IT201900006994A1

IT201900006994A1 - Bacterial strains for industrial use

Info

Publication number: IT201900006994A1
Application number: IT102019000006994A
Authority: IT
Inventors: Elisa Demattè; Elisa Sartori; Olivier Jousson
Original assignee: Biodermol Ambiente S R L
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2020-11-20
Also published as: WO2020234760A1

Description

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo Attached to a patent application for INDUSTRIAL INVENTION having the title

“Ceppi batterici per uso industriale” "Bacterial strains for industrial use"

La presente invenzione ha per oggetto ceppi batterici selezionati e surnatanti ottenuti dagli stessi per l’uso nel processo di concia delle pelli. The present invention relates to selected bacterial strains and supernatants obtained from them for use in the leather tanning process.

STATO DELL’ARTE STATE OF THE ART

Il processo conciario, pur rimanendo fortemente legato alla lavorazione artigianale, ha da anni assunto caratteristiche industriali: solo in Italia nell’anno 2016 sono state prodotte 12 mila tonnellate di pelli finite. Per la realizzazione dell’intero processo sono necessarie ingenti quantità di acqua, energia e reagenti chimici, con notevole impatto ambientale dovuto alla produzione di rifiuti solidi, emissioni in atmosfera e scarti idrici. The tanning process, while remaining strongly linked to craftsmanship, has for years taken on industrial characteristics: in Italy alone in the year 2016 12,000 tons of finished leathers were produced. To complete the entire process, large quantities of water, energy and chemical reagents are required, with a significant environmental impact due to the production of solid waste, emissions into the atmosphere and water waste.

Il ciclo produttivo è costituto essenzialmente da una prima fase, detta fase di riviera, dove le pelli vengono preparare alla ricezione degli agenti concianti aggiunti nelle fasi successive di concia e riconcia. Durante la fase di riviera vengono applicati alla pelle trattamenti chimici con diversi scopi: reidratare le pelli grezze (rinverdimento), rimuovere il pelo (depilazione) e rigonfiare le fibre della pelle (calcinaio). In particolare, la fase di depilazione prevede l’utilizzo, oltre agli agenti depilanti stessi, tipicamente agenti riducenti quali solfuri/solfidrati, altamente tossici e inquinanti, di ingenti quantitativi di acqua che una volta utilizzati devono essere appositamente depurati per abbattere i valori di inquinamento quali chemical oxygen demand (COD), biochemical oxygen demand (BOD), total dissolved solid (TDS), solfuri e solfidrati (Layman’s report, Green LIFE project, 2017). The production cycle is essentially constituted by a first phase, called riviera phase, where the hides are prepared to receive the tanning agents added in the subsequent tanning and retanning phases. During the riviera phase, chemical treatments are applied to the skin with different purposes: rehydrating the raw skins (soaking), removing the hair (hair removal) and swelling the skin fibers (liming). In particular, the depilation phase involves the use, in addition to the depilating agents themselves, typically reducing agents such as sulphides / sulphhydrates, highly toxic and polluting, of large quantities of water that once used must be purposely purified to reduce pollution values. such as chemical oxygen demand (COD), biochemical oxygen demand (BOD), total dissolved solid (TDS), sulphides and sulphhydrates (Layman's report, Green LIFE project, 2017).

La fase di depilazione assistita da enzimi è l'opzione ecologica che riduce di quasi il 40% i valori di BOD e del 50% i valori di COD nella lavorazione della pelle. The enzyme-assisted hair removal phase is the ecological option that reduces BOD values by almost 40% and COD values in leather processing by 50%.

Esempi di depilazione enzimatica sono descritti in US3,840,433, US4,636,222, WO1994/06942, US5,834,299 e WO2008/093353. WO2010/043709 descrive un metodo enzimatico di trattamento delle pelli che comprende l’uso di carboidrasi e lipasi. Examples of enzymatic hair removal are described in US3,840,433, US4,636,222, WO1994 / 06942, US5,834,299 and WO2008 / 093353. WO2010 / 043709 describes an enzymatic method of treating skins which includes the use of carbohydrates and lipases.

US9,267,182 descrive un metodo enzimatico di trattamento delle pelli che comprende l’uso di glutammina endopeptidasi. US9,267,182 describes an enzymatic method of treating skins which includes the use of glutamine endopeptidase.

Gli enzimi usati sono generalmente enzimi proteolitici che catalizzano la rottura delle proteine. Esempi di proteasi che sono stati usati sono estratti di proteasi più o meno grezzi di origine batterica o fungina contenenti diverse peptidasi, nonché proteasi più pure come elastasi, subtilisine, tripsine, chimotripsina, proteasi aspartiche, proteasi di cisteina e metalloproteasi. The enzymes used are generally proteolytic enzymes that catalyze the breakdown of proteins. Examples of proteases that have been used are more or less crude protease extracts of bacterial or fungal origin containing various peptidases, as well as purer proteases such as elastase, subtilisins, trypsins, chymotrypsin, aspartic proteases, cysteine proteases and metalloproteases.

Tuttavia, poiché la pelle e le pelli sono principalmente costituite da collagene, suscettibile alla degradazione da parte della proteasi, c'è un rischio di danni alla pelle o alle pelli con l’utilizzo di proteasi. Inoltre, le proteasi non hanno mostrato attività tale da essere in grado di rimuovere completamente i peli. However, since the skin and skins are mainly made up of collagen, which is susceptible to degradation by the protease, there is a risk of damage to the skin or skins with the use of proteases. Furthermore, the proteases did not show such activity as to be able to completely remove hair.

Per questo, sono fortemente avvertiti metodi di depilazione alternativi che siano efficaci e a basso impatto ambientale. For this, alternative hair removal methods that are effective and with low environmental impact are strongly advised.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE DESCRIPTION OF THE INVENTION

DESCRIZIONE DELLE FIGURE DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1: Test di attività enzimatica in vitro a) attività proteolitica; b) attività reduttasica; c) attività alfa-amilolitica; d) attività cheratinolitica; e) attività proteolitica f) attività collagenolitica. Figure 1: In vitro enzymatic activity test a) proteolytic activity; b) reductase activity; c) alpha-amylolytic activity; d) keratinolytic activity; e) proteolytic activity f) collagenolytic activity.

Figura 2: Heatmap dell’attività enzimatica misurata nei 10 ceppi indicati. NB= Nutrient Broth, terreno ricco in nutrienti. FMM= Feather Minimal Medium, terreno minimo in cui l’unica fonte di carbonio e azoto sono le piume. WMM = Wool Minimal Medium, terreno minimo in cui l’unica fonte di carbonio e azoto è la lana. Figure 2: Heatmap of the enzymatic activity measured in the 10 indicated strains. NB = Nutrient Broth, a soil rich in nutrients. FMM = Feather Minimal Medium, minimal soil in which the only source of carbon and nitrogen are feathers. WMM = Wool Minimal Medium, minimal soil in which the only source of carbon and nitrogen is wool.

Figura 3: fotografie rappresentative delle pelli prima e dopo i trattamenti in bottalino pilota utilizzando i surnatanti secondo la presente invenzione. Figure 3: representative photographs of the hides before and after the treatments in pilot bottal using the supernatants according to the present invention.

Forma un primo oggetto della presente invenzione un ceppo batterico selezionato tra i ceppi descritti in tabella 1. A first object of the present invention is a bacterial strain selected from the strains described in table 1.

Tabella 1 Table 1

IZLER=Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Lombardia ed Emilia Romagna, via Bianchi 9 - 25124 Brescia, Italia IZLER = Experimental Zooprophylactic Institute of Lombardy and Emilia Romagna, via Bianchi 9 - 25124 Brescia, Italy

I ceppi batterici secondo la presente invenzione, da soli o in miscela, si sono rivelati particolarmente efficaci nel trattamento di riviera delle pelli. The bacterial strains according to the present invention, alone or in mixture, have proved to be particularly effective in the riviera treatment of hides.

In un’ulteriore forma di realizzazione, detti ceppi batterici, da soli o in miscela, trovano impiego cosmetico. A titolo di esempio, in applicazioni depilatorie e/o di peeling. In a further embodiment, said bacterial strains, alone or in a mixture, find cosmetic use. For example, in depilatory and / or peeling applications.

Formano un ulteriore aspetto della presente invenzione uno o più surnatanti di detti ceppi batterici, singolarmente o in miscela. A further aspect of the present invention is one or more supernatants of said bacterial strains, singly or in mixture.

Allo scopo della presente invenzione, con il termine “surnatante” si intende il mezzo di coltura dove è cresciuto almeno un ceppo batterico. Detto mezzo di coltura è preferibilmente un mezzo di coltura liquido. Detto surnatante è tal quale, ovvero ad esempio il mezzo di coltura in cui è cresciuto almeno un ceppo batterico, previa opportuna centrifugazione, oppure trattato, ad esempio detto mezzo di coltura in cui è cresciuto almeno un ceppo batterico, previa opportuna centrifugazione, è essiccato e/o liofilizzato. In una forma preferita, detto surnatante deriva da una coltura che si è protratta per almeno 6 ore, preferibilmente per almeno 16 ore. In una forma preferita, detto surnatante è formulato con eccipienti, stabilizzanti, ad esempio è incapsulato. For the purpose of the present invention, the term "supernatant" means the culture medium where at least one bacterial strain has grown. Said culture medium is preferably a liquid culture medium. Said supernatant is as it is, or for example the culture medium in which at least one bacterial strain has grown, after appropriate centrifugation, or treated, for example said culture medium in which at least one bacterial strain has grown, after appropriate centrifugation, is dried and / or freeze-dried. In a preferred form, said supernatant derives from a culture which has lasted for at least 6 hours, preferably for at least 16 hours. In a preferred form, said supernatant is formulated with excipients, stabilizers, for example it is encapsulated.

In una ulteriore forma di realizzazione, forma oggetto della presente invenzione una formulazione che comprende un surnatante da uno dei ceppi batterici di cui in Tabella 1, o una miscela di due surnatanti da due dei ceppi batterici di cui in Tabella 1, o una miscela di almeno due surnatanti da almeno due dei ceppi batterici di cui in Tabella 1, opportunamente trattati e/o opportunamente formulati, opzionalmente con l’aggiunta di ulteriori surnatanti da ulteriori ceppi batterici e/o di ulteriori attivi. In a further embodiment, the present invention relates to a formulation which comprises a supernatant from one of the bacterial strains listed in Table 1, or a mixture of two supernatants from two of the bacterial strains listed in Table 1, or a mixture of at least two supernatants from at least two of the bacterial strains listed in Table 1, suitably treated and / or suitably formulated, optionally with the addition of further supernatants from further bacterial strains and / or additional active ingredients.

Vantaggiosamente, detti surnatanti trattati o detta formulazione possono essere conservanti per utilizzi successivi, mantenendo l’attività degli enzimi in essi contenuti. Advantageously, said treated supernatants or said formulation can be preservatives for subsequent uses, maintaining the activity of the enzymes contained therein.

Forma ulteriore oggetto della presente invenzione un metodo per la depilazione della pelle, dove detto metodo comprende: A further object of the present invention is a method for skin hair removal, where said method comprises:

1) Mettere a disposizione almeno un surnatante da almeno un ceppo batterico secondo la presente invenzione; 1) Providing at least one supernatant from at least one bacterial strain according to the present invention;

2) Esporre la pelle da trattare a detto almeno un surnatante, ad una temperatura compresa tra 18 e 40°C, ad un pH compreso tra 4,5 e 12. 2) Expose the skin to be treated to said at least one supernatant, at a temperature between 18 and 40 ° C, at a pH between 4.5 and 12.

In una forma preferita, detto metodo è per il trattamento di riviera di pelli destinate alla concia. In un’ulteriore applicazione, detto metodo è per l’uso cosmetico. In a preferred form, said method is for the beam treatment of hides intended for tanning. In a further application, this method is for cosmetic use.

Sorprendentemente, i surnatanti isolati dai ceppi batterici secondo la presente invenzione posseggono un’attività depilatoria tale da non rendere necessario il trattamento con agenti riducenti, tipicamente utilizzato in questo processo. Detti surnatanti si sono infatti dimostrati efficaci usati da soli, con il vantaggio di evitare il trattamento con agenti riducenti e l’impatto ambientale conseguente. L’assenza di agenti riducenti permette inoltre una depilazione meno aggressiva per le pelli da trattare, che risultano quindi ben conservate al termine del processo. Inoltre, la non aggressività di detti surnatante li rende sicuri anche in applicazioni di tipo cosmetico. Surprisingly, the supernatants isolated from bacterial strains according to the present invention possess such a depilatory activity as to not require treatment with reducing agents, typically used in this process. These supernatants have in fact proved effective when used alone, with the advantage of avoiding treatment with reducing agents and the consequent environmental impact. The absence of reducing agents also allows less aggressive hair removal for the skin to be treated, which are therefore well preserved at the end of the process. Furthermore, the non-aggressiveness of said supernatants makes them safe even in cosmetic applications.

Gli stessi surnatanti mantengono sorprendentemente la loro efficacia anche quando esposti ad un ambiente riducente o ad un ambiente ossidante, come dimostrano gli esempi che seguono. The supernatants themselves surprisingly maintain their efficacy even when exposed to a reducing or oxidizing environment, as the following examples demonstrate.

In una forma preferita, detta pelle viene esposta a detto surnatante ad una temperatura compresa tra 22 e 29°C, o tra 24 e 27°C ad un pH compreso tra 6 e 9. In a preferred form, said skin is exposed to said supernatant at a temperature between 22 and 29 ° C, or between 24 and 27 ° C at a pH between 6 and 9.

In una forma preferita, laddove applicato al settore conciario, detto metodo comprende altresì un passaggio di rinverdimento. In a preferred form, when applied to the tanning sector, said method also comprises a soaking step.

Detto rinverdimento è operato con le metodiche note all’esperto del settore, ad esempio esponendo detta pelle da trattare a acqua e/o imbibenti e/o tensioattivi e/o alcali quali, a titolo esemplificativo, carbonato di sodio, idrossido di sodio, e/o agenti battericidi e/o miscele enzimatiche. Said soaking is carried out with the methods known to the skilled in the art, for example by exposing said skin to be treated to water and / or wetting agents and / or surfactants and / or alkalis such as, by way of example, sodium carbonate, sodium hydroxide, and / or bactericidal agents and / or enzymatic mixtures.

In un’ulteriore forma preferita, detto metodo comprende altresì un passaggio di calcinaio. Detto calcinaio preferibilmente comprende l’esposizione di detta pelle ad un pH di circa 12 ad una temperatura compresa tra 23 e 32°C, preferibilmente tra 26 e 29°C, o tra 27 e 28°C. In a further preferred form, said method also comprises a liming step. Said liming preferably comprises the exposure of said skin to a pH of about 12 at a temperature between 23 and 32 ° C, preferably between 26 and 29 ° C, or between 27 and 28 ° C.

In una forma preferita, detto metodo comprende: In a preferred form, said method comprises:

1) Isolare il surnatante del terreno di coltura di almeno un ceppo batterico secondo la presente invenzione; 1) Isolate the supernatant of the culture medium of at least one bacterial strain according to the present invention;

2) Esporre le pelli da trattare a una soluzione a pH compreso tra 5 e 9,5 e ad una temperatura compresa tra 22 e 30°C, preferibilmente tra 24 e 28°C; 2) Exposing the hides to be treated to a solution with a pH of between 5 and 9.5 and a temperature of between 22 and 30 ° C, preferably between 24 and 28 ° C;

3) Aggiungere a detta soluzione detto surnatante e, dopo almeno 2 ore, o dopo almeno 5 ore, o 10 ore, o 12 ore, o dopo 24 ore, portare il pH a circa 12. 3) Add said supernatant to said solution and, after at least 2 hours, or after at least 5 hours, or 10 hours, or 12 hours, or after 24 hours, bring the pH to about 12.

In una forma preferita, detto pH in detta fase 2) è ottenuto con l’aggiunta di carbonato e/o, in detta fase 3), detto pH è ottenuto con l’aggiunta di calce idrata e/o soda caustica. In a preferred form, said pH in said phase 2) is obtained with the addition of carbonate and / or, in said phase 3), said pH is obtained with the addition of hydrated lime and / or caustic soda.

In una forma preferita, detto surnatante è derivato dalla crescita di almeno un ceppo batterico in un terreno minimo, ad esempio in terreno FMM o WMM. In a preferred form, said supernatant is derived from the growth of at least one bacterial strain in a minimal medium, for example in FMM or WMM medium.

Preferibilmente, in detta fase 2), detta di rinverdimento, dette pelli sono incubate in una soluzione che comprende altresì un agente emulsionante e/o un agente alcalinizzante. Preferibilmente, detto emulsionante è un emulsionante organico, a titolo di esempio è Biodermol PRODEFAT (Biodermol, IT). Preferably, in said step 2), called soaking, said hides are incubated in a solution which also comprises an emulsifying agent and / or an alkalizing agent. Preferably, said emulsifier is an organic emulsifier, by way of example it is Biodermol PRODEFAT (Biodermol, IT).

Preferibilmente, in detta fase 2), detta di rinverdimento, viene aggiunto altresì un controllore della crescita batterica e/o sali di fosforo. A titolo di esempio, Biodermol BTM OS (Biodermol, IT) e/o Biodermol TP. Preferably, in said step 2), called soaking, a bacterial growth controller and / or phosphorus salts are also added. For example, Biodermol BTM OS (Biodermol, IT) and / or Biodermol TP.

Vantaggiosamente, i ceppi batterici secondo la presente invenzione e/o i loro surnatanti, permettono l’attuazione del processo di depilazione delle pelli in maniera efficiente, senza causare danni alla pelle stessa. Advantageously, the bacterial strains according to the present invention and / or their supernatants, allow the implementation of the hair removal process of the skins efficiently, without causing damage to the skin itself.

I ceppi secondo la presente invenzione sono vantaggiosamente in grado di crescere su terreno minimo, offrendo così il vantaggio di costi di produzione contenuti. Gli autori della presente invenzione hanno altresì dimostrato che la crescita in detto terreno minimo fa sì che in detto surnatante si concentri un pannello enzimatico dotato di una migliore attività depilatoria. The strains according to the present invention are advantageously able to grow on minimal soil, thus offering the advantage of low production costs. The authors of the present invention have also shown that the growth in said minimum medium causes an enzymatic panel with a better depilatory activity to be concentrated in said supernatant.

ESEMPI EXAMPLES

Esempio 1: SCREENING PRIMARIO Example 1: PRIMARY SCREENING

Lo screening primario è stato effettuato mediante Skim Milk agar assay. Il terreno ricco Nutrient Agar è stato addizionato di una soluzione al 5% (p/v) di latte condensato. Il terreno risultante si presenta di aspetto opaco. Se il ceppo batterico presenta attività proteolitica si creerà un alone trasparente intorno alle colonie del ceppo stesso dovuto alla digestione della caseina contenuta nello Skim Milk ad opera di proteasi. L’alone di digestione viene misurato in millimetri e l’ampiezza dell’alone è direttamente proporzionale alla quantità di proteasi rilasciate dal ceppo batterico. La tabella 2 riporta i risultati osservati. Primary screening was performed using the Skim Milk agar assay. Nutrient Agar rich medium was spiked with a 5% (w / v) solution of condensed milk. The resulting soil has an opaque appearance. If the bacterial strain exhibits proteolytic activity, a transparent halo will be created around the colonies of the strain itself due to the digestion of the casein contained in the Skim Milk by proteases. The digestion halo is measured in millimeters and the amplitude of the halo is directly proportional to the amount of protease released by the bacterial strain. Table 2 reports the observed results.

Tabella 2 Table 2

Lo screening ha evidenziato 26 ceppi produttori di attività proteasica. Alcuni ceppi presentano una crescita di tipo migratorio, elemento che altera i risultati del test. I ceppi interessati dal processo di migrazione sono 3Am9, 3Bm2 e 3Bm3. The screening revealed 26 protease producing strains. Some strains exhibit migratory growth, which alters the test results. The strains affected by the migration process are 3Am9, 3Bm2 and 3Bm3.

Esempio 2: SCREENING SECONDARIO Example 2: SECONDARY SCREENING

Con l’obiettivo di selezionare il ceppo che non solo fosse dotato di buona attività proteasica ma che fosse altresì adatto ad essere impiegato in processi produttivi su larga scala, è stato condotto un ulteriore test che ha valutato la capacità dei microrganismi di crescere su terreni minimi. I terreni minimi permettono infatti, nella fase successiva di scale-up, di contenente in modo sostanziale i costi di produzione del surnatante bioattivo da impiegare come agente depilante. With the aim of selecting the strain that not only had good protease activity but was also suitable for use in large-scale production processes, a further test was conducted that assessed the ability of microorganisms to grow on minimal media. . In fact, the minimum soils allow, in the subsequent scale-up phase, to substantially contain the production costs of the bioactive supernatant to be used as a depilating agent.

In particolare, il terreno minimo utilizzato per questa fase di screening contiene: In particular, the minimum medium used for this screening phase contains:

• 0,5 g/L NaCl • 0.5 g / L NaCl

• 0,4 g/L K2HPO4 • 0.4 g / L K2HPO4

• 0,3 g/L KH2PO4 • 0.3 g / L KH2PO4

• 10 g/L substrato cheratina • 10 g / L keratin substrate

Come substrati cheratinici (unica fonte di carbonio e azoto nel terreno) sono stati impiegati piume di gallina, lana di pecora tosata e pelo di mucca derivante da processo di recupero del pelo in conceria. Lo screening è stato condotto inoculando i ceppi batterici con i terreni di coltura minimi e incubando a 27°C e 30°C overnight in agitazione a 160 rpm. As keratin substrates (the only source of carbon and nitrogen in the soil), hen feathers, shorn sheep's wool and cow hair deriving from the hair recovery process in the tannery were used. Screening was conducted by inoculating bacterial strains with minimal culture media and incubating at 27 ° C and 30 ° C overnight with agitation at 160 rpm.

In questa fase, il numero di ceppi ritenuti validi per proseguire la caratterizzazione è sceso da 26 a 10, in quanto solo 10 ceppi si sono dimostrati capaci di crescere sui terreni minimi testati. In particolare, i 10 ceppi selezionati sono: 1Dm3, 1Dm4, 1Dm8, 1Dm14, 1Dm15, 3Am2, 3Am4, T1R2, T2D2, T2D3. In this phase, the number of strains deemed valid to continue the characterization dropped from 26 to 10, as only 10 strains proved capable of growing on the minimum tested media. In particular, the 10 selected strains are: 1Dm3, 1Dm4, 1Dm8, 1Dm14, 1Dm15, 3Am2, 3Am4, T1R2, T2D2, T2D3.

Esempio 3: CARATTERIZZAZIONE GENOMICA Example 3: GENOMIC CHARACTERIZATION

I 10 ceppi che hanno superato lo screening primario e secondario sono stati preparati per una fase di caratterizzazione genomica, nella quale è stato effettuato il sequenziamento completo del genoma di detti ceppi utilizzando una piattaforma Illumina MiSeq. The 10 strains that passed the primary and secondary screening were prepared for a genomic characterization step, in which the complete genome sequencing of these strains was performed using an Illumina MiSeq platform.

Il protocollo di preparazione delle librerie di DNA dei campioni per il sequenziamento consiste di 4 fasi: The sample DNA library preparation protocol for sequencing consists of 4 steps:

1) Tagmentation, ovvero la fase di frammentazione dei filamenti di DNA in frammenti di circa 300 paia di basi; 1) Tagmentation, or the phase of fragmentation of the DNA strands into fragments of about 300 base pairs;

2) Amplificazione, ovvero una classica reazione di PCR per aumentare il numero di frammenti; 2) Amplification, that is a classic PCR reaction to increase the number of fragments;

3) Purificazione del prodotto ottenuto nella fase di amplificazione eliminando prodotti aspecifici di reazione; 3) Purification of the product obtained in the amplification step by eliminating non-specific reaction products;

4) Quantificazione della libreria ottenuta e controllo qualità della stessa. Il ricorso alla tecnologia del sequenziamento ha permesso di identificare tassonomicamente i ceppi selezionati. I risultati sono riportati nella tabella 3 che segue. 4) Quantification of the obtained library and quality control of the same. The use of sequencing technology made it possible to taxonomically identify the selected strains. The results are shown in Table 3 below.

Tabella 3 Table 3

ANI score = average nucleotide identity ANI score = average nucleotide identity

Esempio 4: CARATTERIZZAZIONE ATTIVITA’ IN VITRO E IN VIVO Al fine di caratterizzare l’attività enzimatica svolta dai surnatanti di coltura dei 10 ceppi batterici selezionati è stato realizzato un programma di esperimenti per confrontare l’attività enzimatica in vitro e l’attività depilatoria esercitata su campioni di pelle reali. Example 4: CHARACTERIZATION OF IN VITRO AND IN VIVO ACTIVITIES In order to characterize the enzymatic activity carried out by the culture supernatants of the 10 selected bacterial strains, a program of experiments was carried out to compare the enzymatic activity in vitro and the depilatory activity exerted. on real leather samples.

Le attività enzimatiche misurate sono state: The enzymatic activities measured were:

a) attività proteolitica; a) proteolytic activity;

b) attività cheratinolitica; b) keratinolytic activity;

c) attività reduttasica; c) reductase activity;

d) atttività alfa-amilolitica; d) alpha-amylolytic activity;

e) attività collagenolitica. e) collagenolytic activity.

Ogni esperimento in vitro è stato realizzato in triplicato. Each in vitro experiment was performed in triplicate.

a) ATTIVITA’ PROTEOLITICA a) PROTEOLITHIC ACTIVITY

L’attività proteolitica, ovvero la capacità di un enzima di rompere il legame peptidico, è stata misurata attraverso tre test differenti. The proteolytic activity, or the ability of an enzyme to break the peptide bond, was measured through three different tests.

a1) Test Skim Milk Agar Plate a1) Skim Milk Agar Plate Test

5 µl di surnatante centrifugato (10.000 g, 15 minuti, 4°C) e filtrato sono stati depositati su una piastra di terreno solido Nutrient Agar contenente una soluzione al 3% (p/v) di Skim Milk. Le piastre sono state incubate per 24 ore a 30°C e successivamente sono stati misurati i millimetri (mm) di alone presente. 5 µl of centrifuged (10,000 g, 15 minutes, 4 ° C) and filtered supernatant was deposited on a Nutrient Agar solid medium plate containing a 3% (w / v) solution of Skim Milk. The plates were incubated for 24 hours at 30 ° C and then the millimeters (mm) of halo present were measured.

a2) Test con Azocaseina (Sigma Aldrich) a2) Azocaseine test (Sigma Aldrich)

400 µl di azocaseina (soluzione 20 mg/ml) sono stati messi in incubazione con 400 µl di surnatante centrifugato (10.000 g, 15 minuti, 4°C) e filtrato. L’incubazione è stata realizzata overnight a 30°C in agitazione (160 rpm). Successivamente sono stati aggiunti 800 µl di acido tricloroacetico (TCA) al 5% e i campioni sono stati centrifugati (10.000 g, 3 minuti, 4°C). 400 µl of azocasein (20 mg / ml solution) were incubated with 400 µl of centrifuged supernatant (10,000 g, 15 minutes, 4 ° C) and filtered. The incubation was carried out overnight at 30 ° C under agitation (160 rpm). Then 800 µl of 5% trichloroacetic acid (TCA) was added and the samples were centrifuged (10,000 g, 3 minutes, 4 ° C).

Il valore di assorbanza (400 nm) è stato letto. The absorbance value (400 nm) was read.

Per i campioni di controllo (bianchi), l’incubazione overnight è stata effettuata solo con la soluzione di azocaseina e il surnatante è stato aggiunto solo dopo il blocco della reazione effettuato con TCA. For the control samples (blank), the overnight incubation was carried out only with the azocasein solution and the supernatant was added only after the blocking of the reaction carried out with TCA.

a3) Test con caseina e reagente di Folin Ciocalteau (Sigma Aldrich) Per questo test sono stati impiegati 2 ml di surnatante centrifugato (10.000 g, 15 minuti, 4°C) e filtrato, incubati per 10 minuti a 37°C in agitazione a 160 rpm con 4 ml di soluzione di caseina (5% p/v). dopo il periodo di incubazione si aggiunge alla reazione 1 ml di TCA 5% e si prosegue con un’incubazione di 30 minuti a 37°C in agitazione a 160 rpm. Successivamente si centrifuga per 5 minuti a 10.000 g a 4°C. 2 ml del surnatante così ottenuto sono aggiunti a 5 ml di NaCO3 e a 1 ml di reagente di F-C, come da protocollo Folin Ciocalteau (1929) J. Biol. Chem. a3) Test with casein and Folin Ciocalteau's reagent (Sigma Aldrich) For this test 2 ml of supernatant centrifuged (10,000 g, 15 minutes, 4 ° C) and filtered were used, incubated for 10 minutes at 37 ° C under stirring at 160 rpm with 4 ml of casein solution (5% w / v). after the incubation period, 1 ml of 5% TCA is added to the reaction and continued with an incubation of 30 minutes at 37 ° C with stirring at 160 rpm. Subsequently it is centrifuged for 5 minutes at 10,000 g at 4 ° C. 2 ml of the supernatant thus obtained are added to 5 ml of NaCO3 and to 1 ml of F-C reagent, as per protocol Folin Ciocalteau (1929) J. Biol. Chem.

73, 627. A seguito di un’incubazione di 30 minuti a 37°C in agitazione a 160 rpm si procede con la lettura dell’assorbanza a 660 nm. I bianchi sono trattati come i campioni normali ma il surnatante è aggiunto alla reazione solo dopo il TCA. La lettura dell’assorbanza è stata rapportata ad una curva standard ottenuta con concentrazioni note di tirosina. 73, 627. Following an incubation of 30 minutes at 37 ° C with agitation at 160 rpm, the absorbance is read at 660 nm. The blanks are treated like normal samples but the supernatant is added to the reaction only after the TCA. The absorbance reading was related to a standard curve obtained with known concentrations of tyrosine.

b) ATTIVITA’ CHERATINOLITICA b) KERATINOLYTIC ACTIVITY

L’attività cheratinolitica è stata valutata con l’utilizzo di un substrato di cheratina coniugato ad un colorante, la Keratin Azure (KA, Sigma Aldrich). Nel dettaglio, 1 ml di surnatante centrifugato (10.000 g 15 minuti a 4°C) e filtrato viene aliquotato in una eppendorf contenente 5 mg di KA. Dopo un’incubazione overnight a 30°C in agitazione a 160 rpm e una centrifugazione (10.000 g, 3 minuti, temperatura ambiente), l’assorbanza a 595 nm è stata registrata. Il surnatante tal quale è stato utilizzato come bianco per evitare che il colore proprio di ogni surnatante alterasse la lettura spettrofotometrica. The keratinolytic activity was evaluated with the use of a keratin substrate conjugated to a dye, Keratin Azure (KA, Sigma Aldrich). In detail, 1 ml of centrifuged supernatant (10,000 g 15 minutes at 4 ° C) and filtered is aliquoted in an eppendorf containing 5 mg of KA. After an overnight incubation at 30 ° C with agitation at 160 rpm and a centrifugation (10,000 g, 3 minutes, room temperature), the absorbance at 595 nm was recorded. The supernatant as such was used as a blank to prevent the color of each supernatant from altering the spectrophotometric reading.

c) ATTIVITA’ REDUTTASICA c) REDUCED ACTIVITY

L’attività reduttasica è stata valutata con l’utilizzo di un reagente coniugato ad un colorante, il DTNB (Sigma Aldrich). Nel dettaglio, 1 ml di surnatante centrifugato (10.000 g 15 minuti a 4°C) e filtrato viene aliquotato in una eppendorf contenente 10 mg di piume e 1 ml di buffer a pH 8. Dopo un’incubazione overnight a 30°C 160 rpm e una centrifugazione (10.000 g, 3 minuti, temperatura ambiente), viene aggiunto 1 ml di DTNB (4 mg/ml). L’assorbanza a 412 nm è stata registrata. La lettura dell’assorbanza è stata rapportata ad una curva standard ottenuta con concentrazioni note di cisteina. The reductase activity was evaluated with the use of a reagent conjugated to a dye, the DTNB (Sigma Aldrich). In detail, 1 ml of centrifuged supernatant (10,000 g 15 minutes at 4 ° C) and filtered is aliquoted in an eppendorf containing 10 mg of feathers and 1 ml of buffer at pH 8. After overnight incubation at 30 ° C 160 rpm and a centrifugation (10,000 g, 3 minutes, room temperature), 1 ml of DTNB (4 mg / ml) is added. The absorbance at 412 nm was recorded. The absorbance reading was related to a standard curve obtained with known concentrations of cysteine.

d) ATTIVITA’ ALFA-AMILOLITICA d) ALPHA-AMYLOLYTIC ACTIVITY

1 ml di surnatante centrifugato (10.000 g, 15 minuti a 4°C) e filtrato è aliquotato in eppendorf contenenti 1 ml di soluzione di amido di mais. Dopo un’incubazione di 3 minuti a 20°C 160 rpm, si aggiunge 1 ml di Color Solution (Sigma Aldrich) e si bolle per 15 minuti. A seguito della bollitura, si raffredda in ghiaccio e si aggiungono 9 ml di H2O. L’assorbanza a 540 nm è stata registrata. La lettura dell’assorbanza è stata rapportata ad una curva standard ottenuta con concentrazioni note di maltosio. 1 ml of centrifuged supernatant (10,000 g, 15 minutes at 4 ° C) and filtered is aliquoted in eppendorf containing 1 ml of corn starch solution. After 3 minutes incubation at 20 ° C 160 rpm, 1 ml of Color Solution (Sigma Aldrich) is added and boiled for 15 minutes. Following boiling, it is cooled on ice and 9 ml of H2O are added. The absorbance at 540 nm was recorded. The absorbance reading was related to a standard curve obtained with known concentrations of maltose.

e) ATTIVITA’ COLLAGENOLITICA e) COLLAGENOLYTIC ACTIVITY

L’attività collagenolitica è stata valutata con l’utilizzo di un substrato di collagene coniugato ad un colorante, Azocol (Sigma Aldrich). Nel dettaglio, 1 ml di surnatante centrifugato (10.000 g 15 minuti a 4°C) e filtrato viene aliquotato in una eppendorf contenente 1,5 mg di Azocol. Dopo un’incubazione overnight a 30°C 160 rpm e una centrifugazione (10.000 g, 3 minuti, temperatura ambiente), l’assorbanza a 516 nm è stata registrata. Il surnatante tal quale è stato utilizzato come bianco per evitare che il colore proprio di ogni surnatante alterasse la lettura spettrofotometrica. The collagenolytic activity was evaluated with the use of a collagen substrate conjugated to a dye, Azocol (Sigma Aldrich). In detail, 1 ml of centrifuged supernatant (10,000 g 15 minutes at 4 ° C) and filtered is aliquoted in an eppendorf containing 1.5 mg of Azocol. After an overnight incubation at 30 ° C 160 rpm and a centrifugation (10,000 g, 3 minutes, room temperature), the absorbance at 516 nm was recorded. The supernatant as such was used as a blank to prevent the color of each supernatant from altering the spectrophotometric reading.

f) ATTIVITA’ di DEPILAZIONE f) DEPILATION ACTIVITIES

Per verificare l’attività di depilazione dei surnatanti batterici sono state condotte delle prove in giragiare (in giare rotanti con volume di 13 dm<3 >circa), un prototipo industriale che riproduce su piccola scala le fasi preliminari alla concia delle pelli. To verify the depilation activity of bacterial supernatants, tests were conducted in wandering (in rotating jars with a volume of 13 dm <3> approximately), an industrial prototype that reproduces the preliminary stages of tanning on a small scale.

Ogni prova richiede circa 48 h e 100 g per giaretta di pelle bovina salata, in pezzi da 10x10 cm circa. Tutte le prove sono state effettuate utilizzando pezzi di pelle bovina provenienti dallo stesso capo e sono state realizzate applicando il protocollo riportato in tabella 4. Each test requires about 48 hours and 100 g per jar of salted cowhide, in pieces of about 10x10 cm. All the tests were carried out using pieces of cowhide from the same garment and were carried out by applying the protocol shown in table 4.

Tabella 4 Table 4

I prodotti indicati in tabella sono prodotti commercialmente disponibili (Biodermol Ambiente srl). The products indicated in the table are commercially available products (Biodermol Ambiente srl).

Le % sono espresse come percentuali p/p rispetto alla pelle. Ad esempio, acqua 300% indica che, per 100 g di pelle, vengono caricati 300 g di acqua. The% are expressed as percentages w / w with respect to the skin. For example, 300% water indicates that, per 100g of leather, 300g of water is loaded.

Come controllo positivo viene utilizzato un protocollo come quello di Tabella 4, dove sono stati aggiunti agenti riducenti NaS/NaHS come agenti depilanti. A protocol such as that of Table 4 is used as a positive control, where reducing agents NaS / NaHS have been added as depilating agents.

Come controllo negativo, viene applicato lo stesso protocollo senza aggiunta di alcun agente depilante, né enzimatico né chimico. As a negative control, the same protocol is applied without the addition of any depilating agent, neither enzymatic nor chemical.

Al termine delle 48 h di lavorazione, la depilazione è valutata a livello qualitativo. Per una valutazione quantitativa del grado di depilazione è stata effettuata una rielaborazione grafica delle fotografie effettuate alla pelle prima e dopo il trattamento, ottenendo una percentuale di depilazione. At the end of 48 hours of processing, the hair removal is assessed on a qualitative level. For a quantitative assessment of the degree of hair removal, a graphic reworking of the photographs taken of the skin before and after the treatment was carried out, obtaining a percentage of hair removal.

I dati ottenuti dalla caratterizzazione in vitro sono riportati nei grafici di figura 1 e sono riassunti insieme a quelli ottenuti dalle prove con campione di pelle reale nella Heatmap di figura 2. Sono riportati i risultati ottenuti avendo fatto crescere i ceppi batterici indicati in NB= Nutrient Broth, terreno ricco in nutrienti. FMM= Feather Minimal Medium, terreno minimo in cui l’unica fonte di carbonio e azoto sono le piume. WMM = Wool Minimal Medium, terreno minimo in cui l’unica fonte di carbonio e azoto è la lana. Si evidenzia come la crescita in terreno minimo aumenti pressochè ciascuna delle attività enzimatiche testate. The data obtained from the in vitro characterization are shown in the graphs of figure 1 and are summarized together with those obtained from the tests with real skin sample in the Heatmap of figure 2. The results obtained having grown the bacterial strains indicated in NB = Nutrient are reported Broth, nutrient-rich soil. FMM = Feather Minimal Medium, minimal soil in which the only source of carbon and nitrogen are feathers. WMM = Wool Minimal Medium, minimal soil in which the only source of carbon and nitrogen is wool. It is evident that the growth in minimal medium increases almost each of the enzymatic activities tested.

Vantaggiosamente, ed è ben visibile nei pannelli b), c) d) e) f), l’attività enzimatica ottenuta con i surnatanti secondo la presente invenzione non è limtiata ad un’attività di tipo proteasico (pannello a) ma contempla una serie di ulteriori attività enzimatiche. Advantageously, and it is clearly visible in panels b), c) d) and) f), the enzymatic activity obtained with the supernatants according to the present invention is not limited to a protease type activity (panel a) but contemplates a series of further enzymatic activities.

L’effetto depilatorio osservato sui campioni di pelle reale ha portato a selezionare 4 ceppi che sono: The depilatory effect observed on real skin samples led to the selection of 4 strains which are:

-1Dm8 -1Dm8

-1Dm15 -1Dm15

-3Am2 -3Am2

-T2D3 -T2D3

PROVE SU BOTTALINO PILOTA TESTS ON PILOT BOTTLE

I 4 ceppi selezionati, cresciuti in terreno FMM (48h a 27°C in agitazione 160 rpm), sono stati testati in bottalino pilota per la determinazione di attività di depilazione. In particolare, 4 litri del surnatante chiarificato di ogni ceppo sono stati testati su campione di pelle reale (ca 8 kg) secondo il protocollo riportato in tabella 5 (calcinaio tradizionale) e in tabella 6 (calcinaio ossidativo). The 4 selected strains, grown in FMM medium (48h at 27 ° C with 160 rpm agitation), were tested in pilot boot for the determination of hair removal activity. In particular, 4 liters of the clarified supernatant of each strain were tested on real leather sample (about 8 kg) according to the protocol reported in table 5 (traditional liming) and in table 6 (oxidative liming).

Tabella 5 Table 5

I prodotti denominati Biodermol sono di proprietà di Biodermol Ambiente srl: The products called Biodermol are owned by Biodermol Ambiente srl:

- Biodermol BTM OS: biocida a base di polivinilpirrolidone - Biodermol BTM OS: polyvinylpyrrolidone based biocide

- Biodermol PRODEFAT: bioemulgatore - Biodermol PRODEFAT: bioemulgator

- Biodermol PRODEFAT M: bioemulgatore a base enzimatica - Biodermol PRODEFAT M: enzymatic based bioemulgator

- Biodermol WPM: mix di enzimi fra cui ialuronidasi, amilasi e proteasi - Biodermol TP: tripoli fosfato di sodio e sali - Biodermol WPM: mix of enzymes including hyaluronidase, amylase and protease - Biodermol TP: sodium tripoli phosphate and salts

- Biodermol LIPOL T1/T2S: sgrassante a base di enzimi lipolitici Tabella 6 - Biodermol LIPOL T1 / T2S: degreaser based on lipolytic enzymes Table 6

La figura 3 è esemplificativa dei risultati ottenuti dalle prove di depilazione con i surnatanti batterici su scala pilota. Al termine di tutte e quattro le prove, la lavorazione sui campioni di pelle è stata portata avanti fino allo stadio di Wetblue al fine di valutare eventuali danni alla struttura della pelle. Non sono emersi danni strutturali visibili su nessuno dei quattro test effettuati. Figure 3 is an example of the results obtained from the hair removal tests with the bacterial supernatants on a pilot scale. At the end of all four tests, the processing of the leather samples was carried out up to the Wetblue stage in order to assess any damage to the skin structure. No visible structural damage was found on any of the four tests performed.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo batterico per la produzione di enzimi ad alta capacità depilatoria, dove detto ceppo batterico è selezionato nel gruppo che consiste in 1Dm8, 1Dm15, 3Am2, T2D3, il numero di deposito di ciascuno di detti ceppi essendo DPS RE RSCIC 14, DPS RE RSCIC 13, DPS RE RSCIC 11, DPS RE RSCIC 15, rispettivamente. CLAIMS 1. A bacterial strain for the production of enzymes with a high depilatory capacity, where said bacterial strain is selected in the group consisting of 1Dm8, 1Dm15, 3Am2, T2D3, the deposit number of each of said strains being DPS RE RSCIC 14, DPS RE RSCIC 13, DPS RE RSCIC 11, DPS RE RSCIC 15, respectively.

2. Il surnatante di coltura di almeno un ceppo batterico selezionato nel gruppo che consiste in 1Dm8, 1Dm15, 3Am2, T2D3, il numero di deposito di ciascuno di detti ceppi essendo DPS RE RSCIC 14, DPS RE RSCIC 13, DPS RE RSCIC 11, DPS RE RSCIC 15, rispettivamente. 2. The culture supernatant of at least one bacterial strain selected in the group consisting of 1Dm8, 1Dm15, 3Am2, T2D3, the deposit number of each of said strains being DPS RE RSCIC 14, DPS RE RSCIC 13, DPS RE RSCIC 11, DPS RE RSCIC 15, respectively.

3. Il surnatante secondo la rivendicazione 2, dove detto surnatante è un mezzo di coltura liquido. The supernatant according to claim 2, wherein said supernatant is a liquid culture medium.

4. Il surnatante secondo la rivendicazione 2, dove detto mezzo di coltura è un terreno minimo, preferibilmente è FMM (Feather Minimal Medium) o WMM (Wool Minimal Medium). The supernatant according to claim 2, wherein said culture medium is a minimum medium, preferably is FMM (Feather Minimal Medium) or WMM (Wool Minimal Medium).

5. Il surnatante secondo una delle rivendicazioni da 2 a 4, dove surnatante è trattato, preferibilmente è essiccato e/o liofilizzato. The supernatant according to one of claims 2 to 4, where supernatant is treated, is preferably dried and / or lyophilized.

6. Una formulazione che comprende almeno un surnatante secondo una delle rivendicazioni da 2 a 5, opzionalmente ulteriori surnatanti da ulteriori ceppi batterici, opzionalmente ulteriori attivi. A formulation comprising at least one supernatant according to one of claims 2 to 5, optionally further supernatants from further bacterial strains, optionally further active.

7. Un metodo per la depilazione della pelle, dove detto metodo comprende: - Mettere a disposizione almeno un surnatante secondo una delle rivendicazioni da 2 a 5, o una formulazione secondo la rivendicazione 6; - Esporre la pelle da trattare a detto almeno un surnatante o a detta formulazione, ad una temperatura compresa tra 18 e 40°C, ad un pH compreso tra 4,5 e 12. 7. A method for skin hair removal, where said method includes: - Providing at least one supernatant according to one of claims 2 to 5, or a formulation according to claim 6; - Exposing the skin to be treated to said at least one supernatant or to said formulation, at a temperature between 18 and 40 ° C, at a pH between 4.5 and 12.

8. Il metodo secondo la rivendicazione 7, dove detta pelle viene esposta a detto surnatante ad una temperatura compresa tra 22 e 29°C, o tra 24 e 27°C ad un pH compreso tra 6 e 9. The method according to claim 7, wherein said skin is exposed to said supernatant at a temperature between 22 and 29 ° C, or between 24 and 27 ° C at a pH between 6 and 9.

9. Il metodo secondo una delle rivendicazioni 7 o 8 che è per la concia delle pelli e comprende altresì un passaggio di rinverdimento e/o un passaggio di calcinaio. The method according to one of claims 7 or 8 which is for tanning hides and also comprises a soaking step and / or a liming step.

10. Un metodo per la depilazione o il peeling cosmetico che comprende la somministrazione per via topica di almeno un surnatante secondo una delle rivendicazioni ad 2 a 5 o di una formulazione secondo la rivendicazione 6. A method for cosmetic hair removal or peeling comprising topical administration of at least one supernatant according to one of claims 2 to 5 or a formulation according to claim 6.