IT202000007153A1 - Apporto calorico ridotto e immunoterapia per il trattamento del cancro - Google Patents

Description

APPORTO CALORICO RIDOTTO E IMMUNOTERAPIA PER IL

TRATTAMENTO DEL CANCRO

CAMPO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce ad almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e ad almeno un agente immunoterapeutico per il trattamento del cancro. In particolare, l'agente ? un inibitore PD-1, un inibitore PDL-1, un inibitore CTLA4 o un attivatore OX40.

STATO DELL?ARTE

I tumori sviluppano diverse strategie per eludere la risposta immunitaria al fine di promuovere la crescita e le metastasi. Il tumore dirotta le vie di controllo immunitario, sviluppate per limitare le risposte infiammatorie e immunitarie, esprimendo il ?programmed death-ligand 1? (PD-L1) sulla superficie delle loro cellule, e rimodellando il microambiente immunitario del tumore al fine di proteggersi dalla citotossicit? delle cellule T mediate dalle cellule immunitarie. L'immunogenicit? del tumore varia tra un tumore e l'altro, tuttavia l'alto livello di linfociti infiltranti il tumore (TIL) ? associato ad una migliore prognosi nel paziente oncologico (Foley EJ, 1953; Smith HJ, 1966). Nel cancro l'attivazione del checkpoint immunitario e il microambiente immunosoppressivo rendono i TIL disfunzionali ed esauriti. I TIL esprimono molteplici recettori co-inibitori o checkpoint, come ?cytotoxic T lymphocyte antigen-4? (CTLA-4), ?programmed cell death-1? (PD-1), ?T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3? (TIM-3), e ?lymphocyte-activation gene? (LAG-3) (Walunas TL et al., 1994; Fourcade J et al., 2010; Matsuzaki J et al., 2010). Il blocco di questi punti di controllo inverte l'esaurimento dei TIL e migliora la citotossicit? e la proliferazione di queste cellule.

La terapia con inibitori del checkpoint immunitario (ICI), compresi gli anticorpi contro PD-1, PD-L1 e CTLA-4, permette di ottenere una risposta sostanziale e duratura in molti tipi di tumore. Tuttavia, solo un sottoinsieme di pazienti affetti da cancro risponde alle terapie ICI. Per esempio, i tassi di risposta pi? elevati alla terapia di blocco del PD-1 con un singolo agente si verificano nel linfoma di Hodgkin con un range tra l'80 e il 90%, mentre nei pazienti affetti da melanoma il tasso di risposta ? tra il 35 e il 40%. Nel NSCLC e nei tumori della testa e del collo, gastroesofagei, della vescica e uroteliali, nel carcinoma epatocellulare e nel carcinoma a cellule renali il tasso di risposta varia dal 15 al 25% (Topalian SL et al., 2012; Garon EB et al., 2015; Motzer RJ et al., 2015; Rosenberg JE et al., 2016; Wolchok JD et al., 2017; El-Khoueiry AB et al., 2017; Kim ST et al., 2017; Ribas A & Wolchok JD, 2018).

La monoterapia CTLA-4 produce risposte durature nel 22% dei pazienti con melanoma (Schadendorf D et al., 2015), mentre il tasso di risposta ? inferiore al 10% in altri tumori solidi tra cui l'adenocarcinoma pancreatico, il carcinoma a cellule renali (Yang JC, et al.,2007 ), linfoma a cellule B (Lesokhin AM Lesokhin AM et al., 2016), cancro alla prostata (Slovin SF et al., 2013), cancro colorettale refrattario, carcinoma epatocellulare (Sangro B et al., 2013) e mesotelioma maligno (Calabro L et al., 2013).

Il trattamento combinato anti-CTLA-4 e anti-PD-1 raggiunge un alto tasso di risposta del 58% nei pazienti affetti da melanoma (ma ? stato associato a una grave tossicit? (Larkin J et al., 2015; Postow MA, 1015). Gli studi clinici in corso stanno testando l'efficacia di PD-1 e CTLA-4 in pazienti affetti da carcinoma a cellule renali e da cancro del colon-retto ad alto contenuto di MSI (Sade-Feldman M. et al., 2017).

Gli eventi avversi pi? comuni riscontrati per l'inibitore del pathway PD-1/PD-L1 e CTLA-4 sono affaticamento, diarrea, eruzione cutanea e prurito nel 15-20% dei pazienti (Robert C et al., 2015; Garon EB et al., 2015; Ribas A et al., 2016; Rosenberg JE et al., 2016; Robert C et al, 2015), mentre una percentuale minore di pazienti sviluppa endocrinopatie, come disturbi tiroidei (dal 10 al 15%), ipofisite, disturbi della ghiandola surrenale (dall'1 al 3%), e diabete di tipo 1 (1%), o tossicit? infiammatorie degli organi viscerali (~1%), tra cui encefalopatia, meningite, polmonite, miocardite, esofagite, colite, epatite e nefrite, oltre a miosite e artrite (Sarnaik, A. A. et al, 2011; Wolchok, J.D. et al. 2010).

Il trattamento combinato anti-PD-1 anti CTLA-4 mostra evento avverso di grado 3-4 nel 59% dei pazienti con melanoma, con una maggiore incidenza di evento gastrointestinale (Wolchok JD, 2017).

Il fallimento della terapia ICI pu? derivare da un inadeguato priming delle cellule T. L'attivazione completa delle cellule T dipende dall'interazione del recettore delle cellule T (TCR) con il peptide legato al complesso maggiore di istocompatibilit?, ma anche dai segnali costimolatori forniti da cellule accessorie non-T (Mueller DL et al, 1989; Esensten JH, 2016). I recettori costimolatori appartengono sia alla superfamiglia delle immunoglobuline ( ad esempio, CD28, ICOS e CD226) o alla superfamiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale (TNFRSF), tra cui CD27, OX40 (indicato anche come CD-134), 4-1BB, proteina del recettore TNF indotta da glucocorticoidi, ?death receptor 3? e CD30 (Dougall WC et al., 2017; Wikenheiser DJ et al., 2016; Ward-Kavanagh LK et al., 2016). I segnali costimolatori aumentano l'ampiezza della risposta delle cellule T e la generazione di cellule T effettori e memoria, e possono promuovere le risposte immunitarie cellulari contro i tumori.

L'anticorpo agonista OX40 promuove l'attivazione delle cellule T e l'immunit? antitumorale in diversi studi clinici e sinergizza con il blocco di PD-L1 per migliorare la proliferazione e la funzione delle cellule T CD8 esaurite. Gli effetti avversi pi? comuni della monoterapia con OX40 sono linfopenia, affaticamento, eruzione cutanea e sintomi simil-influenzali (grado 1-2) (Weinberg AD et al., 2000; Piconese S et al., 2008; Bulliard Y et al., 2014, Curti BD et al., 2013).

Tuttavia, la combinazione dell'anti-OX40 con il blocco dei checkpoint PD-1/PD-L1 produce una maggiore frequenza di eventi avversi immuno-correlati (irAE) rispetto ai rispettivi trattamenti individuali (Montler R et al., 2016).

Pertanto, vi ? ancora la necessit? di una terapia che aumenti la risposta agli agenti immunoterapeutici e riduca i loro effetti collaterali, gli eventi avversi e la tossicit?.

SOMMARIO DELL?INVENZIONE

Nella presente invenzione, gli autori hanno identificato che la combinazione di uno specifico regime di assunzione calorica con almeno un agente immunoterapeutico ? efficace nel trattamento del cancro. Detto specifico regime di assunzione calorica si basa su un ridotto apporto calorico giornaliero rispetto ad un normale apporto calorico giornaliero, in particolare comporta un apporto calorico giornaliero specifico e un apporto specifico di macronutrienti come definito di seguito.

L'invenzione si basa sulla sorprendente evidenza che un ridotto apporto calorico o una dieta mima digiuno (FMD) migliora l'attivit? terapeutica dell'agente immunoterapeutico nel trattamento del cancro. Sorprendentemente e inaspettatamente, la combinazione dell'invenzione ? efficace sui tumori caratterizzati da resistenza o risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

Pertanto, l'invenzione prevede almeno un ciclo di apporto calorico ridotto e almeno un agente immunoterapeutico per il trattamento del cancro in cui almeno un ciclo di apporto calorico ridotto comprende una prima parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 30% al 70% e una seconda parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 40 al 97%.

Preferibilmente detta prima parte e/o detta seconda parte dura da 24 a 190 ore, preferibilmente detta prima parte e/o o detta seconda parte dura da 24 a 120 ore, preferibilmente detta prima parte e/o detta seconda parte dura approssimativamente 120 ore.

Preferibilmente l'almeno un ciclo di apporto calorico ridotto viene ripetuto da 1 a 30 volte dopo rispettivi periodi da 5 a 60 giorni.

In altre parole, ogni ciclo pu? essere separato da 5 a 60 giorni.

Preferibilmente detto almeno agente immunoterapeutico ? selezionato dal gruppo consistente di: inibitore PD-1, inibitore PD-L1, inibitore CTLA-4, attivatore OX-40.

Preferibilmente l?inibitore PD-1 ? selezionato dal gruppo costituito da: nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, camrelizumab, sintilimab, toripalimab, tislelizumab, AK-105, dostarlimab, HLX-10, prolgolimab, SCTI-10A, spartalizumab, AK-103, AK-104, APL-501, balstilimab, BAT-1306, BI-754091, cetrelimab, CS-1003, GLS-010, MGA-012, pidilizumab, sasanlimab, AMG-404, BCD-217, BH-2950, budigalimab, CC-90006, F-520, HAB-21, HX-009, IBI-318, JTX-4014, LY-3434172, LZM-009, MEDI-5752, MGD-013, MGD-019, ONO-4685, RO-7121661, RO-7247669, sulituzumab, Sym-021, XmAb-20717, XmAb-23104 o un suo derivato, o una loro combinazione; l?inibitore PD-L1 ? selezionato dal gruppo costituito da: atezolizumab, durvalumab, avelumab, APL-502, bintrafusp alfa, CS-1001, KN-035, SHR-1316, BGBA-333, CX-072, GEN-1046, GS-4224, IO-103, IO-103 IO-120, KD-005, KLA-167, KN-046, lazertinib, STIA-1014, WP-1066, ADG-104, AK-106, BCD-135, CA-170, cosibelimab, FAZ-053, FPT-155, FS-118, HLX-20, IBI-318, INBRX-105, INCB-86550, JS-003, lodapolimab, LP-002, LY-3434172, MCLA-145, MSB-2311, RG-6084, SHR-1701, SL-279252, STIA-1015 o un suo derivato, o una loro combinazione; l?inibitore CTLA-4 ? selezionato dal gruppo costituito da: ipilimumab, tremelimumab, zalifrelimab, AK-104, BMS-986218, BMS-986249, KN-046, ADU-1604, AGEN-1181, ATOR-1015, BCD-145, BCD-217, FPT-155, HBM-4003, IBI-310, MEDI-5752, MGD-019, MK-1308, REGN-4659, RP-2, XmAb-20717, XmAb-22841, PSB-205, ALPN-202, APL-509, BPI-002, BT-001, CBT-103, CBT-107, CG-0161, HL-06, HLX-09, JS-007, KN-044, MV-049, ONC-392, PC-101, BJ-003, DB-002, IMT-400, JMW-3B3, TE-1254, AGEN-2041, FHTCT-4, HOR-010, PRS-010, SNCA-21 o un suo derivato, o una loro combinazionel?attivatore OX40 ? selezionato dal gruppo costituito da: BMS-986178, GSK-3174998, INCAGN-1949, KHK-4083, ABBV-368, ATOR-1015, DNX-2440, IBI-101, SL-279252, INBRX-106, AP-201, APVO-603, DPV-002, FS-120, HLX-51, JNJ-6892, MSB-013, OrthomAb, ABM-193, HuOHX-10, INV-531, SCB-340, ENUM-004, GBR-8383, KAHR-104, MEDI-6469, ZL-1101, efizonerimod alfa, tavolimab, vonlerolizumab o un suo derivato, o una loro combinazione.

Preferibilmente l?inibitore PD-1 ? pembrolizumab, l?inibitore PD-L1 ? atezolizumab, l?inibitore CTLA-4 ? ipilimumab, l?attivatore OX40 ? BMS-986178.

Preferibilmente l?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico comprende somministrare una combinazione di:

- Inibitore PD-1 e inibitore CTLA-4; o

- Inibitore PD-L1 e inibitore CTLA-4; o

- Inibitore PD-L1 e attivatore OX40.

Preferibilmente l?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso come sopra definito, comprendono somministrare un ulteriore intervento terapeutico.

Preferibilmente detto ulteriore intervento terapeutico ? selezionato dal gruppo costituito da: chirurgia, radioterapia e almeno un altro agente terapeutico.

Preferibilmente detto ulteriore agente terapeutico ? un ulteriore inibitore del checkpoint immunitario, uno stimolatore della risposta immunitaria, un agente antitumorale mirato, un inibitore della Risposta al Danno al DNA e/o un agente chemioterapico.

Preferibilmente detto ulteriore inibitore del checkpoint immunitario ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PD1, inibitori PDL1, inibitori CTLA-4, inibitori TIGIT, inibitori ICOS, inibitori TIM3, inibitori IDO1; detto stimolatore della risposta immunitaria ? selezionato dal gruppo costituito da: attivatori di OX40, modulatori di GITR, antagonisti di 4-1BB; detto agente antitumorale mirato ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PI3K, inibitori HDAC, inibitori EGFR, inibitori BRAF, inibitori MAPK, inibitori CDK, attivatori dello stress del ER; detto inibitore della Risposta al Danno al DNA ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PARP, inibitori CHK1, inibitori ATR, inibitori Wee1; detto agente chemioterapico ? selezionato dal gruppo costituito da: agenti alchilanti, antimetaboliti, agenti anti-microtubuli, inibitori della Topoisomerasi, antibiotici citotossici.

Preferibilmente detto cancro ? caratterizzato da resistenza o risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico, preferibilmente detto cancro ? resistente o ha una risposta parziale ad almeno un inibitori PD-1, inibitore PD-L1, inibitore CTLA-4 o attivatore di OX-40. Preferibilmente detto cancro ? resistente o ha una risposta parziale al pembrolizumab e/o atezolizumab.

Il cancro pu? essere resistente ad altri agenti come comunemente usati in chemioterapia.

Preferibilmente detto cancro ? un tumore solido o ematopoietico, preferibilmente il cancro ? selezionato dal gruppo composto da: cancro al seno, melanoma, linfoma, cancro ai polmoni, cancro ai polmoni non a piccole cellule (NSCLC), cancro alla testa e al collo, cancro gastroesofageo, cancro alla vescica e cancro uroteliale, carcinoma epatocellulare e carcinoma delle cellule renali.

La presente invenzione fornisce un metodo di trattamento del cancro che comprende:

- somministrare almeno un ciclo di assunzione calorica ridotta; e

- somministrare almeno un agente immunoterapeutico,

in cui detto almeno un ciclo di apporto calorico ridotto comprende una prima parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 30% al 70% e una seconda parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 40 al 97%.

Preferibilmente il cancro ? caratterizzato da una resistenza o da una risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

Preferibilmente detto ridotto apporto calorico comprende un ridotto apporto di proteine e/o un ridotto apporto di carboidrati semplici e/o un aumentato apporto di carboidrati complessi e/o un aumentato apporto di grassi insaturi.

Preferibilmente detto maggiore apporto di carboidrati complessi ? circa dal 40% al 50% dell'apporto calorico totale, preferibilmente detto minore apporto di proteine ? circa dal 9 all'11% dell'apporto calorico totale, preferibilmente detto maggiore apporto di carboidrati complessi ? circa dal 43 al 47% dell'apporto calorico totale, preferibilmente detto maggiore apporto di grassi insaturi ? circa dal 44 al 46% dell'apporto calorico totale.

In una forma di realizzazione preferita, la riduzione dell'apporto calorico viene effettuata attraverso la somministrazione di un regime specifico. Tale regime consiste in un regime di 4 giorni. Esso fornisce circa 1.100 chilocalorie per un primo giorno e meno di 300 chilocalorie al giorno dal secondo al quarto giorno della dieta (Tabella 1). Include meno di 30 grammi di zucchero il primo giorno; meno di 5 grammi di zucchero dal secondo al quarto giorno; meno di 30 grammi di proteine il primo giorno; meno di 5 grammi di proteine nei giorni dal secondo al quarto giorno; meno di 15 grammi di grassi saturi il primo giorno (Tabelle 2 e 3).

Tabella 1. Esemplare della dieta mima digiuno (FMD) sviluppata per indurre una risposta simile al digiuno massimizzando il nutrimento.

Tabella 2. Il contenuto di macronutrienti per ogni giorno della FMD di 4 giorni. *Valori medi.

Tabella 3. Il contenuto di micronutrienti per ogni giorno del regime di 4 giorni di FMD basato su una persona di 180-200lb.

% DV indica la percentuale di valore giornaliero basata su una dieta di 2000 calorie aggiornata ai regolamenti del 2020. *Valori medi

Le forme di realizzazione e gli esperimenti che illustrano i principi dell'invenzione saranno

discussi con riferimento alle seguenti figure.

Breve descrizione delle figure

Figura 1. La dieta mima digiuno (FMD) e l'anti-PD-L1 sinergizzano per mediare l'inibizione della crescita del melanoma B16F10 aumentando i linfociti infiltranti il tumore (TIL) CD3+CD8+. Programma di trattamento (A), dimensione media del tumore (B), CD3+CD8+ TIL (C), Tregs (CD3+CD4+FoxP3+) (D) per i topi C57BL/6 con cellule del melanoma B16F10 alimentati con dieta standard (CTRL) o FMD e trattati con anti-PD-L1 (100 ?g/topo), IgG (100?g/topo), anti-CD8 (200 ?g/topo). I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001; NS, P < 0,1).

Figura 2. La dieta mima digiuno in combinazione con il blocco del checkpoint immunitario (ICB), anti-PD-L1/CTLA4 o anti-PD1/CTLA4, ? efficace nell'arrestare la progressione del melanoma B16F10. Programma di trattamento (A), dimensione media del tumore (B), peso medio del tumore (C) per i topi C57BL/6 con cellule del melanoma B16F10 alimentati con la dieta standard (AL) o FMD e trattati con il blocco del checkpoint immunitario (anti-PD-L1 100 ?g/topo, anti-PD1100g/topo e anti-CTLA-4 100 ?g/topo). I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001; NS, P < 0,1).

Figura 3. La FMD in combinazione con anti-PD1/CTLA4 o anti-PD-L1/CTLA4blocca la crescita del tumore B16. Programma di trattamento (A), dimensione media del tumore (B), peso medio del tumore (C) per i topi C57BL/6 con cellule del melanoma B16F10 alimentati con dieta standard (AL) o FMD e trattati con blocco del checkpoint immunitario (ICB) (anti-PD1 250 ?g/topo) e anti-CTLA-4 200 ?g/topo). I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001; NS, P < 0,1).

Figura 4. Un ciclo di FMD migliora la risposta antitumorale del trattamento anti-PD1/CTLA4 contro il melanoma B16. Programma di trattamento (A), dimensione media del tumore (B), peso medio del tumore (C) per i topi C57BL/6 con cellule del melanoma B16F10 alimentati con una dieta standard ad libitum (AL) o FMD e trattati con il blocco del checkpoint immunitario ICB (anti-PD1250 ?g/mouse e anti-CTLA-4200 ?g/mouse).

Figure 6. La FMD aumenta la risposta anti-tumorale della terapia anti-PD-L1/OX40 contro il tumore al seno 4T1 e previene l'ingrossamento della milza. Programma di trattamento (A), dimensione media del tumore (B), peso medio del tumore (C) e peso medio della milza (D) per topi BALB/c affetti da tumore al seno 4T1 alimentati con una dieta standard ad libitum (AL) o FMD e trattati con blocco del checkpoint immunitario (anti-PD-L1 100 ?g/topo e anti-OX40 100 ?g/topo). I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001; NS, P < 0,1).

Figura 6. La FMD aumenta i linfociti infiltranti il tumore CD8+ e CD8+CD25-CD44+ (TIL, attivati dagli antigeni tumorali). Linfociti infiltranti il tumore CD3+ (A), TIL CD4+ (B), TIL CD8+ (C), tali cellule includono cellule CD8+CD25-CD44+ attivate, TIL CD8+CD25-CD44+ attivati (D) per topi BALB/c affetti da tumore al seno 4T1 alimentati con una dieta standard ad libitum (AL) o FMD e trattati con anti-PD-L1 (100 ?g/ topo) e/o OX40 (100 ?g/ topo). I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01).

Figura 7. La FMD protegge i topi dalla citotossicit? immunitaria di anti-PDL1 e OX40. Effetto benefico della FMD nella prevenzione degli effetti negativi di anti-PD-L1 e/o anti-OX40 sulla sopravvivenza dei topi allograft 4T1. I topi alimentati con diete standard ad libitum (AL) muoiono alla 4? iniezione di anti-PD-L1 o anti-OX40, mentre i topi alimentati con FMD (4 cicli) sono molto pi? tolleranti e non mostrano alcuna sofferenza o effetto avverso. I dati mostrati sono raccolti da 3 esperimenti indipendenti con 4 topi per gruppo. One-way ANOVA ? stata utilizzata per valutare la significativit? statistica (*, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; ****, P < 0,0001; NS, P < 0,1).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

La presente invenzione fornisce un ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per il trattamento del cancro.

Senza essere legati ad alcuna teoria, i presenti dati mostrano che almeno un ciclo di ridotto apporto calorico migliora l'attivit? terapeutica dell'agente immunoterapeutico e/o aumenta la popolazione di cellule T CD8+ e/o riduce la tossicit? dell'agente immunoterapeutico e/o previene la splenomegalia indotta dall'agente immunoterapeutico.

La riduzione viene confrontata con un regolare apporto calorico giornaliero. Il regolare apporto calorico giornaliero ? compreso tra 1200 Kcal e 3000 Kcal. Preferibilmente il regolare apporto calorico giornaliero (l'intervallo ? basato su et?, sesso e attivit? fisica) ?:

Et? 4-8 anni: 1200-2000 Kcal Et? 9-13 anni: 1800-2600 Kcal Et? 19-30 anni: 1800-3000 Kcal Et? 31-50 anni: 1800-2600 Kcal

+51 anni: 1600-2600 Kcal.

In una forma di realizzazione, l'apporto calorico ridotto per l'uso secondo la presente invenzione dura per un periodo da 24 a 190 ore, preferibilmente detto ridotto apporto calorico dura per un periodo da 24 a 120 ore, preferibilmente detto ridotto apporto calorico dura per circa 120 ore. In una forma di realizzazione preferita il periodo di ridotto apporto calorico ? di 48-168 ore, preferibilmente 120 ore.

Preferibilmente il ridotto apporto calorico inizia almeno 24 ore prima che l'agente immunoterapeutico venga somministrato. Preferibilmente il ridotto apporto calorico inizia almeno 48 ore prima della somministrazione dell'agente immunoterapeutico. Preferibilmente il ridotto apporto calorico dura almeno 24 ore dopo la somministrazione dell'agente immunoterapeutico, preferibilmente almeno 48, 72, 96, 120 ore dopo la somministrazione dell'agente immunoterapeutico.

Preferibilmente il ridotto apporto calorico ? iniziato un giorno prima che l'agente immunoterapeutico venga somministrato e continua per i successivi 2-4 giorni dopo la somministrazione dell'agente immunoterapeutico (cio? mentre l'agente immunoterapeutico ? pi? attivo). Preferibilmente il ridotto apporto calorico consiste di 4 giorni di apporto ipocalorico (50% dell'apporto calorico regolare il primo giorno, e 10% nei giorni 2-4).

Nella presente invenzione, preferibilmente, la riduzione dell'apporto calorico si ottiene a digiuno o con alimenti dietetici a ridotto contenuto calorico e/o di proteine, ma contenenti tutti i micronutrienti necessari per prevenire la malnutrizione.

Nella presente invenzione, preferibilmente, il ridotto apporto calorico si ottiene mediante la dieta mima digiuno (FMD). Con il termine "dieta mima digiuno" (FMD) si intende una dieta che imita gli effetti del digiuno tipicamente fornendo ad un soggetto al massimo il 50% del suo normale apporto calorico ma con qualche componente nutrizionale, in modo che il digiuno sia imitato mentre un soggetto non ? completamente affamato. Esempi di utili digiuni che imitano e migliorano nel contesto della presente invenzione sono riportati nelle domande di brevetto statunitense n. 14/273946 depositata il 9 maggio 2014; 14/497752 depositata il 26 settembre 2014; 12/910508 depositata il 22 ottobre 2010; 13/982307 depositata l?8 febbraio 2012; 14/060494 depositata il 22 ottobre 2013; 14/178953 depositata il 12 febbraio 2014; 14/320996 depositata l?1 luglio 2014; 14/671622 depositata il 27 marzo 2015; l'intera divulgazione di queste domande di brevetto ? qui incorporata per riferimento. Esempi addizionali di diete FMD si trovano nella domanda di brevetto US No. 15/148,251 e nella domanda di brevetto WIPO Pubbl. N. WO 2011/050302 e WIPO Pubbl. N. WO 2011/050302; le intere divulgazioni delle quali sono qui incorporate per riferimento.

Nella presente invenzione il periodo di ridotto apporto calorico viene ripetuto una o pi? volte dopo rispettivi periodi di 5-60 giorni, durante i quali a detto mammifero viene somministrato l'agente mentre viene sottoposto ad una dieta che comporta un regolare apporto calorico.

Preferibilmente, il periodo di ridotto apporto calorico viene ripetuto da 1 a 3 volte dopo un periodo di 5-60 giorni.

L'immunoterapia ? il trattamento della malattia attraverso l'attivazione o la soppressione del sistema immunitario. Le immunoterapie progettate per suscitare o amplificare una risposta immunitaria sono classificate come immunoterapie di attivazione o terapie immunostimolanti, mentre le immunoterapie che riducono o sopprimono sono classificate come immunoterapie di soppressione o terapie immunosoppressive.

Preferibilmente, l'immunoterapia si riferisce alle terapie immunostimolatorie antitumorali che sfruttano le risposte immunitarie preesistenti, inefficaci, targettando i pathway del checkpoint immunitario.

Preferibilmente, gli agenti immunoterapeutici sono: (1) farmaci che agiscono sull'evasione immunitaria del tumore attraverso il blocco dei segnali negativi di regolazione (ad esempio, i checkpoint co-inibitori e gli enzimi tollerogenici) e (2) agenti che stimolano direttamente le vie immunogeniche (ad esempio, agonisti dei recettori costimolatori).

Ulteriori strategie immunostimolatorie includono potenziatori della presentazione dell'antigene (ad esempio, vaccini), l'uso di citochine ricombinanti esogene, virus oncolitici e terapie cellulari che utilizzano cellule immunitarie antigene-competenti native o modificate.

Gli agenti immunoterapeutici secondo l'invenzione possono essere anticorpi o derivati di anticorpi o loro frammenti. Tra i frammenti di anticorpi vi sono equivalenti funzionali o omologhi di anticorpi, tra cui qualsiasi polipeptide comprendente un dominio di legame dell' immunoglobulina o peptidi che imitano questo dominio di legame. Sono pertanto incluse molecole chimeriche che comprendono un dominio di legame dell'immunoglobulina, o equivalenti, fuso con un altro polipeptide. Preferibilmente, il derivato dell'anticorpo comprende almeno parti del frammento Fab, preferibilmente insieme ad almeno parti del frammento F(ab')2 e/o parti della regione della cerniera e/o la parte Fc di un anticorpo lambda o kappa. Le molecole anticorpo esemplificative sono molecole di immunoglobulina intatte e quelle porzioni di una molecola di immunoglobulina che contiene il para- topo, comprese le porzioni note come Fab, Fab', F(ab')2 e F (v). Preferibilmente, l'anticorpo ? un anticorpo IgG, IgM o IgA.

L'anticorpo o il derivato dell'anticorpo utilizzato secondo l'invenzione pu? anche essere un anticorpo glicosilato, in cui la glicosilazione pu? anche imitare un epitopo di un epitopo di carboidrato di un antigene associato al tumore (TAA).

L'anticorpo o il derivato dell'anticorpo pu? essere di origine umana o animale, preferibilmente di origine mammifera, ad esempio di topo, ratto, capra. Pu? essere prodotto con la tecnologia dell'ibridoma secondo metodi ben noti dall'arte o con l'espressione ricombinante utilizzando sistemi di espressione appropriati. A seconda del sistema ospite utilizzato, l'anticorpo o il derivato dell'anticorpo pu? mostrare specifici modelli di glicosilazione.

L'agente immunoterapeutico secondo l'invenzione pu? essere un anticorpo anti-idiotipico, cio? un ab2 e/o un anticorpo idiotipico avente specificit? per un antigene associato al tumore, cio? un abl.

L'agente immunoterapeutico secondo l'invenzione pu? anche essere un vaccino. Pu? essere una struttura antigenica, per esempio una proteina TAA o polipeptide di un TAA che da sola o insieme ad un coadiuvante del vaccino pu? indurre una risposta immunitaria contro l'antigene. L'antigene TAA pu? essere isolato o prodotto in modo ricombinante mediante tecniche conosciute.

L'agente immunoterapeutico secondo l'invenzione pu? anche essere una piccola molecola. Nel contesto della presente invenzione, un "derivato" o "analogo" di un agente immunoterapeutico include una modifica chimica fatta allo scopo di migliorare le sue propriet?, in particolare le sue propriet? farmacocinetiche, farmacodinamiche, chimiche o fisiche. Per esempio, un derivato pu? essere una modifica chimica apportata all'inibitore allo scopo di aumentare la sua affinit? di legame con il recettore, aumentare la sua biodisponibilit? o il suo tempo di emivita.

In una forma di realizzazione, l'agente immunoterapeutico da utilizzare secondo la presente invenzione viene selezionato dal gruppo comprendente: Inibitore PD-1, inibitore PD-L1, inibitore CTLA-4, attivatore OX40, o un loro derivato, o una combinazione di questi.

?Programmed death-1?/ PD-1 (o CD279) ? un recettore del checkpoint immunitario e appartiene alla famiglia di recettori B7-CD28. Al momento del legame con uno dei due ligandi, PD-L1 ( anche noto come CD274 o B7-H1) e PD-L2 ( anche noto come CD273, B7-DC o PDCD1LG2), viene emesso un segnale di co-inibizione. PD-1 ? una glicoproteina monomerica di superficie transmembrana di tipo I da 55 kDa.

Il PD-1 ? un checkpoint immunitario e protegge dall'autoimmunit? attraverso due meccanismi. In primo luogo, promuove l'apoptosi (morte cellulare programmata) delle cellule T antigenespecifiche nei linfonodi. In secondo luogo, riduce l'apoptosi nelle cellule T regolatorie (cellule T antinfiammatorie, soppressive).

Gli inibitori di PD-1, una nuova classe di farmaci che bloccano il PD-1, attivano il sistema immunitario per attaccare i tumori e sono usati per trattare alcuni tipi di cancro.

In una forma di realizzazione, l'agente immunoterapeutico da usare nel trattamento del cancro ? un inibitore PD-1.

In una forma di realizzazione preferita, l'agente immunoterapeutico da usare nel trattamento del cancro ? un inibitore PD-1 selezionato dal gruppo costituito da: nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, camrelizumab, sintilimab, toripalimab, tislelizumab, AK-105, dostarlimab, HLX-10, prolgolimab, SCTI-10A, spartalizumab, AK-103, AK-104, APL-501, balstilimab, BAT-1306, BI-754091, cetrelimab, CS-1003, GLS-010, MGA-012, pidilizumab, sasanlimab, AMG-404, BCD-217, BH-2950, budigalimab, CC-90006, F-520, HAB-21, HX-009, IBI-318, JTX-4014, LY-3434172, LZM-009, MEDI-5752, MGD-013, MGD-019, ONO-4685, RO-7121661, RO-7247669, sulituzumab, Sym-021, XmAb-20717, XmAb-23104 o un loro derivato o una loro combinazione.

In una forma di realizzazione preferita, l?agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro ? il pembrolizumab.

?Programmed death-ligand 1? (PD-L1) anche noto come ?cluster of differentiation 274? (CD274) o ?B7 homolog 1? (B7-H1) ? una proteina che negli umani ? codificata dal gene CD274.

Il PD-L1 da 40 kDa e il PD-L2 da 25 kDa sono entrambe proteine transmembrana di tipo I, contenenti domini IgV e IgC extracellulari e un dominio transmembrana. Mancano di un dominio di segnalazione intracellulare identificabile. I due ligandi condividono il 37% di identit? tra loro, ma differiscono in modo significativo per la loro affinit? per il PD-1 e per la loro espressione specifica del tessuto.

L'espressione/upregulation di PD-L1 ? stata documentata in vari tumori, tra cui melanoma, tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC), tumore al seno e tumore squamoso della testa e del collo.

Il legame del PD-L1 al suo recettore sopprime la migrazione delle cellule T, la proliferazione e la secrezione di mediatori citotossici e limita l'uccisione delle cellule tumorali. Gli inibitori del PD-1 e del PD-L1 alterano l'asse di PD-1, invertendo cos? la soppressione delle cellule T e migliorando l'immunit? antitumorale endogena per scatenare risposte antitumorali a lungo termine per i pazienti con un'ampia gamma di tumori.

In una forma di realizzazione, l'agente immunoterapeutico per il trattamento del cancro ? un inibitore PD-1.

In una forma di realizzazione preferita, l'agente immunoterapeutico da usare nel trattamento del cancro ? un inibitore del PD-L1 selezionato dal gruppo costituito da: atezolizumab, durvalumab, avelumab, APL-502, bintrafusp alfa, CS-1001, KN-035, SHR-1316, BGBA-333, CX-072, GEN-1046, GS-4224, IO-103, IO-103 IO-120, KD-005, KLA-167, KN-046, lazertinib, STIA-1014, WP-1066, ADG-104, AK-106, BCD-135, CA-170, cosibelimab, FAZ-053, FPT-155, FS-118, HLX-20, IBI-318, INBRX-105, INCB-86550, JS-003, lodapolimab, LP-002, LY-3434172, MCLA-145, MSB-2311, RG-6084, SHR-1701, SL-279252, STIA-1015 o un loro derivato, o una loro combinazione.

In una forma di realizzazione preferita, l?agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro ? atezolizumab.

CTLA4 o CTLA-4 (?cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4?), anche nota come CD152 (?cluster of differentiation 152?), 4 ? una proteina di membrana di tipo I che ? espressa su cellule T e monociti attivati, che media un'inibizione locale e temporanea del sistema immunitario. CTLA4 ? costitutivamente espressa nelle cellule T regolatorie, ma solo upregolata nelle cellule T convenzionali dopo l'attivazione - un fenomeno che ? particolarmente notevole nei tumori. Agisce come un interruttore "off" quando ? legato a CD80 o CD86 sulla superficie delle cellule che presentano l'antigene.

Gli inibitori CTLA-4 possono abolire l'inibizione del sistema immunitario, con conseguente attivit? antitumorale immunomediata sostenuta.

In una forma di realizzazione, l'agente immunoterapeutico da usare nel trattamento del cancro ? un inibitore CTLA-4.

In una forma di realizzazione preferita, l'agente immunoterapeutico per l'uso nel trattamento del cancro ? un inibitore CTLA-4 ? selezionato dal gruppo costituito da: ipilimumab, tremelimumab, zalifrelimab, AK-104, BMS-986218, BMS-986249, KN-046, ADU-1604, AGEN-1181, ATOR-1015, BCD-145, BCD-217, FPT-155, HBM-4003, IBI-310, MEDI-5752, MGD-019, MK-1308, REGN-4659, RP-2, XmAb-20717, XmAb-22841, PSB-205, ALPN-202, APL-509, BPI-002, BT-001, CBT-103, CBT-107, CG-0161, HL-06, HLX-09, JS-007, KN-044, MV-049, ONC-392, PC-101, BJ-003, DB-002, IMT-400, JMW-3B3, TE-1254, AGEN-2041, FHTCT-4, HOR-010, PRS-010, SNCA-21 o un loro derivato, o una loro combinazione. In una forma di realizzazione preferita, l?agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro ? un inibitore CTLA-4 ? ipilimumab.

?Tumour necrosis factor receptor superfamily, member 4? (TNFRSF4), anche noto come CD134 e recettore OX40, ? un membro della superfamiglia dei recettori TNFR che non ? espressa costitutivamente sulle cellule T na?ve a riposo, a differenza del CD28. OX40 ? una molecola secondaria co-stimolante del checkpoint immunitario, espressa da 24 a 72 ore dopo l'attivazione; il suo ligando, OX40L, ? anche non espresso sulle cellule che presentano l'antigene a riposo, ma segue la loro attivazione. L'espressione di OX40 ? dipendente dall'attivazione completa della cellula T; senza CD28, l'espressione di OX40 ? ritardata e di quattro livelli inferiori.

Gli anticorpi agonisti di OX40 promuovono la risposta delle cellule T dell'effettore e inducono la regressione tumorale.

In una forma di realizzazione, l'agente immunoterapeutico per il trattamento del cancro ? un attivatore di OX40.

In una forma di realizzazione preferita, l'agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro ? un attivatore OX40 selezionato dal gruppo costituito da: BMS-986178, GSK-3174998, INCAGN-1949, KHK-4083, ABBV-368, ATOR-1015, DNX-2440, IBI-101, SL-279252, INBRX-106, AP-201, APVO-603, DPV-002, FS-120, HLX-51, JNJ-6892, MSB-013, OrthomAb, ABM-193, HuOHX-10, INV-531, SCB-340, ENUM-004, GBR-8383, KAHR-104, MEDI-6469, ZL-1101, efizonerimod alfa, tavolimab, vonlerolizumab o un loro derivato, o una loro combinazione.

In una forma di realizzazione preferita, l?agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro ? un attivatore OX40 ? BMS-986178.

In una forma di realizzazione, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, comprende somministrare una combinazione di:

- inibitore PD-1 e inibitore CTLA-4; o

- inibitore PD-L1 e inibitore CTLA-4; o

- inibitore PD-L1 e attivatore OX40.

In una forma di realizzazione, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo l'invenzione sono combinati con un ulteriore intervento terapeutico.

In una forma di realizzazione preferita, l'apporto calorico ridotto e almeno un agente immunoterapeutico da utilizzare secondo l'invenzione sono combinati con un ulteriore intervento terapeutico selezionato dal gruppo costituito da: chirurgia, radioterapia e almeno un ulteriore agente terapeutico.

La tabella 4 mostra un elenco di classi di farmaci che possono essere utilizzati in combinazione con l'apporto calorico ridotto e con almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo l'invenzione.

Tabella 4. Classi di farmaci che possono essere usati in combinazione con il ridotto apporto calorico e l'almeno un agente immunoterapeutico.

In una forma di realizzazione preferita, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo l?invenzione sono combinati con un ulteriore agente terapeutico ? un ulteriore inibitore del checkpoint immunitario, uno stimolatore della risposta immunitaria, un agente antitumorale mirato, un inibitore della Risposta al Danno al DNA e/o un agente chemioterapico.

In una forma di realizzazione preferita, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo l?invenzione sono combinati un ulteriore inibitore del checkpoint immunitario selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PD1, inibitori PDL1, inibitori CTLA-4, inibitori TIGIT, inibitori ICOS, inibitori TIM3, inibitori IDO1 e/o uno stimolatore della risposta immunitaria ? selezionato dal gruppo costituito da: attivatori di OX40, modulatori di GITR, antagonisti di 4-1BB e/o un agente antitumorale mirato ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PI3K, inibitori HDAC, inibitori EGFR, inibitori BRAF, inibitori MAPK, inibitori CDK, attivatori dello stress del ER e/o un inibitore della Risposta al Danno al DNA ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PARP, inibitori CHK1, inibitori ATR, inibitori Wee1 e/o un agente chemioterapico ? selezionato dal gruppo costituito da: agenti alchilanti, antimetaboliti, agenti anti-microtubuli, inibitori della Topoisomerasi, antibiotici citotossici.

Esempi non limitativi di inibitori del checkpoint immunitario includono: nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, camrelizumab, sintilimab, toripalimab, tislelizumab, atezolizumab, durvalumab, avelumab, APL-502, bintrafusp alfa, ipilimumab, tremelimumab, zalifrelimab, AK-104, BMS-986207, tiragolumab, AB-154, AMG-570, ELN-21, ELN-12, darvadstrocel, indoximod, epacadostat.

Esempi non limitative di stimolatori della risposta immunitaria includono: BMS-986178, GSK-3174998, INCAGN-1949, KHK-4083, ABBV-368, ATOR-1015, Utomilumab.

Esempi non limitativi di agenti antitumorali mirati includono: alpelisib, copanlisib, rigosertib, dactolisib, duvelisib, entinostat, romidepsina, sodio fenilbutirrato, belinostat, panobinostat, osimertinib, cetuximab, panitumumab, erlotinib, vemurafenib, sorafenib, regorafenib, dabrafenib, miltefosine, brimapitide, acumapimod, palbociclib, abemaciclib, ribociclib, alvocidib, honokiol.

Esempi non limitativi di inibitori della Risposta al Danno al DNA includono: olaparib, rucaparib camsylate, talazoparib, niraparib, LY2603618, AZD7762, SRA-737, CBP-501, ESP-01, prexasertib, AZD6738, berzosertib, M-4344, BAY-1895344, AZD1775, adavosertib, ZNC-3.

Esempi non limitativi di agenti chemioterapici includono: Cisplatino, Carboplatino, Dicicloplatino, Oxaliplatino, Picoplatino, Satraplatino, Ciclofosfamide, Clormetina, Uramustina, Melfalan, Clorambucile, Ifosfamide, Bendamustina, Carmustina, Lomustina, Streptozocina, Busulfan, Procarbazina, Altretamina, Dacarbazina, Temozolomide, Mitozolomide.

Preferibilmente, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico secondo la presente invenzione possono essere utilizzati nel trattamento di un cancro caratterizzato da resistenza o risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

Preferibilmente, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico secondo la presente invenzione possono essere utilizzati nel trattamento di un cancro caratterizzato da una riduzione della massa o del volume tumorale compresa tra lo 0% e il 90% dopo un trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

Preferibilmente, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico secondo la presente invenzione possono essere utilizzati nel trattamento di un cancro caratterizzato da una riduzione della massa o del volume tumorale compresa tra lo 0% e il 90% dopo un trattamento con almeno un agente immunoterapeutico selezionato dal gruppo costituito da almeno un agente immunoterapeutico: Inibitori PD-1, inibitori PD-L1, inibitori PD-L1, inibitori CTLA-4, attivatori OX40.

Preferibilmente, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico secondo la presente invenzione possono essere utilizzati nel trattamento di un tumore selezionato tra: tumore al seno, melanoma, linfoma, tumore polmonare, tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC), tumore della testa e del collo, tumore gastroesofageo, tumore della vescica e tumore uroteliale, carcinoma epatocellulare e carcinoma delle cellule renali.

Pi? preferibilmente, il ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico secondo la presente invenzione possono essere utilizzati nel trattamento del cancro al seno o del melanoma.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo in vitro per il trattamento di una cellula tumorale con almeno un agente come definito in precedenza, che comprende:

- coltivare la cellula tumorale in un mezzo con concentrazione ridotta di siero o glucosio; e - trattare la cellula tumorale con l'agente immunoterapeutico.

in cui la concentrazione sierica nel mezzo ? inferiore al 10% e la concentrazione di glucosio in meno di 1 g/1, preferibilmente la concentrazione sierica ? inferiore al 5% , ancora preferibilmente la concentrazione sierica ? 1% o meno dell'1% . Preferibilmente la concentrazione di glucosio ? inferiore a 0,8 g/litro, preferibilmente inferiore a 0,6 g/litro, ancora preferibilmente 0,5 g/litro, preferibilmente inferiore a 0,5 g/litro. Preferibilmente la concentrazione sierica nel mezzo ? ridotta del 10-90% o la concentrazione di glucosio nel mezzo ? ridotta del 20-90%, la riduzione ? rispetto alle concentrazioni normali o di controllo (cio? 10 % del siero e 1 g/litro di glucosio).

La presente invenzione fornisce anche un metodo di trattamento del cancro che comprende: - somministrare un ridotto apporto calorico; e

- somministrare almeno un agente immunoterapeutico.

in cui il cancro ? caratterizzato da una resistenza o da una risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

In cui l'agente immunoterapeutico ? selezionato dal gruppo costituito da: un inibitore PD-1, un inibitore PD-L1, un inibitore CTLA-4, un attivatore OX40.

In cui l'apporto calorico ridotto dura da 24 ore a 190 ore e in cui detto apporto calorico ridotto ? un apporto calorico giornaliero ridotto dal 10 al 100%.

Nella presente invenzione un ridotto apporto calorico preferito ? il seguente:

1? giorno: 54% di apporto calorico, circa 1.090 kcal (10% di proteine, 56% di grassi, 34% di carboidrati)

Giorni 2-7: 20-34% di apporto calorico, circa 426-725 kcal (5,3-9% di proteine, 26-44% di grassi, 27,6-47% di carboidrati).

L'almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo la presente invenzione pu? essere incorporato in composizioni farmaceutiche. Tali composizioni includono tipicamente almeno l'agente immunoterapeutico e almeno un veicolo farmaceuticamente accettabile. Come usato nel presente documento, la dicitura "veicolo farmaceuticamente accettabile" include soluzione salina, solventi, mezzi di dispersione, rivestimenti, agenti antibatterici e antimicotici, isotonica e ritardanti di assorbimento, e simili, compatibili con la somministrazione farmaceutica. Composti attivi supplementari possono anche essere incorporati nelle composizioni.

Una composizione farmaceutica ? formulata in modo da essere compatibile con la via di somministrazione prevista. Esempi di vie di somministrazione comprendono la somministrazione parenterale, ad esempio intravenosa, intradermica, sottocutanea, orale, inalatoria, transdermica (topica), transmucosale e rettale.

In alcune forme di realizzazione preferite, la composizione farmaceutica che comprende almeno un agente immunoterapeutico da utilizzare secondo la presente invenzione, utilizzato per applicazioni parenterali, intradermiche o sottocutanee, pu? ulteriormente comprendere uno o pi? veicoli farmaceuticamente accettabili, esemplificati da, ma non limitati a, particelle lipidiche, vescicole lipidiche, liposomi, niosomi, sfingosomi, nanocarrier polimerici, nanoparticelle, microparticelle, nanocapsule e nanosfere.

Le composizioni farmaceutiche della presente invenzione sono preferibilmente in forma di una singola unit? di dosaggio che contiene una quantit? di agente terapeutico efficace per trattare e/o prevenire un cancro del tipo qui descritto e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Gli eccipienti farmaceuticamente accettabili idonei sono quelli comunemente noti all'esperto del ramo per la preparazione di composizioni per somministrazione parenterale, intradermica, sottocutanea, orale, transdermica, topica, transmucosale e rettale.

A titolo di esempio non limitativo, detti veicoli accettabili possono essere costituiti da leganti, diluenti, lubrificanti, glidanti, disgreganti, agenti solubilizzanti (bagnanti), stabilizzanti, coloranti, antiagglomeranti, emulsionanti, addensanti e gelificanti, agenti di rivestimento, umettanti, sequestranti ed edulcoranti.

La quantit? di almeno un agente immunoterapeutico nella composizione farmaceutica della presente invenzione dipender? dalla natura e dalla gravit? della condizione trattata e dalla natura dei trattamenti precedenti che il paziente ha ricevuto. Per un paziente umano, il medico curante decider? la dose di composto della presente invenzione con cui trattare ogni singolo paziente. Inizialmente, il medico curante pu? somministrare basse dosi e osservare la risposta del paziente. Possono essere somministrate dosi pi? elevate fino a quando non si ottiene l'effetto terapeutico ottimale per il paziente, e a quel punto il dosaggio non viene ulteriormente aumentato. La durata della terapia con la composizione farmaceutica della presente invenzione varier? a seconda della gravit? della malattia trattata e della condizione e della potenziale risposta idiosincratica di ogni singolo paziente.

In una forma di realizzazione, l'invenzione fornisce un ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico da utilizzare nel trattamento del cancro, in cui il cancro ? caratterizzato da resistenza o risposta parziale all'immunoterapia.

Definizioni

Secondo la presente invenzione, prevenire una malattia significa inibire completamente, o in parte, lo sviluppo o la progressione di una malattia, ad esempio in una persona che ? nota per avere una predisposizione a una malattia. Un esempio di persona con una predisposizione nota ? una persona con una storia di cancro in famiglia, o che ? stata esposta a fattori che predispongono il soggetto allo sviluppo di un tumore.

Il trattamento di una malattia si riferisce a un intervento terapeutico che inibisce, o sopprime la crescita di un tumore, elimina un tumore, migliora almeno un segno o sintomo di una malattia o condizione patologica, o interferisce con un processo fisiopatologico, dopo che la malattia o condizione patologica ha iniziato a svilupparsi.

La dose terapeuticamente efficace ? utilizzata nel contesto della presente invenzione per caratterizzare una quantit? del farmaco, che porta alla remissione completa o parziale della malattia neoplastica. Ad esempio, qualsiasi riduzione statisticamente significativa della massa o del volume del tumore o del numero di cellule tumorali indica l'efficacia terapeutica nel contesto della presente invenzione.

Farmaceuticamente accettabile ? utilizzato nel contesto della presente invenzione per riferirsi a quei composti, materiali, composizioni e/o forme di dosaggio che sono, nell'ambito di un valido giudizio medico, adatti all'uso a contatto con i tessuti di esseri umani e animali senza eccessiva tossicit?, irritazione, risposta allergica e/o altri problemi o complicazioni, proporzionati ad un ragionevole rapporto beneficio/rischio.

La resistenza ? utilizzata nel contesto della presente invenzione per riferirsi a nessuna variazione della massa o del volume del tumore dopo un trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.

La risposta parziale ? usata nel contesto della presente invenzione per riferirsi ad una diminuzione delle dimensioni di un tumore, o dell'estensione del cancro nell'organismo, in risposta ad un trattamento con almeno un agente immunoterapeutico. Preferibilmente, la risposta parziale ? utilizzata nel contesto della presente invenzione per riferirsi ad una riduzione della massa o del volume del tumore compresa tra lo 0% e il 90% dopo un trattamento con almeno un agente immunoterapeutico. La risposta parziale pu? anche essere chiamata remissione parziale.

Immunoterapia ? utilizzato nel contesto della presente invenzione per riferirsi alla prevenzione o al trattamento della malattia con agenti (cio? agenti immunoterapeutici) che stimolano la risposta immunitaria.

Secondo la presente invenzione, la somministrazione simultanea pu? avvenire, ad esempio, sotto forma di una combinazione fissa con due o pi? ingredienti attivi, oppure somministrando contemporaneamente due o pi? ingredienti attivi formulati in modo indipendente. Uso ("somministrazione") sequenziale significa preferibilmente la somministrazione di uno (o pi?) componenti di una combinazione in un determinato momento, altri componenti in un altro momento, cio? in modo cronicamente scaglionato, preferibilmente in modo tale che la combinazione mostri una maggiore efficienza rispetto ai singoli composti somministrati indipendentemente (soprattutto mostrando sinergismo). Uso (somministrazione) separato significa preferibilmente la somministrazione dei componenti della combinazione in modo indipendente l'uno dall'altro in punti temporali diversi.

Sono possibili anche combinazioni di due o pi? somministrazioni sequenziali, separate e simultanee, preferibilmente in modo tale che i componenti-farmaci della combinazione mostrino un effetto terapeutico congiunto che supera l'effetto riscontrato quando la combinazione componente-farmaci viene utilizzata in modo indipendente a intervalli di tempo talmente ampi che non si pu? trovare alcun effetto reciproco sulla loro efficienza terapeutica, essendo particolarmente preferito un effetto sinergico.

MATERIALI E METODI

(1) Linee cellulari tumorali.

La cellula tumorale B16-F10 (ATCC? CRL6475?) e 4T1 (ATCC? CRL-2539?) ? stata ottenuta da ATCC. B16F10 sono cellule tumorali della pelle murine usate come modello per il melanoma umano. Questa linea cellulare ? stata derivata dal nodulo del melanoma polmonare della linea cellulare madre B16-F0 iniettato nella vena della coda del topo C57BL/6. Le cellule B16F10 sono altamente metastatiche e formeranno tumori e metastasi dopo l'impianto nei topi C57BL/6 singenici.

4T1 sono linee cellulari murine di tumore al seno derivate dal tessuto della ghiandola mammaria di un topo BALB/c e usate come modello per il tumore al seno umano triplo negativo. Le cellule 4T1 formano tumori e metastasi spontanee dopo l'impianto nei topi BALB/c singenici.

B16 e 4T1 sono anche usati come modello preclinico per studiare l'immunoterapia ed entrambe le linee cellulari sono resistenti alla terapia di blocco del checkpoint immunitario (anti-PD1, anti-PD-L1 e anti-CTLA4). Le cellule sono state coltivate in RPMI1640 o DMEM integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM l-glutammina, penicillina (100 U ml-1) e streptomicina (100 ?g ml-1) a 37 ? C con il 5% di CO2 e mantenuto ad una confluenza del 70-80%.

(2) Impianto tumorale, trattamento con blocco del checkpoint immunitario (ICB) e misurazione del volume tumorale.

Femmine di topi C57BL/6J e BALB/c, di 6-8 settimane, sono state acquistate da Charles River e alloggiate in condizioni di assenza di patogeni nella struttura per animali di Cogentech e con cibo e acqua ad libitum. Tutte le procedure sono state effettuate in conformit? con i protocolli animali approvati dall'"Institutional Animal Care and Use Committee" (OPBA) presso l'IFOM, l'Istituto FIRC di Oncologia Molecolare.

Negli esperimenti in vivo, i tumori sono stati impiantati in topi C57BL/6J iniettando per via sottocutanea (s.c.) 2x10<5 >cellule tumorali B16 per topo nel fianco destro al giorno 0. Quando i tumori erano palpabili, i topi dei gruppi appropriati (5 topi per gruppo) sono stati trattati per via intraperitoneale (i.p.) con anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-CTLA4 e anticorpo anti-PD-L1 a dosi e tempi diversi secondo le condizioni sperimentali previste.

Nell'esperimento mostrato in figura 1, IgG e anti-PD-L1 sono stati somministrati 100 g/mouse una volta alla settimana per 3 settimane. I topi appartenenti al gruppo di FMD sono stati sottoposti a 3 cicli di FMD, una volta alla settimana.

Nell'esperimento di figura 2, IgG, anti-PD1, anti-PD-L1 e anti-CTLA4 sono stati somministrati a una dose di 100 g/mouse tre volte alla settimana per 2 settimane. L'anticorpo anti-CD8 ? stato somministrato ad una dose di 200 g/mouse ogni 3 giorni. I topi appartenenti al gruppo FMD sono stati sottoposti a 2 cicli di FMD, una volta alla settimana.

Nell'esperimento di figura 3, i topi sono stati trattati per via intraperitoneale (i.p.) con anticorpo anti-PD-1 (alla dose di 250 ?g per topo), anticorpo anti-CTLA4 (alla dose di 200 ?g per topo la prima iniezione e 100 ?g per topo la seconda e la terza iniezione) e IgG 450 ?g per topo. I topi appartenenti al gruppo FMD hanno ricevuto 2 cicli di FMD , una volta alla settimana. Nell'esperimento di figura 4, i topi sono stati trattati per via intraperitoneale (i.p.) con anticorpo anti-PD-1 (alla dose di 250 ?g per topo), anticorpo anti-CTLA4 (alla dose di 200 ?g per topo alla prima iniezione e 100 ?g per topo alla seconda e terza iniezione) e IgG 450 ?g per topo. I topi appartenenti al gruppo FMD hanno ricevuto 1 ciclo di FMD.

Per il modello di tumore al seno triplo negativo (TNBC), 3 x 10<4 >cellule 4T1 sono state iniettate per via ortotopica in un cuscinetto di grasso mammario di topi BALB/c di 6-8 settimane. Quando i tumori erano palpabili, i topi sono stati trattati con IgG (100 ?g per topo) (anticorpo anti-OX40 100 ?g per topo) e/o anticorpo anti-PD-L1 (100 ?g per topo) ogni due giorni per tre volte. L'anti-OX40 ? stato somministrato la prima settimana, mentre l'anti-PD-L1 ? stato somministrato la seconda settimana al gruppo appartenente al trattamento combinato. I topi appartenenti al gruppo FMD sono stati sottoposti a 2 cicli di FMD, una volta alla settimana (Figure 5 e 6).

Come riportato nello schema sperimentale della figura 7, 3 giorni dopo l'iniezione di cellule 4T1 nel cuscinetto di grasso mammario, i topi sono stati sottoposti a 1 ciclo di FMD (4 giorni) ogni settimana per 4 settimane e 3 trattamenti con IgG, anti-PD -L1 e/o anti-OX403 volte a settimana a giorni alterni per 1 settimana. I topi appartenenti al gruppo anti-PD-L1/OX40 vengono trattati la prima settimana 3 volte con anti-OX40, la seconda settimana 3 volte con anti-PD-L1, mentre i topi del gruppo anti-PD-L1 e OX40 non ricevono alcun trattamento la seconda settimana. A partire dalla terza settimana, i topi vengono trattati con IgG, anti-PD-L1 o anti-OX401 volta alla settimana l'ultimo giorno di FMD. La sopravvivenza dei topi nel tempo ? stata monitorata.

I tumori sono stati misurati ogni 3-4 giorni con un calibro digitale; il volume tumorale ? stato calcolato con la formula V = (L ? W x H )/2, dove V ? il volume tumorale, L ? la lunghezza del tumore (diametro maggiore), W ? la larghezza del tumore (diametro minore) e H ? l'altezza (diametro del tumore perpendicolare alla lunghezza e alla larghezza). I topi sono stati monitorati per la crescita e la sopravvivenza del tumore. I topi sono stati sacrificati quando il volume del tumore ha raggiunto 1,5 cm<3>.

Le masse tumorali, raccolte nel punto finale della sperimentazione, sono state pesate su una bilancia analitica per confrontare il volume e la massa.

(3) Analisi citometrica a flusso di linfociti tumorali infiltranti e apoptosi.

Al termine della sperimentazione, i topi sono stati sacrificati e tutte le masse tumorali sono state rimosse. Per l'analisi citometrica a flusso dei linfociti tumorali, i tumori sono stati sminuzzati, le masse tumorali B16, raccolte al punto finale sperimentale, sono state digerite per 1 ora con Collagenasi D (10 mg/ml) e DNAseI (10 ?g/ml) mentre i tumori 4T1 sono stati trattati con il kit di dissociazione Miltenyi (130-096-730 ) secondo le istruzioni del produttore.

1-2 ? 10<6 >cellule per campione sono state colorate con la colorazione LIVE/DEAD (Invitrogen L34959), CD45, CD3, CD8, CD4, CD44, FOXP3 e CD45 seguite da una fissazione con formaldeide. L'acquisizione dei dati ? stata effettuata con il citometro a flusso Attune NxT. I risultati sono stati analizzati con il software FlowJo.

(4) Agenti immunoterapeutici usati negli esperimenti in vivo.

Nelle procedure sperimentali sopra descritte sono stati utilizzati gli anticorpi riportati nella Tabella 5. Il numero di catalogo ? tratto dal catalogo degli anticorpi della societ? BioXCell, disponibile all'indirizzo: https://bxcell.com/shop-products/

Tabella 5. Agenti usati negli esperimenti in vivo.

(5) Dieta standard e FMD

I topi sono stati alimentati con una dieta standard (16% di energia da proteine, 46% da carboidrati, 38% da grassi, energia totale: 3,75 Kcal/g di cibo) o FMD durante tutto il corso dell'esperimento. L'FMD ? una dieta ipocalorica a base di composti vegetali che viene eseguita per 4-5 giorni. Il primo giorno i topi sono sottoposti ad una dieta di restrizione calorica che fornisce il 50% del fabbisogno energetico giornaliero (5 g di dieta "FMD giorno 1" come definito nella Tabella 6, corrispondente a 9,16 Kcal) determinato secondo il metodo descritto da Bachmanov, Behav Genet. 2002 Nov; 32(6): 435-443, mentre nei tre giorni successivi i topi vengono alimentati con una dieta il cui apporto calorico ? pari al 10% del fabbisogno giornaliero (5 g di "FMD giorno 2-5" come definito nella Tabella 6, corrispondente a 1,80 Kcal). Alla fine di ogni ciclo di FMD i topi vengono alimentati con una dieta standard per 3 giorni prima di iniziare un nuovo ciclo di FMD. Il numero di cicli di FMD varia a seconda delle condizioni sperimentali. Nell'esperimento della figura 1 ci sono 3 cicli di FMD, nell'esperimento delle figure 2, 3 e 5 gli animali sono stati sottoposti a due cicli di FMD, mentre nell'esperimento della figura 4 ? stato eseguito solo 1 ciclo di FMD. Nell'esperimento di figura 7, sono stati eseguiti 4 cicli di FMD. Il peso dei topi ? stato monitorato durante tutti i giorni di FMD e se i topi hanno perso pi? del 20% del loro peso corporeo sono stati immediatamente alimentati con una dieta standard.

Tabella 6. Densit? energetica di diete FMD somministrate ai topi.

(6) Valutazione della tossicit?

In questo esperimento gli inventori valutano la citotossicit? dell'immunoterapia (anti-PDL1 e anti-OX40) nei topi BALB/c portatori di tumori 4T1. Come riportato nello schema sperimentale della figura 7, 3 giorni dopo l'iniezione di cellule 4T1 nel cuscinetto di grasso mammario, i topi subiscono 1 ciclo di FMD (4 giorni) ogni settimana per 4 settimane e 3 trattamenti con IgG, anti-PD -L1 e/o anti-OX403 volte a settimana a giorni alterni per 1 settimana. I topi del gruppo anti-PD-L1/OX40 vengono trattati la prima settimana 3 volte con anti-OX40, la seconda settimana 3 volte con anti-PD-L1, mentre i topi del gruppo anti-PD-L1 e OX40 non ricevono alcun trattamento la seconda settimana. A partire dalla terza settimana, i topi vengono trattati con IgG, anti-PD-L1 o anti-OX40 1 volta alla settimana l'ultimo giorno di FMD. La sopravvivenza dei topi nel tempo ? stata monitorata.

ESEMPI ESEMPIO 1

Gli inventori hanno indagato se la FMD a potrebbe migliorare l'attivit? terapeutica dell'anti-PD-L1 nel melanoma B16 resistente ad ICI (inibitore del checkpoint immunitario) o ICB (blocco del checkpoint immunitario). Nella prima serie di esperimenti hanno iniettato cellule di melanoma B16F10 sottocutaneo in C57Bl / 6 topi. Quando la massa tumorale era palpabile, i topi sono stati sottoposti a cicli di FMD (riduzione dell'apporto calorico del 50% al giorno 1 e riduzione dell'apporto calorico del 90% al giorno 2, 3 e 4) ogni settimana e sono stati trattati 1 volta alla settimana per 3 settimane con anti-PD-L1 (100 ?g/topo). La monoterapia anti-PD-L1 non ha alcun effetto sulla crescita tumorale nei topi alimentati con la dieta standard, mentre l'FMD non solo ritarda la crescita tumorale, ma aumenta l'effetto antitumorale dell'anti PD-L1 (Figura 1B). Infatti, l'FMD provoca una progressione tumorale significativamente ridotta solo nel gruppo di controllo FMD IgG rispetto al gruppo di controllo della dieta standard (AL IgG). Il trattamento con anti-PD-L1 in combinazione con l'FMD riduce ulteriormente il volume e la progressione delle masse tumorali rispetto al gruppo di controllo FMD IgG, mentre non ha alcun effetto sulla crescita tumorale nel gruppo nutrito con la dieta standard. Cos?, l'FMD da sola ? in grado di bloccare la crescita tumorale e di aumentare l'efficacia anti-tumorale dell'anti-PD-L1.

L'effetto dell'FMD nell'inibire la progressione tumorale ? mediato dal sistema immunitario, poich? la percentuale di linfociti CD8 T aumenta nel letto tumorale. I Linfociti T CD8 costituiscono la popolazione di linfociti che mediano la risposta anti-tumorale.

Infatti, l'esaurimento dei linfociti CD8+ T, ottenuto attraverso la somministrazione di un anticorpo specifico anti-CD8 nei topi, attenua l'effetto antitumorale dell'FMD in combinazione con l'anti-PD-L1 (Figura 1B, ultima linea) e le masse tumorali del gruppo FMD anti-CD8 anti-PDL1 sono pi? grandi di quelle del gruppo IgG dell'FMD. Questi dati hanno dimostrato che l'effetto antitumorale dell'FMD/anti-PD-L1 ? immune mediato e dipendente dalle cellule T CD8+ (Figura 1 B, ultima linea).

ESEMPIO 2

Gli inventori valutano poi l'effetto del trattamento con FMD e anti-PD-L1 sui linfociti infiltranti il tumore che consistono in una popolazione di linfociti CD8 e CD4 T che si infiltrano nel letto tumorale e che regolano la risposta immunitaria anti-tumorale. I linfociti T CD8+ attivati (CD8+ CD44+) riconoscono e attaccano le cellule tumorali rilasciando enzimi citolitici, mentre i linfociti T CD4+ possono differenziarsi in linfociti T helper e sostenere l'azione citotossica dei CD8 o possono differenziarsi in linfociti T Treg (CD4+ FOXP3+) che svolgono un'attivit? immunosoppressiva e promuovono la crescita tumorale. La monoterapia con anti-PD-L1 aumenta leggermente le cellule CD8+ infiltranti il tumore rispetto ai topi trattati con l'IgG di controllo (figura 1 C), ma non ha alcun impatto su Tregs infiltranti CD4+ FoxP3+ (figura 1D). Sorprendentemente, l'FMD da sola o in combinazione con l'anti-PD-L1 aumenta ulteriormente la popolazione di cellule T CD8+ rispetto al singolo trattamento.

ESEMPIO 3

Gli inventori hanno valutato se l'FMD potesse potenziare l'efficacia dell'anti-PDL1 e dell'anti-PD1 in combinazione con l'anti-CTLA4. I topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 10<5 >cellule B16F10 e sottoposti a 2 cicli di FMD e trattati con anti-PD1 o anti-PD-L1 (100 ?g/topo) e anti-CTLA4 ogni 2 giorni. L'FMD da sola e in combinazione con anti PD1/CTLA4 e anti-PD-L1/CTLA4 ? stata pi? efficace nel ritardare la crescita tumorale (volume e peso) rispetto ai topi alimentati con la dieta standard e trattati con anti-PD1/CTLA4 o anti-PD-L1/CTLA4. Gli inventori confermano anche che l'effetto antitumorale dell'FMD sulla crescita tumorale ? immuno-mediato. Infatti, l'esaurimento delle cellule linfociti T CD8+ mediante la somministrazione di anticorpi specifici anti-CD8 nei topi, inverte l'effetto antitumorale dell'FMD sulla crescita tumorale (figura 2B, 2C).

L'FMD in combinazione con il trattamento anti-PD1/CTLA4 o anti-PD-L1/CTLA4 migliora l'efficacia anti-tumorale del singolo trattamento anti-PD-L1. Anti-PD1/CTLA4 e anti-PDL1/CTLA4 hanno un effetto marginale minimo sulla crescita tumorale nel gruppo di topi alimentati con la dieta standard.

Gli inventori valutano anche se solo 2 cicli di FMD in combinazione con dosi pi? elevate di immunoterapia sono in grado di ricapitolare gli stessi effetti osservati nella Fig. 2.

Nell'esperimento di figura 3, i topi sono stati trattati per via intraperitoneale (i.p.) con anticorpo anti-PD-1 (alla dose di 250 ?g per topo), anticorpo anti-CTLA4 (alla dose di 200 ?g per topo la prima iniezione e 100 ?g per topo la seconda e la terza iniezione) e IgG 450 ?g per topo. L'immunoterapeuta o IgG ? stata somministrata solo durante la prima settimana (primo ciclo di FMD). I topi appartenenti al gruppo di FMD sono stati sottoposti a 2 cicli di FMD, una volta alla settimana.

Poich? gli inventori hanno somministrato l'immunoterapeuta solo durante la prima settimana, hanno aumentato la dose.

ESEMPIO 4

Gli inventori hanno testato se 1 ciclo di FMD in combinazione con anti-PD1 (250 ?g/topo), anti-CTLA-4 (200 ?g/topo primo trattamento, 100 ?g/topo secondo e terzo trattamento), somministrato a giorni alterni tre volte in 1 settimana, potesse avere lo stesso effetto benefico sulla progressione tumorale nei topi portatori di tumore B16F10.

La terapia combinata anti-PD1/CTLA-4 ha esercitato un effetto antitumorale contro il tumore B16F10 nei topi sottoposti a 1 solo ciclo di FMD (figura 4). Gli inventori non hanno osservato alcuna risposta antitumorale alla terapia anti-PD1/CTLA-4 nei topi alimentati con la dieta standard. Vale la pena notare che 2 cicli di FMD sono stati in grado di ridurre le dimensioni del tumore (volume e peso, figura 3), mentre 1 ciclo di FMD non influisce sulla crescita del tumore rispetto ai topi alimentati con una dieta standard (figura 4).

ESEMPIO 5

Poi gli inventori hanno testato l'efficacia dell'FMD in combinazione con anti-PDL1 e anti-OX40 contro il cancro al seno 4T1 triplo negativo. I topi BALB/c sono stati iniettati con 5x10<4 >cellule 4T1 in un cuscinetto di grasso mammario e trattati con anti-PD-L1 (100 ?g/topo) o anti-OX40 (100 ?g/topo) o entrambi tre volte alla settimana a giorni alterni per 1 settimana nel gruppo di terapia singola e per 2 settimane nel trattamento combinato. Il trattamento combinato anti-PDL1 e anti-OX40 ? stato somministrato non contemporaneamente ma in modo sequenziale: i topi sono stati trattati con anti-OX40 la prima settimana, mentre con anti-PD-L1 la seconda settimana. La monoterapia anti-PD-L1 e anti-OX40 non ? efficace nel trattamento del cancro al seno 4T1 in topi alimentati con la dieta standard. L'FMD in combinazione con l'anti-PD-L1 o OX40 riduce le dimensioni del tumore 4T1 mentre provoca un effetto additivo nel volume del tumore e nella riduzione del peso se usato in combinazione con l'anti-PD-L1 e l'anti-OX40 (figura 5 B e C). L'FMD previene la splenomegalia specialmente nei topi trattati con la combinazione di anti-PD-L1 e OX40 (figura 5D). L'ingrossamento della milza ? generalmente dovuto ad uno stato infiammatorio caratterizzato da un aumento della polpa rossa, consistente principalmente in globuli rossi e bianchi, e da una forte riduzione della polpa bianca, un'area della milza ricca di linfociti B e T importante per la risposta immunitaria adattiva. Nei topi sottoposti ad FMD la polpa bianca ? pi? conservata e presenta centri germinali multipli, il che indica che la funzionalit? splenica non ? compromessa come nei topi alimentati con una dieta standard.

L'analisi dei linfociti infiltranti il tumore (TIL) ha mostrato che la percentuale dei linfociti T CD3+ totali (Figura 6a) e della sottopopolazione di linfociti T CD4+ (Figura 6b) non cambia nelle varie condizioni sperimentali (dieta standard o FMD; anti-PD- L1 e anti-OX40). D'altra parte, l'FMD in combinazione con l'anti-PD-L1 aumenta la percentuale di linfociti T CD8 citotossici (figura 6c) mentre non influisce sull'attivazione delle cellule CD8+ CD44+ Cd25-T (figura 6d). Nel gruppo anti-PD-L1 e anti-OX40 FMD la popolazione di linfociti T CD8+ infiltrati nel letto tumorale non cambia rispetto ai controlli FMD/IgG (figura 6c), tuttavia si osserva una percentuale pi? alta di linfociti T CD8+CD44+CD25- attivi, che potrebbe spiegare l'effetto antitumorale osservato sulla crescita delle masse tumorali in questo gruppo.

L'analisi dei linfociti infiltranti il tumore ha mostrato che l'FMD pi? anti-PD-L1 o anti-OX40 o entrambi aumentano la percentuale di linfociti T CD8+ nel letto tumorale, mentre l'FMD in combinazione con l'anti-PD-L1/OX40 promuove l'attivazione dei linfociti T CD44+CD8+ (Figura 6).

Inaspettatamente gli inventori hanno notato che se trattano topi portatori di tumore 4T1 con PD-L1 e anti OX40 in combinazione con l'FMD, alla 3? e 4? settimana, 1 volta alla settimana, osservano che il trattamento anti-PD-L1 e anti-OX40 alla 3? settimana risulta essere altamente tossico per gli animali alimentati con la dieta standard e causa morte improvvisa entro 15'-30' dopo l'iniezione di ICI. Inoltre, la terapia anti-PDL1 era letale gi? alla 2? settimana di trattamento in alcuni topi appartenenti al gruppo di trattamento combinato anti-PD-L1/OX40 (figura 7).

In altre parole, i topi alimentati con la dieta standard non sono molto tolleranti al trattamento con anti-PD-L1 e/o anti-OX40 gi? a partire dalla seconda settimana, mentre i topi alimentati con FMD tollerano molto bene il trattamento. Il trattamento singolo anti-PD-L1 o anti-OX40 ? letale per i topi appartenenti a gruppi con dieta standard a partire dalla terza settimana, mentre non ha alcun effetto dannoso nei gruppi alimentati con FMD.

Come mostrato in figura 7, l'FMD (4 cicli separati da 3 giorni di cibo ad libitum) protegge i topi dalla tossicit? indotta da anti-PD-L1 e OX40 a partire dalla 3 settimana di trattamento e aumenta l'efficacia antitumorale della terapia ICB.

Nei pazienti, il regime di FMD pu? consistere in un regime di 5 giorni, limitato alle calorie (fino a 1100 Kcal somministrate il primo giorno; fino a 750 Kcal somministrate nei giorni 2, 3, 4, 5), a basso contenuto di carboidrati, dieta a basso contenuto proteico.

Nei pazienti, il regime di FMD pu? anche consistere in una dieta di 4 giorni, ipocalorica (fino a 1100 Kcal somministrato il giorno 1; fino a 750 Kcal somministrato il giorno 2, 3, 4), a basso contenuto di carboidrati, a basso contenuto proteico.

Per gli studi clinici sui pazienti affetti da cancro al seno o melanoma una dieta FMD che consiste in un 5 giorni, ipocalorica (fino a 600 Kcal somministrate il primo giorno; fino a 300 Kcal somministrate il secondo, terzo, quarto, quinto giorno), a basso contenuto di carboidrati, a basso contenuto proteico dieta ? adottata. La FMD viene ripetuta ogni 28 giorni per almeno 2 volte e l'immunoterapia viene somministrata il terzo giorno di FMD. L'immunoterapia viene somministrata secondo le dosi riportate nel protocollo clinico.

I pazienti affetti da cancro al seno o melanoma possono seguire una dieta FMD composta da una dieta a 5 giorni, a basso contenuto calorico (fino a 600 Kcal somministrate il primo giorno; fino a 300 Kcal nei giorni 2, 3, 4, 5), a basso contenuto di carboidrati, a basso contenuto proteico, che pu? essere ripetuta ogni 28 giorni per almeno 2 volte mentre l'immunoterapia viene somministrata il terzo giorno di FMD. Gli agenti immunoterapeutici sono somministrati secondo le dosi note all'esperto del ramo.

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 6

Fig. 7

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso nel trattamento del cancro, in cui detto almeno un ciclo di ridotto apporto calorico comprende una prima parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 30% al 70% e una seconda parte con un apporto calorico regolare ridotto dal 40% al 97%.
2. 2. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta prima parte e/o detta seconda parte dura per un periodo da 24 a 190 ore, preferibilmente detta prima parte e/o detta seconda parte dura per un periodo da 24 a 120 ore, preferibilmente detta prima parte e/o detta seconda parte dura per approssimativamente 120 ore.
3. 3. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui l?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico ? ripetuto da 1 a 30 volte dopo rispettivi periodi da 5 a 60 giorni.
4. 4. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto agente immunoterapeutico ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitore PD-1, inibitore PD-L1, inibitore CTLA-4, attivatore OX-40.
5. 5. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo la rivendicazione 4, in cui l?inibitore PD1 ? selezionato dal gruppo costituito da: nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, camrelizumab, sintilimab, toripalimab, tislelizumab, AK-105, dostarlimab, HLX-10, prolgolimab, SCTI-10A, spartalizumab, AK-103, AK-104, APL-501, balstilimab, BAT-1306, BI-754091, cetrelimab, CS-1003, GLS-010, MGA-012, pidilizumab, sasanlimab, AMG-404, BCD-217, BH-2950, budigalimab, CC-90006, F-520, HAB-21, HX-009, IBI-318, JTX-4014, LY-3434172, LZM-009, MEDI-5752, MGD-013, MGD-019, ONO-4685, RO-7121661, RO-7247669, sulituzumab, Sym-021, XmAb-20717, XmAb-23104 o un suo derivato, o una loro combinazione; l?inibitore PD-L1 ? selezionato dal gruppo costituito da: atezolizumab, durvalumab, avelumab, APL-502, bintrafusp alfa, CS-1001, KN-035, SHR-1316, BGBA-333, CX-072, GEN-1046, GS-4224, IO-103, IO-103 IO-120, KD-005, KLA-167, KN-046, lazertinib, STIA-1014, WP-1066, ADG-104, AK-106, BCD-135, CA-170, cosibelimab, FAZ-053, FPT-155, FS-118, HLX-20, IBI-318, INBRX-105, INCB-86550, JS-003, lodapolimab, LP-002, LY-3434172, MCLA-145, MSB-2311, RG-6084, SHR-1701, SL-279252, STIA- 1015 o un suo derivato, o una loro combinazione; l?inibitore CTLA-4 ? selezionato dal gruppo costituito da: ipilimumab, tremelimumab, zalifrelimab, AK-104, BMS-986218, BMS-986249, KN-046, ADU-1604, AGEN-1181, ATOR-1015, BCD-145, BCD-217, FPT-155, HBM-4003, IBI-310, MEDI-5752, MGD-019, MK-1308, REGN-4659, RP-2, XmAb-20717, XmAb-22841, PSB-205, ALPN-202, APL-509, BPI-002, BT-001, CBT- 103, CBT-107, CG-0161, HL-06, HLX-09, JS-007, KN-044, MV-049, ONC-392, PC-101, BJ-003, DB-002, IMT-400, JMW-3B3, TE-1254, AGEN-2041, FHTCT-4, HOR-010, PRS-010, SNCA-21 o un suo derivato, o una loro combinazione; l?attivatore OX40 ? selezionato dal gruppo costituito da: BMS-986178, GSK-3174998, INCAGN-1949, KHK- 4083, ABBV-368, ATOR-1015, DNX-2440, IBI-101, SL-279252, INBRX-106, AP-201, APVO-603, DPV-002, FS-120, HLX-51, JNJ-6892, MSB-013, OrthomAb, ABM-193, HuOHX-10, INV-531, SCB-340, ENUM-004, GBR-8383, KAHR-104, MEDI-6469, ZL-1101, efizonerimod alfa, tavolimab, vonlerolizumab o un suo derivato, o una loro combinazione.
6. 6. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo la rivendicazione 5, in cui l?inibitore PD1 ? pembrolizumab, l?inibitore PD-L1 ? atezolizumab, l?inibitore CTLA-4 ? ipilimumab, l?attivatore OX40 ? BMS-986178.
7. 7. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente somministrare una combinazione di: - Inibitore PD-1 e inibitore CTLA-4; o - Inibitore PD-L1 e inibitore CTLA-4; o - Inibitore PD-L1 e attivatore OX40.
8. 8. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente somministrare un ulteriore intervento terapeutico, preferibilmente detto ulteriore intervento terapeutico ? selezionato dal gruppo costituito da: chirurgia, radioterapia, e almeno un ulteriore agente terapeutico, preferibilmente detto ulteriore agente terapeutico ? un ulteriore inibitore del checkpoint immunitario, uno stimolatore della risposta immunitaria, un agente antitumorale mirato, un inibitore della Risposta al Danno al DNA e/o un agente chemioterapico, preferibilmente detto ulteriore inibitore del checkpoint immunitario ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PD1, inibitori PDL1, inibitori CTLA-4, inibitori TIGIT, inibitori ICOS, inibitori TIM3, inibitori IDO1; detto stimolatore della risposta immunitaria ? selezionato dal gruppo costituito da: attivatori di OX40, modulatori di GITR, antagonisti di 4-1BB; detto agente antitumorale mirato ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PI3K, inibitori HDAC, inibitori EGFR, inibitori BRAF, inibitori MAPK, inibitori CDK, attivatori dello stress del ER; detto inibitore della Risposta al Danno al DNA ? selezionato dal gruppo costituito da: inibitori PARP, inibitori CHK1, inibitori ATR, inibitori Wee1; detto agente chemioterapico ? selezionato dal gruppo costituito da: agenti alchilanti, antimetaboliti, agenti anti-microtubuli, inibitori della Topoisomerasi, antibiotici citotossici.
9. 9. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto cancro ? caratterizzato da resistenza o risposta parziale al trattamento con almeno un agente immunoterapeutico.
10. 10. L?almeno un ciclo di ridotto apporto calorico e almeno un agente immunoterapeutico per uso secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto cancro ? un cancro solido o ematopoietico, preferibilmente il cancro ? selezionato dal gruppo costituito da: tumore al seno, melanoma, linfoma, tumore polmonare, tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC), tumore della testa e del collo, tumore gastroesofageo, tumore della vescica e tumore uroteliale, carcinoma epatocellulare e carcinoma delle cellule renali.