dall?altra parte le biopsie tissutali sono procedure altamente invasive che danno una panoramica statica di un tumore in continuo cambiamento. La capacit? di poter distinguere tra reale progressione tumorale e pseudo-progressione sarebbe molto importante poich? aiuterebbe i medici a evitare interventi inutili e prescrivere terapie inefficaci ma, ad oggi, non esiste nessun biomarcatore in grado di determinare la vera natura della lesione
Emerge quindi l?assoluta necessit? di sviluppare tecniche innovative e complementari per integrare la diagnosi e il monitoraggio della risposta al trattamento nei pazienti. Per questo motivo l?attenzione della comunit? scientifica ? rivolta verso la ricerca di biomarcatori circolanti. La maggior parte dei tumori, incluso il glioblastoma multiforme, rilasciano materiale tumorale nella circolazione sanguigna tra cui proteine, acidi nucleici, vescicole e cellule tumorali.
La ricerca di biomarcatori tumorali circolanti ? un campo che negli ultimi anni sta ricevendo molta attenzione dalla comunit? scientifica. I tumori, infatti, rilasciano nella circolazione materiale tumorale come proteine, DNA tumorale circolante (ctDNA), esosomi e cellule tumorali circolanti (CTCs). L?analisi di queste molecole da fluidi biologici ? detta biopsia liquida e pu? essere effettuata utilizzando generalmente il sangue ma anche saliva, urina, fluido cerebrospinale, ecc. La biopsia liquida rappresenta quindi una via non invasiva per avere informazioni in tempo reale dell?attivit? tumorale.
Per quanto riguarda l?utilizzo di biopsie liquide per il glioblastoma multiforme bisogna considerare la presenza della barriera ematoencefalica. Questa barriera regola gli scambi tra la circolazione sanguigna e il tessuto cerebrale. Siravegna, Giulia, et al. "Integrating liquid biopsies into the management of cancer." Nature reviews Clinical oncology 14.9 (2017): 531.
Il glioblastoma multiforme induce uno stato infiammatorio che porta ad un aumento della permeabilit? della barriera emato-encefalica, che si aggrava con il progredire della malattia. Nonostante in certe regioni la barriera emato-encefalica pu? non essere compromessa dalla presenza del glioblastoma multiforme, certe molecole o vescicole, come gli esosomi, riescono ad attraversarla anche da intatta e possono essere individuate nel sangue dei pazienti.
La biopsia liquida da fluido cerebrospinale rimane una valida alternativa ma invasiva e rischiosa. I rapidi progressi nel campo della biopsia liquida hanno portato alla ricerca di una serie di biomarcatori diversi e complementari ognuno dei quali presenta dei vantaggi e degli svantaggi.
Le CTCs possono dare informazioni su pi? livelli (proteine, DNA e RNA) ma sono molto rare nel sangue (circa 1 cellula su 10<9 >nel sangue) e difficili da isolare. Il rilevamento dei livelli di ctDNA potrebbe essere uno strumento molto importante per il monitoraggio dei pazienti in quanto i suoi livelli sono correlati con lo stadio della malattia. Gli esosomi sono facili da rilevare e possono trasportare proteine, DNA, RNA e miRNA ma non vengono rilasciati esclusivamente dalle cellule tumorali ed attraverso l?attuale protocollo di isolamento ? alta la possibilit? di contaminazione.
In generale, nonostante l'importanza della biopsia liquida e la sua applicazione clinica stiano attraendo l?interesse della comunit? scientifica mondiale, questa metodica presenta attualmente numerosi limiti che ne limitano l?applicazione clinica e che dovranno essere necessariamente risolti in futuro. In primo luogo, non c'? consenso tra i ricercatori su quale tipo di acidi nucleici (RNA o DNA) debbano essere maggiormente investigati, in quale tipo di fluido biologico (siero, fluido cerebrospinale o urina) e con quale tecnica analitica (sequenziamento mirato o dell'intero genoma, PCR o microarray). In secondo luogo, prima che la biopsia liquida possa stabilmente essere integrata nella pratica clinica, ? necessario standardizzare la corretta tecnica di prelievo del sangue e le relative questioni pre-analitiche come, ad esempio, la possibilit? di fornire stabilit? ai campioni mediante provette specifiche, la determinazione del limite di tempo ottimale per la conservazione dei campioni etc. (Klekner, ?lmos et al. Significance of liquid biopsy in glioblastoma ? A review. Journal of Biotechnology, Volume 298, 10 June 2019, Pages 82-87).
Nonostante gli sforzi in questo campo, ad oggi, non esiste alcun biomarcatore che sia stato clinicamente approvato per dare indicazioni sulla diagnosi o il monitoraggio di pazienti affetti da glioblastoma multiforme e la ricerca di una strategia sostitutiva o complementare alla biopsia tissutale rimane una necessit? di elevata rilevanza (Bark, Juliana M?ller, et al. "Circulating biomarkers in patients with glioblastoma multiforme." British Journal of Cancer (2019): 1-11.).
Da quanto detto, la capacit? di diagnosticare il glioblastoma multiforme e seguire il decorso della malattia, con tecniche che siano poco invasive e dotate di elevata sensibilit? e specificit?, rimane un?esigenza per la sanit? pubblica.
E? noto in letteratura che nanoparticelle (cio? particelle con almeno una dimensione caratteristica compresa tra 1 e 100 nm) di diversa natura, dopo l?interazione con i fluidi biologici (come sangue, plasma e siero), vengono immediatamente ricoperte da uno strato di proteine, comunemente chiamato ?corona proteica?. La composizione della corona proteica ? influenzata principalmente dalle propriet? delle nanoparticelle, come la dimensione, la forma, la carica e la chimica superficiale, cos? come dalla natura del fluido biologico. Proteine diverse avranno quindi differente affinit? per la superficie di una specifica nanoparticella piuttosto che di un?altra. Ne consegue che la composizione della corona proteica non rispecchia ciecamente la composizione proteica del sangue umano ma pu? mettere in evidenza proteine plasmatiche poco abbondanti ma che hanno alta affinit? per una determinata nanoparticella rispetto a proteine pi? abbondanti (come l?albumina) ma poco affini.
Recentemente, ? stato dimostrato che la composizione delle corone proteiche differisce tra pazienti affetti da patologie diverse, mentre la classica analisi del sangue non riporta alcuna variazione rilevante. Questo significa che la corona proteica ? ?personalizzata?, cio? varia da soggetto a soggetto a seguito della diversit? individuale del proteoma (Hajipour, Mohammad J., et al. "Personalized protein coronas: a ?key? factor at the nanobiointerface." Biomaterials Science 2.9 (2014): 1210-1221). L?analisi di cambiamenti nel proteoma permette infatti di identificare proteine associate alla presenza di una condizione patologica, che possano fungere da marcatori diagnostici in fase precoce, indicatori di prognosi o predittori di risposta ad un trattamento.
Nella pubblicazione M. Papi et al., Converting the personalized biomolecular corona of graphene oxide nanoflakes into a highthroughput diagnostic test for early cancer detection Nanoscale 11.32 (2019): 15339-15346; ? stata dimostrata la possibilit? di utilizzare la corona che si forma attorno a nanoparticelle di ossido di grafene per l?utilizzo nel discriminare soggetti sani da soggetti affetti da tumore del pancreas inoltre viene descritto un protocollo di formazione della corona proteica che ? ottimizzato appositamente per discriminare soggetti sani da pazienti affetti da adenocarcinoma pancreatico. Tale protocollo non restituisce gli stessi risultati se applicato all?analisi di campioni di plasma umano prelevato da pazienti affetti da altre patologie (come, ad esempio, il glioblastoma multiforme). Non solo le condizioni di incubazione (i.e. concentrazione del campione di plasma) sono differenti, ma anche l?analisi del profilo proteico dipende strettamente dalla patologia. Infatti gli intervalli proteici utilizzati per discriminare pazienti oncologici e volontari sani nell?invenzione sono diversi da quelli riportati nell?articolo. La metodica proposta nella presente invenzione ? pertanto specifica per il glioblastoma multiforme.
Nella pubblicazione R. Di Santo et al., Personalized graphene oxideprotein corona in the human plasma of pancreatic cancer patients Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 8 (2020): 491; ? stata caratterizzata la corona proteica che si forma attorno a nanoparticelle di ossido di grafene dopo incubazione con plasma commerciale ed ? stata valutata l?influenza della dimensione delle nanoparticelle e della concentrazione plasmatica sulla formazione della corona stessa. Infine, ? stato dimostrato come la modulazione della concentrazione plasmatica, durante la formazione della corona, pu? essere un fattore fondamentale per discriminare soggetti sani da soggetti affetti da adenocarcinoma pancreatico. Particelle con stessa chimica superficiale ma taglia differente restituiscono gli stessi risultati su soggetti affetti da adenocarcinoma pancreatico. Tuttavia l?uso di particelle diverse (per carica superficiale, composizione, possibile funzionalizzazione) per la diagnosi di patologie differenti dal tumore al pancreas rappresenta un problema a s? stante. Come gi? specificato sopra, nel caso della diagnosi del glioblastoma multiforme mediante analisi della corona proteica, n? le condizioni di incubazione, n? l?analisi dei risultati possono essere direttamente trasferite dallo studio pubblicato sulla diagnosi dell?adenocarcinoma pancreatico.
I parametri critici che non trovano una risposta nell?arte nota e quindi lasciano aperte le problematiche di avere un test ed una metodologia che permetta di aiutare il medico nella decisione di effettuare analisi pi? approfondite circa la patologia di interesse sono quelli relativi a: (i) tipizzazione della corona proteica che si forma attorno a nanoparticelle di ossido di grafene per sviluppare un test diagnostico di una patologia, visto che ogni patologia ha una sua tipizzazione e quindi una sua specifica individuazione delle condizioni operative e della metodologia di analisi dei risultati; (ii) individuazione dei fattori (dimensione delle nanoparticelle di ossido di grafene e concentrazione proteica) di cui bisogna tenere conto se si vuole sviluppare un test affidabile basato sulla corona proteica di nanoparticelle di ossido di grafene nell?ambito del glioblastoma multiforme.
Gli attuali tentativi di sviluppo di test di screening per la diagnosi del glioblastoma multiforme si basano su tecniche di imaging come la RM e la NR che per? risultano poco accurate nel caso in cui si presenti un?elevata eterogeneit? del tumore e biopsia tissutale, che di contro risulta una tecnica altamente invasiva.
Delgado-L?pez, P. D., E. Ri?ones-Mena, and E. M. Corrales-Garc?a. "Treatment-related changes in glioblastoma multiforme: a review on the controversies in response assessment criteria and the concepts of true progression, pseudoprogression, pseudoresponse and radionecrosis." Clinical and Translational Oncology 20.8 (2018): 939-953.
In questo documento sono passate in rassegna le principali limitazioni delle tecniche radiografiche. Viene enfatizzato che differenziare la vera progressione dai cambiamenti legati al trattamento (come la pseudoprogressione o la pseudorisposta) ? fondamentale per non interrompere prematuramente la chemioterapia adiuvante o reindirizzare il paziente a opzioni di seconda linea. Questo aspetto non rientra direttamente nell?ambito della presente invenzione in cui non ? stato valutato l?effetto del trattamento neo-adiuvante (e.g. radioterapia, chemioterapia) sulla progressione della malattia.
Allo stato dell?arte, quindi, non ? noto un possibile uso della corona proteica che si deposita su nanoparticelle per la diagnosi del glioblastoma multiforme.
Sommario dell'invenzione
Gli autori della presente invenzione, analizzando la corona proteica risultante dalla messa a contatto di nanoparticelle di ossido di grafene con campioni ematici di pazienti affetti da glioblastoma, hanno ora trovato che ? possibile individuare anomalie nell?espressione proteica globale mediante semplici tecniche a basso costo come ad esempio l?elettroforesi di proteine su gel di poliacrilammide (PAGE) utilizzando il sodio dodecil solfato (SDS). La SDS-PAGE ? una tecnica sperimentale a basso costo, veloce e molto diffusa nei laboratori clinici. La bassa risoluzione dell?elettroforesi, pur non consentendo di identificare singoli biomarcatori tumorali (come viene fatto con la spettrometria di massa), ha permesso di valutare ?variazioni globali? nel profilo proteico anche senza ipotesi a priori sulle possibili alterazioni in causa la cui espressione risulta globalmente modificata in relazione alla presenza della patologia.
In sintesi, la presente invenzione si basa sulle differenze rilevate nella composizione della corona proteica formata attorno a nanoparticelle di ossido di grafene di taglia compresa tra 100 e 750 nm dopo interazione con plasma umano da soggetti sani e pazienti affetti da glioblastoma multiforme. La composizione della corona ? stata caratterizzata mediante esperimenti di SDS-PAGE.
Rispetto a quanto descritto in Di Santo 2020, l?invenzione si distingue: i) per l?uso di nanoparticelle di ossido di grafene per l?individuazione del glioblastoma rispetto all?adenocarcinoma pancreatico; ii) per la metodica di elaborazione del profilo proteico unidimensionale e l?individuazione delle variabili di input.
Inoltre, non sono fornite nello stato della tecnica o nel documento citato, indicazioni per ottenere risultati rilevanti nella diagnosi precoce del glioblastoma multiforme.
La presente invenzione riguarda quindi un metodo per coadiuvare la diagnosi precoce del glioblastoma multiforme che permette di individuare soggetti affetti dalla malattia per i quali ? necessario o opportuno affrontare i complessi e pi? approfonditi esami convenzionalmente utilizzati oggi (qui definiti di secondo livello) che normalmente hanno un?elevata dose di rischio per il paziente e sono effettuati solo quando assolutamente necessario e in maniera spesso tardiva non essendo disponibili, ad oggi, test che permettano uno screening per individuare nelle popolazioni potenzialmente a rischio di malattia, pazienti potenzialmente malati (anche indicati nella presente descrizione come potenzialmente patologici) e pazienti in cui l?effettivo rischio sia validato da test di laboratorio e non semplicemente dalla storia medica e familiare del paziente.
Non essendo, ad oggi, disponibili esami diagnostici per l?esecuzione di uno screening precoce del rischio o della potenziale presenza del glioblastoma, il test secondo l?invenzione rappresenta quindi un test di primo livello, rapido e facile da eseguire, per una migliore individuazione di pazienti gi? potenzialmente malati o in cui il rischio di malattia sia effettivamente validato da un esame di laboratorio.
Gli esami attualmente effettuati, quando le condizioni patologiche generali del paziente indicano uno stato presumibile di malattia (e quindi normalmente quando la malattia ? in effetti presente e ad uno stadio avanzato) sono qui definiti come esami di secondo livello sono rappresentati dalla TC, RM e biopsia tissutale.
Il metodo dell?invenzione permette di coadiuvare il clinico nella individuazione di soggetti potenzialmente affetti da glioblastoma o che siano in uno stato precoce della malattia per i quali ci sia la necessit? o l?opportunit? di effettuare esami di secondo livello, detto metodo comprendente i seguenti passi:
a) fornire un campione di siero da un campione ematico di un soggetto da analizzare;
b) incubare detto campione di siero con nanoparticelle di ossido di grafene in modo tale da permettere la formazione di una corona proteica su dette nanoparticelle, detto passaggio b) essendo opzionalmente seguito da un passaggio b?) in cui il materiale incubato ? sottoposto a centrifugazione e uno o pi? lavaggi con tampone fosfato per l?eliminazione di proteine legate debolmente;
c) separare le proteine che compongono detta corona proteica da dette nanoparticelle;
d) sottoporre dette proteine ad elettroforesi su gel denaturante a gradiente di poliacrilammide in modo tale da ottenere il profilo proteico (Pp) della corona proteica ottenuta al punto b) o b) e b?);
e) analizzare nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 kDa e 120 kDa, il profilo proteico (Pp) della corona proteica in esame ottenuta nello stadio d);
f) confrontare il profilo della corona proteica in esame con quello di un soggetto sano nello stesso intervallo e osservare se si sia in presenza di uno scarso o non rilevabile assorbimento di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 e 120 kDa sulle nanoparticelle di ossido di grafene;
g) l?assenza o scarsa presenza di tale assorbimento in detto intervallo sar? indicativa della possibile presenza di glioblastoma multiforme.
Sono anche oggetto dell?invenzione: un programma per elaboratore comprendente un codice atto ad eseguire i passi da e) a g) come definiti nella presente descrizione e nelle rivendicazioni quando eseguito su un elaboratore; un supporto informatico comprendente tale programma; un kit per coadiuvare la diagnosi precoce del glioblastoma multiforme che permette di individuare soggetti in stato precoce di malattia per i quali ? necessario o opportuno effettuare esami di secondo livello comprendente una o pi? aliquote di uno o pi? reagenti atti ad eseguire i passaggi da a) a d) e opzionalmente b?) e un supporto informatico come sopra definito.
Ulteriori oggetti e scopi e vantaggi aggiuntivi dell?invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue.
Breve descrizione delle Figure
Figura 1. Schema dell?invenzione.
Figura 2. (a) Immagine rappresentativa di un gel e (b) immagine dopo sottrazione del fondo. (c) superficie di intensit? di un generico campione del gel e profilo unidimensionale corrispondente, (d) localizzazione delle bande di riferimento attraverso relazione funzionale non lineare (Digiacomo, Luca, et al. "The biomolecular corona of gold nanoparticles in a controlled microfluidic environment." Lab on a Chip 19.15 (2019): 2557-2567.).
Figura 3. Immagine rappresentativa del risultato di un esperimento di elettroforesi su gel. I campioni associati a soggetti sani (H) e soggetti affetti da glioblastoma multiforme (P) restituiscono evidenze sperimentali differenti, principalmente visibili all?interno della regione indicata dal rettangolo tratteggiato.
Figura 4. Profili elettroforetici dei soggetti sani e dei pazienti affetti da glioblastoma multiforme. Le curve rappresentano i valori medi, le zone ombreggiate i margini di errore (deviazione standard). Nel riquadro ? mostrato l?ingrandimento della regione di interesse e le distribuzioni (boxplot) delle corrispondenti aree integrali.
Figura 5. Profili elettroforetici dei soggetti sani e dei pazienti affetti da glioblastoma multiforme, da adenocarcinoma duttale pancreatico e da tumore al colon-retto, nella regione compresa tra 100-200 KDa.
Descrizione dettagliata
L?invenzione consiste in un test sierologico basato sull?utilizzo di nanoparticelle di ossido di grafene per la diagnosi e il monitoraggio del glioblastoma multiforme mediante elettroforesi proteica su gel di poliacrilammide.
Nell?ambito della presente descrizione vengono date le definizioni seguenti.
Con riferimento all?ossido di grafene, questo ? un materiale stratificato prodotto dall'ossidazione della grafite. A differenza della grafite, l'ossido di grafene ? fortemente ossigenato, ha gruppi funzionali ossidrilici ed epossidici sui piani basali, oltre a gruppi carbonilici e carbossilici situati ai bordi dei piani. La presenza di questi gruppi funzionali rende l?ossido di grafene fortemente idrofilo e quindi facilmente disperdibile in acqua. Gli strati di ossido di grafene hanno uno spessore di circa 1,1 ? 0,2 nm. Nell?ossido di grafene l?atomo di carbonio non ? sempre ibridizzato sp2 ma in alcuni casi la sua ibridazione ? sp3; questo fattore porta alla formazione di una struttura di legami covalenti i cui atomi sono in parte planari e in parte tetraedrici. Si pu? considerare l?ossido di grafene come fogli di grafene decorati con gruppi funzionali contenenti ossigeno, sia nei piani basali che al bordo dei fogli: nello specifico l?ossido di grafene ? ricco di funzionalit? di tipo idrossido ed epossido sopra e sotto al piano, ovvero in presenza di atomi di carbonio con geometria tetraedrica. Ai bordi del foglio, invece, si trovano gruppi carbonilici (principalmente acidi carbossilici ma anche piccole quantit? di esteri, lattoni, chetoni ed aldeidi), legati questa volta ad atomi di tipo sp2. In passato sono stati proposti diversi modelli strutturali che assumono la presenza di diversi tipi di gruppi funzionali nel GO; le differenze sono dovute ai diversi metodi di produzione e ai diversi substrati di partenza. In particolare, le particelle di ossido di grafene sono, secondo una forma di realizzazione preferita, piastrine o fiocchi di ossido di grafene aventi la dimensione maggiore (anche detta dimensione laterale), per almeno il 95% delle piastrine, non superiore a 10 micrometri, preferibilmente non superiore a 5 micrometri, anche pi? preferibilmente non superiore a 3 micrometri. Preferibilmente le particelle hanno la forma di fiocchi con dimensione laterale inferiore a 10 ?m e spessore inferiore a 2,4 nm con una densit? apparente di circa 40 ? 10 g / L.
Preferibilmente, le nanoparticelle di ossido di grafene secondo la presente invenzione si presentano sotto forma di uno o pi? fiocchi di grafene in cui ciascun fiocco ? prevalentemente costituito da un reticolo esagonale in 2D di atomi di carbonio. Detti fiocchi di ossido grafene su scala nanometrica hanno uno spessore (cio? la dimensione in una direzione ortogonale al foglio di grafene, o pi? in generale, nella terna cartesiana, la dimensione pi? piccola) non maggiore di 300 nm, una lunghezza, larghezza o diametro medio non maggiore di 1 micrometro e una superficie compresa tra 40 e 2000 m<2 >/ g.
Il termine corona proteica ha il significato comunemente utilizzato nella letteratura scientifica e indica lo strato di proteine adsorbite sulla superficie delle nanoparticelle a seguito di interazione con fluidi biologici (ad esempio sangue e plasma).
Con la dicitura ?profilo proteico? si intende la distribuzione dei pesi molecolari delle proteine che compongono la corona proteica.
Ai fini dell?invenzione e della presente descrizione, l?esame di primo livello ? rappresentato dall?esame effettuato con il metodo della presente invenzione mentre gli esami di secondo livello sono rappresentati da quelli convenzionalmente effettuati fino ad oggi, che sono almeno uno tra TC, RM e biopsia tissutale. Ricordiamo che tali esami di secondo livello, essendo complessi e rischiosi per il paziente, sono normalmente effettuati quando le condizioni generali di salute del paziente mostrano sintomi concreti della malattia e sono quindi normalmente effettuati in uno stadio tardivo della malattia, che, come indicato nella discussione dello stato della tecnica, porta generalmente al decesso del paziente.
Attraverso l?analisi del proteoma ? possibile identificare biomarcatori a scopo diagnostico o per il monitoraggio dei pazienti in risposta ad un trattamento. L?analisi proteomica ? generalmente eseguita attraverso protocolli di spettrometria di massa. Tale tecnica consente di individuare singoli biomarcatori ma rimane una tecnica di notevole impatto economico e con elevate tempistiche. La presente invenzione apporta una differenza principale all?analisi proteomica, rispetto all?approccio classico, ovvero l?utilizzo esclusivo di elettroforesi di proteine su gel di poliacrilammide utilizzando il sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) monodimensionale, una tecnica a basso costo, rapida e per questo molto impiegata nei laboratori. Con questa tecnica non ? possibile individuare singoli marcatori ma ? possibile analizzare l?intero profilo proteico alla ricerca di variazioni globali del proteoma associate alla patologia.
Brevemente, l?invenzione coadiuva il clinico nella diagnosi precoce del glioblastoma multiforme e permette di individuare soggetti in stato precoce di malattia o a rischio di sviluppare il glioblastoma per i quali ? necessario o opportuno effettuare esami di secondo livello mediante classificazione di un campione di plasma di detti soggetti secondo due livelli di predittivit? (assenza/presenza di segnale nell?intervallo 100-200 kDa) che indicano la necessit? o l?opportunit? di effettuare esami di secondo livello.
Il metodo si basa sulla differenza rilevata nella composizione della corona proteica formata attorno a nanoparticelle di ossido di grafene dopo interazione con siero umano derivato da soggetti sani e pazienti affetti da glioblastoma multiforme. La caratterizzazione globale della corona ? effettuata, come mostrato dallo schema in figura 1, esclusivamente attraverso esperimenti di SDS-PAGE. Il test sierologico a nanoparticelle di ossido di grafene per la diagnosi e il monitoraggio del glioblastoma multiforme si compone di quattro fasi fondamentali:
fase 1. Separazione in vitro e conservazione del siero, basata su:
a) acquisizione di un campione di siero da un campione ematico di un soggetto da analizzare.
fase 2. Formazione, isolamento e caratterizzazione della corona proteica, basata su:
b) incubare detto campione di siero con nanoparticelle di ossido di grafene in modo tale da permettere la formazione di una corona proteica su dette nanoparticelle, detto passaggio b) essendo opzionalmente seguito da un passaggio b?) in cui il materiale incubato ? sottoposto a centrifugazione e uno o pi? lavaggi con tampone fosfato per l?eliminazione di proteine legate debolmente; c) separare le proteine che compongono detta corona proteica da dette nanoparticelle;
Secondo l?invenzione, al punto b) possono essere utilizzate nanoparticelle di ossido di grafene costituite da uno strato monoatomico di atomi di carbonio con gruppi funzionali contenenti ossigeno, sia nei piani basali che al bordo dei fogli ed aventi una estensione spaziale del piano di atomi di carbonio (dimensione laterale) media di 100-1000 nm, preferibilmente 100-750, preferibilmente 500-800 nm, ancor pi? preferibilmente 600-700 nm e potenziale zeta compreso tra -40 e -20 mV, preferibilmente tra ?35 e -25 mV, preventivamente sottoposte a sonicazione per ottenere una dispersione omogenea (prodotto acquistabile ad esempio da Graphenea - Paseo Mikeletegi 83 - 20009 San Sebasti?n ? Spain). L?incubazione pu? essere realizzata, ad esempio, miscelando due volumi uguali o simili, uno di siero e l?altro di nanoparticelle in sospensione come fornite dal produttore ed incubando il tutto per un tempo e ad una temperatura definiti. I volumi preferiti per l?incubazione sono 100 uL di ossido di grafene (concentrato 0.25mg/mL) con siero diluito 1:10 in un volume variabile entro l?intervallo 50 - 100 uL. L?incubazione del siero con le nanoparticelle di grafene pu? essere effettuata ad una temperatura da 35 a 40?C, preferibilmente da 36 a 39?C, ancor pi? preferibilmente a circa 37?C. Il tempo di incubazione ? preferibilmente compreso tra 40 e 120 minuti, come ad esempio, un periodo di tempo da 50 a 70 minuti, o anche un periodo di circa un?ora. In una particolare forma di realizzazione, detta incubazione pu? essere effettuata a circa 37?C per un periodo di tempo di circa un?ora. Al fine di concentrare le nanoparticelle, il siero pu? essere sottoposto a centrifugazione dopo il periodo di incubazione, l?esperto del settore sapr? stabilire facilmente i tempi e gli rpm di centrifugazione, che potranno essere, in una forma meramente indicativa, ca 12-18 minuti a ca. 13500-21000g. Preferibilmente, il materiale precedentemente incubato sar? tenuto a temperature di circa 4?C. Opzionalmente, il complesso proteine nanoparticelle, liberato del sovranatante, potr? essere sottoposto ad uno o pi? passaggi di lavaggio b?) con una opportuna soluzione, al fine di rimuovere le proteine legate debolmente. Una soluzione idonea ? rappresentata, a titolo meramente esplicativo, da tampone fosfato salino. Il procedimento sopra descritto porta all?ottenimento, dopo l?ultima centrifugazione (i passaggi di lavaggio consisteranno in sospensione del pellet in soluzione opportuna, centrifuga, rimozione del sovranatante, risospensione ecc.) da nanoparticelle di ossido di grafene rivestite della corona proteica. Secondo il metodo dell?invenzione, si risospendono i pellet ottenuti centrifugando il prodotto del punto b) o del punto b?) in una soluzione idonea a caricare il materiale in essa sospeso in gel denaturante. In particolare, la soluzione stessa normalmente ? denaturante e contiene, ad esempio, SDS. Il campione, inserito in provette, viene posto in un incubatore, preferibilmente un incubatore a secco, e portato a una temperatura compresa tra gli 80 e 110?C, preferibilmente 100?C, per un tempo di incubazione compreso tra 5 e 15 minuti, preferibilmente 10 minuti in modo da catalizzare il processo di denaturazione delle proteine del prodotto del punto b) o del punto b?). Terminata l?incubazione il campione viene sottoposto a centrifugazione per favorire il distacco della corona proteica dalle nanoparticelle di ossido di grafene (punto c) del metodo, permettendo quindi di isolare la corona proteica e caricarla su gel a gradiente di poliacrilammide al fine di ottenere un profilo proteico (fase 3 e punto d) del metodo.
fase 3. Acquisizione ed elaborazione delle immagini, basata su:
d) sottoporre dette proteine ad elettroforesi su gel denaturante a gradiente di poliacrilammide in modo tale da ottenere il profilo proteico (Pp) della corona proteica ottenuta al punto b) o b) e b?);
Il gel potr? avere un gradiente di poliacrlilammide, ad esempio, del 4-20%. I campioni possono essere ad esempio sospesi in 20 microlitri di soluzione e sul gel possono essere poi caricati ca. 10 microlitri a pozzetto. I gel che contengono il profilo proteico dei campioni caricati, sono quindi sottoposti a acquisizione di immagine (ad esempio mediante CCD camera, e opportuni programmi di acquisizione di immagine) e l?immagine pu? essere quindi elaborata, ad esempio mediante pulizia del fondo e successiva elaborazione mediante opportuni codici al fine di ottenere una rappresentazione grafica, riportata su ascissa e mediana, con picchi di intensit?, come quella mostrata nelle figure 2.
Ad esempio, i gel possono essere trasferiti all?interno di un sistema di acquisizione delle immagini. A titolo esemplificativo, si pu? utilizzare un sistema Chemidoc MP (BioRad) che contiene una camera CCD (Charge-Coupled Device) per catturare immagini, preferibilmente di alta qualit?, in tempo reale e consentire di posizionare accuratamente il campione. Le immagini dei gel sono elaborate al fine di ottenere un profilo proteico per ciascun campione di misura. Un?immagine di gel rappresentativa ? mostrata in Fig. 2a, dove la prima corsia rappresenta una scala di riferimento per la localizzazione spaziale dei pesi molecolari (ladder) e le corsie rimanenti corrispondono ai campioni caricati. Preliminarmente, viene preferibilmente eseguita una rimozione del segnale di fondo per evitare che variazioni sistematiche di esposizione o luminosit? influiscano sui profili risultanti. Secondo una forma di realizzazione, per ogni immagine, ? adottata la tecnica di sottrazione di fondo attraverso sfera rotolante, riga per riga. Il raggio della sfera ? mantenuto preferibilmente costante per tutte le immagini elaborate. La Fig. 2b mostra una rappresentazione dell?immagine di un gel, dopo aver sottratto il fondo. I lati sinistro (a sinistra della corsia contenente la scala di riferimento) e destro (a destra dell?ultima corsia del gel) mostrano la presenza di regioni residue, all'interno delle quali ? possibile riconoscere un netto andamento, che richiama quello dell'intensit? dell'immagine originale.
Formalmente, se I(x, y) rappresenta l'intensit? campionata dall'immagine originale di un gel, l'immagine elaborata I'(x, y) si ottiene dopo la procedura di rimozione del fondo:
I(x, y) ? I'(x, y) (1)
In altre parole, ciascuna immagine cos? elaborata pu? essere considerata come una funzione I' di due variabili spaziali (x e y), in cui lo spostamento y ? legato ai pesi molecolari delle proteine (si veda Eq.3) e il valore di intensit? alla quantit? di proteine. La FIG. 2c mostra una rappresentazione spaziale della funzione I?. Una proiezione P della funzione a due variabili I'(x, y) su un piano ortogonale all'immagine rappresenta il profilo proteico risultante per un generico campione (j):
Pj (y) = I'(xj, y) (2)
Infine, gli spostamenti lungo y possono essere convertiti in pesi molecolari confrontando la posizione delle proteine note (prima corsia) con un'equazione non lineare del tipo
f (y) = a1*exp(b1*y) a2*exp(b2*y) (3)
Dove i parametri a1, b1, a2, b2 sono ottenuti tramite una procedura di fit dei dati sperimentali (posizione delle bande corrispondenti alle proteine note) mediante la relazione funzionale f. Per qualsiasi procedura di fit ? possibile calcolare il coefficiente di determinazione R2 come segue: R2=1-Sr/St dove Sr ? la somma dei quadrati dei residui (ogni residuo ? definito come la differenza tra il dato sperimentale e il valore assunto dalla funzione di fit in corrispondenza del dato sperimentale stesso) e St ? la somma dei quadrati delle differenze tra i dati sperimentali e la media dei dati sperimentali. Tra le infinite possibili relazioni funzionali, la curva esponenziale a due termini formalizzata nell?equazione (3) rappresenta una scelta molto ragionevole e soprattutto efficace, in quanto permette una procedura di fit molto stabile e versatile. Con questa scelta, il parametro di determinazione R2, che esprime la bont? della procedura stessa, si assesta su valori non inferiori a 0.9999 (dove 1 ? il massimo raggiungibile). Diversamente, R2 si aggira intorno a 0.9894 per curve esponenziali a singolo termine, 0.9929 e 0.9499 per polinomiali di terzo e secondo grado, 0.9614 e 0.9915 per leggi di potenza a singolo e doppio termine. ? da intendersi che questi valori del parametro di determinazione R2 sono relativi al set di dati di riferimento qui considerato a titolo esemplificativo. Se fosse usato un altro set di dati, come qui descritto ad esempio aggiungendo nuovi campioni, o partendo da un diverso set di campioni, i valori di R2 potrebbero variare.
In questo modo, al termine della procedura di elaborazione dell?immagine, per ogni campione si ottiene un profilo proteico unidimensionale, che esprime la distribuzione di peso molecolare delle proteine che compongono la corona. Esistono programmi commerciali e liberi per processare immagini di gel come ad esempio programmi come ImageJ (Mathworks) e Image LabTM (Bio-Rad) o simili. Preferibilmente i programmi potranno essere progettati o modificati in modo da permettere una sottrazione del fondo in modo tale da garantire la riproducibilit? nel confronto di gel diversi. I profili proteici ottenuti dagli esperimenti di elettroforesi su gel per un set di campioni di riferimento noti, con le stesse modalit? descritte sopra relativamente ai campioni da analizzare, sono inseriti in un apposito database, in modo da associare ad ogni campione (sano o malato), il suo personale profilo.
fase 4. Elaborazione statistica dei profili proteici unidimensionali, basata su:
e) analizzare nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 kDa e 120 kDa, il profilo proteico (Pp) della corona proteica in esame ottenuta nello stadio d);
f) confrontare il profilo della corona proteica in esame con quello di un soggetto sano nello stesso intervallo e osservare se si sia in presenza di uno scarso o non rilevabile assorbimento di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 e 120 kDa sulle nanoparticelle di ossido di grafene;
g) l?assenza o scarsa presenza di tale assorbimento in detto intervallo sar? indicativo della possibile presenza di glioblastoma multiforme.
I profili proteici ottenuti dagli esperimenti di elettroforesi su gel sono stati inseriti in un apposito database, in modo che ad ogni soggetto (sano o malato), fosse associato il suo personale profilo. Fig. 3 mostra l?immagine rappresentativa di un gel contente campioni di corona proteica ottenuta da 10 soggetti sani (corsie di sinistra) e 10 soggetti affetti da glioblastoma multiforme (corsie di destra). Il rettangolo evidenzia la regione in cui sono maggiormente visibili le differenze degli output elettroforetici dei campioni, gi? da una semplice ispezione visiva. Ad esempio, all?interno di quella regione si riscontra la presenza di una banda (localizzata poco sopra 100 kDa) per tutti e soli i campioni corrispondenti a donatori sani. La conseguente analisi densitometrica, che si ottiene processando tale immagine ? riassunta in Fig.4.
I profili di intensit? dei campioni sani (linea continua) e malati (linea spezzata) presentano picchi molto pronunciati intorno a 25 kDa e 45 kDa, con ampiezza differente. Le maggiori differenze tra le curve sono per? localizzate nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 kDa e 120 kDa. In quella regione infatti la curva corrispondente ai soggetti oncologici ? pressoch? piatta mentre la controparte dei donatori sani ? caratterizzata da un picco molto evidente. La spiegazione pi? plausibile ? che il tumore produca una down-regolazione di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo tra 100 e 120 kDa e che questa/e proteine non siano assorbite in maniera rilevabile (oppure non siano affatto assorbite) sulle nanoparticelle di ossido di grafene. Ne consegue che l?assenza di questo picco nei profili di intensit? ? una signature caratteristica del glioblastoma multiforme rispetto ai volontari sani.
L?identificazione delle proteine plasmatiche che determinano il picco presente nei volontari sani e assente nei pazienti affetti da glioblastoma multiforme ? al di fuori degli scopi dell?invenzione proposta. Tuttavia, si sottolinea che in quello specifico intervallo di peso molecolare sono state identificate alcune proteine della corona molecolare formatasi su grafene (Castagnola, Valentina, et al. "Biological recognition of graphene nanoflakes." Nature communications 9.1 (2018): 1-9.) che risultano fortemente sotto-espresse da soggetti affetti da glioblastoma (Werbowetski-Ogilvie, Tamra E., et al. "Isolation of a natural inhibitor of human malignant glial cell invasion: Inter ?-trypsin inhibitor heavy chain 2." Cancer research 66.3 (2006): 1464-1472.). Le distribuzioni delle aree integrali corrispondenti sono mostrate nei boxplot e confermano marcate differenze tra le due classi di campioni. Un dato cos? evidente permette di classificare i campioni in una delle due classi senza dover ricorrere ad ulteriori analisi statistiche (ad esempio analisi di discriminazione lineare o analisi delle componenti principali). Infatti, sulla base delle evidenze sperimentali in possesso, lo studio dell?area integrale compresa tra 100 kDa e 120 kDa restituisce distribuzioni totalmente separate, di conseguenza si ottengono i seguenti valori per i parametri finali del test:
? Sensibilit? = 100% (numero di soggetti classificati come malati/numero di soggetti effettivamente malati.
? Specificit? = 100% (numero di soggetti classificati come sani/numero di soggetti effettivamente sani).
? correttezza globale = 100% (numero di soggetti classificati correttamente/numero totale di soggetti).
In altre parole, ? possibile stabilire un valore di soglia per l?area integrale compresa tra 100 kDa e 120 kDa, sotto il quale un ipotetico profilo ignoto sarebbe assegnato alla classe dei soggetti affetti da glioblastoma multiforme. Sulla base dei dati in possesso tale valore ? pari a 0.01. Tale valore di soglia ? determinato massimizzando la correttezza globale del test, ovvero ? quel valore che minimizza la quantit? di falsi positivi e falsi negativi. Pertanto, l?assenza di un picco tra i 100 e 120 kDA nel profilo elettroforetico del campione in esame, rispetto alla presenza di un picco tra i 100 e 120 kDA nel profilo elettroforetico di un campione di controllo ottenuto da un individuo sano, ? indicativa della presenza di glioblastoma multiforme nel soggetto.
In aggiunta, anche la presenza o l?assenza di un picco tra i 145 e 170 kDA ed in cui l?assenza di detto picco nel profilo elettroforetico del campione in esame, rispetto alla presenza di detto picco nel profilo elettroforetico di un campione di controllo ottenuto da un individuo sano, ? indicativa della presenza di glioblastoma multiforme nel soggetto.
L?invenzione proposta permette dunque di valutare tale sottoespressione in modo non invasivo, rapido e relativamente economico, attraverso un prelievo di sangue e successiva applicazione della nanotecnologia basata sulla corona proteica.
In conclusione e tenendo presente che alcune condizioni patologiche potrebbero essere condizioni comuni a soggetti affetti anche da altre neoplasie, non necessariamente da glioblastoma ed anche per esplorare quanto la sensibilit? del test fosse dovuta alla presenza specifica di glioblastoma multiforme, piuttosto che alla generica condizione neoplastica del paziente, sono stati confrontati i profili proteici di donatori sani e pazienti affetti da glioblastoma con i profili ottenuti dalla corona proteica di nanoparticelle di ossido di grafene dopo incubazione con plasma derivante da i) pazienti affetti da adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e da ii) pazienti affetti da tumore al colon-retto. Come mostrato in figura 5, il profilo proteico di queste due patologie, in particolare nella regione 100-120 KDa, ricalca in maniera pi? fedele il profilo dei donatori sani e non vi ? evidenza della stessa down-regolazione proteica trovata nel profilo dei pazienti affetti da glioblastoma.
Data la sua semplicit? e non invasivit?, l?esame effettuato con il metodo dell?invenzione pu? essere ripetuto in tempi successivi su campioni precedentemente esaminati al fine di confermare i risultati ottenuti o di individuare pazienti precedentemente non a rischio che abbiano, nel tempo, subito modifiche della corona proteica che possa spostarli nella classe a rischio o potenzialmente patologici sui quali sia quindi fortemente consigliabile effettuare gli esami di secondo livello come qui definiti.
E? anche oggetto dell?invenzione un programma per elaboratore comprendente codice atto ad eseguire i passi da e) a g) come definiti nella rivendicazione 1 quando eseguito su un elaboratore.
? anche oggetto dell?invenzione un supporto informatico comprendente il programma per elaboratore come sopra definito.
? infine oggetto un kit per coadiuvare la diagnosi del glioblastoma multiforme che permette di individuare soggetti in stato precoce di malattia o a rischio per i quali ? necessario o opportuno effettuare esami di secondo livello comprendente una o pi? aliquote di uno o pi? reagenti atti ad eseguire i passaggi da a) a d) e opzionalmente b?) e un supporto informatico secondo la presente descrizione.
Gli esempi seguenti sono forniti al solo scopo di illustrare l?invenzione e non sono da considerare limitativi della relativa portata.
1. Separazione in vitro e conservazione del siero
Il primo step della procedura consiste nel processare in vitro campioni di sangue venoso. Il sangue posto in provette contenenti inibitori delle proteasi K2EDTA (provette TM BD P100 Blood Collection System (Franklin Lakes, NJ, 7 USA) viene sottoposto a centrifuga per dieci minuti a 2500 giri per due volte per l?isolamento del plasma umano (Fig.
1). Il plasma ottenuto viene conservato in Eppendorf a -80?C fino all?uso. Prima dell?utilizzo il plasma umano ? scongelato a 4?C.
2. Formazione, isolamento e caratterizzazione della corona proteica
Una soluzione di nanoparticelle di ossido di grafene (Graphenea, San Sebasti?n, Spain), alla concentrazione di 0.25 mg/ml, ? sonicata per 2 minuti a 125 W (vibra cell sonicator VC505, Sonics and Materials, UK) per ottenere una soluzione ben dispersa di nanoparticelle di ossido di grafene con una dimensione laterale di circa 650 nm e un potenziale zeta di -30 mV. I campioni di siero (ottenuti dai donatori sani e dai pazienti affetti da glioblastoma multiforme) sono diluiti 1:10 con acqua ultrapura. Successivamente, un volume di 100 microlitri di soluzione di ossido di grafene ? incubato con 75 microlitri di siero umano per un?ora a 37 ?C. Dopo incubazione i campioni sono centrifugati a 18.620 g per 20 minuti a 4?C e successivamente lavati per 3 volte con acqua ultrapura per rimuovere le proteine non legate alle nanoparticelle. I pellet ottenuti sono risospesi in 20 ?l di buffer di caricamento 1x (composta da: 50 mM Tris-HCl, 0.01% bromofenolo blu (BPB), 0.5% sodio-dodecilsolfato (SDS), 10% glicerolo, 0.1 M ditiotreitolo (DTT)), bolliti a 100 ?C per 10 minuti e infine centrifugati a 18.620 RCF per 20 minuti a 4?C. In questo modo vengono separate le corone proteiche (nei surnatanti) dalle nanoparticelle di ossido di grafene (nei pellet). Infine, per ogni campione sono caricati 10 ?l di surnatante su un gel a gradiente di poliacrillammide (4?20% TGX precast gels, Bio-Rad) ai cui capi ? applicata una differenza di potenziale di 100 mV per 90 minuti.
3. Acquisizione ed elaborazione delle immagini
I gel vengono trasferiti su un apposito sistema di acquisizione di immagini ad alta qualit? (Chemidoc MP, Bio-Rad) che permette di posizionare accuratamente il campione e catturare i dati corrispondenti, in termini di immagine a 16bit, dunque consente il successivo trattamento della matrice di intensit? acquisita. Le immagini dei gel vengono processate con opportuni codici Matlab (Mathworks), scritti dagli Inventori e validati appositamente per l?elaborazione dei dati di elettroforesi, al fine di ottenere un profilo proteico per ciascun campione di misura. A tal proposito, Fig. 2a mostra un?immagine rappresentativa dell?output elettroforetico, dove la prima corsia ? occupata da una scala di riferimento per la localizzazione spaziale dei pesi molecolari (ladder) e le corsie rimanenti corrispondono ai campioni caricati. Una rimozione del segnale di fondo viene eseguita preliminarmente per eliminare errori sistematici dovuti a variazioni di esposizione o luminosit? indesiderati. In dettaglio, viene adottata la tecnica di sottrazione di fondo attraverso sfera rotolante, riga per riga, per ciascuna immagine. Il raggio della sfera ? costante per tutte le immagini elaborate. L?immagine risultante ? mostrata nella rappresentazione in pseudo-colori di Fig.2b.
Da un punto di vista matematico, supponendo che I (x, y) rappresenti la funzione di due variabili spaziali dell'intensit? campionata, l'immagine processata a seguito di sottrazione del fondo sar? I'(x, y):
I (x, y) ? I'(x, y) (1)
dove lo spostamento lungo y ? legato ai pesi molecolari delle proteine dei campioni e il valore di intensit? I ? proporzionale alla quantit? di proteine rivelata. La proiezione (P) di questa funzione di due variabili su un piano ortogonale all'immagine ? il profilo proteico risultante per il generico campione (j) (Fig.2c):
P_j (y) = I'(x_j, y) (2)
Infine, lo spostamento lungo y viene convertito in peso molecolare attraverso il confronto con la posizione delle proteine note (prima corsia), per mezzo di un'equazione non lineare (Fig.2d) del tipo
f (y) = a_1 e ^ (b_1 y) a_2 e ^ (b_2 y) (3)
In tal modo, si ottiene un profilo proteico unidimensionale per ogni campione (Fig. 2c), cio? la distribuzione di peso molecolare delle proteine che compongono la corona di ogni campione.
4. Elaborazione statistica dei profili proteici unidimensionali e capacit? predittiva del test ematico
I profili proteici ottenuti dagli esperimenti di elettroforesi su gel sono stati inseriti in un apposito database, in modo che ad ogni soggetto (sano o malato), fosse associato il suo personale profilo. Fig. 3 mostra l?immagine rappresentativa di un gel contente campioni di corona proteica ottenuta da 10 soggetti sani (corsie di sinistra) e 10 soggetti affetti da glioblastoma multiforme (corsie di destra). Il rettangolo evidenzia la regione in cui sono maggiormente visibili le differenze degli output elettroforetici dei campioni, gi? da una semplice ispezione visiva. Ad esempio, all?interno di quella regione si riscontra la presenza di una banda (localizzata poco sopra 100 kDa) per tutti e soli i campioni corrispondenti a donatori sani. La conseguente analisi densitometrica, che si ottiene processando tale immagine ? riassunta in Fig.4.
I profili di intensit? dei campioni sani (blu) e malati (rosso) presentano picchi molto pronunciati intorno a 25 kDa e 45 kDa, con ampiezza differente. Le maggiori differenze tra le curve sono per? localizzate nell?intervallo 100-200 kDa, particolarmente tra 100 kDa e 120 kDa. In quella regione infatti la curva corrispondente ai soggetti oncologici ? pressoch? piatta mentre la controparte dei donatori sani ? caratterizzata da un picco molto evidente. La spiegazione pi? plausibile ? che il tumore produca una down-regolazione di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo tra 100 e 120 kDa e che questa/e proteine non siano assorbite in maniera rilevabile (oppure non siano affatto assorbite) sulle nanoparticelle di ossido di grafene. Ne consegue che l?assenza di questo picco nei profili di intensit? ? una signature caratteristica del glioblastoma multiforme rispetto ai volontari sani. L?identificazione delle proteine plasmatiche che determinano il picco presente nei volontari sani e assente nei pazienti affetti da glioblastoma multiforme ? al di fuori degli scopi dell?invenzione proposta. Tuttavia si sottolinea che in quello specifico intervallo di peso molecolare sono state identificate alcune proteine della corona molecolare formatasi su grafene (Castagnola, Valentina, et al. "Biological recognition of graphene nanoflakes." Nature communications 9.1 (2018): 1-9.) che risultano fortemente sottoespresse da soggetti affetti da glioblastoma (Werbowetski-Ogilvie, Tamra E., et al. "Isolation of a natural inhibitor of human malignant glial cell invasion: Inter ?-trypsin inhibitor heavy chain 2." Cancer research 66.3 (2006): 1464-1472.). Le distribuzioni delle aree integrali corrispondenti sono mostrate nei boxplot e confermano marcate differenze tra le due classi di campioni. Un dato cos? evidente permette di classificare i campioni in una delle due classi senza dover ricorrere ad ulteriori analisi statistiche (ad esempio analisi di discriminazione lineare o analisi delle componenti principali). Infatti, sulla base delle evidenze sperimentali in possesso, lo studio dell?area integrale compresa tra 100 kDa e 120 kDa restituisce distribuzioni totalmente separate, di conseguenza si ottengono i seguenti valori per i parametri finali del test: ? Sensibilit? = 100% (numero di soggetti classificati come malati/numero di soggetti effettivamente malati.
? Specificit? = 100% (numero di soggetti classificati come sani/numero di soggetti effettivamente sani).
? correttezza globale= 100% (numero di soggetti classificati correttamente/numero totale di soggetti).
In altre parole, ? possibile stabilire un valore di soglia per l?area integrale compresa tra 100 kDa e 120 kDa, sotto il quale un ipotetico profilo ignoto sarebbe assegnato alla classe dei soggetti affetti da glioblastoma multiforme. Sulla base dei dati in possesso tale valore ? pari a 0.01. L?invenzione proposta permette dunque di valutare tale sotto-espressione in modo non invasivo, rapido e relativamente economico, attraverso un prelievo di sangue e successiva applicazione della nanotecnologia basata sulla corona proteica.
Claims (13)
1. Metodo per coadiuvare la diagnosi precoce del glioblastoma multiforme in un soggetto comprendente i seguenti passi:
a) fornire un campione di siero da un campione ematico del soggetto;
b) incubare detto campione di siero con nanoparticelle di ossido di grafene preventivamente sottoposte a sonicazione in modo tale da permettere la formazione di una corona proteica su dette nanoparticelle detto passaggio b) essendo opzionalmente seguito da un passaggio b?) in cui il materiale incubato ? sottoposto a centrifugazione e ad uno o pi? lavaggi con tampone fosfato per l?eliminazione di proteine legate debolmente;
c) separare le proteine che compongono detta corona proteica da dette nanoparticelle;
d) sottoporre dette proteine ad elettroforesi su gel denaturante a gradiente di poliacrilammide in modo tale da ottenere il profilo proteico della corona proteica ottenuta al punto b) o b) e b?);
e) analizzare nell?intervallo 100-200 kDa, il profilo proteico della corona proteica in esame ottenuta nello stadio d);
f) confrontare il profilo della corona proteica in esame con quello di un soggetto sano nello stesso intervallo e osservare se si sia in presenza di uno scarso o non rilevabile assorbimento di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo 100-200 kDa, sulle nanoparticelle di ossido di grafene;
g) l?assenza o scarsa presenza di tale assorbimento in detto intervallo sar? indicativo della possibile presenza di glioblastoma multiforme.
2. Metodo secondo la rivendicazione precedente in cui l?intervallo di analisi ? compreso tra 100 kDa e 120 kDa.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui ? ulteriormente analizzato il profilo proteico della corona proteica in esame nell?intervallo 145-170 kDa e in cui uno scarso o non rilevabile assorbimento di una o pi? proteine plasmatiche nell?intervallo 145-170 kDa rispetto a quello di un soggetto sano nello stesso intervallo ? indicativo della possibile presenza di glioblastoma multiforme.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui le particelle di ossido di grafene sono costituite da uno strato monoatomico di atomi di carbonio e hanno una dimensione laterale media compresa tra 100-1000 nm, preferibilmente 100-750 nm preferibilmente 500-800 nm, ancor pi? preferibilmente 600-700 nm e potenziale zeta compreso tra -40 e -20 mV, preferibilmente tra ?35 e -25 mV.
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in cui le particelle di ossido di grafene sono incubate con siero diluito 1:10 ad una concentrazione di 0.25mg/mL.
6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 in cui l?incubazione al punto b) ? effettuata ad una temperatura da 35 a 40?C, preferibilmente da 36 a 39?C, ancor pi? preferibilmente a 37?C.
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 in cui l?incubazione al punto b) ? effettuata per un tempo compreso tra 40 e 120 minuti, preferibilmente tra 50 e 70 minuti, ancor pi? preferibilmente 60 minuti.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7 in cui il passaggio b? ? effettuato a una temperatura di 4?C.
9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8 in cui lo stadio c) comprende:
i. un passaggio di centrifugazione, preferibilmente effettuata a 13500-21000g, dei prodotti al punto b) o ai punti b) e b?) e successiva ri-sospensione del pellet ottenuto in una soluzione, preferibilmente denaturante, idonea a caricare il materiale in essa sospeso in gel denaturante;
ii. un?incubazione del campione in un incubatore, preferibilmente un incubatore a secco, impostato a temperatura compresa tra gli 80 e 110?C, preferibilmente 100?C, e tempo di incubazione compreso tra 5 e 15 minuti, preferibilmente 10 minuti;
iii un ulteriore passaggio di centrifugazione.
10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9 in cui il gel di poliacrilamide ha un gradiente di 4-20%.
11. Programma per elaboratore comprendente un codice atto ad eseguire i passi da e) a g) come definiti nella rivendicazione 1 quando eseguito su un elaboratore.
12. Supporto informatico comprendente il programma secondo la rivendicazione 11.
13. Kit per coadiuvare la diagnosi precoce del glioblastoma multiforme che permette di individuare soggetti in stato precoce di malattia per i quali ? necessario o opportuno effettuare esami di secondo livello comprendente una o pi? aliquote di uno o pi? reagenti atti ad eseguire i passaggi da a) a d) e opzionalmente b?) e un supporto informatico secondo la rivendicazione 12.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| IT102020000031139A IT202000031139A1 (it) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | Test sierologico per coadiuvare la diagnosi e il monitoraggio del glioblastoma multiforme |
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Also Published As
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