IT201900011904A1

IT201900011904A1 - System and method for electromagnetic spectroscopy of a sample

Info

Publication number: IT201900011904A1
Application number: IT102019000011904A
Authority: IT
Inventors: Riccardo Cicchi; Francesco Saverio Pavone; Jesus Reis Lagarto João Luis De
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche; L4T Light4Tech Srl
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-01-16
Also published as: WO2021009205A3; WO2021009205A2

Description

Metodo e sistema per la spettroscopia elettromagnetica di un campione Method and system for the electromagnetic spectroscopy of a sample

Settore tecnico Technical field

La presente invenzione riguarda un metodo e un sistema per la spettroscopia elettromagnetica di un campione illuminato esternamente mediante luce visibile in maniera che un operatore possa vedere il campione mentre il metodo o il sistema è in uso. The present invention relates to a method and system for electromagnetic spectroscopy of a sample externally illuminated by visible light so that an operator can see the sample while the method or system is in use.

Stato dell’Arte State of the art

L'imaging e la spettroscopia, per esempio l'imaging e la spettroscopia di fluorescenza, sono stati sfruttati in maniera via via crescente per la caratterizzazione quantitativa e sensibile dell'attività metabolica e delle alterazioni strutturali nei tessuti biologici ex vivo ed in vivo. In particolare, le misure di autofluorescenza sono particolarmente interessanti per la ricerca clinica, poiché sfruttano le proprietà foto‐fisiche dei fluorofori endogeni (ad es. collagene, elastina, NAD(P)H, cheratina) per generare contrasto senza traccianti e per fornire informazioni sulle proprietà strutturali e funzionali dei tessuti biologici, evitando l'uso di agenti di contrasto esogeni potenzialmente tossici. Il potenziale clinico e la fattibilità delle misure di autofluorescenza per la diagnosi clinica in vivo sono stati dimostrati in numerosi studi, utilizzando sia misure di autofluorescenza stazionarie che risolte temporalmente. La misura stazionaria dell'intensità o la spettroscopia in emissione di autofluorescenza sono state ampiamente utilizzate nella ricerca clinicodiagnostica. Tuttavia, le misure di intensità da sole sono sensibili agli artefatti di intensità e quindi sono difficili da confrontare tra campioni e pazienti. Le misure raziometriche risolte spettralmente mirano a fornire letture quantitative ma la discriminazione fra molti fluorofori endogeni è limitata dai loro spettri di emissione ampi e sovrapposti. Le misure risolte in tempo possono aumentare la specificità dell'acquisizione di fluorescenza risolvendo la dinamica di decadimento della fluorescenza e quindi possono fornire un mezzo per distinguere i fluorofori endogeni che hanno spettri di emissione sovrapposti ma diverse durate di vita media della fluorescenza. Le misure di vita media della fluorescenza sono relativamente insensibili agli artefatti di intensità che influenzano altre tecniche. Quindi, se combinate con strumenti basati su fibre ottiche, le misure di vita media della fluorescenza dei fluorofori endogeni potrebbero migliorare la diagnostica clinica e fornire una guida nelle procedure chirurgiche. Imaging and spectroscopy, for example imaging and fluorescence spectroscopy, have been increasingly exploited for the quantitative and sensitive characterization of metabolic activity and structural alterations in biological tissues ex vivo and in vivo. In particular, autofluorescence measurements are particularly interesting for clinical research, as they exploit the photo-physical properties of endogenous fluorophores (e.g. collagen, elastin, NAD (P) H, keratin) to generate tracer-free contrast and to provide information on the structural and functional properties of biological tissues, avoiding the use of potentially toxic exogenous contrast agents. The clinical potential and feasibility of autofluorescence measures for in vivo clinical diagnosis have been demonstrated in numerous studies, using both stationary and time-resolved autofluorescence measures. Stationary intensity measurement or autofluorescence emission spectroscopy have been widely used in clinical diagnostic research. However, intensity measurements alone are sensitive to intensity artifacts and therefore are difficult to compare between samples and patients. Spectrally resolved ratiometric measurements aim to provide quantitative readings but discrimination among many endogenous fluorophores is limited by their large and overlapping emission spectra. Time-resolved measurements can increase the specificity of fluorescence acquisition by resolving the fluorescence decay dynamics and thus can provide a means to distinguish endogenous fluorophores that have overlapping emission spectra but different mean fluorescence lifetimes. Fluorescence lifetime measurements are relatively insensitive to intensity artifacts affecting other techniques. Hence, when combined with fiber-optic-based instruments, fluorescence lifetime measurements of endogenous fluorophores could improve clinical diagnostics and provide guidance in surgical procedures.

Le misure di fluorescenza risolte temporalmente possono essere effettuate sia nel dominio del tempo che nel dominio delle frequenze. La tecnica utilizzata nel dominio del tempo, che impiega il conteggio di singolo fotone correlato nel tempo (Time‐Correlated Single Photon Counting, TCSPC), è generalmente considerata il metodo "gold‐standard" per le misure di vita media della fluorescenza, data la sua alta risoluzione temporale, elevata sensibilità e ampia gamma dinamica rispetto ad altri metodi. La tecnica TCSPC è stata ampiamente utilizzata nella ricerca clinica sia in piattaforme di imaging che di singolo punto. Nei sistemi di imaging le misure TCSPC sono in genere lente e poco pratiche per le acquisizioni in tempo reale, dato che i Time-resolved fluorescence measurements can be performed in both the time domain and the frequency domain. The technique used in the time domain, which employs Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC), is generally considered the "gold-standard" method for fluorescence lifetime measurements, given the its high temporal resolution, high sensitivity and wide dynamic range compared to other methods. The TCSPC technique has been widely used in clinical research in both imaging and single-point platforms. In imaging systems, TCSPC measurements are generally slow and impractical for real-time acquisitions, since i

decadimenti della fluorescenza devono essere acquisiti in ogni singolo pixel. In alternativa, gli strumenti a singolo punto, che fanno uso di fibre ottiche, possono integrare il segnale di fluorescenza da un volume di campione più ampio e quindi aumentare la velocità di acquisizione rispetto alle piattaforme di imaging. Un importante svantaggio della strumentazione a singolo punto si riferisce alla mancanza delle informazioni spaziali che sono spesso richieste nelle applicazioni cliniche, ad esempio per identificare i margini dei tessuti patologici. Indipendentemente dal fatto che sia implementata in una piattaforma di imaging o a singolo punto, un'ulteriore limitazione importante della TCSPC si riferisce alla sua incapacità di distinguere i fotoni di fluorescenza dai fotoni di fondo (ad esempio dalla luce della stanza o dall'illuminazione diretta del campo di vista), il che rende le misure TCSPC impraticabili sotto un’intensa illuminazione di fondo. Per questo motivo, la maggior parte degli studi che utilizzano la rivelazione TCSPC sono realizzati in ambienti pre‐clinici, in cui è possibile spegnere le luci della stanza e controllare con più attenzione qualsiasi altra fonte di luce di fondo. La sensibilità della TCSPC alla luce di fondo è forse il più grande ostacolo all'adozione di questa tecnica per la guida dei medici durante le procedure mediche, dal momento che spegnere tutte le fonti di luce di fondo è impossibile o, al limite, può causare una grave interruzione del flusso di lavoro con conseguente possibilità di rischio clinico che, alla fine dei conti, ne limita la diffusione. fluorescence decays must be acquired in every single pixel. Alternatively, single-point instruments, which make use of optical fibers, can integrate the fluorescence signal from a larger sample volume and thus increase the acquisition rate compared to imaging platforms. An important disadvantage of single-point instrumentation relates to the lack of spatial information that is often required in clinical applications, for example to identify the margins of pathological tissues. Regardless of whether it is implemented in an imaging platform or single point, a further major limitation of TCSPC relates to its inability to distinguish fluorescence photons from background photons (e.g. from room light or direct illumination field of view), which makes TCSPC measurements impractical under intense background illumination. For this reason, most studies using TCSPC detection are done in pre-clinical settings, where it is possible to turn off the room lights and control any other background light sources more carefully. The sensitivity of TCSPC to background light is perhaps the biggest obstacle to adopting this technique for guiding doctors during medical procedures, since turning off all background light sources is impossible or, at the very least, can cause a serious interruption of the workflow with consequent possibility of clinical risk which, in the end, limits its spread.

Questa limitazione, ovvero l'incapacità di distinguere i fotoni di fluorescenza emessi dal campione dai fotoni prodotti da fonti di luce esterne utilizzate per l'illuminazione del campione o della stanza, non è un problema specifico solo per la TCSPC ma può anche influenzare altre tecniche di misura stazionarie e risolte temporalmente, le quali impiegano la rivelazione di fotoni nell'intervallo visibile dello spettro elettromagnetico. Questo è il caso delle misure spettrali di fluorescenza stazionaria che impiegano uno spettrometro o delle misure di fluorescenza risolte temporalmente tramite la tecnica time‐gating. This limitation, i.e. the inability to distinguish fluorescence photons emitted by the sample from photons produced by external light sources used for illumination of the sample or room, is not a specific problem only for TCSPC but can also affect other techniques. stationary and time-resolved measurement devices, which employ the detection of photons in the visible range of the electromagnetic spectrum. This is the case with stationary fluorescence spectral measurements using a spectrometer or with time-resolved fluorescence measurements using the time-gating technique.

Sommario dell'invenzione Summary of the invention

Scopo dell'invenzione è quello di fornire un metodo e un sistema per ottenere informazioni spettroscopiche da un campione mentre il campione è illuminato con luce visibile. Preferibilmente, ma non necessariamente, il campione e le informazioni spettroscopiche da esso derivate vengono rappresentate nella stessa immagine che può essere visualizzata e interpretata in tempo reale. The purpose of the invention is to provide a method and a system for obtaining spectroscopic information from a sample while the sample is illuminated with visible light. Preferably, but not necessarily, the sample and the spectroscopic information derived from it are represented in the same image which can be displayed and interpreted in real time.

Secondo un primo aspetto, l'invenzione riguarda un metodo per la spettroscopia elettromagnetica di un campione, il metodo comprendente: According to a first aspect, the invention relates to a method for the electromagnetic spectroscopy of a sample, the method comprising:

‐ Inviare un fascio di eccitazione di radiazione elettromagnetica su una prima porzione di un campione per ottenere emissione, diffusione di fotoni, detti fotoni aventi una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile, da molecole che formano il campione; - Sending an excitation beam of electromagnetic radiation on a first portion of a sample to obtain emission, diffusion of photons, said photons having a wavelength in the visible range, from molecules that form the sample;

‐ Illuminare la prima porzione del campione con una luce visibile, accendendo e spegnendo la luce visibile ad una prima frequenza, in modo da definire gli intervalli di tempo illuminati e gli intervalli di tempo non illuminati del campione; - Illuminate the first portion of the sample with a visible light, turning the visible light on and off at a first frequency, in order to define the illuminated time intervals and the unlit time intervals of the sample;

‐ Rivelare i fotoni emessi e diffusi aventi una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile durante detti intervalli di tempo non illuminati; e - detecting emitted and scattered photons having a wavelength in the visible range during said unlit time intervals; And

‐ Ottenere informazioni spettroscopiche da detti fotoni emessi, diffusi e rivelati. - Obtain spectroscopic information from said photons emitted, scattered and detected.

Secondo un secondo aspetto, l'invenzione riguarda un sistema per ottenere informazioni sulla spettroscopia elettromagnetica di un campione, il sistema comprendente: According to a second aspect, the invention relates to a system for obtaining information on the electromagnetic spectroscopy of a sample, the system comprising:

‐ una sorgente di eccitazione che emette un fascio di radiazione elettromagnetica verso una prima porzione di un campione, detta sorgente di eccitazione emettente un fascio tra 300 nm e 700 nm; - an excitation source that emits a beam of electromagnetic radiation towards a first portion of a sample, said excitation source emitting a beam between 300 nm and 700 nm;

‐ una sorgente di luce visibile per illuminare il campione; - a visible light source to illuminate the sample;

‐ un elemento di commutazione della sorgente di luce visibile atto ad accendere e spegnere la sorgente luminosa ad una prima frequenza, in modo da definire intervalli di tempo illuminati e intervalli di tempo non illuminati del campione; - a switching element of the visible light source adapted to turn the light source on and off at a first frequency, so as to define illuminated time intervals and unlit time intervals of the sample;

‐ un rivelatore di fotoni per rilevare fotoni emessi, diffusi dal campione a causa del fascio di eccitazione, detto rivelatore di fotoni avente un intervallo di lunghezze d'onda di rivelazione nell'intervallo visibile, e generare un segnale corrispondente; e - a photon detector for detecting emitted photons scattered from the sample due to the excitation beam, said photon detector having a range of detection wavelengths in the visible range, and generating a corresponding signal; And

‐ una unità di controllo per attivare detto rivelatore per rilevare fotoni emessi e diffusi dal campione solo durante detti intervalli di tempo non illuminati o per attivare un otturatore per impedire che i fotoni emessi, diffusi raggiungano il rivelatore durante detti intervalli di tempo illuminati e ottenere informazioni spettroscopiche da detto segnale in funzione dei fotoni rivelati. - a control unit for activating said detector to detect photons emitted and scattered by the sample only during said non-illuminated time intervals or to activate a shutter to prevent the emitted, scattered photons from reaching the detector during said illuminated time intervals and to obtain information spectroscopic from said signal as a function of the photons detected.

La spettroscopia riguarda la ricerca e la misura dell'interazione della radiazione elettromagnetica con la materia. I tipi di spettroscopia sono classificati in base al tipo di radiazione coinvolta nell'interazione. Questi includono, ma non sono limitati a, spettroscopia ultravioletta/visibile, spettroscopia a infrarossi o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Spectroscopy concerns the research and measurement of the interaction of electromagnetic radiation with matter. The types of spectroscopy are classified according to the type of radiation involved in the interaction. These include, but are not limited to, ultraviolet / visible spectroscopy, infrared spectroscopy, or nuclear magnetic resonance spectroscopy.

In molte applicazioni, lo spettro è determinato misurando le variazioni di intensità o frequenza di questa energia. I tipi di energia studiati includono la radiazione elettromagnetica e la spettroscopia corrispondente è detta spettroscopia elettromagnetica. La spettroscopia include anche altre radiazioni (come particelle o onde acustiche). In many applications, the spectrum is determined by measuring the changes in intensity or frequency of this energy. The types of energy studied include electromagnetic radiation and the corresponding spectroscopy is called electromagnetic spectroscopy. Spectroscopy also includes other radiation (such as particles or acoustic waves).

Le tecniche che impiegano radiazioni elettromagnetiche sono tipicamente classificate dalla regione spettrale della lunghezza d'onda. Techniques employing electromagnetic radiation are typically classified by the spectral region of the wavelength.

Inoltre, la spettroscopia può essere classificata come spettroscopia di emissione o spettroscopia di diffusione o scattering. Furthermore, spectroscopy can be classified as emission spectroscopy or diffusion or scattering spectroscopy.

L'emissione è il processo mediante il quale uno stato quantico di una molecola, avente energia più alta, viene convertito in uno di energia inferiore attraverso l'emissione di un fotone, risultante nella produzione di luce. La frequenza della luce emessa è funzione dell'energia di transizione. Poiché l'energia deve essere conservata, la differenza di energia tra i due stati è uguale all'energia trasportata dal fotone. Gli stati energetici delle transizioni possono portare a emissioni su una gamma molto ampia di frequenze. Ad esempio, la luce visibile viene emessa dall'accoppiamento di stati elettronici in atomi e molecole (quindi il fenomeno è chiamato fluorescenza o fosforescenza). Un fascio di eccitazione può in questo caso causare l'emissione di fotoni dal campione. Emission is the process by which a quantum state of a molecule, having higher energy, is converted into one of lower energy through the emission of a photon, resulting in the production of light. The frequency of the light emitted is a function of the transition energy. Since energy must be conserved, the difference in energy between the two states is equal to the energy carried by the photon. The energy states of the transitions can lead to emissions over a very wide range of frequencies. For example, visible light is emitted by the coupling of electronic states in atoms and molecules (so the phenomenon is called fluorescence or phosphorescence). An excitation beam can in this case cause photons to be emitted from the sample.

I fotoni possono non solo essere emessi dal campione, cioè l'invenzione non si riferisce solo alla spettroscopia di emissione. Anche la spettroscopia di diffusione (o scattering) può essere considerata parte dell'invenzione. In questo caso, il raggio di eccitazione include fotoni nell'intervallo visibile che sono diffusi dalle molecole del campione. Questi fotoni diffusi, che hanno ancora una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile, vengono rilevati dal rivelatore di fotoni e anche da questi fotoni è possibile ottenere informazioni spettroscopiche. Photons can not only be emitted from the sample, i.e. the invention does not only relate to emission spectroscopy. Diffusion (or scattering) spectroscopy can also be considered part of the invention. In this case, the excitation beam includes photons in the visible range which are scattered by the sample molecules. These scattered photons, which still have a wavelength in the visible range, are detected by the photon detector and spectroscopic information can also be obtained from these photons.

In altre parole, l'invenzione si riferisce a qualsiasi spettro che è ottenibile spettroscopicamente da un campione dopo aver indirizzato un fascio di eccitazione verso di esso e rivelando i fotoni uscenti dal campione, i fotoni essendo nell'intervallo visibile. In other words, the invention relates to any spectrum that is spectroscopically obtainable from a sample after directing an excitation beam towards it and detecting the photons exiting the sample, the photons being in the visible range.

Pertanto, nella presente invenzione, al fine di studiare un campione e ottenere informazioni spettroscopiche dallo stesso, il campione viene irradiato con radiazione elettromagnetica, chiamata fascio di eccitazione, avente una determinata lunghezza d'onda (o frequenza). Questa lunghezza d'onda può essere variata entro un intervallo di sintonia. Le lunghezze d'onda della radiazione elettromagnetica che vengono selezionate dipendono dal materiale in cui è realizzato il campione e dagli stati delle molecole che si desidera eccitare. Ad esempio, detta lunghezza d'onda del fascio di eccitazione potrebbe essere compresa tra 300 nm e 700 nm. Therefore, in the present invention, in order to study a sample and obtain spectroscopic information from it, the sample is irradiated with electromagnetic radiation, called an excitation beam, having a certain wavelength (or frequency). This wavelength can be varied within a tuning range. The wavelengths of electromagnetic radiation that are selected depend on the material in which the sample is made and on the states of the molecules to be excited. For example, said wavelength of the excitation beam could be between 300 nm and 700 nm.

Il fascio di eccitazione in questo caso ha preferibilmente una lunghezza d'onda nell'intervallo ultravioletto/blu. The excitation beam in this case preferably has a wavelength in the ultraviolet / blue range.

Nella presente invenzione, questo fascio di eccitazione induce il campione a emettere fotoni, oppure i fotoni del fascio di eccitazione sono diffusi dal campione. I fotoni che vengono emessi, diffusi dal campione hanno una lunghezza d'onda all'interno dell'intervallo visibile. In the present invention, this excitation beam causes the sample to emit photons, or the photons of the excitation beam are scattered from the sample. The photons that are emitted, scattered by the sample have a wavelength within the visible range.

In questo testo, con il termine “diffusione” (o "scattering"), si intende sia lo scattering elastico che anelastico. Lo scattering elastico è una forma di diffusione in cui viene conservata l'energia di un fotone, ma la sua direzione di propagazione viene modificata. Lo scattering anelastico è un processo di scattering in cui l'energia di un fotone incidente non viene conservata (differentemente dallo scattering elastico). Allo stesso modo, con l'aggettivo "diffusi", come i fotoni diffusi, si intendono sia i fotoni diffusi inelasticamente che elasticamente. Pertanto, se non diversamente specificato, il fenomeno di diffusione (o scattering) qui discusso comprende sia il fenomeno elastico che quello anelastico. In this text, the term "diffusion" (or "scattering") refers to both elastic and inelastic scattering. Elastic scattering is a form of scattering in which the energy of a photon is conserved, but its direction of propagation is changed. Inelastic scattering is a scattering process in which the energy of an incident photon is not conserved (unlike elastic scattering). Similarly, with the adjective "diffuse", like diffuse photons, we mean both inelastically and elastically diffused photons. Therefore, unless otherwise specified, the scattering phenomenon discussed here includes both elastic and inelastic phenomena.

Lo spettro visibile è la parte dello spettro elettromagnetico che è visibile all'occhio umano. La radiazione elettromagnetica in questo intervallo di lunghezze d'onda è chiamata luce visibile. Un tipico occhio umano risponde a lunghezze d'onda da circa 380 a 780 nanometri. In termini di frequenza, ciò corrisponde a una banda di circa 385 ‐ 790 THz. Di seguito, con il termine "intervallo visibile" della radiazione elettromagnetica si intendono gli intervalli sopra menzionati. The visible spectrum is the part of the electromagnetic spectrum that is visible to the human eye. Electromagnetic radiation in this wavelength range is called visible light. A typical human eye responds to wavelengths of approximately 380 to 780 nanometers. In terms of frequency, this corresponds to a band of approximately 385 - 790 THz. Hereinafter, the term "visible range" of electromagnetic radiation means the aforementioned ranges.

Ciò non significa che tutti i fotoni emessi o diffusi dal campione a causa del fascio di eccitazione debbano avere una lunghezza d'onda all'interno dell'intervallo visibile. È sufficiente che solo alcuni dei fotoni emessi o diffusi abbiano una lunghezza d'onda all'interno di tale intervallo. Inoltre, i fotoni emessi, diffusi possono avere una pluralità di diverse lunghezze d'onda, ovvero possono non avere tutti la stessa lunghezza d'onda. Pertanto, i fotoni emessi o diffusi definiscono una banda di emissione, definita dal loro intervallo di lunghezze d'onda. This does not mean that all photons emitted or scattered by the sample due to the excitation beam must have a wavelength within the visible range. It is sufficient that only some of the emitted or scattered photons have a wavelength within this range. Furthermore, the emitted, scattered photons may have a plurality of different wavelengths, that is, they may not all have the same wavelength. Thus, emitted or scattered photons define an emission band, defined by their wavelength range.

Il fascio di eccitazione potrebbe essere ad esempio prodotto da un laser. Preferibilmente, il fascio di eccitazione è sostanzialmente un fascio monocromatico. Preferibilmente, il fascio di eccitazione è un fascio a impulsi, cioè il raggio comprende una pluralità di impulsi emessi con una data frequenza. Preferibilmente, la frequenza data è compresa nell'intervallo dei MHz, ad esempio da 1 MHz a 100 MHz. Preferibilmente, il ciclo di lavoro del fascio impulsato è inferiore al 50%. The excitation beam could for example be produced by a laser. Preferably, the excitation beam is substantially a monochromatic beam. Preferably, the excitation beam is a pulsed beam, i.e. the beam comprises a plurality of pulses emitted with a given frequency. Preferably, the given frequency is comprised in the MHz range, for example from 1 MHz to 100 MHz. Preferably, the duty cycle of the pulsed beam is less than 50%.

Il fascio di eccitazione viene inviato ad una porzione specifica del campione, chiamata prima porzione. Preferibilmente, questa porzione è più piccola dell'intero campione. Preferibilmente, è molto più piccola dell'intero campione. Ad esempio, la dimensione della prima porzione è compresa tra 0,1 mm e 3 mm (questa è la dimensione più grande, ad esempio questo è il diametro della prima porzione in caso di un fascio sostanzialmente circolare). La prima porzione è quindi una porzione della superficie del campione. The excitation beam is sent to a specific portion of the sample, called the first portion. Preferably, this portion is smaller than the entire sample. Preferably, it is much smaller than the entire sample. For example, the size of the first portion is between 0.1mm and 3mm (this is the largest size, for example this is the diameter of the first portion in case of a substantially circular beam). The first portion is therefore a portion of the sample surface.

Questa prima porzione specifica una zona superficiale del campione ma allo stesso tempo definisce anche una porzione di volume dello stesso, in particolare quella porzione di volume del campione che è irraggiata dal fascio di eccitazione. I fotoni che vengono emessi o diffusi a causa del fascio di eccitazione inviato sulla prima porzione sono i fotoni che danno l'informazione spettroscopica di interesse. Per ogni intervallo di tempo, viene quindi considerata una singola prima porzione del campione. Questo modo di considerare un singolo volume specifico del campione per ogni misura viene anche indicato in letteratura come "misura di singolo punto". Le misure a singolo punto si riferiscono a misurazioni in cui le informazioni spettroscopiche vengono raccolte per un singolo "punto" (che può essere pensato come un singolo pixel) alla volta, la porzione di volume sopra menzionata del campione. Poiché i dati vengono acquisiti da un volume, viene misurata solo una posizione in un dato momento e pertanto le misure a singolo punto non hanno una risoluzione spaziale. Le misure a singolo punto singolo vengono generalmente effettuate utilizzando sonde a fibra ottica. This first portion specifies a surface area of the sample but at the same time also defines a volume portion of the same, in particular that portion of the sample volume which is irradiated by the excitation beam. The photons that are emitted or scattered due to the excitation beam sent on the first portion are the photons that give the spectroscopic information of interest. For each time interval, a single first portion of the sample is then considered. This way of considering a single specific volume of the sample for each measurement is also referred to in the literature as a "single point measurement". Single point measurements refer to measurements where spectroscopic information is collected for a single "point" (which can be thought of as a single pixel) at a time, the aforementioned volume portion of the sample. Since data is acquired from a volume, only one location is measured at any given time and therefore single-point measurements have no spatial resolution. Single point measurements are typically made using fiber optic probes.

Queste contrastano con le misure di “imaging”, in cui le informazioni vengono catturate da vari punti indipendenti "simultaneamente". These contrast with "imaging" measures, in which information is captured from various independent points "simultaneously".

Inoltre, affinché un utente possa vedere il campione durante le misure spettroscopiche, il campione viene globalmente illuminato da una data sorgente luminosa, che emette radiazione elettromagnetica all'interno dell'intervallo visibile. Questa sorgente luminosa potrebbe essere ad esempio un diodo ad emissione luminosa (LED). Furthermore, in order for a user to see the sample during spectroscopic measurements, the sample is globally illuminated by a given light source, which emits electromagnetic radiation within the visible range. This light source could be for example a light emitting diode (LED).

Preferibilmente, la sorgente di luce visibile può includere un LED bianco, sebbene possano essere usati LED di qualsiasi lunghezza d'onda. In alternativa, è possibile utilizzare la "luce ambientale" standard, che è modulata a 50‐60 Hz (a seconda del paese), ed è quindi preferibilmente sincronizzata con la misura spettroscopica, come descritto di seguito. Preferably, the visible light source can include a white LED, although LEDs of any wavelength can be used. Alternatively, the standard "ambient light" can be used, which is modulated at 50-60 Hz (depending on the country), and is therefore preferably synchronized with the spectroscopic measurement, as described below.

Inoltre, è possibile utilizzare più di una sorgente di luce visibile. Ad esempio, la sorgente di luce visibile può includere due o più LED bianchi, per aumentare l'intensità; un LED rosso, un LED blu e un LED verde che illuminano il campione simultaneamente per generare un'illuminazione bianca. Ovviamente è possibile utilizzare più di un LED per colore. In addition, more than one visible light source can be used. For example, the visible light source may include two or more white LEDs, to increase the intensity; a red LED, a blue LED and a green LED that illuminate the sample simultaneously to generate white illumination. Obviously it is possible to use more than one LED per color.

La sorgente luminosa visibile tuttavia non illumina il campione continuamente, ma si accende e si spegne ad una determinata prima frequenza. Questa prima frequenza potrebbe essere costante o potrebbe variare nel tempo. Il campione viene quindi illuminato da questa luce visibile in determinati intervalli di tempo, quando la sorgente di luce visibile viene accesa, e non illuminata in altri intervalli di tempo, quando la sorgente di luce visibile viene spenta. Solo la prima porzione, e non l'intero campione, devono essere illuminati dalla sorgente di luce visibile. Preferibilmente, l'intero campione è illuminato dalla sorgente di luce visibile. The visible light source, however, does not illuminate the sample continuously, but switches on and off at a certain first frequency. This first frequency could be constant or it could vary over time. The sample is then illuminated by this visible light at certain time intervals, when the visible light source is turned on, and not illuminated at other time intervals, when the visible light source is turned off. Only the first portion, and not the entire sample, must be illuminated by the visible light source. Preferably, the entire sample is illuminated by the visible light source.

Preferibilmente gli intervalli di tempo non illuminati sono più lunghi degli intervalli di tempo illuminati. Preferably the unlit time intervals are longer than the illuminated time intervals.

Preferibilmente, la prima frequenza è superiore o uguale a 40 Hz. Per quanto riguarda il ciclo di lavoro della luce emessa dalla sorgente di luce visibile, cioè la frazione di tempo durante la quale la sorgente di luce visibile è accesa entro un periodo, è preferibilmente intrinsecamente correlata al tempo di acquisizione spettroscopico. Preferibilmente, il ciclo di lavoro è impostato il più basso possibile (per massimizzare il tempo di acquisizione durante il ciclo di spegnimento), a condizione che il campione sia chiaramente visibile all'operatore. Ad esempio, la sorgente di luce visibile può essere attivata solo per 500 μs (2,5% a 50 Hz) purché fornisca un'illuminazione sufficiente del campione affinché l'utente possa vederlo chiaramente. Preferably, the first frequency is greater than or equal to 40 Hz. As regards the duty cycle of the light emitted by the visible light source, i.e. the fraction of time during which the visible light source is switched on within a period, it is preferably intrinsically related to the spectroscopic acquisition time. Preferably, the duty cycle is set as low as possible (to maximize acquisition time during the shutdown cycle), provided that the sample is clearly visible to the operator. For example, the visible light source can only be activated for 500 μs (2.5% at 50 Hz) as long as it provides enough illumination of the sample for the user to see clearly.

Tuttavia, in una diversa forma di implementazione, è anche possibile il contrario. Ad esempio, se la durata dell'intervallo di accensione della sorgente di luce visibile è di circa 18 ms in cicli di 20 ms (90% a 50 Hz), ciò può andare bene fintanto che il campione è chiaramente visibile all'operatore e ci sono un numero sufficiente di fotoni emessi o diffusi dal campione e rivelati durante il periodo di spegnimento della sorgente di luce visibile. However, in a different form of implementation, the reverse is also possible. For example, if the duration of the switch-on interval of the visible light source is approximately 18 ms in cycles of 20 ms (90% at 50 Hz), this may be fine as long as the sample is clearly visible to the operator and there are a sufficient number of photons emitted or scattered by the sample and detected during the shutdown period of the visible light source.

L'invenzione prevede inoltre una fase in cui vengono rivelati i fotoni emessi o diffusi dal campione a causa del fascio di eccitazione. La rivelazione viene realizzata ad esempio da un rivelatore di fotoni, come un tubo fotomoltiplicatore (PhotoMultiplier Tube, PMT), un diodo a valanga a singolo fotone (Single Photon Avalanche Diode, SPAD), un rilevatore ibrido o una camera con dispositivo di accoppiamento di carica (Charge‐Coupled Device, CCD). Tuttavia, questa rivelazione si verifica solo quando la sorgente di luce visibile è spenta, ovvero negli intervalli di tempo durante i quali la sorgente di luce visibile non illumina il campione (negli intervalli di tempo non illuminati). In questo modo, i fotoni rivelati sono dovuti solo all'emissione o alla diffusione da parte del campione e non alla sorgente di luce visibile utilizzata per rendere il campione visibile all'utente. Pertanto, la rivelazione di fotoni emessi o diffusi si verifica solo durante gli intervalli di tempo non illuminati e non durante gli intervalli di tempo illuminati. In alternativa, i fotoni emessi o diffusi vengono continuamente rivelati durante gli intervalli di tempo illuminati e non illuminati, ma i fotoni che arrivano durante l'intervallo di tempo illuminato non vengono considerati nella successiva fase di elaborazione, cioè nessun segnale derivato dai fotoni rivelati durante gli intervalli di tempo illuminati vengono utilizzati per ottenere informazioni spettroscopiche. In alternativa, il rivelatore è oscurato durante l'intervallo di tempo illuminato utilizzando, ad esempio, un otturatore meccanico, in modo che nessun fotone possa raggiungere il rivelatore quando il campione è illuminato dalla sorgente di luce visibile. The invention also provides a step in which the photons emitted or scattered by the sample due to the excitation beam are detected. The detection is realized for example by a photon detector, such as a photomultiplier tube (PMT), a single photon avalanche diode (SPAD), a hybrid detector or a camera with a coupling device. charge (Charge ‐ Coupled Device, CCD). However, this detection only occurs when the visible light source is turned off, i.e. in the time intervals during which the visible light source does not illuminate the sample (in the unlit time intervals). In this way, the detected photons are due only to the emission or diffusion by the sample and not to the visible light source used to make the sample visible to the user. Thus, the detection of emitted or scattered photons occurs only during the unlit time intervals and not during the illuminated time intervals. Alternatively, the emitted or scattered photons are continuously detected during the illuminated and non-illuminated time intervals, but the photons arriving during the illuminated time interval are not considered in the subsequent processing step, i.e. no signal derived from the photons detected during the illuminated time intervals are used to obtain spectroscopic information. Alternatively, the detector is obscured during the illuminated time interval using, for example, a mechanical shutter, so that no photons can reach the detector when the sample is illuminated by the visible light source.

I fotoni rivelati vengono utilizzati per ottenere informazioni spettroscopiche, cioè dati, a partire da un segnale generato dalla loro rivelazione. Ad esempio, è possibile calcolare la durata della vita media di fluorescenza, ovvero l'informazione sul decadimento temporale dell'intensità di fluorescenza derivata dai fotoni rivelati. Per ottenere l'informazione spettroscopica dai fotoni rivelati, il segnale derivato dalla The detected photons are used to obtain spectroscopic information, ie data, starting from a signal generated by their detection. For example, it is possible to calculate the average fluorescence life span, which is the information on the temporal decay of the fluorescence intensity derived from the detected photons. To obtain the spectroscopic information from the detected photons, the signal derived from the

rivelazione dei fotoni, ad es. il segnale emesso dal rivelatore di fotoni, viene elaborato utilizzando algoritmi e tecniche idonee per derivarne le informazioni spettroscopiche richieste. photon detection, e.g. the signal emitted by the photon detector is processed using suitable algorithms and techniques to derive the required spectroscopic information.

Preferibilmente, il segnale derivato dalla rivelazione dei fotoni viene elaborato durante gli intervalli di tempo non illuminati. Pertanto, in ciascun intervallo di tempo non illuminato, possono verificarsi i seguenti processi: Preferably, the signal derived from photon detection is processed during the unlit time intervals. Therefore, in each unlit time interval, the following processes can occur:

‐ rivelare i fotoni dovuti all'emissione o alla diffusione da parte del campione durante ciascuno degli intervalli di tempo non illuminati; - detecting photons due to emission or scattering by the sample during each of the unlit time intervals;

‐ generare un segnale in funzione dei fotoni emessi o diffusi dal campione e rivelati; - generate a signal as a function of the photons emitted or scattered by the sample and detected;

‐ analizzare il segnale per ottenere le informazioni spettroscopiche. - analyze the signal to obtain the spectroscopic information.

L'ultima sotto‐fase, cioè l'analisi, può continuare anche durante un successivo intervallo di tempo illuminato, ma finisce prima del successivo intervallo di tempo non illuminato, cioè, per ciascun intervallo di tempo non illuminato j e per ciascun successivo intervallo di tempo illuminato k, la fase di analisi termina prima che inizi l'intervallo di tempo non illuminato j + 1. The last sub-step, i.e. the analysis, can also continue during a subsequent illuminated time interval, but ends before the next unlit time interval, i.e., for each non-illuminated time interval j and for each subsequent interval of illuminated time k, the analysis phase ends before the unlit time interval j + 1 begins.

Pertanto, entro un intervallo non illuminato e un successivo intervallo di tempo illuminato, ma prima che inizi il successivo intervallo di tempo non illuminato, tutte le informazioni necessarie per ottenere le informazioni spettroscopiche desiderate vengono raccolte ed elaborate. Ad esempio, le possibili informazioni spettroscopiche significano durata della vita media di fluorescenza, componenti della durata della vita media di fluorescenza, intensità di fluorescenza, intensità di fluorescenza raziometrica, spettro di fluorescenza, caratteristiche spettrali della fluorescenza. Thus, within a non-illuminated interval and a subsequent illuminated time interval, but before the next non-illuminated time interval begins, all the information necessary to obtain the desired spectroscopic information is collected and processed. For example, possible spectroscopic information means mean fluorescence lifespan, components of the mean fluorescence lifespan, fluorescence intensity, ratiometric fluorescence intensity, fluorescence spectrum, spectral characteristics of fluorescence.

In questo modo, le informazioni spettroscopiche possono essere visualizzate sostanzialmente in tempo reale non appena vengono elaborate. In this way, the spectroscopic information can be viewed substantially in real time as it is processed.

Questo metodo e il sistema dell'invenzione garantiscono che i fotoni emessi o diffusi dal campione dovuti al fascio di eccitazione ed i fotoni di fondo (in questo caso provenienti dalla sorgente di luce visibile) sono risolti temporalmente ed il segnale ottenuto dai fotoni rivelati è libero dalla luce di fondo luminoso, che rende le misure spettroscopiche possibili e pratiche in condizioni di fondo luminoso. Questo metodo e sistema possono quindi essere utilizzati anche durante le procedure chirurgiche quando l'illuminazione del campione è essenziale. This method and the system of the invention guarantee that the photons emitted or scattered by the sample due to the excitation beam and the background photons (in this case coming from the visible light source) are temporally resolved and the signal obtained from the detected photons is free. by the bright background light, which makes spectroscopic measurements possible and practical in bright background conditions. This method and system can therefore also be used during surgical procedures when specimen illumination is essential.

Ciò è possibile grazie alla sincronizzazione della rivelazione dei fotoni emessi o diffusi con una sorgente di luce visibile esterna. In particolare, viene utilizzata una sorgente luminosa a luce impulsata per fornire l'illuminazione periodica del campione. La misura spettroscopica è sfasata rispetto all'illuminazione della sorgente luminosa visibile, ad es. viene attivata quando la sorgente luminosa viene spenta e viene arrestata This is possible thanks to the synchronization of the detection of the emitted or scattered photons with an external visible light source. In particular, a pulsed light source is used to provide periodic illumination of the sample. The spectroscopic measurement is out of phase with respect to the illumination of the visible light source, e.g. it is activated when the light source is turned off and stopped

prima di un altro ciclo "acceso". In questo modo, i fenomeni spettroscopici e i fotoni di fondo possono essere risolti temporalmente e quindi il corrispondente segnale del rivelatore di fotoni è privo del contributo proveniente dal fondo, il che rende le misurazioni spettroscopiche possibili e pratiche in condizioni di luce visibile. before another "on" cycle. In this way, spectroscopic phenomena and background photons can be temporally resolved and thus the corresponding photon detector signal is devoid of the contribution from the background, which makes spectroscopic measurements possible and practical in visible light conditions.

Preferibilmente, il fascio di eccitazione viene erogato mediante una sonda a fibra ottica. Preferably, the excitation beam is delivered by means of an optical fiber probe.

Per aumentare ulteriormente l'impatto e l'applicabilità di questo metodo e sistema in contesti clinici, l'erogazione della luce di eccitazione e la corrispondente raccolta di fotoni possono essere preferibilmente realizzati con una sonda a fibra ottica utilizzando un approccio a punto singolo. Le mappe spettroscopiche possono essere create e visualizzate nelle misure a singolo punto sovrapponendo un fascio di guida visibile al fascio di eccitazione, che crea un riferimento visibile sul campione che può essere reso in immagine ed elaborato in tempo reale. To further increase the impact and applicability of this method and system in clinical settings, the delivery of the excitation light and the corresponding collection of photons can preferably be accomplished with a fiber optic probe using a single point approach. Spectroscopic maps can be created and displayed in single-point measurements by superimposing a visible guide beam on the excitation beam, which creates a visible reference on the sample that can be imaged and processed in real time.

In accordo con il primo o secondo aspetto, l'invenzione può includere, come alternativa o in combinazione, una o più delle seguenti caratteristiche. In accordance with the first or second aspect, the invention may include, as an alternative or in combination, one or more of the following characteristics.

Preferibilmente, detta prima frequenza è uguale o superiore a 40 Hz. Ancora più preferibilmente, la prima frequenza è uguale o superiore a circa 50 Hz. Preferibilmente, la prima frequenza è compresa tra 40 Hz e 1 kHz. Preferibilmente, il ciclo di lavoro è compreso tra il 2% ed il 90% della prima frequenza. Preferably, said first frequency is equal to or greater than 40 Hz. Even more preferably, the first frequency is equal to or greater than about 50 Hz. Preferably, the first frequency is between 40 Hz and 1 kHz. Preferably, the duty cycle is comprised between 2% and 90% of the first frequency.

La prima frequenza è impostata sopra i 40 Hz perché è preferibile che questa frequenza sia sufficientemente alta per evitare l'effetto stroboscopico di una sorgente lampeggiante e quindi la luce sembrerà essere continua all'occhio umano. Più preferibilmente, la prima frequenza è impostata a circa 50 Hz poiché corrisponde alla frequenza di corrente alternata (Alternating Current, AC) nella maggior parte dei paesi. The first frequency is set above 40 Hz because it is preferable that this frequency is high enough to avoid the stroboscopic effect of a flashing source and therefore the light will appear to be continuous to the human eye. More preferably, the first frequency is set at about 50 Hz as it corresponds to the Alternating Current (AC) frequency in most countries.

Preferibilmente, il metodo comprende: Preferably, the method comprises:

‐ generare la prima frequenza con un primo temporizzatore (clock); - generating the first frequency with a first timer (clock);

‐ generare una seconda frequenza con un secondo temporizzatore, in cui la seconda frequenza è la frequenza alla quale vengono rivelati i fotoni emessi, riflessi o diffusi; e - generating a second frequency with a second timer, in which the second frequency is the frequency at which the emitted, reflected or scattered photons are detected; And

‐ agganciare in fase il primo ed il secondo temporizzatore. - engage the first and second timers in phase.

Preferibilmente la prima (f1) e la seconda frequenza (f2) sono le stesse. In alternativa, la seconda frequenza (f2) può anche essere creata dividendo per un numero intero il valore della prima frequenza (f1) in modo tale che vengano soddisfatti i seguenti criteri: Preferably the first (f1) and the second frequency (f2) are the same. Alternatively, the second frequency (f2) can also be created by dividing the value of the first frequency (f1) by an integer so that the following criteria are met:

Preferibilmente, la prima frequenza è generata da un temporizzatore. Ancora più preferibilmente, vengono generati due temporizzatori agganciati in fase: il primo temporizzatore è il temporizzatore che genera la prima frequenza della sorgente di luce visibile. Ad esempio, una possibile prima frequenza potrebbe essere impostata su 50 Hz e su un ciclo di lavoro del 10% (cioè 2 ms). Un secondo temporizzatore è impostato per le misure di spettroscopia, cioè per la rivelazione dei fotoni e l'elaborazione del segnale risultante per ottenere le informazioni spettroscopiche desiderate. Il secondo temporizzatore ha quindi una seconda frequenza, per esempio impostata uguale alla prima frequenza (ad esempio impostata su 50 Hz) e sfasata rispetto al primo temporizzatore. Ad esempio, lo sfasamento potrebbe essere uguale a 50° che equivale a un ritardo di 2,8 ms. Preferably, the first frequency is generated by a timer. Even more preferably, two phase locked timers are generated: the first timer is the timer that generates the first frequency of the visible light source. For example, a possible first frequency could be set to 50 Hz and a 10% duty cycle (i.e. 2 ms). A second timer is set up for spectroscopy measurements, i.e. for detecting photons and processing the resulting signal to obtain the desired spectroscopic information. The second timer therefore has a second frequency, for example set equal to the first frequency (for example set to 50 Hz) and out of phase with the first timer. For example, the phase shift could be equal to 50 ° which equates to a delay of 2.8 ms.

Il primo temporizzatore è preferibilmente usato per modulare direttamente la sorgente di luce visibile, in modo che questa sia attivata e disattivata alla prima frequenza, nell'esempio sopra è accesa per 2 ms (durata dell'intervallo di tempo illuminato) ogni 20 ms di periodo del temporizzatore (quindi l'intervallo di tempo non illuminato dura 18 ms). Il secondo temporizzatore viene utilizzato per attivare la rivelazione dei fotoni e la misura spettroscopica, come ad esempio una misura di vita media della fluorescenza. L'acquisizione (rivelazione) dei fotoni può per esempio iniziare sul fronte di salita del secondo temporizzatore e correre per un periodo predefinito Δt, che preferibilmente è impostato in modo da non sovrapporsi al successivo intervallo di tempo illuminato dalla sorgente di luce visibile. Questa strategia garantisce che l'informazione spettroscopica misurata, ad esempio un segnale di fluorescenza, non sia contaminata dalla luce di fondo prodotta dalla sorgente di luce visibile, poiché i due segnali sono temporalmente separati. The first timer is preferably used to directly modulate the visible light source, so that it is switched on and off at the first frequency, in the example above it is switched on for 2 ms (duration of the illuminated time interval) every 20 ms of period of the timer (therefore the unlit time interval lasts 18 ms). The second timer is used to activate photon detection and spectroscopic measurement, such as a fluorescence lifetime measurement. The acquisition (detection) of photons can for example start on the rising edge of the second timer and run for a predefined period Δt, which is preferably set so as not to overlap the next time interval illuminated by the visible light source. This strategy ensures that the measured spectroscopic information, such as a fluorescence signal, is not contaminated by the background light produced by the visible light source, since the two signals are temporally separated.

In alternativa, la prima frequenza può essere generata da un fotodiodo che rivela variazioni periodiche dell'intensità di luce nella stanza, invece che da un temporizzatore. Ad esempio, un fotodiodo può essere utilizzato per rilevare variazioni periodiche dell'intensità luminosa della stanza e attivare l'acquisizione spettroscopica quando l'intensità luminosa della stanza si trova al di sotto di una soglia predefinita. Alternatively, the first frequency can be generated by a photodiode that detects periodic variations in the light intensity in the room, rather than by a timer. For example, a photodiode can be used to detect periodic changes in the light intensity of the room and trigger spectroscopic acquisition when the light intensity of the room is below a predefined threshold.

Preferibilmente, il metodo include: Preferably, the method includes:

‐ predisporre una telecamera; - set up a camera;

‐ inviare un fascio di radiazione elettromagnetica di guida rivelabile da detta telecamera su una seconda porzione di un campione, correlata alla prima porzione, per rivelare la posizione del fascio di guida; - sending a beam of electromagnetic guiding radiation detectable by said camera on a second portion of a sample, correlated to the first portion, to detect the position of the guiding beam;

‐ acquisire un'immagine del campione usando la fotocamera. - acquire an image of the sample using the camera.

Preferibilmente, il sistema include: Preferably, the system includes:

‐ una telecamera; - a camera;

‐ una sorgente di radiazione elettromagnetica del fascio di guida avente una lunghezza d'onda rivelabile da detta telecamera, atta ad emettere detto fascio di guida di radiazione elettromagnetica su una seconda porzione di un campione, correlata alla prima porzione, per rivelare la posizione del fascio di guida; - a source of electromagnetic radiation of the guiding beam having a wavelength detectable by said camera, adapted to emit said guiding beam of electromagnetic radiation on a second portion of a sample, related to the first portion, to detect the position of the beam driving;

‐ un'unità di controllo della telecamera per controllare la telecamera ed acquisire un'immagine del campione utilizzando la telecamera. - a camera control unit to control the camera and acquire a sample image using the camera.

Dipendentemente delle informazioni spettroscopiche desiderate, il fascio di eccitazione può avere una lunghezza d'onda al di fuori dello spettro visibile. Ciò significa che il fascio di eccitazione inviato sulla prima porzione del campione potrebbe non essere visibile all'occhio umano e, pertanto, l'esatta posizione del fascio di eccitazione sul campione non è nota all'utente, cioè non è noto dove la prima porzione è situata all'interno del campione. Tuttavia, è desiderabile avere immagini, preferibilmente in tempo reale, sia delle informazioni spettroscopiche sia della porzione del campione da cui proviene l'informazione. Depending on the desired spectroscopic information, the excitation beam can have a wavelength outside the visible spectrum. This means that the excitation beam sent on the first portion of the sample may not be visible to the human eye and, therefore, the exact position of the excitation beam on the sample is not known to the user, i.e. it is not known where the first portion it is located inside the sample. However, it is desirable to have images, preferably in real time, both of the spectroscopic information and of the portion of the sample from which the information comes.

A tale scopo, le informazioni spettroscopiche, come le mappe di vita media della fluorescenza, possono essere create e visualizzate sovrapponendo un fascio di guida al fascio di eccitazione, che crea un riferimento sul campione, riferimento visibile all'occhio umano, alla fotocamera o ad entrambi, che può essere reso in immagine e segmentato in tempo reale. Pertanto, su un'immagine del campione, viene visualizzata sia la prima porzione del campione (identificata dalla posizione del fascio di guida proiettata sulla superficie del campione) sia le informazioni spettroscopiche ottenute rivelando e analizzando i fotoni emessi o diffusi da quella prima porzione del campione. To do this, spectroscopic information, such as fluorescence lifetime maps, can be created and displayed by superimposing a guide beam on the excitation beam, which creates a reference on the sample, visible to the human eye, camera, or other. both, which can be rendered in image and segmented in real time. Therefore, on an image of the sample, both the first portion of the sample (identified by the position of the guiding beam projected on the surface of the sample) and the spectroscopic information obtained by detecting and analyzing the photons emitted or scattered by that first portion of the sample are displayed .

Preferibilmente, il fascio di guida viene indirizzato mediante una sonda a fibra ottica. Preferably, the guide beam is addressed by means of a fiber optic probe.

La radiazione elettromagnetica emessa dal fascio di guida è ad una lunghezza d'onda che può essere rivelata dalla telecamera. Preferibilmente, ma non necessariamente, la lunghezza d'onda del fascio di guida rientra pure nell'intervallo visibile per l'occhio umano. In linea di principio, qualsiasi lunghezza d'onda può essere utilizzata per il fascio di guida, a condizione che si trovi entro l’intervallo sensibile della telecamera. Preferibilmente, la lunghezza d'onda del fascio di guida è fuori dall’intervallo spettrale dei fotoni emessi o diffusi da rivelare. Una possibile opzione per una sorgente del fascio di guida può essere un laser a 785 nm, poiché il sangue ha un basso assorbimento a questa lunghezza d'onda. The electromagnetic radiation emitted by the guide beam is at a wavelength that can be detected by the camera. Preferably, but not necessarily, the wavelength of the guiding beam is also within the range visible to the human eye. In principle, any wavelength can be used for the guide beam, provided it is within the sensitive range of the camera. Preferably, the wavelength of the guide beam is outside the spectral range of the emitted or scattered photons to be detected. A possible option for a guide beam source may be a 785nm laser, as blood has low absorption at this wavelength.

Preferibilmente, il metodo include: dirigere il fascio di eccitazione e/o il fascio di guida sulla prima e/o seconda porzione del campione mediante una fibra ottica. Preferably, the method includes: directing the excitation beam and / or the guide beam onto the first and / or second portion of the sample by means of an optical fiber.

Al fine di fornire acquisizione e risposta in tempo reale, preferibilmente viene utilizzato un approccio a singolo punto. Questa strategia massimizza la raccolta di fotoni integrando il segnale spettroscopico da un volume di eccitazione del campione. D'altra parte, uno strumento a singolo punto non offre risoluzione spaziale, che è rilevante in molte applicazioni cliniche richiedenti un'identificazione precisa di un margine, come l'identificazione del margine tumorale nella chirurgia di resezione. Per superare questa limitazione, preferibilmente tre passi possono essere aggiunti al metodo dell'invenzione. Primo passo, è possibile aggiungere una ulteriore sorgente luminosa nello spettro visibile che emette un fascio di guida, ad esempio una sorgente laser continua (Continuous Wave, CW). Il fascio di guida è preferibilmente sovrapposto al fascio di eccitazione, ma può anche non essere perfettamente coassiale con lo stesso. Preferibilmente il fascio di guida illumina una seconda porzione del campione. Preferibilmente la seconda porzione è sovrapposta alla prima porzione. Preferibilmente, la prima e la seconda porzione sono sostanzialmente coincidenti, cioè il fascio di eccitazione e il fascio di guida vengono inviati al campione sulla stessa superficie. Il fascio di guida, se visibile all'occhio umano, può fornire un riferimento visivo per guidare l'operatore durante le misure. Nel caso in cui la lunghezza d'onda del fascio di guida non sia visibile all'operatore, ma rientra nell'intervallo di sensibilità di una telecamera, la telecamera può rivelare e registrare la posizione del fascio di guida e la sua posizione sul campione può essere visualizzata su uno schermo in modo tale che sia visibile all'occhio umano. L'operatore può comunque avere un riferimento visivo guardando lo schermo. Inoltre, la telecamera, per esempio una telecamera a colori, viene aggiunta al sistema sperimentale per visualizzare il campione da una posizione fissa. La telecamera consente di registrare il punto di campionamento, che si trova nella prima e/o nella seconda porzione del campione. In alternativa, la telecamera potrebbe anche muoversi e viene implementato un algoritmo di elaborazione. In order to provide real-time acquisition and response, a single point approach is preferably used. This strategy maximizes photon collection by integrating the spectroscopic signal from a sample excitation volume. On the other hand, a single point instrument does not offer spatial resolution, which is relevant in many clinical applications requiring precise identification of a margin, such as tumor margin identification in resection surgery. To overcome this limitation, preferably three steps can be added to the method of the invention. First step, it is possible to add an additional light source in the visible spectrum that emits a guiding beam, for example a continuous laser source (Continuous Wave, CW). The guide beam is preferably superimposed on the excitation beam, but it may also not be perfectly coaxial with it. Preferably the guide beam illuminates a second portion of the sample. Preferably the second portion is superimposed on the first portion. Preferably, the first and second portions are substantially coincident, i.e. the excitation beam and the guide beam are sent to the sample on the same surface. The guide beam, if visible to the human eye, can provide a visual reference to guide the operator during measurements. In the event that the wavelength of the guiding beam is not visible to the operator, but is within the sensitivity range of a camera, the camera can detect and record the position of the guiding beam and its position on the sample can be displayed on a screen in such a way that it is visible to the human eye. The operator can still have a visual reference by looking at the screen. In addition, the camera, for example a color camera, is added to the experimental system to view the sample from a fixed position. The camera allows you to record the sampling point, which is located in the first and / or second portion of the sample. Alternatively, the camera could also move and a processing algorithm is implemented.

Preferibilmente, la prima e la seconda porzione sono sostanzialmente sovrapposte. Più preferibilmente, la prima e la seconda porzione sostanzialmente coincidono. Preferably, the first and second portions are substantially superimposed. More preferably, the first and second portions substantially coincide.

Più preferibilmente, il metodo include: More preferably, the method includes:

‐ spostare il fascio di eccitazione sul campione in modo tale che il fascio di eccitazione venga inviato a una prima porzione diversa del campione; - moving the excitation beam on the sample in such a way that the excitation beam is sent to a different first portion of the sample;

‐ spostare corrispondentemente il fascio di guida. - move the guide beam accordingly.

La registrazione può anche essere realizzata quando l'operatore sposta il fascio di eccitazione e/o il fascio di guida attraverso diverse regioni (cioè attraverso diverse prime e/o seconde porzioni) del campione. La posizione spaziale della prima e della seconda porzione quindi varia nel tempo. Preferibilmente, la telecamera segue i movimenti dei fasci di guida e di eccitazione. In alternativa, la telecamera acquisisce sempre le immagini dell'intero campione, in modo che la prima e la seconda porzione siano sempre visibili. Recording can also be accomplished when the operator moves the excitation beam and / or the guide beam through different regions (i.e., through different first and / or second portions) of the sample. The spatial position of the first and second portions therefore varies over time. Preferably, the camera follows the movements of the guide and excitation beams. Alternatively, the camera always captures images of the entire sample, so that the first and second portions are always visible.

In questo modo, le informazioni spettroscopiche possono essere raccolte per diverse parti del campione e le immagini possono essere visualizzate in tempo reale. In this way, spectroscopic information can be collected for different parts of the sample and images can be viewed in real time.

Preferibilmente, il metodo include il passo di: Preferably, the method includes the step of:

‐ acquisire un'immagine del campione solo durante detti intervalli di tempo illuminati. - acquire an image of the sample only during said illuminated time intervals.

Preferibilmente, l'immagine del campione viene catturata solo quando la sorgente di luce visibile è accesa, e solo per il tempo in cui rimane accesa. Quando la sorgente di luce visibile è spenta, la fotocamera preferibilmente non cattura alcuna immagine. Preferibilmente, il primo temporizzatore usato per modulare la sorgente di luce visibile viene anche usato per pilotare l'acquisizione di immagini, in modo tale che le immagini vengano acquisite durante il ciclo "acceso" della sorgente di luce visibile, cioè durante gli intervalli di tempo illuminati. In questo modo, ad esempio mediante elaborazione di immagini, la posizione del fascio di guida può essere localizzata da ciascuna immagine e successivamente la posizione del fascio di eccitazione può essere estrapolata. Preferably, the sample image is captured only when the visible light source is switched on, and only for the time it remains switched on. When the visible light source is turned off, the camera preferably does not capture any image. Preferably, the first timer used to modulate the visible light source is also used to drive the image acquisition, so that the images are acquired during the "on" cycle of the visible light source, i.e. during the time intervals enlightened. In this way, for example by image processing, the position of the guide beam can be localized from each image and subsequently the position of the excitation beam can be extrapolated.

Ad esempio, realizzando un'elaborazione rapida delle immagini, il fascio di guida (ad es. un fascio di 785 nm) può essere rivelato e segmentato dall'immagine, consentendo di tracciare la posizione di misura nel tempo e in tempo reale, fornendo quindi una risoluzione spaziale ad una misura a singolo punto. Dato che sia l'informazione spettroscopica, come la durata della vita media della fluorescenza, sia l'elaborazione dell'immagine avvengono preferibilmente in parallelo, è possibile sovrapporre le informazioni sulla durata della vita media della fluorescenza all'immagine in luce bianca e creare mappe di realtà aumentata che forniscono un riscontro visivo delle misure in tempo reale. For example, by realizing fast image processing, the guiding beam (e.g. a 785 nm beam) can be detected and segmented from the image, allowing the measurement position to be tracked in time and in real time, thus providing a spatial resolution to a single point measurement. Since both the spectroscopic information, such as the average life span of the fluorescence, and the image processing preferably take place in parallel, it is possible to superimpose the information on the average life span of the fluorescence on the white light image and create maps. of augmented reality that provide visual feedback of the measurements in real time.

Preferibilmente, il passo di ottenere informazioni spettroscopiche da detti fotoni emessi e rivelati include: Preferably, the step of obtaining spectroscopic information from said emitted and detected photons includes:

‐ ottenere informazioni sulla spettroscopia di fluorescenza da detti fotoni emessi e rivelati. - obtain information on the fluorescence spectroscopy from said photons emitted and detected.

La spettroscopia di fluorescenza (nota anche come fluorimetria o spettrofluorimetria) è un tipo di spettroscopia elettromagnetica che analizza la fluorescenza emessa da un campione. Pertanto, in questa forma di implementazione, la spettroscopia elettromagnetica coinvolta è la spettroscopia di fluorescenza. I fotoni rilevati sono fotoni emessi dal campione a causa della fluorescenza. Fluorescence spectroscopy (also known as fluorimetry or spectrofluorimetry) is a type of electromagnetic spectroscopy that analyzes the fluorescence emitted by a sample. Therefore, in this form of implementation, the electromagnetic spectroscopy involved is fluorescence spectroscopy. The detected photons are photons emitted from the sample due to fluorescence.

Questo tipo di implementazione si riferisce al campo della spettroscopia nell’intervallo spettrale visibile/ultravioletto, in particolare alla spettroscopia di fluorescenza. La fluorescenza è l'emissione spontanea di un fotone quando in una molecola un elettrone si rilassa al suo stato fondamentale dopo l'eccitazione ad un livello più elevato di energia. La lunghezza d'onda di un fotone di fluorescenza è determinata dalla differenza di energia tra i due stati elettronici coinvolti nella transizione. Le lunghezze d'onda alle quali un fluoroforo può essere eccitato ed emettere luce fluorescente dipendono dalla This type of implementation refers to the field of spectroscopy in the visible / ultraviolet spectral range, in particular to fluorescence spectroscopy. Fluorescence is the spontaneous emission of a photon when an electron in a molecule relaxes to its ground state after being excited at a higher energy level. The wavelength of a fluorescence photon is determined by the energy difference between the two electronic states involved in the transition. The wavelengths at which a fluorophore can be excited and emit fluorescent light depend on the

configurazione elettronica delle molecole, che, a sua volta, dipende dalla struttura chimica della molecola e dal suo ambiente locale. Il tempo medio che intercorre tra l'eccitazione di una molecola e la successiva emissione di un fotone di fluorescenza viene indicato come vita media della fluorescenza e questo è tipicamente compreso nella scala temporale tra 10<-12> e 10<-8> secondi. electron configuration of molecules, which, in turn, depends on the chemical structure of the molecule and its local environment. The average time between the excitation of a molecule and the subsequent emission of a fluorescence photon is referred to as the average life of the fluorescence and this is typically included in the time scale between 10 <-12> and 10 <-8> seconds.

In questo tipo di implementazione, secondo l'invenzione, la misurazione della fluorescenza risolta nel tempo è sfasata rispetto all'illuminazione della luce visibile, ad es. le misurazioni della spettroscopia di fluorescenza vengono attivate quando la sorgente di luce visibile viene spenta e arrestate prima di un altro ciclo "acceso". In this type of implementation, according to the invention, the measurement of the time-resolved fluorescence is out of phase with respect to the illumination of the visible light, e.g. Fluorescence spectroscopy measurements are triggered when the visible light source is turned off and stopped before another "on" cycle.

Preferibilmente, detta informazione spettroscopica include informazioni sul decadimento di intensità della fluorescenza, cioè informazioni sulla vita media della fluorescenza. Preferably, said spectroscopic information includes information on the fluorescence intensity decay, i.e. information on the average life of the fluorescence.

La vita media della fluorescenza o il tempo di decadimento di una molecola è definito come il tempo medio in cui una molecola rimane nello stato eccitato in seguito ad assorbimento di luce prima di ritornare allo stato fondamentale emettendo un fotone. I fotoni sono quelli emessi dal campione e rivelati dal sistema spettroscopico. The average life of fluorescence or the decay time of a molecule is defined as the average time in which a molecule remains in the excited state following absorption of light before returning to the ground state by emitting a photon. Photons are those emitted by the sample and detected by the spectroscopic system.

Inoltre, la presente invenzione riguarda preferibilmente la spettroscopia di emissione di fluorescenza, in cui è studiata l'emissione di radiazione elettromagnetica da un campione a causa dell'assorbimento di un fascio di radiazione elettromagnetica, chiamato fascio di eccitazione. La spettroscopia di emissione di fluorescenza può essere classificata formalmente in due categorie: stato stazionario e risolta in tempo. Furthermore, the present invention preferably relates to fluorescence emission spectroscopy, in which the emission of electromagnetic radiation from a sample is studied due to the absorption of a beam of electromagnetic radiation, called an excitation beam. Fluorescence emission spectroscopy can be formally classified into two categories: steady state and time resolved.

La spettroscopia di fluorescenza a stato stazionario si riferisce alle misurazioni dell'intensità e/o dello spettro di fluorescenza. Le misurazioni di fluorescenza a stato stazionario vengono in genere eseguite utilizzando una sorgente continua (CW) di radiazione per eccitare il campione a intensità costante. Per la rivelazione dei fotoni di fluorescenza emessi, le configurazioni tipiche utilizzano un elemento disperdente per separare l'emissione di fluorescenza in base alla sua lunghezza d'onda e un rivelatore CCD per misurare l'intensità della luce emessa a diverse lunghezze d'onda. Configurazioni alternative possono impiegare un set di specchi dicroici e più rilevatori a singolo canale per realizzare misure raziometriche di intensità. Steady-state fluorescence spectroscopy refers to measurements of fluorescence intensity and / or spectrum. Steady-state fluorescence measurements are typically performed using a continuous (CW) source of radiation to excite the sample at a constant intensity. For the detection of the emitted fluorescence photons, typical configurations use a dispersing element to separate the fluorescence emission based on its wavelength and a CCD detector to measure the intensity of the light emitted at different wavelengths. Alternative configurations may employ a set of dichroic mirrors and multiple single-channel detectors to perform ratiometric intensity measurements.

La spettroscopia di fluorescenza risolta in tempo fa riferimento alle misure dell'intensità della fluorescenza nel tempo in seguito ad eccitazione usando un breve impulso di luce, che è tipicamente fornito da una sorgente laser. La fluorescenza risolta in tempo mira a risolvere la dinamica caratteristica dell'intensità di fluorescenza nel tempo, cioè la vita media della fluorescenza, e quindi fornire informazioni aggiuntive a quelle disponibili dalle sole misure a stato stazionario. La misura della vita media della fluorescenza può essere realizzata nel dominio del tempo o delle frequenze, a seconda delle strategie di eccitazione e rivelazione della fluorescenza. Nelle tecniche nel dominio del tempo, il segnale di fluorescenza viene Time-resolved fluorescence spectroscopy refers to measurements of fluorescence intensity over time upon excitation using a short pulse of light, which is typically provided by a laser source. Time-resolved fluorescence aims to resolve the characteristic dynamics of fluorescence intensity over time, i.e. the lifetime of the fluorescence, and thus provide additional information to that available from steady-state measurements alone. The measurement of the fluorescence lifetime can be performed in the time or frequency domain, depending on the excitation and detection strategies of the fluorescence. In time domain techniques, the fluorescence signal comes

registrato nel tempo dopo l'eccitazione con un breve impulso ottico. Le tecniche nel dominio delle frequenze misurano la risposta armonica del sistema, da cui è possibile ricavare informazioni sulla vita media della fluorescenza dalla differenza di fase e ampiezza tra un segnale di eccitazione modulato periodicamente e la risultante emissione fluorescente demodulata. recorded in the time after excitation with a short optical pulse. The techniques in the frequency domain measure the harmonic response of the system, from which it is possible to obtain information on the average life of the fluorescence from the difference in phase and amplitude between a periodically modulated excitation signal and the resulting demodulated fluorescent emission.

La presente invenzione riguarda preferibilmente misure nel dominio del tempo. Questi metodi includono ma non sono limitati al conteggio di singolo fotone correlato nel tempo (TCSPC) e al “time‐gating/binning”. The present invention preferably relates to time domain measurements. These methods include but are not limited to time-correlated single photon count (TCSPC) and time-gating / binning.

Per la spettroscopia di fluorescenza risolta in tempo, i decadimenti di intensità della fluorescenza misurati possono essere analizzati in tempo reale, cioè immediatamente dopo che ciascuna acquisizione è stata completata, preferibilmente usando il metodo dei fasori. Il metodo dei fasori consiste nella trasformazione di Fourier del decadimento della fluorescenza per produrre componenti reali e immaginari, rispettivamente come le coordinate g e s del fasore, che possono essere rappresentate in un grafico polare. La vita media di fase (τfase) e di modulazione (τmod) possono essere calcolate per ciascuna curva di decadimento, come mostrato nelle Eq. 2 e 3: For time-resolved fluorescence spectroscopy, the measured fluorescence intensity decays can be analyzed in real time, i.e. immediately after each acquisition is completed, preferably using the phasor method. The phasor method consists of the Fourier transformation of the fluorescence decay to produce real and imaginary components, respectively such as the g and s coordinates of the phasor, which can be represented in a polar graph. The phase (τphase) and modulation (τmod) mean life can be calculated for each decay curve, as shown in Eqs. 2 and 3:

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dove f è la frequenza di ripetizione degli impulsi del fascio laser di eccitazione. Per le specie con fluorescenza dal decadimento esponenziale singolo, il fasore caratteristico cadrà sul cerchio universale, definito come il semicerchio centrato su (g = 0,5, s = 0) e raggio 0,5. Una miscela di due specie fluorescenti con caratteristiche distinte e mono‐esponenziali si troverà all'interno del cerchio universale, come una combinazione lineare di componenti singolo esponenziali. Quindi, una qualsiasi miscela dei due fluorofori avrà un fasore corrispondente che cade lungo una linea che collega i fasori corrispondenti ai loro rispettivi esponenziali singoli. Dato che l'analisi mediante fasori è un metodo privo di fit, è molto meno oneroso dal punto di vista computazionale rispetto ad altre tecniche di analisi della vita media di fluorescenza, come il fit multi‐esponenziale ai minimi quadrati. Pertanto, il metodo dei fasori offre una rapida caratterizzazione dei decadimenti della fluorescenza che è adatta all'implementazione in tempo reale, come richiesto nella nostra applicazione. Tutti i parametri spettroscopici calcolati dall'analisi dei fasori possono essere utilizzati per generare mappe di vita media della fluorescenza, che vengono mostrate in tempo reale per la visualizzazione da parte dell'utente. where f is the repetition frequency of the pulses of the excitation laser beam. For species with single exponential decay fluorescence, the characteristic phasor will fall on the universal circle, defined as the semicircle centered on (g = 0.5, s = 0) and radius 0.5. A mixture of two fluorescent species with distinct and mono-exponential characteristics will be found within the universal circle, as a linear combination of single exponential components. Hence, any mixture of the two fluorophores will have a corresponding phasor that falls along a line connecting the corresponding phasors to their respective single exponentials. Since phasor analysis is a fit-free method, it is far less computationally expensive than other fluorescence lifetime analysis techniques, such as multi-exponential least squares fit. Therefore, the phasor method offers a rapid characterization of the fluorescence decays that is suitable for real-time implementation, as required in our application. All spectroscopic parameters calculated from phasor analysis can be used to generate fluorescence lifetime maps, which are displayed in real time for user viewing.

Una descrizione completa dell'approccio mediante fasori all’analisi dei dati di vita media della fluorescenza è fornita in: A complete description of the phasor approach to the analysis of fluorescence average life data is provided in:

M. A. Digman, V. R. Caiolfa, M. Zamai, and E. Gratton, “The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.,” Biophys. J., vol. 94, no. 2, pp. L14‐6, Jan. 2008. M. A. Digman, V. R. Caiolfa, M. Zamai, and E. Gratton, “The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.,” Biophys. J., vol. 94, no. 2, pp. L14-6, Jan. 2008.

H. E. Grecco, P. Roda‐Navarro, and P. J. Verveer, “Global analysis of time correlated single photon counting FRET‐FLIM data,” Opt. Express, vol. 17, no. 8, p. 6493, Apr. 2009. H. E. Grecco, P. Roda ‐ Navarro, and P. J. Verveer, “Global analysis of time correlated single photon counting FRET ‐ FLIM data,” Opt. Express, vol. 17, no. 8, p. 6493, Apr. 2009.

C. Stringari, J. L. Nourse, L. A Flanagan, and E. Gratton, “Phasor fluorescence lifetime microscopy of free and protein‐bound NADH reveals neural stem cell differentiation potential.,” PLoS One, vol. 7, no. 11, p. e48014, Jan. 2012. C. Stringari, J. L. Nourse, L. A Flanagan, and E. Gratton, “Phasor fluorescence lifetime microscopy of free and protein-bound NADH reveals neural stem cell differentiation potential.,” PLoS One, vol. 7, no. 11, p. e48014, Jan. 2012.

Nel caso di una configurazione multispettrale, cioè se si usano rivelatori multipli per separare il segnale di fluorescenza in diverse bande di lunghezze d'onda, l'approccio con i fasori può essere applicato al segnale rivelato in ciascun canale. Le informazioni spettroscopiche di qualsiasi canale possono essere visualizzate in tempo reale. Inoltre, l'intensità di fluorescenza in una specifica banda di lunghezze d'onda può essere calcolata in percentuale rispetto al segnale di fluorescenza totale, cioè rispetto alla somma del segnale di fluorescenza misurato in tutte le bande di lunghezza d'onda, per riportare risultati spettroscopici raziometrici. In the case of a multispectral configuration, i.e. if multiple detectors are used to separate the fluorescence signal into different wavelength bands, the phasor approach can be applied to the signal detected in each channel. The spectroscopic information of any channel can be viewed in real time. Furthermore, the fluorescence intensity in a specific wavelength band can be calculated as a percentage of the total fluorescence signal, i.e. with respect to the sum of the measured fluorescence signal in all wavelength bands, to report results. ratiometric spectroscopic.

In questo tipo di realizzazione, secondo l'invenzione, la misura della fluorescenza risolta in tempo è sfasata rispetto all'illuminazione con luce visibile, cioè le misure spettroscopiche di fluorescenza risolte in tempo vengono attivate quando la sorgente di luce visibile viene spenta e arrestate prima di un altro ciclo “acceso”. In this type of embodiment, according to the invention, the measurement of the time-resolved fluorescence is out of phase with respect to the illumination with visible light, i.e. the spectroscopic measurements of the time-resolved fluorescence are activated when the visible light source is turned off and stopped before of another “on” cycle.

Preferibilmente, il metodo include la fase di: Preferably, the method includes the step of:

‐ generare un'immagine di detto campione; e - generate an image of said sample; And

‐ visualizzare detta immagine e dette informazioni spettroscopiche su uno schermo. - displaying said image and said spectroscopic information on a screen.

Preferibilmente, le informazioni spettroscopiche vengono visualizzate nell'immagine insieme alla prima o alla seconda porzione del campione. In questo modo, è possibile la manipolazione in tempo reale del campione, ad esempio durante un intervento chirurgico, perché è evidente da dove proviene l'informazione spettroscopica. Preferably, the spectroscopic information is displayed in the image along with the first or second portion of the sample. In this way, real-time manipulation of the sample is possible, for example during surgery, because it is clear where the spectroscopic information is coming from.

Preferibilmente, detto campione è una parte di un organismo biologico. Preferably, said sample is a part of a biological organism.

Il campione potrebbe essere parte di un animale o di una pianta. L'organismo può essere vivo o morto. L'organismo può essere un animale, che include gli esseri umani. La parte che viene utilizzata come The sample could be part of an animal or a plant. The organism can be alive or dead. The organism can be an animal, which includes humans. The part that is used as

campione può essere tessuto connettivo, tessuto muscolare, tessuto nervoso, tessuto epiteliale, parte di un organo, ecc. sample can be connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, epithelial tissue, part of an organ, etc.

Preferibilmente, il metodo include: Preferably, the method includes:

‐ identificare la posizione di detta prima porzione del campione identificando la posizione della seconda porzione illuminata dal fascio di guida. - identifying the position of said first portion of the sample by identifying the position of the second portion illuminated by the guide beam.

‐ ottenere informazioni spettroscopiche utilizzando il conteggio di singolo fotone correlato nel tempo o una fase di tipo time‐gating. - obtain spectroscopic information using the time-correlated single photon count or a time-gating phase.

TCSPC è il metodo più comune e consolidato per le misure di vita media della fluorescenza. Si basa sul principio che, a ritmi di rivelazione sufficientemente bassi, tutti i singoli fotoni possono essere rivelati insieme al loro rispettivo tempo di arrivo, misurato rispetto ad un segnale di riferimento impulsato. TCSPC utilizza impulsi di eccitazione ultracorti ad alte frequenze di ripetizione (nel regime MHz), rivelatori a conteggio di singolo fotone, come rilevatori PMT, SPAD o ibridi, ed elettronica di conteggio ad alta velocità per misurare accuratamente il tempo di arrivo dei singoli fotoni. Nel TCSPC, il tempo di arrivo di ciascun fotone rivelato viene misurato rispetto all'impulso di eccitazione laser e memorizzato. Le misure vengono ripetute per molteplici impulsi di eccitazione e, quando è stato registrato un numero sufficiente di fotoni, viene generato un istogramma del numero di fotoni rivelati in ciascuno dei punti temporali registrati. Lo schema di misura del TCSPC impone che i fotoni vengano rivelati uno alla volta, ad un ritmo massimo assoluto di un fotone per ogni periodo di eccitazione. In pratica, tuttavia, il tempo morto della circuiteria TCSPC è dell'ordine di 100 ns e pertanto si estende tipicamente su periodi di eccitazione multipli. Dato che un numero elevato di fotoni è tipicamente richiesto per produrre un decadimento della fluorescenza e per ottenere una certa precisione nella stima della vita media, il TCSPC è spesso considerato una tecnica lenta. TCSPC is the most common and established method for fluorescence lifetime measurements. It is based on the principle that, at sufficiently low detection rates, all individual photons can be detected together with their respective arrival time, measured with respect to a pulsed reference signal. TCSPC uses ultrashort excitation pulses at high repetition rates (in the MHz regime), single-photon count detectors, such as PMT, SPAD or hybrid detectors, and high-speed counting electronics to accurately measure the arrival time of individual photons. In the TCSPC, the arrival time of each detected photon is measured against the laser excitation pulse and stored. The measurements are repeated for multiple excitation pulses and, when enough photons have been recorded, a histogram of the number of photons detected at each of the recorded time points is generated. The TCSPC measurement scheme requires that photons be detected one at a time, at an absolute maximum rate of one photon for each excitation period. In practice, however, the dead time of the TCSPC circuitry is of the order of 100 ns and therefore typically extends over multiple excitation periods. Since a large number of photons is typically required to produce a fluorescence decay and to obtain some accuracy in estimating the lifetime, TCSPC is often considered a slow technique.

Un approccio alternativo alle misure TCSPC si basa sulla rivelazione “gated” del segnale di intensità di fluorescenza in diversi istanti di tempo misurati relativamente all'impulso di eccitazione. Tipici approcci “time‐gating” utilizzano un singolo “gate” che campiona il decadimento dell'intensità di fluorescenza all’interno di un intervallo di tempo di interesse. Il processo viene ripetuto a ritardi diversi rispetto all'impulso di eccitazione, fino a quando viene rilevato un numero sufficiente di fotoni in ogni intervallo di tempo. La curva di decadimento della fluorescenza risultante produce un numero di punti pari al numero di intervalli di tempo campionati. An alternative approach to TCSPC measurements is based on the “gated” detection of the fluorescence intensity signal at different instants of time measured relative to the excitation pulse. Typical "time-gating" approaches use a single "gate" that samples the decay of the fluorescence intensity within a time interval of interest. The process is repeated at different delays than the excitation pulse, until a sufficient number of photons are detected in each time interval. The resulting fluorescence decay curve produces a number of points equal to the number of sampled time intervals.

TCSPC è illustrato nel dettaglio ad esempio in Becker, W. The bh TCSPC Handbook; 2008, stampato da Becker & Hickl GmbH; ulteriori informazioni possono essere ottenute in https://www.becker‐hickl.com/thebh‐tcspc‐handbook/. TCSPC is illustrated in detail for example in Becker, W. The bh TCSPC Handbook; 2008, printed by Becker & Hickl GmbH; further information can be obtained at https://www.becker‐hickl.com/thebh‐tcspc‐handbook/.

Una descrizione completa della tecnica “time‐gating” per le misure di vita media della fluorescenza è fornita in: A full description of the time-gating technique for fluorescence lifetime measurements is provided in:

Mcginty, J.; Galletly, N.P.; Dunsby, C.; Munro, I.; Elson, D.S.; Requejo‐isidro, J.; Cohen, P.; Ahmad, R.; Forsyth, A.; Thillainayagam, A. V; et al. Wide‐field fluorescence lifetime imaging of cancer. Opt. Express 2010, 1, 124–135. Mcginty, J .; Galletly, N.P .; Dunsby, C .; Munro, I .; Elson, D.S .; Requejo ‐ isidro, J .; Cohen, P .; Ahmad, R .; Forsyth, A .; Thillainayagam, A. V; et al. Wide ‐ field fluorescence lifetime imaging of cancer. Opt. Express 2010, 1, 124–135.

McGinty, J.; Requejo‐Isidro, J.; Munro, I.; Talbot, C.B.; Kellett, P.A.; Hares, J.D.; Dunsby, C.; Neil, M.A.A.; French, P.M.W. Signal‐to‐noise characterization of time‐gated intensifiers used for wide‐field time‐domain FLIM. J. Phys. D. Appl. Phys. 2009, 42, 135103. McGinty, J .; Requejo ‐ Isidro, J .; Munro, I .; Talbot, C.B .; Kellett, P.A .; Hares, J.D .; Dunsby, C .; Neil, M.A.A .; French, P.M.W. Signal ‐ to ‐ noise characterization of time ‐ gated intensifiers used for wide ‐ field time ‐ domain FLIM. J. Phys. D. Appl. Phys. 2009, 42, 135103.

Gerritsen, H.C.; Asselbergs, M. a H.; Agronskaia, a V; Van Sark, W.G.J.H.M. Fluorescence lifetime imaging in scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution. J. Microsc. 2002, 206, 218–24. Gerritsen, H.C .; Asselbergs, M. to H .; Agronskaia, a V; Van Sark, W.G.J.H.M. Fluorescence lifetime imaging in scanning microscopes: acquisition speed, photon economy and lifetime resolution. J. Microsc. 2002, 206, 218–24.

Descrizione dei disegni Description of the drawings

L'invenzione sarà ora meglio descritta con riferimento non limitativo ai disegni allegati, dove: The invention will now be better described with non-limiting reference to the attached drawings, where:

‐ La Figura 1 è un diagramma che illustra la strumentazione ottica di un sistema di spettroscopia secondo la presente invenzione; Figure 1 is a diagram illustrating the optical instrumentation of a spectroscopy system according to the present invention;

‐ La Figura 2 è un grafico dello schema di temporizzazione per le misure TCSPC, per l’acquisizione e per l’elaborazione delle immagini; - Figure 2 is a chart of the timing scheme for TCSPC measurements, for image acquisition and processing;

‐ La Figura 3 è uno schema a blocchi dell'implementazione software; - Figure 3 is a block diagram of the software implementation;

‐ Le Figure 4a‐4c sono tre diversi grafici che mostrano: (a) i livelli di intensità del fondo luminoso misurati a finestre di integrazione TCSPC diverse (Δt nella figura 2), quando il LED è spento (quadrati, misurazioni realizzate solo con luce ambientale) e quando il LED pulsa a 50 Hz, interlacciato con le misure TCSPC (cerchi); (b) percentuale di luce di fondo (luce ambientale e luce a LED pulsata) nel decadimento della fluorescenza misurato da un campione fluorescente standard per un ritmo di conteggio di singolo fotone costante, pari a circa 5 × 10<5> fotoni al secondo. Per le misure in (a) e (b) l'intensità del LED è stata mantenuta costante per tutte le misure ad un ritmo di conteggio di 2,5 × 10<5> fotoni al secondo; (c) variazione della vita media di fluorescenza al variare dell’intensità per POPOP. L'intensità di fluorescenza è stata regolata variando la potenza di eccitazione. La distanza tra la sonda e il campione è stata mantenuta costante durante tutte le misure. La luce di fondo impulsata del LED è stata mantenuta costante ad un ritmo di 2 × 10<5> fotoni al secondo per tutte le misure. Le misure sono state realizzate con una finestra TCSPC di 15 ms. Sono state realizzate un totale di 500 misure TCSPC per ciascun punto di dati; - Figures 4a-4c are three different graphs showing: (a) the intensity levels of the light background measured at different TCSPC integration windows (Δt in Figure 2), when the LED is off (squares, measurements made only with light environmental) and when the LED pulses at 50 Hz, interlaced with the TCSPC measurements (circles); (b) Percentage of background light (ambient light and pulsed LED light) in the fluorescence decay measured by a standard fluorescent sample for a constant single photon count rate, equal to approximately 5 × 10 <5> photons per second. For the measurements in (a) and (b) the intensity of the LED was kept constant for all the measurements at a counting rate of 2.5 × 10 <5> photons per second; (c) variation of the average fluorescence life as the intensity for POPOP varies. The fluorescence intensity was adjusted by varying the excitation power. The distance between the probe and the sample was kept constant throughout all measurements. The pulsed background light of the LED was kept constant at a rate of 2 × 10 <5> photons per second for all measurements. The measurements were made with a 15 ms TCSPC window. A total of 500 TCSPC measurements were made for each data point;

‐ Le Figure 5a‐5c mostrano le mappe di vita media della fluorescenza per le strutture interne ad un rene di agnello, che dimostrano il contrasto in autofluorescenza. (a) Immagine in luce bianca non processata e (b) immagine in luce bianca aumentata con i dati di vita media della fluorescenza (τphase); (c) variazione della vita media della fluorescenza (in alto) e dell’intensità totale della fluorescenza (in basso) al variare del tempo di acquisizione. La fibra è stata spostata a una velocità media di 19,4 mm/s. Barra di scala = 10 mm; - Figures 5a-5c show fluorescence lifetime maps for structures within a lamb kidney, demonstrating autofluorescence contrast. (a) Unprocessed white light image and (b) augmented white light image with fluorescence lifetime data (τphase); (c) variation of the average life of the fluorescence (top) and of the total fluorescence intensity (bottom) as the acquisition time varies. The fiber was moved at an average speed of 19.4 mm / s. Scale bar = 10 mm;

‐ Le Figure 6a‐6d mostrano l'effetto della velocità di scansione della fibra nell'acquisizione della vita media della fluorescenza. (a) Immagine in luce bianca del tessuto cardiaco bovino. (b) Profili di vita media della fluorescenza nella regione indicata dalla linea tratteggiata in figura (a) per una fibra in movimento lento (linea continua) e veloce (linea tratteggiata). La freccia bianca indica una distanza maggiore. Le mappe di vita media della fluorescenza per misure con movimento lento e veloce sono mostrate rispettivamente nei pannelli (c) e (d). In (c) la punta della fibra è stata spostata a una velocità media di 17,3 mm/s. In (d) la punta della fibra è stata spostata a una velocità media di 45,1 mm/s. Barra di scala = 10 mm; - Figures 6a-6d show the effect of the fiber scan rate in the acquisition of the fluorescence lifetime. (a) White light image of bovine heart tissue. (b) Fluorescence lifetime profiles in the region indicated by the dashed line in Figure (a) for a slow (solid line) and fast (dashed line) moving fiber. The white arrow indicates a greater distance. Fluorescence lifetime maps for slow and fast moving measurements are shown in panels (c) and (d), respectively. In (c) the fiber tip was moved at an average speed of 17.3 mm / s. In (d) the fiber tip was moved at an average speed of 45.1 mm / s. Scale bar = 10 mm;

‐ Le Figure 7a‐7f mostrano mappe di vita media della fluorescenza per un campione di cartilagine articolare suina (campione 1) prima (in alto) e dopo (in basso) il trattamento con collagenasi batterica. (a, d) Immagini in luce bianca, (b, e) mappe di vita media della fluorescenza (τfase) e (c, f) mappe dei fasori corrispondenti. Barra di scala = 10 mm; - Figures 7a-7f show fluorescence lifetime maps for a porcine joint cartilage sample (sample 1) before (top) and after (bottom) treatment with bacterial collagenase. (a, d) White light images, (b, e) fluorescence lifetime maps (τphase) and (c, f) maps of the corresponding phasors. Scale bar = 10 mm;

‐ Le Figure 8a‐8b descrivono (a) le mappe dei fasori post‐trattamento per il campione di cartilagine articolare. (b) Immagine in luce bianca che mostra la segmentazione basata sull’analisi con i fasori. Le regioni 1 e 2 rappresentano rispettivamente i fasori compresi nei rettangoli indicati con 1 e 2 nella mappa dei fasori; - Figures 8a-8b describe (a) the post-treatment phasor maps for the joint cartilage sample. (b) White light image showing the segmentation based on the analysis with phasors. Regions 1 and 2 respectively represent the phasors included in the rectangles indicated with 1 and 2 in the phasor map;

‐ Le Figure 9a‐9c rappresentano (a) la mappa spettrale dei fasori e (b) gli spettri di emissione per la fluorescenza del POPOP puro (linea tratteggiata) e FAD puro (linea continua) e miscele a diverse concentrazioni. (c) Mappe dei fasori per la fluorescenza di tutte le soluzioni misurate. Ogni colonna rappresenta una soluzione diversa con misure di FAD puro e POPOP puro, presentate rispettivamente sulle colonne di estrema sinistra e di estrema destra, e due miscele nelle colonne al centro. Sono state realizzate un totale di 50 misure per ciascuna soluzione. Le righe mostrano i risultati post‐elaborazione per diversi “binning” spettrali. Ogni punto nella nuvola dei fasori rappresenta un decadimento della fluorescenza lungo lo spettro. Ad esempio, la riga superiore illustra i risultati del “binning” dell'intero spettro in un singolo canale, ottenendo un massimo di 50 punti nello spazio dei fasori (da n = 50 misure) per ciascuna soluzione. La riga inferiore mostra i risultati dell'assenza di “binning” spettrale, cioè 64 canali spettrali, con un massimo di 3200 punti nello spazio dei fasori per ogni soluzione. I decadimenti di fluorescenza con meno di 100 conteggi di fotoni al picco sono stati rimossi; - Figures 9a-9c represent (a) the spectral map of the phasors and (b) the emission spectra for the fluorescence of pure POPOP (dashed line) and pure FAD (solid line) and mixtures at different concentrations. (c) Phasor maps for the fluorescence of all measured solutions. Each column represents a different solution with pure FAD and pure POPOP measurements, presented respectively on the far left and far right columns, and two mixtures in the columns in the center. A total of 50 measurements were made for each solution. The lines show post-processing results for different spectral binning. Each point in the phasor cloud represents a fluorescence decay along the spectrum. For example, the top row illustrates the results of binning the entire spectrum in a single channel, resulting in a maximum of 50 points in phasor space (from n = 50 measurements) for each solution. The bottom row shows the results of the absence of spectral binning, ie 64 spectral channels, with a maximum of 3200 points in the phasor space for each solution. Fluorescence decays with less than 100 photon counts at the peak were removed;

‐ Le Figure 10a‐10f rappresentano mappe di vita media dell’autofluorescenza per un campione di cartilagine pre‐ (riga superiore) e post‐trattamento (riga inferiore) con collagenasi batterica. (a, f) Immagini in luce bianca del campione cartilagineo. (b, g) Mappe di vita media della fluorescenza generate trattando l'intera matrice come un singolo canale. I pannelli (c‐e) e (h‐j) mostrano mappe di vita media della fluorescenza per diverse bande di lunghezza d'onda: canale 1 (400 ‐ 450 nm); canale 2 (450 ‐ 515 nm); canale 3 (515 ‐ 580 nm). Le bande di lunghezze d'onda sono state generate in post‐elaborazione sommando spettralmente 15 colonne di pixel. Barre di scala = 10 mm; - Figures 10a-10f represent autofluorescence mean life maps for a sample of pre-(upper row) and post-treatment (lower row) cartilage with bacterial collagenase. (a, f) White light images of the cartilage sample. (b, g) Fluorescence lifetime maps generated by treating the entire matrix as a single channel. Panels (c ‐ e) and (h ‐ j) show fluorescence lifetime maps for different wavelength bands: channel 1 (400 - 450 nm); channel 2 (450 - 515 nm); channel 3 (515 - 580 nm). The wavelength bands were generated in post-processing by spectrally summing 15 columns of pixels. Scale bars = 10 mm;

‐ Le Figure 11a‐11f rappresentano mappe dell’intensità di autofluorescenza normalizzata per un campione di cartilagine pre‐ (riga superiore) e post‐trattamento (fila in basso) con collagenasi batterica. (a, d) Canale 1 (400 ‐ 450 nm); (b, e) canale 2 (450 ‐ 515 nm); (c, f) canale 3 (515 ‐ 580 nm). Le bande di lunghezze d'onda sono state generate in post‐elaborazione sommando spettralmente 15 colonne di pixel; e - Figures 11a-11f represent maps of the normalized autofluorescence intensity for a sample of pre-(top row) and post-treatment (bottom row) cartilage with bacterial collagenase. (a, d) Channel 1 (400 - 450 nm); (b, e) channel 2 (450-515 nm); (c, f) channel 3 (515 - 580 nm). The wavelength bands were generated in post-processing by spectrally adding 15 columns of pixels; And

‐ Le Figure 12a‐12f sono grafici di spettri di emissione di fluorescenza (a, b) e di vita media della fluorescenza (c‐f), mediati nelle regioni di interesse (ROI), come illustrato nelle Figure 10 (a, f). Nei pannelli (a) e (b) le linee continue rappresentano gli spettri medi e le regioni ombreggiate la deviazione standard corrispondente. - Figures 12a-12f are plots of fluorescence emission spectra (a, b) and fluorescence lifetime (c-f), averaged in the regions of interest (ROI), as illustrated in Figures 10 (a, f) . In panels (a) and (b) the solid lines represent the average spectra and the shaded regions the corresponding standard deviation.

‐ La Figura 13 rappresenta i diversi passi nell’elaborazione dell'immagine per rivelare in tempo reale il fascio di guida nell'immagine in luce bianca acquisita dalla telecamera a colori. - Figure 13 represents the different steps in image processing to reveal in real time the guide beam in the white light image acquired by the color camera.

Descrizione dettagliata delle implementazioni preferite dell’invenzione Detailed description of the preferred implementations of the invention

Il sistema per la spettroscopia di un campione secondo l'invenzione è globalmente indicato con 1 nella Figura 1. The system for the spectroscopy of a sample according to the invention is globally indicated with 1 in Figure 1.

Il sistema 1 include una sorgente di luce di eccitazione 2 che emette un fascio di luce di eccitazione di radiazione elettromagnetica, come un diodo laser ad impulsi. Il fascio di luce di eccitazione è diretto verso un campione 3 mediante una sonda a fibra ottica 4, anch'essa parte del sistema 1. The system 1 includes an excitation light source 2 which emits an excitation light beam of electromagnetic radiation, such as a pulsed laser diode. The excitation light beam is directed towards a sample 3 by means of an optical fiber probe 4, which is also part of system 1.

Il sistema 1 include inoltre una telecamera 5, che può essere, ad esempio, fissa e rivolta verso il campione 3 per registrare le misure e catturare immagini del campione 3. The system 1 also includes a camera 5, which can be, for example, fixed and turned towards the sample 3 to record the measurements and capture images of the sample 3.

Il fascio di eccitazione sul campione produce l'emissione o la diffusione di fotoni all'interno del volume eccitato (prima porzione) del campione 3. Una sonda a fibra ottica 4a viene utilizzata per raccogliere i fotoni emessi o diffusi dal campione 3 e guidarli verso un rivelatore 7. Il rivelatore 7 emette un segnale in funzione dei fotoni rivelati. The excitation beam on the sample produces the emission or diffusion of photons inside the excited volume (first portion) of the sample 3. An optical fiber probe 4a is used to collect the photons emitted or scattered by the sample 3 and guide them towards a detector 7. The detector 7 emits a signal as a function of the photons detected.

Un'unità di elaborazione 20 è collegata al rivelatore 7 per registrare il segnale emesso da quest'ultimo e calcolare le informazioni spettroscopiche dallo stesso. A processing unit 20 is connected to the detector 7 to record the signal emitted by the latter and to calculate the spectroscopic information therefrom.

Inoltre, un secondo fascio, emesso da una sorgente di fascio di guida 6, come un diodo laser operante in modalità a onda continua (CW), viene aggiunto per fornire un riferimento visibile nelle immagini in luce bianca catturate dalla telecamera 5, come descritto di seguito. Il fascio di guida è diretto verso il campione 3 mediante una fibra aggiuntiva 4b. Per impedire al fascio di guida di raggiungere il rivelatore 7, un filtro passa‐basso (non visibile nei disegni) viene preferibilmente aggiunto al percorso ottico di rivelazione. Il secondo fascio ha una lunghezza d'onda compresa nell'intervallo di sensibilità della telecamera 5. Furthermore, a second beam, emitted from a guide beam source 6, such as a laser diode operating in continuous wave (CW) mode, is added to provide a visible reference in the white light images captured by the camera 5, as described in following. The guide beam is directed towards the sample 3 by means of an additional fiber 4b. To prevent the guide beam from reaching the detector 7, a low-pass filter (not visible in the drawings) is preferably added to the detection optical path. The second beam has a wavelength within the sensitivity range of camera 5.

Il sistema 1 include anche una sorgente luminosa visibile 9, come un LED bianco, che illumina il campione per fornire un'illuminazione chiara del campo visivo (FOV) della telecamera 5 durante le misure spettroscopiche. La sorgente di luce visibile viene attivata da un alimentatore LED 12 e attivata e disattivata ad una determinata prima frequenza da un temporizzatore 13. System 1 also includes a visible light source 9, such as a white LED, which illuminates the sample to provide clear illumination of the field of view (FOV) of camera 5 during spectroscopic measurements. The visible light source is activated by a LED power supply 12 and activated and deactivated at a given first frequency by a timer 13.

Un display 21 è anche preferibilmente compreso nel sistema 1 per visualizzare l'immagine catturata dalla telecamera 5 e le informazioni spettroscopiche. A display 21 is also preferably included in the system 1 for displaying the image captured by the camera 5 and the spectroscopic information.

Il fascio di eccitazione e il fascio di guida vengono entrambi inviati al campione 3, preferibilmente nella stessa posizione. Preferibilmente, il fascio di eccitazione è un fascio impulsato e il fascio di guida è un fascio a onda continua. Anche la sorgente luminosa 9 viene accesa e spenta per illuminare periodicamente il campione e anche l'acquisizione dell'immagine dalla fotocamera 5 viene eseguita con la stessa frequenza (il temporizzatore 13 è anche collegato alla telecamera 5). The excitation beam and the guide beam are both sent to sample 3, preferably in the same position. Preferably, the excitation beam is a pulsed beam and the guide beam is a continuous wave beam. The light source 9 is also turned on and off to periodically illuminate the sample and also the acquisition of the image from the camera 5 is performed with the same frequency (the timer 13 is also connected to the camera 5).

Il fascio di eccitazione genera una pluralità di fotoni emessi o diffusi dal campione 3. I fotoni vengono raccolti dalla fibra 4a e rivelati dal rivelatore 7. La raccolta di fotoni dal rivelatore 7 e l'accensione e lo spegnimento della sorgente di luce bianca 9 sono sincronizzati fra loro. Preferibilmente, anche l'acquisizione di immagini della telecamera 5 è sincronizzata con la sorgente 9 e il rivelatore 7. The excitation beam generates a plurality of photons emitted or scattered by the sample 3. The photons are collected by the fiber 4a and detected by the detector 7. The collection of photons by the detector 7 and the switching on and off of the white light source 9 are synchronized with each other. Preferably, the image acquisition of the camera 5 is also synchronized with the source 9 and the detector 7.

Il rivelatore 7 emette un segnale per ciascun fotone rivelato, che viene registrato dall'unità di elaborazione 20 e da cui vengono ottenute informazioni spettroscopiche. The detector 7 emits a signal for each detected photon, which is recorded by the processing unit 20 and from which spectroscopic information is obtained.

La telecamera e la sorgente visibile vengono preferibilmente attivate utilizzando lo stesso temporizzatore utilizzato per garantire che il campione sia ben illuminato quando la fotocamera sta acquisendo. The camera and visible source are preferably activated using the same timer used to ensure that the sample is well lit when the camera is acquiring.

Esempio 1 Example 1

Il sistema 1 utilizzato in questa prima implementazione è quello illustrato nella Figura 1. Il fascio di luce di eccitazione impulsata è fornito da un diodo laser 2 a 375 nm (BDL‐SMN‐375, Becker & Hickl GmbH, Berlino, Germania), operante a 20 MHz di frequenza di ripetizione degli impulsi e inviato sul campione 3 tramite una singola fibra 4, di diametro del nucleo interno di 100 μm, integrata in un fascio di fibre ottiche quadriforcato (EMVision LLC, Loxahatchee, FL, USA). La fluorescenza che emana dal campione 3 viene raccolta da sette fibre ottiche 4a di diametro del nucleo interno (core) di 300 μm e, attraverso un sistema di lenti, focalizzata sul catodo di un rivelatore ibrido 7 (HPM‐100, Becker & Hickl GmbH). Un filtro di emissione 11 (FF01‐470 / 28‐25, Semrock, Rochester, NY, USA), indicato in Figura 1 con il termine generico di “sistema ottico di rivelazione”, restringe la rivelazione del segnale di fluorescenza alla banda 470 ± 14 nm. L'uscita del rivelatore 7 è collegata ad una scheda di acquisizione TCSPC 20 (SPC‐730, Becker & Hickl GmbH) che fornisce la risoluzione temporale alle misure di fluorescenza. La risoluzione temporale della scheda TCSPC è stata regolata su 8 bit, dividendo così il decadimento della fluorescenza in 256 intervalli temporali, equivalenti dunque a 195 ps per intervallo a 20 MHz di frequenza di ripetizione. System 1 used in this first implementation is the one shown in Figure 1. The pulsed excitation light beam is provided by a laser diode 2 at 375 nm (BDL ‐ SMN ‐ 375, Becker & Hickl GmbH, Berlin, Germany), operating at 20 MHz of pulse repetition frequency and sent on sample 3 through a single fiber 4, with an internal core diameter of 100 μm, integrated in a quad-forked optical fiber bundle (EMVision LLC, Loxahatchee, FL, USA). The fluorescence emanating from sample 3 is collected by seven optical fibers 4a with a core diameter of 300 μm and, through a lens system, focused on the cathode of a hybrid detector 7 (HPM ‐ 100, Becker & Hickl GmbH ). An emission filter 11 (FF01‐470 / 28‐25, Semrock, Rochester, NY, USA), indicated in Figure 1 with the generic term of "optical detection system", restricts the detection of the fluorescence signal to the 470 ± band 14 nm. The detector output 7 is connected to a TCSPC 20 acquisition card (SPC ‐ 730, Becker & Hickl GmbH) which provides temporal resolution to fluorescence measurements. The temporal resolution of the TCSPC board has been adjusted to 8 bits, thus dividing the fluorescence decay into 256 time intervals, thus equivalent to 195 ps per interval at 20 MHz of repetition frequency.

Per fornire una risoluzione spaziale all'acquisizione TCSPC a singolo punto, il sistema 1 include una telecamera a colori USB 5 (DFK 33UP1300, The Imaging Source, Bremen, Germania), fissata e puntata sul campione 3 per registrare le misure. Un secondo diodo laser 6 (FC‐785‐350‐MM2‐PC‐0‐RM, RGBLase, Fremont, CA, USA) con lunghezza d'onda centrale di 785 nm e funzionamento in modalità CW viene aggiunto al sistema per fornire un riferimento visibile nelle immagini in luce bianca, come descritto di seguito. Per evitare che la luce a 785 nm raggiunga il rivelatore 7, nel percorso ottico del fascio è stato aggiunto un filtro passa‐basso da 700 nm (non mostrato nei disegni ‐ ET700SP, Chroma Technologies, Bellows Falls, VT, USA). To provide spatial resolution to single-point TCSPC acquisition, System 1 includes a USB 5 color camera (DFK 33UP1300, The Imaging Source, Bremen, Germany), fixed and pointed at sample 3 to record measurements. A second laser diode 6 (FC ‐ 785‐350 ‐ MM2 ‐ PC ‐ 0 ‐ RM, RGBLase, Fremont, CA, USA) with 785 nm center wavelength and CW mode operation is added to the system to provide a reference visible in white light images, as described below. To prevent 785 nm light from reaching detector 7, a 700 nm low pass filter (not shown in drawings - ET700SP, Chroma Technologies, Bellows Falls, VT, USA) was added in the optical path of the beam.

Infine, la configurazione sperimentale include anche un diodo a emissione di luce bianca 9 (LED, MNWHL4, Thorlabs, Newton, NJ, USA), diretto al campione 3 per fornire un'illuminazione chiara del FOV durante le Finally, the experimental setup also includes a 9 white light emitting diode (LED, MNWHL4, Thorlabs, Newton, NJ, USA), directed at sample 3 to provide clear illumination of the FOV during

misure di vita media della fluorescenza, come illustrato nella Figura 1 e descritto in dettaglio di seguito. Nelle misure effettuate, il LED si trovava a 30 cm di distanza dal campione. Il LED 9 era collegato a un generatore di corrente (LEDD1B, Thorlabs), con interfaccia adeguata alla modulazione esterna. Fluorescence lifetime measurements, as illustrated in Figure 1 and detailed below. In the measurements made, the LED was 30 cm away from the sample. LED 9 was connected to a current generator (LEDD1B, Thorlabs), with an interface suitable for external modulation.

Il sistema 1 opera secondo il metodo dell'invenzione. Le misure TCSPC sono sincronizzate con il LED 9 per realizzare l'imaging di vita media della fluorescenza in tempo reale in condizioni di fondo luminoso. Per generare mappe di vita media della fluorescenza in tempo reale utilizzando la rivelazione TCSPC sotto illuminazione brillante del campione 3, vengono sincronizzati tre processi: 1) l’acquisizione TCSPC e l’analisi corrispondente del decadimento di fluorescenza utilizzando la scheda di acquisizione TCSPC 20; 2) l’acquisizione dell'immagine a colori dalla telecamera 5 e la rivelazione del fascio di guida; 3) l’illuminazione del FOV mediante LED 9 senza interferire con l'acquisizione del decadimento della fluorescenza. Il LED bianco 9, la videocamera 5 e l'acquisizione TCSPC sono sincronizzati da una scheda di acquisizione dati NI PCI‐6221 (Data Acquisition Board, DAQ, PCI‐6221 National Instruments), che corrisponde al temporizzatore 13 nella figura 1. La telecamera 5 e il LED 9 vengono attivati utilizzando lo stesso temporizzatore 13 per garantire che il campione sia ben illuminato quando la telecamera 5 sta acquisendo. L'acquisizione TCSPC viene attivata 0,8 ms dopo che il segnale LED è impostato su spento, per garantire che il LED 9 sia completamente spento quando viene avviata la misura TCSPC. System 1 operates according to the method of the invention. TCSPC measurements are synchronized with LED 9 to realize real-time fluorescence lifetime imaging under bright background conditions. To generate real-time fluorescence lifetime maps using the TCSPC detection under bright illumination of sample 3, three processes are synchronized: 1) the TCSPC acquisition and the corresponding analysis of the fluorescence decay using the TCSPC 20 acquisition card; 2) the acquisition of the color image from camera 5 and the detection of the guide beam; 3) the lighting of the FOV by LED 9 without interfering with the acquisition of the fluorescence decay. The white LED 9, camera 5, and TCSPC acquisition are synchronized by an NI PCI ‐ 6221 (National Instruments Data Acquisition Board, DAQ, PCI ‐ 6221) data acquisition card, which corresponds to timer 13 in Figure 1. The camera 5 and the LED 9 are activated using the same timer 13 to ensure that the sample is well lit when the camera 5 is acquiring. TCSPC acquisition is activated 0.8ms after the LED signal is set to off, to ensure that LED 9 is completely off when TCSPC measurement is started.

Il diagramma temporale di questa implementazione è mostrato nella figura 2. L'intero ciclo di acquisizione e analisi TCSPC funziona indipendentemente dal ciclo di acquisizione, elaborazione e visualizzazione dell'immagine, come illustrato nella Figura 3. Questa strategia ottimizza le risorse computazionali parallelizzando i due processi, facendo così in modo che i requisiti di sincronizzazione dell'acquisizione siano soddisfatti sicuramente. L'applicazione principale è stata implementata in LabVIEW (LabVIEW 2015, National Instruments, Austin, TX, USA) in un computer desktop a 64 bit dotato di CPU Intel Core i7‐7700 da 3,6 GHz, 16 GB di RAM e 2 Tb di disco rigido. The timing diagram of this implementation is shown in Figure 2. The entire TCSPC acquisition and analysis cycle operates independently of the image acquisition, processing, and display cycle, as illustrated in Figure 3. This strategy optimizes computational resources by parallelizing the two processes, thus ensuring that acquisition synchronization requirements are met with certainty. The main application was implemented in LabVIEW (LabVIEW 2015, National Instruments, Austin, TX, USA) on a 64-bit desktop computer equipped with a 3.6 GHz Intel Core i7‐7700 CPU, 16 GB of RAM and 2 Tb hard drive.

Tornando alla figura 2, come si può vedere dalla prima e dalla seconda curva in alto, l'illuminazione a LED mediante LED 9 e l'acquisizione di immagini da parte della telecamera 5 avviene contemporaneamente. Pertanto, in ciascun periodo di 20 ms, il LED è acceso per 2 ms e in questo intervallo "acceso" la telecamera 5 acquisisce l'immagine. Per realizzare misure di vita media della fluorescenza sotto l'illuminazione in luce bianca del campione, il LED bianco 9 è preferibilmente sfasato rispetto all'acquisizione TCSPC (si veda la Figura 2, seconda curva dal basso, “misura spettroscopica”). Il LED è modulato direttamente utilizzando un'onda quadra a 50 Hz fornita da una scheda PCI‐6221. A questa frequenza, l'effetto stroboscopico causato dalla sorgente luminosa lampeggiante non viene riconosciuto dall'occhio umano e l'operatore percepisce effettivamente un'illuminazione continua e brillante del FOV. Per evitare di acquisire il fondo intenso generato dal LED, le misure TCSPC vengono realizzate quando il LED è spento. Il ciclo di lavoro del LED può essere ridotto al minimo per massimizzare il tempo di integrazione TCSPC Δt (si veda Figura 2) e la Returning to Figure 2, as can be seen from the first and second curves at the top, the LED lighting by means of LEDs 9 and the acquisition of images by the camera 5 takes place simultaneously. Therefore, in each 20 ms period, the LED is on for 2 ms and in this "on" interval the camera 5 acquires the image. To perform fluorescence lifetime measurements under white light illumination of the sample, the white LED 9 is preferably out of phase with the TCSPC acquisition (see Figure 2, second curve from below, “spectroscopic measurement”). The LED is modulated directly using a 50Hz square wave provided by a PCI-6221 card. At this frequency, the strobing effect caused by the flashing light source is not recognized by the human eye and the operator actually perceives a continuous and bright illumination of the FOV. To avoid acquiring the intense background generated by the LED, TCSPC measurements are made when the LED is off. The duty cycle of the LED can be minimized to maximize the integration time TCSPC Δt (see Figure 2) and the

raccolta di fotoni. Per un LED che pulsa a 50 Hz con un ciclo di lavoro del 10% (vale a dire 2 ms di tempo di accensione), il tempo di integrazione massimo per una misura TCSPC sarebbe in teoria 18 ms, dopo di che il LED si riaccende. Vi sono, tuttavia, alcune considerazioni pratiche che limitano la durata temporale dell'acquisizione TCSPC. Da una parte è necessario tenere conto del tempo di latenza nella commutazione del LED per garantire che la misura TCSPC sia priva del fondo luminoso originato dal LED. Ciò si ottiene avviando l'acquisizione TCSPC con un leggero ritardo rispetto al fronte di discesa del segnale di spegnimento del LED ‐ questo è stato impostato su 0,8 ms nella presente implementazione (50° sfasamento), che è sufficiente per contenere il tempo di spegnimento del LED (< 100 μs) e selezionando un tempo di integrazione conservativo in modo che la misurazione sia completata prima che il LED si riaccenda. Il periodo per le misure TCSPC Δt è ulteriormente ridotto poiché deve essere considerato il tempo per: (1) la preparazione della misura secondo i requisiti hardware; (2) la memorizzazione, elaborazione e visualizzazione dei dati (si veda in Figura 2 l'ultima curva in basso “analisi dati”, che termina prima dell'inizio di una nuova misurazione spettroscopica, e la curva centrale, “elaborazione e visualizzazione immagine”). Mentre la preparazione è virtualmente istantanea, la memorizzazione, l'elaborazione e la visualizzazione dei dati potrebbero richiedere tempo e risorse e potrebbero quindi rappresentare un collo di bottiglia di questo metodo. Quindi, per fornire un rapido riscontro in tempo reale della misura, i decadimenti della fluorescenza vengono analizzati immediatamente dopo l'acquisizione utilizzando il metodo dei fasori, come descritto precedentemente nel sommario dell'invenzione. Un fasore caratteristico viene calcolato per ogni misura e visualizzato in coordinate polari, fornendo un riscontro in tempo reale della misura. Complessivamente, al fine di soddisfare i requisiti di temporizzazione, viene scelto un tempo di integrazione TCSPC conservativo, insieme ad algoritmi intensivi di calcolo che parallelizzano l'elaborazione e l'archiviazione dei dati. collection of photons. For an LED pulsing at 50Hz with a 10% duty cycle (i.e. 2ms on time), the maximum integration time for a TCSPC measurement would theoretically be 18ms, after which the LED turns on again. . There are, however, some practical considerations that limit the time duration of the TCSPC acquisition. On the one hand, it is necessary to take into account the latency time in switching the LED to ensure that the TCSPC measurement is free of the light background originating from the LED. This is achieved by starting the TCSPC acquisition with a slight delay with respect to the falling edge of the LED turn-off signal - this has been set to 0.8 ms in the present implementation (50th phase shift), which is sufficient to contain the switching time. turning off the LED (<100 μs) and selecting a conservative integration time so that the measurement is completed before the LED turns on again. The period for TCSPC Δt measurements is further reduced as the time for: (1) preparation of the measurement according to hardware requirements must be considered; (2) data storage, processing and visualization (see in Figure 2 the last curve below "data analysis", which ends before the start of a new spectroscopic measurement, and the central curve, "image processing and visualization "). While the preparation is virtually instantaneous, storing, processing, and viewing the data could be time-consuming and resource-intensive and could therefore be a bottleneck for this method. Then, to provide a quick real-time feedback of the measurement, the fluorescence decays are analyzed immediately after acquisition using the phasor method, as previously described in the summary of the invention. A characteristic phasor is calculated for each measurement and displayed in polar coordinates, providing real-time feedback of the measurement. Overall, in order to meet timing requirements, a conservative TCSPC integration time is chosen, along with compute-intensive algorithms that parallelize data processing and storage.

L'illuminazione del campione è fornita solo dal LED bianco a impulsi 9 e quindi tutte le misure qui presentate sono realizzate con le luci ambiente spente. L'intensità del LED è stata regolata per ciascun campione, considerando due condizioni: 1) fornire un'uscita di intensità sufficiente in modo che il campione sia ben illuminato e visibile all'operatore a occhio nudo; 2) evitare di esporre il rilevatore a luce intensa che potrebbe causare danni permanenti. The illumination of the sample is provided only by the white pulsed LED 9 and therefore all the measurements presented here are made with the ambient lights switched off. The intensity of the LED was adjusted for each sample, considering two conditions: 1) providing an output of sufficient intensity so that the sample is well lit and visible to the operator with the naked eye; 2) avoid exposing the detector to intense light which could cause permanent damage.

Il LED è pilotato da un “hardware”, ovvero il DAQ 13 PCI‐6221 trasmette direttamente un segnale a 50 Hz tramite un cavo BNC all’alimentatore del LED 12, l'acquisizione TCSPC viene avviata tramite “software”: un segnale a 50 Hz, che viene agganciato in fase e ritardato di 2,8 ms rispetto al segnale LED, viene letto da un convertitore analogico‐digitale (Analog‐to‐Digital Converter, ADC) PCI‐6221 (13) e l'acquisizione TCSPC viene attivata quando viene rilevato un fronte di salita di questo segnale. Di conseguenza, eventuali ritardi nel “software”, dovuti ad es. all'elaborazione ed all'archiviazione dei dati, possono eventualmente portare a non rilevare il seguente fronte di salita e dunque a mancate acquisizioni. The LED is driven by a "hardware", ie the DAQ 13 PCI ‐ 6221 directly transmits a signal at 50 Hz via a BNC cable to the power supply of the LED 12, the TCSPC acquisition is initiated via "software": a signal at 50 Hz, which is phase locked and 2.8 ms delayed with respect to the LED signal, is read by an Analog-to-Digital Converter (ADC) PCI-6221 (13) and TCSPC acquisition is triggered when a rising edge of this signal is detected. Consequently, any delays in the "software", due to eg. processing and archiving of data, may eventually lead to not detecting the following rising edge and therefore to missing acquisitions.

Per garantire che il campione sia ben illuminato durante l'acquisizione dell'immagine, la videocamera USB 5 viene attivata dall’”hardware” utilizzando un'onda quadra a 50 Hz che è in fase con il segnale di attivazione del LED (si veda la Figura 2). Il tempo di esposizione della telecamera è stato impostato a 1.93 ms, massimizzando così l'illuminazione durante l'acquisizione del fotogramma. La risoluzione di ciascun fotogramma è impostata su 640 × 480 pixel. Per la sorgente CW 6 viene utilizzato un diodo laser a 785 nm. In linea di principio, qualsiasi lunghezza d'onda può essere utilizzata fintanto che rientra nell'intervallo visibile dell'occhio umano, rilevabile dalla telecamera 5, e fuori dall’intervallo spettrale di rivelazione del segnale di fluorescenza. Attraverso un'elaborazione veloce delle immagini, il fascio di guida a 785 nm, che corrisponde alla posizione approssimativa delle misure di fluorescenza poiché la sorgente di eccitazione per la fluorescenza ed il fascio di guida a 785 nm sono sovrapposti sul piano del campione, può essere rivelato e segmentato dall'immagine in luce bianca. In breve, la rivelazione di un fascio di guida a 785 nm in un'immagine in luce bianca comprende i seguenti passaggi (si veda per riferimento la Figura 13): To ensure that the sample is well lit during image acquisition, the USB 5 camera is activated by the "hardware" using a 50 Hz square wave which is in phase with the trigger signal of the LED (see Figure 2). The exposure time of the camera has been set to 1.93 ms, thus maximizing the illumination during frame capture. The resolution of each frame is set to 640 × 480 pixels. A 785 nm laser diode is used for the CW 6 source. In principle, any wavelength can be used as long as it falls within the visible range of the human eye, detectable by camera 5, and outside the spectral range of detection of the fluorescence signal. Through fast image processing, the 785 nm guide beam, which corresponds to the approximate position of the fluorescence measurements since the excitation source for the fluorescence and the 785 nm guide beam are superimposed on the sample plane, can be revealed and segmented by the white light image. Briefly, the detection of a 785 nm guide beam in a white light image includes the following steps (see Figure 13 for reference):

1. Nel passo 1F l'immagine viene acquisita dalla telecamera 5; 1. In step 1F the image is acquired by the camera 5;

2. Nel passo 2F avviene l'estrazione del canale rosso dall'immagine RGB, che crea un'immagine a 8 bit in scala di grigi; 2. In step 2F the red channel is extracted from the RGB image, which creates an 8-bit grayscale image;

3. Nel passo 3F all'immagine in scala di grigi viene applicata una soglia di intensità per creare una maschera binaria; 3. In step 3F an intensity threshold is applied to the grayscale image to create a binary mask;

4 Nel passo 4F l’erosione morfologica e la chiusura della maschera binaria vengono utilizzate per erodere i confini dell'oggetto in primo piano e per rimuovere il rumore; 4 In step 4F the morphological erosion and the closure of the binary mask are used to erode the boundaries of the object in the foreground and to remove the noise;

5. La chiusura morfologica viene utilizzata per riempire i buchi all'interno dell'oggetto; 5. The morphological closure is used to fill the holes inside the object;

6. Nel passo 5F avviene la rilevazione dei contorni dell'oggetto. Il risultato di questo passo 5F è anche mostrato in una vista ingrandita dell'area di interesse nella Figura 13; 6. In step 5F the contours of the object are detected. The result of this step 5F is also shown in an enlarged view of the area of interest in Figure 13;

7. Il “fit” con un cerchio del contorno rilevato e la creazione di una maschera circolare (passo 6F); 7. The “fit” with a circle of the detected contour and the creation of a circular mask (step 6F);

Per una soglia fissa, il diametro della maschera circolare dipende da vari parametri sperimentali tra cui l’illuminazione del FOV, la distanza sonda‐bersaglio e le proprietà di assorbimento e diffusione del tessuto. For a fixed threshold, the diameter of the circular mask depends on various experimental parameters including the illumination of the FOV, the probe-target distance and the absorption and diffusion properties of the tissue.

Per ciascun fotogramma in cui viene rivelato il fascio di guida, ai pixel situati all'interno della maschera circolare viene attribuito l'ultimo valore di durata della vita media della fluorescenza, calcolato dall'analisi con i fasori. Se un pixel viene trovato all'interno della maschera circolare in più acquisizioni, il suo valore di vita media della fluorescenza viene calcolato come media dei valori di ciascuna acquisizione (si vedano i passaggi 7F e 8F in figura 13). Ciò consente di produrre una mappa dinamica di vita media della For each frame in which the guide beam is detected, the pixels located within the circular mask are given the last value of average fluorescence lifespan, calculated from the phasor analysis. If a pixel is found within the circular mask in multiple acquisitions, its mean fluorescence life value is calculated as the average of the values of each acquisition (see steps 7F and 8F in Figure 13). This allows you to produce a dynamic map of the average life of the

fluorescenza, che può essere sovrapposta all'immagine in luce bianca e aggiornata a 50 Hz, fornendo così un riscontro visivo delle misure in tempo reale. fluorescence, which can be superimposed on the white light image and updated at 50 Hz, thus providing visual feedback of measurements in real time.

I decadimenti di intensità della fluorescenza vengono analizzati usando il metodo dei fasori sopra descritto. The fluorescence intensity decays are analyzed using the phasor method described above.

Come descritto, ogni decadimento della fluorescenza viene acquisito da un gruppo di pixel che è segmentato per generare mappe di vita media della fluorescenza. Pertanto, la reciprocità tra il decadimento della fluorescenza e la trasformazione in un fasore determina che ogni punto nella nuvola dei fasori può anche essere ricondotto a un gruppo di pixel nell'immagine di vita media della fluorescenza. As described, each fluorescence decay is captured by a cluster of pixels that are segmented to generate fluorescence lifetime maps. Thus, the reciprocity between the fluorescence decay and the transformation into a phasor determines that each point in the phasor cloud can also be traced back to a cluster of pixels in the fluorescence lifetime image.

Anche la vita media della fluorescenza così calcolata (passo 8F) è sovrapposta all'immagine (passo 9F). The average life of the fluorescence thus calculated (step 8F) is also superimposed on the image (step 9F).

Il passo 9F del calcolo della vita media della fluorescenza è illustrato in dettaglio nella Figura 3 insieme alla sua interazione con l'elaborazione dell'immagine. Step 9F of the fluorescence lifetime calculation is detailed in Figure 3 along with its interaction with image processing.

Il suddetto sistema e metodo sono stati applicati per rivelare le informazioni spettroscopiche di fluorescenza dai tessuti animali. Campioni di cuore bovino e rene di agnello sono stati acquisiti e conservati a 4 °C per un massimo di 12 ore prima delle misure. Campioni di cartilagine articolare suina sono stati ottenuti da zampetti suini appena macellati dal macello locale. Le superfici delle articolazioni metacarpofalangee sono state esposte. La cartilagine è stata lasciata attaccata all'osso subcondrale, che è stato tagliato distalmente utilizzando un seghetto. Dopo l'estrazione, pezzi di cartilagine di circa 3 × 3 × 3 cm di dimensione sono stati immersi in PBS con sodio azide allo 0,05% per 24 ore per prevenire la crescita batterica. I campioni sono stati accuratamente lavati in tampone fosfato salino (Phosphate Buffer Saline, PBS) e conservati a ‐20 °C per 24 ore prima delle misure. The above system and method were applied to reveal fluorescence spectroscopic information from animal tissues. Bovine heart and lamb kidney samples were acquired and stored at 4 ° C for up to 12 hours prior to measurements. Swine articular cartilage samples were obtained from freshly slaughtered pig trotters from the local slaughterhouse. The surfaces of the metacarpophalangeal joints were exposed. The cartilage was left attached to the subchondral bone, which was cut distally using a hacksaw. After extraction, pieces of cartilage approximately 3 × 3 × 3 cm in size were soaked in PBS with 0.05% sodium azide for 24 hours to prevent bacterial growth. Samples were carefully washed in Phosphate Buffer Saline (PBS) and stored at -20 ° C for 24 hours prior to measurements.

I campioni di cartilagine articolare suina (n = 2) sono stati preparati per le misure di vita media della fluorescenza in seguito a digestione della cartilagine. Le lesioni localizzate nella superficie della cartilagine articolare sono state indotte mediante ammollo con carta da filtro (dimensioni approssimative 5 × 4 mm) imbevuta con una collagenasi batterica da 250 μM. A scopo di controllo, anche la carta da filtro imbevuta di PBS è stata collocata sulla superficie articolare. Il trattamento è stato applicato per 5 ore a 37 °C. Le misure sono state realizzate prima e dopo il trattamento. I risultati presentati di seguito sono relativi ad un solo campione. Risultati simili sono stati ottenuti con il secondo campione. Porcine articular cartilage samples (n = 2) were prepared for fluorescence lifetime measurements following cartilage digestion. Localized lesions in the articular cartilage surface were induced by soaking with filter paper (approximate size 5 × 4 mm) soaked with 250 μM bacterial collagenase. For control purposes, PBS-soaked filter paper was also placed on the articular surface. The treatment was applied for 5 hours at 37 ° C. The measurements were made before and after the treatment. The results presented below are for one sample only. Similar results were obtained with the second sample.

Per dimostrare la fattibilità di questo metodo, è stato studiato se la luce di fondo proveniente dal LED stesse contaminando la lettura TCSPC, per diverse durate della finestra di integrazione Δt (si veda la Figura 2). Per confronto, è stata misurata anche la sola luce di fondo prodotta dalla luce ambientale della stanza, cioè il LED 9 è stato spento durante l'intera acquisizione. I risultati sono presentati in Figura 4a. Come previsto, il livello di fondo proveniente solo dalla luce ambientale aumenta in maniera lineare con il tempo di integrazione (si veda Figura 4a, quadrati). Quando il LED 9 è acceso e pulsa a 50 Hz (cerchi), si osserva un To demonstrate the feasibility of this method, it was investigated whether the background light from the LED was contaminating the TCSPC reading, for different durations of the Δt integration window (see Figure 2). For comparison, only the background light produced by the ambient light of the room was also measured, i.e. the LED 9 was turned off during the entire acquisition. The results are presented in Figure 4a. As expected, the background level from ambient light alone increases linearly with the integration time (see Figure 4a, squares). When LED 9 is on and pulsing at 50Hz (circles), a

aumento lineare del fondo luminoso misurato, fino ad un tempo di integrazione di 15 ms. Per tempi di integrazione superiori a 15 ms, viene misurato un aumento significativo del numero di fotoni acquisiti, il che suggerisce che la luce proveniente dal LED 9 viene rivelata dal sistema TCSPC 20. Questo aumento può essere spiegato in termini dei vincoli temporali del presente metodo (si veda figura 2): se il tempo di integrazione del TCSPC è superiore a 17,2 ms (che corrisponde alla differenza di tempo tra l'inizio della misurazione TCSPC e il successivo ciclo LED), si sovrapporrà alla finestra temporale di illuminazione del LED da 2 ms. I ritardi nell’elaborazione software riducono ulteriormente il tempo massimo di integrazione. Complessivamente, queste misure dimostrano che per tempi di integrazione fino a 15 ms il LED produce un livello di fondo luminoso residuo (meno di 20 fotoni in misure di 15 ms) che non influenza la lettura TCSPC. Da 5 a 15 ms, si osserva un aumento del fondo luminoso quando il LED è acceso (cerchi) rispetto alle sole misurazioni della luce ambientale della stanza (quadrati). Ciò potrebbe essere attribuito al fatto che il fondo luminoso del LED viene ancora rivelato ai bordi della finestra di integrazione TCSPC ed anche all’eventuale post‐impulso del rivelatore: mentre l'uscita LED non sta contaminando in modo significativo la misura TCSPC, essa sta comunque raggiungendo il rivelatore e producendo artefatti di post‐impulso. Per indagare ulteriormente la fattibilità di questo metodo, viene misurata la percentuale di fondo luminoso proveniente dal LED pulsato 9 e dalla luce ambiente della stanza nel decadimento della fluorescenza di uno standard di fluorescenza (si veda la Figura 4b). La luce di fondo è stata mantenuta ad un ritmo di conteggi costante pari a 2,5 × 10<5> fotoni al secondo (ritmo di conteggio del discriminatore a frazione costante, Costant Fraction Discriminator (CFD)). Quando viene eccitato lo standard di fluorescenza, il ritmo del CFD aumenta a circa 5 × 10<5> fotoni al secondo. I risultati in Figura 4b dimostrano che la percentuale di fondo luminoso nel decadimento della fluorescenza è residuale (circa 1%) per i tempi di integrazione fino a 15 ms. Come previsto, per tempi di integrazione più lunghi il contributo del fondo luminoso aumenta a circa il 45% del segnale totale misurato a causa della sovrapposizione della misura TCSPC con l'illuminazione a LED, che è coerente con l'aumento misurato nel ritmo di conteggio del CFD. linear increase of the measured light background, up to an integration time of 15 ms. For integration times greater than 15 ms, a significant increase in the number of photons acquired is measured, suggesting that the light from LED 9 is detected by the TCSPC 20 system. This increase can be explained in terms of the time constraints of the present method. (see figure 2): if the integration time of the TCSPC is greater than 17.2 ms (which corresponds to the time difference between the start of the TCSPC measurement and the next LED cycle), it will overlap the lighting time window of the 2 ms LED. Delays in software processing further reduce the maximum integration time. Overall, these measurements demonstrate that for integration times up to 15 ms the LED produces a residual light background level (less than 20 photons in 15 ms measurements) that does not affect the TCSPC reading. From 5 to 15 ms, there is an increase in the background light when the LED is on (circles) compared to only the ambient light measurements of the room (squares). This could be attributed to the fact that the bright background of the LED is still being detected at the edges of the TCSPC integration window and also to the eventual post ‐ pulse of the detector: while the LED output is not significantly contaminating the TCSPC measurement, it is however reaching the detector and producing post ‐ impulse artifacts. To further investigate the feasibility of this method, the percentage of light background from pulsed LED 9 and ambient room light in the fluorescence decay of a fluorescence standard is measured (see Figure 4b). The background light was maintained at a constant counting rate of 2.5 × 10 <5> photons per second (Constant Fraction Discriminator (CFD) count rate). When the fluorescence standard is excited, the rate of the CFD increases to approximately 5 × 10 <5> photons per second. The results in Figure 4b demonstrate that the percentage of bright background in the fluorescence decay is residual (approximately 1%) for integration times up to 15 ms. As expected, for longer integration times the light background contribution increases to approximately 45% of the total measured signal due to the overlap of the TCSPC measurement with the LED illumination, which is consistent with the measured increase in the count rate. of the CFD.

Una preoccupazione comune spesso associata alle misure TCSPC si riferisce ai lunghi tempi di integrazione che sono tipicamente necessari per raccogliere un numero di fotoni sufficiente a descrivere con precisione un decadimento della fluorescenza. Dai risultati presentati in Figura 4 (a, b), il tempo di integrazione massimo per il sistema attuale è 15 ms. Quindi, viene verificata la capacità del sistema 1 di misurare la vita media della fluorescenza per un fluoroforo di riferimento (POPOP in etanolo), che presenta un caratteristico decadimento esponenziale singolo, utilizzando un tempo di integrazione fisso di 15 ms. Le misure sono state realizzate per diversi valori di intensità di eccitazione laser al fine di valutare la capacità del sistema 1 di misurare accuratamente il decadimento della fluorescenza di POPOP a diverse intensità di fluorescenza. I risultati presentati in Figura 4c mostrano che in presenza di conteggi di fotoni elevati le durate di fluorescenza misurate sono in perfetto accordo con il valore riportato di 1,29 ns. Come previsto, la precisione e l'accuratezza delle misure aumentano con il numero dei fotoni conteggiati. Tuttavia, per i A common concern often associated with TCSPC measurements relates to the long integration times that are typically required to collect enough photons to accurately describe a fluorescence decay. From the results presented in Figure 4 (a, b), the maximum integration time for the current system is 15 ms. Then, the ability of system 1 to measure the fluorescence lifetime for a reference fluorophore (POPOP in ethanol), which exhibits a characteristic single exponential decay, is verified using a fixed integration time of 15 ms. Measurements were made for different laser excitation intensity values in order to evaluate the ability of system 1 to accurately measure POPOP fluorescence decay at different fluorescence intensities. The results presented in Figure 4c show that in the presence of high photon counts the measured fluorescence durations are in perfect agreement with the reported value of 1.29 ns. As expected, the precision and accuracy of the measurements increase with the number of photons counted. However, for the

decadimenti di fluorescenza con circa 500 fotoni abbiamo misurato una durata di 1,32 ± 0,09 ns, che è ancora in eccellente accordo con il valore atteso. Pertanto, in tutte le misurazioni riportate di seguito è stato utilizzato un tempo di integrazione fisso di 15 ms. fluorescence decays with about 500 photons we measured a duration of 1.32 ± 0.09 ns, which is still in excellent agreement with the expected value. Therefore, a fixed integration time of 15 ms was used in all measurements below.

A seguito della validazione iniziale e della caratterizzazione della strategia di acquisizione TCSPC, vengono prodotte mappe di vita media della fluorescenza da campioni biologici, senza traccianti, a partire da misure di singolo punto, in tempo reale. Le Figure 5 a‐c mostrano la misura di vita media della fluorescenza di un rene di agnello bisecato. Il rene di agnello è un comodo campione di prova per le misure di autofluorescenza data la sua eterogeneità anatomica che costituisce una ricca fonte di contrasto endogeno. I dati relativi alla vita media della fluorescenza (si veda Figura 5b) sono in accordo con le precedenti misure TCSPC effettuate sul rene di agnello. In particolare, i vasi sanguigni (frecce bianche nella Figura 5a) presentano una vita media dell’autofluorescenza più lunga rispetto ad altre regioni, a causa dell'elevato contenuto di elastina e collagene e della loro caratteristica vita media di fluorescenza lunga. L'intensità della fluorescenza misurata varia significativamente con una media di 8568 ± 7514 fotoni per ciascuna misura TCSPC (si veda Figura 5c). Following the initial validation and characterization of the TCSPC acquisition strategy, fluorescence lifetime maps are produced from biological samples, without tracers, starting from single point measurements, in real time. Figures 5 a-c show the mean life measure of the fluorescence of a bisected lamb kidney. Lamb kidney is a convenient test specimen for autofluorescence measurements given its anatomical heterogeneity which constitutes a rich source of endogenous contrast. The data relating to the mean life of the fluorescence (see Figure 5b) are in agreement with the previous TCSPC measurements carried out on the lamb kidney. In particular, the blood vessels (white arrows in Figure 5a) have a longer average life of autofluorescence than other regions, due to the high content of elastin and collagen and their characteristic long fluorescence average life. The measured fluorescence intensity varies significantly with an average of 8568 ± 7514 photons for each TCSPC measurement (see Figure 5c).

Inoltre, il tessuto cardiaco bovino fresco è stato scansionato a velocità diverse. In particolare, sono state generate mappe di vita media della fluorescenza con velocità di scansione medie di 17,4 mm/s (Figura 6c) e 45,1 mm/s (Figura 6d), corrispondenti rispettivamente alle acquisizioni "lente" e "veloci". I risultati dimostrano la somiglianza tra le misure, che è ulteriormente confermata tracciando l’andamento della vita media della fluorescenza misurata lungo la linea tratteggiata verde (si veda Figura 6(a‐b)). L'effetto della velocità di scansione si riflette essenzialmente sul numero di volte in cui ogni pixel viene campionato: per velocità di scansione inferiori, ciascun pixel viene campionato un numero maggiore di volte, producendo così risultati di vita media della fluorescenza più consistenti attraverso la media di più acquisizioni. Di conseguenza, le misure a velocità di scansione più basse producono mappe di vita media della fluorescenza più uniformi, come dimostrato nella Figura 6(c‐d). In addition, fresh bovine heart tissue was scanned at different rates. In particular, fluorescence lifetime maps were generated with average scan speeds of 17.4 mm / s (Figure 6c) and 45.1 mm / s (Figure 6d), corresponding respectively to the "slow" and "fast" acquisitions. ". The results demonstrate the similarity between the measurements, which is further confirmed by plotting the trend of the average life of the fluorescence measured along the green dotted line (see Figure 6 (a-b)). The effect of the scan rate is essentially reflected in the number of times each pixel is sampled: for slower scan rates, each pixel is sampled a greater number of times, thus producing more consistent fluorescence lifetime results across the average. more acquisitions. Consequently, measurements at slower scan rates produce more uniform fluorescence lifetime maps, as demonstrated in Figure 6 (c ‐ d).

Per illustrare la possibilità di riportare il contrasto intrinseco in un'applicazione clinicamente rilevante, i campioni di cartilagine articolare suina sono stati mappati prima e dopo il trattamento localizzato, effettuato con collagenasi batterica per promuovere la digestione (si veda la Figura 7a‐f). Il segnale di autofluorescenza della cartilagine articolare emana prevalentemente da legami di collagene di tipo II. Precedenti studi hanno dimostrato che le misure di vita media della fluorescenza sono sensibili alla degradazione enzimatica della cartilagine, sia alla scissione delle fibrille di collagene che all'esaurimento dei proteoglicani. Prima del trattamento (vedere figure 7 (a‐c)), è stata misurata una vita media della fluorescenza di 6,89 ± 0,45 ns sull'intero campione, su un totale di 1528 misure TCSPC in un periodo di 30,8 secondi, con una frequenza TCSPC media di 49,6 Hz. È stata osservata una variazione molto piccola della vita media della fluorescenza sull'intero campione (vedere figura 7b), che ha provocato una nuvola di fasori To illustrate the possibility of reporting intrinsic contrast in a clinically relevant application, porcine joint cartilage samples were mapped before and after localized treatment, performed with bacterial collagenase to promote digestion (see Figure 7a-f). The articular cartilage autofluorescence signal emanates mainly from type II collagen bonds. Previous studies have shown that half-life measurements of fluorescence are sensitive to enzymatic degradation of cartilage, both to cleavage of collagen fibrils and to depletion of proteoglycans. Before treatment (see figures 7 (a-c)), a mean fluorescence life of 6.89 ± 0.45 ns was measured over the entire sample, out of a total of 1528 TCSPC measurements over a period of 30.8 seconds, with an average TCSPC frequency of 49.6 Hz. A very small change in fluorescence lifetime was observed over the entire sample (see Figure 7b), resulting in a cloud of phasors

compatta, come mostrato nella Figura 7c. Il trattamento con una collagenasi batterica da 250 μM per 5 ore ha provocato una digestione visibile della superficie della cartilagine articolare, come mostrato in Figura 7d, che si è tradotto in una drastica diminuzione della vita media della fluorescenza nell'area interessata (si veda la Figura 7e). Nella regione di controllo è stata osservata una leggera diminuzione della vita media della fluorescenza, che è in accordo con gli studi precedenti. compact, as shown in Figure 7c. Treatment with a 250 μM bacterial collagenase for 5 hours resulted in visible digestion of the surface of the articular cartilage, as shown in Figure 7d, which resulted in a drastic decrease in the lifetime of fluorescence in the affected area (see Figure 7e). A slight decrease in fluorescence lifetime was observed in the control region, which is in agreement with previous studies.

La diminuzione della vita media della fluorescenza nella regione interessata ha generato una nuvola più ampia nello spazio dei fasori, con un baricentro significativamente spostato verso vite media di fluorescenza più brevi, cioè ruotato in senso orario rispetto alla mappa nello spazio dei fasori misurata prima del trattamento (si veda Figura 8a). La nuvola di fasori del campione pretrattato rientra nella regione racchiusa dal rettangolo identificato con il numero 2 nella Figura 8a, il che suggerisce che questi fasori provengano da misure effettuate nella regione in cui il trattamento non è stato applicato. Sfruttando la reciprocità tra le misure di decadimento della fluorescenza e la corrispondente trasformazione nello spazio dei fasori con la segmentazione dei pixel, i fasori all'interno dei rettangoli 1 e 2 nella Figura 8a possono essere mappati ed evidenziati nell'immagine in luce bianca, escludendo i punti corrispondenti a fasori al di fuori di queste regioni. I risultati di questa segmentazione basata sui fasori sono mostrati nella Figura 8b, dove le regioni 1 e 2 rappresentano i fasori all'interno dei rettangoli 1 e 2 nella Figura 8a, rispettivamente. La regione 1 si sovrappone in larga misura con la regione in cui è stato applicato il trattamento, il che dimostra ulteriormente il vantaggio di realizzare l'analisi mediante fasori. Data la semplicità dell'approccio con i fasori e la sua idoneità all'implementazione in tempo reale, una segmentazione basata sui fasori che fornisce una discriminazione tra i tessuti normali e malati potrebbe anche essere implementata in tempo reale, aumentando così l'impatto del metodo per le applicazioni cliniche. The decrease in the fluorescence lifetime in the affected region generated a larger cloud in the phasor space, with a center of gravity significantly shifted towards shorter fluorescence lifetime, i.e. rotated clockwise with respect to the map in the phasor space measured before treatment (see Figure 8a). The phasor cloud of the pretreated sample falls within the region enclosed by the rectangle identified with the number 2 in Figure 8a, suggesting that these phasors come from measurements made in the region where the treatment was not applied. By exploiting the reciprocity between the fluorescence decay measurements and the corresponding transformation in phasor space with pixel segmentation, the phasors within rectangles 1 and 2 in Figure 8a can be mapped and highlighted in the image in white light, excluding the points corresponding to phasors outside these regions. The results of this phasor-based segmentation are shown in Figure 8b, where regions 1 and 2 represent the phasors within rectangles 1 and 2 in Figure 8a, respectively. Region 1 overlaps to a large extent with the region where the treatment was applied, which further demonstrates the advantage of performing phasor analysis. Given the simplicity of the phasor approach and its suitability for real-time implementation, phasor-based segmentation that provides discrimination between normal and diseased tissues could also be implemented in real time, thus increasing the impact of the method. for clinical applications.

Esempio 2 Example 2

In questo esempio, il sistema per la spettroscopia di fluorescenza è lo stesso del sistema illustrato in Figura 1, ad eccezione del tipo di rilevatore 7 utilizzato. Qui viene utilizzata una matrice di SPAD. In this example, the system for fluorescence spectroscopy is the same as the system shown in Figure 1, except for the detector type 7 used. Here a SPAD matrix is used.

In questa seconda implementazione del sistema 1, i fotoni di fluorescenza del campione 3 vengono dispersi mediante un reticolo di diffrazione 11 ("sistema ottico di rivelazione” in Figura 1, GT50‐06V, Thorlabs, Newton, NJ, USA) e il segnale di fluorescenza risultante viene risolto spettralmente con ingrandimento 1:1 lungo uno degli assi di una matrice SPAD 7 (SPC3, MPD, Bolzano, Italia), costituita da 2048 pixel disposti in 32 righe per 64 colonne. Un filtro ottico passa‐alto da 400 nm (FEL0400, Thorlabs) è stato aggiunto al cammino ottico di rivelazione per impedire che la luce di eccitazione raggiunga il rivelatore. Questa configurazione ottica è semplice e offre un ampio intervallo di lunghezze d'onda (400 ‐ 650 nm) di rivelazione. In this second implementation of system 1, the fluorescence photons of sample 3 are scattered by means of a diffraction grating 11 ("optical detection system" in Figure 1, GT50‐06V, Thorlabs, Newton, NJ, USA) and the The resulting fluorescence is spectrally resolved with 1: 1 magnification along one of the axes of a SPAD 7 matrix (SPC3, MPD, Bolzano, Italy), consisting of 2048 pixels arranged in 32 rows by 64 columns. A 400 nm high-pass optical filter (FEL0400, Thorlabs) has been added to the detection optical path to prevent excitation light from reaching the detector This optical setup is simple and offers a wide range of detection wavelengths (400 - 650 nm).

Per generare mappe di vita media e di intensità dell’autofluorescenza da misure a singolo punto, vengono utilizzati lo stesso fascio di eccitazione e il fascio di guida dell'Esempio 1. In breve, le misure di fluorescenza vengono realizzate spostando liberamente la sonda a fibra ottica 4 sul campione 3. Una seconda sorgente luminosa ‐ un diodo laser a 785 nm a onda continua (CW) 6 (FC‐785‐350‐MM2‐PC‐0‐RM, RGBLase, Fremont, CA, USA) ‐ viene utilizzata in contemporanea con la luce di eccitazione a 375 nm per fornire un riferimento visibile alle misure, che possono essere registrate utilizzando una telecamera a colori (DFK 33UP1300, The Imaging Source, Brema, Germania). L'acquisizione e l'elaborazione rapida delle immagini consentono di determinare la posizione del fascio di guida a 785 nm, che viene approssimato alla posizione dell'eccitazione e della raccolta della fluorescenza, in tempo reale. Per evitare la contaminazione del segnale di fluorescenza con la luce a 785 nm, è stato aggiunto al cammino ottico di emissione un filtro ottico passa‐basso da 700 nm (ET700SP, Chroma Technologies, Bellows Falls, VT, USA). To generate autofluorescence mean life and intensity maps from single point measurements, the same excitation beam and guide beam as in Example 1 are used. In short, fluorescence measurements are made by freely moving the fiber probe optics 4 on sample 3. A second light source - a 785 nm continuous wave (CW) laser diode 6 (FC ‐ 785‐350 ‐ MM2 ‐ PC ‐ 0 ‐ RM, RGBLase, Fremont, CA, USA) - is used simultaneously with the excitation light at 375 nm to provide a visible reference to the measurements, which can be recorded using a color camera (DFK 33UP1300, The Imaging Source, Bremen, Germany). Rapid image acquisition and processing enables the position of the 785 nm guide beam to be determined, which is approximated to the position of excitation and fluorescence collection, in real time. To avoid contamination of the fluorescence signal with 785 nm light, a 700 nm low pass optical filter (ET700SP, Chroma Technologies, Bellows Falls, VT, USA) was added to the emission path.

L'illuminazione del campo di vista (FOV) è stata fornita da un diodo a luce bianca 9 (LED, MNWHL4, Thorlabs), modulato da un'onda quadra a 50 Hz e con un ciclo di lavoro del 10%, ovvero 2 ms acceso su un ciclo da 20 ms come nell'esempio 1. Infine, attivando la telecamera a colori 5 contemporaneamente al LED 9 si otterranno immagini a colori ben illuminate a 50 Hz (con tempo di esposizione di ~2 ms), che possono essere utilizzate per determinare la porzione del campione misurata in tempo reale, come descritto precedentemente. Dato che le acquisizioni della telecamera e della fluorescenza sono sincronizzate, ciascuna misura della fluorescenza è associata a una posizione della sonda a fibra ottica. Di conseguenza, la vita media della fluorescenza e le mappe spettrali possono essere generate e rappresentate come realtà aumentata sull'immagine in luce bianca per fornire un riscontro visivo delle misure in tempo reale. Uno dei punti salienti di questo metodo è che le bande spettrali possono essere selezionate e variate al volo durante l'elaborazione, in modo da fornire un riscontro in tempo reale per una specifica regione dello spettro e, se necessario, modificare la corrispondente banda spettrale. Field of view (FOV) illumination was provided by a 9 white light diode (LED, MNWHL4, Thorlabs), modulated by a square wave at 50 Hz and with a duty cycle of 10%, i.e. 2 ms lit on a 20 ms cycle as in example 1. Finally, activating color camera 5 at the same time as LED 9 will result in well-lit color images at 50 Hz (with exposure time of ~ 2 ms), which can be used to determine the portion of the sample measured in real time, as described above. Since the camera and fluorescence acquisitions are synchronized, each fluorescence measurement is associated with a location of the fiber optic probe. As a result, fluorescence lifetime and spectral maps can be generated and represented as augmented reality on the white light image to provide visual feedback of real-time measurements. One of the highlights of this method is that the spectral bands can be selected and varied on the fly during processing, in order to provide real-time feedback for a specific region of the spectrum and, if necessary, modify the corresponding spectral band.

Il rivelatore 7 usato in questa seconda implementazione è una matrice di SPAD 32 × 64 (4,8 × 9,6 mm), realizzata utilizzando la tecnologia semiconduttore ‐ ossido di metallo complementare (CMOS) da 0,35 um. L'istogramma dei tempi di arrivo dei fotoni viene generato indipendentemente in ciascun pixel mediante il “time‐gating”, ad una frequenza di ripetizione fissata a 50 MHz, che è stata utilizzata per la sincronizzazione con il laser di eccitazione. Poiché il tempo di integrazione in questa applicazione è limitato, al fine di migliorare l'efficienza della raccolta di fotoni mantenendo un ragionevole campionamento dei decadimenti di intensità della fluorescenza, la strategia utilizzata consiste nell'impiegare intervalli temporali di rivelazione relativamente lunghi (4 ns) e 40 punti di campionamento. La finestra di acquisizione è stata regolata su 16 ns. Tutte le misure presentate sono state realizzate con queste impostazioni temporali. Detector 7 used in this second implementation is a 32 × 64 (4.8 × 9.6 mm) SPAD array, made using 0.35 µm complementary metal oxide (CMOS) semiconductor technology. The photon arrival times histogram is generated independently in each pixel by time-gating, at a repetition frequency set at 50 MHz, which was used for synchronization with the excitation laser. Since the integration time in this application is limited, in order to improve the photon collection efficiency while maintaining reasonable sampling of the fluorescence intensity decays, the strategy used is to employ relatively long detection time intervals (4 ns) and 40 sampling points. The acquisition window was adjusted to 16 ns. All the measurements presented were made with these time settings.

I fluorofori di riferimento utilizzati sono i seguenti. The reference fluorophores used are the following.

Soluzioni di flavina adenina dinucleotide (Flavin Adenine Dinucleotide, FAD, F6625, Sigma‐Aldrich, Saint Louis, MO, USA) e 1,4‐bis (5‐fenilossazol‐2‐il) benzene (POPOP, P3754, Sigma‐Aldrich) sono state preparate sciogliendo i fluorofori in polvere in 50 ml di acqua purificata ed etanolo, rispettivamente, per ottenere concentrazioni di 50 μM. Due diverse miscele sono state ottenute a partire da soluzioni stock con le proporzioni approssimative 1:2 e 2:1 ([FAD]: [POPOP]). Solutions of flavin adenine dinucleotide (Flavin Adenine Dinucleotide, FAD, F6625, Sigma ‐ Aldrich, Saint Louis, MO, USA) and 1,4 ‐ bis (5 ‐ phenyloxazol ‐ 2 ‐ yl) benzene (POPOP, P3754, Sigma ‐ Aldrich) were prepared by dissolving powdered fluorophores in 50 ml of purified water and ethanol, respectively, to obtain concentrations of 50 μM. Two different mixtures were obtained starting from stock solutions with the approximate proportions 1: 2 and 2: 1 ([FAD]: [POPOP]).

Le caratteristiche di decadimento della fluorescenza per ogni serie di pixel segmentati sono state analizzate in tempo reale utilizzando il metodo dei fasori, come nell'esempio 1, utilizzando le equazioni 2) e 3). I dati relativi alla vita media dell'autofluorescenza presentati sono riferiti alle misurazioni di fase τfase. The fluorescence decay characteristics for each series of segmented pixels were analyzed in real time using the phasor method, as in example 1, using equations 2) and 3). The data relating to the average life of the autofluorescence presented refer to the phase τphase measurements.

I campioni di cartilagine articolare suina sono stati preparati come descritto precedentemente nell'esempio 1. In breve, i campioni di cartilagine articolare (dimensioni 3 × 3 × 3 cm) sono stati ottenuti dalle articolazioni metacarpo‐falangee di suini appena macellati e conservati in PBS con sodio azide allo 0,05% per 24 ore per prevenire la proliferazione batterica. La digestione articolare della cartilagine è stata indotta mediante l’applicazione di carta da filtro imbevuta di collagenasi batterica da 250 μM sulla superficie articolare. Il trattamento è stato applicato per 5 ore a 37°C. Le misure di vita media della fluorescenza sono state realizzate prima e dopo il trattamento sull'intera superficie della cartilagine per dimostrare la variazione spaziale del segnale di fluorescenza. I campioni sono stati accuratamente lavati in tampone fosfato salino (PBS) e conservati a ‐20 °C per 24 ore prima delle misure. Sono stati preparati e misurati un totale di n = 2 campioni. I risultati presentati di seguito sono relativi a un solo campione. Risultati coerenti con quelli mostrati sono stati ottenuti per il secondo campione. The porcine articular cartilage samples were prepared as described previously in Example 1. Briefly, the articular cartilage samples (3 × 3 × 3 cm dimensions) were obtained from the metacarpophalangeal joints of freshly slaughtered pigs and stored in PBS with 0.05% sodium azide for 24 hours to prevent bacterial growth. Articular digestion of the cartilage was induced by applying filter paper soaked in 250 μM bacterial collagenase on the joint surface. The treatment was applied for 5 hours at 37 ° C. Fluorescence lifetime measurements were made before and after treatment on the entire cartilage surface to demonstrate the spatial variation of the fluorescence signal. Samples were carefully washed in phosphate buffered saline (PBS) and stored at -20 ° C for 24 hours prior to measurements. A total of n = 2 samples were prepared and measured. The results presented below are for one sample only. Results consistent with those shown were obtained for the second sample.

Le misurazioni spettrali e di vita media della fluorescenza dei fluorofori di riferimento sono descritte di seguito. The spectral and lifetime measurements of the fluorescence of the reference fluorophores are described below.

La risoluzione spettrale della misura di vita media della fluorescenza può essere regolata in base ai requisiti di ciascuna applicazione. Per verificare l'impatto della risoluzione spettrale sul segnale di fluorescenza vengono misurate la vita media della fluorescenza e le caratteristiche spettrali di FAD e POPOP puri e delle loro due miscele (si veda la Figura 9a‐9d). Per le soluzioni pure di POPOP (si veda la Figura 9 (a, b) linea tratteggiata) e FAD (si veda la Figura 9 (a, b) linea continua), abbiamo misurato l'emissione massima di fluorescenza a ~425 nm e 530 nm, rispettivamente, in buon accordo con gli studi precedenti. Per le due miscele, gli spettri di fluorescenza mostrano tracce di entrambi i fluorofori in proporzioni diverse: quando il FAD è predominante (+ curva FAD), abbiamo misurato l'emissione massima a ~ 530 nm e una spalla a 410-430 nm, coerente con il picco di emissione di POPOP; quando POPOP è il fluoroforo predominante (curva + POPOP), l'emissione massima si verifica a 420 nm ed è accompagnata da una spalla a 510‐520 nm, che è indicativa della fluorescenza di FAD. The spectral resolution of the fluorescence lifetime measurement can be adjusted according to the requirements of each application. To verify the impact of the spectral resolution on the fluorescence signal, the fluorescence lifetime and the spectral characteristics of pure FAD and POPOP and their two mixtures are measured (see Figure 9a-9d). For the pure solutions of POPOP (see Figure 9 (a, b) dashed line) and FAD (see Figure 9 (a, b) solid line), we measured the maximum fluorescence emission at ~ 425 nm and 530 nm, respectively, in good agreement with previous studies. For the two mixtures, the fluorescence spectra show traces of both fluorophores in different proportions: when the FAD is predominant (+ FAD curve), we measured the maximum emission at ~ 530 nm and a shoulder at 410-430 nm, consistent with the peak of POPOP emissions; when POPOP is the predominant fluorophore (curve + POPOP), the maximum emission occurs at 420 nm and is accompanied by a shoulder at 510-520 nm, which is indicative of FAD fluorescence.

I dati di vita media della fluorescenza per ciascuna soluzione sono presentati nella Figura 9c, in cui ogni colonna rappresenta una soluzione diversa, con misurazioni di FAD puro e POPOP puro presentate rispettivamente sulle colonne di estrema sinistra e di estrema destra, e le due miscele al centro. Per dimostrare come la risoluzione spettrale influenzi il segnale di fluorescenza, i dati sono stati spettralmente binned in post‐elaborazione per regolare la risoluzione spettrale delle misure, dal valore massimo (Figura 9c riga inferiore, 64 canali spettrali, corrispondenti a 1 colonna di pixel per canale) a quello minimo (Figura 9c riga superiore, 1 canale spettrale, corrispondente a 64 colonne di pixel sommate in un singolo canale). Ogni punto nella nuvola di fasori rappresenta un decadimento di fluorescenza lungo lo spettro, cioè per una banda spettrale ben definita. Di conseguenza, maggiore è la risoluzione spettrale, maggiore è il numero di fasori in ciascun grafico. Per le colonne FAD e POPOP pure (all’estrema sinistra e all'estrema destra, rispettivamente), si ottengono nuvole di fasori compatte indipendentemente dalla risoluzione spettrale. Questo indica che le durate della fluorescenza di FAD e POPOP sono indipendenti dalla lunghezza d'onda. A sua volta, per le soluzioni miscela dei due fluorofori, la specificità della fluorescenza aumenta con la risoluzione spettrale. Questo è più evidente quando POPOP è il fluoroforo dominante (si veda Figura 9c, terza colonna). Specificatamente, quando i dati vengono uniti in un singolo canale (Figura 9c, pannello 3), il decadimento della fluorescenza corrispondente sarà una media ponderata dei decadimenti della fluorescenza nei diversi intervalli spettrali. Poiché POPOP è predominante rispetto a FAD (si veda Figura 9b), il fasore corrispondente sarà più vicino al fasore POPOP puro. Se i dati sono binned in quattro canali spettrali di uguale ampiezza (Figura 9c, pannello 7), la specificità della misura aumenta e due gruppi di fasori sono ora evidenti nella mappa dei fasori, corrispondenti ai segnali di fluorescenza risolti spettralmente FAD e POPOP. Un terzo gruppo è visibile lungo la linea che collega le popolazioni pure, che rappresenta i decadimenti della fluorescenza all'interno della regione spettrale in cui sono presenti entrambi i contributi POPOP e FAD, cioè da ~ 450 nm a 500 nm. All'aumentare della risoluzione spettrale (si veda Figura 9c, pannelli 11, 15 e 19), aumenta anche il numero di gruppi di fasori lungo la linea che collega le popolazioni pure e la loro distribuzione varia a seconda del contributo di ciascun fluoroforo in ciascuna banda spettrale: decadimenti della fluorescenza da bande con lunghezze d'onda più corte si spostano verso POPOP puro (a destra); a loro volta, i decadimenti della fluorescenza da bande di lunghezze d'onda più lunghe sono più vicini a FAD puro (a sinistra). Per la massima risoluzione spettrale, cioè 64 canali spettrali, i decadimenti di fluorescenza in ciascun canale hanno un contributo leggermente diverso da ciascun fluoroforo, con conseguenti durate di fluorescenza leggermente differenti. Di conseguenza, i corrispondenti fasori occupano l'intera regione compresa tra le popolazioni di fasori corrispondenti a FAD e POPOP puri, passando dal POPOP puro verso il FAD puro con l'aumentare della lunghezza d'onda (Figura 9c, riquadro 23). The fluorescence lifetime data for each solution are presented in Figure 9c, where each column represents a different solution, with pure FAD and pure POPOP measurements presented on the far left and far right columns, respectively, and the two mixtures at center. To demonstrate how the spectral resolution affects the fluorescence signal, the data were spectrally binned in post-processing to adjust the spectral resolution of the measurements, from the maximum value (Figure 9c bottom row, 64 spectral channels, corresponding to 1 column of pixels per channel) to the minimum (Figure 9c top row, 1 spectral channel, corresponding to 64 columns of pixels added together in a single channel). Each point in the phasor cloud represents a fluorescence decay along the spectrum, i.e. for a well-defined spectral band. Consequently, the higher the spectral resolution, the greater the number of phasors in each graph. For pure FAD and POPOP columns (at the extreme left and at the extreme right, respectively), compact phasor clouds are obtained regardless of the spectral resolution. This indicates that the fluorescence durations of FAD and POPOP are independent of the wavelength. In turn, for the mixture solutions of the two fluorophores, the specificity of the fluorescence increases with the spectral resolution. This is most evident when POPOP is the dominant fluorophore (see Figure 9c, third column). Specifically, when data is merged into a single channel (Figure 9c, panel 3), the corresponding fluorescence decay will be a weighted average of the fluorescence decays in the different spectral ranges. Since POPOP is predominant over FAD (see Figure 9b), the corresponding phasor will be closer to the pure POPOP phasor. If the data is binned into four spectral channels of equal amplitude (Figure 9c, panel 7), the specificity of the measurement increases and two sets of phasors are now evident in the phasor map, corresponding to the spectrally resolved fluorescence signals FAD and POPOP. A third group is visible along the line connecting the pure populations, representing the fluorescence decays within the spectral region in which both POPOP and FAD contributions are present, i.e. from ~ 450 nm to 500 nm. As the spectral resolution increases (see Figure 9c, panels 11, 15 and 19), the number of phasor groups along the line connecting the pure populations also increases and their distribution varies according to the contribution of each fluorophore in each. spectral band: fluorescence decays from bands with shorter wavelengths move towards pure POPOP (right); in turn, the fluorescence decays from longer wavelength bands are closer to pure FAD (left). For the highest spectral resolution, i.e. 64 spectral channels, the fluorescence decays in each channel have a slightly different contribution from each fluorophore, resulting in slightly different fluorescence durations. Consequently, the corresponding phasors occupy the entire region between the populations of phasors corresponding to pure FAD and POPOP, moving from pure POPOP to pure FAD with increasing wavelength (Figure 9c, box 23).

Per dimostrare l'implementazione in un tessuto biologico clinicamente rilevante, è stata misurata la vita media dell'autofluorescenza e le caratteristiche spettrali sul campione di cartilagine articolare porcina. Le To demonstrate implementation in clinically relevant biological tissue, autofluorescence lifetime and spectral characteristics were measured on the porcine joint cartilage sample. The

misure sono state realizzate prima e dopo il trattamento della superficie articolare con collagenasi batterica, per indurre il contrasto endogeno derivato dalla digestione localizzata del collagene e la conseguente alterazione delle sue caratteristiche di fluorescenza. Il tempo di integrazione per ogni acquisizione di autofluorescenza è stato impostato su ~11 ms. Con questa ampiezza della finestra temporale, è presente un contributo trascurabile proveniente dalla luce di fondo del LED. Per tempi di integrazione più lunghi, vi è un aumento significativo del contributo della luce LED nella misura dell'autofluorescenza, che risulta da ritardi nell'acquisizione e nell'elaborazione dei dati, i quali fanno sì che l'acquisizione della fluorescenza si sovrapponga al ciclo di accensione del LED. Ciò è dovuto essenzialmente al fatto che l'acquisizione della fluorescenza è attivata dal software e quindi più suscettibile a ritardi ed errori di temporizzazione. Per questo motivo, mentre la fluorescenza e le acquisizioni di immagini sono attivate a 50 Hz, alcuni cicli di acquisizione vengono saltati e la velocità di acquisizione reale può variare tra 25 e 50 Hz a seconda dell'utilizzo del processore del computer e del consumo di memoria. Tuttavia, una velocità di acquisizione di 25 Hz è ancora sufficiente per fornire un riscontro delle misure in tempo reale. measurements were made before and after the treatment of the joint surface with bacterial collagenase, to induce the endogenous contrast derived from the localized digestion of the collagen and the consequent alteration of its fluorescence characteristics. The integration time for each autofluorescence acquisition was set to ~ 11 ms. With this time window width, there is a negligible contribution from the LED background light. For longer integration times, there is a significant increase in the contribution of LED light to the autofluorescence measurement, resulting from delays in data acquisition and processing, which cause the fluorescence acquisition to overlap the power cycle of the LED. This is essentially due to the fact that the fluorescence acquisition is activated by the software and therefore more susceptible to delays and timing errors. For this reason, while fluorescence and image acquisitions are turned on at 50Hz, some acquisition cycles are skipped and the actual acquisition rate may vary between 25 and 50Hz depending on the computer processor usage and power consumption. memory. However, an acquisition rate of 25 Hz is still sufficient to provide real-time measurement feedback.

La vita media dell'autofluorescenza della cartilagine articolare suina pre‐ e post‐trattamento con collagenasi batterica è presentata nella Figura 10a‐10f per l'intero intervallo spettrale (pannelli b, g) e per bande spettrali distinte: canale 1, 400 ‐ 450 nm (pannelli c, h); canale 2, 450 ‐ 515 nm (d, i); canale 3, 515 ‐ 580 nm (e, j). Le mappe di intensità dell’autofluorescenza normalizzata della cartilagine articolare suina pre‐ e post‐trattamento sono presentate nella Figura 11a‐11c: mappe normalizzate di intensità della fluorescenza pre‐trattamento (riga superiore) e post‐trattamento (fila inferiore) con collagenasi batterica. (a, d) Canale 1 (400 ‐ 450 nm); (b, e) canale 2 (450 ‐ 515 nm); (c, f) canale 3 (515 ‐ 580 nm). Le bande spettrali di lunghezze d'onda sono state generate in post‐elaborazione dividendo spettralmente le 15 colonne di pixel. The mean life of autofluorescence of porcine articular cartilage pre- and post-treatment with bacterial collagenase is presented in Figure 10a-10f for the entire spectral range (panels b, g) and for distinct spectral bands: channel 1, 400 - 450 nm (panels c, h); channel 2, 450-515 nm (d, i); channel 3, 515 - 580 nm (e, j). Normalized autofluorescence intensity maps of pre- and post-treatment porcine articular cartilage are presented in Figure 11a-11c: Pre-treatment (upper row) and post-treatment (lower row) normalized fluorescence intensity maps with bacterial collagenase . (a, d) Channel 1 (400 - 450 nm); (b, e) channel 2 (450-515 nm); (c, f) channel 3 (515 - 580 nm). The spectral wavelength bands were generated in post-processing by spectrally dividing the 15 columns of pixels.

Le Figure 11a‐c mostrano i dati di fluorescenza nello stato stazionario piuttosto che la vita media e mostrano ulteriori informazioni spettroscopiche ottenute dallo stesso metodo della Figura 10. Figures 11a-c show steady-state fluorescence data rather than lifetime and show additional spectroscopic information obtained by the same method as in Figure 10.

Durante l'acquisizione, è stato fornito un riscontro in tempo reale delle misure per l'intero intervallo spettrale. Prima del trattamento (si veda Figura 10 (a‐e)), è stata osservata una piccola variazione della vita media dell’autofluorescenza sulla superficie articolare (vedere Figura 12 (c‐f)), probabilmente derivante da regioni sottoposte ad un diverso carico meccanico. Nella regione in cui è stato applicato il trattamento (si veda Figura 10a, regione quadrata, n = 1088 pixel), è stata misurata una vita media dell'autofluorescenza pre‐trattamento di 3,44 ± 0,03 ns, 3,20 ± 0,04 ns e 2,89 ± 0,05 ns nelle bande di lunghezze d'onda corrispondenti ai canali 1, 2 e 3, rispettivamente, che indicano una leggera dipendenza della vita media dell'autofluorescenza dalla lunghezza d'onda di emissione. Unendo i dati in una singola banda spettrale (Figura 10b e Figura 12c), si ottiene un valore medio di 3,20 ± 0,05 ns. During the acquisition, real-time feedback of the measurements for the entire spectral range was provided. Before treatment (see Figure 10 (a-e)), a small change in the mean life of autofluorescence on the joint surface was observed (see Figure 12 (c-f)), possibly resulting from regions subjected to different loading mechanic. In the region where the treatment was applied (see Figure 10a, square region, n = 1088 pixels), a mean pretreatment autofluorescence life of 3.44 ± 0.03 ns, 3.20 ± 0.04 ns and 2.89 ± 0.05 ns in the wavelength bands corresponding to channels 1, 2 and 3, respectively, indicating a slight dependence of the mean life of the autofluorescence on the emission wavelength. By merging the data into a single spectral band (Figure 10b and Figure 12c), an average value of 3.20 ± 0.05 ns is obtained.

Il trattamento con collagenasi batterica ha provocato una visibile digestione della superficie della cartilagine articolare (si veda Figura 10f, regione quadrata), che a sua volta ha prodotto una notevole diminuzione della vita media dell'autofluorescenza in questa regione rispetto alla cartilagine non digerita. Mentre una diminuzione della vita media dell'autofluorescenza è visibile in tutte le bande spettrali, questo è più evidente nel canale 2 (si veda Figura 10h), che è coincidente con il picco di emissione fluorescente del collagene (si veda Figura 12 (a, b)). Una leggera diminuzione della vita media dell’autofluorescenza è stata misurata anche nella regione non digerita, sebbene non sia così evidente come nella regione di digestione del collagene. Nella regione della digestione (n = 1740 pixel), sono state misurate vite medie dell'autofluorescenza di 2,82 ± 0,06 ns, 2,51 ± 0,07 ns e 2,36 ± 0,07 per i canali 1, 2 e 3, rispettivamente. Per l'intero intervallo spettrale, è stata misurata una vita media di 2,42 ± 0,05 ns. Treatment with bacterial collagenase resulted in visible digestion of the surface of the articular cartilage (see Figure 10f, square region), which in turn produced a noticeable decrease in the mean life of autofluorescence in this region compared to undigested cartilage. While a decrease in the mean life of autofluorescence is visible in all spectral bands, this is most evident in channel 2 (see Figure 10h), which coincides with the fluorescent emission peak of collagen (see Figure 12 (a, b)). A slight decrease in the average life of autofluorescence was also measured in the undigested region, although it is not as evident as in the collagen digestion region. In the digestion region (n = 1740 pixels), mean autofluorescence lives of 2.82 ± 0.06ns, 2.51 ± 0.07ns, and 2.36 ± 0.07 were measured for channel 1, 2 and 3, respectively. For the entire spectral range, a mean life of 2.42 ± 0.05 ns was measured.

Per quanto riguarda l'intensità dell'autofluorescenza (Figura 12), i dati suggeriscono uno spostamento verso il rosso nello spettro dell'autofluorescenza della regione digerita rispetto alla cartilagine non digerita. In generale, dopo il trattamento viene misurato un segnale di autofluorescenza assoluto inferiore, che genera mappe e spettri di autofluorescenza più rumorosi. Regarding the intensity of the autofluorescence (Figure 12), the data suggest a red shift in the autofluorescence spectrum of the digested region relative to the undigested cartilage. In general, a lower absolute autofluorescence signal is measured after treatment, resulting in louder autofluorescence maps and spectra.

Claims

Rivendicazioni 1. Metodo per la spettroscopia elettromagnetica di un campione (3), il metodo comprendente ‐ Inviare un fascio di eccitazione (2) di radiazione elettromagnetica su una prima porzione di un campione (3) per ottenere emissione, diffusione di fotoni, detti fotoni aventi una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile, da molecole che formano il campione; ‐ Illuminare la prima porzione del campione con una luce visibile (9), accendendo e spegnendo la luce visibile ad una prima frequenza, in modo da definire gli intervalli di tempo illuminati e gli intervalli di tempo non illuminati del campione; ‐ Rivelare i fotoni emessi o diffusi aventi una lunghezza d'onda nell'intervallo visibile durante detti intervalli di tempo non illuminati; e ‐ Ottenere informazioni spettroscopiche da detti fotoni emessi o diffusi e rivelati. Claims 1. Method for electromagnetic spectroscopy of a sample (3), the method comprising - Sending an excitation beam (2) of electromagnetic radiation on a first portion of a sample (3) to obtain emission, diffusion of photons, called photons having a wavelength in the visible range, from molecules that form the sample; - Illuminate the first portion of the sample with a visible light (9), turning the visible light on and off at a first frequency, in order to define the illuminated time intervals and the unlit time intervals of the sample; - detecting emitted or scattered photons having a wavelength in the visible range during said unlit time intervals; And - Obtain spectroscopic information from said photons emitted or scattered and detected.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta prima frequenza è uguale o superiore a 40 Hz. Method according to claim 1, wherein said first frequency is equal to or greater than 40 Hz.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente la fase di: ‐ utilizzare una telecamera (5); ‐ inviare un fascio di guida (6) di radiazione elettromagnetica rivelabile da detta telecamera su una seconda porzione di un campione, correlata alla prima porzione, per rilevare la posizione del fascio di guida; ‐ acquisire un'immagine del campione usando la telecamera (5). Method according to claim 1 or 2, comprising the step of: - use a video camera (5); - sending a guiding beam (6) of electromagnetic radiation detectable by said camera on a second portion of a sample, correlated to the first portion, to detect the position of the guiding beam; - acquire an image of the sample using the camera (5).

4. Metodo secondo la rivendicazione 3, comprendente: ‐ spostare il fascio di eccitazione (2) all'interno del campione (3) in modo tale che il fascio di eccitazione venga inviato su una prima porzione diversa del campione; ‐ spostare corrispondentemente il fascio di guida. The method according to claim 3, comprising: - moving the excitation beam (2) inside the sample (3) so that the excitation beam is sent to a different first portion of the sample; - move the guide beam accordingly.

5. Metodo secondo la rivendicazione 3 o la rivendicazione 4, in cui la prima e la seconda porzione si sovrappongono sostanzialmente. Method according to claim 3 or claim 4, wherein the first and second portions substantially overlap.

6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti quando dipende dalla rivendicazione 3, includente la fase di: ‐ acquisire un'immagine del campione solo durante detti intervalli di tempo illuminati. Method according to any one of the preceding claims when it depends on claim 3, including the step of: - acquire an image of the sample only during said illuminated time intervals.

7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase di ottenere informazioni spettroscopiche da detti fotoni emessi, diffusi e rivelati include: ‐ ottenere informazioni sulla spettroscopia di fluorescenza da detti fotoni emessi e rivelati. Method according to any one of the preceding claims, wherein the step of obtaining spectroscopic information from said emitted, scattered and detected photons includes: - obtain information on the fluorescence spectroscopy from said photons emitted and detected.

8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui dette informazione spettroscopiche includono informazioni sul decadimento di intensità della fluorescenza. The method according to claim 7, wherein said spectroscopic information includes information on the fluorescence intensity decay.

9. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, includente la fase di: ‐ generare un'immagine di detto campione (3); e ‐ visualizzare detta immagine e dette informazioni spettroscopiche su uno schermo (21). Method according to one of the preceding claims, including the step of: - generating an image of said sample (3); And - displaying said image and said spectroscopic information on a screen (21).

10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto campione è una parte di un organismo biologico. Method according to any one of the preceding claims, wherein said sample is a part of a biological organism.

11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti quando dipendente dalla rivendicazione 3, includente: ‐ identificare la posizione di detta prima porzione nel campione identificando la posizione della seconda porzione identificata dal fascio di guida. Method according to any one of the preceding claims when dependent on claim 3, including: - identifying the position of said first portion in the sample by identifying the position of the second portion identified by the guide beam.

12. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il passo di ottenere informazioni spettroscopiche da detti fotoni emessi e rivelati include: ‐ ottenere le informazioni spettroscopiche utilizzando il metodo del conteggio di singolo fotone correlato nel tempo o una fase di "time gating". Method according to any one of the preceding claims, wherein the step of obtaining spectroscopic information from said emitted and detected photons includes: - obtain the spectroscopic information using the time correlated single photon counting method or a "time gating" phase.

13. Sistema (1) per ottenere informazioni sulla spettroscopia elettromagnetica di un campione (3), il sistema comprendente: ‐ una sorgente di fascio di eccitazione (2) per emettere un fascio di radiazione elettromagnetica verso una prima porzione di un campione (3), detta sorgente di fascio di eccitazione emettendo un fascio tra 300 nm e 700 nm; ‐ una sorgente di luce visibile (9) atta ad illuminare il campione; ‐ un elemento di commutazione (12, 13) della sorgente di luce visibile (9) atto ad accendere e spegnere la sorgente di luce visibile ad una prima frequenza, in modo da definire intervalli di tempo illuminati e intervalli di tempo non illuminati del campione; ‐ un rivelatore di fotoni (7) per rivelare i fotoni emessi, diffusi, riflessi dal campione a causa del fascio di eccitazione, detto rivelatore di fotoni (7) avente una finestra di lunghezza d'onda di rivelazione nell'intervallo visibile, e generare un segnale corrispondente; ‐ un'unità di controllo (21) per attivare detto rivelatore di fotoni per rivelare fotoni emessi o diffusi dal campione solo durante detti intervalli di tempo non illuminati o per attivare un otturatore per impedire che i fotoni emessi o diffusi raggiungano il rivelatore durante detti intervalli di tempo illuminati, e ottenere informazioni spettroscopiche in funzione del segnale dei fotoni rivelati. 13. System (1) for obtaining information on the electromagnetic spectroscopy of a sample (3), the system comprising: - an excitation beam source (2) for emitting an electromagnetic radiation beam towards a first portion of a sample (3), said excitation beam source emitting a beam between 300 nm and 700 nm; - a visible light source (9) suitable for illuminating the sample; - a switching element (12, 13) of the visible light source (9) adapted to turn the visible light source on and off at a first frequency, so as to define illuminated time intervals and unlit time intervals of the sample; - a photon detector (7) for detecting the emitted, scattered photons reflected by the sample due to the excitation beam, said photon detector (7) having a detection wavelength window in the visible range, and generating a corresponding signal; - a control unit (21) for activating said photon detector to detect photons emitted or scattered by the sample only during said unlit time intervals or to activate a shutter to prevent emitted or scattered photons from reaching the detector during said intervals of time illuminated, and obtain spectroscopic information as a function of the detected photon signal.

14. Sistema secondo la rivendicazione 13, in cui detto rivelatore di fotoni è un rilevatore per conteggio di singolo fotone. 14. A system according to claim 13, wherein said photon detector is a single photon counting detector.

15. Sistema secondo la rivendicazione 13 o 14 comprendente: ‐ una telecamera (5); ‐ una sorgente di fascio di guida (6) di radiazione elettromagnetica avente una lunghezza d'onda rivelabile da detta telecamera, detto fascio di guida di radiazione elettromagnetica atto a essere inviato su una seconda porzione di un campione, correlata alla prima porzione, per rilevare la posizione del fascio di guida; ‐ un'unità di controllo della telecamera (13) per controllare la telecamera e per acquisire un'immagine del campione utilizzando la telecamera. System according to claim 13 or 14 comprising: - a video camera (5); - a source of guide beam (6) of electromagnetic radiation having a wavelength detectable by said camera, said guide beam of electromagnetic radiation adapted to be sent on a second portion of a sample, related to the first portion, to detect the position of the guide beam; - a camera control unit (13) for controlling the camera and for acquiring a sample image using the camera.