IT201800005072A1

IT201800005072A1 - Nuovi farmaci prosenescenza

Info

Publication number: IT201800005072A1
Application number: IT102018000005072A
Authority: IT
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2019-11-04

Description

"NUOVI FARMACI PROSENESCENZA”

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce all’uso di attivatori di recettori degli acidi retinoidi e a composizioni che li comprendono, per uso come farmaci attivatori della senescenza cellulare. In particolare si riferiscono all’uso di attivatori di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cis-retinoico per uso come farmaco attivatore della senescenza cellulare in un metodo di trattamento del tumore.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

La senescenza è uno stato in cui la cellula, in risposta a precisi stimoli, perde la capacità replicativa pur mantenendosi metabolicamente attiva. Essa svolge ruoli fisiologicamente importanti durante i processi di invecchiamento e risulta essere cruciale nel contrastare la crescita incontrollata delle cellule tumorali. Nonostante le cellule senescenti si trovino in uno stato non proliferativo, rimangono comunque metabolicamente attive e iniziano a secernere un ampio numero di citochine e fattori pro-infiammatori, assumendo quindi un fenotipo secretorio (senescence-associated secretory phenotype, SASP). Questo “secretoma” è in grado di attivare la risposta immunitaria antitumorale e promuovere la rimozione delle cellule senescenti stesse (“sorveglianza della senescenza”). Incrementare la senescenza cellulare in un contesto tumorale porta ad un arresto della crescita della neoplasia ed all’attivazione della risposta immunitaria, la quale può essere sfruttata nella terapia oncologica.

Ad oggi esiste un numero limitato di composti in grado di promuovere la senescenza cellulare i quali esibiscono scarsa specificità per le cellule tumorali.

Scopo della presente invenzione è fornire nuove sostanze con attività pro senescenza per uso nel trattamento dei tumori o ad altre patologie associate in cui risulta utile l’attivazione della senescenza cellulare.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione si basa sulla scoperta che l’attivazione dei recettori degli acidi retinoidi è in grado d’indurre selettivamente la senescenza delle cellule tumorali, tale scoperta è supportata dagli esperimenti riportati in dettaglio nella relativa sezione sperimentale della presente descrizione. Gli autori della presente invenzione hanno infatti identificato nuovi composti in grado di promuovere la senescenza cellulare in un modello tumorale che prevede la delezione del gene oncosoppressore Pten.

Pertanto un primo oggetto della presente invenzione sono attivatori di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cis-retinoico per uso come induttore della senescenza cellulare in un metodo di trattamento, in particolare in un metodo di trattamento del tumore.

Un secondo oggetto sono composizioni comprendenti attivatori di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cis-retinoico per uso come induttore della senescenza cellulare in un metodo di trattamento, in particolare in un metodo di trattamento del tumore.

Ulteriori vantaggi, così come le caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione preferite.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

Figura 1 Piattaforma di screening chemogenomico per l’identificazione di composti pro-senescenza in PICS. (A) Disegno sperimentale dello screening. Le cellule MEFs Pten-/- e MEF Pten wt sono state trattate a singola dose 10 µM in triplicato. La senescenza viene rilevata grazie all’inibizione della proliferazione cellulare (saggio Crystal Violetto) e dal saggio dalla positività della β-Galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal). I composti che sono in grado di inibire la proliferazione ed incrementare la senescenza nei MEF Pten null vengono testati per l’IC50. Solamente i composti che sodisfano questi filtri verranno poi sottoposti a test successivi per indagare la senescenza tramite marcatori addizionali, successivamente testati su linee cellulari di cancro, ed infine su modelli preclinici in vivo. (B). Rappresentazione grafica dello screening. A partire da più di 90000 composti, questo approccio chemogenomico l’identificazione di composti e geni in grado di incrementare la senescenza indotta dalla perdita di Pten (PICS, Pten loss induced cellular senescence).

Figura 2 Attivazione dei recettori RARγ-RXRγ come strategia pro-senescente. (A) Lo screening pro-senescente ha dimostrato che l’attivazione dei recettori degli acidi retinoidi (RAR e RXR subunità γ) è una strategia per incrementare la PICS. Questo è dimostrato utilizzando tre diverse piccole molecole (small molecules) in grado di attivare i recettori RARγ-RXRγ, Adapalene, Acitracina e Bexarotene. (B) I nostri dati dimostrano un forte decremento della proliferazione cellulare dei MEF Pten null ma non nei MEF Pten wt. Nei MEF Pten null l’attivazione dei recettori RARγ-RXRγ è in grado di incrementare la PICS, come dimostrato dal saggio di SA-β-Gal. (C) Questi dati sono stati validati, testando i tre attivatori dei recettori RARγ-RXRγ anche in linee cellulari umane di cancro alla prostata, PC3. I nostri dati mostrano una forte inibizione della proliferazione cellulare ed un incremento della percentuale delle cellule SA-β-Gal positive rispetto al controllo (DMSO).

Figura 3 Attivazione dei recettori RARγ-RXRγ come strategia pro-senescente in linee cellulari di cancro. (A) Abbiamo validato l’attivazione dei recettori RARγ-RXRγ in un ampio pannello di linee cellulari umane di cancro alla prostata (22RV1, LNCaP, Du-145), linee cellulari di cancro alla prostata murine (TrampC1 e TrampC1 Pten null) e linee cellulari umane di cancro al colon, HTC116 ed HTC116 PTEN null trattate con Acitracina. I nostri dati dimostrano una forte inibizione nella proliferazione cellulare ed un conseguente incremento della percentuale delle cellule positive al saggio della SA-β-Gal (C). Questi dati sono stati validati trattando queste linee cellulari con Bexarotene, come dimostrano i dati di Crystal Violet i quali mettono in luce un arresto della proliferazione cellulare (B) e l’incremento della percentuale delle cellule positive al saggio di β-Galattosidasi (D).

Figura 4 Profilo trascrizionale di marcatori di senescenza in seguito all’attivazione dei recettori RARγ-RXRγ. Analisi trascrizionale di geni noti utilizzati come marcatori di senescenza (p16, P21, p27, PAI-1). In entrambe le linee cellulari umane di cancro alla prostata, PC3 (A) e LNCaP (B) tutti i marcatori di senescenza sono trascritti maggiormente (in grigio) rispetto al controllo non trattato (in nero).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Lo screening pro-senescente realizzato dagli inventori ha dimostrato che l’attivazione dei recettori degli acidi retinoidi (RAR e RXR subunità γ) è in grado di attivare la risposta senescente. I recettori dell’acido retinico sono noti anche come RAR e dell’acido 9-cis-retinoico come RXR. Un primo aspetto della presente invenzione riguarda quindi l’uso di attivatori di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cisretinoico in un metodo di trattamento, in particolare in un metodo di trattamento del tumore. Il tumore trattato potrà essere scelto ad esempio tra tumore del pancreas, prostata, polmoni, vescica, ghiandola mammaria, colo-retto, sarcomi, rene, tiroide. Nella presente descrizione con il termine “induttore della senescenza cellulare” s’intende una sostanza in grado di promuovere lo stato di senescenza cellulare.

Esempi di attivatori dei recettori degli acidi retinoidi sono Adapalene, Acitracina e Bexarotene. Di seguito a titolo esemplificativo è riportato la formula di struttura dell’Adapalene:

È oggetto della presente anche una composizione farmaceutica comprendente uno o più attivatori dei recettori degli acidi retinoidi ed un veicolante e/o un diluente per uso come attivatore della senescenza in un metodo di trattamento di una qualsiasi delle condizioni da trattare riportate nella presente descrizione. La composizione comprendente l’attivatore potrà essere orale, parenterale, rettale, transdermica, topica o idonea per altra via di somministrazione. Le composizioni per uso secondo la presente invenzione potranno essere somministrate mediante qualsiasi mezzo convenzionale disponibile per uso unitamente a farmaci, o come agenti terapeutici individuali o in una combinazione di agenti terapeutici. Essi possono essere somministrati da soli, ma generalmente somministrati con un veicolante farmaceutico scelto sulla base della via di somministrazione scelta e della pratica farmaceutica standard. Il dosaggio somministrato, ovviamente, varierà dipendentemente da fattori noti, come le caratteristiche farmacodinamiche del particolare agente e dalla sua modalità e via di somministrazione; dall'età, salute e peso del ricevente; dalla natura e grado dei sintomi, dal tipo di trattamento concomitante; dalla frequenza di trattamento; e dall'effetto desiderato. Si può prevedere che un dosaggio giornaliero di ingrediente attivo sia di circa 0,001 fino a 1000 milligrammi (mg) per chilogrammo (kg) di peso corporeo, con la dose preferita che è di 0,1 fino a circa 30 mg/kg. Forme di dosaggio (composizioni adatte per somministrazione) tipicamente contengono da circa 1 mg a circa 100 mg di ingrediente attivo per unità di dosaggio. In queste composizioni farmaceutiche, l'ingrediente attivo sarà normalmente presente in una quantità di circa 0,1-95% in peso in base al peso totale della composizione.

L’attivatore, o la composizione che lo comprende, potrà essere somministrato per via orale in forme di dosaggio solide, come capsule, compresse, e polveri, o in forme di dosaggio liquide, come elisir, sciroppi, e sospensioni. Esso può essere somministrato anche per via parenterale, in forme di dosaggio liquide sterili. Capsule di gelatina contengono l'ingrediente attivo e veicoli polverizzati, come lattosio, amido, derivati di cellulosa, stearato di magnesio, acido stearico, e simili. Diluenti simili possono essere usati per preparare compresse pressate. Sia compresse che capsule possono essere fabbricate come prodotti a rilascio prolungato per fornire rilascio continuo di medicazione per un periodo di alcune ore. Compresse pressate possono essere rivestite di zucchero o rivestite con pellicola per coprire qualsiasi sapore sgradevole e proteggere la compressa dall'atmosfera, o rivestite con rivestimento enterico per la disintegrazione selettiva nel tratto gastro-intestinale. Forme di dosaggio liquide per somministrazione orale possono contenere coloranti e aromi per aumentare l'accoglienza da parte del paziente. In generale, acqua, un olio adatto, soluzione salina, destrosio acquoso (glucosio), e soluzioni di zuccheri collegati e glicoli come glicole propilenico o glicoli polietilenici sono veicoli adatti per soluzioni parenterali. Soluzioni per somministrazione parenterale contengono preferibilmente un sale solubile in acqua dell'ingrediente attivo, adatti agenti stabilizzanti, e, se necessario, sostanze tamponanti. Agenti antiossidanti come sodio bisolfito, sodio solfito, o acido ascorbico, da soli o combinati, sono agenti stabilizzanti adatti. Vengono usati anche acido citrico e suoi sali e sodio EDTA. Inoltre soluzioni parenterali possono contenere conservanti, come cloruro di benzalconio, metil- o propil-parabene, e clorobutanolo. Le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione potranno comprendere uno o più ingredienti attivi, cioè sostanze farmacologicamente attive, in particolare chemioterapici, come ad esempio Docetaxel e/o Palbociclib. I chemioterapici potranno ad esempio essere usati nei dosaggi noti la tecnico del settore.

Sono qui descritti anche i metodi di trattamento terapeutico o cosmetico delle condizioni patologiche sopra dette comprendente un passaggio di somministrazione dell’attivatore o di composizioni che li comprendono.

Sono qui descritti anche kit di parti comprendenti una composizione contenente attivatori dei recettori degli acidi retinoidi, quali ad esempio Adapalene, Acitracina o Bexarotene ed una composizione comprendente un chemioterapico, preferibilmente Docetaxel e/o Palbociclib ed il loro uso nel trattamento terapeutico delle condizioni patologiche sopra dette.

Sono di sotto riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio le metodologie rivelate nella presente descrizione, tali esempi non sono in alcun modo da considerare come una limitazione della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.

SPERIMENTAZIONE

Allo scopo di selezionare efficacemente sostanze in grado di promuovere la senescenza è stata implementata la piattaforma sviluppata e descritta in Kalathur, M. et al. A chemogenomic screening identifies CK2 as a target for pro-senescence therapy in PTEN-deficient tumour Nat. Commun.6, 7227 (2015).

Al fine di poter identificare nuovi composti che possano essere rapidamente traslati alla clinica, senza andare incontro a problemi di sicurezza, tossicità e farmacocinetica, abbiamo scelto di testare l’abilità pro-senescente di farmaci già approvati in clinica in ambito oncologico e per il trattamento di malattie di varia natura (500 composti).

Il nostro studio è implementato con una libreria di 90000 composti che comprende: (1) nuove entità chimiche;

(2) composti in fase avanzata di sviluppo;

(3) farmaci già utilizzati in clinica per la cura di patologie di natura non oncologica (Neurologia, HIV, virologia ecc.) (Figura 1.A).

La piattaforma che abbiamo messo a punto nel nostro laboratorio è in grado di identificare i composti in grado di attivare la senescenza cellulare sulla base di due parametri: (1) l’arresto della proliferazione cellulare e (2) l’incremento della percentuale delle cellule positive al saggio di β-Galattosidasi (SA-β–Gal, marcatore di senescenza). La potenzialità pro-senescente di questi composti viene testata su fibroblasti murini embrionali (MEF) Pten-/- e WT (Figura 1.B).

Lo screening di composti pro-senescenti permette di filtrare i composti sulla base di tre proprietà:

- Efficacia: il farmaco testato in triplicato, ad una singola concentrazione (10 µM), nei MEF Pten-/- deve essere in grado di apportare una massiccia diminuzione della proliferazione cellulare ed incrementare la percentuale di cellule positive al saggio di SA- β –Gal.

- Specificità: il farmaco testato in triplicato, ad una singola concentrazione (10 µM), nei MEF Pten-/- e wt deve essere in grado di apportare una massiccia diminuzione della proliferazione cellulare ed incrementare la percentuale di cellule positive al saggio di SA- β –Gal nelle cellule Pten-/-senza impattare negativamente sui MEFs wt.

- Dose-Risposta: il farmaco testato in duplicato nel saggio di dose-risposta, sia nelle MEF Pten-/- che wt deve permettere il calcolo dell’IC50. I dati di ogni piastra sono stati normalizzati sul rispettivo controllo negativo, a seconda della popolazione cellulare, Ptenfl/fl e Pten-/- (Fig 1A, B).

Come risultato finale di questo screening di più di 90000 composti, abbiamo identificato RARγ-RXRγ come bersaglio da attivare per instaurare ed incrementare la senescenza cellulare.

I recettori dell’acido retinico (noti come RAR) e dell’acido 9-cis-retinoico (noti come RXR) appartengono, rispettivamente, alla prima e alla seconda classe di recettori intracellulari. A differenza dei RARs, la caratteristica degli RXRs è che quando viene attivato non dimerizza con i recettori della stessa classe ma con altri recettori orfani o appartenenti alla prima classe. Il ligando naturale di questi recettori è l’acido retinoico.

L'acido retinoico è un metabolita che interviene nelle funzioni della vitamina A (retinolo) necessarie per la crescita e lo sviluppo. È fondamentale nello sviluppo embrionale in quanto necessario per la polarizzazione antero-posteriore dell’embrione.

I nostri dati mostrano che la selettiva attivazione dei recettori degli acidi retinoidi (RAR, RXR subunità γ) è in grado di attivare la risposta senescente. Questi dati sono stati validati con tre diversi composti: Adapalene, Acitracina e Bexarotene (Figura 2.A). Il trattamento con questi composti è in grado di arrestare la proliferazione cellulare specificatamente nei MEF Pten null, senza impattare sulla proliferazione dei MEF Pten wt (Figura 2.B). Specularmente a questo l’attivazione dei RARγ-RXRγ in grado di incrementare la percentuale delle cellule senescenti nei MEF Pten-/- all’80%, come dimostrato dai saggi di SA-β-Gal. (Figura 2.B).

Questo dato è stato successivamente confermato testando gli effetti dell’attivazione dei RARγ-RXRγ in PC3, una linea cellulare umana di cancro alla prostata. Anche in questo caso abbiamo testato 3 diversi attivatori (Acitracina Adapalene, Bexarotene), i quali hanno portato, in tutti e tre i casi, ad un massiccio arresto della proliferazione ed incremento delle cellule SA-β-Gal positive, rispetto al controllo non trattato (DMSO) (Figura 2.C)

Successivamente abbiamo validato la capacità pro-senescente dell’attivazione dei RARγ-RXRγ su un vasto pannello di linee cellulari di cancro umane (22RV1, LNCaP, Du-145, HTC116 ed HTC116 PTEN null) e murine (TrampC1 e TrampC1 Pten null) (Figura 3.A B). In tutte queste linee, in seguito al trattamento con Acitracina (Figura 3.A) o Bexarotene (Figura 3.B) abbiamo osservato una inibizione della proliferazione cellulare rilevata grazie al saggio del Crystal Violetto. I nostri dati mostrano un incremento della percentuale di cellule SA-β-Gal positive, indice della senescenza cellulare nelle cellule trattate sia con Acitracina (Figura 3.C) o Bexarotene (Figura 3.D) In seguito, abbiamo indagato l’espressione genica dei marcatori di senescenza p16, p21, p27 e PAI-1, in seguito all’attivazione dei RARγ-RXRγ. Per questo scopo abbiamo utilizzato come modello PC3 e LNCaP, due linee cellulari umane di cancro alla prosata. Le cellule sono state trattate per 48 ore con Adapalene alla dose di 10 µM e 5µM rispettivamente, e successivamente sono state collezionate per gli studi trascrizionali. Entrambe le linee cellulari trattate con gli attivatori di RARγ-RXRγ mostrano in forte incremento di tutti i marcatori di senescenza rispetto al controllo non trattato (Figura 4.A e B).

In aggiunta sono stati eseguiti ulteriori esperimenti per il test di Chou-Talalay al fine di stabilire se gli agonisti di RARγ-RXRγ agiscono in maniera additiva o sinergica con i convenzionali farmaci chemioterapici nell’arresto della proliferazione cellulare.

Brevemente questo test valuta la sinergia o gli effetti additivi ottenuti dalla combinazione di due farmaci a concentrazioni scalari. Come output di questo si ottiene il valore di “Chou-Talalay index“ che è l’indice della forza sinergica dei due composti, più basso è questo valore, più forte è l’azione congiunta dei due farmaci utilizzati (0-0.3 Forte sinergismo; 0.3-0.9 Sinergismo; 0.9-1.1 Effetto additivo; superiore a 1.1 Non vi è alcun beneficio).

In questo saggio sono stati utilizzati farmaci agonisti di RARγ-RXRγ in combinazione con Docetaxel o Palbociclib. I nostri dati mostrano che nel modello in vitro TrampC1 il trattamento di Docetaxel e Adapalene ha effetto additivo (Chou-Talalay Index 1.09), mentre il trattamento combinato di Docetaxel e Bexarotene ha un effetto sinergistico (Chou-Talalay Index 0.86). Analogamente l’attivazione di RARγ-RXRγ tramite Acitracina accoppiata al trattamento con Palbociclib ha effetto additivo (Chou-Talalay Index 1.1). Abbiamo valutato il Chou Talalay index anche sulla linea cellulare PC3 ed abbiamo osservato che in questo modello il trattamento con Palbociclib ed Adapalene ha effetto additivo (Chou-Talalay Index 1.1).

In conclusione i nostri dati mostrano che sia in linee cellulari primarie, che in linee cellulari di cancro, umane e murine, l’attivazione dei RARγ-RXRγ è in grado di portare le cellule in senescenza.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Attivatore di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cis-retinoico per uso come induttore della senescenza cellulare in un metodo di trattamento.
2. Attivatore per uso secondo la rivendicazione 1 in cui detto metodo di trattamento è un metodo di trattamento del tumore.
3. Attivatore per uso secondo la rivendicazione 2 in cui detto tumore è scelto tra tumore del pancreas, prostata, polmoni, vescica, ghiandola mammaria, colo-retto, sarcomi, rene, tiroide e melanoma.
4. Attivatore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in associazione ad un farmaco chemioterapico, in particolare in associazione al Docetaxel e/o Palbociclib.
5. Attivatore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detto recettore è scelto tra RARγ e RXRγ.
6. Attivatore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detto attivatore è scelto tra Adapalene, Acitracina e Bexarotene.
7. Attivatore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6 in cui: -detto attivatore è Bexarotene e detto chemioterapico è Docetaxel; o -detto attivatore è Acitracina e detto chemioterapico è Docetaxel; o -detto attivatore è Bexarotene e detto chemioterapico è Palbociclib.
8. Composizione farmaceutica per uso come induttore della senescenza cellulare in un metodo di trattamento di un tumore comprendente un attivatore di un recettore dell’acido retinico e/o dell’acido 9-cis-retinoico e uno o più veicolanti e/o diluenti e/o eccipienti.
9. Composizione farmaceutica per uso secondo la rivendicazione 8 in cui detto tumore è scelto tra tumore del pancreas, prostata, polmoni, vescica, ghiandola mammaria, colo-retto, sarcomi, rene, tiroide.
10. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 9 ulteriormente comprendente uno o più chemioterapici, in particolare Docetaxel o Palbociclib.
11. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10 cui detto recettore è scelto tra RARγ e RXRγ.
12. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 11 cui detto attivatore è scelto tra Adapalene, Acitracina e Bexarotene.
13. Composizione farmaceutica per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 12, in cui: -detto attivatore è Bexarotene e detto chemioterapico è Docetaxel; o -detto attivatore è Acitracina e detto chemioterapico è Docetaxel; o -detto attivatore è Bexarotene e detto chemioterapico è Palbociclib.