HUT75989A - Novel pesticidal composition and bacillus thuringiensis strain - Google Patents

Description

PESZTICID KÉSZÍTMÉNY ÉS ANNAK ALAPJAUL SZOLGÁLÓ BACILLUS THURINGIENSIS TÖRZS

A találmány tárgyát új Bacillus thuringiensis törzsek képezik, melyeknél gyakorlatilag az összes peszticid aktivitás a törzs tenyészetének felülúszójában található. A törzsek egy olyan anyagot termelnek, mely aktív a Coleoptera rend rovarkártevőivel szemben és fokozza egy Bacillusból származó peszticid aktivitását. A találmány tárgyát képezik továbbá peszticid készítmények, melyek a anyagot és egy peszticid hordozót vagy a anyagot és a Bacillusból származó peszticidet vagy egy kémiai peszticidet és/vagy egy peszticid aktivitással rendelkező vírust tartalmaznak, valamint a találmány tárgyát képezik rovarkártevők leküzdésére használatos, peszticid készítményeket használó módszerek.

Évente a világ kereskedelmileg fontos mezőgazdasági termékeinek - élelmiszerek, textíliák és különféle haszonnövények - jelentős része esik áldozatul a kártevőknek, ami dollár milliókban mérhető veszteséget eredményez. Ezért különböző stratégiákat vetettek be az ilyen kártevők leküzdésére.

Az egyik stratégia széles spektrumú peszticideket használ, vagyis széles tartományban aktív kémiai peszticideket. Sajnálatos módon az ilyen kémiai peszticidek használata sok hátrányt is jelent. így széles aktivitási spektrumuknak köszönhetően ezek a peszticidek a megcélzottól eltérő, hasznos róva rókát, valamint a kártevők parazitáit is elpusztíthatják. Továbbá ezek a kémiai peszticidek gyakran mérgezőek az állatokra

84222-1045 TF • · · · · és az emberekre, ezenkívül gyakori használat után sokszor rezisztencia fejlődik ki velük szemben a megcélzott kártevőkben.

A másik stratégia biopeszticideket alkalmaz: természetesen előforduló patogéneket használ a termés rovar-, gombaés gyomfertőzéseivel szemben. A biopeszticidek toxint termelő baktériumot tartalmaznak, mely toxin mérgező a kártevőre. Általában a biopeszticidek egészében kevésbé károsítják a megcélzottól eltérő organizmusokat és a környezetet, mint a kémiai peszticidek.

A legszélesebb körben használt biopeszticid a Bacillus thuringiensis (B. t.). A Bacillus thuringiensis egy igen elterjedt, pálcikaalakú, aerob, spóraképző mikroorganizmus. Spórázási ciklusa során a Bacillus thuringiensis egy kristályos, delta-endotoxin néven ismert fehérjé(ke)t termel, mely(ek) a rovarlárvákat megöli(k). A Bacillus thuringiensis tehát igen hasznos mezőgazdasági peszticid.

Egyes törzsek, így a Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki és a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, specifikusak a Lepidopterákra. A Bacillus thuringiensis subsp. israelensis a Dipterákra specifikus (Goldberg, 4 166 112 számú egyesült államokbeli szabadalom). Más törzsek, így Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg és mts., 4 766 203 számú egyesült államokbeli szabadalom, 1988) a Coleopterákra specifikus. Egy további, Coleopterákra toxikus Bacillus thuringiensis törzsről 1986-ban számoltak be (Hernnstadt és mts., Bio/Technology 4, 305-308, 1986, 4 764 • ·

372 számú egyesült államokbeli szabadalom, 1988). Ez a törzs Bacillus thuringiensis subsp. san diego, M-7 név alatt ismert és NRRL B-15939 szám alatt helyezték letétbe a Northern Régiónál Research Laboratory, USA-ban. Azonban a 4 764 372 számú egyesült államokbeli szabadalom tulajdonosa, a Mycogen Corp., nyilvánosan elismerte, hogy a Bacillus thuringiensis subsp. san diego törzs azonos a Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis törzzsel. Ezen túlmenően, a 4 764 372 számú egyesült államokbeli szabadalmat átruházták a Novo Nordisk A/S-re. Ezenkívül bemutatásra került egy Bacillus thuringiensis törzs, mely toxikus mind a Lepidopterákra, mind pedig a Coleopterákra (WO90/13651 számon közzétett PCT szabadalmi bejelentés). A W090/13651 számon közzétett PCT szabadalmi bejelentésben leírt toxin molekulatömege 81 kd.

A spórázási ciklus során Bacillus thuringiensis kristályos fehérjé(ke)t termel, mely(ek) kristály delta-endotoxin(ok) néven ismert(ek), molekulatömege 27-140 kd tartományban van és elfogyasztva elpusztítja a rovarlárvákat. Az adott Bacillus thuringiensis törzsön belül a toxikus aktivitás egy vagy több ilyen delta-endotoxin sajátossága. A legtöbb delta-endotoxin protoxin, mely a megcélzott rovar középbelében proteolítikus hasítással alakul át rövidebb, toxikus polipeptiddé (Höfte és Whiteley, Microbial Rév. 53, 242-255, 1989). A deltaendotoxinokat a cry (crystal protein) gének kódolják. Szerkezeti hasonlóság és peszticid specificitás alapján a cry géneket hat osztályba és számos alosztályba sorolják. A fő osztályok: Lepidoptera-specifikus (cryl), Lepidoptera- és Diptera• · · · · specifikus (crylI), Coleoptera-specifikus (crylll), Dipteraspecifikus (crylV) (Höfte és Whitney, Microbiol. Rév. 53, 242255, 1989), Coleoptera- és Lepidoptera-specifikus (cryV génként idézi Tailor és mts., Molecular Microbiology 6, 12111217, 1992) és Nematoda-specifikus (cryV és cryVI génként idézi Feitelson és mts., Bio/Technology 10, 271-275, 1992) gének.

A delta-endotoxinokat rekombináns DNS módszerekkel állították elő. A DNS módszerrel termelt delta-endotoxinok lehetnek kristályos és nem-kristályos formában.

A Bacillus thuringiensis delta-endotoxin nem oldódik vízben, kivéve a lúgos pH-t, és majdnem mindig plazmiddal kódolt. Egyes Bacillus thuringiensis törzsek hőálló adeninnukleotid analóg peszticidet termelnek, a β-exotoxint vagy thuringiensint, mely egyedül is peszticid aktivitású (Sebesta és mts., H. D. Burges (kiadó), Microbial Control of Pests and Plánt Diseases, Academic Press, New York, 249-281, 1981], A β-exotoxint egyes Bacillus thuringiensis tenyészetek felülúszójában is ki lehetett mutatni. Molekulatömege 789, adenozint, glükózt és allarinsavat tartalmaz [Lüthy és mts., Kurstak (szerkesztő) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker,

New York 35-72, 1982], Hordozói - a korlátozás igénye nélkül a következők: Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster és Tetranychus cinnabarinus. Feltételezik, hogy a β-exotoxin toxicitása a DNSel irányított RNS polimeráz kompetitiv gátlására vezethető vissza, ahol ATP-vel lép versenybe. Kimutatták, hogy az öt

Bacillus thuringiensis törzsben (B. t.) a β-exotoxint egy cry plazmid kódolja és hogy a β-exotoxin I. vagy II. típusú βexotoxin lehet (Levinson és mts., J. Bacteriol. 172, 3172-3179, 1990). I. típusú β-exotoxint termel az 1. szerotípusba tartozó Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, a 9. szerotípusba tartozó Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi és a 10. szerotípusba tartozó Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis.

II. típusú β-exotoxint termel a 8ab. szerotípusba tartozó Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, mely aktív Leptinotarsa decemlineata-val (Colorado burgonyabogár) szemben. Egyéb Bacillus thuringiensisből izolált vízoldékony anyag az α-exotoxin, mely toxikus a Musca domestica lárváival szemben (Lüthy, FEMS Microbiol. Lett. 8, 1-7, 1980), a gamma-exotoxinok, melyek különböző proteolitikus enzimek lecitinázok, kitinázok és proteázok - , melyek toxikus hatása csak β-exotoxinnal vagy delta-endotoxinnal kombináltan fejeződik ki (Forsberg és mts., Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria fór Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena), szigmaexotoxin, melynek szerkezete hasonlít a β-exotoxin szerkezetéhez és amely szintén aktív Leptinotarsa decemlineataval szemben (Argauer és mts., Entomol. Sci. 26, 206-213, 1991) és anhidrothuringiensin (Coll. Czechoslovak Chem. Comm. 40, 1775, 1975).

• ·

A W094/09630 számon publikált PCT találmányi bejelentés vízoldékony anyagot ismertet, mely fokozza Bacillus thuringiensis var. kurstaki és Bacillus thuringiensis var. aizawai aktivitását.

Stonard és mtsa. [Natural and Engineered Pest Management Agents, Paul A. Mann, Róbert M. Hollingworth (szerkesztő), ÁCS Washington, D. C. 25-36, 1994] leírja az (1) általános képletű diabroticineket, ahol

1) R, Rí, R₂ = H, R₃ = OH Diabroticin A és

2) R, Rí, R₂, R₃ = H Diabroticin B.

A diabroticineket Bacillus subtilisből izolálták, aktívak Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, moszkitó lárva, Staphylococcus aureus és Micrococcus lutea organizmusokkal szemben, de nem aktívak európai gabonazsizsikkel, Escherichia colival, Bacillus subtilissel és Pseudomonas aeruginosaval szemben. Stonard és mtsai nem ismertetnek egyéb kártevőellenes aktivitást. A Diabroticin A-t Bacillus cereus fermentleveiből is izolál ták.

A mai technika arra törekszik, hogy fokozza a Bacillus thuringiensis formulációk peszticid hatását. Ezt nagyobb peszticid aktivitású új törzsek keresésével, meglevő törzsek átalakításával és hatékonyabb formulációk előállításával, mégpedig Bacillus thuringiensis spórák és/vagy kristályok és új peszticid hordozók vagy kémiai peszticidek kombinálásával kívánták elérni.

A találmány célja ismert Bacillus thuringiensis formulációk rovarölő aktivitásának fokozása.

A találmány célja továbbá a peszticidek peszticid aktivitásának fokozása és új felhasználási területek keresése ismert peszticid termékek számára.

Előnyös az olyan új Bacillus thuringiensis törzsek izolálása, melyek új anyagokat termelnek, úgy, hogy bármely adott rovarkártevővel szemben a biopeszticidek szélesebb körét tudjuk szembeállítani.

A találmány tárgya egy új Bacillus thuringiensis törzs, melynél gyakorlatilag az összes peszticid aktivitás a törzs tenyészetének felülúszójában található. A találmány szerinti Bacillus thuringiensis törzs tenyészetéből nyert kristályos fehérjének és spóráknak egyáltalán nincs peszticid aktivitása. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a törzs az EMCC0077, mely az NRRL B-21090 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0077 törzsével; az EMCC-0078, mely az NRRL B21091 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0078 törzsével; az EMCC-0079, mely az NRRL B-21092 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0079 törzsével; az EMCC-0080, mely az NRRL B-21093 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC0080 törzsével vagy az EMCC-0081, mely az NRRL B-21094 • · törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0081 törzsével.

Az anyag, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és potenciáló vagy szinergista hatást mutat egy másik Bacillusból származó peszticiddel valamely kártevő ellen, ezen törzs tenyészetének felülúszójából nyerhető ki. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a anyag LC₅o értéke (LC₅o az adott peszticid azon koncentrációja, melynél a kártevők 50 %-a elpusztul) Leptinotarsa texanaval szemben 126 pg aktív hatóanyag/g összes anyag. A törzs tenyészetéből készült pellet LC₅o értéke a biológiai értékmérés szerint 3000 pg aktív hatóanyag/g öszszes anyag felett van.

A találmány egy másik szempontja szerint az anyag peszticid aktivitást mutat a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben. Még specifikusabban az anyag aktivitást mutat a Diabrotica undecimpunctata, Leptinotarsa texana és Anthomus grandia speciesek rovarkártevőivel szemben és nem várt aktivitást mutat a Coleoptera rendbe tartozó Ips calligraphus, Popillia japonicus, Epilachna varivastis, Leptinotarsa decemlineata és Dendroctonus frontális rovarkártevők ellen.

A találmány egyik speciális szempontja szerint az anyag fokozza a Bacillus thuringiensis kristályos delta-endotoxin(ok) rovarölő aktivitását rovarkártevőkkel szemben. A találmány egy további speciális szempontja szerint az anyag fokozza a Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis kristályos delta9 endotoxin(ok) rovarölő aktivitását a Coleoptera rend rovarkártevőivel szemben.

A találmány szerint Bacillusból származó peszticid alatt Bacillus (így Bacillus thuringiensis vagy Bacillus subtilis) törzset vagy spórát értünk. Bacillusból származó peszticid lehet Bacillusból származó anyag, például fehérje vagy fehérje fragmens, melynek kártevőellenes vagy peszticid aktivitása van, növényvédőszer, mely megakadályozza a növény elfogyasztását, mikroorganizmus, mely expresszálja a kártevőellenes vagy peszticid aktivitással rendelkező Bacillus fehérjét vagy fragmensét kódoló Bacillus gént (ilyen a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin) és egy megfelelő hordozó (lásd a következő készítményekre vonatkozó részt). A kártevő lehet például rovar, nematóda, atka vagy csiga. Egy mikroorganizmus, mely expresszálja a kártevőellenes vagy peszticid aktivitással rendelkező Bacillus fehérjét vagy fragmensét kódoló Bacillus gént, mely a phylloplanumon (növényi levélfelület) és/vagy a rhizospherán (növény gyökereit körülvevő talaj) és/vagy vizes környezetben él és sikeresen versenybe tud szállni az adott környezetben (vetés és egyéb rovarok természetes előfordulási helye) a vad-típusú mikroorganizmussal és biztosítani tudja a kártevőellenes vagy peszticid aktivitással rendelkező Bacillus fehérjét vagy fragmensét kódoló Bacillus gén folyamatos fenntartását vagy expresszálását. Ilyen mikroorganizmusok - nem korlátozó jelleggel - a baktériumok, így a Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium. Rhodopseudomonas,

MethylophiIius, Agrobacterium, Acetobacter. Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes és Clostridium törzsek, algák, így Cyanophycea,

Prochlorophycea, Rhodophycea, Dinophycea, Chrysophycea, Prymnesiophycea, Xanthophycea, Raphidophycea, Bacillariophycea, Eustigmatophycea, Cryptophycea, Euglenophycea, Prasinophycea és Chlorophycea családok és gombák, különösen az élesztők, így a Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula és Aureobasidium törzsek.

A találmány szerint peszticid aktivitás az az aktivitásmennyiség, mely szükséges a kártevő elpusztításához vagy növekedésének gátlásához vagy a növények védelméhez a kártevő-fertőződéssel szemben.

A találmány tárgyát képezik továbbá peszticid készítmények, melyek az anyagot és Bacillusból származó peszticidet tartalmazzák, valamint a módszerek, melyek a kártevés megfékezésére az ilyen peszticid készítményeket alkalmazzák.

A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti anyag lényegében tiszta minőségben való előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a Bacillus thuringiensis törzset megfelelő növekedési táptalajon tenyésztjük,

b) kinyerjük az a) lépés felülúszóját és

c) a b) lépésben nyert felülúszót az anyag tisztítása céljából oszlopkromatografáljuk.

A találmány szerinti lényegében tiszta minőség alatt olyan • · anyagot értünk, mely 5 %-nál kevesebb szennyezőanyagot, például delta-endotoxin fehérjét tartalmaz.

Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük röviden.

1. ábra Az (I) általános képletű vegyületek előállítását bemutató reakcióvázlat.

2. ábra Az A származék és B származék szerkezete.

3. ábra az la/lb és NOVODOR™ szinergizmus hatásossága Leptinotarsa decemlineataval szemben.

Az anyag előállítása

Az anyag(ok) Bacillus thuringiensis tenyészetének felülúszójából állítható(k) elő, ilyen Bacillus thuringiensis törzs nem korlátozó jelleggel - az EMCC-0077, mely az NRRL B21090 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0077 törzsével; az EMCC-0078, mely az NRRL B-21091 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0078 törzsével; az EMCC-0079, mely az NRRL B-21092 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC0079 törzsével; az EMCC-0080, mely az NRRL B-21093 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0080 törzsével vagy az EMCC-0081, mely az NRRL B-21094 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0081 törzsével.

Az anyag, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben, potenciáló vagy • · szinergista hatást mutat egy Bacillusból származó peszticiddel. A találmány egyik speciális megvalósítási módja szerint az anyag szerkezete az (I) általános képlettel jellemezhető, ahol R! jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoil-csoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, például - nem korlátozó jelleggel - alaniI-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinil- vagy fenilglicinil-csoport,

R₂ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport,

R₃ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetil-amin, tionil-, metil-tionil-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

R₄ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

R₅ jelentése hidrogénatom, metoxi-, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril• · · · · • · · · · C « ··«·· · ·

-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport,

R₆ jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észtercsoport, halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport,

R₇ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos aIkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonátvagy nitrátsók,

R₈ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogénbenzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetiI-amin,tioniI-, metil-tioniI-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

R₉ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport és

R₁₀ jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, így alanil-, valinil-, leucinil-, izoleuciniI-, fenil-ala niI-, glicinil- vagy feniI-gIiciηiI-csoport.

A pirazin nitrogén szubsztituense adott esetben lehet 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észter• · · · • · · · · · csoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-ben zoilcsoport) vagy oxigénatom.

A találmány oltalmi köre kiterjed az összes (I) általános képletű vegyület sztereoizomer formáira, valamint a racemátokra.

A találmány egyik speciális megvalósítási formájában az anyag az (la) illetve (lb) általános képlettel jellemezhető, s ezeket a továbbiakban la-val és Ib-vel jelöljük, ahol la: R, R₁₍ R₂, R₃ = H és lb: R, R₁₍ R₂ = H és R₃ = OH

Bacillus thuringiensist a szakmában ismert táptalajon és fermentációs módszerrel tenyésztettük (Rogoff és mts.,

J. Invertebrate Path. 14, 122-129, 1969, Dulmage és mts.,

J. Invertebrate Path. 18, 353-358, 1971, Dulmage és mts., Microbial Control of Pests and Plánt Diseases, H. D. Burges (szerkesztő) Academic Press, Ν. Y. 1980). A fermentációs ciklus befejezése után a Bacillus thuringiensis spórákat és kristályokat a fermentlétől a szakmában ismert módon, centrifugálással és/vagy ultraszüréssl elválasztva nyertük a felülúszót. Az anyag a felülúszóban található, ahonnan a szakmában ismert módon, ultraszűréssel, bepárlással és permetszárítással nyerhető ki.

Egy másik változat szerint a találmány szerinti vegyület(ek) a szakmában ismert eljárással, kémiai szintézissel állíthatóik) elő.

Az (I) általános képletű szerkezetet, a megfelelő szubsztituenseket és védőcsoportokat tartalmazó, egyszerű • · · · · pirazin gyűrűt több reakciólépésben állíthatjuk elő, például a-amino-karbonil-vegyületek spontán kondenzációjával. Közbülső termékként dihidro-pirazin képződik, mely azonban oxigén hatására könnyen oxidálódik pirazinná. Ezzel a módszerrel egyetlen α-amino-karbonil-vegyület dimerizációja egyetlen pirazint eredményez, míg a két különböző a-amino-karbonil-vegyülettel végzett reakció 3 terméket ad. A megfelelő vegyületet kromatografálással választjuk el (1. ábra). Utóbbi reakcióval lehetővé válik olyan pirazinok szintézise, melyekben különbözőek a szubsztituensek a gyűrű két oldalán.

A vegyület(ek) tisztítása a szakmában ismert módon történhet - nem korlátozó jelleggel - kromatográfiával, (ioncserélő-, affinitás- és méretkizárásos-oszlopkromatográfiával), elektroforézissel, differenciális oldékonyság alapján, extrakcióval vagy a szakmában ismert bármely eljárással (például Protein Purification, szerkesztő J-C. Janson és Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989).

Az anyag aktivitása a szakmában ismert módon, biológiai értékméréssel határozható meg, így mesterséges étrend beépítéssel, mesterséges étrend kiegészítéssel, levélfestéssel, levélbemártással és levélzet permetezéssel. A biológiai értékmérésre speciális példák a következőkben példák alatt találhatók.

Az anyagot tartalmazó készítmények

Az anyag peszticid készítménnyé formulálható vagy egyedül vagy egy Bacillusból származó peszticiddel, mely a fenti definíció szerint egy olyan Bacillus törzs, spóra, fehérje vagy • · annak fragmense, melynek kártevőellenes vagy peszticid aktivitása van és adott esetben egy megfelelő hordozóval, mely peszticid készítmény(ek) lehet szuszpenzió, oldat, emulzió, por alakjában felvihető por, diszpergálható granulátum, nedvesíthető por, emulgeálható koncentrátum, aeroszol vagy impregnált granulátum. Ilyen Bacillus törzs lehet - nem korlátozó jelleggel - a Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (kereskedelemben DIPEL™ Abbott Laboratories, Inc., JAVELIN™ Sandoz, BIOBIT™ Novo Nordisk A/S, FORAY™ Novo Nordisk A/S, MVP™ Mycogen, BACTOSPEINE™ Novo Nordisk A/S és THURICIDE™ Sandoz), Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (kereskedelemben FLORBAC™ Novo Nordisk A/S és XENTARI™ Abbott Laboratories, Inc), Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (kereskedelemben NOVODOR™ Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ Sandoz, M-TRAK™ és M-ONE™ Mycogen), Bacillus thuringiensis subsp.israelensis (kereskedelemben BACTIMOS™ vagy SKEETAL™ Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ Sandoz és VECTOBAC™ Abbott Laboratories, Inc.), Bacillus sphaericus (kereskedelemben SPHERIMOS™ Novo Nordisk A/S), Bacillus thuringiensis. kurstakí/tenebrionis (kereskedelemben FOIL™ Ecogen), Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (kereskedelemben CONDOR™ Ecogen és AGREE™ Ciba-Geigy) és Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (kereskedelemben CUTLASS™ Ecogen). A Bacillusból nyerhető fehérje - nem korlátozó jelleggel - lehet Cryl, Cryll. Crylll, CrylV, CryV és CryVI.

Az anyag formulázható egyéb faktorokkal vagy vegyületekkel is, melyeket egy Bacillus felülúszó felülúszójából nyertünk, beleértve - nem korlátozó jelleggel - olyan exotoxint, és/vagy növelő tényezőt, melyet az 1993. július 20-án benyújtott 08/095 240 számú bejelentésben hoztunk nyilvánosságra s melyet itt referenciaként említünk. Adott esetben a formuláció tartalmazhat még valamely Bacillusból származó peszticidet, kémiai peszticidet és/vagy peszticid tulajdonságokkal rendelkező vírust, valamint megfelelő hordozót.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a készítmény komponensei szinergista hatásúak. Ennek eredményeként a készítmény hatásosabbá válik, mintha a komponenseket külön-külön egyedül alkalmaztuk volna. A szinergizmus azonos vagy nagyobb hatékonyságot tud megvalósítani kisebb és/vagy kevésbé gyakori dózisoknál, mint egy-egy egyedül használt komponens. Vagyis az anyag növelni tudja a Bacillusból származó peszticid aktivitását.

Az anyagot és a Bacillusból származó peszticidet tartalmazó készítményekben az anyag körülbelül 0,001 - körülbelül 300 g per LTU mennyiségben van jelen. A leírás definíciója szerint LTU a biológiai értékméréssel meghatározott Leptinotarsa texana egység. A biológiai értékmérésnél a mintát standard Bacillus referencia anyaggal hasonlítjuk össze, Leptinotarsa texana-t vagy egyéb kártevő organizmust használva standard teszt organizmusként. Az aktivitást úgy határozzuk meg, hogy elosztjuk a referencia standard LD₅o-et, majd megszorozzuk a referencia standard aktivitásával.

• « «

A találmány egy további megvalósítási módja szerint a készítmény tartalmazhatja az anyagot lényegében tiszta formában vagy a Bacillusból származó felülúszót száraz, betöményített vagy folyékony formában és a megfelelő peszticid hordozót, ezekre példák a következőkben találhatók. Ez a készítmény külön is felvihető egy növényre, így például transzgén növényre. Speciális esetben a készítmény felvihető olyan növényre, mely előzőleg már Bacillus thuringiensis gén-hordozó volt. Egy további megvalósítási mód szerint a készítményt felvihetjük olyan növényre, melyet előzőleg már kezeltünk valamely Bacillus thuringiensis készítménnyel. Az anyag a készítményben körülbelül 0,001 % - körülbelül 60 % (tömeg/tömeg) mennyiségben van jelen.

A könnyebb kezelhetőség, valamint megcélzott kártevők elleni bevetés megkönnyítése érdekében a fent ismertetett készítmények a következő anyagok hozzáadásával készülhetnek: felületaktív anyag, inért hordozó, konzerválószer, nedvesítőszer, táplálkozást stimuláló szer, csalogató-vonzó szer, kapszulázó szer, kötőanyag, emulgeálószer, színezék, UV védőszer, puffer, áramlást előmozdító szer és egyéb komponensek.

Alkalmas felületaktív anyagok lehetnek - nem korlátozó jelleggel - anionos vegyületek, így karboxilátok, például hoszszú szénláncú zsírsavak fém-karboxilátjai, N-acil-szarkozinát, foszforsav zsíralkohol etoxilátokkal képezett mono- vagy diészterei vagy az ilyen észterek sói, zsíralkohol-szulfátok, így nátrium-dodecil-szulfát, nátrium-oktadecil-szulfát vagy nátrium-ceti I-szuIfát, etoxilezett zsíralkohol-szulfátok, etoxilezett alkil-fenol-szulfátok, lignin-szulfonátok, petroleumszulfonátok, alkil-arilszulfonátok, így alkil-benzolszulfonátok vagy alacsony szénatomos alkil-naftalinszulfonátok, így butil-naftalinszulfonát, sók vagy szulfonált naftalin-formaldehid kondenzátumok, szulfonált fenol-formaldehid kondenzátumok sói vagy összetettebb szulfonátok, mint az amid-szulfonátok, így az olajsav és N-metil-taurin szulfonált kondenzációs terméke és N-metil-taurin vagy dialkil-szulfo-szukcinátok, így a nátrium-szulfonát vagy dioktil-szukcinát. Nem-ionos szerek lehetnek nem korlátozó jelleggel - zsírsav észterek, zsíralkoholok, zsírsavamidok vagy zsír-alkil- vagy alkenil-szubsztituált fenolok etilén-oxiddal képezett kondenzációs termékei, polihidroxialkohol-éterek zsírsav észterei, így a szorbitán-zsírsav-észterek, az ilyen észterek etilén-oxiddal képezett kondenzációs termékei, így polioxi-etilén-szorbit-zsírsav-észterek, etilén-oxid és propilén-oxid blokk-kopolimerek, acetilén-glikolok, így 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol vagy etoxilezett acetilén-glikolok. Kationos felületaktív anyag lehet például alifás mono-, di- vagy poliamin acetát, naftenát vagy oleát formájában, oxigént tartalmazó amin, mint a poIioxi-etilén-aIkiIamin amin-oxidja, egy karbonsav és egy di- vagy poliamin kondenzációjával készült amidhoz kötődő amin vagy egy kvaterner ammonium-só.

Inért anyagok lehetnek - nem korlátozó jelleggel - szervetlen ásványok, mint a kaolin, mika, gipsz, műtrágya, phy11ősziIikátok, karbonátok, szulfátok vagy foszfátok, szerves anyagok, mint a cukor, keményítők vagy ciklodextrinek vagy növényi anyagok, mint a fa termékek, parafa, porított kukoricacső, rizshánt, földimogyoróhéj és mogyoróhéj.

A találmány szerinti készítmények lehetnek olyan formában, mely alkalmas közvetlen alkalmazásra vagy koncentrátum vagy primer készítmény formájában, melyet használat előtt megfelelő mennyiségű vízzel vagy egyéb hígítószerrel kell felhígítani. A peszticid koncentráció az adott formuláció jellegétől függ, attól, hogy koncentrátumról van-e szó vagy közvetlen felhasználásról. A készítmény 1 - 98 t% szilárd anyagot vagy folyékony inért hordozót és 0 - 50 %, előnyösen 0,1 - 50 % felületaktív anyagot tartalmaz. A készítményt a kereskedelmi termék esetén a címkén feltüntetett dózisban kell adagolni, előnyösen száraz formában 0,01 - 5,0 pound/acre (pound=454 g, acre = 0,405 hektár), folyadék formában pedig 0,01 - 25 pint/acre [pint=570 ml (GB), =470 ml (US)] mennyiségben.

A találmány további megvalósítási módja szerint a Bacillusból származó peszticidet és/vagy anyagot formuláció előtt olyan kezelésnek lehet alávetni, mely a megcélzott károkozó környezetében alkalmazva meghosszabbítja a peszticid aktivitásának élettartamát, feltéve, hogy a kezelés nem teszi tönkre a Bacillusból származó peszticidet vagy vegyületet. A kezelés lehet kémiai és/vagy fizikai jellegű, feltéve, hogy a kezelés nem károsítja a készítmény(ek) aktivitását. Ilyen kémiai reagensek lehetnek például - nem korlátozó jelleggel halogénező szerek, aldehidek, mint a formaldehid és glutáraldehid, fertőtlenítőszerek, mint a zephiran-klorid, alko« · holok, mint az izopropanol és etanol és szövettani fixálók, mint a BoUVn fixáló és a Helly fixáló (Humason, Animál Tissue Techniques, W. H. Freeman and Co., 1967).

A találmány szerinti készítmények rávihetők közvetlenül a növényre, például permetezéssel, vagy beporzással, mikor a kártevő kezd megjelenni a növényen, vagy - elővigyázatossági rendszabályként - annak megjelenése előtt. A találmány szerint védhető növények - nem korlátozó jelleggel - a következők: gabonafélék (búza, árpa, rozs, zab, rizs, sorghum és rokonnövények), répafélék (cukorrépa és takarmányrépa), csonthéjjas, magvas és lágy gyümölcsök (alma, körte, szilva, őszibarack, mandula, cseresznye, eper, málna és földi szeder), hüvelyesek (alfalfa, bab, lencse, borsó, szójabab), olajnövények (repce, mustár, mák, olajbogyó, napraforgó, kókuszdió, ricinusolaj növények, kakaóbab, földimogyoró), uborkafélék (uborka, tök, dinnyék), rostos növények (pamut, len, kender, juta), citromfélék (narancs, citrom, grépfrút, mandarin), zöldségek (spenót, saláta, spárga, káposzta és egyéb dohányfélék, répa, hagyma, paradicsom, burgonya), babérfélék (avokádó, fahéj, kámfor), lombhullató és fenyőfák (hársfa, tiszafa, tölgyfa, égerfa, nyárfa, nyírfa, fenyőfák, vörösfenyő, feketefenyő) vagy olyan növények, mint a kukorica, pázsitnövények, dohány, diók, kávé, cukornád, tea, szőlő, komló, banán és természetes gumi-növények, valamint dísznövények. Az anyag felhordható a levélzetre, a barázdába, granulátumszórással, melléhelyezéssel vagy talajelárasztással. Általánosan alkalmazható rendszabály, hogy a kártevőket a növény «

• · « * · • *···· * · *· « * korai növekedési szakaszában kell megfékezni, mikor a növény a legsebezhetőbb. A permet vagy por tartalmazhat előnyösen további peszticidet is, amennyiben ezt szükségesnek tartjuk. Az egyik előnyös megvalósítási módnál a készítményt közvetlenül a növényre visszük rá.

A találmány készítményei a következő kártevők ellen lehetnek hatásosak: A Coleoptera rend kártevői, így Leptinotarsa sp. (például Leptinotarsa texana, Leptinotarsa decemlineata), Diabrotica undecimpunctata, Dendroctonus frontális, Anthono-mus grandis, Acanthoscelides obtectus, Calloso-bruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popilfia japonica, Rhizotrogus majális, Alphitoblus diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium costaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor.

A találmány készítményei még a következő rovarkár tevők ellen is hatásosak lehetnek - nem korlátozó jelleggel - : « Lepidoptera rend kártevői, így Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrons ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuechniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx móri, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautel-la, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferrea-nus, Cydia pomonella, Datana integerrima,

Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreu-ma loftini, Ephestia elutella,

Erannis tilaria, Estig-mene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea,

Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicover-pa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria.Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lamantria dispar, Macalla thyrsisalis Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca qUVnquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phrygandia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynotaflouendana, Platynota stultana, Platyptilia cardUVdactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineola bisselIiella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Dipterák, így Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, • · • · · · ♦

Calliphora stygia, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufificies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antigua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centrális, Glossina moristans morsitans, Glossina moristans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus eqUVnus, Haematobius irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia channoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericuta, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomaxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tipteroides bambusa Acarik, így Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; Hymenopterák, így Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isopterák, így Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonapterák, így Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, eptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalldes felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans és Tylendikák, így Melodidogne incognita, Pratylenchus penetrans.

A találmányt - nem korlátozó jelleggel - a következő példák mutatják be.

1. példa

Különböző Bacillus thuringiensis izolátumok tenyésztése Az EMCC-0077, EMCC-0078, EMCC-0079, EMCC-0080 és

EMCC-0081 ferdeagar táptalajon fenntartott altenyészeteivel beoltottunk 250 ml-es bedugaszolt rázólombikokat, melyek 50 ml táptalajt tartalmaztak, a következő összetétellel:

Kukoricalekvár 15 g/l

Maltrin-100 40 g/l

Burgonyakeményítő 30 g/l KH2PO4 1,77 g/l

K₂HPO₄ 4,53 g/l.

A táptalaj pH-ját 10 mol/l-es NaOH-dal 7,0-re állítottuk be. Beoltás után a rázólombikokat rázógépen (250/perc) 72 óra hosszat inkubáltuk 30 C°-on. Az aktivitás meghatározására Diabrotica undecimpunctataval szemben a teljes tenyészetet használtuk.

2. példa

Különböző Bacillus thuringiensis izolátumok teljes tenyészetének aktivitása Diabrotica undecimpunctataval szemben

A fenti fermentációból származó teljes tenyészetek

2,5 ml-ét átvittük a rázott lombikokból az 50 ml-es polipropilén • · biológiai értékmérő csövekbe. Mindegyik csőbe annyi Diabrotica undecimpunctata tápot adtunk, hogy a végső térfogat 25 ml legyen. A tesztmintát és a tápot erőteljesen összekevertük, majd biológiai értékmérésre értékmérő tálcákra osztottuk szét. Ezután 3-6 Diabrotica undecimpunctata petét tettünk a táp tetejére. Mylart simítottunk a biológiai értékmérő tálcákra és a tálcákat fotóperiódus nélkül 28 C°-on inkubáltuk. A leolvasást 7 naponként végeztük. A mortalitást az inkubáció után 7 nappal olvastuk le. SS7 = az elpusztult lárvák mérete a 7. napon, összehasonlítva az élő, kontroll lárvák méretével ugyanazon a napon, mint az SS7, amit 4-nek vettünk. SS7 = 3, SS7 = 2 és SS7 = 1 a 75 %-os, 50 %-os illetve 25 %-os lárvaméretet jelenti, a 4 méretű élő, kontroll lárvához képest.

Az eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az eredmények mutatják, hogy mind az öt tesztelt törzs esetében a mortalitás 100 % volt. Ezen túlmenően az elpusztult lárvák mérete 12,5 %-a volt az élő, kontroll lárvákénak.

1. táblázat

Diabrotica undecimpunctata aktivitás teljes táptalajon

Törzs	Mortalitás %	SS7
EMCC-0077	100	0,5
EMCC-0078	100	0,5
EMCC-0079	100	0,5
EMCC-0080	100	0,5
EMCC-0081	100	0,5

3. példa

A Diabrotica undecimpunctata aktivitás lokalizálása Annak felderítésére, hogy a Diabrotica undecimpunctataval szembeni aktivitás a delta-endotoxin/spórákhoz rendelhető-e vagy a felülúszóhoz, EMCC-0077, EMCC-0080, EMCC0081 és NB125 (azonos körülmények között tenyésztett Bacillus thuringiensis) teljes tenyészeteinek 2,5 ml-ét 15 percig centrifugáltuk 15 000/perc fordulatszámmal (Sorvall SS34 rotor) Sorvall RC-5B centrifugában, ekkor különvált a felülúszó és a pellet. A kristályos delta-endotoxinokat és a spórákat a pelletből lehetett visszanyerni. SDS-PAGE-el meghatározva a Diabrotica undecimpunctata-val szemben hatásos delta-endotoxinok molekulatömege, melyeket az EMCC-0077

B. t. izolátum termelt, 66kD, 29kD és 12kD. SDS-PAGE-el meghatározva a Diabrotica undecimpunctata-val szemben ha• · tásos delta-endotoxinok molekulatömege, melyeket az EMCC0078 B. t. izolátum termelt, 153kD, 77kD, 67kD, 61kD, 50kD, 42kD, 34kD, 30kD és 24kD. SDS-PAGE-el meghatározva a Diabrotica undecimpunctata-val szemben hatásos deltaendotoxinok molekulatömege, melyeket az EMCC-0080 B. t. izolátum termelt, 94kD és 40kD. SDS-PAGE-el meghatározva a Diabrotica undecimpunctata-val szemben hatásos deltaendotoxinok molekulatömege, melyeket az EMCC-0081 B. t. izolátum termelt, 129kD és 32kD.

Az összes fenti centrifugálással kapott felülúszót (2,5 ml) 50 ml-es, biológiai értékméréshez használatos polipropilén csőbe vittük át. A pelletet felszuszpendáltuk 2,5 ml steril desztillált vízben és külön 50 ml-es, biológiai értékméréshez használatos polipropilén csőbe vittük át. A biológiai értékméréshez használatos polipropilén csövekbe, melyek vagy a felülúszót vagy a felszuszpendált pelletet tartalmazták, ezután Diabrotica undecimpunctata tápot adtunk úgy, hogy a végső térfogat 25 ml legyen. A biológiai értékmérés további lépései azonosak voltak a fent leírtakkal. Az értékmeghatározás szintén ugyanúgy történt, mint fent.

A 2. táblázatban összefoglalt eredmények mutatják, hogy az EMCC-0077, EMCC-0080 és EMCC-0081 Diabrotica undecimpunctata aktivitása az összes felülúszóban jelen volt, míg az ismert Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis minor Diabrotica undecimpunctata aktivitása a pelletben koncentrálódott (spóra + kristály).

2. táblázat

A felülúszó és a pellet Diabrotica undecimpunctata aktivitása

Törzs	Frakció	Mortalitás %	Gátlási érték
EMCC-0077	Felülúszó	100	0,5
	Pellet	10	3,0
EMCC-0080	Felülúszó	100	0,5
	Pellet	0	4,0
EMCC-0081	Felülúszó	100	0,5
	Pellet	0	3,0
NB125	Felülúszó	0	3,0
	Pellet	50	1,5

4. példa

Aktivitás Leptinotarsa texanaval szemben

Az 1. példában kapott EMCC-0080 felülúszót 0,2p-os membránon szűrtük s ezt használtuk a rovarellenes aktivitás mérésére.

A leszűrt felülúszót 20 GPA (gallon per acre) térfogatban felvittük a törökparadicsom (padlizsán) levélzetére. A hígítás 0, 1:1, 1:4 és 1:8 (felülúszó:ionmentes víz, térf/térf) volt.

Standard protokoll szerint a Leptinotarsa texana lárvákat összehoztuk a kezelt levelekkel. Mindegyik növényre 20 Leptinotarsa texana lárvát vittünk fel.

• ·

A 3. táblázatban összefoglalt eredmények mutatják, hogy az EMCC-0080 szűrt felülúszója aktív Leptinotarsa texana-val szemben.

3, táblázat

EMCC-0080 aktivitása Leptinotarsa texana-val szemben

Törzs	Híqítás	Mortalitás %
EMCC-0080	0	95
	1:1	55
	1:4	20
	1:8	0
Kezeletlen kontroll		0

5. példa

Az EMCC-0080 és NOVODOR™ szinergista hatása A fenti 3. táblázat eredményeiből kitűnik, hogy az EMCC0080 egyedül, 1:8 (térf/térf) hígításban nem fejt ki aktivitást. Azonban, ha a törökparadicsom levélzetét 1,25 % vagy 2,5 % 10-szeresére koncentrált EMCC-0080 felülúszó plusz 200 μg NOVODOR™-ral (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dánia) kezeltük milliliterenként; szinergista hatás érvényesült amit a NOVODOR™ LC₅o és LC₉o értékének éles csökkenése is tanúsí tott. Az adatokat a 4. táblázatban foglaltuk össze.

4. táblázat

Az EMCC-0080 és NOVODOR™ szinergista hatása

Minta	LC5o(u/a)1	LCgofu/fl)2	Meredekséq3
NOVODOR™	642	4286	1,55
NOVODOR™ + 1,25 % EMCC-0080	250	1292	1,79
NOVODOR™+ 2,5 % EMCC-0080	98	490	1,83

¹ LC₅o az a koncentráció, mely elpusztítja a megcélzott rovarpopuláció 50 %-át.

² LCgo az a koncentráció, mely elpusztítja a megcélzott rovarpopuláció 90 %-át ³ A meredekség a mortalitás (%) - lóg koncentráció görbe meredeksége

6. példa

A B. t. EMCC-0080 törzs által termelt Colepterán-aktív anyag tisztítása

A B. t. EMCC-0080 törzset 24 óra hosszat tenyésztettük 30 C°-on, pH 7,0-en, egy táptalajon, melynek összetétele g/lben a következő:

• ·

Maltodextrin 40 g/l

Szójafehérje 40 g/l

KH2PO4 1,8 g/l

K₂HPO₄ 4,5 g/l

MgSO₄.7H₂O 0,3 g/l

Nyom fémek 0,2 ml.

A B. t. EMCC-0080 törzs teljes tenyészetéből a sejteket és egyéb oldhatatlan anyagokat centrifugálást követő szűréssel (Celite és 0,2 μ membrán) távolítottuk el. A kapott szűrletet bepárlással térfogatának tizedrészére töményítettük be.

A 10-szeresére koncentrált permeátumból a coleopteranaktív anyag(oka)t négylépcsős eljárással tisztítottuk. A tisztítás alatt az aktivitást az alábbiak szerint felületi biológiai Diaprotica undecimpunctata értékméréssel követtük nyomon és a tisztaságot a 8. példában leírt kapilláris elektroforézissel határoztuk meg. Az összes kromatográfiás lépésnél 226 nmnél detektáltunk.

A felületi biológiai értékmérésnél a következőképen jártunk el. A mikrotiter lemez lyukaiba, melyek 200 μΙ szilárd, szintetikus rovartápot tartalmaztak lyukanként, bevittük a 10szeresre koncentrált permeatum mintákat, majd levegőn megszárítottuk. Ecsettel óvatosan 2-4 Diaprotica undecimpunctata újszülöttet (búza gyökérféreg, CRW) helyeztünk mindegyik lyukba. A mikrotiter lemezeket ezután lezártuk Mylarral, melyet a levegőcsere biztosítására kilyukasztottunk, majd 30 C°-on 80 % nedvességtartalom mellett inkubáltuk. ötnaponta értékeltük ki a százalékos mortalitást.

·· · · · · « ····· · ·

Első lépésben a 10-szeresére koncentrált permeátumot oszlopkromatográfiával (5 x 30 cm) Pharmacia SP Sephadex®C-25 kationcserélőn tisztítottuk. Egy 10-szeresére koncentrált permeátum mintát (450 ml) ionmentesített vízzel 18 literre hígítottuk és felvittük egy oszlopra, melyet előzőleg pH 5,0-ön 20 mM ammónium-acetát pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 18 ml/perc sebességgel gradiensen eluáltuk pH 5,0-ön 5,0 I ammónium-acetát pufferrel, melynek töménységét folyamatosan 20 mM-ról 0,5 M-ra növeltük. 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, melyeknek mértük biológiai aktivitását és megvizsgáltuk tisztaságát. Az aktív frakciókat egyesítettük (közelítőleg 150 ml), liofilizáltuk és ismét feloldtuk ionmentesített vízben eredeti térfogatának 1/5-öd részében.

A második lépésben egy 25 ml-es mintát az első lépésből felvittünk egy BioRad P2 (extra fine) kizárásos oszlopra (5 x 100 cm) melyet előzőleg ionmentesített vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 1 ml/perces sebességgel ionmentesített vízzel eluáltuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, mértük biológiai aktivitásukat és kapillár-elektroforézissel megvizsgáltuk tisztaságukat. Az aktív frakciókat (közelítőleg 400 ml) egyesítettük.

A harmadik lépésben az egyesített 400 ml eluátumot a második lépésből 16 literre hígítottuk ionmentesített vízzel. Az oldatot felvittük egy Pharmacia S Sepharose® Fást Flow (erős kationcserélő) oszlopra (5 x 30 cm), melyet előzőleg 20 mM ammónium-acetát pufferrel hoztunk egyensúlyba pH = 5,0-ön. Az oszlopot pH = 5,0-ön, 17 ml/perces sebességgel gradien• · sen eluáltuk 5,0 liter ammónium-acetát pufferrel, melynek töménységét folyamatosan 20 mM-ról 0,5 M-ra növeltük. 20 mles frakciókat gyűjtöttünk, meghatároztuk biológiai aktivitásukat és vizsgáltuk tisztaságukat. Az aktív frakciókat egyesítettük (közelítőleg 250 ml) és - az illékony ammónium-acetát puffer eltávolítására - szárazra liofilizáltuk.

A negyedik lépésben az egyesített eluátumok IiofiIizátumát a harmadik lépésből feloldtuk 400 ml ionmentesített vízben. Az oldatot felvittük egy BioRad Chelex® 100 oszlopra (0,9 x 30 cm), melyet előzőleg 20 mM ammónium-formát pufferrel hoztunk egyensúlyba pH 4,0-en. Az oszlopot pH = 4,0-en, 5 ml/perces sebességgel gradiensen eluáltuk 2,4 liter ammónium-formát pufferrel (gradiens 0,02-»0,1 -»0,2-»0,35^0,5->1,0 M). 20 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, meghatároztuk biológiai aktivitásukat és vizsgáltuk tisztaságukat. Az aktív frakciókat egyesítettük (közelítőleg 300 ml) és - az illékony ammóniumformát puffer eltávolítására - szárazra liofilizáltuk.

Kapilláris-elektroforézissel kimutattuk, hogy a tisztított coleopteran-aktív anyag két komponenst - la és lb - tartalmaz.

7. példa

A coleopteran-aktív anyagok szerkezetfelderítése

Az la és lb vegyületek szerkezetét acetilezett származékaik spektroszkópiai adatai alapján határoztuk meg.

114 mg keveréket (la és lb) 5,0 ml piridinben, egy kristály 4-dimetil-amino-piridin katalizátor jelenlétében,

5,0 ml ecetsavanhidriddel acetileztünk 24 óra hosszat, szobahőfokon, majd fél-preparatív RP-Ci₈ HPLC-vel tisztítottuk. 25 μΙ-ben levő 5 mg mintát felvittünk az oszlopra és 4 ml/perc sebességgel eluáltuk 80% víz - 20% acetonitril keverékével. A detektálás 254 nm-nél történt.

A tisztítás két acetil származékot eredményezett:

A származékot és B származékot. Az A származék és B származék szerkezetét a 4. ábra mutatja be.

Az A származék NMR spektroszkópiai adatai 14 szénatom és 17 proton jelenlétét mutatták ki. A tömegspektrometriás adatok szerint viszont a molekulatömeg 652 és az összegképlet C28H₄oN₆Oi2 (pontos tömeg 653,2801, MH ⁺ , számított 653,2782). Ezért a vegyület szimmetrikus, ahol az NMR csak a jelek felét regisztrálja.

Az NMR számos spin-rendszert regisztrál. A magas térerősségnél, 8,6 ppm-nél (H-3 és H-6) megjelenő proton szinglettek a 2 és 5 helyzetben szubsztituált központi pirazin gyűrűt jelzik, melyek széles tartományban csatolódnak a gyűrű összes szénatomjához és az oldallánc első szénatomjához (C7). A három szénatomos oldallánc mind a 7 mind a 8 helyzetben acetilezett és a 9 helyzetben metiléncsoport van. A 9 helyzet szénatomja korrelációban van egy észter-karbonillal, mely észter egy alanin része, mely acetilezett aminocsoportot tartalmaz.

A B származék szerkezete egyetlen helyzetben különbözik az A származék szerkezetétől. A B származéknál egyik oldalláncban a C-7 szénatom nincs acetilezve, nem kötődik oxigénhez sem, hanem egy metiléncsoport. A másik oldallánc azonos az A származék oldalláncával. Az egyetlen oxigénatomban le·» · · • ···« vő különbség a tömegspektrometriás adatokban is megnyilvánul. A tömegspektrum szerint a B származék pontos tömege 595,2722 (MH⁺, számított 595,2727), összegképlete: C26H38N6Oio. Az A és B származék optikai forgatóképessége: A származék: [a]D²⁷=-6,9° és B származék: [a]D²⁷=+32°. Az ¹H és a ¹³C NMR adatok hozzárendelését a COSY, HMQC és HMBC lecsatolási kísérletek alapján végeztük; ezeket az 5. táblázatban foglaltuk össze.

5. táblázat

Az A származék és B származék ¹H és a ¹³C NMR adatai

D-4 metanolban

Helyzet	LH (mult.,inteq.,csa- tolási állandók
	A származék	B származék	A	B
2			152,9	154,7
3 5	8,6 (s,lH)	8,54 (s.lH)	144,2 152,9 144,2	144,4 151,1
6	8,6 (s.lH)		145,6
7	5,84 (d,lHJ=7,4 Hz)	2,95 (dd,lH, J=13,9.9,2) 3,10 (ddJH, J=13,9,4,8)	74,0	37,5
8	4,72 (m.lH)	4,48 (m.lH)	52,1	i 50f2
9	4,24(dd,lH. J= 11,5,6,7 Hz) 4,30 (dd,lH,	4,ll(dd,lH, J=11,4,6,7) 4.20 (m.lH)	63,5	66,3

21 22

J= 11,5,6,7 Hz)

4,20 (q,lHJ=7,1 Hz) 1,2 (d,3HJ= 7,1 Hz) 5,84 (d,lHJ=7,4 Hz) 4,72 (m,lH)

4,24 (dd,lH,

1=11,5,6,7 Hz)

4,30 (dd,lHJ=l 1,5,6,7)

4,20 (q,lHJ=7,l Hz) 1,2 (d,3HJ= 7,1Hz) 2,1*

2,0*

1,95*

1,95*

2,0*

2,1*

4,20 (m.lH)

1,17 (d,3HJ=7,3)

5,80 (d,lHJ=7,4)

4,70 (m,lH)

4,20 (m.lH)

4,30 (dd,lHJ= 11,6.6,8)

4.20 (m.lH)

1.20 (d,3HJ=7,3Hz) 1,97

2,02

2,09

2,03

174,81 174,7

503 49,8

17,8 18,1

74,0 73,9

52,1 52,1

63,5 63,6

174,81 174,7

50,3 50,4

17,8 17,8

171,41 171,4

20,6** 20,6

17291 1724

20,5** 22,5

172^31 172,5

5** 22.6

172,31 172,9

22,5** 20,7

172,91 171,4

20,5** 20,6

171,41 20,6** + , + + , f jelek felcserélhetők ·

Az la és Ib vegyületek keverékének tömegspektrometriai adatai két molekulaiont adnak 400 és 384 molekulatömeggel. Ezek szerint az adatok szerint az la vegyület összegképlete C₁₆H₂eN₆O6 és az 1b vegyületé Ci₆H₂₈N₆O₅. la és Ib szerkezetét úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk az A származék és a B származék NMR adatait az la és Ib keverék NMR adataival. Ezek szerint az la és Ib szerkezetét az (1) általános képlet adja meg az alábbiak szerint la: R, Rí, R₂, R₃ = H

Ib: R, Rí, R₂ = H, R₃ = OH

Az la és Ib vegyületek, valamint acetilezett származékaik tulajdonságait az alábbiakban foglaltuk össze:

A származék:

Molekulatömeg: 652

Összegképlet: C₂₈H₄oN₆Oi₂

UV (MeOH): 275, 310 nm

MS (FAB): (M + H) m/z 653,2801, számított: 653,278

B származék:

Molekulatömeg: 594

Összegképlet: C₂6H₃8N₆O₁₀

UV (MeOH): 275, 310 nm

MS (FAB): (M + H) m/z 595,2722, számított: 595,2727 _l_a

Molekulatömeg: 400

Összegképlet: Ci6H₂₈N₆O₆

UV (MeOH): 275, 310 nm

MS (FAB): (M + H) 401.

Jb.

Molekulatömeg: 384

Összegképlet: Ci₆H₂8N₆O5

UV (MeOH): 275, 310 nm

MS (FAB): (M + H) 385.

8. példa la és lb kvantitatív meghatározása a fermentlében

A B. t. EMCC-0080 törzset az 1. példában leírtak szerint tenyésztettük. Az la és lb vegyület koncentrációját a fermentlében kapillárelektroforézissel határoztuk meg.

A kvantitatív meghatározásnál BioRad Biofocus 3000, bevonatmentes kapillárissal (50 pm x 50 cm) felszerelt elektroforézis rendszert, 0,1 M foszfátot (pH 2,5), 20 kV-ot, pozitívtól negatívig terjedő polaritást és 200 nm-nál végzett detektálást használtunk. A minta térfogata 30 pl volt, 5 psi második injektálás mellett. Az analízis időigénye 10 perc, az la és lb coleopteran-aktív vegyületek 6,0 ill. 5,9 percnél eluálódtak.

Egy másik változat szerint a kvantitatív meghatározásnál Beckman P/ACE 2100, bevonatmentes kapillárissal (50 pm x 47 cm) felszerelt elektroforézis rendszert, 0,1 M foszfátot (pH 2,5), 20 kV-ot, pozitívtól negatívig terjedő polaritást és 200 nm-nál végzett detektálást használtunk. A minta térfogata 30 pl volt, 10 psi második injektálás mellett. Az analízis időigénye « · perc, az la és Ib coleopteran-aktív vegyületek 7,0 ill. 6,7 percnél eluálódtak.

A B. t. EMCC-0080 törzs teljes tenyészetéből a sejteket és egyéb oldhatatlan komponenseket centrifugálással, valamint Celite-en és 0,2 μ-os membránon végzett szűréssel távolítottuk el. A kapott felülúszót a fentiek szerint kapillárelektroforézissel analizáltuk. Az eredmények alapján az la és Ib coleopteran-aktív vegyületek a tenyészetben különkülön közelítőleg 90 mg/l mennyiségben termelődtek.

9. példa

Az la és Ib vegyület aktivitásának meghatározása

Az la és Ib vegyületek nyers keverékének viszonylagos aktivitását (közelítőleg 1:1 tömeg/tömeg) Leptinotarsa texana teszt-rovar alkalmazásával határoztuk meg, a mortalitást Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis belső standard készítmény mortalitásával hasonlítottuk össze.

Levélzeti biológiai értékmérést alkalmaztunk az la és Ib nyers keverék aktivitásának meghatározására Leptinotarsa texana-val szembeni. A levélzeti biológiai értékmérésnél a teszt anyagot és a standardeket bemértük 50 ml-es centrifuga csövekbe és felszuszpendáltuk 0,1 % Tween®20-at tartalmazó ionmentesített vízben. Bemértünk 1200 mg Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis standardét és felszuszpendáltuk úgy, hogy a végső koncentráció 12 000 pg/g legyen. A teszt mintákat (NOVODOR™ és NOVODOR™ plusz la és Ib) hasonló módon kezeltük, hacsak a dóziskereső biológiai mérés nem mutatott arra, hogy az alkalmazott dózis túl magas, vagy

túl alacsony ahhoz, hogy értékelhető mérési pontot kapjunk. Ebben az eseben a hígítószer mennyiségének változtatásával megnöveltük vagy csökkentettük az elsődleges törzsoldat koncentrációját. Ezután mindegyik mintát Virtis homogenizálóval 30 másodpercig homogenizáltuk és 20 másodpercig ultrahanggal kezeltük 100 wattnál Braunsonic 1510 ultrahangos homogenizálóval. Utána - Hamilton Microlab 1000 segítségével - mindegyik törzsoldatot felhígítottuk, így 3000, 2000, 1333, 857, 545, 364 és 245 pg/ml-es sorozat-hígításokat kaptunk összesen 16 ml-ben. Ezután Devries Linear Track permetezőt használva - mely úgy volt kalibrálva, hogy 20 gallon per acret juttasson a területre - mindegyik 16 ml-es oldatot felvittünk közelítőleg 288 négyzet-inch törökparadicsom (padlizsán) levélre. A kontroll leveleket 16 ml ionmentesített vízzel permeteztük le. A leveleket megszárítottuk a levegőn és egy 1 unciás (1 uncia = 28,35 g) tiszta műanyag pohár peremére helyeztük, mely 5 másod lárvaállapotú Leptinotarsa texana lárvát tartalmazott. A levelekre kartonfedőket helyeztünk, helyrenyomtuk, amivel 4 cm-es levélkorongokat vágtunk ki, mely így bezáródott a pohár belsejébe. Ekkor a poharakat megfordítottuk és a lárvák ráestek a levél kezelt felületére. Mindegyik sorozathígításhoz 8 ilyen poharat készítettünk. A poharakat ragasztószalaggal összekötöttük, felcímkéztük, állványra helyeztük és 30 C°-on 3 napig inkubáltuk 65 %-os relatív nedvességtartalom mellett. Az 56 kísérleti pohár és a 8 kontroll pohár képezett egy biológiai értékmérést.

• · · ·

Három nap után kiértékeltük a rovar-mortalitást. Mindegyik poharat erősen megütöttük és a nem mozduló lárvákat elpusztultnak tekintettük. Kiszámítottuk a százalékos mortalitást és az adatokat probit analízissel értékeltük. Megbecsültük az LC₅o- és LCgo-értékeket, a regressziós egyenesek meredekségét, a variációs együtthatót és az aktivitásokat.

Az aktivitás meghatározására az la és lb nyers keverékét meghígítottuk, meghatároztuk Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis standard-hez viszonyított biológiai aktivitását, melynek hozzárendelt aktivitása 20 000 LTU/g (Leptinotarsa texana egység/g) volt.

Az aktivitásokat a lenti 6. táblázatban tüntettük fel. Az la és lb vegyület (1:1 tömeg/tömeg) aktivitása: 75 555 LTU/g hatóanyag, LD₅o = 70 μg/ml (1,8 mg összes aktív hatóanyag milliliterenként).

6. táblázat la és lb vegyület keverékének aktivitása

Minta la/lb keverék

LC 50. ug/ml

Becsült aktivitás

555 LTU

10. példa

Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis kristályos deltaendotoxin potenciálása az la és lb vegyületekkel • ·

Az la és lb vegyületeknek azt a képességét, hogy potenciáin! tudják a Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis kristályos delta-endotoxin rovarölő aktivitását Leptinotarsa texanaval szemben úgy határoztuk meg, hogy az la és lb vegyületek nyers keverékét hozzáadtuk NOVODOR™-hoz és párhuzamos probit analízissel mértük az LD₅₀ értékeket.

A potenciálás mértékének meghatározásához, amit azzal értünk el, hogy hozzáadtuk az la és lb vegyületeket NOVODOR™-hoz, levélzeti biológiai értékmérést alkalmaztunk Leptinotarsa texana-val szemben. Az la és lb vegyületek nyers keverékét hozzáadtuk NOVODOR™-hoz. Az oldatokból Hamilton Microlab 1000-rel sorozathígításokat készítettünk, így olyan törzsoldatokat nyertünk, melyek 1000,0, 666,7, 444,4, 285,7, 181,8, 121,2 és 80,0 pg/g NOVODOR™-t tartalmaztak. Az la és lb keverékből két különböző hígítást készítettünk, így hét sorozathígítást kaptunk, 72,0, 48,0, 32,0, 20,6, 13,1, 8,7 és 5,8 μg/g (2,5 % térf./térf. + 1000 μg/g NOVODOR™), illetve 36,0, 24,0, 16,0, 10,3, 6,5, 4,4 és 2,9 μg/g (1,25 % térf./térf. + + 1000 μg/g NOVODOR™) koncentrációban. Üres mintákat (la és lb vegyületek nélkül) és referencia vegyületeket is készítettünk. A párosított üres minták LC₅o értékét elosztva a potenciált LC₅o értékkel, megkaptuk, hogy hányszorosára csökkent az la és lb vegyületekhez rendelhető LC₅₀ érték.

Az alábbi, 7. táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy az la és lb vegyület nyers keveréke potenciálja a NOVODOR™ rovarölő aktivitását Leptinotarsa texanaval szemben.

« ·

7. táblázat

A NOVODOR™ aktivitásának potenciálása az la és Ib vegyület keverékével Leptinotarsa texanaval szemben

Minta	LCso ud/ml	Potenciáló tényező
NOVODOR™	642	0
NOVODOR™+ 1,25 % la/lb	250	2,6
NOVODOR™ + 2,50 % la/lb	98	6,5

11. példa

Az la és Ib vegyületek keverékének aktivitása Ips calligraphus és Dendrotonus frontális rovarokkal szemben

Meghatároztuk az la és Ib vegyületek nyers keverékének toxicitását Ips calligraphus és Dendroctonus frontális rovarokkal szemben. Az la és Ib vegyület nyers keverékének oldatából 3 ml-t (1,8 mg hatóanyag/ml) hozzáadtunk liofilizált Lobolly fenyőháncshoz és 7 ml desztillált vízhez. A kontroll tápot 10 ml vízzel készítettük el. A tápot elosztottuk 3 petri csészébe és mindegyik csészébe 5-10 csupasz felnőtt Ips vagy frissen kikelt Dendroctonus rovart helyeztünk. A kezelt táp három különböző sarzsát és a kontroll tápot 10 - 20 rovarral telepítettük • · · · · be. A petri csészéket sötétben inkubáltuk 25 C°-on, majd a tápra helyezés után 4, 7 és 10-12 nappal megszámoltuk az elpusztult rovarokat. Az eredmények 2 vagy 3 különálló, ismételt kísérlet átlagai mindegyik rovarfajta esetén.

Az Ips calligraphusra vonatkozó eredmények az alábbi

8. táblázatban azt mutatják, hogy az la és lb vegyület nyers keveréke rovarölő hatású.

8. táblázat

Az la és lb vegyület keverékének hatása Ips calligraphusra

Kezelés	Kezelést követő nap	Rovarszám	Elpusztultak átlaga	%-os mór- talitás átlaga
Kontroll	4	20	0	0
Kontroll	7	20	0	0
Kontroll	10	20	1	3
la/lb	4	20	1	5
la/lb	7	20	7	35
la/lb	10	20	20	100

Az Dendroctonus fragilisra vonatkozó biológiai értékmérés eredményei az alábbi, 9. táblázatban azt mutatják, hogy az la és lb vegyület keveréke rovarölő hatású.

9, táblázat

Az la és Ib vegyület keverékének hatása Dendroctonus frontálisra

Kezelés	Kezelést követő nap	Rovarszám	Elpusztultak átlaga	%-os mór- talitás átlaga
Kontroll	4	14-20	0	0
Kontroll	7	14-20	1	7
Kontroll	10-12	14-20	3	16
la/lb	4	10-20	1	5
la/lb	7	10-20	1	5
la/lb	10	20	14	83

12. példa

Aktivitás Popillia japonicaval (japán rovar) szemben Meghatároztuk az la és Ib vegyület nyers keverékének peszticid aktivitását harmad lárvaállapotú Popillia japonicaval szemben. Évelő rozsgyökeret (11 napos) belemártottuk az la és Ib vegyület nyers keverékébe (1,8 mg/ml la + Ib) és hagytuk részben megszáradni. A harmad lárvaállapotú Popillia japonica lárvákat betettük a kezelt gyökereket tartalmazó konzervdobozba. 24 óra elteltével a gyökereket és a lárvákat befedtük Wooster iszapos agyaggal. A kontroll gyökereket vízbe mártottuk és a kezeletlen kontrolinál a lárvákat közvetlenül az agyagba helyeztük az első napon. A konzervdobozokat sötét47 ·» · * · * • »···« · · ·» · · ben inkubáltuk 25 C°-on és az elpusztult lárvák számát a 7., 10., 21., 28. és 36. napon határoztuk meg és jelentettük a kontrollal korrigált mortalitást:

[(kontroli-túlélő - kezeIést-túIéIö)/kontro11-túIéIő] x 100 %. Minden kezeléshez összesen 25 lárvát használtunk.A

10. táblázatban összefoglalt eredmények mutatják, hogy az la és Ib vegyületek nyers keveréke hatásos a lárva állapotú Popillia japonicaval szemben.

10, táblázat la és Ib vegyületek aktivitása Popilia japonicaval szemben

	7. nap	10. nap	21. nap	28. nap	36. nap
Keze- letlen	Elpusztult #	2	2	4	5	5
Vizes	Elpusztult	2	3	8	10	11
kontrol I	# Kontroll %	0	4,3	19	25	30
la és	Elpusztult	6	8	13	14	15
Ib	# Kontroll %	17,4	26,1	42,9	45	50

13. példa

Aktivitás Epilachna varivestissel (mexikói babbogár) szemben

Meghatároztuk az la és lb vegyületek nyers keverékének (1,8 mg/ml) peszticid aktivitását harmad lárvaállapotú Epilachna varivestis lárvákkal szemben. Kalitkába zárt Epilachna varivesis felnőtteket 80 F°-on, 50 % relatív nedvességtartalom mellett és 16:8 fotoperiódus alkalmazásával tartottuk fenn növekedési kamrában Burpee limababon. A petetömeget összegyűjtöttük és hagytuk, hogy egy vizes vattát és limabab leveleket tartalmazó petri csészében kikeljenek. Két nappal később öszegyűjtöttük a másod lárvaállapotú lárvákat és ezeket használtuk a levél-bemártásos biológiai értékméréshez. A biológiai értékméréshez begyűjtöttük a bableveleket és egyetlen levél szárát átszúrtuk a 4 ml vizet tartalmazó virágkertész cső gumi elválasztófalán. Megszáradás után minden egyes levélre 8-10 másod lárvaállapotú lárvát helyeztünk. A rovarokat, leveleket és a virágkertész csövet 22 unciás papírpohárba helyeztük, melyet finom háló borított. A poharakat ugyanabban a növekedési kamrában tartottuk, mint amit a rovartelep felneveléséhez használtunk. Minden második nap a poharakat eltávolítottuk a növekedési kamrából, megszámoltuk a lárvákat és a leveleket kicseréltük frissen kezelt levelekre. A teszteket 8 nap múlva fejeztük be.

A 11. táblázatban összefoglalt eredmények mutatják, hogy az la és lb vegyületek nyers keveréke hatásos az Epilachna varivesis lárvákkal szemben.

11. táblázat

Epilachna varivesis lárvák dózis - mortalitás válasza

Kezelést kö-	LC50	95 %-os	megbízhatósági
vető nap			határ
	%	alsó	felső
4	5,6	2,58	10,65
6	2,12	3,03	9,37
8	1,94	0,75	2,81

14. példa

Szabadföldi kísérlet Leptinotarsa decemlineataval (Colorado burgonyabogár) szemben

Burgonya Leptinotarsa decemlineata (Katahdin variáns) fertőzése ellen az la és lb vegyületek nyers keverékét 50, 100, 150 és 300 g/acre mennyiségben, NOVODOR™-ral kombinálva - 0,5 és 1,0 quart/acre mennyiségben (1 quart =1,136 I) alkalmaztuk, A NOVODOR™-t egyedül is alkalmaztuk, 0,5, 1,0 és 2,0 quart/acre mennyiségben. Kétszer végeztünk kezelést, hét kezelésmentes nap közbeiktatásával, háti CO₂ permetezővel (3 Spray Systems TXVX-12 üreges szórófej soronként), mely úgy volt kalibrálva, hogy 32 GPA-t (gallon per acre) szórjon ki 3 mph sebességgel 56 psi-n. Minden kezelést négyszer ismételtünk meg a területen két sorban (egymástól 34 inch távolság50 ra) 25 láb távolságban, randomizált blokk elrendezésben. A Leptinotarsa decemlineata rovarok és lárvák számát felülről számoltuk meg területenként 50 láb hosszú sorban úgy, hogy ne mozgassuk meg a levélzetet.

A 3. ábrán közölt eredmények mutatják, hogy burgonya esetében az la és lb vegyületek nyers keveréke jelentős szinergista aktivitást fejt ki NOVODOR™-al. 0,5 quart/acre NOVODOR™ esetében 21 % kontrollt kaptunk, míg 50 g/acre la és lb vegyület nyers keverék esetében 13 % volt a kontroll. Akkor azonban, mikor mind a NOVODOR™-t mind az la és lb vegyület nyers keveréke ugyanilyen mennyiségben volt jelen, a százalékos kontroll 81 %-ra emelkedett. Hasonló módon, 100 g/acre la és lb vegyület nyers keveréke esetén 28 % kontrollt kaptunk, míg 0,5 quart/acre NOVODOR™-nál a kontroll 21 %, azonban, mikor mind a NOVODOR™-t mind az la és lb vegyület nyers keverékét ugyanilyen mennyiségben vittük fel, a százalékos kontroll 81 %-ra emelkedett. Sőt, mikor 50 g/acre la és lb vegyület nyers keverékét és 1,0 quart/acre NOVODOR™-t együtt vittünk fel, a kontroll 88 %-ra emelkedett.

MIKROORGANIZMUSOK LETÉTBE HELYEZÉSE

A Budapesti Szerződés (Budapest Treaty) alapján a következő törzseket helyeztük letétbe az Agricultural Research Service Patent Culture Collection Northern Régiónál Research Center (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA-ban:

• ·

Törzs	Kódszám	Letétbe helyezés dátuma
EMCC-0077	NRRL B-21090	1 993. május 10.
EMCC-0078	NRRL B-21091	1 993. május 1 0.
EMCC-0079	NRRL B-21092	1 993. május 10.
EMCC-0080	NRRL B-21093	1993. május 10.
EMCC-0081	NRRL B-21094	1 993. május 1 0.

A törzseket olyan körülmények között helyeztük letétbe, mely biztosítja, hogy hozzáférhetőek legyenek jelen találmányi bejelentés benyújtásától kezdve, addig az időpontig, amit a Commissioner of Patents and Trademarks határoz meg, akit erre a 37 C.F.R.§1.14 és 35 U.S.C.§122 feljogosít. A letét minden egyes törzs tiszta tenyészete. A külföldi szabadalmi törvények előírásainak megfelelően a letét hozzáférhető minden országban, ahol a találmányt vagy utódját bejelentették. Azonban le kell szögezni, hogy a letét szabad hozzáférhetősége nem jogosít fel a találmány gyakorlati használatára, mely csorbítaná a törvény által biztosított jogot a szabadalomhoz.

A találmány leírása és szabadalmi igénypontjai csak a találmány sokoldalú bemutatására szolgálnak, nem korlátozzák azt az itt leírt speciális megvalósítási formákra. A találmány oltalmi köre kiterjed bármely egyenértékű megvalósítási formára. Valójában különböző módosítások lehetségesek az itt bemutatottakon és leírtakon kívül, melyek a bejelentés alapján

·· · ········ * · · · · • · · · · · • ····· · « •» · · kézenfekvőek a szakember számára. Az ilyen módosítások is az igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

Számos referenciát idéztünk, melyek leírását teljes egészében referenciaként vettük be a leírásba.

Claims (14)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Bacillus thuringiensis törzs, melynél gyakorlatilag az összes peszticid aktivitás a törzs tenyészetének felülúszójában található.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti Bacillus thuringiensis törzs az alábbiak közül választva:

   EMCC-0077, mely az NRRL B-21090 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0077 törzsével; az EMCC-0078, mely az NRRL B-21091 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC0078 törzsével; az EMCC-0079, mely az NRRL B-21092 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0079 törzsével; az EMCC-0080, mely az NRRL B-21093 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC-0080 törzsével vagy az EMCC-0081, mely az NRRL B-21094 törzs azonosító jellemvonásait mutatja, vagy annak mutánsai, melyek tulajdonságai azonosak az EMCC0081 törzsével.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti törzs, mely törzs tenyészetének felülúszójából olyan anyag nyerhető ki, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és potenciáló vagy szinergista hatást mutat egy másik Bacillusból származó peszticiddel valamely kártevő ellen.

   • · ·
4. 4. A 3. igénypont szerinti törzs, melyben az anyag szerkezete az (I) általános képlettel írható le, ahol

   Rí jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoil-csoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, például - nem korlátozó jelleggel - alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinil- vagy fenilg I ici ni I-csoport,

   R₂ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport,

   R₃ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetil-amin, tionil-, metil-tionil-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₄ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos aIkiI)-észtér-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₅ jelentése hidrogénatom, metoxi-, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport, • · · · ·

   Re jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észtercsoport, halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport,

   R₇ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonátvagy nitrátsók,

   Re jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetil-amin.tioniI-, métiI-tioniI-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₉ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport és

   Rio jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos aIkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, így alanil-, valinil-, leucinil-, izoleuciniI-, fenil-ala nil-, glicinil- vagy fenil-gIiciniI-csoport.
5. 5. A 4. igénypont szerinti törzs, melyben Rt egy aminosavcsoport, melyet a következők közül választhatunk: alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinilvagy fenil-glicinilcsoport.
6. 6. A 4. igénypont szerinti törzs, melyben R₁₀ egy aminosavcsoport, melyet a következők közül választhatunk: alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alaniI-, glicinilvagy feniI-gIiciniIcsoport.
7. 7. A 4. igénypont szerinti törzs, melyben az anyag az (1) általános képletű vegyületek közül az alábbi két vegyület:

   la: ahol R, R^ R₂, R3 = H és lb: ahol R, R_1f R₂ = H és R₃ = OH.
8. 8. Peszticid készítmény, mely tartalmaz (a) egy anyagot, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más BaciItusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevővel szemben, az anyag egy Bacillus törzs fermentlevének felülúszójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található és (b) egy Bacillusból származó peszticidet, melyben az anyag legalább 1 g/LTU mennyiségben van jelen.
9. 9. A 8. igénypont szerinti készítmény, melyben az anyag szerkezete az (I) általános képlettel írható le, ahol

   Rí jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1 10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoil-csoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, például - nem korlátozó jelleggel - alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinil- vagy fenilglicinil-csoport,

   R₂ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport, • · • · · • · · · · *

   R₃ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos al ki l)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetil-amin, tionil-, metil-tionil-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₄ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jellegge - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₅ jelentése hidrogénatom, metoxi-, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport,

   Re jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észtercsoport, halogénatom vagy 1-5 szénatomos alkoxicsoport,

   R₇ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, arilésztercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy sóik, például - nem korlá tozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonátvagy nitrátsók,

   R₈ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogénbenzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetil-amin,tionil-, metil-tionil-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

   R₉ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport és

   R₁₀ jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (ΙΙΟ szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy amino-sav, így alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-ala nil-, glicinil- vagy fenil-glicinil-csoport.
10. 10. A 8. igénypont szerinti készítmény, melyben az anyag az (1) általános képletű vegyületek közül az alábbi két vegyület:

    la: ahol R, Rí, R₂, R₃ = H és lb: ahol R, R₁₍ R₂ = H és R₃ = OH.
11. 11. Módszer kártevők leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a kártevőt a 8. igénypont szerinti peszticid készítmény kártevővel szemben hatásos mennyiségével érintkeztetjük.
12. 12. Módszer a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevők melyeket Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frontális, Epilachna varivestis és Popillia japonica közül választjuk - leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a kártevőt a peszticid készítmény kártevővel szemben hatásos mennyiségével érintkeztetjük, ahol a peszticid készítmény tartalmaz (a) egy vegyületet, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más Bacillusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevőkkel szemben, mely vegyület egy Bacillus törzs tenyészetének felülúszójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található, és (b) egy peszticid hatású hordozót.
13. 13. Módszer egy Bacillusból származó peszticid anyag peszticid aktivitásának potenciálására, azzal jellemezve, hogy kitesszük a kártevőt egy peszticid készítmény hatásának teszszük ki, mely készítmény tartalmaz (a) egy anyagot, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más Bacillusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevőkkel szemben, mely anyag egy Bacillus törzs tenyészetének felülúszójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található, és (b) egy peszticid hatású hordozót olyan mennyiségben, mely potenciálni tudja a Bacillusból származó peszticid anyagpeszticid aktivitását.
14. 14. Eljárás lényegében tiszta olyan anyag előállítására, melynek peszticid hatása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevők ellen és amely más Bacillusból származó peszticiddel együtt hat a kártevőre, mely anyagot egy Bacillus thuringiensis törzs tenyészetének felülúszójából nyerjük ki, • ·

    6. A 4. igénypont szerinti törzs, melyben R₁₀ egy aminosavcsoport, melyet a következők közül választhatunk: alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinilvagy fenil-glicinilcsoport.

    7. A 4. igénypont szerinti törzs, melyben az anyag az (1) általános képletű vegyületek közül az alábbi két vegyület:

    la: ahol R, Rí, R₂, R₃ = H és

    Ib: ahol R, R,, R₂ = H és R₃ = OH.

    8. Peszticid készítmény, mely tartalmaz (a) egy anyagot, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más Bacillusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevővel szemben, az anyag egy Bacillus törzs fermentlevének felüió^zójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található és (b) egy Bacillusból származó peszticidet, melyben az anyag legalább 1 g/LTU mennyiségben van jelen.

    9. A 8. igénypont szerinti készítmény, melyben az anyag szerkezete az (I) általános képlettel írható le, ahol

    Rí jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (ΙΙΟ szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoiI-, halogén-benzoil-csoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy aminosav, például - nem korlátozó jelleggel - alanil-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-alanil-, glicinil- vagy fenilglicinil-csoport,

    R₂ jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport,

    R₈ jelentése hidrogénatom, amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (1-10 szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogénbenzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport, metil-amin, dimetiI-amin,tioniImetil-tioniI-, ciáncsoport vagy sóik, például - nem korlátozó jelleggel - a foszfát-, szulfát-, acetát-, karbonát- vagy nitrátsók,

    Rg jelentése 1-10 szénatomos alkilcsoport és

    Rio jelentése amino-, hidroxil-, 1-10 szénatomos alkil-, (ΙΙΟ szénatomos alkil)-észter-, aril-észtercsoport (benzoil-, nitro-benzoil-, dinitro-benzoil-, halogén-benzoilcsoport), halogénatom, 1-5 szénatomos alkoxicsoport vagy amino-sav, így alanti-, valinil-, leucinil-, izoleucinil-, fenil-ala nil-, glicinil- vagy feniI-gIiciniI-csoport.

    10. A 8. igénypont szerinti készítmény, melyben az anyag az (1) általános képletű vegyületek közül az alábbi két vegyület:

    la: ahol R, Rí, R₂, R₃ = H és lb: ahol R, R₁₍ R₂ = H és R₃ = OH.

    11. Módszer kártevők leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a kártevőt a 8. igénypont szerinti peszticid készítmény kártevővel szemben hatásos mennyiségével érintkeztetjük.

    12. Módszer a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevők melyeket Leptinotarsa decemlineata, Ips calligraphus, Dendroctonus frontális, Epilachna varivestis és Popillia japonica közül választjuk - leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a kártevőt a peszticid készítmény kártevővel szemben • « hatásos mennyiségével érintkeztetjük, ahol a peszticid készítmény tartalmaz (a) egy vegyületet, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más Bacillusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevőkkel szemben, mely vegyület egy Bacillus törzs tenyészetének felülúszójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található, és (b) egy peszticid hatású hordozót.

    13. Módszer egy Bacillusból származó peszticid anyag peszticid aktivitásának potenciálására, azzal jellemezve, hogy kitesszük a kártevőt egy peszticid készítmény hatásának teszszük ki, mely készítmény tartalmaz (a) egy anyagot, melynek peszticid aktivitása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevőkkel szemben és más Bacillusból származó peszticiddel együtt hatást fejt ki a kártevőkkel szemben, mely anyag egy Bacillus törzs tenyészetének felülúszójából nyerhető, ahol gyakorlatilag a törzs teljes peszticid aktivitása a tenyészet felülúszójában található, és (b) egy peszticid hatású hordozót olyan mennyiségben, mely potenciálni tudja a Bacillusból származó peszticid anyagpeszticid aktivitását.

    14. Eljárás lényegében tiszta olyan anyag előállítására, melynek peszticid hatása van a Coleoptera rendbe tartozó rovarkártevők ellen és amely más Bacillusból származó peszticiddel együtt hat a kártevőre, mely anyagot egy Bacillus thuringiensis törzs tenyészetének felülúszójából nyerjük ki, • ···· mely törzsnél gyakorlatilag a teljes peszticid aktivitás a fermentlé felülúszójában található, azzal jellemezve, hogy

    a) a Bacillus thuringiensis törzset, melynél gyakorlatilag a teljes peszticid aktivitás a fermentlé felülúszójában található, megfelelő növekedési táptalajon tenyésztjük,

    b) kinyerjük az a) lépés felülúszóját és

    c) a b) lépésben nyert felülúszóból izoláljuk az anyagot, hogy lényegében tiszta anyagot nyerjünk.

    A meghatalmazott:

    Danubia Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.