IT201800009318A1 - Composizioni antiossidanti - Google Patents

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Roberto Carnevale
Giacomo Frati
Luigi Frati
Antonino Marullo
Valentina Valenti
Sebastiano Sciarretta
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Luigi Frati
Roberto Carnevale
Sebastiano Sciarretta
Giacomo Frati
Valentina Valenti
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Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
“Composizioni antiossidanti”
TESTO DELLA DESCRIZIONE
Campo dell’invenzione
La presente descrizione si riferisce a composizioni antiossidanti particolarmente adatte per contrastare processi infiammatori.
Sfondo dell’invenzione
Lo stress ossidativo, termine coniato per la prima volta da Sies nel 1985, definisce una perturbazione transitoria o permanente tra la produzione cellulare di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e la disponibilità di specie antiossidanti (Sies, 2015). Tale perturbazione – nota per contribuire alla patogenesi di diverse malattie (Rahman et al., 2012) – comporta l’insorgenza sia di lesioni cellulari a causa di una ossidazione diretta delle proteine cellulari, dei lipidi e del DNA sia di alterazioni nelle vie di segnalazione che modificano la risposta cellulare favorendo, ad esempio, la morte delle cellule (Birben et al., 2012).
Diversi sono i fattori che contribuiscono alla genesi dello stress ossidativo. Gli xenobiotici, come ad esempio radiazioni, droghe e abitudini, come ad esempio, il fumo così come gli agenti ambientali interagiscono con le fonti cellulari di ROS inducendone la produzione. I mitocondri, il reticolo endoplasmatico, i perossisomi e i sistemi enzimatici, come ad esempio la NADPH ossidasi, NADP e la xantina ossidasi, sono alcune delle principali fonti intracellulari di ROS (Pizzino et al., 2017). Quando prodotte in eccesso, le ROS - che comprendono diverse specie reattive quali, ad esempio, il superossido (-O2), i radicali idrossilici (HO), il perossido d’idrogeno (H2O2) -sono coinvolte in diverse patologie, come il cancro, le malattie neurodegenerative, il diabete e le malattie cardiovascolari, poiché promuovono il processo infiammatorio.
Il processo infiammatorio è comunemente considerato una reazione complessa nel tessuto connettivo vascolarizzato in risposta a stimoli esogeni ed endogeni. L'obiettivo finale di questa risposta è di liberare l'organismo dalla causa iniziale della lesione cellulare e dalle conseguenze di tale lesione. Tuttavia, un processo infiammatorio prolungato o non regolato può causare danni ai tessuti ed è la causa di molte malattie croniche. Diversi studi supportano una relazione interdipendente tra infiammazione e stress ossidativo e un loro coinvolgimento in diverse malattie croniche tra cui diabete e complicazioni diabetiche, ipertensione e malattie cardiovascolari, malattie neurodegenerative, epatopatia alcolica, malattie renali croniche, cancro e invecchiamento (Biswas, 2015). Infatti, in condizioni infiammatorie patologiche può verificarsi una over-produzione di ROS da parte delle cellule fagocitiche che quindi possono indurre stress ossidativo localizzato e lesioni tissutali (Fialkow et al., 2007).
Oltre che con lo stress ossidativo, un'associazione complessa è stata identificata anche tra infiammazione e autofagia.
L’autofagia è un processo intracellulare citoprotettivo che media la degradazione di proteine, il turnover degli organelli, il riciclo di componenti citoplasmatici in condizione di deprivazione di nutrienti e di stress cellulare (Levine et al., 2004). Inoltre, l’autofagia riveste un ruolo importante nella rimozione delle ROS cellulari in eccesso consentendo il mantenimento di un equilibrio redox (Li et al., 2015). I materiali degradati nell’autofagosoma sono poi utilizzati per le reazioni anaboliche, per sostenere le richieste di energia e per fornire molecole semplici derivanti dal processo degradativo che possono essere riutilizzate dalle cellule per altre funzioni. L’autofagia, quindi, aiuta le cellule ad adattarsi ai cambiamenti energetici e stressanti sostenendo il metabolismo cellulare, l’omeostasi e la sopravvivenza (Mizushima, 2007). L’insufficiente attività autofagica può contribuire alla morte cellulare. Numerosi studi hanno dimostrato che l’inibizione del flusso autofagico può contribuire alla patogenesi di malattie cardiovascolari, del diabete, di disordini infiammatori, del cancro e allo stress fisico (Levine et al., 2008). Inoltre, l'autofagia influenza lo sviluppo, l'omeostasi e la sopravvivenza delle cellule infiammatorie, compresi macrofagi, neutrofili e linfociti, che svolgono ruoli critici nello sviluppo e nella patogenesi dell'infiammazione (Qian et al., 2017).
Considerando che lo stress ossidativo ed una deficienza autofagica associati all’infiammazione sono comuni in molte patologie, la possibilità di esercitare una loro modulazione può rappresentare un possibile approccio terapeutico utile a ridurre l’insorgenza e lo sviluppo di numerose patologie associate allo stress ossidativo, quali ad esempio i processi infiammatori.
Sintesi dell’invenzione
Lo scopo della presente descrizione consiste nel fornire composizioni con una elevata capacità antiossidante in grado di contrastare la formazione di radicali liberi attraverso l’effetto sinergico esercitato dai diversi componenti.
Secondo l’invenzione, il suddetto scopo viene raggiunto grazie all’oggetto specificamente richiamato nelle rivendicazioni che seguono, che vanno intese quale parte integrante della presente descrizione.
Una forma di realizzazione della presente descrizione fornisce una composizione contenente un agente attivo, detto agente attivo comprendendo:
- almeno un composto antiossidante selezionato nel gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi,
- spermidina,
- almeno un ulteriore componente scelto fra trealosio e lentztrealosio.
In un’altra forma di realizzazione, la presente descrizione fornisce una composizione comprendente un agente attivo, detto agente attivo comprendendo spermidina, nicotinamide e almeno un ulteriore componente scelto fra trealosio e lentztrealosio.
Il lentztrealosio può essere selezionato tra lentztrealosio A, B, C.
Gli Inventori della presente domanda hanno dimostrato che, grazie a un’azione sinergica esercitata dai diversi componenti dell’agente attivo, le composizioni descritte sono in grado di contrastare lo stress ossidativo e di attivare meccanismi di autofagia.
In una o più forme di realizzazione, le composizioni descritte in questa sede possono essere usate anche in medicina.
Le composizioni oggetto della presente descrizione possono essere utilizzate nella prevenzione e/o nel trattamento di una malattia da stress ossidativo selezionata nel gruppo costituito da infiammazione, insufficienza cardiaca, malattia aterosclerotica, malattie neurodegenerative, neoplasie, steatosi epatica, diabete mellito. In una o più forme di attuazione, la composizione può essere destinata al trattamento di uno stato infiammatorio acuto o cronico.
Breve descrizione del disegno
L’invenzione verrà ora descritta, solo a titolo di esempio, con riferimento alle figure allegate, in cui:
- La Figura 1 mostra i risultati di una valutazione dell’effetto delle composizioni oggetto della presente descrizione sulla funzione piastrinica. Valutazione dell’aggregazione piastrinica (A) e della produzione di TxB2 (B) in piastrine di soggetti sani, pazienti con fibrillazione atriale (FA; C e D), sindrome metabolica (SM; E e F) e fumatori (G e H);
- la Figura 2 mostra i risultati di una valutazione dell’effetto delle composizioni oggetto della presente descrizione sull’autofagia e sullo stress ossidativo. Valutazione dell’autofagia (A) e della produzione di H2O2 (B) in piastrine di soggetti sani, pazienti con fibrillazione atriale (FA; C e D), sindrome metabolica (SM; E e F) e fumatori (G e H);
- la Figura 3 mostra i risultati di una valutazione dell’effetto delle composizioni oggetto della presente descrizione sullo stress ossidativo, angiogenesi e vitalità su cellule endoteliali (HUVEC). Effetto del trattamento di cellule HUVEC con singoli componenti delle composizioni e con le composizioni oggetto della presente descrizione sulla produzione di H2O2 (A) e sulla biodisponibilità di ossido nitrico (NO) (B), sulla vitalità cellulare (C) e sull’angiogenesi (D).
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Nella seguente descrizione, sono riportati numerosi dettagli specifici per consentire una comprensione approfondita di forme di realizzazione. Le forme di realizzazione possono venire messe in pratica senza uno o più dei dettagli specifici, o con altri procedimenti, componenti, materiali, ecc. In altri casi, strutture, materiali od operazioni ben noti non vengono mostrati o descritti in dettaglio per evitare di confondere aspetti delle forme di realizzazione.
Il riferimento in tutta la presente descrizione a “una sola forma di realizzazione” o a “una forma di realizzazione” indica che un/una particolare aspetto, struttura o caratteristica descritto/a in relazione alla forma di realizzazione è incluso/a in almeno una sola forma di realizzazione. Pertanto, le forme delle espressioni “in una sola forma di realizzazione” o “in una forma di realizzazione” in vari punti in tutta la presente descrizione non si riferiscono tutte necessariamente alla stessa forma di realizzazione. Inoltre, i particolari aspetti, strutture o caratteristiche possono venire combinati in qualsiasi modo adatto in una o più forme di realizzazione.
I titoli forniti in questa sede sono solo per convenienza e non interpretano l’ambito o lo scopo delle forme di realizzazione.
Una forma di realizzazione della presente descrizione fornisce una composizione comprendente un agente attivo, detto agente attivo comprendendo i) almeno un composto antiossidante selezionato nel gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi, ii) spermidina, iii) almeno un ulteriore componente scelto fra trealosio e lentztrealosio.
Lentztrealosio impiegabile quale componente dell’agento attivo delle composizioni descritte può essere lentztrealosio A, B o C.
Una ulteriore forma di realizzazione, fornisce una composizione comprendente un agente attivo, detto agente attivo comprendendo spermidina, nicotinamide e un ulteriore componente scelto fra trealosio e lentztrealosio. Anche in questa ulteriore forma di attuazione, lentztrealosio può essere lentztrealosio A, B o C.
Il principio attivo delle composizioni oggetto della presente descrizione può inoltre contenere un inibitore delle trealasi, preferibilmente scelto tra treazolina e validoxilamina A.
Le composizioni possono essere utilizzate nella prevenzione e/o nel trattamento di una malattia da stress ossidativo selezionata nel gruppo costituito da infiammazione, insufficienza cardiaca, malattia aterosclerotica, malattie neurodegenerative, neoplasie, steatosi epatica, diabete mellito.
Lo stato infiammatorio che può essere prevenuto e/o trattato somministrando le composizioni oggetto della presente descrizione è uno stato infiammatorio acuto o cronico.
Con riferimento a tale condizione, vi è un crescente numero di prove che suggeriscono che i ROS possono essere implicati nell’infiammazione sistemica e nella disfunzione endoteliale, fattori che caratterizzano condizioni patologiche come malattie cardiovascolari e tumori, (Carnevale et al., 2014, Lahera et al., 2007, Liou and Storz, 2010) ma anche condizioni associate ad esempio all’abitudine al fumo (Pittilo, 2000) o all’esercizio fisico intenso (Ghisi, et al., 2010).
L’analisi dell’autofagia, che è tra i più importanti meccanismi di difesa contro il danno cellulare indotta dallo stress ossidativo (Scherz-Shouval R et al., 2007) ha consentito agli Inventori della presente domanda di dimostrare che l’eccessiva produzione di ROS nelle piastrine dei pazienti esaminati era attribuibile ad una diminuita attività autofagica.
Le composizioni oggetto della presente descrizione si sono rivelate in grado – grazie a un effetto sinergico esercitato dai diversi componenti - di contrastare la produzione di ROS, come illustrato nel seguito.
La presente descrizione dimostra infatti per la prima volta che la somministrazione in vitro delle composizioni descritte a piastrine estratte da pazienti esercita un evidente effetto antiossidante e pro-autofagico.
Le composizioni oggetto della presente descrizione comprendono quale agente attivo trealosio (e/o lentztrealosio A, B o C) in combinazione con componenti con specifica attività antiossidante.
Il trealosio è un disaccaride naturale composto di due molecole di glucosio legate da un legame α1-1-glicosidico. Il trealosio è sintetizzato dagli organismi inferiori come lieviti, batteri insetti e piante ma non dai mammiferi. Il trealosio svolge molteplici funzioni che lo distinguono dagli altri comuni disaccaridi, compresa un'azione protettiva contro diversi agenti stressogeni, quali stress ossidativo, escursioni termiche, accumulo di aggregati proteici e disidratazione. Inoltre, recenti evidenze hanno dimostrato che il trealosio potrebbe prevenire le risposte infiammatorie indotte dallo shock endotossico sia in vivo che in vitro. La somministrazione orale di questo disaccaride si è dimostrata anche in grado di ridurre lo sviluppo e la progressione di disturbi neurodegenerativi, steatosi epatica, danno renale, insulino-resistenza, aterosclerosi, rimodellamento cardiaco post-ischemico e pancreatite (Schaeffer and Goedert, 2012; Zhang et al., 2014; DeBosch et al., 2016; Wang et al., 2017; Arai et al., 2010; Sciarretta et al., 2018) principalmente attraverso la stimolazione dell'autofagia.
Il lentztrealosio è un analogo del trealosio la cui struttura è caratterizzato dalla presenza di sostituenti su una delle molecole di glucosio; questa struttura determina una maggiore resistenza alla degradazione del legame glicosilico da parte delle trealasi. Il lentztrealosio esibisce diverse attività biologiche che includono l’induzione dell’autofagia (Zhang et al, 2015). Il lentztrealosio può presentarsi in diverse isoforme, quali l’isoforma A, B, C.
Spermidina e almeno un composto antiossidante selezionato nel gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi possono essere contenute in composizioni secondo forme di attuazione della presente descrizione in combinazione con trealosio e/o lentztrealosio A, B o C. Il gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi può comprendere composti sia di sintesi sia derivati, ad esempio, da piante, frutti, bevande naturali e oli.
In una o più forme di attuazione, il gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi può comprendere la frazione polifenolica di piante, frutta ed oli.
In una o più forme di attuazione, il gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi può comprendere epicatechina, catechina, curcumina, quercitina, resveratrolo.
In una o più forme di attuazione, la composizione comprende un agente attivo contenente i) almeno un composto selezionato nel gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi, preferibilmente catechina e epicatechina, ii) spermidina, iii) almeno uno fra trealosio e/o lentztrealosio.
Catechina e epicatechina sono polifenoli in grado di esercitare un effetto antiossidante; catechina, in particolare, è un composto presente nel tè, cacao e vino rosso.
Spermidina è una poliammina presente in natura in alcuni alimenti come la crusca di riso, la soia, funghi e broccoli. E' stato dimostrato che la spermidina è in grado di prolungare la durata della vita nei lieviti, mosche e vermi in una modalità dipendente dall’autofagia.
Di seguito verranno fornite indicazioni in merito alle rispettive quantità dei componenti dell’agente attivo delle composizioni descritte.
L’almeno un composto selezionato nel gruppo costituito da polifenoli e flavonoidi può essere compreso nelle composizioni in una quantità compresa tra 10% e 40% del principio attivo.
In composizioni comprendenti i) trealosio (e/o lentztrealosio A, B o C), ii) spermidina e iii) catechina e epicatechina quali polifenoli la quantità di catechina può essere compresa tra 10 e 40% (peso/peso), preferibilmente pari a 25 % (peso/peso) dell’agente attivo.
La quantità di spermidina può essere compresa tra 0,025 e 5% (peso/peso), preferibilmente pari a 0,15% (peso/peso) dell’agente attivo.
La quantità di epicatechina può essere compresa tra 10 e 40% (peso/peso), preferibilmente pari a 25% (peso/peso) dell’agente attivo.
In una o più forme di attuazione, il rapporto in peso tra catechinina e epicatechina può essere compreso tra 2:1 e 0,5:1, preferibilmente pari a 1:1.
Almeno un componente scelto fra trealosio e lentztrealosio (A, B o C) può essere presente in una quantità compresa tra 15 e 79,5% (peso/peso), più preferibilmente pari a 49,85% (peso/peso) dell’agente attivo.
Il rapporto in peso tra la quantità di trealosio (e/o lentztrealosio A, B o C) e la quantità di catechina può essere compreso tra 0,5:1 e 2:1.
Il rapporto in peso tra la quantità di trealosio (e/o lentztrealosio A, B o C) e la quantità di epicatechina può essere compreso tra 0,5:1 e 2:1.
Tali dosaggi possono consentire di raggiungere in circolo una concentrazione biologicamente attiva per ciascun componente attivo della miscela.
In una o più forme di attuazione, l’agente attivo può consistere di catechina, epicatechina, spermidina, e almeno uno fra trealosio e/o lentztrealosio A, B o C.
La composizione può inoltre comprendere almeno un ulteriore componente selezionato tra vitamine, minerali, additivi, sostanze aromatizzanti. Tale ulteriore componente può essere compreso in una quantità in peso compresa tra 1% e 100% (peso/peso) rispetto al peso dell’agente attivo. Ad esempio, una composizione secondo forme di attuazione può comprendere i seguenti componenti nelle seguenti quantità: epicatechina 250 mg, catechina 250 mg, trealosio e/o lenztrealosio (A, B o C) 498,5 mg, spermidina 1,5 mg, additivi 100 mg.
Una ulteriore forma di attuazione della composizione descritta è una composizione che – in combinazione con un componente scelto trealosio e lentztrealosio – comprende spermidina e nicotinamide.
Lentztrealosio può essere contenuto nella composizione sottoforma di lentztrealosio A, B o C.
Nicotinamide è il precursore del coenzima nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+) e partecipa al metabolismo energetico cellulare nella catena mitocondriale di trasporto degli elettroni. Esso è inoltre essenziale per la sintesi di nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADP+), molecola alla base della sintesi degli acidi grassi e della sopravvivenza cellulare in condizioni di stress ossidativo. Evidenze sperimentali hanno dimostrato che la nicotinamide può modificare il bilancio redox in vivo e in vitro; è stato inoltre suggerito un ruolo potenziale come agente antitumorale eventualmente in combinazione con altri chemioterapici sulla base di studi in vitro su modelli di cellule tumorali (Zhang et al., 2013; Audrito et al., 2011; Jung-Hynes et al., 2009; Dominguez-Gomez et al., 2015).
Composizioni comprendenti quale agente attivo trealosio e/o lentztrealosio A, B o C in combinazione con nicotinamide e spermidina può contenere i diversi componenti nelle quantità come di seguito indicate.
Trelaosio (e/o lentztrealosio A, B o C) può essere presente in una quantità compresa tra 96,5 e 99,95% (peso/peso), preferibilmente pari al 98,99% dell’agente attivo.
Nicotanamide può essere contenuta in una quantità compresa tra 0,01 e 3% (peso/peso), preferibilmente pari allo 1% dell’agente attivo.
La quantità di spermidina può essere compresa tra 0,001 e 1% (peso/peso), preferibilmente pari allo 0,01% dell’agente attivo.
Il rapporto in peso tra la quantità di nicotinamide e la quantità di spermidina può essere compreso tra 100:1 e 3:1.
In una o più forme di attuazione, l’agento attivo può consistere di nicotinamide, spermidina e trealosio e/o lentztrealosio.
Anche in questo caso, la composizione può inoltre comprendere almeno un ulteriore componente selezionato tra vitamine, minerali, additivi, sostanze aromatizzanti. Tale ulteriore componente può essere compreso in una quantità in peso compresa tra 1% e 100% (peso/peso) rispetto al peso dell’agente attivo.
Ad esempio, una composizione secondo forme di attuazione può comprendere i seguenti componenti nelle seguenti quantità: trealosio e/o Lenztrealosio (A, B o C) 10000 mg, spermidina 1 mg, nicotinamide 100 mg, additivi 500 mg.
In una o più forme di attuazione, le composizioni oggetto della presente descrizione possono essere somministrate come supplemento nutrizionale orale.
Le composizioni oggetto della presente descrizione possono essere somministrate, ad esempio, sotto forma di compresse o sotto forma di granuli da sciogliere in acqua o in bevande.
In una o più forme di attuazione, la composizione può essere somministrata per via topica sotto forma di gel, crema o unguento.
Gli Inventori della presente domanda hanno impiegato diversi approcci per esplorare l’attività antiossidante e autofagica delle composizioni descritte.
In particolare, è stato dimostrato che le composizioni sono in grado di sotto-regolare la produzione di ROS piastrinici, come dimostrato nel seguito con riferimento alla valutazione quantitativa di produzione di perossido di idrogeno (H2O2).
Inoltre, la riduzione dello stress ossidativo è stata corroborata dall’evidente aumento dell’attività autofagica dimostrata da un incremento significativo dell’espressione di LC3, uno dei componenti fondamentali della formazione dell’autofagosama durante il processo autofagico.
L’eccessiva produzione di ROS in varie patologie può avere un potenziale effetto sulla funzione endoteliale (Taniyama and Griendling, 2003) e sulla apoptosi (Circu and Aw, 2010). I ROS, infatti, possono interferire con la biodisponibilità dell’NO, con il processo di angiogenesi favorendo il processo apoptotico attraverso l’induzione di molecole quali le caspasi.
La presente descrizione fornisce l’evidenza di un effetto sinergico esercitato dai componenti delle composizioni secondo le diverse forme di attuazione.
Come descritto nelle sezioni che seguono il trattamento in vitro con le composizioni è associato ad un aumento della vitalità cellulare nelle cellule HUVEC, come dimostrato dal saggio di proliferazione cellulare (MTS, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt).
Inoltre, la migliore vitalità è stata corroborata da i) aumentata biodisponibilità del NO, che svolge un ruolo importante nella protezione dall'insorgenza e dalla progressione della malattia cardiovascolare, e ii) aumentata angiogenesi come dimostrato da un aumento della capacità di formazione di vasi in vitro.
Gli Inventori della presente domanda hanno condotto test sperimentali verificando l’effetto dei componenti da soli e in combinazione. I risultati dei test sperimentali hanno dimostrato un sorprendente effetto sinergico esercitato dai diversi componenti dell’agente attivo sullo stress ossidativo, autofagia, funzione piastrinica e endoteliale.
Al contrario, la somministrazione in vitro dei singoli componenti di ciascuna composizione non si è dimostrata efficace nel contrastare la produzione di H2O2 e l’aggregazione piastrinica. Inoltre, la somministrazione dei singoli componenti non ha determinato un aumento significativo della biodisponibilità di NO, di autofagia, della vitalità cellulare, dell’angiogenesi.
La presente descrizione fornisce la prima prova che l’effetto del trealosio può essere potenziato quando in combinazione con polifenoli e molecole antiossidanti qui descritti contrastando efficacemente lo stress ossidativo e la funzione endoteliale attraverso un meccanismo mediato dall’autofagia.
MATERIALI E METODI
Popolazione di Studio e reclutamento
Cinque soggetti sani (3 maschi e 2 femmine, età 61.2±8.3), 5 pazienti con fibrillazione atriale (FA) (3 maschi e 2 femmine, età 61,6±10,1), 5 pazienti con sindrome metabolica (SM) (3 maschi e 2, età 68,4±6,8) e 5 fumatori (3 maschi e 2 femmine, età 30,8±6,7) hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio che è stato condotto tra marzo e maggio 2018 al Policlinico Umberto I (Roma).
Preparazione delle piastrine
Il sangue intero dei soggetti è stato raccolto in provette contenenti 3,2% di citrato di sodio come anticoagulante (citrato di sodio/rapporto sangue intero, 1:9). Per ottenere il plasma ricco di piastrine (PRP), i campioni di sangue sono stati centrifugati per 15 minuti a 180 g a temperatura ambiente (circa 21°C). Due terzi del PRP (75%) sono stati trasferiti in un nuovo tubo di plastica utilizzando una pipetta di trasferimento senza disturbare lo strato di buffy coat, al fine di evitare la contaminazione. Il plasma povero di piastrine (PPP) è stato preparato centrifugando il campione rimanente a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Il test di funzione piastrinica è stato eseguito in tre ore.
Preparazione della composizione comprendente trealosio, catechina, epicatechina, spermidina (Mix1)
I vari componenti sono stati acquistati presso Sigma Aldrich (cod T9631 per il trealosio; cod C0567 per la catechina; cod E4018 per epicatechina; cod S2626 per la spermidina). Il Mix 1 è stato preparato dalle soluzioni madri di ciascun componente che è stato diluito in H20 (trealosio e spermidina) e in dimetilsofato (DMSO; epicatechina e catechina) a ottenere una concentrazione di 10 µM per tralosio, 10 µM per la catechina, 10 µM per l’epicatechina e 5 µM la spermidina.
Preparazione della composizione comprendente trealosio, spermidina, nicotinamide (Mix2)
I vari componenti sono stati acquistati presso la Sigma Aldrich (cod T9631 per il trealosio; cod S2626 per la spermidina; cod N3376 per la nicotinamide). Il Mix 2 è stato preparato dalle soluzioni madri di ciascun componente che è stato diluito in acqua a ottenere una concentrazione di 10 µM per tralosio, 5 µM per la spermidina e 5 µM per la nicotinamide.
Aggregazione piastrinica
L'aggregazione piastrinica è stata eseguita su PRP ed è stata monitorata attraverso aggregometro a trasmissione di luce ChronoLog modello 700.
Prima dell'attivazione con collagene, diversi campioni sono stati pre-incubati (20 minuti a 37°C) con composizioni contenenti i seguenti componenti:
- Composizione 1: epicatechina (E, 10μM)
- Composizione 2: catechina (C, 10μM)
- Composizione 3: trealosio (T, 10μM)
- Composizione 4: spermidina (S, 5μM)
- Composizione 5: nicotinamide (N, 5μM).
Al fine di valutare l’eventuale effetto sinergico esercitato dalla combinazione degli specifici componenti, ulteriori campioni sono stati pre-incubati (20 minuti a 37°C) con:
i) una composizione comprendente epicatechina (10μM), catechina (10μM), trealosio (10μM), spermidina (5μM) (“Mix 1”);
ii) una composizione comprendente, trealosio (10μM), spermidina (5μM), nicotinamide (5μM) (“Mix 2”).
Dopo l'incubazione, i campioni sono attivati con collagene (Mascia Brunelli, 2 μg/mL) per 10 minuti a 37°C.
Dopo stimolazione, ai campioni è stato aggiunta la soluzione ACD (Acido Citrico Destrosio) e successivamente i campioni sono stati centrifugati per 3 minuti a 3000 g. I supernatanti sono stati conservati a -80°C per l'analisi dei biomarcatori solubili e i pellet sono stati conservati a -80°C per l'analisi dell’autofagia. I coefficienti di variazione intra-saggio e inter-saggio per il test di aggregazione sono rispettivamente del 5,7% e del 6,8%.
Valutazione della produzione di H2O2
La produzione di H2O2 è stata valutata mediante un saggio colorimetrico (Arbor Assay) ed espressa in μM. I coefficienti di variazione intra-saggio e inter-dosaggio sono stati rispettivamente del 2,1% e del 3,7%.
Valutazione dell’autofagia mediante analisi Western blot
Le proteine (30 μg/pozzetto), la cui concentrazione è stata stimata mediante metodo Bradford, sono state solubilizzate nel 2X Leammli buffer contenente il 20% di 2-mercaptoetanolo e poi portati ad ebollizione per 5 minuti a 95°C. Le proteine sono state separate su gel 15% e poi trasferite su membrane di nitrocellulosa (Trans-Blot Turbo Mini Nitrocellulose, Bio-Rad). Successivamente, le membrane sono state bloccate con il 5% (w/v) di latte dissolto in soluzione Tris 1X e 0,1% di Tween. Le membrane sono state poi incubate con anticorpo anti-LC3 (MBL) e anticorpo monoclonale anti-αactin e incubate a 4°C per una notte. Infine, le membrane sono state incubate con l’anticorpo secondario (Santa Cruz Biotechnology, 1:5000) e gli immunocomplessi visualizzati con substrato chemiluminescente. L’analisi densitometrica delle bande è stata eseguita usando il software Image J.
Trattamento di cellule HUVEC
Cellule HUVEC (Lonza, Cat. N.CC-C2517A) sono state messe in coltura in terreno completo EGM-2 (Lonza Cat. N. CC-3162) e sono state diluite a una densità di 2500 cellule/cm<2>. Gli esperimenti sono stati condotti su tre diversi lotti di cellule HUVEC. Le colture cellulari sono state testate tra i passaggi 3-6.
Angiogenesi
50μl di matrice extracellulare (Matrigel) sono stati deposti in una piastra 96-well che è stata successivamente incubata a 37°C per 60 minuti. Un ugual numero di cellule (3x10³ cellule/cm²) sono state inizialmente trattate per 2h con terreno di coltura in assenza di siero e successivamente trattate con terreno di coltura (senza siero) H2O2 (800 μM) in presenza o meno di epicatechina (10 μM) o catechina (10 μM) o trealosio (10 μM) o spermidina (5 μM) o nicotinamide (5 μM) o della composizione “Mix1” o della composizione “Mix2” per 3h. Dopo 3h, le cellule sono state staccate e piastrate ad una concentrazione di 1X10³cellule/cm² in ogni pozzetto della piastra 96-well contenente il Matrigel e incubate per 8h. La presenza di strutture simil-capillari è stata valutata al microscopio a contrasto di fase. La quantificazione dei vasi è stata espressa come media del numero di vasi in 5 campi casuali.
Saggio di vitalità cellulare (MTS)
Cellule HUVEC sono state piastrate in triplicato alla concentrazione di 3x10³/pozzetto in una piastra da 96. Sono state lasciate aderire per 24h dopo di che si è proceduto al trattamento. Le cellule sono state trattate per 2h con terreno in assenza di siero. Successivamente le cellule sono state trattate con 100µl di terreno (senza siero) contenente i vari componenti per 3h. Al termine delle 3h, 20µL di MTS sono stati aggiunti al terreno e la piastra è stata incubata a 37°C per 2h. Al termine delle due ore è stata misurata la lunghezza d’onda a 490 nm con un lettore di micropiastra (Tecan Magellan).
Determinazione della biodisponibilità di NO
Un kit di dosaggio colorimetrico (Tema Ricerca, Italia) è stato utilizzato per determinare i metaboliti dell’NO, ovvero nitriti e nitrati (NOx) in 100 μL di campione mantenuto in condizioni di agitazione per 10 minuti a 37°C. I coefficienti di variazione intra-saggio e inter-dosaggio sono rispettivamente del 2,9% e 1,7%.
Procedimenti statistici
Le variabili continue sono riportate come medie ± deviazione standard. I confronti tra i gruppi sono stati effettuati mediante test t di Student e sono stati replicati come appropriato con test non parametrici (test di Kolmogorov-Smirnov (z) in caso di varianze non omogenee come verificato dal test di Levene). I risultati sono stati espressi come media±DS. Un valore di p<0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi sono state eseguite mediante GraphPad Prism 7 (GraphPad Software La Jolla, CA 92037 USA).
RISULTATI
Effetto delle composizioni su funzione piastrinica, stress ossidativo, autofagia
Rispetto a piastrine isolate da soggetti sani, le piastrine isolate da pazienti con fibrillazione atriale (FA), pazienti con sindrome metabolica (SM) e fumatori sono maggiormente reattive come dimostrato dall’aumento:
- dell’aggregazione in risposta al collagene (74,6±4,1 % vs 81,6±1,5 % FA, p=0,03; 74,6±4,1 % vs 82,33±1,6 % SM, p=0,02; 74,6±4,1 % vs 82,0±2,6 % fumatori, p=0,03) (Figura 1A) e
- dall’aumento della produzione di Trombossano B2 (129,7±6,8 pg/ml vs 159,0±11,8 pg/ml FA, p=0,002; 129,7±6,8 pg/ml vs 146,7±4,7 pg/ml SM, p=0,001; 129,7±6,8 pg/ml vs 138,0±5,5 pg/ml fumatori, p=0,008) (Figura 1B).
Su altri campioni degli stessi gruppi di soggetti è stato inoltre valutato il grado di autofagia mediante l’analisi quantitativa della proteina associata ai microtubuli LC3, che è un marker dell’autofagosoma.
L’analisi condotta mediante western blot ha dimostrato che l’espressione della proteina LC3 è significativamente ridotta nelle piastrine di pazienti rispetto a quella di soggetti sani (1,95±0,07 AU vs 0,075±0,07 AU FA, p=0,0005; 1,95±0,07 AU vs 0,3±0,14 AU SM, p=0,0008; 1,95±0,07 AU vs 0,29±0,24 AU fumatori, p=0,0007) (Figura 2A).
A questa evidenza si associa inoltre un incremento di stress ossidativo, come dimostrato dall’aumento significativo della produzione di H2O2 (5,1±0,4 µM vs 8,6±1,5 µM FA, p<0,001; 5,1±0,4 µM vs 11,17±1,4 µM SM, p<0,001; 5,1±0,4 µM vs 9,8±1,0 µM fumatori, p<0,001) (Figura 2B).
L’effetto sinergico esercitato dai componenti dell’agente attivo delle composizioni descritte è stato dimostrato a seguito di trattamento delle piastrine con i componenti somministrati singolarmente e in combinazione.
I risultati dimostrano che il trattamento delle piastrine con i componenti somministrati singolarmente non induce cambiamenti significativi:
- nella aggregazione piastrinica (Figura 1C, E, G), - nella produzione di trombossano (Figura 1D, F, H), - nel processo autofagico (Figura 2C, E, G),
- nello stress ossidativo (Figura 2D, F, H).
Al contrario, la somministrazione delle due composizioni (“Mix1”) e (“Mix2”) riduce in maniera significativa:
- l’aggregazione piastrinica (Figura 1C, E, G),
- i livelli di trombossano (Figura 1D, F, H),
- lo stress ossidativo (Figura 2D, F, H),
e determina un aumento dei processi autofagici (Figura 2C, E e G).
Le composizioni oggetto della presente descrizione inoltre proteggono le cellule HUVEC dallo stress ossidativo indotto da H2O2, favoriscono l’angiogenesi e la vitalità cellulare.
Lo stress ossidativo e la biodisponibilità di NO sono stati valutatati in seguito a stimolazione delle cellule con H2O2.
In particolare, il trattamento con i singoli componenti della prima composizione (“MIX1”) e della seconda composizione (“Mix2”) determina una riduzione non significativa nella produzione di H2O2 e un aumento non significativo della biodisponibilità di NO (Figura 3A e B).
Allo stesso modo, non ci sono variazioni significative nella vitalità cellulare (Figura 3C) e nel numero di vasi (Figura 3D).
Di contro, il pre-trattamento con le composizioni descritte di cellule HUVEC stimolate con H2O2 induce una riduzione significativa della produzione di H2O2 (Figura 3A), un aumento della biodisponibilità di NO (Figura 3B), un aumento della vitalità cellulare (Figura 3C) e del numero di vasi sanguigni (Figura 3D).
Le composizioni qui descritte pertanto, grazie all’effetto sinergico esercitato dai diversi componenti, sono in grado di contrastare significativamente i danni esercitati dallo stress ossidativo e potenziare la funzione endoteliale attraverso un meccanismo mediato dall’autofagia.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione antiossidante contenente un agente attivo, detto agente attivo comprendendo nicotinamide, spermidina e almeno un ulteriore componente scelto fra trealosio e lentztrealosio.
  2. 2. Composizione antiossidante secondo la rivendicazione 1, in cui la quantità di nicotinamide è compresa tra 0,01 e 3% (peso/peso) dell’agente attivo.
  3. 3. Composizione antiossidante secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui la quantità di spermidina è compresa tra 0,001 e 1% (peso/peso) dell’agente attivo.
  4. 4. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui la quantità di trealosio e/o lentztrealosio è compresa tra 96,5 e 99,95% (peso/peso) dell’agente attivo.
  5. 5. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui il rapporto in peso tra la quantità di nicotinamide e la quantità di spermidina è compreso tra 100:1 e 3:1.
  6. 6. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui detto principio attivo comprende inoltre almeno un inibitore delle trealasi, preferibilmente scelto fra treazolina e validoxilamina A.
  7. 7. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui la composizione comprende almeno un ulteriore componente selezionato nel gruppo costituito acqua, vitamine, minerali, additivi, sostanze aromatizzanti.
  8. 8. Composizione antiossidante secondo la rivendicazione 7, in cui detto ulteriore componente è compreso in una quantità in peso compresa tra 1% e 100% (peso/peso) rispetto al peso dell’agente attivo.
  9. 9. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, detta composizione essendo somministrata sotto forma di compresse, granuli da sciogliere in acqua o in bevande e/o come soluzione acquosa preformata.
  10. 10. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, in cui la composizione è somministrata come supplemento nutrizionale orale.
  11. 11. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, per l’uso in medicina.
  12. 12. Composizione antiossidante secondo una qualsiasi rivendicazione precedente, per l’uso nel trattamento di una malattia da stress ossidativo selezionata nel gruppo costituito da infiammazione, insufficienza cardiaca, malattia aterosclerotica, malattie neurodegenerative, neoplasie, steatosi epatica, diabete mellito.
  13. 13. Composizione antiossidante per l’uso secondo la rivendicazione 12, in cui l’infiammazione comprende uno stato infiammatorio acuto o cronico.
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