HUT68218A - Tumor necrosis factor muteins - Google Patents

Description

Találmányunk tamor nekrózis faktor mateinekre vonatkozik.

A tumor nekrózis faktor, vagy közelebbről tumor nekrózis faktor-alfa /a továbbiakban az egyszerűség kedvéért a tumor nekrózis faktor vagy TNF kifejezés a TNF-oc-ra vonatkozik feltéve, hogy mást nem közlünk/ elsősorban stimulált makrofágok által termelt citokin. A tumor nekrózis faktor nem csipán különböző timorsejtek ellen fejt ki jelentős citotoxicitást /Uarswell et al., Procd. Nat. Acad. Sci., USA 72, 3666-3670, /1975(7, hanem közvetítőként gyulladásos folyamatokban és az imminválaszban is jelentős szerepet játszik /Seatler és Cerami áttekintése: Ann. Rév. Immunoi. /» 625-655 /1989/$ Bonavista és Granger /eds./ Tenor Necrosis Factor: Structare, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy, Karger, Basel /1990/7· A hamán tamor nekrózis faktor-alfa /hTNF-^/ primer szerkezetét egy E. coli-ban klónozott és kifejezett cDNS nakleotid szekvenciájából következtették le /Fennica et al., Natire 3T2, 724-729 /1984/; Marmenoat et al·, Eirop. J. Biochem. 152, 515-522 /1985/; Wang et al·, Science 228, 149-154 /1985/; Shirai et al., Natare 313, 803-806 /1985/7« A hTNF-alfa és a hamán limfotoxin aminosav-szekvenciája között nagyfokú /30 %/ homológiát találtak; atőbbi anyaga gyakran tamor nekrózis faktor bétának /hTNF-/3/ nevezett, főkéntALimfooiták által termelt citokin /TTray et al·, Natare 312, 721-724 /1984/; Fiers et al., Cold Spring Harboar Symp. 51, 587-595 /1986/7·

A módosított aminoaav-szekvenciákat tartalmazó hTNF-«-t - an. TNF-oomatelnek - az irodalomban leírták /Tfamagishi et al., Protein Engineering 3, 713-719, /1990/; Fiers: Tamor Necrosis Factors: Stractare, Fanction and Mechanism of Action; Fiers et al·: Bonavista és Granger, 77-81 oldal /lásd fent/;

• · · · · · « • · • · · · • · • · · « ·

Goh et al., /1991/: Structural and fanctional domains in humán tumor necroais factors· Prot. Engineering 4: 385-389? Kircheia et al·, /1992/ Biological activity of mutants of humán tumor necrosis factor-alpha, Immenology 76: 433-438? Van Oetade et al·, /1991/: Localization of the active site of haman tumor necroeia factor /hTNP/ by mutational analyses, EMBO J· 10: 827-836? Van Ostade et al,_t /1993/: Humán TNF mutants with selective activity on the p55 receptor, Natúré 361: 266-269? Zhang et al·, /1992/: Site-directed matational analysis of humán tumor necrosie factor-<x receptor binding site and structare-functional relationship, J. Bioi. Chem. 267: 24069-24075? és Ito et al., /1991/: Növel muteins of humán tumor necroais factor alpha, Biochim. Biophys. Acta 1096: 245-2527· Ezenkívül a TNF-alfa metélnék számos szabadalmi bejelentés tárgyát képezik /pl. WO 86/02381, WO 86/04606, WO 88/06625 az· nemzetközi szabadalmi bejelentések? 155 549, 158 286, 168 214, 251 037 és 340 333 sz. európai közrebocsátott earópai szabadalmi bejelentések? és 3 843 534 sz. német közrebocsátási irat/·

Az irodalomban a limfotoxin muteinjeit is leirták /lásd pl· 250 000, 314 094 és 336 383 sz. európai közrebocsájtási iratok, valamint az alábbi két publikáció: Goh et al·, /1991/: Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential fór receptor binding and cytotoxic activity of tumor necrosie factor béta /lymphotoxin/, Prot· Engineering 4: 785-791,és Wakabayashi et al., /1990/: Deletion of lysine 89 enhances the cytotoxicity and the receptor binding affinity of humán lymphotoxin, J. Bioi. Chem. 265: 7604-7609/·

A TNP biológiai hatásait specifikus receptorok közvetítik, éspedig a nátrium-dodecilszulfát poliakrilamid gél elektroforézis /SDS-PAGE/ szerint 55 kD látszólagos molekulatömegű receptor /p55-TNP-R/ és az SDS-PAGE szerint 75 kD látszólagos molekulatömegü receptor /p75-TNP-R/· A TNP-receptor mindkét formáját klónozták, éspedig a p55-TNP-R receptort Loetscher és tsai /Üell. 61, 351-359 /1990/_7 és a p75-TNP-R receptort pl. Dembic és tsai /TTytokine 2, 53-58 /199O/_7;/mindkét receptor klónozását, továbbá pl. a 90116707*2 sz. európai szabadalmi bejelentésben ismertették/. Az utóbbi időben azt találták, hogy mindkét receptor nem csupán a TNP-oc-t, hanem nagy affinitással a TNP-/?-t is megköti /Schönfeld és tsai: J. Bioi. Chem. 266, 3863-3869 /1991/_7*

Az irodalomból jól ismert, hogy a TNP-oc biológiai aktivitásai alapján különböző rendellenességek kezelésére alkalmazható. így pl. a TNP-oc önmagában vagy interferonnal kombinálva hatékony tumorellenes szer lehet /Erouckaert és tsai: Int. J. Cancer 38, 763-769 /1986/_7* E vegyület szélesebbkörü gyógyászati alkalmazását azonban szisztémás toxicitása gátolja /Taguchi T. és Sohmura Y: Biotherapy 3, 177-186 /1991/J·

Azt találták, hogy a hTNP-oc és az mTNP-oc a humán P55-TNP-R és humán p75-TNP-R receptorhoz csaknem azonos aktivitással kötődik. Ugyanakkor azonban azt találták, hogy egéren a humán TNP-oc /hTNPrt/ csak a kisebb egér TNP-receptorhoz kötődik /rágcsáló p55-TNP-R/. Egéren a hTNP-oc sokkal kevésbé toxikus, mint a rágcsáló TNP-oc / mTNP-oc/, amely mindkét mp55-TNP-R és mp75-TNP-R egér receptorhoz kötődik. így pl. C57B16 egéren az mTNP-oc és hTNP-oc LD^_Q értéke 10 /ug/egér illetve 500/ug/egér ···· ····

- 5 ^Erouckaert et al., Agents and Actions 26, 196-198 /1989/; Everaerdt, B. et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 163, 378-385 /1989/; Lewis, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci· USA 88, 2830 /1991/; Brouckaert, P·, Libert, C·, Everaerdt, B. and Piers, W. /1992/. Selective species specificity of tumor necrosis factor fór toxicity in the mouse. Lymphokine Cytokine Rés.

11, 193-1967· Ezért úgy tűnik, hogy a p75-TNP-R a szisztémás toxicitásban jelentős szerepet tölt be.

Az irodalom szerint továbbá a burjánzásos jelzések humán T limfocitákban hp75-TNP-R által közvetíthetők /Gehr et al., J. Immunoi. 14-9, 911, 1992; Tartaglia et al_o, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9292, 1991/·

A humán p75-tumor nekrózis faktor receptorhoz /hp75-TNP-R/ és a humán p55-tumor-nekrózis faktor receptorhoz /hp55-TNP-R/ szignifikáns mértékben eltérő kötődési affinitást mutató humán tumor nekrózis faktor muteineket a 486 908 sz. európai közrebocsájtási iratban írtak le. Az itt ismertetett hTNP muteinek a hp55-TNP-R receptorhoz való kötődési aktivitásukat megtartották, ugyanakkor azonban a hp75-TNP-R receptorhoz való kötődést csaknem teljesen elvesztették.

Találmányunk tárgya humán tumor nekrózis faktor mutein, amely a humán p75-tumor-nekrózis-faktor receptorhoz nagyobb kötődési affinitást mutat, mint a humán p55-tumor-nekrózis-faktor-receptorhoz /a humán tumor nekrózis faktor mutein kifejezés a humán tumor nekrózis faktor mutein sóit is magában foglalja/.

A /vadtipusú/ humán TNP-ot aminosav-szekvenciáját

Pennica és tsai /lásd fent/ a következőképpen Írták lej ···· ···« · *

1 VAL

ARG

SER

SER

SER

ARG

THR

PRO

SER

10 ASP

LYS

PRO

VAL

ALA

HIS

VAL

VAI,

ALA

ASN

20 PRO

GLN

ALA

GLU

GLY

GLN

LEU

GLN

TRP

LEU

30 ASN

ARG

ARG

ALA

ASN

ALA

LEU

LEU

ALA

ASN

40 GLY

VAL

GLU

LEU

ARG

ASP

ASN

GLN

LEU

VAL

50 VAL

PRO

SER

GLU

GLY

LEU

TYR

LEU

ILE

TYR

60 SER

GLN

VAL

LEU

PHE

LYS

GLY

GLN

GLY

CYS

7 0 PRO

SER

THR

HIS

VAL

LEU

LEU

THR

HIS

THR

80 ILE

SER

ARG

ILE

ALA

VAL

SER

TYR

GLN

THR

90 LYS

VAL

ASN

LEU

LEU

SER

ALA

ILE

LYS

SER

100 PRO

CYS

GLN

ARG

GLU

THR

PRO

GLU

GLY

ALA

110 GLU

ALA

LYS

PRO

TRP

TYR

GLU

PRO

ILE

TYR

120 LEU

GLY

GLY

VAL

PIIE

GLN

LEU

GLU

LYS

GLY

130 ASP

ARG

LEU

SER

ALA

GLU

ILE

ASN

ARG

PRO

140 ASP

TYR

LEU

ASP

PHE

ALA

GLU

SER

GLY

GLN

150 VAL

TYR

PHE

GLY

ILE

ALA

157 LEU

A fenti aminoaav-ezekvenciát továbbá Marmenout és tsai /lásd fent/, vagy Wang és tsai /lásd fent/, vagy Shirai és tsai /lásd fent/ közölték, vagy az érett TNF-oc-t kódoló pDS56/RBSII,~ Sphl-TNT-oC plazmid /SEQ ID No. 1; lásd la és lb ábra valamint I. példa; vagy a 486 908 sz. európai szabadalmi leirás 3bl-3b3 ábrája/inzertjenek nukleotid szekvenciája kódolta.

A jelen találmány kidolgozása előtt az irodalom nem tartalmazott utalást arra, hogy a hp75TNF-R receptorhoz szelektíven kötődő hTNF műtőinek előállithatók lennének. A találmányunk ·<· • ··· ··* ···* ·· .:.. :

- 7 szerinti muteinek előnyösen alkalmazhatók hp75-TNF-R receptor jellemzésére, és a továbbiakban ismertetésre kerülő diagnosztikai és gyógyászati területeken is kedvezően alkalmazhatók·

A muteinek a vadtipusú humán TNP-ed-hoz viszonyítva, az N-terminális aminosavhoz képest a 33, 34, 65, 67, 75, 143, 145 és/vagy 147 helyzetnek megfelelő helyzetek legalább egyikében legalább egy aminosav-változtatást tartalmaznak. A fenti megfelelőkifejezés azt jelenti, hogy a találmányunk szerinti muteinek a vadtipusú humán TNF-^-val a megjelöltektől eltérő helyzetekben nem szükségszerűen homológok, minthogy ilyen helyzetekben a vadtipusú aminosav-szekvenciához viszonyítva törlések, beillesztések vagy helyettesítések eszközölhetők, feltéve, hogy ezek a hp75-TNF-R-hez történő kötődési affinitást lényegesen nem befolyásolják·

A fehérjék és polipeptidek olyan aminosav helyettesítései, amely a biológiai aktivitást lényegében nem változtatják JLásd pl_v meg, az irodalomból jól ismerte^ÉTNeurath and R.L. Hill: ”The Proteins”, Academic Press, New York /1979/, különösen a

14. oldalon levő 6. ábra. A leggyakoribb megfigyelt aminosav-helyettesitések az alábbiak: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Lea/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly ős vice versa.

A muteinek előnyösen a vadtipusú szekvenciában feltüntetett helyzeteknek megfelelő alábbi helyzetekben tartalmaznak legalább egy aminosav-változtatást.

Α33Τ

Κ65Α

K65W

Q67K

Q67T

Q67Y

5H

5 W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F1441 - A145S

D143N - A145R

B143V - A145S

A145R

A145D

A145G

A145H

A145K

A145F

A145S

A145T

A145W

A145Y

A145V

E146R

S1471 • · · • ·

- 9 A fenti nomenklatúrában szereplő betiik az egybe tűs aminosav kódnak megfelelően aminosavakat jelölik. A kötőjelek az egynél több aminosav-változtatásokat választják el egymástól. Minden aminosav-változtatás esetében az első betű a vadtipusú humán TOK-bán levő aminosavat, mig a második betű a muteinben levő aminosavat jelzi. A számok a vadtipusú szekvencia azon helyzetét jelölik, amelyben a vadtipusú szekvencia a megjelölt aminosavat tartalmazza.

A variánsok közül az alábbiak hp75-TNF-R-hez különösen jó kötődési szelektivitást mutatnak.

K65W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S

A145R

A145H

A145K

A145F

A145W A145Y Különösen kedvező tulajdonságokkal rendelkeznek az alábbi variánsok:

- 10 D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S

A145R

Α145Κ

A145F

A145W

Α145Υ

Megjegyezzük, hogy valamennyi felsorolt variáns a vadtipusú szekvencia helyzeteinek megfelelő 143 és/vagy 145 helyzetben aminosav-változtatást tartalmaz· Ezért a fenti helyzetekben eszközölt aminosav-változtatások előnyösek.

A találmányunk szerinti hTNF muteinek továbbá linker szekvenciák által kódolt különböző aminosav-szekvenciákat tartalmazhatnak. Ezek a szekvenciák a fent ismertetett hTNF muteinek kifejezésére használt kifejező vektorok révén keletkezhetnek.

A találmányunk szerinti hTNF muteinek továbbá olyan specifikus szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek nagy szelektivitással affinitás hordozóanyagokhoz kötődnek és ily módon a tisztítást elősegítik. Az ilyen szekvenciák példájaként a legalább két szomszédos hisztidin-maradékot tartalmazó szökvén• · · · ···· ·· ·« · · · · • · · · · . · ciákat említjük meg /láad 282 042 sz. európai közrebocsájtási irat/. Az ilyen szekvenciák nitrilotriecetsav nikkel kelát gyantákhoz szelektíven kötődnek /Hochuli és Döbeli: Bioi· Chem· Hoppe-Seyler 368, 748 /1987/; 253 303 az. európai közrebocsájtási irat/· Az ilyen specifikus szekvenciákat tartalmazó hTNF muteinek a hTNF-mutein aminosav-szekvenciájának C-terminálisához vagy N-terminálisához vagy mindkét terminálisához kapcsolódhatnak·

A találmányunk szerinti hTNF muteinek különböző nehézláncú immunoglobulinokkal vagy könnyüláncú polipeptidekkel is kombinálhatók. Ez kimer hTNF mutein immunoglobulin polipeptidekhez vezet, amelyek hosszabbin vivő felezési idővel rendelkezhetnek· Hosszabb in vivő felezési időket tapasztaltunk pl· olyan kimer polipeptidek esetében, amelyek az emlős immunoglobulin nehézlánca vagy könnyülánca konstans tartományának első két részéből állnak /Tásd Tranunecker és tsai: Natúré 331, 84-86 /1988/; 394 827 sz. európai közrebocsájtási irat/· A hTNF muteinek bármely más peptid szekvenciával fuzionált kimer fehérjéi is előállíthatok.

A hTNF muteinek továbbá polimerekhez is kapcsolhatók, pl. 500-20.000 Dalton molekulatömegü polietilénglikolhoz vagy polipropilénglikolhoz /pegilezett hTNF muteinek/· Ez védett hTNF mutein kompozíciókhoz vezet, amelyek lényegében nem-immunogének lehetnek. A polimer és polipeptid összekapcsolására számos módszer ismeretes /lásd pl. 4 179 337 sz· amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás/. Ennek megfelelően találmányunk pegilezett hTNF muteinekre vagy gyógyászatilag alkalmas sóikra is kiterjed.

·· · · · · ' · _ν ·······»· • · · · · · ·· ··· ·· ···· ·

- 12 A találmányunk szerinti hTNF muteineket az irodalomból Jól ismert módszerekkel állíthatjuk elő ^“Sambrook és tsai: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA /1989/-7 vagy a következő bekezdések· A példákban leirt módon határozható meg, hogy az ilyen hTNF muteinek a p75-TNF-R receptorhoz szelektíven kötődnek-e vagy sem. A találmányunk szerinti hTNF muteinek alternatív módon az irodalomból ismert standard kémiai módszerekkel is szintetizálhatók; előnyösen szilárdfázisú módszereket alkalmazhatunk £“lásd Merrifield módszerei: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 /1963/_7· Találmányank továbbá e muteinek sóira is kiterjed. A sók előállítása önmagukban ismert módszerekkel történik.

Feltételezésünk szerint a TNF-el összefüggő betegségek és állapotok kezelésében általánosan használható az a stratégia, amely szerint a hasznos és nemkívánatos TNF-ot aktivitásokat az egyik vagy másik TNF-receptorhoz kötődő vegyületek - pl. a találmányunk szerinti hTNF muteinek - felhasználásával szétválasztjuk.

Találmányunk tárgya továbbá a fentiekben leirt hTNF muteineket kódoló DNS-szekvenciák. Az ilyen szekvenciák /vagy fragmentjeik/ egyrészről a találmányunk szerinti muteinek előállításánál felhasználható közbenső termékek, másrészről a génterápiában is felhasználhatók és ezáltal egy meglevő gén kedvező hatások fellépése mellett módosítható. A szekvenciák /vagy fragmenseik/ továbbá anti-DNS-ként is felhasználhatók, gén kifejezés szabályozására, komplementer mRNS szekvenciákhoz történő kötődés útján.

··· ···· ··«· • · · • · · · ·· ··· ·· ···· ·

- 13 A fenti DNS-szekvenciák hTNF-t kódoló genom-vagy cDNS-szekvenciákból kiindulva, az irodalomban leirt módon alakíthatók ki /lásd: fent/, az in vitro mutagenézis ismert módszereinek alkalmazásával /lásd: pl· Sambrook és tsai., 1989/. Találmányunk továbbá a jelen találmány szerinti DNS-szekvenciákkal komplementer RNS-szekvenciákra is kiterjed, amelyet pl· cDNS szekvenciák előállítására alkalmazhatunk.

A fent említett mutagenézist többféleképpen végezhetjük el. Az egyik módszer a '‘véletlenszerű” mutagenézis. Ennek során nagyszámú mutánst kapunk, amelyeket megfelelő vizsgáló rendszerekben a kívánt tulajdonságokra megvizsgálunk. Másik módszer szerint az un· helyre irányított mutagenézis /“lásd: pl. Sambrook és tsai /1989/ 15·51-15·1137; ennek során egy adott DNS-azekvencia meghatározott helyzeteiben mutációkat végzünk el. A mutagenézis továbbá polimeráz lánc reakció segítségével is elvégezhető /Tásd: pl. White et al.; Trends in Genetics 5, 185-189 /1989/^7.

A véletlenszerűen végzett mutagenézisnél alkalmazott egyik kémiai mutagén ágens a nátrium-biszulfit, amely a citozinmaradékot uracilmaradékká alakítja és ezáltal a C—>T átmenethez vezet /nukleotidok standard rövidítése; a módszer tekintetében lásd pl. Shortle és Nathans, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 75.» 2170-2174 /1978/ vagy Pine és Huang, Meth. Enzym. 154, 415-430 /1987/_7· Ez a mutagén ágens csak az egyszálú DNS-re hat, mig a mutált cél DNS-szekvencia kifejezése kettősszálú plazmid vektorral történik. A mutagenézisnél és kifejező vektoroknál az újraklónozás többek között un. phazmidok alkalmazásával kerülhető el. Ezek vektorok, amelyek a replikádé

- 14 • · · · » · · • ··· · ·' φ · • · · · « • ·*· ·· ···· · plazmid eredetén kívül valamely szálszerü fágból leszármaztatott replikáció eredetet is hordoznak. Az ilyen phazmidok példáiként a Stanssen és tsai által leirt /“Nucleic Acids. Rés. 17, 4441-4454 /1989/_7 pMa- és pMc-phazmidokat említjük meg. Ezen kifejező rendszer felhasználásával un. hézag-duplex szerkezetek alakíthatók ki /~lásd továbbá Kramer és tsai: Nucl. Acids. Rés. 12, 9441-9456 /1984/_7» amelyekben csak a TNF-t kódoló szekvencia /lásd: fent/ van egyszálú konfigurációban és ezért a specifikus kémiai mutagén ágens számára hozzáférhető. A véletlenszerű mutagenézisben felhasznált hézag-duplexek a hely-specifikus mutagenézissel kapcsolatban Stanssen és tsai által /lásd: fent/ leirt módon építhetők fel azzal a különbséggel, hogy a /-/szál ugyanazt az aktív antibiotikum rezisztens gént tartalmazza mint a /+/szál. A hTNEot-t kódoló DNS-szekvenciában különböző restrikciós helyek felhasználásával a hézag szélessége változtatható. Az ilyen restrikciós helyes példáiként a Clal-Sall helyeket /470 nukleotid/, BstXl-BstXl helyeket /237 nukleotid/ vagy Styl-Styl helyeket /68 nukleotid/ említjük meg. Az ilyen hézag-duplex összetételeket ezután növekvő koncentrációjú /4 M-ig/ biszulfittal kezelhetjük, majd számos dialízis lépésnek vethetjük alá /“Shortle és Nathans /lásd: fent/ által leirt módon7· Egy megfelelő prokarióta gazdasejtet ezután az irodalomból ismert és pl. Sambrook és tsai /lásd: fent/ által leirt módszerekkel ilyen phazmidokkal transzformálhatunk. Ebben az összefüggésben megfelelő prokarióta gazdasejten olyan gazdasejtet értünk, amely egy specifikus regeneráló funkciójában hiányos és ezért a replikáció alatt az uracil-maradék a DNS-ben megmarad; ez a gazdasejt továbbá a megfelelő mutált TNJ? kifeje

- 15 • · · · · · · • ··· ··· · · • · · · · · • · ··· ·· ···· · zésére képes. Az ilyen specifikus gazdasejtek az irodalomból ismertek, pl. E. coli törzsek, mint pl. E. coli BW 313 /“'Kunkel T.A.: Procd. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 /1985/_7. A keletkező kiónokból screeneléssel megfelelő vizsgáló rendszerek segítségével kiválasztjuk azokat, amelyek a kívánt hTNF kifejezésére képesek. így pl. eljárhatunk oly módon, hogy minden telepet mikrotiter-lemezen a releváns antibiotikumot tartalmazó megfelelő táptalajban inokulálunk. A sejteket lizozim hozzáadásával lizálhatjuk, majd szekvenciális fagyasztásos-felengedéses ciklusokat hajtunk végre. A nukleinsavak kicsapása és centrifugálás után minden telep felülúszóját közvetlenül a megfelelő vizsgálatoknak vethetjük alá /lásd: pl. jelen szabadalmi leírás

III. példája/.

A mutáció specifikus helyeit pl. restrikciós fragmens analízissel határozhatjuk meg /~lásd: pl. Sambrook és tsai /lásd: fent/JT· Az ilyen fragmensek DNS-szekvenciájának meghatározásával a mutáció pontos helyzete meghatározható és ha az ilyen mutáció aminosav-cseréhez vezet, úgy az új aminosav a meghatározott DNS-szekvenciából leszármaztatható· A DNS szekvenciálást az irodalomból ismert módszerekkel végezhetjük el, pl. T7 polimeráz felhasználásával szuperspirális DNS-en a kereskedelemben beszerezhető szekvenciáló kit segítségével /Pharmacia, Uppsala, Svédország/.

Mint már említettük, egy adott DNS-szekvencia mutálására rendelkezésre álló másik lehetőség a “hely irányított mutagenézis. Az ilyen típusú mutagenézis széleskörűen használt stratégiáját Hutchinson és Adgell /~J· Virol. 8, 181 /1971/J írták le; ennek lényege, hogy a kívánt nukleotid helyettesítést ···· ···· • ·· • · · • · · · · · • · ··· ·· ···· ·

- 16 hordozó szintetikus oligonukleotidet valamely egyszálú DNS-szekvencia azon cél-tartományába építjük be, ahol a mutációt el kívánjuk végezni ^“láad: pl. Smith Annual Rév. Génét. 19, 423 /1985/; javított módszerek vonatkozásában lásd Stanssen és tsai: 2-6. hivatkozás /1989/_7·

Egy ilyen előnyös módszert Stanssen és tsai /1989/ írtak le, amelynek során hézagos duplex DNS-t alkalmaznak a Kramer és tsai /1984/ által leirt módon /~lásd: fent és Kramer és Fritz: Methods in Enzimology, /1987/, Academic Press Inc. /USA/_—7» azonban a mutációt tartalmazó szál kiválasztásához M13 funkcionális gének helyett antibiotikum rezisztens géneket alkalmazunk, a phasmid-technológián kívül £~lásá továbbá: Stanssen és tsai /1989/, /lásd: fent/_7· B módszer előnye, hogy egymás után több mutagenézis ciklus elvégzésére képes anélkül, hogy a gént egy új mutagenézis vektorra át kellene vinni; a második mutagenézis ciklus csupán abban különbözik, hogy egy másik antibiotikum markert kell kiválasztani /Stanssen és tsai, lásd: fent/. Kontrollként a mutánsnak a vadtipusú TNF~é történő hely-specifikus visszamutagenézise alkalmazható. Ezenkívül a TNF génben egy restrikciós helyet létrehozó vagy megszüntető oligonukleotid alkalmazása esetén a mutáns nem csupán a hely-irányitott mutagenézishez felhasznált oligonukleotiddé történő hibridizáció útján ellenőrizhető, hanem a restrikciós hely jelenléte vagy hiánya által is. Az aminosav-szekvenciában a vadtipusú aminosavak helyén bármely természetben előforduló aminosavat tartalmazó hTNF mutein készlet előállítása céljából egy oligonukleotid készletet alkalmazunk, amely a meghatározott helyzetekben minden lehetséges kodont tartalmaz.

···♦ ···· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · ··· · · • · · · · · ·· ··· ·· ···· ·

Mint már említettük, egy adott DNS-szekvencia mutálásának további lehetősége a polimeráz lánc reakciót /POR/ alkalmazó mutagenézis. A módszer elveit pl. White és tsai /1989/ ismertették, mig javított módszereket pl. Innis és tsai írtak le /PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. /199O/_7.

A PCR nagymennyiségű, meghatározott hosszúságú és szekvenciájú specifikus DNS fragmens kis mennyiségű templát DNS-ből történő termelésére szolgáló in vitro módszer. A PCR a cél szekvencia ellentétes szálaihoz hibridizáló két oligonukleotid primer által szegélyezett DNS fragmens enzimes amplifikációján alapul. A primerek orientációja olyan, hogy 3’ végeik egymásfelé mutatnak. A templát hővel több ciklusban végzett denaturálása, a primereknek komplementer szekvenciáikhoz történő illesztése és az igy átalakított primerek DNS polimerázzal végrehajtott kiterjesztése a PCR primerek 5* végei között levő szegmens amplifikációját eredményezi. Minthogy minden primer kiterjesztett terméke egy másik primer templátjaként szolgálhat, minden ciklus lényegében megkétszerezi az előző ciklusban termelt DNS fragmens mennyiségét. Minthogy a primerek a megsokszorozott termékbe fizikailag beépülnek, s a primer 5’ végei és a templát közötti hibás összeillesztések az amplifikáció hatékonyságát jelentős mértékben nem befolyásolják, a megsokszorozott szekvencia megváltoztatható és ezáltal a kívánt mutáció a megsokszorozott DNS-be beépíthető. A termofil Thermus aquaticus baktériumból izolált termostabil Taq DNS polimeráz felhasználásával a polimeráz denaturálódása elkerülhető; ez a denaturálódás mindezideig minden egyes denaturálási lépés után • « • · · * ··

- 18 enzim hozzáadását tette szükségessé. E fejlesztés segítségével a POR számos egyszerű, hőmérséklet-cikluson alapuló berendezés felhsználásával automatizálható. Ezenkívül az amplifikációs reakció specifikussága oly módon növelhető, hogy a primer beillesztésnél és kiterjesztésnél magasabb hőmérsékleteket alkalmazunk. A megnövelt specifikusság a megsokszorozott termékek összkitermelését azáltal javítja, hogy a nem célzott fragmensek között az enzimekért és primerekért folyó versengést minimumra csökkenti.

Az oligonukleotidok megtervezését és szintézisét az irodalomban ismert és pl· Sambrook és tsai /1989/ által leirt módon vagy a hely-irányitott mutagenézissel kapcsolatban idézett irodalmi helyek valamelyikében leírtak szerint végezhetjük el.

A találmányunk szerinti hTNF muteint kódoló DNS-szekvencia létrehozása után a kifejezést a fentiekben leirt phasmid technológiával vagy az irodalomból jólismert bármely megfelelő prokarióta vagy eukarióta kifejező rendszer felhasználásával /lásd: pl. Sambrook és tsai, lásd: fent/ végezhetjük el.

A kifejezést előnyösen prokarióta sejtekben végezhetjük el, igy pl. az alábbi sejteket alkalmazhatjuk: E. coli, Bacillus subtilis stb., előnyösen E. coli, különösen E. coli K12 törzsek, pl. M15 /~DZ 291, Villarejo és tsai: J. Bacteriol.

120, 466-474 /1974/_7, HB 101 /~ATCC No. 33694_7, WK6 /Stranssen és tsai, lásd: fent/ vagy E. coli SG13OO9 /“Gottesmann és tsai: J. Bacteriol. 148, 265-273 /1981/_7· A találmányunk szerinti hTNF muteineket továbbá alacsonyabb vagy magasabb rendű eukarióta sejtekben is kifejezhetjük, igy pl. élesztősejtekben /pl. Saccharomyces, Pichia stb./, szálszerü gombákban /pl. Aspergillus stb./ vagy sejtvonalakban /pl. kínai hörcsög petefészek···♦ «··· «· ·· «·«· • · · · · · · • ··· ··· V · ······ ·· · ·· ·· ···· ♦

- 19 sejtvonalakban stb./; a kifejezést előnyösen élesztősejtekben végezhetjük el /“lásd: Sreekrishna és tsai; Biochem. 28, 4117-4125 /1989/; Hitzeman és tsai; Natúré 293, 717-722 /1981/; 263 311 az. európai közrebocsájtási irat_7· A találmányunk szerinti hTNF muteinek az ilyen rendszerekben intraoellulárisan vagy - a gén megfelelő adaptálása után - extracellulárisan fejeződnek ki /~lásd: Lermans és tsai; Gene 85, 99-108 /1989/J7·

Az E. coli-ban történő kifejezésre alkalmas vektorokat többek között az alábbi irodalmi helyeken Írták le: /“Sambrook és tsai, /lásd; fent/ vagy Fiers és tsai; ”Procd· 8th Int. Biotechnology Symposium”, Soc. Franc, de Microbiol., Paris, /Duránci és tsai kiadó/, 680-697· oldal /1988/__7 vagy a pDS családhoz tartozó egy vagy több specifikus vektor ^“Bujard és tsai: Methods in Enzymology, kiadó: Wu és Grossmann, Academic Press, Inc., 155. kötet, 416-433 /1987/; Stüber és tsai: Immúnological Methods, kiadó: Lefkovits és Pernis, Academic Press, Inc., IV. kötet, 121-152 /199O/J7, mint pl. pDS56/RBSII, SphI-TNFcx/D143N, A145R/,/lásd: I.példa/ vagy pDS56/RBSII, Sphl-TN^po/mutein/, /lásd: II. példa/ - aholis a mutein szó az 1. táblázatban felsorolt TNFK-muteinekre vonatkozik* Minthogy ezekkel a specifikus pDS56/RBSII plazmidokkal specifikus szabályozható promotor/operátor elemeik és riboszómás megkötő helyeik révén magas szintű kifejezés érhető el, a plazmidok az E· coli sejtekben csak akkor tarthatók fenn, ha a promotor/operátor elem aktivitását a lac represszornak az operátorhoz történő kötődése represszálja. A promotor aktivitása a kívánt sejtsürüségre IPTG hozzáadásával állítható vissza, amely a represszort inaktiválja és a promotort megtisztítja· Minthogy a legtöbb E. coli törzs nem rendelkezik az ilyen nagy kópia···· «·«· • 4

4 4 4 ·4··

- 20 számú plazmidokban jelenlevő promotor szekvenciák funkciójának teljes represszálásához elegendő represszor molekulával, az ilyen

E. coli törzseket / pl· E. coli M15 vagy SG13OO9/ a specifikus pDS56/RBSII plaztnidokkal történő transzformálás előtt a lac represszort kódoló valamely plazmiddal /pl· pREP 4 - lásd: 2a ée 2b ábra/ transzformálni kell; ezután a plazmidok az E. coli sejtekben stabilan fenntarthatók. A pREP4 a lac repreaazor kódolásán kívül a pACYC184 plazmid /“Chang és Colién:

J· Bacteriol· 134 >

1141-1156 /1978/__7 egy tartományát ia tartalmazza, amely a rep likádéhoz és a leánysejtekhez történő stabil transzmisszióhoz szükséges összes információt tartalmazza /“további információk tekintetében lásd továbbá System fór high level production in

E· coli and rapid purification of recombinant proteins: application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure function analysia” - Stüber és teái: Immunological Methods, IV· kötet, 121-152. oldal, Lefkovits és Pernis /kiadók/, Academic Press, New York /1990/J7·

A gazdasejteknek vektorok által végzett, a fentiekben leirt transzformációját bármely szokásos módszerrel végrehajthatjuk /“lásd: pl. Sambrook és tsai /lásd: fent/^7· Prokarióta gazdasejtek /pl· E· coli/ esetében DNS felvételére alkalmas kompetens sejtek az exponenciális növekedési fázis után összegyűjtött, majd az ismert kalciúm-kloridos módszerrel kezelt sejtekből állíthatók elő. A transzformáció a gazdasejtből történő protoplaszt képzés után vagy az irodalomból ismert és leirt más módszerekkel is elvégezhető /“Sambrook és tsai /lásd: fent/_7. Bnnek megfelelően valamely vektor - különösen a fentiekben leirt hTNP muteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó, prokarióta vagy alacsonyrendű eukarióta gazdasejtekben történő kifejezésre képes ···· ·<·» ·« »ν • · · · · * · ♦ · ·· ··· · · ···«·· • · ··· ·· ·«·· ·

- 21 vektorok - és az ilyen vektorok által transzformált gazdasejtek különösen prokarióta gazdasejtek, pl. E. coli vagy alacsonyrendii eukarióta gazdasejtek - szintén találmányunk tárgyát képezik.

A kívánt kifejező vektort tartalmazó gazdaszervezeteket általában a növekedés szempontjából optimális körülmények között tenyésztjük. Prokarióta gazdasejtek esetében az exponenciális növekedés végén - amikor az időegységre vonatkoztatott sejtszámnövekedés lassul - a kívánt hTNF mutein kifejezését indukáljuk» azaz a kívánt hTNF muteint kódoló DNS-t átírjuk és az átirt mRNS-t lefordítjuk. Az indukciót oly módon végezhetjük el, hogy a táptalajhoz valamely induktort vagy derepresszort adunk vagy a fizikai paramétereket módosítjuk /pl. hőmérséklet változtatás/· A találmányunk előnyös kiviteli alakjait képező kifejező vektorokban a kifejezést a lac represszor ellenőrzi. A kifejező kontroll szekvenciát izopropil- P-D -tiogalaktopiranozid /IPTG/ hozzáadásával derepresszáljuk és ezáltal a kívánt hTNP mutein szintézisét indukáljuk.

A transzformált gazdasejtek által fentiek szerint termelt találmányunk szerinti hTNP muteineket a fermentációs közegből nyerhetjük ki vagy a sejtek felnyitása után és/vagy a fehérje és peptid kémiában ismert bármely megfelelő extrakciós módszerrel izolálhatjuk. így pl. az alábbi kinyerési módszerek alkalmazhatók: ammónium-szulfátos kicsapás, dialízis, ultraszürés, gélszürés vagy ioncserélő kromatografálás, gél elektroforézis izoelektromos fókuszálás, affinitás kromatográfia, mint pl. immunoaffinitás kromatográfia, HPLC stb. Különösen előnyösnek bizonyultak az alábbi eljárások: ammónium-szulfátoa és/vagy polietilénimines kicsapás, dialízis, affinitás kromatográfia, pl. fenil-agarózon, különösen fenil-sepharozon, vagy ioncserélő • ·· · ·· • ··« ·«· « , • · · · · » ·· ··· ·· ···· «

- 22 kromatografálás, különösen MONO-Q- és/vagy MONO-S-matrixon /Pharmaoia, Uppsala, Svédország/ vagy különösen a Tavernier és tsai által leírt /”J. Mól. Bioi. 211, 493-501 /1990/J és a

IV. példában leírt módszer.

Találmányunk tárgya ennek megfelelően eljárás a fentiekben meghatározott hTNP muteinek előállítására oly módon, hogy valamely a fentiekben leirt transzformált gazdaBejtét, előnyösen valamely prokariota gazdasejtet, pl. E. coli sejtet vagy eukariota gazdasejtet megfelelő táptalajban tenyésztünk, a muteint a tenyészet felülúszójából vagy magából a gazdasejtből izoláljuk és a muteint kívánt esetben önmagában ismert módon pegilezzük vagy gyógyászatilag alkalmas sóvá alakítjuk.

Találmányunk továbbá a fenti eljárással előállított vegyületekre is kiterjed.

A találmányunk szerinti hTNP muteineket az jellemzi, hogy humán p75-TNP-R receptorhoz szelektiv kötődési affinitást mutatnak. Ezt a tulajdonságot az irodalomból a kötődési affinitások mérésére ismert bármely módszerrel meghatározhatjuk. így pl. a TNP és a találmányunk szerinti muteinek kötődését sejttenyészetekben olyan sejtek alkalmazásával határozzuk meg, amelyek a TNP-receptorok két típusát különböző mértékben fejezik ki; ilyen sejtek pl. a Hep-2 sejtek, amelyek kizárólag a humán p55-TNP-R receptort fejezik ki, vagy az U937 és HLÓO sejtek, amelyek ezen kívül a humán p75-TNP-R receptort is kifejezik. £*Brockhaus et al., Procd. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 3127-3131, /1990/; Hohmann et al., J. Bioi. Chem. 264» 14927-14934, /1989/; Loetscher et al. /1990/; Dembic et al. /1990/__7· A kötődési affinitások természetesen közvetlenül, tisztított natív vagy rekombináns p55-TNP-R és p75-TNP-R felhasználásával, a példákban ♦ · · · · · » • ··· 04· · • · « · · · ·· ··· ·· ···« ·

- 23 leirt módon, vagy az ilyen receptorok megfelelő oldható analógjai alkalmazásával is meghatározhatók.

A jelen szabadalmi leírásban használt humán p75-tumor-nekrózis-faktor-receptorhoz történő szelektív kötődési affinitás kifejezés a két TNF-receptor típushoz való kötődési affinitás különbségére utal.

A példákban leirt vizsgáló rendszer vonatkozásában a találmányunk szerinti mutein a hp75-TNF-R receptorhoz előnyösen szelektíven kötődik /kívánatos, hogy a vadtipusú TNF-hez hasonló mértékben/, ugyanakkor azonban a hp55-TNF-R receptorhoz való kötődését lényegében teljesen elveszti. A találmányunk szerinti specifikus hTNF mutein Kp értéke a rekombináns oldható hp55-TNF-R receptorral végzett in vitro kötődési teszt szerint - a példában megadott vizsgálati rendszer alapján - előnyösen legalább 10-szer és előnyösen legalább 10 -szer nagyobb mint a vadtipusú TNF-«i megfelelő értéke, mig ugyanezen hTNF mutein megfelelő Kp értéke a rekombináns oldhatóhp75-TNF-R receptorral végzett in vitro kötődési teszt szerint legfeljebb 20-szorosa a vadtipusú TNF-pc. megfelelő értékének. Megjegyezzük azonban, hogy a fenti specifikus Kp értékek csupán tájékoztató jellegűek és szabadalmunk oltalmi köre szempontjából semmilyen korlátozást nem jelentenek.

A találmányunk szerinti hTNF muteineket önmagukban vagy egy vagy több további hatóanyaggal együtt orálisan, injekció vagy helyi úton felhasználásra kerülő készítmények formájában alkalmazhatjuk. A hatóanyag dózisát oly módon választjuk meg, hogy a hTNF mutein funkcióval kapcsolatos biológiai funkciót hatékonyan módosítsa.

Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amely találmányunk szerinti hTNF muteineket és megfelelő inért

- 24gyógyászati hordozóanyagokat tartalmaz. Bármely szokásos gyógyászati hordozóanyag felhasználható. E célra enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen hordozóanyagok alkalmazhatók, pl. viz, zselatin, gumiarábikum, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, talkum, növényi olajok, polialkilénglikolok, vazelin stb. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények további hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A készítmények ezenkívül más adalékanyagokat is tartalmazhatnak, pl. ízesítő-, tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket stb. A készítmények a gyógyszergyártásnál használatos adalékanyagokat tartalmazhatnak.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények bármely szokásos formában előállithatók, pl.

a/ orális adagolásra szolgáló szilárd formák, pl. tabletták, kapszulák, pilulák, porok, granulák stb.;

b/ orális adagolásra szolgáló folyékony formák, pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixirek stb.;

c/ parenterális adagolásra szolgáló készítmények, pl. steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók; és d/ helyi alkalmazásra szolgáló formák, pl. oldatok, szuszpenziók, kenőcsök, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszolok stb.

A gyógyászati készítmények sterilezhetők és adjuvánsokat /pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő-, emulgeálószerek, az ozmózisnyomás változását előidéző sók és/vagy pufferek/ tartalmazhatnak·

A parenterális adagolásra szolgáló készítmények intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziós vagy injekciós oldatok lehetnek· Ezek a készítmények további gyógyá• · · · ·

- 25 szati hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A készítményekhez adalékanyagokat /pl. tartósító-, stabilizáló-, emulgeélószerek, pufferek stb./ is adhatunk, a gyógyszergyártás szokásos módszereinek megfelelően.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására oly módon, hogy valamely találmányunk szerinti vegyületet és kívánt esetben további gyógyászati hatóanyagokat nem-toxikus inért gyógyászatilag kompatibilis hordozóanyagokkal összekeverünk és a keveréket galenikus formára hozzuk.

Találmányunk tárgya továbbá a találmányunk szerinti eljárással előállított vegyületek felhasználása gyógyászati készítmények előállítására.

Találmányunk tárgya továbbá a találmányunk szerinti hTKP muteinek ellen termelt antitestek. Az ilyen antitestek jólismert módon diagnosztikai vagy gyógyászati célokra és tisztítási módszereknél alkalmazhatók. Az antitesteket oly módon termeljük, hogy egy emlősbe vagy madárba a találmányunk szerinti hTNF mutein elleni antitest termelésének megindításához elegendő mennyiségű találmányunk szerinti hTNF muteint és gyógyászatilag kompatibilis hordozóanyagot tartalmazó vakcinát fecskendezünk. Az e célra szükséges hTNF mutein mennyiség a szakember által jólismert vagy rutin kísérletekkel határozható meg. A jelen szabadalmi leírásban használt gyógyászati hordozóanyag kifejezés a humán gyógyászatban alkalmazható standard készítményekben vagy állati vakcinákban használatos tipikus adjuvánsokra vonatkozik.

A TNF - mint arra már rámutattunk - potens pleiotrop citokin. Számos különböző aktivitása /pl. immun sejtek növekedési faktorának aktiválása, gyulladásoknál betöltött közvetítő szerep • ·

- 26 vagy az endotéliumban levő specifikus gének induktora/ a gazdaszervezetnek fertőzésekkel vagy sérülésekkel szemben kifejtett védekezésében játszik szerepet. A TNF erős szisztémás toxicitást is mutat; a bakteriaemia káros hatásait és a bakteriális meningitis okozta szeptikus sokkot nagy mértékben endogén citokinek közvetítik és ezek között a TNF korai és fontos szerepet tölt be. Ezenkívül a TNF közvetlen citotoxikus aktivitásával szemben sok sejt és sejtvonal érzékeny. Állatkísérletek tanúsága szerint a TNF tumorellenes hatásában különböző szisztémás hatások és celluláris toxicitás feltehetően kombinálódnak.

A fenti tények reális alapot szolgáltatnak a találmányunk szerinti hTNF muteineket felhasználó új gyógyászati stratégiák kidolgozásához. Ezek során a sok különböző hTNF aktivitás szétválasztásával a nemkívánatos toxikus hatásokat a kívánt aktivitásoktól különválasztjuk oly módon, hogy a két hTNF receptor típus közül csak az egyiket aktiváljuk /ellentétben a vadtipusú hTNF-el, amely mindkettőt megköti és aktiválja/. A találmányunk szerinti hTNF muteinek potenciális felhasználása nem korlátozódik a rákterápiára. A 75kDa TNF receptor típusú specifikus gyógyászati hatóanyagok /mint pl. a találmányunk szerinti hTNF muteinek/ minden olyan betegség kezeléséhez kedvezően alkalmazhatók, amelyben a TNF gazdaszervezet védekező faktorként bakteriális fertőzésekben /“lásd; pl. Kindler, V. et al., CELL 56, 731-740 /1989/; Nakano, Y. et al., J. Immunoi. 144, 1935, /199O/_7 vagy gyulladásokban közvetítőként jótékony szerepet játszik. Ezenkívül a TNF-oc zsirsejtekre és egész állatokra bizonyos katabolikus hatást fejt ki és ezért a cachexiában játszik szerepet /~Beutler, B. és Cerami, /lásd fent/; Hotamisligil et • 4

- 27 al., Science 259, 87 1993J7 és ezért a találmányunk szerinti

TNF muteinek elhízás kezelésére alkalmazhatók. Azt találtuk továbbá, hogy a TNF-x az inzulin által serkentett perifériás gliikóz-hasznositás mértékét közömbösíti /Hotamisligil és tsai, lásd: fent/. A TNF-c*- elhízással összefüggő inzulin-rezisztenciában kifejtett fenti feltételezett szerepe a cachexiában játszott lehetséges hatásával a két TNF receptor rendszer biológiai hatásaiban jelentkező dózisfüggő különbségek és a két receptor rendszer különböző szerepe által kiegyenlíthető és ez vadtipusú TNF-inhibitorok jelenlétében vagy nélkülük, receptor-típusú specifikus agonisták alkalmazásával eredményesen kihasználható. Még a túlzott mértékű TNF felszabadulás által okozott toxikus aktivitások által jellemzett betegségek /pl. szeptikus sokk vagy bakteriális memingitis/ is kedvezően kezelhetők TNF receptor specifikus agonistákkal /pl. a találmányunk szerinti muteinekkel/ önmagukban vagy vadtipusú TNF antagonistákkal képezett kombinációikkal.

Az irodalomban tömör összefoglalást közöltek a TNF várható szerepére olyan új terápiás területeken, ahol a TNF-receptor típusú specifikus agonisták a sok különböző TNF aktivitás közül csupán néhányat indítanak be és ez a vadtipusú TNF-el összehasonlítva várhatóan jelentős előnyöket hoz majd. /Tumor Necrosis Factors, The Molecules and their Emerging Role in Medicine,

B. Beutler, ed., Raven Press, 1992, ISBN Ο-Θ8167-852-Χ/· Ide tartoznak a TNF aktivitások az alábbi területeken: endotheliás sejt homosztatikus tulajdonságok és neutrofil adhézió modulálása, szövet-iskémia és reperfúziós sérülés, osteoblasztok és osteoclastok csont reszorpcióban, továbbá növekedési faktorként sok sejtben általában és hematopoiesisben, valamint metabolikus és táp• · · ·

- 28 láló hatások. A TNF limfokin-aktivált killer /LAK/ sejtek képzésében növekedés/differenciálás faktorként vesz részt és úgy tűnik, hogy ez a TNF tumorellenes aktivitásában szerepet játszik.

Ennek megfelelően találmányunk a fentiekben leirt, találmányunk szerinti hTNF-muteinekre vagy gyógyászatilag alkalmas sóikra is kiterjed.

Valamennyi fenti aktivitás más rekombináns citokinekkel /pl. gamma-interferon/ való együttes alkalmazás esetén erősíthető vagy módosítható.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, a kisérő rajzokra hivatkozva.

Az alábbi rövidítéseket és szimbólumokat alkalmazzuk:

Β, Ε, H, S, Xb és XaBglI, EcoRI, HindlII, Sáli, Xbal illetve Xhol restrikciós enzimek hasítási helyeit jelölik.

jelentése a N25OPSN25OP29 szabályozható promotor/operátor elem;

ftV.wl jelentése a RBSII, Sphl szintetikus riboszómás kötődési hely;

jelentése a TNF-tx/TNF-oc/, beta-laktamáz /bla/, kloramfenikol acetil transzferáz /cat/, lac represszor /lacl/ és neomicin foszfotranszferáz /neo/ génjei;

liliiillil jelentése a fág lambda t transzkripciós terminátora /t_Q/ és az E. coli rrnB operon Ti /TI/;

jelentése a pBR322 és pREP4 /repl/ plazmid replikációs tartományai;

--> jelentése a N25OPSN25OP29 és RBSII, Sphl által ellenőrzött kódoló tartomány.

Az la, ábrán a pDS56/RBSII, SphI-TNF-otplazmid sematikus rajzát tüntetjük fel.

•••· ··«· ·· ·· ♦··· • · · · « * · • ··« ·*· · ·

Az lb. ábra a pDS56/RBSII, SphI-TNF-Λ/SEQ ID No.l/ plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tartalmazza. Ebben a szekvenciában a restrikciós enzimeknek az la. ábrán feltüntetett felismerő szekvenciáit megjelöltük. A bemutatott aminosav-szekvencia az érett TNF-oe/157 aminosav; SEQ ID No.l és 2/ hárombetűs kódban feltüntetett aminosav-szekvenciája.

A 2a<> ábrán a pREP4 plazmid sematikus rajzát tüntetjük fel.

A 2b. ábra a pREP4 /SEQ ID No.3/ plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tartalmazza. Ebben a szekvenciában a restrikciós enzimeknek a 2a. ábrán feltüntetett felismerő szekvenciáit bejelöltük /lásd továbbá 486908 sz. európai szabadalmi leírás 261-263 ábrái/.

A 3· ábrán a TNF-0</D143N, A145R/ TNE-o< muteint kódoló EcoRI-HindlII fragmens készítését tüntetjük fel.

A 4· ábrán humán típusú TNP-oc és D143N, A145R és D143N-A145R muteineknek humán TNFRp75 és TNFRp55 receptorokhoz történő kompetitiv kötődését tüntetjük fel. Rekombináns humán TNERp75“h^3 fúziós fehérjével /felső rész/ és rekombináns humán TNFRp55“h^3 fúziós fehérjével /alsó rész/ bevont 96-mélyedéses mikrotiter lemezeket radioaktív jelzett humán TNP-oO-val inkubálunk, különböző koncentrációjú jelzetlen vadtipusú TNF-o^ D143N, A145R vagy D143N-A145R mutein jelenlétében. A szobahőmérsékleten 3 óra alatt megkötött radioaktivitást gamma-számlálóban számláljuk.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy az oltalmi kört a példákban korlátoznánk. A szilárd anyagokra szilárd keverékekben, folyadékokra folyadék-e legyekben és szilárd anyagokra folyadékokban megadott százalékos értékek tömeg/tömeg, térfogat/térfogat illetve

- 30 ···· ·<*· ·· *· ♦··· • · · · · » · • ··« ··· · · ·· ·*· · · ···· · tömeg/térfogat %-ban értendők, feltéve, hogy mást nem közlünk.

I. példa

TNP-©C/D143N-A145R/ előállítása A pDS56/RBSII, SphI-TNF-oc plazmid

A pDS56/RBSII, SphI-TNF-cC humán TNF-0C kifejezési plazmid /lásd 1. ábra/ a találmányunk szerinti különböző TNF-0C mutelnek előállításánál felhasznált TNF-cC gén forrás. A transzformált /pREP4;pDS56/RBSII, Sphl-TNP-pcJT’ E. coli M15 törzset a Mikroorganizmusok Szabadalmi Célokra Történő Deponálásának Nemzetközi Elismerésére irányuló Budapesti Szerződés értelmében a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH /DSM/» Braunschweig, Németország törzstenyészetnél 1991. szeptember 8-án DSM 6713 számon helyeztük letétbe.

A TNF-oC gén mutagenézise PCR felhasználásával

A pDS56/RBSII, SphI-TNF-oC/1. ábra/ plazmiddal mint p templát DNS-sel, Perkin-Elmer Cetus GeneAmp DNS ampfikációs p reagens kit felhasználásával, AmpliTaq rekombináns Taq DNS polimeráz /lásd 3. ábra/ felhasználásával két PCR reakciót végzünk el.

Az I. reakciót az alábbi primerekkel végezzük el: 17/F /“5-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3’ /SEQ ID No.4/; a 17/F primer a pDS56/RBSII, SphI-TNF-pc· plazmid 3949-3970 nukleotidjeit tartalmazzaJT, és a 46/M12 /“5»-GCGAAAGTTGAGATAGTCGGGCCGATTG-3’/SEQ ID No.5/; a 4θ/Μ12 primer a pDS56/RBSH, Sphl-TNF-űCplazmid 552-525 nukleotidjeivel komplementer nukleotideket tartalmaz; a mutált bázisokat alahuztuk__7· ···· ···« *· »· ♦··· • « · · · » · • · · · ··· · * ·····* • · ··· · · ···· ·

- 31 A II. reakciót az alábbi primerekkel végezzük el: 29/MR2 /”5’-GAGTCTGGGCAGGTCTACTTTG-3’ /SEQ ID No.6/ ; a 29/MR1 primer a pDS56/RBSII, SphI-TNF-oC·plazmid 553-574 nukleotidjeit tartalmazza^» és a 17/0 /“5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3* /SEQ ID No.7/; a 17/0 primer a pDS56/RBSII, SphI-TNF-oc plazmid 748-727 nukleotidjeivel komplementer nukleotideket tartalmaz 7·

Egy tipikus kísérletben 10 /ul templát DNS-t /10 ng/,

5-5 /ul prímért /mindkét primerből 100 pmól/, 16 /ul dNTP keveréket /1,25 mM dATP, dGTP, dCTP ás dTTP/ 10 /ul lOx reakciópuffert /100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KG1, 15 mM MgCl₂ és 0,1 % zselap tin/ 10 yul /5 egység/ AmpliTaq DNS polimerázt és 53 yul vizet Eppendorf-csőben összekeverünk és 80 ml ásványolajat /Perkin-Elmer Cetus/ rétegezőnk föléje. A csöveket DNS termikus ciklus berendezésbe /TRIO-Thermoblock Biometra/ visszük át és 1 percen át 94 °C-on tartjuk, majd 35 ciklust végzünk el, amelyek során a DNS-t megolvasztjuk /1 percen át 94 °C-on/, a primereket összekapcsoljuk /1 percen át 50 °C-on/ és a primereket kiterjesztjük /3 percen át 72 °C-on/. Ezután további 2 percen át 72 °C-on tartjuk, majd a reakcióelegyeket szobahőmérsékletre hütjük és kloroformmal extraháljuk. A vizes fázisban levő DNS-t etanollal kicsapjuk és 6 %-os poliakrilamid gélben /Sambrook és tsai, 1989/ elektroforézisnek vetjük alá. A DNS-t etidium-bromiddal megfestjük, a I. ás II. fragmenst /lásd 3· ábra/ a gélről izoláljuk és tisztítjuk /Sambrook és tsai 1989/·

A TNF-p(/D143N-A145R/ kódolására szolgáló DNS fragmens előállítása

A I. és II. fragmenst enzimatikusan foszforilezzük, majd egymással ligáljuk /Sambrook és tsai 1989/. A ligázt hővel inaktiváljuk, EcoRI és Hindii! restrikciós enzimekkel emésztjük, ···« ···· ·· ·· ···« • · · · ♦ · · • · ·· ··· · ·

- 32 majd a DNS-t 6 %-os poliakrilamid gélben elektroforézisnek vetjük alá. A DNS-t ethidium-bromiddal megfestjük, majd az

EcoRI-HindlII A fragmenst /lásd: 3· ábra/ a gélről izoláljuk és tisztítjuk /lásd fent/.

A TNF-o</D143N-A145R/ kódolására szolgáló plazmid előállítása

Az EcoRI-HindlII A fragmenst standard módszerekkel /Sambrook és tsai 1989/ EcoRI-HindlII nyitott pDS56/RBSII, SphI-TNF-oc plazmidba illesztjük be, a pDS56/RSBII, SphI-TNF-oc /D143N-A145R/ plazmid kialakítása közben. A DNS plazmidot elkészítjük /Bimbóim és tsai 1979/ és a TNF-pc muteint kódoló tartományt a kettős-szálú DNS szekvencia meghatározásával azonosítjuk /Sambrook és tsai 1989/·

TNF-pc/D143N~A145R/ termelése

A pDS56/RBSII, SphI-TNF-öC/D143A-A145R/ plazmidot standard módszerekkel /lásd fent/ pREP4 plazmidot tartalmazó E. coli M15 sejtekben transzformáljuk. A transzformált sejteket 37 °Cron 100 mg/1 ampicillint és 25 mg/1 kanamicint tartalmazó LB táptalajban tenyésztjük. Ezután 600 nm optikai sűrűség mellett kb. 0,7 - 1,0 IPTG-t adunk hozzá, 2 mM végső koncentrációig. Ezután további 2,5-5 órán át 37 °C-on tartjuk, majd a sejteket centrifugálással learatjuk.

II. példa

További TNF-öCtnuteinek előállítása

A I. táblázatban felsorolt további TNF-ocmuteineket az I. példában a TNF-tf/D143N-A145R/ előállítására megadott rész • ·4 letes eljárás szerint készítjük el. A kapott, a pDS56/RBSII,

SphI-TNF-eC/D143N-A145R/ plazmiddal analóg kifejezési plazmidok elnevezése: pDS56/RBSII, Sphl-TNF-^/mutein/; ahol a mutein kifejezés az I. táblázatban felsorolt TI\TF-«c muteineke t jelenti.

Ezek a plazmidok. a TNF-oc muteineket kódoló tartományokat tartalmaznak, amelyekben a pDS56/RBSII, SphI-TKF-eCplazmádban levő kodonokat a fenti muteineket kódoló kodonok helyettesítik /lásd: 1. táblázat/.

III. példa

Humán TNF-tX mutejnek receptor tipusú specifikus kötődési aktivitásának meghatározása E. coli lizátumokban

E. coli lizátumok előállítása

Az I. és II. példában leirt módon transzformált és indukált E. coli sejtekből készített szuszpenziókat /10 ml/ percenként 4·000 fordulat mellett 10 percen át centrifugálunk és 0,9 ml lizis pufferben /10 mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM EDTA, 2 mM PMSF, 10 mM benzamidin, 200 egység/ml aprotinin és 0,1 mg/ml lizozin/ újraszuszpendálunk. Ezután szobahőmérsékleten 20 percen át inkubáljuk, majd 50/ul 1 M MgClg-t, 20 /ul 5 mg/ml DNasel-t, 50 yul 5 M NaCl-t és 50 yul 10 %-os ΝΡ-40-t adunk hozzá és az elegyet szobahőmérsékleten további 15 percen át inkubáljuk. A lizátumot percenkénti 13.000 fordulat mellett 5 percen át centrifugáljuk, majd 0,5 ml ily módon derített lizátumot ammónium-szulfátos lecsapásnak vetünk alá /25 % - 70 % vágás/. A 70 %-os ammónium-szulfát pelletet 0,2 ml PBS-ben oldjuk és a rekombináns fehérjék jelenlétét és hozzávetőleges mennyiségét nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gél /SDS-PAGE/ elektroforézissel meghatá rozzuk ···· ···· • · ··

Szilárd fázisú radioligand kompetitiv megkötési vizsgálat

96-mélyedéses mikrotiter lemezekre rekombináns humán

TNFR-p75-hy3 és TMFR-p55-hy3 fúziós fehérjéket viszünk fel /a receptor extracelluláris része fúziónál a humán IgG3 Fc részé-

át 4 °C-on_7> /“Loetscher, H. et al. J. Bioi. Chem. 266,

18324-18329 /1991/; Lesslauer, W. et al. Eur. J. Immunoi. 21, 2883-2886 /1991/7* Ezután blokkoló pufferrel /50 mM Tris pH 7,4,

140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02 % NaNp 1 % zsirmentesitett tejpor/ blokkoljuk, majd a mikrotiter lemezt PBS-el mossuk és 0,1 % zsirmentesitett tejport tartalmazó blokkoló pufferben 10 ng/ml humán vad-tipusú ¹²^I-TNF-^-al és E. coli lizátumok változó hígitásaival /10 - 10 ; tízszeres sorozat hígítás/ inkubáljuk.

A TNF-tfC-t jodogén módszerrel /Pierce Chemical Company/ kb. 10-30 /uCi//ug fajlagos aktivitással jelezzük. A térfogat 100 mé-

lyedés és minden lizátumhigitást kétszer vagy háromszor határozunk meg. Az elegyeket szobahőmérsékleten 3 órán át tartjuk, majd a mélyedéseket PBS-el alaposan mossuk és ^-számlálóban számláljuk. A fenti muteineket tartalmazó lizátumokkal kapott eredményeket a 2. táblázatban tüntetjük fel.

IV. példa

Humán TNF-^c muteinek tisztítása

Az I. és II. példában leirt módon transzformált és indukált E. coli sejtek egy éjszakás tenyészeteit /1 liter/ centrifugálással összegyűjtjük és 20 ml pufferben /50 mM Trisz pH 7,2, 200 mM KC1, 50 mM MgCl₂, 5 % glicerin/ újraszuszpendál

- 35 juk. A sejteket francia présen 20.000 psi nyomáson vagy Branson S sugárzóval /Model 450, 2x2 perc maximális teljesítménnyel, jégen/ végzett besugárzással feltörjük. Ezután centrifugálással /70.000 g, 30 perc, 4 °C/ derítjük, a mintákat 20 mM Tris-HCl-el /pH 9,0/ szemben egy éjjelen át 4 °C-on dializáljuk, majd a fenti pufferrel kiegyensúlyozott Q-Sepharose oszlopra /Pharmacia, 2,6 x 15 cm/ felvisszük. A fehérjéket lineáris nátrium-klorid gradiens szerint /0-400 mM, 20 rríM pH 9,0 értékű Tris-ben/1 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. Az eluátumból 5 ml-es frakciókat gyűjtünk össze, és a TNP fehérjék jelenlétét SDS-PAGE analízissel meghatározzuk. A pozitív frakciókat összegyűjtjük, 20 mM 2-morfolino-etánszulfonsavval /KIES/ szemben dializáljuk /pH 6,0/ és 20 mM MES-el /pH 6,0/ kiegyensúlyozott MonoS oszlopra /HR 5/5, LKB-Pharmacia/ felvisszük· A fehérjéket lineáris nátrium-klorid gradiens szerint /0-400 mM, 20 mM MES-ben pH 6,0/ eluáljuk, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett. A különböző TNF-<* muteineket 250 mii és 350 mM nátrium-klorid között elektroforetikusan tiszta fehérjék formájában eluáljuk. Ezután PBS-el szemben dializáljuk, majd a fehérjekoncentrációt BOA fehérje vizsgálat /Pierce Chemical Company/ segítségével meghatározzuk; standardként vad-tipusú humán TNP-oc-t alkalmazunk. A fehérjekoncentrációt 280 nM mellett végzett abszorbció méréssel is meghatározzuk.

V.

a

Tisztított vadtipusú TNP-océs muteinek kompetitiv kötődése rekombináns humán TNFR-p75 és TNFR-p55 receptorhoz

A kompetitiv kötődési teszt elvégzése céljából tisztított muteineket alkalmazunk és mikrotiter lemezeket a III. példa····

- 36 bán leirt módon rekombináns humán TNFR-p75-h^3 és TNBR-p55-h^3 fúziós fehérjékkel vonunk be. Blokkoló pufferrel /50 mM Tris pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mii EDTA, 0,02 % NaN^, 1 % zsirmentesitett tejpor/ történő blokkolás után a mikrotiter lemezt PBS-el mossuk, es 0,1 % zsirmentesitett tejport tartalmazó blokkoló pufferben 10 ng/ml humán vadtipusú ⁹I-TNF-tfC-val és jelzetlen vadtipusú

-5

TNF-pCvagy a muteinek különböző koncentrációival /“10 -10 yug/ml; tízszeres sorozat higitás_7 inkubáljuk. A TNP-CG-t jodogén módszerrel /Pierce Chemical Company/ kb. 10-30 uCi//ug fajlagos aktivitással jelezzük. A térfogat 100 yul/mélyedés és minden koncentrációval két vagy három meghatározást végzünk. Az elegyeket szobahőmérsékleten 3 órán át állni hagyjuk, majd a mélyedéseket PBS-el alaposan mossuk és ^p-számlálóban számláljuk.

A fenti muteinekre kapott eredményeket a 3° táblázatban tüntetjük fel és a 4. ábrán mutatjuk be.

• ••· ·« 4« • ♦ • * ·« • · · • ·· ·

A muteínekben levő új aminosavak kódolására felhasznált kodonok «··· • ·« ·

- 37 1. táblázat

Mutein	Uj kodon
N19D	GAC
Q21S	TCT
L29S«	TCC
L29S-R32W	TCC-TGG
L29S-R32W-S86T	TCC-TGG-ACC
L29S-S86T	TCC-ACC
N30T	ACC
R31E	GAG
R31K	AAG
R31N-R32T	AAC-ACT
R31N-R32T-N34S	AAC-ACT-AGT
R31N-R32T-S86T	AAC-ACT-ACC
R31E-S86T	GAG-ACC
R32Wa	TGG
R32W-S86T	TGG-ACC
A33D	GAC

• »<* • · · *>

Α33Τ

N34R

N34D

N34C

N34Q

Ν34Ε

N34G

Ν34Η

Ν34Ι

Ν34Μ

N34F

Ν34Ρ

Ν34Τ

Ν34Υ

Ν34Υ

N34V

Κ65Α

K65W

Q67K

Q67T

Q67Y

H73Q

Η73Τ

L75R

L75H

- 38 ACC

CGT

GAC

TGT

CAA

GAA

GGT

CAC

ATT

ATG

TIT

CCT

ACT

TAT

TAC

GTT

GCA

TGG

AAA

ACA

TAC

CAA

ACT

CGT

CAC ♦ «

L75W

S86D

S86T

Y87Q

Y87Q-Q88A

Y87E

Y87G

Y87L

Y87K

Y87F

Y87T

Y87T-E104G

N92R

I97K

I97Y

S99A

S99Y

Y115W

- 39 TGG

GAC

ACC

CAG

CAGGAA

GGT

CTG

AAA

TTC

ACC

ACC-GGG

CGT

AAG

TAC

GCA

TAC

TGG

D143N

D143E

D143F

AAC

GAA

TTC

D143W

TGG »··· ·· ·* ···* • · · · · · · • ··· ··* · · • · · · « * * · «·« · · r · · · ·

D143Y	TAC
D143V	GTC
D143V-F144L-A145S	GTC-CTG-TCC
D143N-A145R	AAC-CGC
D143V-A145S	GTC-TCC
F144R	CGT
F144D	GAT
F144G	GGT
F144L	TTG
F144W	TGG
F144Y	TAC
A145R	CGC
A145D	GAT
A145G	GGT
A145H	CAC
A145K	AAA
A145F	TTT
A145S	TCC
A145T	ACA
A145W	TGG
A145Y	TAC
A145V	GTT
E146R	CGT
S147N	AAC
S147L	CTG

a L29S és R32W muteineket dr. W. Fiers laboratóriumában /Ghenti

Egyetem/ készítették el /lásd továbbá EP 486 908 sz. európai szabadalmi leírás/.

2, táblázat

Humán TNF-oC muteinek kötődése TNFR-p55 és TNFRrp75 receptorhoz

Mutein

J-25j_tnp-oC kötődés 50 %-os gátlásához szükséges

E. coli lizátum hígítás,

ID_5q TNFR-p55 ^b/

ID_5q TNFR-p75

TNFR-p55 TNFR-p75

-szoros	-szoros
vadtipus C/Z	14'260	14'140	1
N19D	5'000	5’000	1
Q21S	2’500	2'500	1
L29S c>	2’980	<100	>29.8
L29S-R32W	5'000	«100	»50
L29S-R32W-S86T	2’500	«100	»25
L29S-S86T	200	«100	»2
N30T	2’860	2'500	1.1

···· ·*·« 99 ♦»** • · ♦ · 9 » A • ··· ··· v * • · · · · · ·· ··« ·♦ ·♦*· ·

R31E^	3'470	180	19.3
R31K	3'330	3'330	1
R31N-R32TC^	3’260	<100	>32.6
R31N-R32T-N34S	«100	«100	1
R31N-R32T-S86T	500	<100	>5
R31E-S86T	2'000	«100	»20
R32W c> e>	8’780	<100	>87.8
R32W-S86T	3'330	«100	»33.3
A33D	<100	«100	>1
A33T	1'110	1'250	0.9
N34R<#	<100	«100	>1
N34D	250	<100	>2.5
N34C	250	<100	>2.5
N34Q	<100	«100	>1
N34E	330	«100	»3.3
N34G	330	<100	>3.3
N34H	670	<100	>6.7
N34I d)	200	<100	>2
N34M d)	<100	«100	>1
N34F<#	100	<100	>1
N34P	<100	«100	>1

···· ·«·« 99 99···» • · fr · · ·· • ··» 999 «* • · · · · · ·· «·· ·· ·«* · ·

Ν34Τ	1'000	<100	>10
N34Y<#	<100	«100	>1
Ν34Υ<#	<100	«100	>1
N34V$	<100	«100	>1

K65A	20'000	33'330	0.6
K65W^	500	3'330	0.2
Q67K	25’000	50'000	0.5
Q67T	25'000	33'330	0.75
Q67Y	20'000	33'330	0.6
H73Q	10'000	10'000	1
H73T	2'000	2'000	1
L75R	<100	<100	1
L75H	1’670	2’500	0.7
L75W	220	330	0.7

S86D	6670	1'000	6.7
S86T	10'000	<100	>100
Y87Q	«100	«100	1
Y87Q-Q88Á	«100	«100	1
Y87E	<100	«100	>1

···· ···· ·· ·*·» • * · · 9 W 6 • β·4 ·4· · » • · · · · · ·· ··· ·· ···· ·

Y87G	«100	«100	1
Y87L	«100	«100	1
Υ87Κ	«100	«100	1
Y87F	200	<100	>2
Υ87Τ	«100	«100	1
Y87T-E104G	<100	<100	1

N92R	5’000	1'250	4
Ι97Κ	143	<100	>1.4
Ι97Υ	2’500	330	7.6
S99A	6’670	6’670	1
S99Y	<100	<100	1
Y115W	2’220	2’220	1

D143N c)	«100	330	«0.3
D143E	<100	330	<0.3
D143F	«100	250	«0.4
D143W	«100	100	«1
D143Y^	«100	1'330	«0.08
D143V	«100	<100	<1
D143V-F144L-A145S	«100	<100	<1

*··· ···« ·· ·· ···· • te w · · · * • ··· ·«· « · • · 9 · · · ·· ·«* ·· ···« ·

D143N-A145R$	«100	125	«0.8
D143V-A145S c)	«100	200	«0.5
F144R	2'500	330	7.6
F144D	5'000	330	15.2
F144G	2'500	2'000	1.2
F144L	5'000	5Ό00	1
F144W	400	180	2.2
F144Y	2'860	2'860	1
A145R	<100	3’330	<0.03
A145D	5'000	6'670	0.7
A145G	2'500	6'670	0.4
A145H	330	1'670	0.2
A145K	<100	1'820	<0.05
A145F c)	240	6'000	0.04
A145S	14'290	25'000	0.6
A145T	5'000	6'670	0.7
A145Wrf>	«100	<100	<1
A145Y	1’670	11'110	0.1
A145V	1'000	2'000	0.5
E146R	6'670	<100	>67
S147N	10'000	10'000	1
S147L	2’000	3’330	0.6

- 46 A humán vadtipusú TNF-iX-t és a muteineket fejezzük ki és a baktériumok lizálásával extraháljuk. /. .jLt vadtipusú és mutáns TNF-<?C szelektív receptor kötődési akti uását szilárdfázisú radioligand kötődési vizsgálattal határozzuk meg. A humán vadtipusú I-TNFnpí-nak iramobilizált humán TNFR-p75 és TNFR-p55 receptorokhoz történő kompetítiv kötődési gátlásának vizsgálatához E. coli lizátumok különböző hígításait /10 -10 ;

tízszeres sorozathigitások/ alkalmazzuk. Az ID^q értékeket /50 %-os gátláshoz szükséges hígítás/ oly módon határozzuk meg, hogy a kötődés gátlását a lizátum hígításával szemben ábrázoljuk. Minthogy a rekombináns fehérjék koncentrációja a lizátumban SDS-PAGE analízis szerint 0,05 és 1 mg/ml közötti érték, az abszolút ID^q értékek nem tekinthetők relevánsnak. A receptor szelektivitást oly módon fejezzük ki, hogy az adott mutein TNFR-p75 és TiIFR-p55 receptorokkal szemben mutatott ID^q értékeit közvetlenül összehasonlítjuk.

a/ < jelzés azt jelenti, hogy az érték a megadott számnál kisebb /jelen esetben a TNZF-«—kö tód és gátlása mérhető, azonban az %-os gátlást a legalacsonyabb vizsgált hígításban - 1:100 nem éri el/;

jelzés azt jelenti, hogy az érték a megadott számnál lényegesen kisebb /jelen esetben a legalacsonyabb vizsgált hígításban - 1:100 - mérhető gátlást nem tapasztaltunk/.

b/ arány = 1, nincs receptor szelektivitás;

arány > 1, TNFR-p55 szelektivitás; arány < 1, TNFR-p75 szelektivitás. A találmányunk szerinti muteinek ID50 TNFR-p55

ID50 THFR-p75

értéke 1-nél kisebb kell hogy legyen. Ez az érték általában

0,5-nél kisebb, azonban előnyösen 0,2-nél kisebb vagy ezzel egyenlő /lásd: az 5. igénypont szerinti muteinek/ és még előnyösebben 0,1-nél kisebb vagy ezzel egyenlő /lásd: 6. igénypont szerinti muteinek/. Az 1. táblázatban feltüntetett vagy ”<<” jelölések esetében a szóbanforgó muteinek előnyösen a fenti tartományokba tartoznak.

c/ E muteinek esetében legalább három különböző lizátumot készítettünk el és vizsgáltunk; az átlagos ID^q értékeket tüntetjük fel.

d/ Ezek a muteinek az Ξ. coli lizátumok készítésénél alkalmazott körülmények között csak részlegesen oldhatók /megjegyezzük azonban, hogy különböző tisztítási módszerek esetén eltérő oldhatósági viszonyok alakulhatnak ki/· Az oldható mutein koncentrációját ezekben a lizátumokban SDS-PAGE analízissel határozzuk meg és a kapott érték 0,05 mg/ml-nél kisebb.

e/ A L29S és R32W muteineket dr. W. Fiers laboratóriumában /Ghenti egyetem/ készítették el /lásd: továbbá EP 486 908 sz. európai szabadalmi leírás/.

3. táblázat

Szelektált humán TNF-c£ muteinek kötődése humán. TNFR-p75 és

TNFR-p55 receptorokhoz

Mutein ¹²⁵I-TNF-0C kötődés 50 %-os gátlásához szükséges mutein koncentráció

A kötődési affinitás vadtipusú termékhez viszonyított csökkenése

	TNPR-p55	TNFR-P75	TNFR-p55	TNFR-p75
	ng/ml	ng/ml	-szoros	-szoros
D143N	>100'000	300	>2'500	6.7
D143Y	>100'000	350	>6'660	17.5
A145F	500	30	33	1.5
A145R	100'000	35	2'500	0.8
A145W	10'000	100	250	2.5
D143N- A145R	»100'000	300	»2'500	6.7

- 49 A humán TNFR-p75 receptorhoz preferenciálisan kötődő muteineket szelektáljuk /lásd: 2. táblázat/ és szekvenoiális ioncserélő kromatográfiával látszólagos homogenitásig tisztítjuk. A tisztított muteinek szelektív receptor kötődési aktivitását szilárdfázisú radioligand kötődési vizsgálattal mérjük. A humán vadtipusú ^i-TNF-pc/lO ng/ml/ rögzített humán TNFR-p75 és TNFR-p55 receptorhoz történő kompetitiv kötődési gátlásának meghatározáséhoz különböző mutein koncentrációkat vizsgálunk /10 -10 ^/Ug/tnl;

r-10 ^J/Ug/ml os gátláshoz

szükséges koncentráció/ oly módon határozzuk meg, hogy a kötődés gátlását a koncentrációval szemben ábrázoljuk.

a/ jelölés mérhető kompetitiv kötődést jelent, amelynek értéke azonban 100 yug/ml mellett 50 %-nál kisebb;

jelölés azt jelzi, hogy a legmagasabb vizsgált koncentrációban /100 mérhető kompetitiv gátlást nem tapasz-

talunk b/ Az affinitás csökkenését oly módon számítjuk ki, hogy a muteinekre kapott ΙΟ^θ értékeket a vadtipusú TNF-AS-ra kapott ΙΟ^θ értékekkel elosztjuk. A vadtipusú TNF-oc ΙΟ^θ értékét minden kisérletsorozatnál meghatározzuk; a kapott értékek 15*-45 mg/ml tartományba esnek, a felhasznált radioaktív jóddal jelzett TNF-oC-tól függően.

Claims (29)

1/ Humán p75-TNF-dC-receptorhoz a humán p55-TNF-oG-receptornál nagyobb kötődési affinitást mutató humán TIíF-oC rauteinek vagy gyógyászatilag alkalmas sóik,

2/ Az 1, igénypont szerinti vegyület, azzal j ellemezve, hogy a vadtipusú humán TNF-<£-hoz viszonyítva, a vadtipusú humán TNF-X-nak megfelelő 33, 65, 67, 75, 143, 145 és/vagy 147 helyzetben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz.

3/ A 2. igénypont szerinti vegyület, azzal j ellemezve, hogy a mutein a vadtipusú humán TNF-oC-nak megfelelő 143 és/vagy 145 helyzetben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz.

4/ A 2. igénypont szerinti vegyület, azzal j ellemezve, hogy a mutein a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz:

A33T

K65A

K65W

Q67K

Q67T

Q67Y

L75H

L75W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143IÍ - A145R • · · · ···

D143V - A145S

A145R

A145D

A145G

Α145Η

Α145Κ

A145F

A145S

Α145Τ

A145W

Α145Υ

A145V

E146R

S147L

5/ A 4. igénypont szerinti vegyület, azzal jellemezve, hogy a mutein a vad típusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz:

K65W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S ····

4 · ·

- 52 A145R

Α145Η

Α145Κ

A145F

A145W

Α145Υ

6/ Az 5. igénypont szerinti vegyület, azzal j e lleme zve, hogy a mutein a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz:

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S

A145R

A145K

A145F

A145W

A145Y

7/ Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vegyület azzal jellemezve, hogy a mutein a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz:

• · · ·

- 53 D143N

D143Y

A145F

A145R

A145W

D143N - A145R

8/ Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vegyület pegilezett formában.

9/ Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti muteint kódoló DNS-szekvencia.

10/ A 9. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmazó vektor.

11/ A 10. igénypont szerinti vektort tartalmazó gazdasejt.

12/ A 10. igénypont szerinti DNS-szekvenciával komplementer RNS-szekvencia.

13/ Gyógyászati készítmény azzal jellemezv e, hogy hatóanyagként valamely, az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet és inért gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.

14/ Eljárás humán p75-TNF-receptorhoz a humán p55-TNF-receptorhoz viszonyítva nagyobb kötődési affinitást mutató humán TNF-pc muteinek, adott esetben pegilezett formában, vagy gyógyászatilag alkalmas sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely , a fenti muteineket kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral transzformált gazdasejtet megfelelő táptalajban tenyésztünk, majd a muteint tisztítjuk és az ily módon kapott tisztított muteint adott esetben az irodalomból ismert módszerekkel pegilezzük vagy sóvá alakítjuk.

• ·<· ···· · · • · · · • ··· ··· • « · ·

- 54

15/ A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú humán TnF-<£-hoz viszonyítva, a vadtipusú humán TNF-<x> nak megfelelő 33, 65, 67, 75, 143, 145 és/vagy 147 helyzetben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz.

16/ A 15o igénypont szerinti eljárás, azzal jellemzve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú humán TNF-tfC-hoz viszonyítva, a vadtipusú humán TIJF-pC-nak megfelelő 143 és/vagy 145 helyzetben legalább egy aminosav-változtatást tartalmaz.

17/ A 15» igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú szekvenciához viszonyítva az alábbi helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz;

A33T

K65A

K65W

Q67K

Q67T

Q67Y

L75H

L75W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

- 55 ···· «··« • ·

D143V - A145S

A145R

A145D

A145G

Α145Η

Α145Κ

A145F

A145S

Α145Τ

A145W

Α145Υ

A145V

E146R

S147L

18/ A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz:

K65W

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S

A145R

Α145Η

Α145Κ

A145F

A145W

Α145Υ

19/ A 18. igénypont szerint eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz:

D143N

D143E

D143F

D143W

D143Y

D143V

D143V - F144L - A145S

D143N - A145R

D143V - A145S

A145R

A145K

A145F

A145W

A145Y

20/ A 14-19· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan muteint állítunk elő, amely a vadtipusú szekvenciának megfelelő helyzetekben legalább egy alábbi aminosav-változtatást tartalmaz;

···· ···« ·«<

D143N

D143Y

A145F

A145R

A145W

D143N - A145R

21/ A 14-20. igénypontok 'bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként valamely prokarióta vagy alacsonyabbrendü eukarióta gazdasejtet alkalmazunk.

22/ A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prokarióta gazdasejtként valamely E.coli sejtet alkalmazunk.

23/ A 14-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kifejező vektorként valamely, a pDS családba tartozó vektort alkalmazunk.

24/ Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 14-23. igénypontok bármelyike szerint előállított vegyületet, és kívánt esetben további gyógyászati hatóanyagot vagy hatóanyagokat, nemtoxikus inért gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagokkal összekeverünk és a keveréket galenikus formára hozzuk.

25/ A 14-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyűletek felhasználása a 13. igénypont szerinti gyógyászati készítmények előállítására.

26/ DNS-szekvencia azzal jellemezve, hogy a 14-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyületet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.

27/ Vektor, különösen valamely prokarióta vagy alacsonyabbrendü eukarióta gazdasejtben történő kifejezésre azzal **·· ·*·· ··· * · * * ·«·· · jellemezve, hogy valamely, a 26. igénypont szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz.

28/ Gazdasejt, különösen valamely prokarióta vagy alacsony abbrendü. enkarióta gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 27. igénypont szerinti vektorral transzformálva van.

29/ A 28. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely E. coli sejt.