IT201800008017A1 - Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio - Google Patents
Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio Download PDFInfo
- Publication number
- IT201800008017A1 IT201800008017A1 IT102018000008017A IT201800008017A IT201800008017A1 IT 201800008017 A1 IT201800008017 A1 IT 201800008017A1 IT 102018000008017 A IT102018000008017 A IT 102018000008017A IT 201800008017 A IT201800008017 A IT 201800008017A IT 201800008017 A1 IT201800008017 A1 IT 201800008017A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- probe
- nucleotide sequence
- nucleic acid
- target nucleotide
- pna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 13
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 67
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 35
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 15
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 14
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 5
- 108091046915 Threose nucleic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- -1 hexitol nucleic acid Chemical class 0.000 claims description 3
- 102100032050 Elongation of very long chain fatty acids protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000921368 Homo sapiens Elongation of very long chain fatty acids protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical group NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 claims description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 2
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 31
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 4
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 4-pentoxyphenol Chemical compound CCCCCOC1=CC=C(O)C=C1 JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyputrescine Chemical compound NCCC(O)CN HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100096579 Drosophila melanogaster sqd gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical class C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- LHIJANUOQQMGNT-UHFFFAOYSA-N aminoethylethanolamine Chemical compound NCCNCCO LHIJANUOQQMGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/119—Reactions demanding special reaction conditions pH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/137—Concentration of a component of medium
Description
DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
“METODO E KIT PER LA RIVELAZIONE E/O LA QUANTIFICAZIONE DI UNA SEQUENZA NUCLEOTIDICA BERSAGLIO”
La presente invenzione è relativa a un metodo e a un kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione basati su un sistema a due sonde di acido nucleico.
Stato della tecnica
L’analisi degli acidi nucleici su differenti campioni biologici (biopsie, siero, plasma, colture cellulari) è fondamentale per lo studio e la diagnosi precoce di molte malattie (es. Alzheimer, cancro, osteoartrite, malattie infettive) oltre ad avere sempre maggiori applicazioni nei campi veterinario, agricolo e alimentare.
Gli acidi nucleici interessanti da analizzare sono DNA genomico, RNA messaggero (mRNA), RNA ribosomiale (rRNA), RNA di trasporto (tRNA), RNA eterogeneo nucleare (hnRNA, premRNA) e piccole sequenze di RNA (small RNA). Gli small RNA si dividono in: microRNA (miRNA), piccolo RNA nucleare (snRNA), short interfering RNA (siRNA), piwi-interacting RNA (piRNA).
I microRNA sono i più interessanti acidi nucleici da analizzare per lo studio e la diagnosi precoce di molte malattie. I microRNA sono corte sequenze di RNA (acido ribonucleico) da 18-24 nucleotidi e regolano l’espressione genica a livello trascrizionale e post-trascrizionale andando a legare, inibendolo, l’mRNA bersaglio. Sono stati descritti moltissimi miRNA in differenti specie (in particolare nei mammiferi) e spesso le differenze di sequenza (quindi effetto) è dovuta alla variazione di un singolo nucleotide. La loro numerosità e la loro similarità rende necessario lo sviluppo di metodi altamente specifici capaci di riconoscere differenze a livello di singolo nucleotide. I microRNA hanno le potenzialità per essere la prossima generazione di biomarker per la diagnosi precoce di numerose malattie. Infatti oggi molti nuovi biomarker scoperti sono proprio microRNA, che risultano essere implicati nella regolazione di numerosi sistemi biologici e malattie, tra cui vari tipi di cancro, malattie neurodegenerative, muscoloscheletriche (es. osteoartrite, Alzheimer).
La principali tecniche ad oggi utilizzate per l’analisi degli acidi nucleici sono la PCR (reazione a catena della polimerasi) e il sequenziamento diretto. Queste tecniche richiedono molto tempo per avere i risultati, personale altamente qualificato per l’esecuzione e risultano essere molto costose. Un altro limite di queste tecniche è dovuto alla loro facile alterazione da componenti presenti nei campioni biologici, quali ad esempio Ca+, proteasi, nucleasi e/o dalla qualità e tipo dei tamponi utilizzati per raccogliere ed estrarre il campione (per esempio concentrazione di EDTA, SDS). Per questo un altro limite di queste tecniche è la preparazione, estrazione e purificazione del campione prima dell’analisi vera e propria che tende ad allungare i tempi e ad aumentare i costi. In particolare, per i microRNA, le tecniche oggi in uso (PCR e sequenziamento) e i prodotti in commercio non sono soddisfacenti a causa di tecnologie complesse, poco riproducibili e specifiche (non ottimizzate per corte sequenze), costose, che richiedono molto tempo e personale altamente qualificato e risultano essere incompatibili con la strumentazione e il workflow diagnostico clinico.
Un metodo che eviti l’uso della PCR è stato descritto in EP2639312. Questo metodo prevede l’uso di oliognucleotidi a DNA e anticorpi in grado di riconoscere gli ibridi DNA/RNA, ma non permette ancora di ottenere risultati in modo sufficientemente semplice, riproducibile e sensibile.
È pertanto un oggetto della presente invenzione fornire un metodo per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione, che risolva i succitati problemi in un modo semplice ed efficiente. In particolare il metodo deve presentare alta sensibilità, specificità, affinità, stabilità, facilità nella standardizzazione, basso costo e rapidità di esecuzione.
Questo oggetto è ottenuto mediante la presente invenzione in quanto relativa a un metodo come definito nella rivendicazione 1.
È un ulteriore oggetto della presente invenzione fornire un kit come definito nella rivendicazione 9.
Definizioni
A meno che definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati nella presente hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona normalmente esperta nella tecnica a cui è relativa questa invenzione. Nonostante nella pratica o nella valutazione della presente invenzione possano essere utilizzati molti materiali e metodi simili o equivalenti a quelli descritti nella presente, di seguito sono descritti i materiali e metodi preferiti. A meno che menzionato altrimenti, le tecniche descritte nella presente per uso con l’invenzione sono metodologie standard ben note alle persone normalmente esperte nella tecnica.
Breve descrizione delle Figure
La Figura 1 rappresenta una vista schematica degli elementi utilizzati nel metodo secondo l’invenzione.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Con riferimento alla Figura 1, il metodo per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio 3 in un campione comprende le seguenti fasi.
In una prima fase viene fornita la sequenza nucleotidica bersaglio 3 a singolo filamento.
Non è necessaria previa amplificazione della sequenza nucleotidica bersaglio 3, ma la stessa deve essere fornita in forma di singolo filamento.
La sequenza nucleotidica bersaglio può essere di DNA genomico, RNA messaggero (mRNA), RNA ribosomiale (rRNA), RNA di trasporto (tRNA), RNA eterogeneo nucleare (hnRNA, premRNA) e piccole sequenze di RNA (small RNA): microRNA (miRNA), piccolo RNA nucleare (snRNA), short interfering RNA (siRNA), piwi-interacting RNA (piRNA).
Preferibilmente, la sequenza nucleotidica bersaglio 3 è un microRNA (miRNA).
Tipicamente, la sequenza nucleotidica bersaglio 3 ha una lunghezza da 10 a 50 nucleotidi, preferibilmente da 18 a 30 nucleotidi.
Il campione che comprende la sequenza nucleotidica bersaglio 3 può essere costituito da fluidi biologici tra sangue, siero, plasma, liquido sinoviale, saliva tal quali o diluiti in buffer e da colture cellulari, biopsie, tessuti solo con un passaggio di omogeneizzazione e lisi senza necessità di passaggi di estrazione/purificazione e amplificazione. Preferibilmente il campione è una cellula vivente.
In una seconda fase, la sequenza nucleotidica bersaglio 3 a singolo filamento è ibridizzata con una prima sonda 1 di acido nucleico a singolo filamento e con una seconda sonda 2 di acido nucleico a singolo filamento.
La prima sonda 1 è immobilizzata ad una estremità a un supporto solido 4 e comprende, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una prima porzione 5 di sequenza nucleotidica bersaglio 3.
Il supporto solido 4 è selezionato dal gruppo costituito da cellulosa, nitrocellulosa, cellulosa acetato, destrano crosslinked, agarosio, polistirene, polipropilene, nylon, ceramica, vetro, metallo tipo oro e argento, magnetite e combinazioni degli stessi. Il supporto solido 4 può inoltre essere costituito da cellule, liposomi e vescicole di fosfolipidi. Preferibilmente, il supporto solido 4 è costituito da micropiastre da 48, 96, 384 pozzetti, biglie magnetiche, biglie d’oro o argento, microparticelle, strips, fogli da cromatografia, tubi, stecca, materiali da filtri.
La sonda 1 è può essere coniugata a molecole adatte alla coniugazione alla fase solida, ad esempio: lisina, arginina, tioli, cisteine, glucatione.
La seconda sonda 2 è marcata a un’estremità e comprende, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una seconda porzione 6 di sequenza nucleotidica bersaglio 3.
La seconda sonda 2 può essere coniugata a una o più molecole, ad esempio: glicina, lisina, arginina.
Preferibilmente, la seconda sonda 2 è marcata mediante biotina, molecole fluorescenti (ad esempio cyanine, alexafluor), fluorescina.
Il risultato della seconda fase è la formazione di un complesso prima sonda-sequenza nucleotidica bersaglioseconda sonda.
Preferibilmente, la prima sonda 1 e la seconda sonda 2 sono costituite da un acido nucleico selezionato dal gruppo costituito da PNA (acido peptidonucleico), LNA (locked nucleic acid), morfolino, orn-PNA (PNA con scheletro di ornitina), aep-PNA (aminoetilprolil-PNA), aepone-PNA (amminoetilpirrolidone-PNA), GNA (acido nucleico glicolico), HNA (hexitol nucleic acid), TNA (threose nucleic acid), ENA (2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid), ANA (arabino nucleic acid), F-ANA (2’-F-arabino nucleic acid). Ancor più preferibilmente la prima sonda 1 e la seconda sonda 2 sono costituite da PNA (acido peptidonucleico), ancor più preferibilmente PNA con una struttura scheletro modificata in cui il carbonio-alfa ha come sostituente la catena laterale dell’arginina o della lisina.
Utilizzare sonde 1, 2 costituite da PNA permette di aumentare stabilità, specificità e sensibilità del metodo. Caratteristiche simili si possono ottenere anche con l’uso di altri oligonucleotidi artificiali quali, ad esempio, gli LNA e i morfolino.
La natura non carica dello scheletro dei PNA è una importante caratteristica che fa sì che l’affinità di legame tra due filamenti di PNA e DNA o RNA sia molto più forte di quella tra due filamenti di DNA o RNA, proprio in virtù dell’assenza di repulsione elettrostatica. La maggiore stabilità dei doppi filamenti contenenti PNA si traduce in una più elevata temperatura di fusione. Complessi PNA con DNA o RNA sono più sensibili alla presenza di un singolo mismatch rispetto ai complessi formati da due filamenti di DNA o RNA. I PNA presentano un’elevata stabilità biologica; sono, infatti, resistenti all’attacco di nucleasi e proteasi, sia nel siero umano che nelle cellule o in estratti cellulari, di conseguenza il tempo di vita è esteso sia in vitro che in vivo. Alla resistenza alla degradazione enzimatica si accompagna, poi, una elevata stabilità chimica. Grazie a queste caratteristiche dei PNA e alla possibilità di operare a pH fisiologico (pH 7,2) come dimostrato nell’esempio 3, il metodo può essere usato in cellule viventi.
Il metodo può inoltre essere usato a concentrazioni saline tra 0 mM e 1000mM.
Preferibilmente, la prima sonda 1 e/o la seconda sonda 2 sono costituite da un numero di nucleotidi da 10 a 18.
Preferibilmente, la prima porzione 5 e la seconda porzione 6 di sequenza nucleotidica bersaglio hanno in comune da 2 a 10 nucleotidi.
Preferibilmente, quando il metodo è utilizzato per la rivelazione e/o quantificazione di miRNA, la sonda 2 può comprendere una regione di 2-6 nucleotidi aggiuntivi, alla regione N-terminale, per aumentare la specificità solo ai miRNA maturi escludendo i pre-miRNA, come nella SEQ ID NO: 13 (PNA 2d) dove sono aggiunte 4 Timine (T) alla regione N terminale (si vedano esempi).
In una terza fase, il complesso prima sonda-sequenza nucleotidica bersaglio-seconda sonda è rivelato.
Preferibilmente, il complesso è rivelato mediante un sistema selezionato dal gruppo costituito da streptavidina/anticorpo coniugata con: enzima perossidasi (HRP singola, HRP20, HRP40, HRP80), PE (ficoeritrina), una molecola fluoresente (ad esempio cyanine, alexafluor, fluorescina.
Il kit per uso nel metodo secondo la presente invenzione comprende:
- una prima sonda 1 come descritta sopra;
- una seconda sonda 2 come descritta sopra;
- opzionalmente almeno una soluzione tampone selezionata dal gruppo costituito da SSC5x, SSC05x, SSC5x Tween 0,05/0,01%, SSC 0,5x Tween 0,05/0,01%, SSC2,5x SDS 1/0.5%, SSC2,5x SDS 0.1/0.05% BSA 5/10%, SSC5x SDS 0.1/0.05% BSA 5/10%, PBS, PBS Tween 0,05/0,1%, buffer fosfato tra un pH 5.8 e un pH 7.2, buffer fosfato tra un pH 5.8 e un pH 7.2. SDS 0.1/0.05%.
Esempi
Di seguito sono descritte le sequenze nucleotidiche bersaglio 3 e le sonde 1 e 2 utilizzate negli esempi.
Sequenze nucleotidiche bersaglio. DNA e RNA da 22 basi singolo filamento, prodotti di sintesi acquistati da Sigma-Aldrich. (Sono sottolineati i punti di mismatch)
Sonde 1 e 2 a PNA, prodotte da Bioridis con sintesi automatica peptidica.
Legenda: K: lisina; G: Glicina; AEEA: Aminoetiletanolamina; ac: acetilato; K Biot: lisina con biotina coniugata sulla catena laterale.
Preparazione fase solide. Sono state testate due tipologie di fasi solide con differenti sistemi di coniugazione per valutare la capacità del metodo su differenti supporti solidi: a) Nunc Immobilizer Amino (Thermo-Fischer), micropiastre da 96 pozzetti con una superficie con un stabile gruppo elettrofilo per legare gruppi carichi positivamente; b) Nunc Maxisorp (Thermo-Fischer) micropiastre da 96 pozzetti con una superficie idrofobica/idrofilica adatta a legare molti tipi di molecole differenti, cariche eletricamente o neutre. Le sonde 1 sono state coniugate alle fasi solide seguendo il protocollo proposto del fornitore.
Buffer. SSC5x (750 mM NaCl, 75 mM sc pH 7.0); SSC5x T (750 mM NaCl, 75 mM sc pH 7.0, Tween 0.05); SSC5x S (750 mM NaCl, 75 mM sc EDTA 0.5mM; SDS 0.05%, pH 7.0), SSC2.5x S (375 mM NaCl, 37.5 mM sc EDTA 0.5mM; SDS 0.05% pH 7.0;); SSC0.5x (75 mM NaCl, 7,5 mM sc pH 7.0); SSC0.5x T(75 mM NaCl, 7,5 mM sc pH 7.0; Tween 0.05); PBS (8,1mM Na2HPO4; KH2PO4 1.7mM; KCl 0.27mM; NaCl 137mM; pH 7.2); PBST (8,1mM Na2HPO4; KH2PO4 1.7mM; KCl 0.27mM; NaCl 137mM; pH 7.2; Tween 0.05/0.1); Buffer fosfato, BF5,8 (100mM NaP; 100mM NaCl EDTA 0.5mM pH 5,8) BF5,8 S (100mM NaP; 100mM NaCl EDTA 0.5mM SDS 0.05% pH 5,8); Buffer fosfato, BF7,2 (100mM NaP; 100mM NaCl EDTA 0.5mM pH 7,2); Buffer fosfato, BF7,2 S (100mM NaP; 100mM NaCl EDTA 0.5mM SDS 0.05% pH 7,2)
Sistema di rilevamento.
I sistemi di rilevamento testati negli esempi ed utilizzati nel metodo sono stati: Chemiluminescente, colorimetrico e fluorescente, utilizzati seguendo le linee guida dei protocolli dei fornitori. I dati sono stati acquisiti con un BIOTEK Synergy HT seguendo le linee guida di utilizzo e di impostazione. Le misure sono state espresse in RLU (relative luminescence units) per il chemiluminescente (valore massimo 4,5*10<6 >RLU) e colorimetrico (valore massimo 4,500 RLU) e in RFU (relative fluorescence unit, valore massimo 99998 RFU) per la fluorescenza (i risultati di quest’ultimo esperimento non sono mostrati). ;Esempio 1 ;Metodo. RNA NA1 sono stati diluiti in SSC 0.5 T0.1% alla concentrazione di 150fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl sui pozzetti, precedentemente preparati con le sonde e lasciati ibridare per 3 h. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF5,8 con SDS 0.1% degli oligonucleotidi per l’ibridazione over-night (o.n). Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100ul in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. È stato aggiunto 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;Risultati ;;; ;;;
L’esempio dimostra il vantaggio dell’ibridazione tra le sonde 1 e 2 con la sonda bersaglio 3 a seconda dei nucleotidi coinvolti nella regione di sovrapposizione ;Esempio 2 (influenza concentrazione sali) ;Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote in SSC 0.5 (NaCl 75mM) T0.1% e in SSC 5x (NaCl 750nM) T0.1% alla concentrazione 150fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 3 h. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF5,8 e con SDS 0.1% della sonda 2c per l’ibridazione over-night (o.n). Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;;;
L’esempio dimostra la capacita del metodo a lavorare in ampi range di forza ionica (Concentrazione NaCl tra 750mM e 75mM) ;Esempio 3 (stabilità al variare del pH) ;Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote in SSC 5x alla concentrazione 150fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 3 h. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF5,8 o BF7,2 e con SDS 0.05% della sonda 2c per l’ibridazione over-night (o.n). Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ; ;;;
L’esempio dimostra la capacita del metodo a lavorare in ampi range di pH, in particolare a pH fisiologico e cellulare (pH 7.2) ;Esempio 4 (tempi ibridazione ridotti, no over night) Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote in SSC 5x alle concentrazioni 150fmoli/ml, 15fmoli/ml, 1.5fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 90min. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF7,2 con SDS 0.05% della sonda 2c per l’ibridazione 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;
L’esempio dimostra la capacita del metodo a lavorare in tempi rapidi (5h) senza necessità di passaggi overnight. ;Esempio 5 (effetto cariche positive) ;Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote in SSC 5x alla concentrazione 15fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 90min. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF7,2 con SDS 0.05% della sonda 2c o 2d o 2e per l’ibridazione 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;; ;;;
L’esempio mostra l’effetto delle cariche positive (inserite con la lisina) aggiunte alla sequenza sulla capacità di ibridazione. ;Esempio 6 (uso senza estrazione/purificazione in siero e cellule viventi) ;Metodo. Il siero e l’estratto sono stati trattati con una RNase inibitor (Thermo) e diluito 1:1 con SSC5x SDS 0.1% EDTA 1mM. RNA NA1 è stato diluito in aliquote alla concentrazione di 15fmoli/ml. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 90min. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 10nM in BF7,2 con SDS 0.05% della sonda 2c per l’ibridazione 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. E stato aggiunto 100ul di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;;
L’esempio dimostra la capacita del metodo a lavorare direttamente su campioni biologici: liquidi biologici (es. siero) o cellule viventi senza necessità di passaggi di estrazione e/o purificazione. ;Esempio 7 (single step) ;Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote in SSC 5x alla concentrazione 15fmoli/ml. Per una serie, della soluzione sono stati piastrati 100ul per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 90min. Dopo è stato tolto l’RNA e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti in una serie 10nM in BF7,2 con SDS 0.05% della sonda 2c per l’ibridazione e in nell’altra una soluzione con 15fmoli/ml di RNA NA1 con 10nM di 2c in BF7,2 con SDS 0.05% e lasciati ibridare per 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;;;
L’esempio dimostra la capacita del metodo a lavorare in tempi rapidi (3h) e con un singolo step di ibridazione. ;Esempio 8 (specificità del metodo) ;Metodo. RNA NA1, NA2, NA3, NA4 sono stati diluiti in aliquote alle concentrazione di 150fmoli/ml in SSC2.5x S, sono stati aggiunti 20nM della sonda 2d. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1d e lasciato ibridare per 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;;
L’esempio dimostra come il metodo sia altamente specifico anche a livello di singolo mismatch. ;Esempio 9 (confronto RNA e DNA). ;Metodo. RNA NA1, DNA NA5 sono stati diluiti in due aliquote alla concentrazione 150fmoli/ml in SSC2.5x S, sono stati aggiunti 20nM della sonda 2d. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 4h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). ;Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;;; ;;;
Il metodo può essere utilizzato anche per rilevare il DNA. La minore affinità per il DNA è vantaggiosa per l’uso con gli RNA perché permette un minor rischio di aspecifici derivati da eventuali frammenti di DNA. ;Esempio 10 (rilevamento colorimetrico) ;Metodo. RNA NA1 e NA2, sono stati diluiti in due aliquote alla concentrazione 150fmoli/ml e 15fmoli/ml (solo NA1) in SSC2.5x S, sono stati aggiunti 20nM della sonda 2d. Della soluzione sono stati piastrati 100µl per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciato ibridare per 4h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato Colorimetrico (TMB High sensitivity substrate, Biolegend). La reazione è stata bloccata dopo 10 min con l’aggiunta di 100ul di stop solution (Biolegend). La piastra è stata letta a 450nm come da protocollo. ; ;;
Il metodo risulta essere utilizzabile anche con la rilevazione colorimetrica e su un supporto solido differente da quello utilizzato nei precedenti esperimenti. ;Esempio 11 (sensibilità) ;Metodo. RNA NA1 è stato diluito in due aliquote alle concentrazioni di 150fmoli/ml, 15fmoli/ml 1.5fmoli/ml, 150amoli/ml, 15amoli/ml, 1,5amoli/ml, in SSC2.5x S, sono stati aggiunti 10nM della sonda 2d. Per ogni concentrazione, della soluzione sono stati piastrati 100ul per pozzetto, precedentemente preparati con la sonda 1b e lasciati ibridare per 2h. Dopo sono stati tolti gli oligonucleotidi e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl in PBST della SA-HRP40 alla concentrazione di 0,1 µg/ml per 60min. Dopo è stata tolta la SA-HRP40 e i pozzetti sono stati lavati. Sono stati aggiunti 100µl di substrato chemiluminescente (Clarity, Biorad). Acquisizioni effettuate dopo 5 min. ;Il limite di rilevamento (LOD limited of detection) calcolato come il rumore+(3*deviazione standard) è inferiore alla concentrazione di 1,5 amoli/ml (ultimo punto dell’esempio).
Dai risultati mostrati negli esempi è evidente come il metodo secondo l’invenzione presenti alta sensibilità, specificità, affinità, facilità e rapidità di esecuzione.
In particolare, utilizzando sovrapposizioni parziali di tre oligonucleotidi (le due sonde e l’acido nucleico bersaglio) si ottengono vantaggi fino ad ora mai ottenuti.
Infine, è chiaro che possono essere fatte modifiche e varianti al metodo e kit descritti e illustrati senza allontanarsi dall’ambito di protezione delle rivendicazioni allegate.
Claims (2)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio (3) in un campione comprendente le fasi di: - fornire la sequenza nucleotidica bersaglio (3) a singolo filamento; - ibridizzare la sequenza nucleotidica bersaglio (3) a singolo filamento con una prima sonda (1) di acido nucleico a singolo filamento e con una seconda sonda (2) di acido nucleico a singolo filamento, la prima sonda (1) essendo immobilizzata ad una estremità a un supporto solido (4) e comprendendo, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una prima porzione (5) di sequenza nucleotidica bersaglio (3), la seconda sonda (2) essendo marcata a un’estremità e comprendendo, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una seconda porzione (6) di sequenza nucleotidica bersaglio (3), in modo da formare un complesso prima sonda-sequenza nucleotidica bersaglio-seconda sonda; - rivelare il complesso prima sonda-sequenza nucleotidica bersaglio-seconda sonda. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la prima sonda (1) e la seconda sonda (2) sono costituite da un acido nucleico selezionato dal gruppo costituito da PNA (acido peptidonucleico), LNA (locked nucleic acid), morfolino, orn-PNA (PNA con scheletro di ornitina), aep-PNA (aminoetilprolil-PNA), aepone-PNA (amminoetilpirrolidone-PNA), GNA (acido nucleico glicolico), HNA (hexitol nucleic acid), TNA (threose nucleic acid), ENA (2'-O,4'-C-ethylenebridged nucleic acid), ANA (arabino nucleic acid), F-ANA (2’-F-arabino nucleic acid). 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui la prima sonda (1) e la seconda sonda (2) sono costituite da PNA (acido peptidonucleico). 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la sequenza nucleotidica bersaglio (3) è un microRNA (miRNA). 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la prima porzione (5) e la seconda porzione (6) di sequenza nucleotidica bersaglio hanno in comune da 2 a 10 nucleotidi. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la prima sonda (1) e/o la seconda sonda (2) sono costituite da un numero di nucleotidi da 10 a 18. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui il campione è una cellula vivente. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la seconda sonda (2) è marcata mediante biotina, molecole fluorescenti o fluoresceina. 9. Kit per uso nel metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente: - una prima sonda (1) di acido nucleico a singolo filamento, la prima sonda (1) essendo immobilizzata ad una estremità a un supporto solido (4) e comprendendo, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una prima porzione (5) di una sequenza nucleotidica bersaglio (3), - una seconda sonda (2) di acido nucleico a singolo filamento, la seconda sonda (2) essendo marcata a un’estremità e comprendendo, all’estremità opposta, una sequenza complementare a una seconda porzione (6) di sequenza nucleotidica bersaglio (3). 10. Kit secondo la rivendicazione 9, comprendente inoltre almeno una soluzione tampone selezionata dal gruppo costituito da SSC5x, SSC05x, SSC5x Tween 0,05/0,01%, SSC 0,5x Tween 0,05/0,01%, SSC2,5x SDS 1/0.5%, SSC2,5x SDS 0.1/0.05% BSA 5/10%, SSC5x SDS 0.1/0.05% BSA 5/10%, PBS, PBS Tween 0,05/0,1%, buffer fosfato tra un pH 5.8 e un pH 7.2, buffer fosfato tra un pH 5.8 e un pH 7.
- 2. SDS 0.1/0.05%.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102018000008017A IT201800008017A1 (it) | 2018-08-09 | 2018-08-09 | Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio |
| EP19769900.2A EP3833781B1 (en) | 2018-08-09 | 2019-08-09 | Method for detecting and/or quantifying a target nucleotide sequence |
| PCT/IB2019/056785 WO2020031142A1 (en) | 2018-08-09 | 2019-08-09 | Method and kit for detecting and/or quantifying a target nucleotide sequence |
| KR1020217007187A KR20210044253A (ko) | 2018-08-09 | 2019-08-09 | 표적 뉴클레오티드 서열을 검출 및/또는 정량화하는 방법 |
| CN201980053397.1A CN112689681A (zh) | 2018-08-09 | 2019-08-09 | 用于检测和/或定量靶核苷酸序列的方法和试剂盒 |
| US17/265,285 US20210301330A1 (en) | 2018-08-09 | 2019-08-09 | Method and kit for detecting and/or quantifying a target nucleotide sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT102018000008017A IT201800008017A1 (it) | 2018-08-09 | 2018-08-09 | Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT201800008017A1 true IT201800008017A1 (it) | 2020-02-09 |
Family
ID=64049586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT102018000008017A IT201800008017A1 (it) | 2018-08-09 | 2018-08-09 | Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210301330A1 (it) |
| EP (1) | EP3833781B1 (it) |
| KR (1) | KR20210044253A (it) |
| CN (1) | CN112689681A (it) |
| IT (1) | IT201800008017A1 (it) |
| WO (1) | WO2020031142A1 (it) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014028793A1 (en) * | 2012-08-17 | 2014-02-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Cyclopentane-peptide nucleic acids for qualitative and quantitative detection of nucleic acids |
| US20160046988A1 (en) * | 2014-08-12 | 2016-02-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Detection of nucleic acids |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101182579B (zh) * | 2007-11-19 | 2010-12-08 | 中国科学院上海微***与信息技术研究所 | 一种无需扩增基因组dna的纳米探针芯片及检测方法 |
-
2018
- 2018-08-09 IT IT102018000008017A patent/IT201800008017A1/it unknown
-
2019
- 2019-08-09 US US17/265,285 patent/US20210301330A1/en active Pending
- 2019-08-09 EP EP19769900.2A patent/EP3833781B1/en active Active
- 2019-08-09 CN CN201980053397.1A patent/CN112689681A/zh active Pending
- 2019-08-09 WO PCT/IB2019/056785 patent/WO2020031142A1/en active Search and Examination
- 2019-08-09 KR KR1020217007187A patent/KR20210044253A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014028793A1 (en) * | 2012-08-17 | 2014-02-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Cyclopentane-peptide nucleic acids for qualitative and quantitative detection of nucleic acids |
| US20160046988A1 (en) * | 2014-08-12 | 2016-02-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Detection of nucleic acids |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HIDEYUKI ARATA ET AL: "Rapid microRNA detection using power-free microfluidic chip: coaxial stacking effect enhances the sandwich hybridization", THE ANALYST, vol. 137, no. 14, 1 January 2012 (2012-01-01), UK, pages 3234, XP055571818, ISSN: 0003-2654, DOI: 10.1039/c2an16154k * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112689681A (zh) | 2021-04-20 |
| EP3833781A1 (en) | 2021-06-16 |
| WO2020031142A1 (en) | 2020-02-13 |
| US20210301330A1 (en) | 2021-09-30 |
| EP3833781B1 (en) | 2022-09-28 |
| KR20210044253A (ko) | 2021-04-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gagnon et al. | RNAi factors are present and active in human cell nuclei | |
| Pitchiaya et al. | Dynamic recruitment of single RNAs to processing bodies depends on RNA functionality | |
| Raguseo et al. | Chemical-biology approaches to probe DNA and RNA G-quadruplex structures in the genome | |
| Duan et al. | An ssDNA library immobilized SELEX technique for selection of an aptamer against ractopamine | |
| EP3030548B1 (en) | Transcriptome-wide design of selective, bioactive small molecules targeting rna | |
| Sztuba-Solinska et al. | Unveiling the druggable RNA targets and small molecule therapeutics | |
| JP2019512489A (ja) | マイクロｒｎａおよびその使用方法 | |
| EP1959012A3 (en) | Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of microRNAs and their target mRNAs | |
| ES2689568T3 (es) | Sondas de oligonucleótidos monocatenarias para la enumeración de copias de cromosomas o genes | |
| US20160257669A1 (en) | Specific targeting of rna expanded repeat sequences | |
| US9957548B2 (en) | Methods of capturing sperm nucleic acids | |
| EP4060047A1 (en) | Method for detecting or quantifying oligonucleotide | |
| Liu et al. | Noncoding RNAs that associate with YB-1 alter proliferation in prostate cancer cells | |
| WO2015007293A1 (en) | Stem-loop silver nanocluster probes for mirna detection | |
| Haniff et al. | A structure-specific small molecule inhibits a miRNA-200 family member precursor and reverses a type 2 diabetes phenotype | |
| CN103898119B (zh) | 一种多西紫杉醇的核酸适配体、核酸适配体衍生物及其用途 | |
| Haga et al. | Rapid generation of miRNA inhibitor leads by bioinformatics and efficient high-throughput screening methods | |
| Zhang et al. | A one-pot strategy for the sensitive detection of miRNA by catalyst–oligomer-mediated enzymatic amplification-based fluorescence biosensor | |
| IT201800008017A1 (it) | Metodo e kit per la rivelazione e/o la quantificazione di una sequenza nucleotidica bersaglio | |
| ES2659747T3 (es) | Ensayo de doble sonda para la detección de poblaciones heterogéneas de amplicón | |
| CN107532216A (zh) | 寡核苷酸的同步检测及其相关的试剂盒和用途 | |
| US20220049284A1 (en) | Method of detecting or method of quantifying oligonucleotides | |
| KR101678946B1 (ko) | 25-하이드록시 비타민 디3에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 그 용도 | |
| WO2015033237A1 (en) | Nucleotide sequences, nucleic acid sensors and methods thereof | |
| EP4234714A1 (en) | Multiplexed system for the detection of disease-related micrornas in biological samples |