HUT77806A - Antigénspecifikus immunválaszt alulszabályozó peptidkészítmények - Google Patents

Description

Antigénspecifikus immunválaszt alulszabályozó peptid-készítmények

Immulogic Pharmaceutical Corporation, WALTHAM, MA, US

Feltalálók: Malcolm L. GEFTER, LINCOLN, MA, US

Ze'ev SHAKED, BERKELEY, CA, US

Malcolm MORVILLE, SHREWSBURY, MA, US

A bejelentés napja: 1994. 09. 02.

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US94/10262

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/07428

A TALÁLMÁNY HÁTTERE

Az emberi történelem kezdete óta az allergiák jelentik az emberi létezés átkát. Az allergiában szenvedők a sinusitis, rhinitis, viszkető könnyező szemek, orr és száj, allergiás asztma örökös vagy ismétlődő rohamaiban szenvednek, mely rohamok * \ 2 olyan komolyak is lehetnek, hogy kórházi kezelésre van szükség. A legkomolyabb emberi allergiás reakció az anaphylaxis, mely orvosi beavatkozás nélkül halált okoz.

A kevésbé komoly tünetek közül soknak az enyhítésére szolgáló gyógyszerészeti készítményeket fejlesztettek ki, mint például az antihisztaminok orális alkalmazását, az asztma elleni inhaláló készítményeket és a hordozható injekciós kiteket, melyek adrenalint tartalmaznak az anaphylaxiás sokk elnyomására az orvosi segítség megérkezéséig. Azonban ezek a gyógyszerészeti készítmények a hisztamin felszabadítás révén - mely a támadó allergén testbe való behatolásakor kezdődő humán immunválasz végeredménye - semmi egyebet nem tesznek mint lefedik a tüneteket. Azonkívül a hatékonyabb antihisztamin készítmények közül sok olyan nem kívánatos mellékhatással rendelkezik, mint a nyálkahártya túlzott szárazsága, vagy az álmosság.

Az elmúlt évtizedek során egy az emberek deszenzitizálását (deszenzibilizálását, érzékenységének megszüntetését) is magába foglaló terápiát fejlesztettek ki. Az deszenzitizálási terápia magába foglalja a támadó allergén nyers allergén kivonatának növekvő dózisokban való ismételt injektálását. Bár a klinikai területen az allergén kivonatokkal való kezelések valamelyest hatékonynak bizonyultak az allergénnel kapcsolatos tünetek csökkentésében, és a leggyakrabban alkalmazott általános terápiaként használják az allergia klinikákon, a deszenzitizálás mechanizmusa máig ismeretlen. Azonkívül, a deszenzitizálási terápiát különös figyelemmel kell alkalmazni, mivel a mellékhatások jelentősek, vagy akár halálosak is lehetnek (például anaphylaxis). így a beteg számára szükséges, hogy a nyers kivonat jelentősen nagyobb dózisú többszörös injekciózásán essen át és ezután egy vagy több óráig tartó orvosi megfigyelés alatt maradjon minden egyes injekciózás után. Ezenkívül, gyakran szükség van arra, hogy az allergiás beteg addig részesüljön kezelésben, míg eléri a fenntartási dózist, amihez gyakran heti egyszeri injekciózás szükséges 6-12 hónapon keresztül, valamint ezután 4-6 hétig. így ez a kezelés nagyon időigényes, kényelmetlen és nem mellékhatás mentes vagy veszélytelen a betegre nézve.

A deszenzitizálási immunoterápia hatékonyabbá és biztonságosabbá tételére tett kísérletekben számos kutató próbált módosított allergéneket kifejleszteni azzal a szándékkal, hogy az immunoterápia alatt előforduló immunológiai eseményeket befolyásolja (azaz az IgG antitestek blokkolását növelje, vagy az allergén specifikus IgE antitestek számát csökkentse). Az ilyen módosítások közé tartoznak az urea(kabamid)-denaturált allergének, Ishizaka et al., E.J. Immunoi. 114:100-115 (1975); az allergének formalinnal való kezelése révén létrehozott allergoidok, Norman et al., J. Allergy Clin Immunoi. 70:248-260 (1982); a tolerogénekhez, mint például a D-glutaminsav-D-lizinhez kötött allergének, Katz D., Immunology, 41:1-24 (1980); vagy a polietilénglikol, Sehon et al., J. Allergy Clin Immunoi. 64:242-250 (1979); és a glutáraldehid-polimerizált allergének, Metzger et al., N. Engi. J. Med. 295:1160-1164 (1976) előállítása és tesztelése.

Michael és munkatársai (4,338,297 számú US szabadalom) egy polipeptid aktív pollen immunoszuppresszánst írnak le, melyet a pollen antigén proteolitikus enzimes emésztésével állítottak elő, majd antipollen antitesttel tisztítottak, mely potenciálisan a deszenzitizálás során terapeutikumként használható fel. Később, ugyanez a csoport tett közzé olyan kísérletet, melyből az derült ki, hogy enzimatikus emésztésből származó fragmentekkel lehetőség van egerekben az immunválasz szuppresszálása olyan antigénekkel szemben, mint a szarvasmarha szérum és a mézelő méh venom foszfolipáz A2, (Michael et al., J. Clin Immunoi. 75:200 (abst.) (1985); (Ferguson et al., Cell Immunoi. 78:1-12 (1983)), továbbá azt találták, hogy a parlagfű pollen allergén proteinjeinek peptides emésztéssel történő fragmentálása és az 5-15 kD molekulasúlyú emésztési termékek egy parlagfű készítménnyel történő intraperitoneális immunizálás előtti vagy utáni alkalmazása az immunválasz szuppresszióját eredményezte (Michael et al., Clin Exp. Allergy, 20:669-674, 1990). Michael és munkatársai úgy vélték, hogy a parlagfűre adott immunválasz szuppressziójába beletartoznak a T sejtek is, valamint hogy a peptides emésztett anyag fragmentjei képesek az immunoszuppressziót szabályozó T sejteket stimulálni.

Ezenkívül, ugyanezen kutatócsoport klinikai hatékonyságra tesztelt egy a parlagfű peptikus fragmentjeit tartalmazó készítményt emberek esetében (Litwin et al., Clin Exp. Allergy 21:457-465, 1991). Ebben a vizsgálatban parlagfűtől szénanáthás betegek három csoportjátval kezdtek szezon előtti immunoterápiát. Az egyik csoport egy parlagfű antigénnel (Amb a I) dúsított hagyományos parlagfű készítményt - ezt nevezték 2-es Poolnak - kapott. A 2-es Poolban a proteinek körülbelül 26% Amb a l-et tartalmaznak. A 2-es Poolt enzimatikus emésztésnek vetették alá és a 10 kD vagy ennél kisebb méretű proteineket tartalmazó frakciót használták peptikus fragment készítményként és fSRW-nek jelölték. A harmadik csoport placebot kapott. Bár az eredmények azt jelezték, hogy a 2-es Poolt vagy az fSRW-t kapó csoportok esetében szignifikánsan csökkent a tünet-gyógykezelés arány a placebo csoporttal szemben, az fSRW és a 2-es Pool kezelés közötti különbség nem volt szignifikáns. így az fSRW peptikus emésztési készítmény nem érte el teljesen azt a célját, hogy szignifikáns hatásfokot biztosítson vagy kényelmet biztosítson egy hagyományos, egy allergén - mellyel szemben az egyén érzékeny nyers kivonatát tartalmazó immunoterápiás készítményhez viszonyítva és ennél • · fogva alkalmazását az Egyesült Államokban nem hagyták jóvá, vagy egy ilyen peptikus készítmény klinikai vizsgálatai folynak jelenleg az Egyesült Államokban.

Ezenkívül, egy protein allergén - mint amilyet Litwin és munkatársai leírtak peptikus fragmentjeit tartalmazó készítmény alkalmazása komoly hátrányokkal jár. Például a protein kivonatot, (2-es Pool) melyet azért vetettek alá emésztésnek, hogy létrehozzák az fSRW peptid készítményt, a kívánt Amb a I proteinben csupán 26%ban dúsították fel és bármilyen a 2-es Pool készítményben valószínűleg jelen levő eltérő proteinek és szennyeződések, átkerültek az fSRW emésztett anyagba. Litwin és munkatársai szerint az fSRW-ben levő Amb a I tartalom pontosan nem határozható meg, mert az fSRW alkotórészei nem maradnak oldatban. így az fSRW tartalmazhat nem kívánatos proteineket, melyek kedvezőtlen hatással lehetnek a kezelt betegre nézve és így nem biztosítanak előnyt a hagyományos nyers kivonat alkalmazásával szemben, sőt a klasszikus immunoterápiával kapcsolatos hátronyokkal jellemezhető. Ezenkívül egy nyers protein enzimatikus emésztése nem állandóan ugyanazt a peptid összetételt eredményezi minden egyes alkalommal. Ezért szinte lehetetlen egy állandó, pontosan meghatározott összetételű nagy tisztaságú gyógyszerként alkalmazható peptid készítményt létrehozni humán terápiás célokból, márpedig a világ legtöbb szabályozó hivatalában ezek a kívánalmak az enzimatikusan emésztett protein készítmények - a Litwin és munkatársai által leírt fSRW-hez hasonló készítmények - felhasználásával kapcsolatban.

Ezenkívül, az allergiához hasonlóan, az autoimmun betegségeket, mint az Ies típusú diabetest, a sclerosis multiplexet és a reumaszerű arthritist, általában egy antigén specifikus T sejt által közvetített válasz eredményének tekintik egy olyan antigénnel szemben, mely autoimmun betegség esetében a test saját szövete. Ezért • · , 6 úgy vélik, hogy az autoimmun betegség kezelésének egyik megközelítése, mely lényegében hasonló az allergiák kezeléséhez, megfelelő lenne. Például a WO 88/10120, a WO 91/08760, a WO 92/06704, a WO 93/21222 és a WO 94/07520 számú szabadalmak teljes autoantigének vagy ezek fragmentjeinek orális vagy enterális alkalmazását írják le mint például a mielin bázikus protein alkalmazását, (az MBP egy feltételezett autoantigén a sclerosis multiplexben) az inzulin alkalmazását a diabetes kezelésében, vagy a kollagén alkalmazását a reumaszerű arthritis kezelésében. A fent leírt okok miatt korlátozott az autoantigének klinikai alkalmazhatósága orális, enterális vagy aeroszolos alkalmazásban, például nem lehet jellemezni egy terápiás készítmény aktív komponensét ha egyszer bekerült a gyomorba a gyomorban lezajló enzimatikus lebontás következtében. így az előre megjósolható és reprodukálható terápiás hatások nehezen valósíthatók meg ezekkel a módszerekkel, nem is említve a kedvezőtlen mellékhatásokat, amik a test terapeutikumra vonatkozó további előre meg nem jósolható feldolgozási folyamataiból adódnak.

A jelen találmány legyőzi a fent leírt hátrányokat és módszert biztosít az allergiák és más emberekben előforduló protein antigénre adott immunválasszal kapcsolatos betegségek (például az autoimmun betegségek) kezelésére, pontosan meghatározott, nagy tisztaságú készítményeket használva, melyek legalább egy meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkező pepiidet tartalmaznak, ami legalább a protein antigén egy T sejt epítópját tartalmazza, és melyet nemimmunogén formában alkalmazunk. Előnyösen az emberek kezelésére szolgáló készítmények és módszerek a jelen találmánnyal összhangban klinikailag tesztelésre kerültek és sikeresnek bizonyultak. Ezen sikeres klinikai kísérletek szerteágazósága úgy tűnik örökre megváltoztatta az allergiás immunterápia arculatát, valamint • · megváltoztatják az autoimmun betegségek és más az immunválaszokkal kapcsolatos betegségi állapotok kezelésének menetét.

A TALÁLMÁNY ÖSSZEFOGLALÁSA

A jelen találmány terápiás készítményeket és módszereket biztosít egy antigénre, például egy protein antigénre adott antigén specifikus immunválasszal kapcsolatos betegség (például az allergiák és az autoimmun betegségek) kezelésére emberek esetében. A jelen találmány terápiás készítményei pontosan meghatározott összetételűek, nagy tisztaságú, újra létrehozható készítmények, melyek alkalmasak a humán terápiában való alkalmazásra. A jelen találmány előnyben részesített készítményei tartalmaznak legalább egy izolált, tisztított peptidet, mely mentes más polipeptidektől vagy szennyeződésektől, a peptid egy a kérdéses antigén legalább egy T sejt epitópját tartalmazó meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkezik. A jelen találmány egy terápiás készítménye képes lefelé szabályozni egy a kérdéses antigénre adott antigén specifikus immunválaszt olyan humán populációban, mely az antigén specifikus immunválasznak ki van téve, oly módon, hogy a betegség tünetei csökkennek vagy eltűnnek és/vagy a betegség tüneteinek megindulása vagy fokozódása akadályozódik vagy lassított.

A jelen találmány készítményei és módszerei felhasználhatók a protein allergénekkel, például a parlagfű, a füvek, a fák, a por részecskék (por), a macska, kutya és más állatok és bármilyen más levegő eredetű vagy kontakt allergénekkel szembeni érzékenység kezelésére emberek esetében. A jelen találmány készítményei és módszerei felhasználhatók az autoimmun betegségek, mint például a reumaszerű arthritis, a diabetes, a myasthenia gravis, a Grave-féle betegség, a Good Pasture-féle szindróma, a thyroiditis és a sclerosis multiplex kezelésére.

*> ·· ♦ · * * · • · « · • · · ·

A RAJZOK RÖVID LEÍRÁSA

Az 1. ábra a macska-teszt szindróma (orr, tüdő és teljes allergia) súlyosbodásának grafikus ábrázolását mutatja a kezelés után 1 és hat héttel a placebohoz viszonyított (PBO) párhuzamos összehasonlításban a teljes allergia szimptómák esetében 75 pg és 750 pg mennyiségeknél, a hatodik héten, a dózis válasz függvényében az 1. és 6. heti teszt trendeket a teljes allergiás tünetek esetében jelezzük (lásd a megcsillagozott adatokat).

A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

A jelen találmányban hivatkozott tudományos irodalom és szabadalom biztosítja a tudomány e területén képzett szekamberek számára elérhető ismeretanyagot Ily módon, a közzétett US szabadalmak, PCT alkalmazások és más idézett publikációk a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak.

A jelen találmány terápiás készítményeket és módszereket biztosít egy antigénre adott immunválasszal kapcsolatos betegségi állapotok emberek esetében történő kezelésére. A jelen találmány terápiás készítményei tartalmaznak legalább egy izolált, tisztított pepiidet, mely mentes minden egyéb proteintől és szennyeződéstől és meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkezik, mely maradékok az antigén legalább egy T sejt epitópját tartalmazzák. A találmány szerinti használatban az izolált kifejezés egy olyan pepiidre utal, mely mentes minden egyéb polipeptidtöl, szennyeződéstől, kiindulási reagenstől vagy egyéb anyagtól, és mely más molekulákhoz nem kapcsolódik. A jelen találmány készítménye vagy készítményei, ha egy betegnek nem immunogén formában adják terápiás ellátás során, képes lefelé szabályozni az antigén specifikus immunválaszt • · egy olyan emberi populációban, akik az antigén specifikus immunválasznak ki vannak téve.

A jelen találmány készítményei és módszerei felhasználhatók az olyan antigénekkel kapcsolatos betegségek kezelésére, mint a protein antigének, emberek esetén, azaz a parlagfű, füvek, fák, házipor részecskék (por), macska, kutya és más állatok és bármilyen levegő eredetű vagy kontakt allergénekre való allergiák esetében. A példák között leírt humán klinikai kísérletek a jelen találmány készítményeinek és módszereinek sikeres alkalmazását írják le a macskával szembeni humán allergia kezelésében. Ez a találmány felhasználható az olyan autoimmun betegségek kezelésében is, mint a reumaszerű arthritis, a diabetes, a myasthenia gravis, a Grave-féle betegség, a Good Pasture-szindróma, a psoriasis, a thyroiditis és a sclerosis multiplex, amikor a betegségért felelős antigén egy protein autoantigén.

A jelen találmánnyal összhangban egy peptid egy meghatározott aminosav maradékokból álló szekvenciára utal, ami előnyösen nem tartalmaz körülbelül 50 aminosav maradéknál több maradékot és magába foglal legalább körülbelül 7 aminosav maradékot és előnyösen legalább 12-40 aminosav maradék hosszúságú és még előnyösebben legalább 13-30 aminosav maradék hosszúságú, és mely ha egy protein antigénből származik a teljes protein antigén aminosav maradékainál kevesebb aminosav maradékot tartalmaz és előnyösen a teljes protein antigén aminosav maradékainak körülbelül 75%-ánál kevesebbet. A találmánnyal összhangban alkalmazott peptidek egy antigén legalább egy T sejt epitópját tartalmazzák. A T sejt epitóp a T sejt receptor felismerésének alapeleme vagy legkisebb egysége, ahol az epitóp tartalmazza a receptor felismeréshez létfontosságú aminosavakat. Úgy vélik, hogy a T sejt epitóp benne foglaltatik egy az

allergia klinikai tüneteiért felelős antigénre - például a protein allergénre - adott immunválasz beindulásában és állandósulásában. Úgy vélik, hogy ezek a T sejt epitópok váltják ki a korai immunválasz eseményeket a T helper sejtek szintjén, az antigént prezentáló sejt felszínén levő megfelelő HLA molekulához való kapcsolódás, valamint a megfelelő T sejt szubpopuláció stimulálása révén. Ezek az események a T sejt proliferációhoz, a limfokin szekrécióhoz, a helyi gyulladásos reakciókhoz, további immunsejtek az adott területre való gyűléséhez és a B sejt áradás aktiválásához vezetnek, ami antitestek termelését eredményezi. Ezen antitestek egyik izotípusa, az IgE, alapvető fontosságú az allergiás tünetek kiváltásában és ezek termelése a kiváltási események korai szakaszában szabályozódik a T helper sejtek szintjén a szekretált limfokinek természetén keresztül. Egy autoimmun betegség esetében a termelt antitestek egy autoantigén ellen termelt autoantitestek, melyek egy autoimmun betegség, például egy a myelin bázikus proteinnel - melyről feltételezik, hogy a sclerosis multiplex autoantigénje - szemben termelt autoantitestek.

A jelen találmánnyal összhangban egy terápiás/profilaktikus kezelési mód (egy támadó antigén által okozott betegség tünetei kialakulásának kivédését vagy késleltetését eredményezik, vagy a támadó antigén által okozott tünetek csökkenését, progresszióját vagy enyhülését eredményezik, azaz az antigén specifikus immunválaszt lefelé szabályozzák) magába foglalja nem immunogén formában (például hatásjavító nélkül) a jelen találmány egy terápiás készítményének alkalmazását, ami azt jelenti, hogy legalább egy olyan izolált pepiidet tartalmaz, mely a kezelendő betegségért felelős protein antigénből származhat (vagy egy immunológiailag kereszt reaktív protein antigénből származó pepiid lehet). Míg nem • · • · · · · · ·

• ·· · szándékozunk semmilyen elméletet korlátozni, úgy véljük, hogy a jelen találmány terápiás készítményének alkalmazása révén

a) T sejt érzéketlenséget idézünk elő a megfelelő T sejt szubpopulációban oly módon, hogy ezek nem reagálnak a támadó antigénre és nem vesznek részt egy immunválasz stimulálásában a támadó protein antigénnek való kitettség esetén (azaz anergia vagy apoptosis esetében);

b) módosítjuk a limfokin szekréciós profilt a természetesen előforduló támadó antigénnek való kitettséggel (például az IL-4 csökkenést és/vagy IL-2 növekedést eredményez);

c) a T sejt szubpopulációt, mely normális esetben részt vesz a támadó antigénre adott válaszban, eltávolítjuk a normális kitettség helyszínétől (például az orr nyálkahártya, bőr vagy tüdő allergia esetén) a készítmény alkalmazási helyszíne felé (a T sejt szubpopuláció ezen újraeloszlása csökkenti vagy javítja az egyén immunrendszerének azon képességét, hogy a szokásos immunválaszt stimulálja a támadó antigénnek való normális kitettsg helyszínén, ami az allergiás tünetek csökkenését eredményezi); vagy

d) a T sejt szuppresszor sejtek indukcióját eredményezi.

Miközben nem szándékozunk semmilyen elméletre sem korlátozódni, úgy véljük, hogy egy antigén specifikus immunválasz lefelé szabályozása indukálódik ha nem biztosítunk megfelelő kostimulációs szignált, melyre gyakran második szignálként utalnak. Röviden, úgy véljük, hogy a T sejtek stimulálása két típusú jelt (szignált) igényel, az első a T sejtek által történő felismerés az antigént prezentáló sejteken (APC-k) levő megfelelő MHC-kapcsolt feldolgozott antigének T sejt receptorain keresztül, a második típusú jelre kostimulációs jel(ek)ként utalunk, vagy második jelként, melyeket bizonyos kompetens APC-k biztosítanak. Amikor a találmány egy készítményét nem-immunogén forma nélkül (például hatásjavító nélkül) alkalmazzuk, úgy véljük, a kompetens APC-k, melyek képesek a második jelet, vagy a kostimulációs jelet létrehozni, nem vesznek részt a megfelelő T sejtek stimulálásában, ez pedig a T sejt érzéketlenséget vagy csökkent T sejt érzékenységet eredményez. Ezenkívül, számos olyan antitest vagy más olyan reagens van, melyek képesek a kostimulációs jelek, mint például a második szignál - ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a B7 (ideértve a B7-1, B7-2, és BB-1), a CD28, a CTLA4, a CD40, a CD40L, a CD54 és a CD11a/18 (Jenkins and Johnson, Current Opinion in Immunology, 5:361-367, 1993), Clark and Ledbetter, Natúré 367:425-428, 1994)) szállítását blokkolni. Ily módon, a jelen találmánnyal összhangban egy készítmény nem immunogén formában alkalmazható a fentiekben leírtaknak megfelelően, egy olyan reagenssel együtt, mely képes a kostimulációs jeleket blokkolni oly módon, hogy a T sejt érzéketlenség szintjét fokozza.

A jelen találmány készítményei és módszerei hasznosak olyan emberek kezelésében, akik bármilyen számú protein allergénnel szemben allergiásak, mint például a Dermatophagoides nemzetség protein allergénjével szemben; a Felis nemzetség egy protein allergénjével szemben; az Ambrosia nemzetség protein allergénjével szemben; a Lolium nemzetség protein allergénjével szemben; a Cryptomeria nemzetség protein allergénjével szemben; az Alternaria nemzetség protein allergénjével szemben; az Alder nemzetség protein allergénjével szemben; a Betula nemzetség protein allergénjével szemben; a Quercus nemzetség protein allergénjével szemben; az Olea nemzetség protein allergénjével szemben; az Artemisia nemzetség protein allergénjével szemben; a Plantago nemzetség protein allergénjével szemben; a Paríetaria nemzetség protein allergénjével szemben; a Canine nemzetség protein allergénjével szemben; a Blattella nemzetség protein allergénjével szemben; az Apis nemzetség protein allergénjével szemben; a Cupressus nemzetség protein allergénjével szemben; a Juniperus nemzetség protein allergénjével szemben; a Thuya nemzetség protein allergénjével szemben; a Chemaecyparis nemzetség protein allergénjével szemben; a Períplaneta nemzetség protein allergénjével szemben; az Agropyron nemzetség protein allergénjével szemben; a Secale nemzetség protein allergénjével szemben; a Triricum nemzetség protein allergénjével szemben; a Dactylis nemzetség protein allergénjével szemben; a Festuca nemzetség protein allergénjével szemben; a Poa nemzetség protein allergénjével szemben; az Avena nemzetség protein allergénjével szemben; a Holcus nemzetség protein allergénjével szemben; az Anthoxanthum nemzetség protein allergénjével szemben; az Arrhenatherum nemzetség protein allergénjével szemben; az Agrostis nemzetség protein allergénjével szemben; a Phleum nemzetség protein allergénjével szemben; a Phalaris nemzetség protein allergénjével szemben; a Paspalum nemzetség protein allergénjével szemben; és a Sorghum nemzetség protein allergénjével szemben.

A fent azonosított nemzetségek némelyikéből származó különböző ismert protein allergénekre szolgáló példák közé tartoznak például a Dermatophagoides (pteronyssinus vagy farináé) Dér p /; a Dér p II·, a Derp III, a Dér p VII, Dér fi; Dér fii, Dér flll, Dér FVII; a Felis (domesticus) Fel d I; Ambrosia (artemisfolia) Amb a 1.1; Amb a 1.2; Amb a 1.3; Amb a 1.4; Amb a II; Lollium (perenne) Lol p I; Lol p II; Lol p III; Lol p IV; Lol p IX (Lol p V vagy Lol p Ib); Cryptomeria (japonica) Cry j I; Cry j II; Can f I; Can f II; Juniperus (sabinoides vagy virginiana) Jun s I; Jun v I; Dactylis (glomerata) Dac g I; Poa (pretensis) Poa p I; Phl p / és a Sorghum (halepensis) Sor h

I.

Meghatározott, legalább egy T sejt epitópot tartalmazó aminosav maradék szekvenciával rendelkező peptidek - melyek T sejt érzéketlenséget, vagy csökkent T sejt érzékenységet indukálnak - kerültek azonosításra és izolálásra számos a fent megnevezett protein allergén esetében és ezek hasznosak a jelen találmány készítményeiben és módszereiben. Például a Dér p l-ből; Dér p ll-ből, a Dér f l-ből és a Dér f ll-ből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptidek az USSN

08/227,772 és az USSN 07/963,381 számú szabadalmakban kerültek leírásra, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak, és melyeket a WO 93/08279 számú alkalmazásban publikáltak. A Fel D l-ből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket az USSN 07/662,276, 07/884,718 és a 08/006,116 számú szabadalmakban írtak le, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak. Az Amb a 1.1-ből; az Amb a 1.2-ből; az Amb a 1.3-ból; az Amb a l.4-ből és az Amb a ll-ből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket az USSN 07/866,679 és a WO 93/21321 számú szabadalmakban írtak le, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak. A Lol p l-böl; Dac g l-ből, a Poa p l-ből és a Phl p l-ből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket az USSN 08/031,001 számú szabadalomban és a Lol p IX-ből (Lol ρ V vagy Lol p lb) származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket a WO 94/04564 és a 08/106,016 számú szabadalmakban írtak le, melyek a hivatkozás révén részét képezik a találmánynak. A Cry j l-ből és a Cry j ll-ből és a Jun s l-ből és a Jun v l-ből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket az USSN 08/226,248 számú szabadalomban írtak le, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A Can f l-ből és a Can f llből származó T sejt epitópokat tartalmazó peptideket az USSN 08/156,549 számú szabadalomban írtak le, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. A

Sor h l-ből származó T sejt epitópot tartalmazó peptideket az AU 93/00559 számú szabadalomban írtak le.

Számos antigénről (például autoantigénről) kiderült, hogy az autoimmun betegségek esetében betegségi tüneteket okoznak (például autoantigének, mint az inzulin, a myelin bázikus protein; az rh faktor; az acetilkolin receptorok; a thyroid sejt receptorok, az alap membrán proteinek; a thyroid proteinek; az ICA-69 (PM-1); a glutaminsav dekarboxiláz (64K vagy 65 K); a proteolipid protein (PLP), a myelinhez kapcsolódó glikoprotein (MAG), a Kollagén (ll-es típusú), a Hősokk Protein és a karboxipeptidáz H) autoimmun betegségek esetében, mint például a diabetes a reumaszerű arthritis és a sclerosis multiplex. Például a mielin oligodendrocita proteinből (MOG) - egy a sclerosis multiplexben szerepet játszó egyik autoantigénnek tartják - származó T sejt epitópokat tartalmazó peptidek kerültek leírásra az USSN 08/116824 számú szabadalomban, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. Az MBP-vel (mielin bázikus protein) - a sclerosis multiplexben egy autoantigénjének tartott protein - szembeni antigén specifikus válasz lefelé szabályozására képesnek vélt peptideket azonosítottak a WO 93/21222, az EP 0 304 279, a WO 91/15225, szabadalmakban, valamint Óta et al (Letters to Natúré 346:183-187 (1990)) és Wucherpfennig et al., (J. Exp. Med. 170:279-290 (1994)). Az oldható ll-es típusú kollagénnel - a reumaszerű arthritis egy autoantigénjének tartott protein - szembeni antigén specifikus válasz lefelé szabályozására képesnek vélt peptideket azonosítottak a WO 94/07520, és a WO

92/06704 számú szabadalmakban. A WO 92/06704 szabadalomban az inzulin peptidjeinek azonosítására szolgáló módszert írtak le, melyet hatékonynak tartanak az l-es típusú diabetes kezelésében és megelőzésében.

Ezenkívül, a meghatározott aminosav összetétellel, valamint T sejt epitópokkal rendelkező peptidek azonosíthatók bármilyen protein antigén vagy autoantigén esetében. Az egyik módszer magába foglalja a protein antigén nem átfedő vagy átfedő, kívánt hosszúságú peptidekké való felosztását és szintetizálását, tisztítását és ezen peptidek tesztelését annak céljából, hogy megállapítsuk, hogy a peptidek tartalmaznak-e legalább egy T sejt epitópot. Ehhez tetszőleges számú vizsgálatot végzünk el, például a T sejt proliferációs vizsgálatot, a limfokin szekréciós vizsgálatot és a T sejt érzéketlenségi vizsgálatokat). Egy másik módszerben egy algoritmust használunk az olyan peptidek kiszámítására, melyek valószínűleg tartalmaznak T sejt epitópokat , majd az algoritmus által kiszámított peptideket szintetizáljuk, tisztítjuk és teszteljük a T sejt vizsgálatokban annak meghatározása céljából, hogy a kiszámított peptidek okoznak-e T sejt proliferációt, vagy limfokin szekréciót, vagy T sejt érzéketlenséget és ezért valószínűleg tartalmaznak T sejt epitópot. Amint a korábban idézett dokumentumok közül sokban megvitatták, a humán T sejt stimuláló aktivitás tesztelhető ha egy előre meghatározott protein antigénre (például egy allergénre vagy egy autoantigénre) érzékeny egyénből származó T sejteket tenyésztünk egy antigénből származó pepiiddel és meghatározzuk, hogy a T sejtek proliferációja bekövetkezik-e a peptidre adott válaszként, ahogy azt például a tritiált timidin celluláris felvételén keresztül mérjük. A T sejtek peptidekre adott válaszainak stimulációs indexei kiszámíthatók a percenkénti maximális számmal (CPM) egy peptidre adott válaszként osztva a kontroll CPM-mel. A háttér szintnél kétszer nagyobb vagy azzal egyenlő T sejt stimulációs indexet (S.l.) pozitívnak tekintjük. A pozitív eredményeket használjuk a tesztelt peptid csoport egyes peptidjei átlagos stimulációs indexeinek kiszámításához. A jelen találmánnyal összhangban használható előnyben részesített peptidek legalább egy T sejt epitópot, előnyösen legalább két vagy több T sejt epitópot tartalmaznak és az átlagos T sejt stimulációs indexek 2,0 értékkel egyezőek vagy ennél magasabbak. Egy 2,0 értékű vagy annál nagyobb T sejt stimulációs indexszel rendelkező peptidet hasznos terápiás anyagnak tartunk. Az előnyben részesített átlagos T sejt stimulációs index legalább 2,5, még előnyösebben legalább 3,5, még előnyösebben legalább 4,0 és legelőnyösebben legalább 5,0.

Ezenkívül, az előnyben részesített peptidek pozitivitási indexe (P.l.) legalább 100, még előnyösebben legalább 150, még előnyösebben legalább 200 és legelőnyösebben legalább 250. Egy peptid pozitivitási indexét úgy határozzuk meg, hogy megszorozzuk az átlagos T sejt stimulációs indexet az egyén százalékával - a tesztelt antigénnel szemben érzékeny tesztelt egyének csoportjában (például legalább 9 egyén, előnyösebben legalább 16 egyén vagy több és még előnyösebben legalább 20 egyén vagy több, vagy még előnyösebben legalább 30 egyén vagy több) - akik a pepiidre reagáló T sejtekkel rendelkeznek. így a pozitivitási index egy peptiddel szembeni T sejt válasz erősségét (S.l.) és egy pepiidre adott T sejt válasz gyakoriságát is reprezentálja a tesztelt pepiidre érzékeny egyének populációjában.

Egy T sejt stimulációs aktivitással rendelkező, sikeresen használt peptidek kiszámítására szolgáló algoritmusról számoltak be Rothbard, 1 st Fórum in Virology, Annals of the Pasteur Institute, pp. 518-526 (December, 1986), Rothbard and Taylor, Embo, 7:93-100 (1988) és az EP 0 304 279 számú szabadalomban. Ezekben egy általános T sejt modell (algoritmus) meghatározásáról számolnak be, annak statisztikai jelentőségéről valamint ismert epitópokkal való korrelációjáról, valamint különböző protein antigének és autoantigének korábban nem meghatározott T sejt epitópok megállapításában elért sikerekről számolnak be. Egy a ll-es osztályú MHChez kötődő pepiidként ismert peptid általános modellje - amint arról a korábban . 18 említett dokumentumok beszámolnak - úgy tűnik egy töltéssel rendelkező aminosav maradékból, vagy két hidrofób maradékkal követett glicinből álló lineáris modellel rendelkezik. Miután meghatározásra kerül, hogy egy peptid igazodik-e az általános modellhez, a peptid T sejt reaktivitásra tesztelhető. A korábban nem meghatározott proteinek T sejt epitópjainak becslésére használt más algoritmusok közé tartoznak a Margalit és munkatársai által leírt (J. Immunoi. 138:2213-2229, 1987) algoritmus, mely egy amfipatikus helix modellen alapul.

Ezenkívül, kriptikus epitópokat tartalmazó peptidek is meghatározhatók, és ezek szintén felhasználhatók a jelen találmány módszereivel összhangban. Egy protein antigénben vagy protein autoantigénben a kriptikus epitópok olyan determinánsok, melyek a megfelelő MHC moelkulához való natív protein feldolgozásának és prezentációjának köszönhetően normálisan nem jellemzőek az immunrendszerre. Azonban egy kriptikus epitópot tartalmazó peptid képes a T sejteket nem fogékonnyá tenni, valamint ha az alanyt egy pepiiddel telítjük az alanyból nyert T sejtek in vitro proliferálódnak a peptidre vagy a protein antigénre melyből a peptid származik - adott válaszként. Egy protein antigénből vagy autoantigénből származó legalább egy kriptikus epitópot tartalmazó peptidekre kriptikus peptidekként utalunk. A kriptikus epitópok jelenlétének megerősítéséhez egy T sejt proliferációs vizsgálatot lehet elvégezni amint az a tudomány számára ismert és azt a fentiekben leírtuk. Ebben a vizsgálatban, az antigénnel telített T sejteket in vitro tenyésztjük az egyes peptidek jelenlétében, külön-külön, a peptidreaktív T sejt vonalak létrehozása céljából. Úgy véljük, hogy egy peptid tartalmaz legalább egy kriptikus epitópot, ha egy T sejt vonal hozható létre egy adott pepiiddel és a T sejtek képesek a proliferációra ha a peptid és a protein antigén - melyből a peptid származik - hatásának teszik ki ezeket.

···· ·» · t·

Lehetőség van a jelen találmány szerint alkalmazható fent leírt bármely peptid szerkezetének módosítására is olyan célokkal, hogy növeljük az oldékonyságot (különösen kívánatos, ha a készítményt injektálni fogják), növeljük a terápiás vagy megelőző hatásfokot, vagy stabilitást (például ex vivő tárolási idő és az in vivő proteolitikus lebomlásnak való ellenállás). Egy módosított peptid hozható létre melyben az aminosav szekvencia megváltozott ahhoz a natív protein szekvenciához képest, melyből származik, vagy a módosítandó pepiidhez viszonyítva - például szubsztitúcióval, delécióval, vagy addicióval az immunogenitás módosítása céljából, vagy melyhez egy komponenst adunk ugyanezzel a céllal. Például a WO 94/06828 számú szabadalomban olyan helyettesített peptidek kerültek leírásra, melyekben alapjában véve minden egyes aminosav maradék helyettesíthető egy konzervatív aminosavval, egy a természteben nem található aminosavval, vagy alaninnal és ennek ellenére a helyettesített peptid még mindig képes lefelé szabályozni az antigén specifikus immunválaszt. Ezenkívül, a fent idézett irodalmak közül sok különböző módosításokat ír le a meghatározott aminosav összetételű peptidek esetében, melyekről kimutatták, hogy T sejt érzéketlenséget indukálnak.

Ezenkívül, nem szükségszerű, hogy egy a jelen találmány módszerével összhangban alkalmazott peptid egy ismert antigén proteinből származzon. Bármilyen meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkező peptid, vagy mely képes egy antigénre vagy egy autoantigénre adott antigén specifikus immunválasz lefelé szabályozására képes peptid felhasználható a jelen találmány módszerével összhangban. Például a peptidek szintetizálhatók úgy, hogy nem egy ismert protein antigén szekvenciára alapozott meghatározott aminosav szekvenciát tartalmazzanak, és melyek mégis képesek egy antigén specifikus immunválaszt lefelé szabályozni, például a peptid a protein antigén egy T sejt epitópját utánozza és erre a protein antigénre adott immunválaszt képes lefelé szabályozni, vagy más ok miatt képes az immunválaszt lefelé szabályozni, úgymint egy közeli antigénből származik. Bármilyen elméletre való korlátozás nélkül, úgy véljük, hogy a közeli antigének, melyek szintén szövet specifikusak (de melyek az immun vagy az autoimmun támadásnak nem célpontjai) rendelkeznek azzal a tulajdonsággal, hogy hatással legyenek a szuppresszor T sejtekre az immuntámadás helyszínén, mely viszont az immunválasz lefelé irányuló szabályozását eredményezi az immuntámadás helyszínén (például az érintett saját szövet az autoimmun betegség esetében, vagy a nazális nyálkahártya, a bőr és a tüdő allergia esetében). A közeli antigének közé tartoznak az ezekre való korlátozá nélkül az antigén azon részei, melyek maguk nem célpontjai az immuntámadásnak, és mely részek szuppresszív aktivitásúak az immuntámadás helyszínén.

Ezenkívül, bármely egy antigénre vagy autoantigénre adott antigén specifikus immunválaszt lefelé szabályozni képes pepiidet utánozó vegyület felhasználható a találmánnyal összhangban. Az ilyen vegyületek nem állhatnak teljesen pepiid kötésekkel kapcsolódó alegységekből, de kapcsolódhatnak más kötéseken keresztül (például tiolészter kötések), feltételezve, hogy a nem peptid kötésű vegyület egy olyan peptidet utánoz, mely képes lefelé szabályozni egy a kérdéses antigénre adott antigén specifikus immunválaszt amint azt jelöltük, a tünetek hatékony terápiás/profilaktikus kezelésével.

Ezenkívül, a jelen találmánnyal összhangban alkalmazott peptid készítmények előnyösen tartalmazzák a támadó protein antigén T sejt epitópjainak megfelelő százalékát (azaz a kérdéses támadó antigén T sejt reaktivitásának legalább körülbelül 10 %-át még előnyösebben legalább körülbelül 20 %-át, még előnyösebben legalább 30 %-át, még előnyösebben legalább 40 %-át és még előnyösebben legalább 60 %-át vagy még többet) és úgy vannak jelen a készítményben, hogy a jelen találmánnyal összhangban egy adott protein antigénre érzékeny egyénnek a készítmény terápiás alkalmazásakor az egyén T sejtjeit érzéketlenné teszi a protein antigénnel szemben. Annak meghatározásához, hogy egy peptid (jelölt peptid) vagy a jelölt peptidek egy kombinációja valószínűleg a kérdéses protein antigén T sejt epitópjainak megfelelő százalékát tartalmazza a T sejt érzéketlenség indukálásához a protein antigénre érzékeny egyének jelentős százalékú populációjában egy algoritmus használható. Egy ilyen algoritmussal egyezően a peptid(ek)hez egy in vitro T sejt proliferációs vizsgálatban egy humán T sejt stimulációs index (korábban említettük) számítható ki az egyes tesztelt egyének esetében egy olyan populációban, ahol az egyének érzékenyek az adott protein antigénre. Az in vitro T sejt proliferációs vizsgálatban a fennmaradó peptidek átfedő peptidek (körülbelül 5-15 aminosav maradék között mutatnak átfedést), ami fedi a protein azon fennmaradó részét, melyet a jelölt (peptid(ek) nem fednek, mely fennmaradó peptidek legalább 12 aminosav hosszúságúak és melyek előnyösen 30 aminosav maradéknál nem hosszabbak, előnyösen 25 aminosav maradéknál nem hosszabbak. A tesztelt egyének populációjában az egyes egyénekből kapott T sejtekkel végzett in vitro T sejt proliferációs vizsgálatban létrehozott peptid sorozatban az egyes ilyen fennmaradó peptidek T sejt stimulációs indexét kiszámítjuk és egymáshoz adjuk. Az egyes egyének esetében a humán T sejt stimulációs indexet a jelölt peptid(ek) esetében elosztjuk a fennmaradó peptidek humán T sejt stimulációs indexének összegével a tesztelt peptid sorozatban a százalékos érték meghatározása céljából. Ezt a százalékot megkapjuk a kérdéses protein antigénre érzékeny legalább 20, előnyösen legalább 30 egyén esetében és meghatározzuk a százalék érték átlagát. A jelölt peptid(ek) körülbelül 10 % átlag százaléka, előnyösen körülbelül 20 %-a. előnyösen 30 %-a és még előnyösebben körülbelül 50 %-a vagy ennél nagyobb átlag százaléka együtt a legalább körülbelül 60 %-os, előnyösen legalább körülbelül 75 %-os, még előnyösebben legalább körülbelül 90 %-os szazálékos pozitivitással (a jelölt peptid vagy jelölt peptidek kombinációjára adott pozitív T sejt válaszok százalékaként került meghatározásra, (S.l. 2,0 értéknél nagyobb vagy azzal egyenlő)) azt jelzi, hogy a kiválasztott jelölt peptid(ek) valószínűleg elegendő százalékú T sejt epitópot tartalmaznak ahhoz, hogy a kérdéses protein antigénre érzékeny egyének populációjának egy jelentős százalékában T sejt érzéketlenséget indukáljanak.

Az allergia kezeléséhez, a találmány módszereivel összhangban, előnyben részesül, ha az ezzel együtt alkalmazott peptid nem köti az immunoglobulin E-t (IgE) vagy az lg E-t lényegesen kisebb mértékben köti (azaz legalább 100-szor kisebb kötődés, és még előnyösebben legalább 1000-szer kisebb kötődés) mint ahogy az a protein allergén köti, melyből a peptid származik. A standard immunoterápia fő komplikációja az IgE által közvetített válaszok, mint például az anaphylaxis. A immunoglobulin E az anaphylaxiás reakciók egy közvetítője, ami az antigén hízósejteken vagy bazofil sejteken levő IgE-hez való kötődéséből vagy keresztkötődéséből és a mediátorok felszabadulásából (például hisztamin, szerotonin, eozinofíl kemotatikus faktorok) adódik allergiás (atopiás) betegek esetében. így az anaphylaxis az allergénre érzékeny egyének kezelt populációjának jelentős százaléka esetében elkerülhető, ha az immunoterápia során egy olyan peptidet vagy peptideket használunk, melyek nem kötik az IgE-t az adott allregénre érzékeny egyének populációja jelentős százalékában (azaz legalább 75 %-ban), vagy ha a peptid kötődik az IgE-hez, az ilyen kötődés nem eredményezi a hízósejtekről vagy a bazofil sejtekről a mediátorok felszabadulását. Az anaphylaxis kockázata csökkenthető ha az immunoterápia során egy olyan peptidet vagy olyan peptideket használunk, melyek csökkent IgE kötő tulajdonságúak. Továbbá, a minimális IgE stimuláló aktivitással rendelkező peptidek kívánatosak a terápiás hatékonysághoz. A minimális IgE stimuláló aktivitás olyan IgE termelésre utal, ami kevesebb, mint a natív protein allergén (például a Dér ρ I) által stimulált IgE termelés és/vagy IL-4 termelés mennyisége. Ha egy peptid kötődik az IgE-hez, előnyben részesül, ha az ilyen kötődés nem eredményezi a mediátorok (például hisztamin) hízósejtekből vagy bazofil sejtekből történő felszabadulását. Annak meghatározása céljából, hogy vajon egy IgE-hez kötődő peptid a mediátorok felszabadulását eredményezi-e, egy hisztamin felszabadulási vizsgálat végzehető el például az Amac, Inc. (Westbrook, ME) cég standard reagenseit és eljárási leírását használva. Röviden, a tesztelendő peptid puffereit oldatát egy allergiás alany teljes heparinizált vérének azonos mennyiségével keverjük össze. Keverés és inkubálás után a sejteket pelletizáljuk és a felülúszót feldolgozzuk és rádió immunovizsgálatot használva analizáljuk a felszabadult hisztamin mennyiségének meghatározása céljából.

A jelen találmány terápiás készítményében használt minden más peptidtől és szennyeződéstől mentes nagy tisztaságú peptideket, melyek meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendlekeznek, és legalább egy T sejt epitópot tartalmaznak, előállíthatok szintetikusan is standard technikák felhasználásával. A peptidek kémiai szintetizálásának különböző módszerei ismertek a tudomány e területén, mint például a szilárd fázisú szintézis, amely a kereskedelemben beszerezhető peptid szintetizálókon teljesen vagy félig automatizált. A szintetikusan létrehozott peptidek ezután homogenitásig tisztíthatok (azaz legalább 90%, még előnyösebben legalább 95% és még előnyösebben legalább 97% tisztaságig), úgy, hogy mentesek legyenek minden más polipeptidtől és szennyezőanyagtól, és ehhez az irodalomban megadott protein tisztítási eljárásokban ismert számos technika áll rendelkezésre.

Egy a nagy tisztatású homogén pepiid készítmény előállítására szolgáló eljárással összhangban a szintetikus kémiai eszközökkel (vagy egy polimer támasztékhoz rögzített szilárd fázisú szintézis, vagy hagyományos homogén kémiai reakciókkal oldat szintézissel) létrehozott pepiid preparatív reverz fázisú kromatográfiás módszerekkel tisztítható. Ebben a módszerben a szintetikusan létrehozott nyers formában levő pepiidet egy megfelelő oldószerben feloldjuk (tipikusan vizes pufferben) és egy szeparációs oszlopra (tipikusan egy reverz fázisú szilika alapú közeg, ezenkívül polimer vagy szén alapú közeg is használható) helyezzük. A peptidet az oszlopról egy vizes pufferben (tipikusan TFA, trietilamin foszfát, acetát vagy valami hasonló puffer) levő szerves komponens (tipikusan acetonitril vagy metanol) növekvő koncentrációival eluáljuk. Az eluátum frakcióit összegyűjtjük és megfelelő analitikai módszerekkel (tipikusan reverz fázisú HPLC-vel vagy CZE kromatográfiával) analizáljuk. A kívánt homogenitású frakciókat összeöntjük. A jelen levő ellentétes ion kicserélhető további reverz fázisú kromatográfiával a választott só segítségével, vagy ioncserés gyantákkal. Ezután a peptid acetát vagy más megfelelő só formájában izolálható. Ezután a peptidet szűrjük és a vizet eltávolítjuk (tipikusan liofilezéssel) egy homogén peptid készítmény létrehozása céljából, mely legalább 90%, még előnyösebben legalább 95% és még előnyösebben legalább 97% mennyiségben a kívánt alkotórészt tartalmazza. Lehetőség szerint, vagy a fent leírt reverz fázisú HPLC-vel együtt a tisztítási eljárás elvégezhető affinitás kromatográfiával, ioncserével, méret exklúzióval, ellenáramú vagy normál fázisú szeparációs rendszerrel, vagy ezen módszerek kombinációjával.

A pepiid koncentrálható ultraszűréses, rotációs evaporációs, precipitációs, dialízises vagy más hasonló technikákkal is.

Ezután a nagy tisztatású homogén peptid készítmény az alábbi technikákkal vagy technikák kombinációjával jellemezhető:

a) tömeg spektroszkópiával a molekulasúly meghatározása céljából a peptid azonosságának ellenőrzése céljából:

b) aminosav analízissel, a peptid azonosságának ellenőrzése céljából az aminosav összetételen keresztül

c) aminosav szekvenálással (automatizált protein szekvenálót használva vagy manuálisan) a meghatározott aminosav maradékok szekvenciájának megerősítése céljából

d) HPLC-vel (ha szükséges többszörös rendszerrel) a peptid azonosságának és tisztatáságának ellenőrzése céljából (ez azonosítja a peptid szennyeződéseket)

e) a víztartalommal, a peptid készítmény víz koncentrációjának meghatározása céljából

f) az ion tartalommal a peptid készítményben a sók jelenlétének meghatározása céljából és

g) a maradék szerves anyagok meghatározásával a maradék szerves reagensek, kiindulási anyagok és/vagy szerves szennyeződések jelenlétének ellenőrzése céljából.

A jelen találmány szintetikusan előállított peptidjei esetében különösen kívánatos, hogy körülbelül 45 aminosav maradék hosszúságúak, legelőnyösebben körülbelül 30 aminosav maradék hosszúságúak legyenek, mivel a hosszúság növekedése a peptid szintézis nehézkességét okozza. Az ennél hosszabb peptidek rekombináns DNS technikákkal állíthatók elő az alábbiakban leírtak szerint.

A jelen találmányban használható peptidek előállíthatok rekombináns DNS technikákkal is egy ilyen pepiidet kódoló nukleinsav szekvenciával transzformált gazdasejtben. Ha rekombináns technikákkal állítják elő, a kívánt pepiidet kódoló nukleinsavval transzfomrált gazdasejteket egy a sejtek tenyésztéséhez megfelelő tápközegben tenyésztjük és az izolált peptideket a sejt tenyészető tápközegből, a sejtekből vagy mindkettőből tisztítjuk a tudomány e területén ismert pepiid és protein tisztítási technikákat használva, ideértve az ioncserés kromatográfiát, az ultraszürést, az elektroforázist vagy a kívánt peptidre specifikus antitestekkel végzett immunopurifikációt használva. A rekombináns módon előállított peptideket izolálhatjuk és homogenitásig tisztíthatjuk, hogy mentesek legyenek a celluláris anyagoktól, más polipeptidektől vagy a használt tenyésztápközegtől a szintetikusan létrehozott peptidek esetében fent leírt módszerekkel összhangban.

Bizonyos korlátozott körülmények között a peptidek létrehozhatók a nagy tisztaságú teljes hosszúságú natív protein kémiai vagy enzimatikus hasításával is, melyből a kémiai emésztett szakasz vagy enzimatikusan kihasított szakaszt előre meghatároztuk és a kapott emésztett szakasz reprodukálható. A meghatározott aminosav szekvenciákkal rendelkező peptidek esetében nagy tisztaságot lehet elérni, és más polipeptidektől vagy a kémiai vagy enzimatikus emésztett anyagban jelen levő szennyeződésektől mentesen izolálhatok a nagy tisztaságú és izolált szintetikusan vagy rekombinánsan előállított peptidek esetében fent leírt eljárások felhasználásával.

A fent leírtak szerint előállított nagy tisztaságú és izolált peptidek a jelen találmány terápiás készítményeivé formulázhatók, melyek megfelelnek a humán terápia céljaira. Ha a jelen találmány egy terápiás készítményét injekcióban alkalmazzuk (például szubkután injektálással) előnyös, ha a nagy tisztaságú pepiid vizes oldószerben oldódik egy gyógyszerészetileg elfogadható pH tartományban (például 4-9 pH értékek között) oly módon, hogy a készítmény folyékony könnyen injektálható. A készítmény előnyösen tartalmaz egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót is. A találmány szerinti alkalmazásban a gyógyszerészetileg elfogadható hordozó bármilyen hatásjavítót, oldószert, diszperziós közeget, burkoló anyagot, antibakteriális és gombaellenes anyagot, toxicitási anyagot, pufferoló anyagot, abszorpciót késleltető vagy elősegítő anyagot, felületaktív anyagot és micélium képző (miclle?) anyagot, lipideket, liposzómákat és folyadék kompelx képző anyagot, stabilizáló anyagot és más hasonló anyagokat foglal magába. Az ilyen közegek és anyagok gyógyszerészetileg aktív anyagként történő alkalmazása ismert a tudomány számára. Kivétel, ha bármely hagyományos közeg vagy anyag nem kompatibilis az aktív anyaggal, akkor a terápiás készítményekben való alkalmazásukat meg kell fontolni. Kiegészítő aktív vegyületeket is be lehet építeni a készítményekbe.

A jelen találmány injektálható formában való alkalmazáshoz megfelelő terápiás készítményei előnyösen steril vizes oldatok, melyek úgy készülnek, hogy az aktív anyagot (például a fentiek szerint leírt nagy tisztaságú és izolált pepiidet) egy megfelelő hordozó kívánt mennyiségébe építjük be az alábbiakban és a korábbiakban felsorolt alkotórészek egyikével vagy kombinációjukkal együtt - ahogy szükséges - melyet szüréses sterilezés követ. Az előnyben részesített gyógyszerészetileg elfogadható hordozók közé tartozik legalább egy hatásjavító, mint például a steril víz, a nátrium foszfát, a mannitol, a szorbitol vagy a nátrium klorid vagy ezek bármilyen kombinációja. Az egyéb megfelelő gyógyszerészetileg elfogadható hordozók közé tartoznak az oldószerek vagy a diszperziós tápközegek, melyek például vizet, etanolt, poliolt (például glicerolt, propilén glikolt és folyékony polietilén glikolt és más hasonló anyagokat) tartalmaznak, ezek megfelelő keverékei • 0 « 0 0 · · · 0· « 0 0 0 0 0 és a növényi olajok. A megfelelő fluiditás például olyan burkoló anyagokkal tartható fenn, mint a lecitin, a megfelelő részecske méret fenntartásával tartható fenn diszperziók esetében és felületaktív anyagok használatával. A mikroorganizmusok aktivitásának megelőzése a különböző antibakteriális anyagok és gombaellenes anyagok használatával érhető el, például parabének, klórbutanol, fenol, aszkorbinsav, tirmerosol és más hasonló anyagok használatával. Az injektálható készítmények meghosszabbodott abszorpciója úgy valósítható meg, ha a készítmény tartalmaz egy olyan anyagot is, mely késlelteti az abszorpciót, például alumínium monosztearát és a zselatin.

A jelen találmány egy terápiás készítménye steril kell legyen, az előállítás, raktározás és szétosztás során stabil kell maradjon és védeni kell a mikroorganizmusok, mint például a baktériumok és fonalasgombák szennyező hatása ellen. A jelen találmány egy terápiás készítményének előnyben részesített eszköze a készítmény integritásának fenntartására (például a szennyeződés elleni védelem, a tárolási idő meghosszabbítása stb.) az, ha a peptid formulát és a gyógyszerészetileg elfogadható hordozót úgy állítjuk elő, hogy a készítmény egy liofilezett por alakjában van, mely újraoldható egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóban, például steril vízben való csupán a felhasználás előtti feloldással. A steril injektálható oldatokhoz való steril porok esetében az előállítás előnyben részesített módszere a vákuum szárítás, a fagyasztva szárítás vagy a centrifugálásos szárítás, mely az aktív alkotórész por alakját valamint a a korábban sterilre szűrt oldatból származó további kívánt alkotórészeket tartalmazza. A jelen találmány terápiás készítményeinek specifikus formuláit az alábbiakban a példák között írjuk le.

Számos esetben a találmány terápiás készítményei egynél több izolált pepiidet tartalmaznak. Az emberek esetén gyógyszerészeti alkalmazásra megfelelő többszörös formulákat tartalmazó terápiás készítmény kívánatos lehet többféle aktív peptid alkalmazása esetén. A többszörös formula legalább két vagy több izolált peptidet foglal magába, melyek egy meghatározott aminosav szekvenciával rendelkeznek és melyek képesek lefelé szabályozni az antigén specifikus immunválaszt. Egy többszörös formula előállításakor figyelembe veendő szempontok közé tartoznak a formulában levő peptidek oldékonyságának és a stabilitásának fenntartása egy vizes oldatban fiziológiailag elfogadható pH értéken. Ez szükségessé teszi egy vagy több olyan gyógyszerészetileg elfogadható oldószer és hatásjavító kiválasztását, melyek kompatibilisek az összes a többszörös formulában jelen levő peptiddel. Például, a megfelelő excipiensek közé tartoznak a steril víz, a nátrium foszfát, a mannitol, vagy a nátrium foszfát és a mannitol együtt. Egy további szempont egy többszörös formula esetében a peptidek dimerizációjának megakadályozása, ha erre szükség van. Olyan anyagok is szerepelhetnek a többszörös formulában, melyek megakadályozzák a dimerizációt, például az EDTA, vagy bármely más olyan anyag, vagy eljárás melyekről ismert, hogy megakadályozzák a dimerizációt. Az alábbiak egy olyan többszörös formulára adnak példát, melyet a II fázisú humán klinikai kísérletekben kerülnek felhasználásra terápiás anyagként a macskával szembeni allergia kezelésében. A két aktív peptidet az X peptidet (1. számú szekvencia) és az Y peptidet (2. számú szekvencia) mindkettő meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkezik és a Fel d I protein allergénből származik - kémiai szintézissel szintetizáljuk és homogenitásig a fent leírtak szerint tisztítjuk egy többszörös formulában való alkalmazáshoz az emberek macskákkal szembeni allergiájának a jelen találmánnyal összhangban való ···· kezelése céljából. Ehhez a megvalósuláshoz az X pepiid (1. számú szekvencia) és az Y pepiid (2. számú szekvencia) liofilezett pro alakjában van, melyet használat előtt steril vízben újra oldunk. Az az X pepiidet (1. számú szekvencia) és az Y peptidet (2. számú szekvencia) az előállítás során kevertük össze ismert technikákat használva egy olyan fiola létrehozása céljából, mely egy steril, pirogén mentes, liofilezett port tartalmaz, mely a következő összetételű:

Aktív: 0,75 mg X peptid (1. számú szekvencia) és 0,75 mg Y peptid (4. számú szekvencia)

Inaktív: 0,05 M nátrium foszfát, pH = 6,2

5% w/v mannitol U.S.P.

Oldószer: Steril víz az injektáláshoz U.S.P. (kezdeti újra oldás)

0,9% nátrium klorid az injektáláshoz (a kezdeti újra oldáson felüli hígítás)

Ezen többszörös formula előállítása szükségessé teszi a fiolák steril vízzel való újra oldását az injektáláshoz. Egy másik megvalósulásban a többszörös formula továbbá tartalmazhat még három (lásd a 2. példát), négy vagy öt további, a humán terápiára alkalmas peptidet is.

A fent leírtak szerinti terápiás készítmények egy egyén esetében történő alkalmazása, nem immunogén formában, ismert eljárásokkal valósítható meg olyan dózisban és annyi ideig, mely az egyén esetében az antigén specifikus immunválasz lefelé szabályozásának (például a behatoló antigén által kiváltott antigén specifikus immunválasz betegség tüneteinek csökkentéséhez) eléréséhez szükséges. Egy betegségi állapottal kapcsolatos antigénre adott antigén specifikus immunválasz lefelé irányuló szabályozása emberekben klinikailag meghatározható amikor csak • < · ·· ·· · * • ···· ·· · · · • · · · · · · • ······ ··· · ··· ·· · ···· lehetséges a kezelt betegségi állapottól függően, vagy meghatározható szubjektiven is (azaz a kezelt betegségi állapottal kapcsolatos tünetek közül néhányról vagy mindről úgy érzi a beteg, hogy enyhültek).

A jelen találmány terápiás készítményeinek hatékony mennyiségei az olyan faktoroktól függnek, mint például az egyén antigénnel szembeni érzékenységének mértéke, a beteg kora és neme, testsúlya, valamint az, hogy az egyénben a peptid képes-e lefelé szabályozni az antigén specifikus immunválaszt. A jelen találmány terápiás készítménye alkalmazható nem immunogén formában hagyományos módszerrel, például injekcióval (szubkután, intravénás, stb.) orális alkalmazással, szubliguálisan, inhalálással, transzdermális alkalmazással, rectális alkalmazással vagy bármely más a tudomány e területén terápiás anyagok használatában ismert alkalmazási módszerrel. Kívánatos lehet, hogy az egyénnek azonos időben vagy egymást követően a jelen találmány terápiás készítményéből egynek vagy többnek a terápiás szempontból hatékony mennyiségét adjuk. Az azonos idejű vagy az egymást követő alkalmazáshoz való ilyen készítmények mindegyike tartalmazhat csupán egy peptidet vagy tartalmazhat egy fent leírt többszörös formulát.

A találmány egy vagy több terápiás készítményének szubkután injektálásához, előnyösen 1 pg - 3 mg, még előnyösebben 20 pg - 1,5 mg, és még előnyösebben körülbelül 50 pg - 750 pg aktív komponenst (peptidet) alkalmazunk dózis egységenként. Különösen előnyös parenterális készítményeket egység dózisban formulázni az alkalmazás megkönnyítése és a dózis egységessége céljából. A találmány szerinti használatban az egység dózis forma kifejezés fizikailak elkülönült egységeket jelent, melyek egységes dózisként megfelelőek, a kezelendő humán betegek esetében, az egyes egységek az aktív vegyületből egy előre meghatározott mennyiséget tartalmaznak, melyet úgy számítottunk ki, hogy a kívánt terápiás hatást váltsák ki a kívánt gyógyszerészeti hordozóval együtt. A jelen találmány új egység dózis formáinak specifikációját a következők diktálják és a következőktől függ:

a) az aktív vegyület egyedi jellemzői és az elérni kívánt adott terápiás hatás;

és

b) a humán alanyok kezelésére szolgáló aktív vegyület összeállításában a tudomány e területén fennálló kapcsolódó korlátozások.

A dózis alkalmazási rend beállítható úgy, hogy optimális terápiás választ biztosítson. Például, több osztott dózis alkalmazható a napok, hetek, hónapok, évek során, vagy a dózis arányosan növelhető vagy csökkenthető az egyes egymást követő injektálás során, ahogy azt a terápiás körülmény kényszerhelyzete diktálja. Egy előnyben részesített terápiás menetrendben a terápiás készítmény szubkután injekcióit hetente egyszer adjuk be 3-6 héten keresztül. A dózis állandó maradhat az egyes injekciók során, vagy az egymást követő injektálások során növekedhet vagy csökkenhet. Egy emlékeztető injekció adható körülbelül három - körülbelül 1 év intervallumokban a kezdeti kezeléstől számítva és ez csupán egyetlen injekciót jelenthet, vagy a kezdeti kezeléshez hasonló injekciók sorozatát jelentheti.

A találmány készítményének a parenterális alkalmazástól eltérő alkalmazásához (például orális alkalmazás) szükség lehet a készítmény burkolására, vagy a készítmény egy olyan anyaggal történő együttes alkalmazására, mely megakadályozza annak inaktiválódását vagy fokozza abszorpcióját és bioelérhetőségét. Például egy peptid formula alkalmazható együtt egy enzim inhibitorral vagy egy liposzómában. Az enzim inhibitorok közé tartozik a pankreatikus tripszin inhibitor, a diizopropil-fluoro-foszfát (DEP) és a trasilol. A liposzómák közé tartoznak a víz-olajban-vízben levő CGF emulziók, valamint a hagyományos liposzómák (Strejan et al., 1984, J. Neuroimmunol., 7:27). Ha egy pepiidet

·· megfelelően védünk alkalmazható orálisan, például egy inért diluenssel vagy agy asszimilálható ehető hordozóval. A peptid és a többi alkotórész bezárható egy kemény vagy lágy héjú zselatin kapszulába, tablettává préselhető vagy beépíthető közvetlenül a beteg étrendjébe. Az orális terápiás alkalmazáshoz az aktív vegyület beépíthető excipiensekbe és alkalmazható elfogyasztható tabletták formájában, orális tabletták formájában, pirulák formájában, kapszulákként, elixirekként, oldatokként, gélekként, szuszpenziókként, szirupokként, ostyaként és más hasonlóként. Az ilyen készítményeknek és összetételeknek legalább 1 súly% aktív anyagot kell tartalmazniuk. A készítmény és az összetétel százaléka természetesen változhat és megfelelően körülbelül 5 - 80 súly% között van egységenként. Egy ilyen terápiásán hasznos készítményben az aktív vegyület mennyisége olyan, hogy egy megfelelő dózist érjünk el vele. Ezenkívül, az aktív vegyület beépíthető késleltetett felszabadulású vagy szabályozott felszabadulású (állandó állapotú vagy pulzáló felszabadulású) készítményekbe és formulákba.

A jelen találmányt az alábbi nem korlátozó jellegű pédákkal szemléltetjük.

1. példa

A peptidek humán alanyok esetében történő alkalmazása a macskával szembeni allergia kezelésében

A. Az l-es fázisú formula összetétele

Az l-es fázisú klinikai kísérletekhez a drog termék két fagyasztva szárított peptid formulát tartalmaz, az X pepiidet (1. számú szekvencia) és az Y pepiidet (2. számú szekvencia). Az X peptidet (1. számú szekvencia) és az Y peptidet (2. számú szekvencia) külön állítjuk elő és két különböző pyrogén fiolába csomagoljuk.

X peptid (1. számú szekvencia)

Aktív: 1,5mg/fiola

Inaktív: 0,1 M nátrium foszfát, pH = 5,7

Higítószer: steril víz az injektáláshoz U.S.P.

Y peptid (2. számú szekvencia)

Aktív: 1,5mg/fiola

Inaktív: 0,1 M nátrium foszfát, pH = 5,7 % w/v mannitol, U.S.P.

Higítószer: steril víz az injektáláshoz U.S.P.

Ebben a vizsgálatban a drog terméket két különböző fiolában alkalmazzuk steril pirogén-mentes, liofilezett por formájában, mely nátrium foszfátot és mannitolt tartalmaz excipiensként és az aktív vegyület az X peptid (1. számú szekvencia) és az

Y peptid (2. számú szekvencia).

A drog termék készítménye ezekben a vizsgálatokban szükségessé teszi a fiolákban levő anyag steril vízzel való újra oldását az injektáláshoz. Az újra oldott fiolák hígítására van szükség az alacsonyabb dózisok biztosításához a 7,5 vagy 75 pg/ml dózis titrálási koncentrációkban, ezt is steril 0,9%-os nátrium kloriddal végezzük el az injektáláshoz. Ha szükséges a fiolák előállíthatok csupán peptidenként 7,5 vagy 75 pg mennyiségben hígítás szükségessége nélkül.

A liofilezett drog terméket 20 C° hőmérséklet alatt tároljuk és a drog terméket az újra oldás után azonnal felhasználjuk. A tárolási és az alkalmazási körülmények nem korlátozóak.

·« • · · · · « · • ······ ··· ··· ·· · ··«·

B. Il-es fázisú formula összetétele

A ll-es fázisú klinikai kísérletekhez az egyes peptidekből 750 pg/ml végső koncentrációt tartalmazó egyedüli formulát állítunk elő. Az X peptidet (1. számú szekvencia) és az Y peptidet (2. számú szekvencia) a végső töltési eljárás során összekeverjük egy olyan fiola létrehozása céljából, mely egy steril, pirogén-mentes, liofilezett port tartalmaz.

Aktív: 0,75 mg X peptid (1. számú szekvencia) és 0,75 mg Y peptid (4. számú szekvencia)

Inaktív: 0,05 M nátrium foszfát, pH = 6,2 % w/v mannitol, U.S.P.

Higítószer: steril víz az injektáláshoz U.S.P. (kezdeti újra oldás)

0,9% nátrium klorid az injektáláshoz (a kezdeti újraoldáson felüli hígítás)

A fagyasztva szárított drog készítményt 750 pg/ml koncentrációban steril vízzel hígítjuk az injektáláshoz. Az alacsonyabb dózisokhoz az újraoldott fiolák hígítását, például a 7,5 vagy 75 pg/ml koncentrációk eléréséhez, steril 0,9 % nátrium klorid használatával végezzük. Az alanyoknak a drog készítményt a klinikai protokolban megadott alkalmazási útmutatók szerint adagoljuk.

A drog készítményt az újraoldás után azonnal alkalmazzuk.

A liofilezett drog készítményt -20 C° hőmérséklet alatt tároljuk, azonban ez nem korlátozó.

·· > *» *· ·· • « · · '4 « « · · · • · · · · · · • ·····* ···· *·· ·· · ··*·

D. Humán 1-es és ll-es fázisú klinikai kísérletek

Az X és Y peptidek (1. és 2. számú szekvencia) alábbiakban megadott l-es és ll-es fázisú vizsgálatait macska-allergiás betegek esetében végezzük el.

P92-01 protokol: Az X és Y peptidek biztonságának és aktivitásának l-es fázisú klinikai vizsgálata

Ezt az l-es fázis, nyílt jelölésű, dózis-fokozó biztonsági vizsgálatot azért végezzük el, hogy megállapítsuk az X peptid (1. számú szekvencia) és az Y peptid (2. számú szekvencia) alkalmazásának biztonságosságát. A vegyületek antigenitását a pepetidek változó bőr teszt szenzitivitásban mutatkozó aktivitása szerint értékeljük.

Ebben a vizsgálatban két központ - a Johns Hopkins Asthma and Allergy Center (Baltimore, Maryland) és a New England Medical Center (Boston, Massachusetts) - összesen 19 macska allergiás beteget adott a vizsgálathoz. Az X pepiidet (1. számú szekvencia) és az Y pepiidet (2. számú szekvencia) külön, de egyidőben alkalmazzuk, szubkután injekció formájában 7,5 pg - 1500 pg határok között növekvő dózisokban 5 hetes időtartam alatt.

A biztonságot a klinikai laboratóriumi paraméterek, fizikai megfigyelések, antitest vizsgálatok és ártalmas vizsgálatok értékelésével becsüljük. Az aktivitást a bőr teszt analízissel értékeljük. A szúrásos és intradermális bőr tesztelést az affinitás tisztított natív Fel d l-gyel és a peptidekkel a kezelési periódus előtt egy héttel és a kezelési periódus után 2 és hat héttel végezzük el. Tizenhat (16) beteget kezelünk az X és az Y peptidekkel a vizsgálat során. A peptideket jól tolerálták 1500 pg dózisokban. Nem tapasztaltunk komoly káros hatást és a peptidek biztonságossága a további klinikai fejlesztéshez megerősítést nyert. A kísérlet során feljegyzett káros események tipikusak voltak a nyílt allergia vizsgálatokban tapasztaltakéhoz. A *· · ·· ♦· V» * « · · * « · · · · • * · « » « · • ·«···· ··«· ··· «· « ·*·» betegek közül mindenki macska allergiás ebben a kísérletben és a tolerált dózis nagyságrendekkel magasabb, mint amit a hagyományos immunoterápiás dózisokkal el lehet érni.

Egy beteg abbahagyta a vizsgálatot egy első asztmás roham következtében, ami az 1. héten végzett macska l-es kivonattal és peptidekkel végzett bőrtesztelés után jelentkezett, majd egy második asztma roham miatt, mely az egyes peptidek 7,5 pg dózisának 2. héten történő beadása után jelentkezett. Nem világos, hogy közvetlen kapcsolat van-e az asztma és peptides kezelés között ezen beteg esetében. Érdemes megjegyezni, hogy a vizsgálatot az utóbbi évek legkomolyabb pollen időszakában végeztük el, és ez a beteg, mint a vizsgálatban szereplő többi beteg közül sokan, szintén szezonálisan allergiás.

Az antitest vizsgálatok kiderítették, hogy az összes értékelhető beteg IgG és IgE antitestekkel rendelkezik a Fel d I ellen. Két beteg kivételével az összes beteg esetében a koncentrációk nem változtak a vizsgálat ideje alatt. Két beteg IgE antitestet mutatott az X pepiiddel (1. számú szekvencia) és/vagy az Y peptiddel (2. számú szekvencia) szemben a 8. és a 12. héten, ez az 1. héten nem jelentkezett. Ezen betegek közül az egyik beteg lényeges bőr teszt reakciót mutat az X peptiddel (1. számú szekvencia) szemben a 8. héten, ez a 12. héten nem jelentkezett. 5 beteg rendelkezett endogén IgG antitesttel az X peptiddel (1. számú szekvencia) szemben és 3 beteg adott IgG antitesteket az Y peptiddel (2. számú szekvencia) szemben a pepiidnek való kitevést megelőzően. Négy beteg, akik nem rendelkeztek előzetes antipeptid IgG antitestekkel az X peptiddel (1. számú szekvencia) és/vagy az Y peptiddel (2. számú szekvencia) szemben az ilyen antitesteket növekvő koncentrációban fejlesztették ki a kezelés után. Két beteg pozitív azonnali bőr teszt reakciót adott egy kezelési pepiidre a vizsgálat ideje alatt, klinikai korreláció nélkül.

Egy másik beteg késleltetett helyi reakciót mutatott az Y peptiddel (2. számú szekvencia) végzett bőr tesztelésre a 8. héten, ez az Y peptid (2. számú szekvencia) intradermális dózisával van összefüggésben.

A macska allergénre adott bőr teszt eredmények egy statisztikailag szignifikáns csökkenést mutatnak a Fel d l-et tartalmazó macska kivonattal szembeni reaktivitásban két vagy három hígítás esetében a szúrási tesztek esetén sorrendben 8 vagy 12 hét után. Nem észleltünk statisztikailag szignifikáns eltérést a reaktivitásban az intradermális módszernél észleltek esetén. A Fel d l-re (Σ|=) adott késői fázisú reaktivitásban 6. és 24. órában statisztikailag szignifikáns csökkenést figyeltünk meg a Johns Hopkins központban, amikor a 8 hetes eredményeket az alapértékhez (1. hét) hasonlítottuk. A csökkenés nem volt szignifikáns, amikor a 12. hetet hasonlítottuk az alapértékhez.

Bár ezt a vizsgálatot azért végeztük el, hogy a biztonságosságot értékeljük, ezek a bőr tesztelési adatok azt sugallják, hogy a peptidek deszenzitizálást okozhatnak a Fel d l-gyel szemben.

P92-02 Protokol: Az X és az Y peptidek biztonságosságának és aktivitásának ll-es fázisú klinikai vizsgálata Macskás Szoba Próba Modellt használva

A ll-es fázisú biztonsági és hatékonysági vizsgálatot az X és Y peptidek egy kettős vak placebo-szabályozott vizsgálatával végezzük el, mely peptideket szubkután módon alkalmazzuk négy heti peptidenként 7,5 pg, 75 pg vagy 750 pg dózisokban. A betegek természetes kitettséggel szembeni érzékenységét úgy határoztuk meg, hogy mértük a tünet pontokat és a pulmonáris funkciót egy 60 perces időtartam alatt, amikor a beteget egy bútorokkal tömött és két macskát is tartalmazó kis szobába helyeztük. Ezt a macskás szoba próbát a kezelés előtt w ·» ·· · · · · · · • · · · · · • · ' w · · ··· «· * ··♦· végzetük el, majd a kezelés után 1 és 6 héttel. A macskás szobában a betegek nazális, szem és tüdő tüneteket értékeltek egy öt pontos skálán öt percenként. A pulmonáris funkciót minden 15 percben teszteltük. A vizsgálat során a további értékelt paraméterek közé tartoznak a bőr teszt érzékenység a macska kivonattal szemben, valamint az X és Y peptidekkel szemben, a Fel d l-gyel és komponens X és Y peptidekkel szembeni specifikus IgE és IgG-vel szemben, valamint a T sejt válaszadás a macska antigénnel és a szelektált peptidekkel szemben.

beteg vett részt a kísérletben két központban - a Johns Hopkins Asthma and Allergy Centerben (Baltimore, Maryland) és New England Medical Center (Boston, Massachusetts). 91 beteg fejezte a be a kísérletet. Négy beteg abbahagyta, kettő a terápiával kapcsolatos átmeneti allergiás tünetek miatt és kettő az ütemezési ellentétek miatt.

Általában a kezelést jól tolerálták. A vizsgálat elsődleges hatékonysági adatainak analízise azt mutatja, hogy szignifikáns dózis válasz kapcsolat létezik, amit statisztikailag szignifikánsnak tartunk (1. ábra) az allergiás tünetek (nazális, tüdő és teljes alergia) kontrolljához képest, amit a macskás szobának való kitettség indukált a kezelés utáni 1. és 6. héten. A placeboval való statisztikailag szignifikáns páros összehasonlítást a nazális és teljes allergiás tünetek esetében 75 pg és 750 pg dózisoknál a 6. héten nyertük (lásd az 1. ábrát). A 7,5 pg-os dózist nem lehetett elkülöníteni a placebotól. A betegek szúrás teszt negatívak voltak a vizsgálati kezelési előkezelés során, de 13 beteg pozitív szúrás és/vagy intradermális bőr tesztet mutatott a peptides kezelés esetén. Két beteg adott szignifikáns IgE titert a kezelési pepteiddel szemben és bőr teszt pozitív volt a vizsgálati kezelés után. Csupán 5 a peptiddel kiváltott pozitív bőr teszttel rendelkező beteg adott mérhető IgE-t a peptiddel szemben. A betegek egy része (placebo: 57,5%; 7,5 pg: 60,9%; 75 pg: 63,6%; 750 pg 83,3%) macska allergiás tüneteket produkált, mint például rhinorrheát, nazális congestiot, pruritust, mell szorítást, és/vagy asztmás légzést a vizsgálat során. A vizsgálati kezelés úgy tűnik enyhe átmeneti tüneteket eredményez, ami a természetes macskának való kitettségére emlékeztet. Az esetek dózisfüggőek (placebo: 11,5-19,2%; 7,5 pg: 21,7-26,1%; 75 pg: 31,8-45,5%; 750 pg 50,0-62,5%). Ezek a tünetek általában enyhék voltak önkorlátozóak, és nem igényeltek kezeiét, vagy béta agonistával és/vagy antihisztaminnal szabályozni lehetett. Egy beteget adrenalinnal kezeltünk és hat beteg asztmás tüneteket mutatott a cseppekkel a csúcs lefolyásban. Mindegyiket könnyen megoldottuk. A kezelés nem változtatja meg az antitest válaszokat, hogy allergiát hívjon elő a vizsgálati időtartam alatt, nem hat a bőr mellbimbó (teát) reaktivitásra a placebohoz viszonyítva, azonban kapcsolódik a teljes allergiás pontarány javulásához a vizsgálati betegek 80 %-ában. A kezelés hatékonyságának jobb jellemzéséhez további vizsgálatokat folytatunk.

2. példa

Peptidek alkalmazása emberek esetében a parlagfű elleni allergia kezelésére

A. l-es fázisú formulázás

Az l-es fázisú klinikai kísérletekhez a gyógyszer termék egy többszörös formula, mely az Amb a I három fagyasztva szárított peptidjét tartalmazza, az egyes peptidek aminosav maradék szekvenciája tartalmazza az Amb a 1.1 (lásd a WO 93/21321 számú szabadalmat, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak) parlagfű protein allergén legalább egy T sejt epitópját. Az egyes peptideket homogenitásig tisztítjuk (legalább 97%-os tisztaság) a fentiekben leírt módszerekkel összhangban. A többszörös formulát az itt leírt eljárásokkal összhangban állítjuk elő. A l-es fázisú klinikai vizsgálatban használt többszörös formulában az egyes peptidek fagyasztva szárított por pogácsa alakjában vannak jelen egy fiolában. A formulát csupán használat előtt oldjuk újra steril vízben az injektáláshoz és normális sóoldatot (0,9%) használunk a kezdeti feloldáson felül használt hígításhoz.

B. Humán l-es fázisú klinikai vizsgálatok

Az előzetes adatok azt jelzik, hogy az összes dózist tolerálták és a többszörös formula biztonságosnak tűnik. További analízis és a ll-es fázisú klinikai vizsgálatok az Egyesült Államokban és Kanadában folynak.

Ekvivalensek

A tudomány e területén képzett szakember csupán rutin kísérletezés felhasználásával fel fogja ismerni, vagy kiderítheti, hogy az itt leírt specifikus eljárásoknak számos megfelelője van. Az ilyen megfelelő eljárások a jelen találmány körén belüliek és az alábbiakban szereplő igénypontok körébe tartoznak.

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) BEJELENTŐ: IMMULOGIC PHARMACEUTICAL CORPORATION (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: ANTIGÉNSPECIFIKUS IMMUNVÁLASZT ALULSZABÁLYOZÓ PEPTID-KÉSZÍTMÉNYEK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 2 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: IMMULOGIC PHARMACEUTICAL CORPORATION (B) UTCA: 610 LINCOLN STREET (C) VÁROS: WALTHAM (D) ÁLLAM: Massachusetts (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 02154 (v) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:

(A) HORDOZÓ KÖZEG: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: ASCII text (vi) A JELEN ALKALMAZÁS ADATAI:

(A) AZ ALKALMAZÁS SZÁMA:

(B) IKTATÁSI DÁTUM:

(C) KLASSZIFIKÁCIÓ:

(vii) ELSŐBBSÉGI ALKALMAZÁSI ADATOK:

(A) ALKALMAZÁSI SZÁM:

(B) IKTATÁSI DÁTUM:

(C) KLASSZIÓFIKÁCIÓ:

(viii) ÜGYVÉD/IRODA INFORMÁCIÓK:

(A) NÉV: DARLENE A. VANSTONE (B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM:

(C) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: 092.0US (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:

(A) TELEFON: (617) 466-6000 (B) TELEFAX: (617) 466-6040 (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) FRAGMENT TÍPUS: intemális (belső) (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val

10 15

Glu Gin Val Alá Gin Tyr Lys Alá Leu Pro Val

25

(2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) FRAGMENT TÍPUS: internális (belső) (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Alá Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Alá Arg He Leu Lys Asn Cys

10 15

Val Asp Alá Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu

Claims (43)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy terápiás készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy meghatározott aminosav maradékokból álló szekvenciával rendelkező izolált peptidet tartalmaz, az említett készítmény, ha nem immunogén formában alkalmazzuk az említett antigén specifikus immunválasznak kitett emberi populációban egy antigén specifikus immunválasz lefelé irányuló szabályozására képes.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid egy protein antigénből származik és az említett antigén specifikus immunválasz az említett antigén ellen irányul.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptidet legalább 95% tisztaságig tisztítunk.
4. 4. Egy terápiás készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy izolált és tisztított peptidet tartalmaz, legalább egy említett peptid meghatározott hosszúságú és meghatározott aminosav maradékokból álló szekvenciával rendelkezik és tartalmazza egy protein antigén legalább egy T sejt epitópját, az említett készítmény ha nem immunogén formában alkalmazzuk az említett antigén specifikus immunválasznak kitett emberi populációban egy antigén specifikus immunválasz lefelé irányuló szabályozására képes.
5. 5. Az 1. vagy a 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid meghatározott hosszúságú és legfeljebb 50 aminosav maradékból áll.

   ··· · ··· ·
6. 6. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid legalább 12 aminosav maradékból, de legfeljebb 40 aminosav maradékból áll.
7. 7. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett antigén egy protein allergént jelent.
8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett protein allergént a Drematophagoides nemzetség egy protein allergénjét; egy a Felis nemzetség egy protein allergénjét; egy az Ambrosia nemzetség egy protein allergénjét; egy a Lolium nemzetség egy protein allergénjét; egy a Cryptomería nemzetség egy protein allergénjét; egy az Alternaria nemzetség egy protein allergénjét; egy az Alder nemzetség egy protein allergénjét; egy a Betula nemzetség egy protein allergénjét; egy a Quercus nemzetség egy protein allergénjét; egy az Olea nemzetség egy protein allergénjét; egy az Artemisia nemzetség egy protein allergénjét; egy a Plantago nemzetség egy protein allergénjét; egy a Parietaria nemzetség egy protein allergénjét; egy a Canine nemzetség egy protein allergénjét; egy a Blattella nemzetség egy protein allergénjét; egy az Apis nemzetség egy protein allergénjét; egy a Cupressus nemzetség egy protein allergénjét; egy a Juniperus nemzetség egy protein allergénjét; egy a Thuya nemzetség egy protein allergénjét; egy a Chamaecyparis nemzetség egy protein allergénjét; egy a Periplaneta nemzetség egy protein allergénjét; egy az Agropyron nemzetség egy protein • · · · ·· allergénjét; egy a Secale nemzetség egy protein allergénjét; egy a Triticum nemzetség egy protein allergénjét; egy a Dactylis nemzetség egy protein allergénjét; egy a Festuca nemzetség egy protein allergénjét; egy a Poa nemzetség egy protein allergénjét; egy az Avena nemzetség egy protein allergénjét; egy a Holcus nemzetség egy protein allergénjét; egy az Anthoxanthum nemzetség egy protein allergénjét; egy az Arrhenatherum nemzetség egy protein allergénjét; egy az Agrostis nemzetség egy protein allergénjét; egy a Phleum nemzetség egy protein allergénjét; egy a Phalaris nemzetség egy protein allergénjét; egy a Paspalum nemzetség egy protein allergénjét és egy a Sorghum halepensis nemzetség egy protein allergénjét magába foglaló csoportból szelektáljuk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a protein allergént a Dérp l-et; a Derp ll-őt; a Derp lll-at; a Derp Vll-et; a Derf l-et; a Derf IIőt; a Dér f lll-at; a Dér f Vll-et; a Fel d l-et; az Amb a 1.1-et; az Amb. a l.2-őt; az Amb. a 1,3-at; az Amb a l.4-et; az Amb a ll-őt; a Lol p l-et; a Lol p ll-őt; a Lolp lll-at; a Lolp IV-et; a Lol p IX-et (Lol ρ V vagy Lol p lb); a Cry j l-et; a Cry j ll-őt; a Can f l-et; a Can f ll-őt; a Jun s l-et; a Jun v l-et; a Dac g l-et; a Poa p l-et; a Phl p l-et és a Ser h l-et magába foglaló csoportból szelektáljuk.
10. 10. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett protein antigén egy autoantigént jelent.
11. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az autoantigént az inzulint, a mielin bázikus proteint, a mielinoligodendrocita proteint, az rh faktort, az acetilkolin receptorokat, a tiroid sejt receptorokat, az alap membrán • · · * 48 proteineket, a tiroid proteineket; az ICA-69-et (PM-1); a glutaminsav dekaarboxilázt (64K és 65 K); a proteolipid proteint (PLP), a mielinhez kapcsolódó glükoproteint (MAG); a kollagént (ll-es típusú); a hősokk proteint; és a karboxipeptidáz H-t magába foglaló csoportból szelektáljuk.
12. 12. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid nem az említett protein antigénből származik és az említett peptid az említett antigén T sejt epitópját utánozni képes.
13. 13. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid az említett protein antigén egy kriptikus peptidjét jelenti.
14. 14. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid legalább 3,5 átlagos T sejt stimulálási indexszel rendelkezik, amit az említett allergénre érzékeny emberi populációból nyert T sejtekkel végzett in vitro T sejt proliferációs vizsgálattal meghatározunk.
15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy peptid legalább 150 pozitivitási indexszel rendelkezik, amit az említett allergénre érzékeny emberi populációból nyert T sejtekkel végzett in vitro T sejt proliferációs vizsgálattal meghatározunk.

    • · • · • · · · · · · · ....... ·»··.·.:.
16. 16. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid az említett protein antigén megfelelő százalékú T sejt epitópját tartalmazza oly módon, hogy a készítmény alkalmazásakor az antigén által kiváltott betegség tüneteinek kialakulása és előrehaladása csökken.
17. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid az említett protein allergén T sejt epitópjainak legalább 20%-át tartalmazza.
18. 18. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid nem kötődik az IgE-hez vagy az IgE-hez alapjában véve kisebb mértékben kötődik, mint ahogyan az említett protein természetesen előforduló allergénje az IgE-hez kötődik.
19. 19. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptidet homogenitásig tisztítjuk.
20. 20. A 19. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptidet legalább 95% tisztaságig tisztítjuk.
21. 21. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptidet a kémiai szintézist, a rekombináns DNS technikákat, a tisztított teljes protein kémiai hasítását, és a tisztított teljes protein enzimatikus hasítását magába foglaló módszerek közül szelektált módszerrel összhangban termeljük.

    • · • ί ! · · ·

    ........· * * . · . j ” 50
22. 22. A 4. igénypont szerinti terápiás készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót magába foglal.
23. 23. A 22. igénypont szerinti terápiás készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett gyógyszerészetileg elfogadható hordozót a steril vizet, a nátrium foszfátot, a mannitot, a szorbitolt, a nátrium kloridot és ezek bármilyen kombinációját magába foglaló csoportból szelektáljuk.
24. 24. Az 1., 4., 16., vagy a 22. igénypontok szerinti említett készítmény, azzal jellemezve, hogy fiziológiailag elfogadható pH érték mellett vizes oldatban oldható.
25. 25. A 1., 4., 16., vagy a 22. igénypontok szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid az említett protein antigén megfelelő százalékú T sejt epitópját tartalmazza oly módon, hogy a készítmény alkalmazásakor az antigén által kiváltott betegség tüneteinek kialakulása és előrehaladása kiküszöbölődik.
26. 26. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid dózis egységenként körülbelül 1 pg - 3,0 mg peptid/dózis mennyiségben van jelen.
27. 27. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid dózis egységenként körülbelül 20 pg - 1,5 mg peptid/dózis mennyiségben van jelen.

    • · . . . . .··. .

    • :::::

    ···· ··· ·· . _β
28. 28. A 27. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett legalább egy peptid dózis egységenként körülbelül 50 pg - 750 pg peptid/dózis mennyiségben van jelen.
29. 29. A 1., 4., 16., vagy a 22. igénypontok szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább két peptidet tartalmaz.
30. 30. Egy antigénnel szemben érzékeny ember kezelésére szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy legalább egy a 4. igénypont szerinti terápiás készítménnyel kezeljük.
31. 31. Egy antigénnel szemben érzékeny ember kezelésére szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy olyan terápiás készítményt alkalmazunk, mely legalább két izolált és tisztított peptidet tartalmaz, melyek mindegyike meghatározott hosszúságú, meghatározott aminosav maradék szekvenciával rendelkezik és egy protein antigén legalább egy T sejt epitópját tartalmazza, az említett készítmény képes az említett protein antigénre adott antigén specifikus immunválaszt lefelé irányulóan szabályozni olyan embei polpulációban, akik az említett antigén specifikus immunválasznak vannak kitéve, amikor a készítményt nem immunogén formában alkalmazzuk és az említett készítmény a fiziológiailag elfogadható pH értékek mellett vizes oldatban oldódik és stabil marad.
32. 32. Egy antigénnel szemben érzékeny ember kezelésére szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti legalább két készítményt egyidőben vagy egymást követően alkalmazzuk.
33. 33. Egy antigénnel szemben érzékeny ember kezelésére szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy a 31. igénypont szerinti legalább két készítményt egyidőben vagy egymást követően alkalmazzuk.
34. 34. A 30. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt orálisan alkalmazzuk.
35. 35. A 30. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt szubkután alkalmazzuk.
36. 36. A 35. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy a készítményt kezdeti kezelésben alkalmazzuk, az említett kezdeti kezelés a készítmény legalább 3 héten keresztül, de 6 hétnél rövidebb ideig tartó szubkután injektálását jelenti.
37. 37. A 36. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett készítmény említett kezdeti kezelés után legalább három hónappal történő emlékeztető oltását alkalmazzuk.
38. 38. A 36. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett kezdeti kezelés során az egyes egymást követő injekciókat növekvő dózisban alkalmazzuk.
39. 39. A 30. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett antigén egy protein allergént vagy egy autoantigént jelent.

    • · * ·· «» • · · · · • · · · • · · · ♦ ··♦·
40. 40. A 36. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett kezdeti kezelés során az egyes egymást követő injekciókat csökkenő dózisban alkalmazzuk.
41. 41. A 30. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett alkalmazás az említett készítmény sublinguális alkalmazását jelenti.
42. 42. A 30. igénypont szerinti módszer, azzal jellemezve, hogy az említett készítményt intravénásán alkalmazzuk.
43. 43. Egy antigénnel szemben érzékeny ember kezelésére szolgáló módszer, azzal jellemezve, hogy az 1., 16., 22., vagy a 26. igénypontok szerinti legalább egy terápiás készítmény alkalmazását jelenti.