HUT64593A - Method for producing human fgf muteine - Google Patents
Method for producing human fgf muteine Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64593A HUT64593A HU9202039A HU203992A HUT64593A HU T64593 A HUT64593 A HU T64593A HU 9202039 A HU9202039 A HU 9202039A HU 203992 A HU203992 A HU 203992A HU T64593 A HUT64593 A HU T64593A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mutein
- hbfgf
- amino acid
- iptg
- transformant
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 56
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 31
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 31
- -1 polysaccharide sulfate Chemical class 0.000 claims description 25
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 16
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 7
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 10
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 10
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 8
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 8
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 5
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 4
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 4
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 3
- KHLLRHIUKOJXLL-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl)methanesulfonyl fluoride;hydron;chloride Chemical compound Cl.NC(=N)C1=CC=C(CS(F)(=O)=O)C=C1 KHLLRHIUKOJXLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100020873 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 2
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N iron(3+);trinitrate Chemical compound [Fe+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O VCJMYUPGQJHHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 1,3-dichloro-5,5-dimethylimidazolidine-2,4-dione Chemical compound CC1(C)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O KEQGZUUPPQEDPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWVCIORZLNBIIC-UHFFFAOYSA-N 2,3-dibromopropan-1-ol Chemical compound OCC(Br)CBr QWVCIORZLNBIIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100015199 Caenorhabditis elegans gly-11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100335894 Caenorhabditis elegans gly-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100335897 Caenorhabditis elegans gly-9 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037681 Protein FEV Human genes 0.000 description 1
- 101710198166 Protein FEV Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N chlorosulfonic acid Substances OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006698 hydrazinolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L iron dichloride Chemical compound Cl[Fe]Cl NMCUIPGRVMDVDB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WBJZTOZJJYAKHQ-UHFFFAOYSA-K iron(3+) phosphate Chemical compound [Fe+3].[O-]P([O-])([O-])=O WBJZTOZJJYAKHQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000399 iron(III) phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015094 jam Nutrition 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 description 1
- AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N sulfur trioxide Inorganic materials O=S(=O)=O AKEJUJNQAAGONA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940101641 thiamine 50 mg Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical class CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás a humán bázikus fibroblaszt növekedési faktor (az alábbiakban csak hbFGF néven említjük) egy muteinjének előállítására, amely muteinben a hbFGF-nek legalább egy aminosavát egy másik aminosawal helyettesítjük, és ez a mutein sebek gyógyulásának elősegítésére szolgál.The present invention relates to a method for the production of a mutein of the human basic fibroblast growth factor (hereinafter only referred to as hbFGF), which replaces at least one amino acid of hbFGF with another amino acid and serves to promote the healing of mutein wounds.
A bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) egy bázikus polipeptid, molekulasúlya körülbelül 17 000, és főleg a hipofízis mirigy választja ki. A bFGF-et először egy olyan faktorként izolálták, amely erős növekedést serkentő hatással rendelkezik fibroblasztokon, például a BALB/C3T3 sejteken [D. Gospodarowicz et al., Natúré, 249. 123 (1974)]. Az már ismert, hogy az FGF majdnem minden mezoblaszt-eredetű sejtre növekedést serkentő hatással rendelkezik [D. Gospodarowicz et al., National Cancer Institute Monograph, 48, 109 (1978)]. Különösen a bFGFnek az angiogén faktora, a sejt növekedést serkentő hatásával együtt, azt sugallja, hogy traumák kezelésére alkalmas gyógyszerekben felhasználható lehet, valamint megelőző és gyógyító hatóanyag lehet trombózis, arterioszklerózis stb. esetében.Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) is a basic polypeptide with a molecular weight of about 17,000 and is mainly excreted by the pituitary gland. BFGF was first isolated as a factor with potent growth promoting effects on fibroblasts, such as BALB / C3T3 cells [D. Gospodarowicz et al., Natura, 249, 123 (1974)]. It is known that FGF has growth promoting effects on almost all mesoblast-derived cells [D. Gospodarowicz et al., National Cancer Institute Monograph, 48, 109 (1978)]. In particular, the angiogenic factor of bFGF, together with its cell growth stimulating effect, suggests that it may be used in drugs for the treatment of trauma, and may be a preventive and curative agent for thrombosis, arteriosclerosis, and the like. In the case.
A hbFGF-et kódoló géneket Abraham és munkatársai [The EMBO Journal, 5, 2523-2528 (1986)], valamint Kurokawa és munkatársai [FEBS Letters, 213. 189-194 (1987)] klónozták és expresszálták állati sejtekben [FEBS Letters, 213. 189-194 (1987)], élesztőben [The Journal of Biological Chemistry, 263. 16471-16478 (1988)] és Escherichia coliban [The Journal of Biological Chemistry, 263. 16279-16302 (1988)]. Ezek termelési szintje azonban nem mindig elegendő és a kapott minták nagyon instabilak ahhoz, hogy gyógyszerként használjuk őket. Különböző,The genes encoding hbFGF were cloned and expressed in animal cells by Abraham et al. (1986) The EMBO Journal 5: 2523-2528 and Kurokawa et al. (FEBS Letters 213: 189-194 (1987)). 213: 189-194 (1987)], in yeast (The Journal of Biological Chemistry, 263: 16471-16478 (1988)), and in Escherichia coli (The Journal of Biological Chemistry, 263: 16279-16302 (1988)). However, their production levels are not always sufficient and the resulting samples are very unstable to be used as a medicine. Different,
- 3 az instabilitás megoldását célzó vizsgálatok eredményeképpen kiderült, hogy azok az anyagok, amelyekben a hbFGF molekulák cisztein csoportjait szerin csoportokkal helyettesítik, azok sokkal stabilabbak, és ugyanolyan biológiai aktivitással rendelkeznek [Biochemical and Biophysical Research Communications, 151. 701-708 (1988)].3 studies of instability have shown that substances in which the cysteine moieties of hbFGF molecules are replaced by serine moieties are more stable and have the same biological activity (Biochemical and Biophysical Research Communications, 1988, 151, 701-708). .
Továbbá eljárást fejlesztettek ki olyan muteinek előállítására, amelyekben a hbFGF-nek legalább egy aminosavát génsebészeti módszerekkel más aminosavra cserélték ki [281 822 számú európai szabadalmi leírás].In addition, a method has been developed for the production of muteins in which at least one amino acid of hbFGF has been replaced by genetic engineering methods (EP 281 822).
Ha a rekombináns fehérjéket Escherichia colival állítjuk elő, akkor gyakran vízben oldhatatlan zárványok, úgynevezett zárványtestek-k jönnek létre, amelyekben a fehérjék akkumulálódnak. Ha a keresett anyagokat ilyen zárványokból izoláljuk, akkor a zárványokat általában fehérje denaturáló anyagok hozzáadásával visszük oldatba. Ami azonban a hbFGF muteineket illeti, az így oldatba vitt fehérjék inaktívak, és reaktiválásukra még nem dolgoztak ki technikát.When recombinant proteins are produced with Escherichia coli, often water-insoluble inclusion bodies, called inclusion bodies, are formed, in which the proteins accumulate. When the desired substances are isolated from such inclusions, the inclusions are generally resolved by addition of protein denaturing agents. However, as far as hbFGF muteins are concerned, the proteins thus solubilized are inactive and no technique has yet been developed for their reactivation.
A hbFGF muteineket gyógyszerként alkalmazhatjuk, ha a muteinek génsebészeti módszerek alkalmazása következtében nagy mennyiségben, aktív állapotban halmozódnak fel, és további izolálásuk és tisztításuk nagyon jó kitermeléssel megy. Ezért nagyon fontos olyan módszerek kidolgozása, amelyek a muteineket nagy frekvenciával termelik.HbFGF muteins can be used as medicaments if the muteins accumulate in large amounts in an active state as a result of genetic engineering techniques and are further isolated and purified in very good yields. Therefore, it is very important to develop methods that produce high frequency muteins.
Általában, ha a géntermékeket nagy mennyiségben termelik génsebészeti technikákkal, akkor a gazda-vektor rendszerek valamint a promoterek megválasztása nagyon fontos, és az egyes génektől függ. A hbFGF muteinek hatékony expressziójára ···· kidolgozott különböző expressziós rendszerek vizsgálata felfedte, hogy egy olyan Escherichia coli expressziós rendszer, amely T7 promotert használ [F. W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189. 113-130 (1986)], egy kiváló expressziós rendszer a hbFGF muteinek expressziójához. A T7 promoter és a hbFGF muteinek kombinációja újszerű. Erről a T7 promoterről ismert, hogy egy erős promoter. Néhány esetben azonban, mint például az interleukin-2, prolaktin, zárványok keletkeznek, és a legtöbb inaktív állapotban akkumulálódik. A jelen találmány szerzői írták le az interleukin-2 esetét, míg a prolaktin esetét Paris, N. és munkatársai írták le [Paris, N. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12., 436-449 (1990)].Generally, when large quantities of gene products are produced by genetic engineering techniques, the choice of host-vector systems and promoters is very important and depends on the individual genes. Examination of various expression systems for efficient expression of hbFGF muteins ···· revealed that an Escherichia coli expression system using the T7 promoter [F. W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189: 113-130 (1986)], is an excellent expression system for the expression of hbFGF muteins. The combination of the T7 promoter and hbFGF muteins is novel. This T7 promoter is known to be a strong promoter. However, in some cases, such as interleukin-2, prolactin, inclusions occur and accumulate in most inactive states. The authors of the present invention have described the case of interleukin-2, while the case of prolactin has been described by Paris, N., et al., 1990, Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 436-449.
A jelen találmány szerzői intenzív vizsgálatokat végeztek abból a célból, hogy a hbFGF muteinből nagy mennyiséget halmozzanak fel aktív állapotban, és azt találták, hogy izopropil-tio-galaktopiranozid kis mennyiségben való adagolása hatásos. A jelen találmány szerzői emellett módszert dolgoztak ki a hbFGF mutein hatékony izolálására és tisztítására, ezzel téve teljessé a jelen találmányt.The present inventors have conducted intensive studies to accumulate large amounts of hbFGF mutein in the active state and have found that administration of small amounts of isopropylthio-galactopyranoside is effective. The present inventors have further developed a method for efficiently isolating and purifying the hbFGF mutein, thereby completing the present invention.
A jelen találmány tárgya tehát:The present invention thus relates to:
(1) olyan muteint kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó vektor, amelyben az érett humán bázikus fibroblaszt növekedési faktor (hbFGF)-nak legalább egy aminosavát egy másik aminosawal helyettesítjük, és egy T7 promoter található előtte;(1) a vector comprising a nucleotide sequence encoding a mutein in which at least one amino acid of the mature human basic fibroblast growth factor (hbFGF) is replaced by another amino acid and is preceded by a T7 promoter;
(2) az (1) pontban leírt vektorral transzformált transzformáns;(2) a transformant transformed with the vector described in (1);
(3) a (2) pontban leírt transzformáns, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli gazdaszervezetben egy T7 RNS polimeráz • ·· ··· · ·· · • »·»«*» · , ·· · ·· ··· · · ·(3) the transformant described in (2), characterized in that a T7 RNA polymerase is present in the host Escherichia coli. · · ·
- 5 gén található egy lac promoter után beépítve;- 5 genes inserted after a lac promoter;
(4) eljárás olyan mutein előállítására, amelyben az érett hbFGF-nek legalább egyik aminosavát egy másik aminosavval helyettesítjük, azzal jellemezve, hogy a (2) pontban ismertetett transzformánst táptalajban tenyésztjük;(4) a method for producing a mutein in which at least one amino acid of the mature hbFGF is replaced by another amino acid, wherein the transformant described in (2) is cultured in culture medium;
(5) a (4) pontban ismertetett módszer, azzal jellemezve, hogy körülbelül 3-500 μπιοΐ/l izopropil-tio-galaktopiranozidot (a továbbiakban csak röviden IPTG néven említjük) adunk a (3) pontban leírt transzformáns logaritmikus növekedési fázisban levő tenyészetéhez, majd így tenyésztjük tovább, és (6) az (5) pontban ismertetett módszer, azzal jellemezve, hogy a keletkező mutein-tartalmú oldatot egy térhálós poliszacharid-szulfátot (ioncserélő csoportként szulfonsavat tartalmazó szintetikus polimer) alkalmazó kromatográfiával és egy hordozóként szintetikus polimert alkalmazó gélszűréssel tisztítjuk.(5) the method described in (4), characterized in that about 3-500 μπιοΐ / l isopropylthio-galactopyranoside (hereinafter briefly referred to as IPTG) is added to the culture of the transformant in the logarithmic growth phase described in (3), and (6) the method described in (5), characterized in that the resulting mutein-containing solution is purified by chromatography on a cross-linked polysaccharide sulfate (a synthetic polymer containing sulfonic acid as ion-exchange group) and a synthetic polymer using a support as a support. .
A jelen találmány szerint az érett hbFGF-eknek a szubsztitúciós típusú muteinjeit lehet hatékonyan előállítani. A jelen találmány tehát előnyösen alkalmazható a muteinek ipari méretben való előállítására.According to the present invention, substitution-type muteins of mature hbFGFs can be efficiently produced. Thus, the present invention is advantageously applicable to the production of muteins on an industrial scale.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.The figures are briefly described below.
Az 1. ábrán az 1. példában használt CS23 rhbFGF muteinFigure 1 is a CS23 rhbFGF mutein used in Example 1
DNS nukleotid szekvenciáját látjuk, valamint a nukleotid szekvencia által kódolt fehérje aminosav szekvenciáját.The nucleotide sequence of the DNA as well as the amino acid sequence of the protein encoded by the nucleotide sequence are shown.
A 2. ábrán az 1. példában használt pTB960 plazmid készítését ismertető sematikus ábra látható.Figure 2 is a schematic diagram of the construction of plasmid pTB960 used in Example 1.
A 3. ábrán az 5. példában előállított tisztított mintaFigure 3 is a purified sample prepared in Example 5
SDS-PAGE mintázatát és egy markert láthatunk.An SDS-PAGE pattern and a marker can be seen.
• · · · · · · ·*φ • · · φ • ·· · · · · · · • ······ · ·· · ·· ···• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·erateerate
- 6 Α 4-6. ábrákon az 5. példában előállított tisztított minta nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatának eredménye látható.- 6 Α 4-6. Figures 1 to 5 show the results of HPLC purification of the purified sample prepared in Example 5.
A 7-9. ábrákon a 8. példában előállított pHP901, pME901 és pCM901 plazmidok konstrukciójának sematikus vázlatát látjuk.7-9. Figures 1 to 8 show a schematic diagram of the construction of plasmids pHP901, pME901 and pCM901 produced in Example 8.
A jelen találmány szerinti érett hbFGF egy 146 aminosavat tartalmazó peptid, az N-terminális Met mögötti Pro aminosavat számítva elsőnek, és a C-terminálison levő Ser aminosavat számítva 146.-nak az 1. ábrán.The mature hbFGF of the present invention is a peptide containing 146 amino acids, with Pro as the first amino acid behind the N-terminal Met and 146 as the amino acid Ser at the C-terminus.
A jelen találmány szerinti hbFGF muteinek közé olyan muteinek tartoznak, amelyekben az érett hbFGF-nek legalább egy aminosavát egy másik aminosawal helyettesítjük [281 922 számú európai közrebocsátási irat; Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701-708 (1988)].The hbFGF muteins of the present invention include muteins in which at least one amino acid of the mature hbFGF is replaced by another amino acid (EP 281,922; Biochemical and Biophysical Research Communications, 151: 701-708 (1988)].
Az, hogy a szubsztitúció előtt hány hbFGF-et képező aminosavnak kell lennie a muteinben, amelyben a hbFGF-et képező aminosavak közül legalább egyet más aminosawal helyettesítünk, az nem lényeges, csak az a feltétel, hogy az FGF jellemzői, azaz az angiogenezis, a sejtnövekedést serkentő és a sejtek differenciálódását serkentő hatás ne vesszen el.The number of hbFGF-forming amino acids in the mutein in which at least one of the hbFGF-forming amino acids is replaced is immaterial, provided that the characteristics of FGF, i.e., angiogenesis, cell growth stimulating and cell differentiation stimulating effects should not be lost.
A helyettesítendő aminosavak közé tartozik például a cisztein, valamint minden, ciszteintől eltérő aminosav. Azonban a cisztein az előnyös. A ciszteintől eltérő aminosavak közé tartozik például az aszparaginsav, arginin, glicin és valin.The amino acids to be replaced include, for example, cysteine as well as any non-cysteine amino acid. However, cysteine is preferred. Non-cysteine amino acids include, for example, aspartic acid, arginine, glycine and valine.
Ha ciszteint helyettesítünk, akkor helyettesítő aminosavként semleges aminosavak az előnyösek. A semleges aminosavakra jellemző példa lehet a glicin, valin, alanin, leucin, izoleucin, tirozin, fenilalanin, hisztidin, triptofán, • · · 4 · • · • · · • 4 « · szerin, treonin és metionin. De főleg a szerin és a treonin előnyös.When cysteine is substituted, neutral amino acids are preferred as the replacement amino acid. Examples of neutral amino acids include glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, tryptophan, serine, threonine and methionine. But especially serine and threonine are preferred.
Ha a helyettesítendő aminosav nem cisztein, akkor a helyettesítendő aminosavat másképpen választjuk ki, például a helyettesítendő aminosavtól eltérő hidrofilitású, hidrofobicitású vagy elektromos töltésű aminosav. Specifikusan, ha a helyettesítendő aminosav aszparaginsav, akkor a helyettesítendő aminosav lehet aszparagin, treonin, valin, fenilalanin és arginin. Főleg az aszparagin és az arginin előnyös.If the amino acid to be substituted is not a cysteine, the amino acid to be substituted is selected in a different manner, for example, a hydrophilic, hydrophobic, or electrically charged amino acid other than the amino acid to be replaced. Specifically, if the amino acid to be substituted is aspartic acid, the amino acid to be substituted is asparagine, threonine, valine, phenylalanine and arginine. Especially asparagine and arginine are preferred.
Ha a helyettesítendő aminosav arginin, akkor a helyettesítő aminosav lehet glutamin, treonin, leucin, fenilalanin és aszparaginsav. Főleg a glutamin előnyös.When the amino acid to be substituted is arginine, the amino acid substitutent may be glutamine, threonine, leucine, phenylalanine and aspartic acid. Glutamine is particularly preferred.
Ha a helyettesítendő aminosav glicin, akkor a helyettesítő aminosav lehet treonin, leucin, fenilalanin, szerin, glutaminsav és arginin. Főleg a treonin előnyös.When the amino acid to be substituted is glycine, the replacement amino acid may be threonine, leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid and arginine. Threonine is particularly preferred.
Ha a helyettesítendő aminosav szerin, akkor a helyettesítő aminosav lehet metionin, alanin, leucin, cisztein, glutamin, arginin és aszparaginsav. Főleg a metionin előnyös.When the amino acid to be substituted is serine, the replacement amino acid may be methionine, alanine, leucine, cysteine, glutamine, arginine and aspartic acid. Especially methionine is preferred.
Ha a helyettesítendő aminosav valin, akkor a helyettesítő aminosav lehet szerin, leucin, prolin, glicin, lizin és aszparaginsav. Főleg a szerin előnyös.When the amino acid to be substituted is valine, the replacement amino acid may be serine, leucine, proline, glycine, lysine and aspartic acid. Serine is particularly preferred.
Helyettesítendő aminosav előnyösen az aszparaginsav, az arginin, a glicin, a szerint és a valin.Preferred amino acids to be substituted are aspartic acid, arginine, glycine, a and valine.
Helyettesítő aminosav előnyösen az aszparagin, glutamin, arginin, treonin, metionin, szerin és leucin.Preferred replacement amino acids are asparagine, glutamine, arginine, threonine, methionine, serine and leucine.
Azok a legelőnyösebb helyettesített muteinek, amelyekben a cisztein aminosavat helyettesítjük szerinnel.Most preferred are substituted muteins in which the cysteine amino acid is replaced by serine.
• · « • · · ··· • · ···· · · , ·· · ·· ·«· ·· ·• · «• · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
- 8 A fenti helyettesítés során legalább két aminosav helyettesítését is elvégezhetjük egyszerre. Az különösen előnyös, ha két vagy több aminosavat helyettesítünkIn the above substitution, at least two amino acids may be substituted simultaneously. It is particularly preferred that two or more amino acids are substituted
A jelen találmány szerinti előnyös hbFGF muteinek közé tartoznak azok a muteinek, amelyekben az érett hbFGF muteinnek legalább cisztein csoportját szerin csoporttal helyettesítjük.Preferred hbFGF muteins of the present invention include those in which at least a cysteine moiety of the mature hbFGF mutein is replaced by a serine moiety.
A muteinek közül különösen a CS23 rekombináns hbFGF mutein (a továbbiakban csak röviden GS23 rhbFGF mutein néven említjük) előnyös, amelyben az érett hbFGF mutein 69-es és 87-es pozíciójában levő cisztein csoportokat cseréljük ki szerin csoportokkal. A fent említett hbFGF aminosavai meg vannak számozva, az egyes számot az 1. ábrán látható szekvencia alapján az N-terminális Met után következő Pro kapja.Of the muteins, particularly the CS23 recombinant hbFGF mutein (hereinafter only briefly referred to as GS23 rhbFGF mutein) is preferred, wherein the cysteine residues at positions 69 and 87 of the mature hbFGF mutein are replaced by serine residues. The amino acids of the aforementioned hbFGF are numbered, each number being assigned to the Pro following the N-terminal Met according to the sequence shown in Figure 1.
A muteinek előállítása céljából helyspecifikus mutagenezist végzünk. Ez a technika jól ismert, például R.F. Lather és J.P. Lecoq írták le [Genetic Engineering, 31-50, Academic Press (1983)]. Az oligonukleotid mutagenezist M. Smith és S. Gillam írják le [Genetic Engineering: Principles and Methods, 3, 1-32, Plenum Press (1981)].Site-specific mutagenesis is performed to produce muteins. This technique is well known, e.g., R.F. Lather and J.P. Lecoq (Genetic Engineering, 31-50, Academic Press (1983)). Oligonucleotide mutagenesis is described by M. Smith and S. Gillam (Genetic Engineering, Principles and Methods, 3, 1-32, Plenum Press, 1981).
A muteint kódoló struktúrgén előállítását például az alábbiak szerint végezzük:For example, the construction of a mutein-encoding structural gene is carried out as follows:
(a) a hbFGF struktúrgénjének egyik szálát tartalmazó egyszálú DNS-t egy mutagén oligonukleotid indító molekulával hibridizálunk (a fenti indító molekula komplementer ahhoz a régióhoz, amely a helyettesítendő ciszteint kódolja, vagy egy antisens triplettet tartalmaz, amely bizonyos esetekben párt képez ezzel a kodonnal, azzal a feltétellel, hogy ez nem okoz paritási problémákat más aminosavak kodonjaival, vagy néhány ··«♦ · • ··· • ·· · «· ν «· ;(a) hybridizing the single-stranded DNA comprising one strand of the structural gene of hbFGF with a mutagenic oligonucleotide primer (said primer complementary to the region encoding the cysteine to be replaced or containing an antisense triplet which in some cases forms a pair with this codon, provided that this does not cause problems parity with other amino acid codon, or a few ·· "♦ • · · · · · • ··« ν · «·;
* ······ « # •· · ·· ··· ···* ······ « # • · · · · · · · · · · ·
- 9 esetben az antisens triplettel), (b) az indító molekulát DNS polimerázzal meghosszabítjuk, így kapunk egy mutáns heteroduplexet, és (c) ezt a mutáns heteroduplexet replikáltatjuk.(In 9 cases the antisense triplet), (b) extending the primer molecule by DNA polymerase to obtain a mutant heteroduplex, and (c) replicating this mutant heteroduplex.
Ezután a mutagenizált gén átviteléhez fág DNS-t izolálunk, és plazmidba építjük.Phage DNA is then isolated and inserted into a plasmid to transfer the mutagenized gene.
Ami a jelen találmány során alkalmazott T7 promotert illeti, a T7 DNS-en felfedezett 17 féle promoter közül bármelyik alkalmazható [J.L. Oakley, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 4266-4270 (1977) ; D. Rosa, Cell, 16, 815-825 (1979); N. Panayotatos et al., Natúré, 280, 35 (1979); J.J. Dunn et al., Journal of Molecular Biology, 166, 477-535 (1983), de egy FI10 fág promoter is [Rosenberg et al., Gene, 56, 125-135 (1987)] előnyösen alkalmazható.As for the T7 promoter used in the present invention, any of the 17 types of promoters discovered on T7 DNA can be used [J.L. Oakley, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 4266-4270 (1977); D. Rosa, Cell, 16, 815-825 (1979); Panayotatos N. et al. (1979) 280: 35; J.J. Dunn et al., Journal of Molecular Biology, 166, 477-535 (1983), but also a phage FI10 promoter (Rosenberg et al., Gene 56, 125-135 (1987)) is preferred.
A jelen találmányban transzkripciós terminátorként bármely terminátor alkalmazható, feltéve, hogy Escherichia coli rendszerekben működőképes, de egy T FI terminátor [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189. 113-130 (1986)] is előnyösen használható.Any terminator may be used as a transcriptional terminator in the present invention, provided it is functional in Escherichia coli systems but is a T1 terminator [F.W. Studier et al., 1986, Journal of Molecular Biology 189: 113-130].
A jelen találmány alkalmazása során használt T7 RNS polimeráz gének közé tartozik a T7 gén [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189, 113-130 (1986)].T7 RNA polymerase genes used in the practice of the present invention include the T7 gene [F.W. Studier et al., 1986, Journal of Molecular Biology, 189, 113-130.
A jelen találmány alkalmazása során az alábbi vektorokat használjuk: pBR322, pUC8, pUC9, pMB9, pKC7, pACYC177 és pKN410.The vectors used in the practice of the present invention are pBR322, pUC8, pUC9, pMB9, pKC7, pACYC177 and pKN410.
A jelen találmány alkalmazásához a vektorokat úgy állítjuk elő, hogy a fenti vektorokba a T7 promotert és T7 terminátort építjük be. Ilyen vektorok például a pET-1, pET-2, pET-3, pET-4 és pET-5 [Rosenberg et al., Gene, 56, 125-135 ·♦·· «For use in the present invention, the vectors are prepared by incorporating the T7 promoter and T7 terminator into the above vectors. Examples of such vectors are pET-1, pET-2, pET-3, pET-4 and pET-5 [Rosenberg et al., Gene, 56, 125-135.
- 10 (1987)], de a pET-3C is előnyösen alkalmazható [Rosenberg et al., Gene, 56, 125-135 (1987)].10 (1987)], but pET-3C may also be used (Rosenberg et al., Gene 56: 125-135 (1987)).
A jelen találmány megvalósítása során a transzformánsok előállításához gazdaszervezetként bármely olyan Escherichia coli törzs használható, amelybe a T7 RNS polimeráz gén (T7 1-es gén) be van építve [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189, 113-130 (1986)], például az MM294, DH-1, C600 és BL21. Az MM294 és BL21 törzseket használhatjuk előzetesen, amelyekben egy lambda fág, vele egy T7 1-es gén lizogenizálva található. A T7 RNS polimeráz gén is könnyen kinyerhető, mivel a plazmid az expressziós vektorétól eltérő replikációs origóval rendelkezik. Ebben az esetben, a T7 1-es gén esetében, a lac promotert használjuk, amelynek expresszióját izopropil-tiogalaktoziddal (IPTG) indukáljuk.In the practice of the present invention, any Escherichia coli strain incorporating the T7 RNA polymerase gene (T7 gene 1) can be used as a host for the production of transformants [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189, 113-130 (1986)] such as MM294, DH-1, C600 and BL21. MM294 and BL21 strains, in which a lambda phage, with which a T7 1 gene is lysogenized, may be used in advance. The T7 RNA polymerase gene can also be readily recovered because the plasmid has an origin of replication other than its expression vector. In this case, for the T7 gene 1, the lac promoter is used, the expression of which is induced by isopropylthiogalactoside (IPTG).
A jelen találmány során használt transzformánsokat úgy állítjuk elő, hogy azokat az Escherichia coli törzseket transzformáljuk, amelyekbe az említett T7 1-es gén (RNS polimeráz gén) bele van építve, azokkal a plazmidokkal együtt, amelyek a T7 promoter expressziójához gén-transzkripciós terminátort tartalmaznak, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel, például amelyeket a Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 69, 2110 (1972); valamint a Gene, 17. 107 (1982) publikációkban ismertettek. Ebben az esetben a használandó gazdaszervezeteket előzetesen transzformálják a T7 lizozim gént tartalmazó plazmidokkal, tehát a keletkező transzformánsokban egyszerre két különböző plazmid található.The transformants used in the present invention are prepared by transforming strains of Escherichia coli into which said T7 1 gene (RNA polymerase gene) is incorporated, together with plasmids containing a gene transcription terminator for expression of the T7 promoter. , by methods known to those skilled in the art, such as those described in Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 69, 2110 (1972); and Gene, 17, 107 (1982). In this case, the host to be used is pre-transformed with plasmids containing the T7 lysozyme gene, so that the resulting transformants contain simultaneously two different plasmids.
Ha a transzformánsokat tenyésztjük, akkor a tenyésztés « · «If the transformants are cultivated, then the cultivation is · · «
- n céljára a folyadék táptalajok különösen alkalmasak. A táptalaj szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen vegyületeket és más, a transzformánsok növekedéséhez nélkülözhetetlen anyagokat tartalmaz. A szénforrás lehet például glükóz, dextrin, oldható keményítő és szacharóz. A nitrogénforrás lehet szervetlen vagy szerves anyag, például ammóniumsók, nitrátok, kukoricalekvár, pepton, kazein, kazaminosav, húskivonat, szójaliszt és burgonya kivonat oldata. A szervetlen vegyület lehet kalcium-klorid, nátrium-dihidrogén-foszfát és magnézium-klorid. Emellett élesztőkivonatot, vitaminokat, növekedést serkentő faktorokat és hasonlókat lehet a táptalajhoz adni.Liquid media are particularly suitable for n. The medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic compounds and other substances essential for the growth of transformants. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch and sucrose. The nitrogen source may be a solution of an inorganic or organic material, such as ammonium salts, nitrates, corn jam, peptone, casein, caseinic acid, meat extract, soybean meal and potato extract. The inorganic compound may be calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth-promoting factors and the like can be added to the medium.
A táptalaj pH-ja előnyösen 6 és 8 között van.The pH of the medium is preferably between 6 and 8.
Az Escherichia coli transzformánsok tenyésztéséhez használható táptalaj előnyösen az M9 táptalaj [Miller, Journal of Experiments in^Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring »The medium for culturing Escherichia coli transformants is preferably M9 medium (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring).
Harbor Laboratory, New York (1972)], glükózzal és kazaminosavakkal kiegészítve. Ehhez a táptalajhoz még vas ionokat is lehet adni. A vasionok forrásai olyan anyagok, amelyek oldatban vas ionokra disszociálnak, vagy vas formában felhasználható anyagok. Ilyen anyagok például a vas sók, előnyösen szervetlen ferro vagy ferri sók, például a vas(II)klorid, vas(III)-klorid, vas(II)-szulfát, vas(III)-szulfát, vas(III)-foszfát és vas(III)-nitrát. A vasion-forrást 10“^-10“4 mol/1 koncentrációban alkalmazzuk, előnyösen körülbelül 5X10-65xl0~5 mol/1 koncentrációban. A tenyésztést általában 15-43°C között végezzük, körülbelül 3-72 óra hosszat, előnyösen körülbelül 12-48 óra hosszat, ha szükséges, akkor levegőztetés vagy kevertetés közben.Harbor Laboratory, New York (1972)], supplemented with glucose and casino acids. Even iron ions can be added to this medium. Sources of iron ions are substances that dissociate into iron ions in solution, or substances that can be used in iron form. Such materials are, for example, iron salts, preferably inorganic ferro or ferric salts, such as iron (II) chloride, iron (III) chloride, iron (II) sulfate, iron (III) sulfate, iron (III) phosphate and the like. iron (III) nitrate. The iron ion source is used at a concentration of 10 µm to 10 µm 4 mol / l, preferably at a concentration of about 5 x 10 -6 to 5 x 10 ~ 5 mol / l. The culturing is generally carried out at 15-43 ° C for about 3-72 hours, preferably about 12-48 hours, if necessary with aeration or stirring.
A gén expressziójához előnyös ha a tenyésztés során IPTG-t adunk a rendszerhez. Ezáltal a lac promoter mögé ligáit T7 1-es gén (RNS polimeráz gén) expresszálódik, és az így keletkező T7 RNS polimeráz specifikusan felismeri a T7 promotert. A szakirodalom szerint az IPTG-t 0,1-20 mmol/1 koncentrációban adjuk a rendszerhez, előnyösen 1-2 mmol/1 mennyiségben, a lac promoter expresszálása céljából [egészen 1 mmol/1 IPTG-ig, Lobner-Olesen et al., Cell, 57, 881-889 (1989); 2 mmol/1 IPTG: Ernst H. et al., Gene.68, 345-355 (1988); 20 mmol/1 IPTG: Luck, D. N. et al., DNA, 5, 21-28 (1986)]. Azonban felfedezték, hogy az ilyen mennyiségű IPTG hozzáadásával indukált expresszió során akkumulálódó fehérjék zárványokat képeznek, és ez gyakran inaktív fehérjék felhalmozódását eredményezi. Az oldott állapotban való felhalmozódás céljából végzett különböző vizsgálatok eredményei alapján azt fedezték fel, hogy a célt úgy lehet elérni, hogy ha először 3-500 μιηοΐ/ΐ, előnyösen körülbelül 3-300 μιηοΐ/l-t, még előnyösebben 6-200 μιηοΐ/l-t, és legelőnyösebben 6-80 μπιοί/ΐ- IPTG-t adunk a rendszerhez a tenyésztés során. Ha nagy térfogatban, például tartályban tenyésztünk, akkor előnyös ha az IPTG-t 10-500 mol/1, előnyösebben 10-20θ|μιηο1/1, legelőnyösebben 10-80 μιηοΐ/ΐ mennyiségben adjuk a rendszerhez. Ha kis mennyiségben végezzük a tenyésztést, például lombikban, akkor az IPTG-t előnyösen 3-100 μπιο1/1, még előnyösebben 6-80 μιηοΐ/ΐ mennyiségben alkalmazzuk. Az IPTG-t először az 1-24. órában, előnyösen a tenyésztés megkezdése utáni 3-12. órában adjuk a tenyészethez, és az az előnyös, ha a logaritmikus növekedési fázisban használjuk. Az IPTG-t megszakításokkal vagy folyamatosan adagolhatjuk, szükségIt is advantageous to add IPTG to the system for expression of the gene. Thus, the T7 gene (RNA polymerase gene) ligated behind the lac promoter is expressed and the resulting T7 RNA polymerase specifically recognizes the T7 promoter. In the literature, IPTG is added at a concentration of 0.1 to 20 mM, preferably 1 to 2 mM, to express the lac promoter (up to 1 mM IPTG, Lobner-Olesen et al. Cell, 57: 881-889 (1989); 2 mM IPTG: Ernst H. et al., Gene.68, 345-355 (1988); 20 mM IPTG: Luck, D.N. et al., DNA, 5, 21-28 (1986)]. However, it has been discovered that proteins accumulated during expression induced by the addition of this amount of IPTG form inclusions and often result in the accumulation of inactive proteins. Based on the results of various studies on the accumulation in the dissolved state, it has been discovered that the goal can be achieved by first starting with 3-500 μιηοΐ / ΐ, preferably about 3-300 μιηοΐ / lt, more preferably 6-200 μιηοΐ / lt, and most preferably 6-80 μπιοί / ΐ- IPTG is added to the system during culture. When cultured in a high volume, such as a tank, it is preferable to add the IPTG to the system in an amount of 10-500 mol / l, more preferably 10-20θ | μιηο1 / 1, most preferably 10-80 μιηοΐ / ΐ. When cultivating in small amounts, for example in flasks, the IPTG is preferably used in an amount of 3-100 μπιο1 / 1, more preferably 6-80 μιιοΐ / ΐ. IPTG is first described in Figures 1-24. hours, preferably 3 to 12 hours after commencement of culture. hours, and is preferably used in the logarithmic growth phase. The IPTG can be administered intermittently or continuously as needed
szerint. Az IPTG-t tartalmazó táptalajokat 20-42°C-on, előnyösen 20-30°C-on inkubáljuk. Az izopropil-tio-galaktopiranozid helyett néhány esetben például propil-tio-galaktopiranozidot, metil-tiogalaktopiranozidot, butil-tio-galaktopiranozidot és ciklohexiltio-galaktopiranozidot használhatunk.According to. Media containing IPTG are incubated at 20-42 ° C, preferably 20-30 ° C. In some cases, for example, propylthio-galactopyranoside, methylthiogalactopyranoside, butylthio-galactopyranoside and cyclohexylthio-galactopyranoside may be used instead of isopropylthio-galactopyranoside.
A jelen találmány szerinti hbFGF muteineket a fentiek szerint előállított tenyészetekből izolálhatjuk és tisztíthatjuk, például az alábbi módszerek szerint.The hbFGF muteins of the present invention can be isolated and purified from the cultures prepared as described above, for example, by the following methods.
Amikor a jelen találmány szerinti hbFGF muteineket a tenyésztett sejtekből extraháljuk, akkor a sejteket a tenyésztés után a szakterületen jártas szakember számára ismerős módszerekkel, például centrifugálással nyerjük ki. A kinyert sejteket ezután üveggyöngyökkel, French-press-szel, lizozimes kezeléssel és/vagy a fagyasztás-olvasztás módszerével nyerhetjük ki. Pontosabban, az üveggyöngyökkel való feltárás az előnyös.When the hbFGF muteins of the present invention are extracted from cultured cells, the cells are cultured after culture by methods known to those skilled in the art, such as centrifugation. The recovered cells can then be recovered by glass beads, French-press, lysozyme treatment and / or freeze-thawing. More particularly, digestion with glass beads is advantageous.
A jelen találmány szerinti muteineknek a felülúszóból való tisztítására szolgáló különböző módszereket tanulmányoztuk. Ennek eredményeképpen nagytisztaságú mintákat nyertünk nagy mennyiségben, olymódon hogy legalább egyszer kombináltuk egymással az affinitás kromatográfiát, hordozóként térhálósított poliszacharid-szulfátot használva, az ioncserélő kromatográfiát, amelyben a hordozó szulfonsav csoportot tartalmazó szintetikus polimer, és a gélszűrést, amelyben a hordozó egy szintetikus polimer.Various methods for purifying the muteins of the present invention from the supernatant have been studied. As a result, high purity samples were obtained in large quantities by combining at least once with affinity chromatography using crosslinked polysaccharide sulfate as carrier, ion exchange chromatography in which the carrier is a synthetic polymer containing a sulfonic acid moiety, and the carrier being a synthetic polymer.
A jelen találmányban alkalmazott térhálósított poliszacharid-szulfátok lehetnek térhálósított cellulózszulfátok, térhálósított agaróz-szulfátok és térhálósított dextrán-szulfátok.The crosslinked polysaccharide sulfates used in the present invention include crosslinked cellulose sulfates, crosslinked agarose sulfates, and crosslinked dextran sulfates.
A fenti cellulóz egy olyan poliszacharid, amely β-1,4 kötésekkel összekapcsolt glükóz molekulákból áll, molekulasúlya előnyösen 50 000 és 2 000 000 között van. Az egyes anyagok lehetnek például az Avicel (kristályos cellulóz, Asahi Chemical Industry, Japán) vagy a Cellulofine (Chisso Corporation, Japán).The above cellulose is a polysaccharide consisting of glucose molecules linked by β-1,4 bonds, preferably having a molecular weight of between 50,000 and 2,000,000. The individual materials may be, for example, Avicel (crystalline cellulose, Asahi Chemical Industry, Japan) or Cellulofine (Chisso Corporation, Japan).
Az előzőkben említett agaróz egy poliszacharid, ami az agar fő komponense, és amelyben a D-galaktozil-(β1-4)-3,6anhidro-L-galaktozil-(al-3). Molekulasúlya előnyösen körülbelül 10 000 és 5 000 000 között van. Az egyes anyag lehet a Sepharose 2B, Sepharose 6B (Pharmacia, Svédország).The aforementioned agarose is a polysaccharide which is a major component of agar and in which D-galactosyl- (β 1-4) -3,6-anhydro-L-galactosyl- (al-3). Preferably, the molecular weight is between about 10,000 and 5,000,000. The individual material may be Sepharose 2B, Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden).
Az előzőkben említett dextrán egy D-glükóz polimer, amely főleg a(1-6) kötéseket tartalmaz, és mikroorganizmusok, például Leuconostoc mesenteroides hatására alakul ki glükózból. Molekulasúlya előnyösen 1 000 és 40 000 000 között változhat.The dextran mentioned above is a D-glucose polymer which contains predominantly the bonds (1-6) and is formed from glucose by microorganisms such as Leuconostoc mesenteroides. Preferably, its molecular weight ranges from 1,000 to 40,000,000.
A jelen találmányban használt térhálósított poliszacharid szulfátokat térhálósított poliszacharidokból, például az előzőkben említett dextránból, agarózból és cellulózból állítjuk elő, olymódon hogy ismert térhálósító anyagokkal, például 2,3-dibróm-propanollal kezeljük a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerrel.The crosslinked polysaccharide sulfates used in the present invention are prepared from crosslinked polysaccharides, such as dextran, agarose and cellulose, as described above, by treatment with known crosslinking agents, such as 2,3-dibromopropanol, known to those skilled in the art.
A térhálósított poliszacharidok kereskedelmi forgalomban vannak, beszerezhetők a Pharmacia-tól (Svédország), Sephadex G10, Sephadex G-15, Sephadex G-25, Sephadex G-50 és Sephadex G-100 (térhálósított dextrán), valamint Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B és Sepharose CL-6B (térhálósított agaróz) márkanevek alatt. A térhálósított cellulóz beszerezhető még a Chisso Corporation-tól (Japán) is, Cellulofine márkanéven (térhálósított cellulóz). A kívánatos térhálósítottCross-linked polysaccharides are commercially available from Pharmacia (Sweden), Sephadex G10, Sephadex G-15, Sephadex G-25, Sephadex G-50 and Sephadex G-100 (Cross-linked dextran), and Sepharose CL-2B, Sepharose Under the trade names CL-4B and Sepharose CL-6B (Cross-linked Agarose). Cross-linked cellulose is also available from Chisso Corporation (Japan) under the trade name Cellulofine (cross-linked cellulose). Desired cross-linked
- 15 poliszacharid-szulfátokat úgy állíthatjuk elő, hogy ismert szulfatáló ágenseket, például a klórszulfonsavat és kénsavanhidrid-észtereket reagáltatjuk ezekkel a térhálósított poliszacharidokkal.Polysaccharide sulfates can be prepared by reacting known sulfating agents such as chlorosulfonic acid and sulfuric anhydride esters with these crosslinked polysaccharides.
A térhálósított cellulóz szulfát lehet például a Seikagaku Kogyo (Japán) cég terméke, Sulfated Cellulofine (térhálósított cellulóz szulfát) márkanéven.Cross-linked cellulose sulfate can be, for example, sold by Seikagaku Kogyo (Japan) under the trade name Sulfated Cellulofine (cross-linked cellulose sulfate).
A térhálósított dextrán-szulfát lehet például szulfátéit Sephadex.The cross-linked dextran sulfate may be, for example, sulfated Sephadex.
A térhálósított agaróz-szulfát lehet például szulfátéit Sepharose.The crosslinked agarose sulfate may be, for example, sulfated Sepharose.
A jelen találmány során alkalmazott térhálósított poliszacharid-szulfátok a megfelelő sók formájában lehetnek. A sók lehetnek például nátrium-, kálium-, ammónium- és trimetilammónium-sók. Pontosabban, a nátrium-sók az előnyösek.The crosslinked polysaccharide sulfates used in the present invention may be in the form of the corresponding salts. Salts include, for example, sodium, potassium, ammonium and trimethylammonium salts. More specifically, the sodium salts are preferred.
A jelen találmány során alkalmazott térhálósított poliszacharid-szulfátok vízben oldhatatlanok, ennélfogva előnyös ha géles formában alkalmazzuk őket hidratálás után.The crosslinked polysaccharide sulfates used in the present invention are insoluble in water and are therefore preferably applied in a gel form after hydration.
A jelen találmány során a hbFGF muteinek tisztítására használt térhálósított poliszacharid-szulfátokat alkalmazó módszerek közé tartozik például az alábbiakban ismertetett aff initás-kromatográf ia.Methods utilizing cross-linked polysaccharide sulfates for purifying hbFGF muteins in the present invention include, for example, affinity chromatography as described below.
A hbFGF muteint tartalmazó vizes táptalajok a hbFGF muteineket tartalmazó oldatok. A vizes táptalajok közé tartozik például a víz, és a vizet tartalmazó táptalajok, pH-jukat előnyösen 3-10 közé állítjuk puffer-oldatokkal, például foszfátpuff errel, citrát-pufferrel és TRIS-HC1 pufferrel, hogy megelőzzük a hbFGF muteinek inaktiválódását.Aqueous media containing hbFGF mutein are solutions containing hbFGF muteins. Aqueous media include, for example, water, and aqueous media, and are preferably adjusted to pH 3 to 10 with buffer solutions such as phosphate buffer, citrate buffer and TRIS-HCl buffer to prevent inactivation of hbFGF muteins.
• ····,· · ’ ·· · ·· ......• · · · · · · · · · · · · · · ·
- 16 A hbFGF muteineket tartalmazó oldatok pH-ját ezután 5,09,0 közé állítjuk, majd desztillált vízzel igény szerint hígítjuk, hogy elektromos vezetőképességük körülbelül 15 milliohm vagy kevesebb legyen. Az így előállított hbFGF muteint tartalmazó oldatokat térhálósított poliszacharid-szulfát géllel hozzuk érintkezésbe. Erre a célra mind lombikos, mind oszlopos módszerek használhatók. Az oszlopos módszer azonban alkalmasabb, mivel egyszerűbb a művelet. Az oszlopos módszer esetében a térhálósított poliszacharid-szulfát gélt egy oszlopba töltjük, majd az oszlop egyensúlyba hozásához alaposan mossuk egy megfelelő pufferrel, például egy 50 mmol/l-es citrát pufferrel (pH=7,0), amely 0,4 mol/1 NaCl-t tartalmaz. A használt gél mennyisége függ a feltöltött hbFGF muteint tartalmazó oldat természetétől, de egy mg hbFGF muteinre 1-50 ml az előnyös.The pH of the solutions containing hbFGF muteins is then adjusted to 5.09.0 and diluted with distilled water as required to have an electrical conductivity of about 15 milliohm or less. The thus prepared solutions containing hbFGF mutein are contacted with a crosslinked polysaccharide sulfate gel. Both flask and column methods can be used for this purpose. However, the columnar method is more appropriate because it is simpler. In the column method, the crosslinked polysaccharide sulfate gel is loaded into a column and washed thoroughly with an appropriate buffer, such as 50 mM citrate buffer, pH 7.0, 0.4 M to equilibrate the column. Contains NaCl. The amount of gel used will depend on the nature of the solution containing the charged hbFGF mutein, but 1-50 ml per mg hbFGF mutein is preferred.
A fentiekben leírt hbFGF muteint tartalmazó oldatokat ezután az őszlopra| visszük. A felvitel sebessége körülbelül 0,15,0 térfogati sebesség között változik. A felvitel után az oszlopot alaposan mossuk, majd a pufferoldat ionerősségét szokványos módszerekkel megemeljük, hogy a hbFGF muteineket eluáljuk és kinyerjük. Az ionerősség növelése céljából sókat, például NaCl-t adunk az oldathoz, vagy magas koncentrációjú puffer oldatokat, olyan mennyiségben, hogy az elektromos vezetőképesség legalább körülbelül 15 milliohmra nőjön, előnyösen legalább 30 milliohmra. Az eluáláshoz mind batch, mind koncentráció gradiens elúciós módszereket használhatunk. Ha a koncentráció gradiens elúciós módszereket használjuk, akkor például az NaCl koncentrációját 0 mol/l-ről 2,0 mol/-re emeljük, és így hajtjuk végre az eluálást és a kinyerést. Ezáltal nagyon tisztított hbFGF muteineket lehet előállítani.The solutions containing the hbFGF mutein described above are then applied to the column applied. The application rate varies between about 0.15.0 vol. After loading, the column is washed extensively and the ionic strength of the buffer solution is increased by conventional means to elute and recover the hbFGF muteins. In order to increase the ionic strength, salts such as NaCl or high concentration buffer solutions are added in an amount such that the electrical conductivity increases to at least about 15 million, preferably at least about 30 million. Both batch and concentration gradient elution methods can be used for elution. When concentration gradient elution methods are used, for example, the NaCl concentration is increased from 0 mol / l to 2.0 mol / l to elute and recover. In this way highly purified hbFGF muteins can be produced.
A jelen találmány során alkalmazott, szulfonsavat tartalmazó szintetikus polimerek közé olyan polimerek tartoznak, amelyekben a szulfonsav csoportokat közvetlenül vagy közvetve bejuttatjuk a hidrofil vinil polimerekbe, sztirol-divinilbenzol polimerekbe, akrilamid polimerekbe és a hasonlókba. Részletesebben, SP (szulfopropil)-Toyopearl (Tosoh, Japán), amelynél a szulfonsav csoportokat hidrofil vinil polimerbe juttatjuk be, előnyösen használható a kinyerés és a műveletek szempontjából.Sulfonic acid-containing synthetic polymers used in the present invention include those in which the sulfonic acid groups are incorporated directly or indirectly into hydrophilic vinyl polymers, styrene-divinylbenzene polymers, acrylamide polymers and the like. More specifically, SP (sulfopropyl) -Toyopearl (Tosoh, Japan), wherein the sulfonic acid groups are introduced into a hydrophilic vinyl polymer, is advantageously used for recovery and operations.
A kromatografálás során a hbFGF muteineket tartalmazó részlegesen tisztított oldatoknak sókoncentrációját körülbelül 50 mmol/l-re vagy kisebbre állítjuk, például a foszfát puffer esetében, majd hagyjuk, hogy az előbb említett gyantára adszorbeálódjón, körülbelül 5-7 pH tartományban. Az adszorpcióhoz mind a batch mind az oszlop rendszer használható, de az oszlop rendszert a működtetés szempontjából előnyösebben használhatjuk. A gyantákról való elúciót a sókoncentráció növelésével hajtjuk végre. Az eluáláshoz mind batch, mind koncentráció gradiens módszerek használhatók. Ha a batch módszert használjuk, akkor puffer oldatot készítünk, olymódon hogy a fenti foszfát pufferhez NaCl-t adunk körülbelül 500 mmol/l-től 1 mol/l-ig terjedő koncentráció tartományban. A foszfát puffer helyett citrát puffer is használható. Az eluálást körülbelül l-25°c-on végezzük, előnyösen körülbelül l-10°C-on, még előnyösebben körülbelül 4°C-on.During chromatography, partially purified solutions of hbFGF muteins are adjusted to a salt concentration of about 50 mmol / l or less, for example in phosphate buffer, and then allowed to adsorb to the above resin at a pH of about 5-7. Both batch and column systems can be used for adsorption, but the column system may be more advantageous for operation. Elution from the resins is accomplished by increasing the salt concentration. Both batch and concentration gradient methods can be used for elution. If the batch method is used, a buffer solution is prepared by adding NaCl to the above phosphate buffer in a concentration range of about 500 mM to 1 M. Citrate buffer may be used instead of phosphate buffer. Elution is carried out at about 1 to about 25 ° C, preferably at about 1 to about 10 ° C, more preferably at about 4 ° C.
A jelen találmány során ha gélszűrésre használt szintetikus polimerek lehetnek vinil polimerek és akrilamid • · η • · · ··· * ····«· ·· · ··In the present invention, if the synthetic polymers used for gel filtration can be vinyl polymers and acrylamide.
- 18 polimerek. Részletesebben, a Toyopearl HW (Tosoh, Japán), a hidrofil vinil polimer előnyösen használható a gél tartóssága és a művelet szempontjából.- 18 polymers. More specifically, Toyopearl HW (Tosoh, Japan), a hydrophilic vinyl polymer, is advantageously used for gel durability and operation.
Ha a részlegesen tisztított hbFGF muteineket tartalmazó oldatokat kezeljük például egy Toyopearl HW-50F oszlopon, akkor puffer oldatokat, például foszfát puffért és citrát puffért használhatunk kifejlesztő oldatokként. Az azonban előnyös, ha 50 mmol/l-es citrát puffért használunk (pH=7,0). A kezelést körülbelül l-25°C-on előnyösen l-10°C-on, még előnyösebben körülbelül 4°C-on végezzük.When solutions containing partially purified hbFGF muteins are treated, for example, on a Toyopearl HW-50F column, buffer solutions such as phosphate buffer and citrate buffer can be used as development solutions. However, it is preferable to use 50 mM citrate buffer (pH 7.0). The treatment is carried out at about 1 to about 25 ° C, preferably at about 1 to about 10 ° C, more preferably about 4 ° C.
Az előzőkben leírt módszerek mellett más módszerek is használhatók a tisztítási eljárások során. Az ilyen módszerekben például természetes termékeket, úgymint cellulózt, agarózt és dextránt, valamint szervetlen anyagokat, úgymint üveggyöngyöket használhatunk az ioncserélő kromatográfia hordozóiként.In addition to the methods described above, other methods may be used in the purification process. Such methods include, for example, natural products such as cellulose, agarose and dextran, as well as inorganic materials such as glass beads as carriers for ion exchange chromatography.
A gélszűréshez hordozóként hasonlóképpen olyan géleket lehet használni, amelyek főleg természetes anyagokból állnak, például cellulózból, agarózból és dextrán gélekből, amelyek szervetlen anyagokon alapulnak, úgymint üveggyöngyökön.Similarly, gels comprising mainly natural materials such as cellulose, agarose and dextran gels based on inorganic materials such as glass beads may be used as carriers for gel filtration.
Az így kapott minták dializálhatók és liofilezhetők, így kapunk szárított porokat. Továbbá az megfelel, ha szérum albumint adunk a mintákhoz hordozóként tárolás céljából, amivel megakadályozható, hogy a minták a tartóedény oldalára adszorbeálódjanak.The samples thus obtained can be dialyzed and lyophilized to give dried powders. Further, it is convenient to add serum albumin to the samples as a carrier for storage to prevent the samples from adsorbing to the side of the container.
Ha a tisztítás vagy tárolás során nyomnyi mennyiségben redukáló szerek vannak jelen, az alkalmas arra, hogy megelőzzük a minták oxidálódását. A redukáló szer lehet β-merkapto-etanol, ditiotreitol és glutation.If trace amounts of reducing agents are present during purification or storage, it is useful to prevent oxidation of the samples. The reducing agent can be β-mercaptoethanol, dithiothreitol and glutathione.
• · · ··· ··· ·;• · · ··· ··· ·;
• · *··· · · · • ·· ··· ···• · * ··· · · · · · · · · · · · · · · ·
A jelen találmány szerint lényegében tiszta hbFGF muteinek állíthatók elő, lényegében pirogének és endotoxinok nélkül. A jelen találmány szerinti lényegében tiszta hbFGF muteinek olyan termékek lehetnek, amelyek a jelen találmány szerinti hbFGF muteineket 95%-os, vagy még nagyobb mennyiségben tartalmazzák, még előnyösebb, ha 98 vagy még nagyobb százalékban.According to the present invention, essentially pure hbFGF muteins can be prepared, essentially without pyrogens and endotoxins. The substantially pure hbFGF muteins of the present invention may be products containing 95% or more of the hbFGF muteins of the present invention, more preferably 98% or more.
A jelen találmány szerinti, előzőkben leírt módon kapott hbFGF muteinek fibroblaszt növekedést serkentő aktivitással rendelkeznek, vaszkuláris endotél sejtek növekedését elősegítő aktivitással és angiogén aktivitással rendelkeznek, és alacsony a toxicitásuk. Ezért használhatók olyan anyagokként, amelyeknek gyógyító hatásuk van az égésekre, sebekre, posztoperatív szövetekre és hasonlókra, vagy gyógyászati hatóanyagokként, a trombózissal, arterioszklerózissal és hasonlókkal szembeni angiogén aktivitásuk alapján. Használhatók továbbá a sejttenyészetek növekedését elősegítő reagensekként is. Pontosabban, az a mutein az előnyös, amelyben az eredeti fehérjében levő cisztein csoportok közül legalább egyet szerin csoporttal helyettesítünk, mivel nagyobb a stabilitása.The hbFGF muteins of the present invention obtained as described above have fibroblast growth promoting activity, vascular endothelial cell growth promoting activity and angiogenic activity, and have low toxicity. Therefore, they can be used as substances having a curative effect on burns, wounds, post-operative tissues and the like, or as therapeutic agents based on their angiogenic activity against thrombosis, arteriosclerosis and the like. They can also be used as growth promoters for cell cultures. More specifically, mutein is preferred in which at least one of the cysteine residues in the original protein is replaced by a serine moiety because of its greater stability.
Ha a jelen találmány szerinti hbFGF muteineket gyógyászati készítményekként használjuk, akkor biztonságosan beadhatjuk parenterálisan vagy szájon át melegvérű állatoknak (úgymint embereknek, egereknek, patkányoknak, hörcsögöknek, nyulaknak, kutyáknak és macskáknak) por formájában, vagy gyógyászati készítmény formájában (például injekciók, tabletták, kapszulák, oldatok és kenőcsök), farmakológiailag elfogadható hordozókkal, kötőanyagokkal és higítóanyagokkal.When used as pharmaceutical compositions, the hbFGF muteins of the present invention can be safely administered parenterally or orally to warm-blooded animals (such as humans, mice, rats, hamsters, rabbits, dogs and cats) in powder form or as pharmaceutical formulations (e.g. , solutions and ointments) with pharmaceutically acceptable carriers, excipients and diluents.
♦ β>♦ β>
- 20 ~- 20 ~
Az injekciókat szokványos módszerekkel állítjuk elő, például fiziológiás sóoldat vagy glükózt tartalmazó vizes oldatok, illetve más segédanyagok alkalmazásával. A szokványos módszerek alkalmazásával más gyógyászati készítmények is előállíthatők, például tabletták és kapszulák is.Injections are prepared by conventional techniques such as physiological saline or aqueous solutions of glucose or other excipients. Other pharmaceutical preparations, such as tablets and capsules, may also be prepared using conventional techniques.
Ha a jelen találmány szerinti hbFGF muteineket használjuk az említett gyógyászati készítményekben, akkor ezeket az említett melegvérű állatoknak naponta körülbelül 1 ng/testsúlykilogramtól 100 ug/testsúlykilogramig terjedő mennyiségben adhatjuk be, figyelembe véve a beadás módját, a szimptómákat, stb.When used in said pharmaceutical compositions, the hbFGF muteins of the present invention may be administered to said warm-blooded animals in an amount ranging from about 1 ng / kg body weight to 100 ug / kg body weight per day, depending on the route of administration, symptoms, etc.
Továbbá, ha a jelen találmány szerinti hbFGF muteineket használjuk reagensekként a sejtek szaporodásának felgyorsítására, akkor ezeket előnyösen hozzáadjuk a tenyésztáptalajokhoz körülbelül 0,01-10 pg per liter táptalaj mennyiségben, előnyösebben körülbelül 0,1-10 pg/1 táptalaj mennyiségben.Further, when the hbFGF muteins of the present invention are used as reagents to accelerate cell proliferation, they are preferably added to the culture media in an amount of about 0.01-10 pg / l of medium, more preferably about 0.1-10 pg / l of medium.
Ha bázisokat, aminosavakat és egyéb ilyen molekulákat jelölünk rövidítésekkel a specifikációban és a rajzokon, akkor a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature által elfogadott, vagy a szakterületen jártas szakember által általánosan használt rövidítéseket alkalmazzuk.Abbreviations used to indicate bases, amino acids, and other such molecules in the specification and the drawings are those generally accepted by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used by one of ordinary skill in the art.
Például a következő rövidítéseket használjuk. Ha az aminosavaknál az optikai izomer is előfordul, akkor a rövidítés az L-formát jelöli, hacsak másképpen nem jelezzük.For example, the following abbreviations are used. If the optical isomer also occurs at amino acids, the abbreviation denotes the L-form unless otherwise indicated.
DNS: dexoxiribonukleinsav cDNS: ' komplementer dezoxiribonukleinsavDNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid
A: adenin • 9 « · V • * • · · • · ·«·9 ·· ·A: adenin • 9 «· V • * • · · · · · · · 9 ·· ·
Trp:Trp:
triptofántryptophan
Pro:Pro:
prolinproline
Asn:Asn:
aszparaginasparagine
Gin:Gin:
glutamin.glutamine.
w··w ··
Az 1.1.
ábra alapján a hbFGF-et alkotó aminosavak számozása az aminosav szekvencia N-terminális metioninjánál indul, az kapja az 1-es sorszámot. Ebben a specifikációban azonban a Met·utáni Pro kapja az egyes sorszámot.The amino acids that make up hbFGF are numbered at the N-terminal methionine of the amino acid sequence, and are numbered 1. However, in this specification, the post-Met · Pro is assigned a single serial number.
Az Escherichia coli MM294/pTB762 transzformánst, amely az 1. példában ismertetett pTB762 plazmidot hordozza, az 1. példában előállított Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960 jelű transzformánst, a 8. példában előállított Escherichia coli MM294(DE3)/pCM90i jelű transzformánst, valamint az 1. példában használt Escherichia coli DHl/pTB1004 jelű transzformánst, amely a pTB1004 jelű plazmidot hordozza, letétbe helyeztük az Institute fór Fermentation-nál, Osaka (IFO), Japán, valamint a Fermentation Research Institute-nál, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japán. Ezeknek a letéti számát és a letétbe helyezés időpontját az 1. táblázatban mutatjuk be. Az Escherichia coli MM294/pTB762-nek az FRI-nél való letétbe helyezése először FERM P számok alapján történt. Az említett letétet azután a Budapesti Egyezmény alapján átalakítottuk, és a transzformánsokat az FRI-nél tároltuk FERM BP letéti számokkal jelezve.The Escherichia coli MM294 / pTB762 transformant carrying the plasmid pTB762 described in Example 1, the Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 transformer produced in Example 1, the Escherichia coli MM294 (DE3) / pCM90i produced in Example 8. and the Escherichia coli DH1 / pTB1004 transformant used in Example 1, carrying the plasmid pTB1004, was deposited with the Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, and the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japan. Their deposit numbers and deposit dates are shown in Table 1. Escherichia coli MM294 / pTB762 was first deposited at FRI using FERM P numbers. Said deposit was then converted under the Budapest Convention and the transformants were stored at FRI with FERM BP accession numbers.
A jelen találmányt az alábbiakban a példákon keresztül részletesen ismertetjük. Ennek nem az a célja, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzuk.The present invention will now be described in more detail by way of examples. This is not intended to limit the scope of the invention.
1, Példa1, Example
Az rhbFGF CS23 muteint termelő rekombináns előállításaProduction of recombinant mutein producing rhbFGF CS23
A pTB762 plazmidban levő gént, amely az rhbFGF CS23 muteint kódolja, amelyben a hbFGF-ben létező négy cisztein közül a 69-es és 87-es pozícióban levőket szerin csoportokkal helyettesítették [Senoo et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701-708 (1988); 281.822-es számú európai közrebocsátási irat] EcoRI és PstI restrikciós endonukleázokkal kezeljük, ezzel kivágjuk az rhbFGF CS23 muteint kódoló DNS fragmentet. Ezután a pTB1004 jelű plazmidot (333.383 számú európai közrebocsátási irat) teljesen megemésztjük EcoRI és PstI restrikciós enzimekkel, majd ezt a fragmentet a keletkező legnagyobb fragmenthez ligáijuk T4 DNS ligázzal, így kapjuk a pTB92i jelű plazmidot. Ezután a pTB921 jelű plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, a kapott terméket mung bean (yaenari) nukleázzal kezeljük, ezzel a terméken tompa végeket alakítunk ki, majd BglII restrikciós enzimmel emésztjük, így kapjuk a CS23 rhbFGF muteint kódoló gént tartalmazó fragmentet. Ezután a T7 fág FI 10 promoterét hordozó pET3C vektort [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189. 113-130 (1986)] Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, majd a » kapott terméket müng bean nukleázzal kezeljük, hogy tompavégű terméket kapjunk, majd BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. Egy, a CS23 rhbFGF muteint kódoló DNS fragmentet a kapott DNS fragmenthez ligálunk T4 ligázzal, így kapjuk a pTB960 expressziós plazmidot (2. ábra).The gene in plasmid pTB762, which codes for the mutein rhbFGF CS23, has been substituted for serine residues 69 and 87 of the four cysteines present in hbFGF [Senoo et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701 -708 (1988); European Patent Publication No. 281,822] is digested with restriction endonucleases EcoRI and PstI, thereby deleting the DNA fragment encoding the mutein rhbFGF CS23. Plasmid pTB1004 (EP 333.383) was then completely digested with EcoRI and PstI and ligated to the largest fragment generated by T4 DNA ligase to give plasmid pTB92i. Plasmid pTB921 is then digested with Eco RI, treated with mung bean (yaenari) nuclease to form blunt ends and digested with BglII to obtain the fragment encoding the CS23 rhbFGF mutein. Next, the pET3C vector carrying the F10 promoter of phage T7 [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189: 113-130 (1986)], digested with Nde I and treated with nascent bean nuclease to give a blunt end product and digested with Bam HI. A DNA fragment encoding the CS23 rhbFGF mutein was ligated to the resulting DNA fragment with T4 ligase to give expression plasmid pTB960 (Figure 2).
Az Escherichia coli MM294-et DE3 lambda fággal lizogenizáljuk, amelybe a T7 fág RNS polimeráz génjét építettük be [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189, 113-130 (1986)], így állítjuk elő az Escherichia coli MM294(DE3) törzset. Ezt az Escherichia coli törzset azután transzformáljuk a pTB960 expressziós vektorral, így kapjuk az Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960 rekombinánst (IFO 14979, FERM BP-2960), amely a CS3 rhbFGF muteint kódoló gént tartalmazza (1. ábra).Escherichia coli MM294 was lysogenized with the phage DE3 lambda into which the RNA polymerase gene of phage T7 was incorporated [F.W. Studier et al., 1986, Journal of Molecular Biology, 189, 113-130], to prepare Escherichia coli MM294 (DE3). This Escherichia coli strain is then transformed with the expression vector pTB960 to give the Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 recombinant (IFO 14979, FERM BP-2960), which contains the gene encoding the mRBF for mRBF3 (Figure 1).
2. Példa mg/ml ampicillint tartalmazó 30 ml LB táptalajt (10 g/1 Bacto Tryptone, 5 g/1 Bacto Yeast Extráét és 5 g/1 NaCl) oltunk be egy kacsnyi rekombináns Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960 törzssel (IFO 14979, FERM BP-2690), majd éjszakán át 37°C-on rázatjuk. Ebből a tenyészetből 1,5 ml-t 30 ml M9 táptalajba viszünk át (16,8 g/1 Na2HPO4X12 H2O, 3 g/1 KH2PO4, 1 g/1 NH4CI, 0,5 g/1 NaCl és 0,246 g/1 MgSO4x7 H20), amelyet 15 g/1 glükózzal, 15 g/1 kazaminosawal, 1 mg/1 tiaminhidrokloriddal és 50 mg/ml ampicillin-nátriumsóval egészítünk ki, és a tenyésztést 37°C-on végzett rázatással folytatjuk. Ha a tenyészet turbiditása eléri a 100-120 Klett egységet, akkor IPTG-t adunk hozzá különböző koncentrációban, és a tenyésztést még további 4 óra hosszat folytatjuk. A sejteket centrifugálással nyerjük ki és -20°C-on tároljuk.Example 2 30 ml of LB medium (10 g / l Bacto Tryptone, 5 g / l Bacto Yeast Extrase and 5 g / l NaCl) containing ampicillin mg / ml was inoculated with a loop of recombinant Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 strain (IFO). 14979, FERM BP-2690) and shaken overnight at 37 ° C. 1.5 ml of this culture was transferred to 30 ml of M9 medium (16.8 g / l Na2HPO4X12 H2O, 3 g / l KH2PO4, 1 g / l NH4Cl, 0.5 g / l NaCl and 0.246 g / l MgSO4). 4 x 7H 2 O) supplemented with 15 g / l glucose, 15 g / l casaminosa, 1 mg / l thiamine hydrochloride and 50 mg / ml ampicillin sodium and cultured by shaking at 37 ° C. When the turbidity of the culture reaches 100-120 Klett units, IPTG at various concentrations is added and the culture is continued for an additional 4 hours. Cells were harvested by centrifugation and stored at -20 ° C.
Két azonos mintát állítunk elő. Az egyik mintához 7 mol/1 guanidin-hidrokloridot adunk, és a sejteket elegendő mértékben felrázzuk, és 1 óra hosszat hagyjuk állni. Ezután a felülúszót centrifugálással kapjuk meg (a bFGF mutein teljes mennyisége itt van). A másik mintához 50 ^g/ml lizozim oldatot adunk (10% szacharóz, 10 mmol/1 EDTA, 100 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1Two identical samples were prepared. To one sample was added 7M guanidine hydrochloride, and the cells were shaken sufficiently and allowed to stand for 1 hour. The supernatant is then obtained by centrifugation (total bFGF mutein is present). To the other sample was added 50 µg / ml lysozyme solution (10% sucrose, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM)
- 26 APMSF és 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,6), majd az elegyet 1 óra hosszat 4°C-on hagyjuk állni. A sejteket azután ultrahangos besugárzással feltárjuk (Kubota Insonater 200 M), majd centrifugálással kapunk egy felülúszót (az oldható hbFGF mutein itt található). Mindkét extrahált oldatot meghigítjuk, és a CS23 rhbFGF mutein mennyiségét ELISA módszerrel meghatározzuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.- 26 APMSF and 10 mM TRIS-HCl pH 7.6) and allowed to stand at 4 ° C for 1 hour. The cells were then lysed by sonication (Kubota Insonater 200 M) and centrifuged to obtain a supernatant (soluble hbFGF mutein is found here). Both extracted solutions were diluted and the amount of CS23 rhbFGF mutein was determined by ELISA. The results are shown in Table 2.
2. TáblázatTable 2
A hozzáadott A felhalmozódottThe added A has accumulated
IPTG rhbFGF mutein mennyisége (μΜ) mennyisége (mg/1)Amount (μΜ) of IPTG rhbFGF mutein (mg / l)
Az oldható CS23 rhbFGF mutein aránya (%)Ratio of soluble CS23 rhbFGF mutein (%)
Amint az a fentiekből látható, ha a tenyésztést kis térfogatban, azaz lombikokban végezzük, akkor a jelen találmány szerinti hatást kis mennyiségű IPTG hozzáadásával lehet elérni. Nevezetesen, körülbelül 1 mmol/1 IPTG hozzáadásával lehet a lac promotert indukálni. Ha az IPTG-t 100 μτηοΐ/ 1-ben vagy nagyobb mennyiségben adjuk a tenyészethez, akkor a termelőképesség alacsony, és a kívánt termék oldhatatlan formában akkumulálódik. Ezzel szemben, a jelen találmány szerint, ha az IPTG-t 3-100 μιηοΐ/ΐ mennyiségben adjuk a rendszerhez, főleg 6-80 gmol/l mennyiségben, akkor azt a teljesen váratlan eredményt kapjuk, hogy jelentős javulás tapasztalható a termelőképességben, valamint az oldható formában felhalmozódott fehérje arányában.As can be seen from the above, when the culture is carried out in small volumes, i.e. flasks, the effect of the present invention can be achieved by adding a small amount of IPTG. Namely, the addition of about 1 mM IPTG can induce the lac promoter. Addition of IPTG at 100 μτηοΐ / l or higher results in low productivity and accumulation of the desired product in insoluble form. In contrast, according to the present invention, adding IPTG in the amount of 3-100 μιηοΐ / ΐ, especially 6-80 gmol / l, results in a completely unexpected result that there is a significant improvement in productivity and in the proportion of protein accumulated in soluble form.
3. PéldaExample 3
2,5 liter, 15 g/1 glükózt, 15 g/1 kazaminosavat és 5 mg/1 tiamin-hidrokloridot tartalmazó M9 táptalajt (pH=6,8) egy 5 literes üvegfermentorba teszünk és kisterilezzük. A táptalajt ezután 125 ml, a 2. példában leírtak alapján előállított oltóanyaggal oltjuk be, a pH-t 6,8-ra állítjuk, majd 37°C-on inkubáljuk kevertetés (1000/perc) és levegőztetés (2,5 1/perc) közben. Amikor a tenyészet turbiditása eléri a 120 Klett egységet (3 órával a tenyésztés megkezdése után), akkor IPTG-t adunk hozzá 10 μηοΐ/ΐ végkoncentrációban. A tenyésztés megkezdése utáni 8. órában glükózt és kazaminosavat adunk hozzá 10 g/1 végkoncentrációban. A tenyésztés még 15 óra hosszat folytatjuk. Ennek eredményeképpen 440 mg/1 rhbFGF mutein halmozódik fel oldható formában. Ezzel ellentétben, ha 400 μπιοί/ΐ IPTG-t adunk a tenyészethez ugyanilyen körülmények között, akkor a CS rhbFGF mutein mennyisége csak 17,5 mg/1.2.5 liters of M9 medium (pH 6.8) containing 15 g / l glucose, 15 g / l casaminic acid and 5 mg / l thiamine hydrochloride were placed in a 5 l glass fermenter and cysterilized. The medium is then inoculated with 125 ml of the inoculum prepared as described in Example 2, the pH is adjusted to 6.8, and then incubated at 37 ° C with stirring (1000 rpm) and aeration (2.5 l / min). ). When the turbidity of the culture reaches 120 Klett units (3 hours after start of culture), IPTG is added at a final concentration of 10 μηοΐ / ΐ. At 8 hours after the start of culture, glucose and casamino acid were added to a final concentration of 10 g / L. The culture was continued for another 15 hours. As a result, 440 mg / l rhbFGF mutein accumulates in soluble form. In contrast, when 400 μπιοί / ΐ IPTG is added to the culture under the same conditions, the amount of CS rhbFGF mutein is only 17.5 mg / L.
4. PéldaExample 4
A 2. példában leírtak alapján készített oltóanyagot 5 literes üvegfermentorba visszük, amelyben ugyanaz a táptalaj található, mint amit a 3. példában láttunk, majd a tenyésztést 30°C-on, pH=6,8 érték beállításával, 2,5 1/perc levegőztetési arány mellett, 1000/perc kevertetési sebességgel indítjuk. Ha a turbiditás eléri a körülbelül 700 Klett egységet a tenyésztés megkezdése utáni 7. órában, akkor 42 μπιο1/1 IPTG-t adunk hozzá.The inoculum prepared as described in Example 2 was transferred to a 5 L glass fermenter containing the same medium as in Example 3 and cultured at 30 ° C at pH 6.8 at 2.5 L / min. at aeration rate of 1000 rpm. If the turbidity reaches about 700 Klett units by the 7th hour after the start of culture, 42 μπιο1 / 1 IPTG is added.
A tenyésztés megindítása utáni 8,5-ik órában 20 g/1 glükózt és g/1 kazaminosavat adunk a tenyészethez pH=6,8-as érték mellett. A tenyésztést további 36 óra hosszat folytatjuk. A tenyészlében 860 mg/1 rhbFGF halmozódik fel oldható formában.At 8.5 hours after the start of the culture, 20 g / L glucose and g / L casinoic acid were added at pH 6.8. The culture was continued for another 36 hours. In culture medium, 860 mg / l rhbFGF accumulates in soluble form.
5, PéldaExample 5
2,5 liter, 15 g/1 glükózt, 15 g/1 kazaminosavat és 5 mg/1 tiamin-hidrokloridot tartalmazó M-9 táptalajt teszünk 5 literes üvegfermentorba, majd sterilezzük. Ezután vasionokat adunk hozzá a 3. táblázatban látható mennyiségben (szűréssel sterilezve). A kapott táptalajt 125 ml, a 2. példában leírtak alapján előállított tenyészettel oltjuk be, majd a tenyésztést a következő paraméterekkel folytatjuk: pH=6,8, 30°C, levegőztetés2.5 liters of M-9 medium containing 15 g / L glucose, 15 g / L casaminic acid and 5 mg / L thiamine hydrochloride were placed in a 5 L glass fermenter and sterilized. Iron ions are then added in the amounts shown in Table 3 (sterilized by filtration). The resulting medium was inoculated with 125 ml of the culture prepared as described in Example 2 and the culture was continued with the following parameters: pH 6.8, 30 ° C, aeration.
2,5 1/perc, kevertetés 1000/perc. Amikor a tenyészet turbiditása eléri a körülbelül 300 Klett egységet (körülbelül 5,5-6 órával a tenyésztés megindítása után), akkor IPTG-t adunk hozzá 42 Mmol/l végkoncentrációban, majd ugyanebben az időpontban a tenyésztés hőmérsékletét 25°C-ra csökkentjük, és a tenyésztést további 23,5 óra hosszat folytatjuk. A tenyésztés megindítása után 7-7,5 órával glükózt és kazaminosavat adunk a rendszerhez 15 g/1 mennyiségben, majd a pH-t a tenyésztés során 6,8-as értéken tartjuk. Az eredmények a 3. Táblázatban láthatók.2.5 rpm, stirring 1000 rpm. When the turbidity of the culture reaches about 300 Klett units (about 5.5-6 hours after the start of culture), IPTG is added to a final concentration of 42 mM and then the culture temperature is reduced to 25 ° C at the same time. and culturing was continued for an additional 23.5 hours. 7-7.5 hours after the start of culture, glucose and casamino acid were added at 15 g / l and the pH was maintained at 6.8 during culture. The results are shown in Table 3.
3. TáblázatTable 3
A hozzáadott vasion mennyiségeThe amount of iron ion added
A termelt CS23 rhbFGF mutein produktivitása • ·Productivity of the produced CS23 rhbFGF mutein • ·
(Megjegyzés: a hozzáadott vasion mennyisége a táptalajhoz utólagosan hozzáadott vasionok mennyiségét jelenti. A produktivitás a súlyarányt mutatja arra az esetre vonatkoztatva, amikor a hozzáadott vasion mennyisége 0.)(Note: the amount of iron ion added is the amount of iron ions added to the medium afterwards. Productivity shows the weight ratio of the amount of iron ion added to 0.)
6♦ Példa liter, 50 mg/ml ampicillin nátriumsót tartalmazó LB táptalajt oltunk be 1 ml Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960 (IFO 14979, FERM BP-2690) tenyészettel, majd a tenyésztést 8 óra hosszat folytatjuk 30°C-on végzett rázatással. A kapott teljes mennyiséget 20 liter, 50 literes fermentorban levő, 50 mg/1 ampicillin nátriumsót tartalmazó LB táptalajba visszük át, és a tenyésztést 7 óra hosszat 30°C-on végezzük 1,0 kg/cm2G belső nyomás mellett, a levegőztetés értéke 10 1/perc, a kevertetés sebessége 300/perc. A kapott tenyészetből ezután 18 litert átviszünk 360 liter fermentációs táptalajba (M-9 táptalaj, kiegészítve 15 g/1 glükózzal, 15 g/1 kazaminosawal, 5 mg/1 Βχ vitaminnal és 5 mg/1 FeSO4x7 ^O-val), majd a tenyésztést 30°Con indítjuk 1,0 kg/cm2G belső nyomás mellett, a levegőztetés sebessége 240 1/perc, a kevertetés sebessége 250/perc. Ha a tenyészet turbiditása eléri a körülbelül 1000 Klett egységet, • · akkor IPTG-t adunk hozzá 100 μιηοΐ/ΐ végkoncentráciőban, és a tenyésztés hőmérsékletét 25°C-ra csökkentjük. Ugyanebben az időpontban 50 liter steril, 18 kg glükózt és 5,4 kg kazaminosavat tartalmazó oldatot adunk a tenyészethez körülbelül6 ♦ Example One liter of LB medium containing 50 mg / ml of ampicillin sodium salt was inoculated with 1 ml of Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 (IFO 14979, FERM BP-2690) and cultured for 8 hours at 30 ° C. shaking. The total amount obtained is transferred to 20 L of LB medium containing 50 mg / L ampicillin sodium salt in a 50 L fermenter and cultured at 30 ° C for 7 hours at an internal pressure of 1.0 kg / cm 2 G with aeration. its value is 10 l / min and the stirring rate is 300 rpm. 18 liters of the resulting culture were then transferred to 360 liters of fermentation medium (M-9 medium supplemented with 15 g / l glucose, 15 g / l casaminosa, 5 mg / l Βχ vitamin and 5 mg / l FeSO4x77O) and culture at 30 ° C at an internal pressure of 1.0 kg / cm 2 G, aeration rate of 240 rpm and agitation rate of 250 rpm. When the turbidity of the culture reaches about 1000 Klett units, IPTG is added at a final concentration of 100 μιηοΐ / ΐ and the culture temperature is reduced to 25 ° C. At the same time, 50 liters of sterile solution containing 18 kg glucose and 5.4 kg casinoic acid were added to the culture at about
2,5 óra alatt, majd a tenyésztést további 36 óra hosszat folytatjuk. Ennek eredményeképpen 1,2 g/1 CS23 rhbFGF mutein akkumulálódik oldható állapotban. Az így kapott tenyészetből Sharpless centrifugával nyerjük ki a nedves sejteket, és a sejteket -80°C-on tároljuk.After 2.5 hours, the culture was continued for another 36 hours. As a result, 1.2 g / L of CS23 rhbFGF mutein accumulates in a soluble state. From the resulting culture, wet cells were harvested by Sharpless centrifugation and stored at -80 ° C.
7. PéldaExample 7
A CS23 rhbFGF mutein tisztítása kg, a 6. példában leírtak alapján előállított, -80°Con fagyasztva tárolt Escherichia coli MM294(DE3)/pTB960 sejtet szuszpendálunk 4 liter pufferben [összetétele: 25 mmol/1 foszfát puffer pH=6,0, 0,1 mmol/1 p-amidinofenil-metánszulfonil-fluoridhidroklorid (APMSF) és 2 mmol/1 ditiotreitol (DTT)J.A sejteket egy Ötliteres Dynomill Model KD-5-ben (Willybachfen, Svájc) öt ciklusban feltárjuk, 4 liter üveggyöngyöt használva. Az üveggyöngyöket körülbelül 5 liter pufferrel mossuk, majd a mosófolyadékot az extraktummal együtt összegyűjtjük. A kapott oldatból körülbelül 10 litert 10 000/perc fordulatszámmal 60 percig centrifugálunk (Model 21, Beckman, USA), így kapunk egy felülúszót. Az így kapott felülúszót egy oszlopra visszük (25,2 cm x 50 cm) , amely Sulfated Cellulofine-t tartalmaz (Seikagaku Kogyo, Japán). Az adszorpció után az oszlopot 25 liter 25 mmol/l-es foszfát pufferrel (pH=7,0) mossuk, amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz. Az eluálást ezután 30 liter 25 mmol/l-es foszfát pufferrel (pH=7,0) végezzük, amely 1 mol/1 NaCl-t tartalmaz. Az eluátumot egy ultraszűrővel töményítjük (Pellicon Casset System, Millipore, USA), egészen addig, amíg a 280 nmendonukleáz mért abszorbancia el nem éri a 3-4-es értéket. A kapott töményített oldatot körülbelül 60 liter 25 mmol/l-es foszfát pufferrel szemben (pH=6,0) dializáljuk éjszakán át. A dializátumot lecentrifugáljuk (4200/perc, 30 perc, Beckman USA), így kapunk egy felülúszót. A felülúszót egy oszlopra visszük (17,0 cm x 33,0 cm), amely SP-Toyopearl 650M-et (Tosoh, Japán) tartalmaz. Az oszlopot 7 liter 25 mmol/l-es foszfát pufferrel (pH=6,0) mossuk, amely 200 mmol/1 NaCl-t tartalmaz, majd az eluálást 10 liter, 25 mmol/l-es foszfát pufferrel folytatjuk (pH=6,0), amely 500 mmol/1 NaCl-t tartalmaz. Az eluátumot egy Sulfated Cellulofine-t (Seikagaku Kogyo) tartalmazó oszlopra visszük (15,0 cm x 50 cm), amely egy nagynyomású folyadékkromatográfhoz van kötve (Gilson, Franciaország). Az eluálást azután egy lineáris gradienssel végezzük, amelynek komponensei 20 liter 50 mmol/l-es citrát puffer (pH=7,0) illetve 30 liter 50 mmol/l-es citrát puffer (pH=7,0), amely 2 mol/1 NaCl-t tartalmaz. A fő frakciókat összegyűjtjük, majd 10 mmol/l-es citrát pufferrel (pH=6,0) annyira meghigítjuk, hogy a vezetőképességük 20 mohm vagy kisebb legyen. A hígított oldatot oszlopra visszük (14,0 x 39,0 cm), amelynek töltete SP-Toyopearl 650M (Tosoh, Japán). Az oszlopot 10 liter 25 mmol/l-es citrát pufferrel (pH=6,0) mossuk, majd az eluálást 10 liter 25 mmol/les citrát pufferrel végezzük, amely 0,5 mol/1 NaCl-t tartalmaz. Az eluátumot oszlopra visszük (14,0 cm x 90,0 cm), az oszlop töltete Toyopearl HW-50F (Tosoh, Japán), majd 50 mmol/l-es ♦ ·· ·Purification of the CS23 rhbFGF mutein in kg of Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 frozen -80 ° C prepared as described in Example 6 was suspended in 4 L of buffer [composition: 25 mM phosphate buffer pH 6.0, 0 , 1 mmol / l p-amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride (APMSF) and 2 mmol / l dithiothreitol (DTT) JA cells were lysed in a 5 L Dynomill Model KD-5 (Willybachfen, Switzerland) for 5 cycles using 4 L glass beads. The glass beads are washed with about 5 liters of buffer and the washings are collected together with the extract. About 10 liters of the resulting solution were centrifuged at 10,000 rpm for 60 minutes (Model 21, Beckman, USA) to obtain a supernatant. The supernatant thus obtained was applied to a column (25.2 cm x 50 cm) containing Sulfated Cellulofine (Seikagaku Kogyo, Japan). After adsorption, the column was washed with 25 L of 25 mM phosphate buffer, pH 7.0 containing 0.5 M NaCl. Elution was then performed with 30 L of 25 mM phosphate buffer, pH 7.0 containing 1 M NaCl. The eluate was concentrated by ultrafiltration (Pellicon Casset System, Millipore, USA) until the absorbance at 280 nmendonuclease reached 3-4. The resulting concentrated solution was dialyzed against about 60 L of 25 mM phosphate buffer, pH 6.0 overnight. The dialysate was centrifuged (4200 / min, 30 min, Beckman USA) to give a supernatant. The supernatant was applied to a column (17.0 cm x 33.0 cm) containing SP-Toyopearl 650M (Tosoh, Japan). The column was washed with 7 L of 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 200 mM NaCl and eluted with 10 L of 25 mM phosphate buffer (pH 6). , 0) containing 500 mM NaCl. The eluate was applied to a column (15.0 cm x 50 cm) containing Sulfated Cellulofine (Seikagaku Kogyo) bound to a high performance liquid chromatograph (Gilson, France). Elution is then performed with a linear gradient of 20 liters of 50 mM citrate buffer, pH 7.0, and 30 liters of 50 mM citrate buffer, pH 7.0, 2 mol / l. Contains 1 NaCl. The major fractions were collected and diluted with 10 mM citrate buffer (pH 6.0) until they had a conductivity of 20 mohm or less. The diluted solution was applied to a column (14.0 x 39.0 cm) packed with SP-Toyopearl 650M (Tosoh, Japan). The column was washed with 10 L of 25 mM citrate buffer (pH 6.0) and eluted with 10 L of 25 mM citrate buffer containing 0.5 M NaCl. The eluate was applied to a column (14.0 cm x 90.0 cm), packed with Toyopearl HW-50F (Tosoh, Japan), then loaded with 50 mmol / l ♦ ·· ·
- 33 citrát pufferrel (pH=7,0) fejlesztjük ki. A fő frakciókat összegyűjtjük, majd egy Millipak 20 szűrőn (Millipore, USA) átszűrve sterilezzük, így kapjuk a CS23 rhbFGF mutein tisztított oldatát. A kitermelés 17,0 g (a százalékos kitermelés 70%). Az N-terminális aminosav szekvencia analízis, a C-terminális aminosav szekvencia analízis valamint az aminosav összetétel meghatározás eredményeit a 4-6. Táblázatokban mutatjuk be.- 33 citrates were developed with buffer pH 7.0. The major fractions were collected and sterilized by filtration through a Millipak 20 filter (Millipore, USA) to give a purified solution of the CS23 rhbFGF mutein. Yield 17.0 g (70% yield). The results of the N-terminal amino acid sequence analysis, the C-terminal amino acid sequence analysis and the amino acid composition determination are shown in Figures 4-6. It is presented in tables.
4. TáblázatTable 4
N-terminális aminosav szekvencia elemzésN-terminal amino acid sequence analysis
Ciklus Aminosav csoport (pmol) A nukleotid szekvenciából sorszáma CS23 rhbFGF mutein (750 pmol) következő aminosavCycle Amino acid group (pmol) Nucleotide sequence sequence number CS23 rhbFGF mutein (750 pmol) Next amino acid
4. Táblázat (folyt.)Table 4 (cont'd)
N-terminális aminosav szekvencia elemzésN-terminal amino acid sequence analysis
CiklusCycle
Aminosav csoport (pmol)Amino acid group (pmol)
A nukleotid szekvenciábólFrom the nucleotide sequence
- 34 sorszáma CS23 rhbFGF mutein (750 pmol) következő aminosav- 34 is the next amino acid for CS23 rhbFGF mutein (750 pmol)
Model 477A fehérje szekvenátorral (Applied Biosystems) elemezve.Model 477A Protein Sequencer (Applied Biosystems).
5. TáblázatTable 5
C-terminális aminosav elemzésC-terminal amino acid analysis
C-terminális aminosav Termelési %C-terminal amino acid Production%
Ser 41,0 * Hidrazinolízis módszer;Ser 41.0 * Hydrazinolysis method;
* Model 6330 aminosav elemzővel (Beckman) elemezve;* Model 6330 amino acid analyzer (Beckman);
6. TáblázatTable 6
Aminosav-összetétel elemzésAmino acid composition analysis
6. Táblázat (folyt.)Table 6 (cont'd)
Aminosav összetétel elemzésAmino acid composition analysis
Aminosavamino acid
CS23 rhbFGF muteinCS23 rhbFGF mutein
Elméleti érték • 9 ·Theoretical Value • 9 ·
- nincs vizsgálva;- not tested;
* sósavas hidrolízis módszer;* hydrolysis method with hydrochloric acid;
** Model 6330 aminosav elemzővel (Beckman) elemezve;** Model 6330 amino acid analyzer (Beckman);
1 Edelhoch módszer. 1 Edelhoch method.
Továbbá, a 3. ábrán láthatók a redukált körülmények között (100 mmol/1 DTT, 50°C, 15 perc) végzett SDS-PAGE eredményei. A 3. ábrán (1) illetve (2) jelenti a marker, illetve a CS23 rhbFGF mutein eredményeit.Furthermore, Figure 3 shows the results of SDS-PAGE under reduced conditions (100 mM DTT, 50 ° C, 15 minutes). Figure 3 (1) and (2), respectively, represent the marker and CS23 rhbFGF mutein results.
A 4. ábrán egy nagynyomású folyadékkromatografálás eredményei láthatók, hordozóként heparin-5PW-vel (Tosoh, Japán) töltött oszlopot használva (7,5 mm x 7,5 cm), az alábbi körülmények között:Figure 4 shows the results of a high performance liquid chromatography using a column packed with heparin-5PW (Tosoh, Japan) (7.5mm x 7.5cm) under the following conditions:
Eluálószerek: A oldat [50 mmol/1 foszfát puffer (pH=7)]Eluents: Solution A [50 mM phosphate buffer (pH 7)]
B oldat [2 mol/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmol/l-es foszfát puffer (pH=7)J.Solution B [50 mM phosphate buffer, pH 7, 2 M NaCl].
Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc.Flow rate: 0.8 ml / min.
A detektálás hullámhossza: 280 nm.Detection wavelength: 280 nm.
w<·w <·
- 37 Az 5. ábrán egy nagynyomású folyadékkromatografálás eredményei láthatók, hordozóként ODP-50-et (Asahi Chemical Industry, Japán) tartalmazó oszlopot használva (4,6 mm x 150 cm), az alábbi körülmények között:Figure 5 shows the results of a high performance liquid chromatography using a column (4.6 mm x 150 cm) containing ODP-50 (Asahi Chemical Industry, Japan) as a carrier under the following conditions:
Eluálószerek: A oldat (0,1% trifluorecetsav);Eluents: Solution A (0.1% trifluoroacetic acid);
B oldat (80% acetonitril, amely 0,1% trifluorecetsavat tartalmaz).Solution B (80% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid).
Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc.Flow rate: 1.0 ml / min.
A detektálás hullámhossza: 280 nm.Detection wavelength: 280 nm.
A 6. ábrán egy nagynyomású folyadékkromatografálás eredményei láthatók, hordozóként G2000SW-t (Tosoh, Japán) tartalmazó oszlopot használva (7,5 mm x 7,5 cm), az alábbi körülmények között:Figure 6 shows the results of a high performance liquid chromatography using a column (7.5 mm x 7.5 cm) containing G2000SW (Tosoh, Japan) as the support under the following conditions:
Kifejlesztő oldat: 0,1 mol/1 foszfát puffer (pH=7) + 0.1 mol/1 nátrium-szulfát.Developing solution: 0.1 M phosphate buffer (pH 7) + 0.1 M sodium sulfate.
Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc.Flow rate: 0.5 ml / min.
A detektálás hullámhossza: 280 nm.Detection wavelength: 280 nm.
A biológiai aktivitást azzal a módszerrel mérjük, amelyben a borjúmagzat szív endoteliális sejtek növekedést serkentő hatását használjuk a biológiai aktivitás mérésére. Ennek eredményeképpen a mintáéval ekvivalens aktivitást lehet kimutatni.Biological activity is measured by the method used to measure the growth activity of fetal calf endothelial cells to measure biological activity. As a result, activity equivalent to that of the sample can be detected.
8. példaExample 8
A CS23 rhbFGF muteint termelő rekombináns előállítása, amely tetraciklin rezisztencia markerrel rendelkezik A pTB762 plazmidot, amely azt a CS23 rhbFGF muteint tartalmazza, amelyben a hbFGF-ben találhat) négy cisztein * a · csoport közül a 69. és 87. pozícióban levőket szerin csoportokkal helyettesített [Senoo et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701-708 (1988); 281.822-es számú európai közrebocsátási irat], teljesen megemésztjük Aval és PstI restrikciós enzimekkel, így egy olyan, körülbelül 0,45 kb méretű DNS fragmentet kapunk, amely a CS23 rhbFGF muteinnek a legnagyobb részét tartalmazza. Egy szintetikus DNS szakaszt ( GATCTGC) ligálunk a keletkező ACGTCTAGACG) fragmenthez T4 DNS ligázzal, majd a keletkező DNS molekulát Aval és PstI restrikciós enzimmel emésztjük, így kapjuk az A fragmentet, amelyben a PstI restrikciós hasítási helyet egy BglII hasítási helyre módosítottuk. Ezután a pTB955 plazmidot, amelybe hbFGF C-terminálisán deletált, C128 rhbFGF muteint kódoló gént [Senoo et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151. 701-708 (1988)] teljesen megemésztjük Sáli és BamHI restrikciós enzimekkel, így kapjuk a B fragmentet, amely körülbelül 4,1 kb méretű. A pTB955-öt teljesen megemésztjük Aval restrikciós enzimmel, majd Sáli restrikciós enzimmel, így kapjuk a körülbelül 390 bp méretű C fragmentet.Preparation of recombinant CS23 rhbFGF mutein producing a tetracycline resistance marker Plasmid pTB762 containing the CS23 rhbFGF mutein containing hbFGF) was replaced by serine residues at positions 69 and 87 of the four cysteine a groups. [Senoo et al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications 151: 701-708; No. 281,822] is completely digested with the restriction enzymes Aval and PstI to give a DNA fragment of about 0.45 kb containing most of the rh23FGF mutein CS23. A synthetic DNA fragment (GATCTGC) was ligated to the resulting fragment ACGTCTAGACG) with T4 DNA ligase and the resulting DNA molecule was digested with the restriction enzymes Aval and PstI to give fragment A in which the PstI restriction site was modified to a BglII site. Plasmid pTB955, to which the C128 rhbFGF mutein coding gene was deleted at the C-terminus of hbFGF (Senoo et al., 1988, Biochemical and Biophysical Research Communications, 151: 701-708), was digested with restriction enzymes SalI and BamHI. fragment of about 4.1 kb. PTB955 is completely digested with the restriction enzyme Aval and then with the restriction enzyme SalI to give fragment C of about 390 bp.
A három fragmentet (A, B és C), T4 DNS ligázzal összeligáljuk, így kapjuk a pHP901 expressziós plazmidot, amely ampicillin rezisztencia markert tartalmaz.The three fragments (A, B and C) were ligated with T4 DNA ligase to give the expression plasmid pHP901, which contains the ampicillin resistance marker.
A pHP901 plazmidot teljesen megemésztjük EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel, így kapunk egy körülbelül 1,1 kb méretű fragmentet, amely a CS23 rhbFGF muteint kódoló gént, a T7 promotert és a T7 terminátort tartalmazza. A fragmentet EcoRI ás BamHI restrikciós enzimekkel emmésztett pUC18 vektorba ligáijuk *· ·«· • · ·»*· S Λ a * ·* · ·« ««* -?·Plasmid pHP901 is completely digested with restriction enzymes EcoRI and BglII to give a fragment of about 1.1 kb containing the gene encoding the CS23 rhbFGF mutein, the T7 promoter and the T7 terminator. The fragment was ligated into pUC18 digested with EcoRI and BamHI * S * * * * *???
- 39 T4 DNS ligázzal, így kapjuk a pME901 plazmidot (8. ábra).- 39 T4 DNA ligase to give plasmid pME901 (Figure 8).
A pME901 plazmidot teljesen megemésztjük EcoRV és Hindin restrikciós enzimekkel, így kapunk egy körülbelül 0,77 kb méretű fragmentet, amely a CS23 rhbFGF muteint kódoló gént, a T7 promotert és a T7 terminátort tartalmazza. A fragmentet T4 DNS polimerázzal inkubáljuk, hogy a végeit feltöltsük. A fragmentet Sci restrikciós enzimmel emésztett pBR322 plazmidba ligáijuk, így kapjuk a pCM901 expressziós plazmidot, amely tetraciklin rezisztencia markert tartalmaz (9. ábra).Plasmid pME901 was completely digested with restriction enzymes EcoRV and Hindin to give a fragment of about 0.77 kb containing the gene encoding the CS23 rhbFGF mutein, the T7 promoter and the T7 terminator. The fragment was incubated with T4 DNA polymerase to fill the ends. The fragment was ligated into the Sci restriction enzyme digested plasmid pBR322 to obtain the expression plasmid pCM901, which contains the tetracycline resistance marker (Figure 9).
Az Escherichia coli MM294 törzset DE3 fággal lizogenizáljuk, amelybe a T7 fágnak az RNS polimeráz génjét építettük be [F.W. Studier et al., Journal of Molecular Biology, 189, 113-130 (1986)], így állítjuk elő az Escherichia coli MM294(DE3) törzset. Ezt az Escherichia coli törzset azután transzformáljuk a pCM901 expressziós vektorral, így kapjuk az Escherichia coli MM294(DE3)/pCM901 rekombinánst (IFO 15104, FERM BP-3168), amely a CS3 rhbFGF muteint kódoló gént tartalmazza.Escherichia coli strain MM294 was lysogenized with phage DE3 into which the RNA polymerase gene of phage T7 was incorporated [F.W. Studier et al., 1986, Journal of Molecular Biology, 189, 113-130], to prepare Escherichia coli MM294 (DE3). This Escherichia coli strain is then transformed with the expression vector pCM901 to give the Escherichia coli MM294 (DE3) / pCM901 recombinant (IFO 15104, FERM BP-3168), which contains the gene encoding the CS3 rhbFGF mutein.
9. Példa liter, 5 mg/liter tetraciklin-hidrokloridot tartalmazó LB táptalajt az Escherichia coli MM294(DE3)/pCM901 (IFO 15104, FERM BP-3168) rekombináns törzs 1 ml-es inokulumával oltjuk be, majd a tenyésztést 8 óra hosszat 30°C-on folytatott rázatással végezzük. A teljes mennyiséget azután 50 literes fermentorban levő 20 liter LB táptalajba visszük át (5 mg/ml tetraciklinhidrokloridot tartalmaz), majd a tenyésztést 30°C-on végezzük, 1 kg/cm2G belső nyomással, a levegőztetés sebessége 10 1/perc, a kevertetés 300 rpm, egészen addig, amíg a tenyészet turbiditása eléri a 700 Klett egységet. Ezután a kapott tenyészet teljes mennyiségét 360 liter fermentációs táptalajba visszük (M-9 táptalaj, amely 15 g/1 glükózt, 15 g/1 kazaminosavat, 16,8 g/1 Na2HPO4xl2 H2O-t, 3 g /1 KH2PO4-et, 1 g/1 NH4Cl-t, 0,5 g/1 tiamin-hidrokloridot, 2,5 mg/1 FeSO4x7 H2O-t és 0,2 g/1 habzásgátló anyagot tartalmaz kiegészítőként), majd a tenyésztést 28°C-on indítjuk, 1 kg/cm’G belső nyomás, 240 1/perc levegőztetési sebesség és 250/perc kevertetés mellett. Ha a tenyészetet körülbelül 450 Klett egységnyi turbiditásig növesztettük, akkor 10 mg/1 (42 μιηοΐ/ΐ) IPTG-t adunk hozzá. Mivel a megmaradó cukor mennyisége körülbelül 1%, egy 60 g/1 koncentrációjú glükózt és 15 g/1 koncentrációjú kazein hídrólizátumot tartalmazó oldatot adunk hozzá, és a tenyésztést további 40 óra hosszat folytatjuk. Ennek eredményeképpen 1,6 g/1 CS23 rhbFGF mutein halmozódik fel oldható formában. Az így kapott tenyészetet Sharpless centrifugával fugáljuk a nedves sejtek kinyerésére, majd a sejteket -80°C-on lefagyasztva tároljuk.EXAMPLE 9 1 L of LB medium containing 5 mg / L tetracycline hydrochloride was inoculated with 1 ml inoculum of the recombinant strain Escherichia coli MM294 (DE3) / pCM901 (IFO 15104, FERM BP-3168) and cultured for 8 hours. By shaking at 0 ° C. The entire volume is then transferred to 20 L of LB medium (5 mg / ml tetracycline hydrochloride) in a 50 L fermenter and cultured at 30 ° C with an internal pressure of 1 kg / cm 2 G with an aeration rate of 10 L / min. mixing at 300 rpm until turbidity of the culture reaches 700 Klett units. The total volume of the resulting culture was then transferred to 360 liters of fermentation medium (M-9 medium containing 15 g / l glucose, 15 g / l casamino acid, 16.8 g / l Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O, 3 g / l KH). Contains 2 PO 4 , 1 g / l NH 4 Cl, 0.5 g / l thiamine hydrochloride, 2.5 mg / l FeSO 4 x 7 H 2 O and 0.2 g / l antifoam) and culturing was started at 28 ° C with an internal pressure of 1 kg / cm @ g, aeration rate of 240 rpm and agitation at 250 rpm. If the culture was grown to about 450 Klett turbidities, 10 mg / L (42 μιηοΐ / ΐ) IPTG was added. Since the amount of sugar remaining is about 1%, a solution containing 60 g / l glucose and 15 g / l casein bridge lysate is added and the culture is continued for an additional 40 hours. As a result, 1.6 g / l of CS23 rhbFGF mutein accumulates in soluble form. The resulting culture was centrifuged in a Sharpless centrifuge to obtain wet cells and the cells were frozen at -80 ° C.
A kapott sejtekből 1 kg-ot a 7. példában leírt módon kezelünk, így kapjuk a CS23 tisztított rhbFGF mutein eredeti oldatát (25,0 g mennyiségben). Az oldat minősége azonos azzal, amit a 7. példában állítottunk elő, mind a biológiai aktivitás, mind a kémiai vizsgálatok alapján.1 kg of the resulting cells was treated as described in Example 7 to give a stock solution of purified CS23 rhbFGF mutein (25.0 g). The quality of the solution is the same as that obtained in Example 7, based on both biological activity and chemical assays.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33022589 | 1989-12-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202039D0 HU9202039D0 (en) | 1992-09-28 |
| HUT64593A true HUT64593A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=18230255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202039A HUT64593A (en) | 1989-12-19 | 1990-12-18 | Method for producing human fgf muteine |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0506963A1 (en) |
| JP (1) | JP3130313B2 (en) |
| KR (1) | KR920703789A (en) |
| CN (1) | CN1055009A (en) |
| CA (1) | CA2070989A1 (en) |
| HU (1) | HUT64593A (en) |
| WO (1) | WO1991009126A1 (en) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100374310B1 (en) * | 1995-02-14 | 2003-05-22 | 주식회사 엘지생명과학 | Modified human basic fibroblast growth factor and process for the production thereof |
| US6274712B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-08-14 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137 |
| JP4262979B2 (en) * | 2000-11-21 | 2009-05-13 | ザ・テキサス・エイ・アンド・エム・ユニバーシテイ・システム | FGF affinity chromatography |
| EP1926459B1 (en) | 2005-09-19 | 2015-01-07 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
| EP2083846B1 (en) | 2006-09-28 | 2015-07-15 | Hepacore Ltd. | N-terminal fgf variants having increased receptor selectivity and uses thereof |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| DE102021211272A1 (en) | 2021-10-06 | 2023-04-06 | Ruhr-Universität Bochum, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Composition containing artificial oxygen carriers to prevent organ damage in transplant organs |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0178863A1 (en) * | 1984-10-15 | 1986-04-23 | Schering Corporation | Novel expression systems utilizing bacteriophage T7 promoters and gene sequences |
| DE3723992A1 (en) * | 1987-07-20 | 1989-02-02 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR PRODUCING PROTEINS IN SOLUBLE FORM |
| JPH02504468A (en) * | 1987-11-24 | 1990-12-20 | アムジエン・インコーポレーテツド | Fibroblast growth factor analog |
| EP0326907A1 (en) * | 1988-01-26 | 1989-08-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptide, DNA and its use |
-
1990
- 1990-12-18 JP JP03501005A patent/JP3130313B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-18 CA CA002070989A patent/CA2070989A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-18 EP EP91900328A patent/EP0506963A1/en not_active Withdrawn
- 1990-12-18 HU HU9202039A patent/HUT64593A/en unknown
- 1990-12-18 KR KR1019920701470A patent/KR920703789A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-12-18 WO PCT/JP1990/001646 patent/WO1991009126A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-12-19 CN CN90110115A patent/CN1055009A/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920703789A (en) | 1992-12-18 |
| HU9202039D0 (en) | 1992-09-28 |
| JP3130313B2 (en) | 2001-01-31 |
| CN1055009A (en) | 1991-10-02 |
| EP0506963A1 (en) | 1992-10-07 |
| WO1991009126A1 (en) | 1991-06-27 |
| CA2070989A1 (en) | 1991-06-20 |
| JPH05503006A (en) | 1993-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0503297B1 (en) | GLIA activating factor and its production | |
| US5559093A (en) | N-terminally truncated hst-1 is a platelet-increasing factor | |
| US5851990A (en) | bFGF mutein and its production | |
| JPH05271279A (en) | Human parathyroid hormone mutein and its production | |
| HUT64593A (en) | Method for producing human fgf muteine | |
| EP0326907A1 (en) | Polypeptide, DNA and its use | |
| EP0373540A2 (en) | Method for purifying fibroblast growth factor protein | |
| US5639862A (en) | Deletion muteins of hst-1 | |
| US5395756A (en) | Production of acidic FGF protein | |
| EP0528271B1 (en) | Human parathyroid hormone muteins and production thereof | |
| JP2840441B2 (en) | Expression and processing of authentic FGF in yeast | |
| US5679550A (en) | Hst-2 muteins, pharmaceutical compositions and kits comprising same, and preparation of same | |
| JPH04164096A (en) | Afgf mutein, dna and use thereof | |
| JP3004788B2 (en) | Arginine deiminase expression vector, transformed microorganism and method for producing arginine deiminase | |
| EP0406738A2 (en) | Production of acidic FGF protein | |
| AU607129B2 (en) | Human basic fibroblast growth factor (hbFGF) and method of production thereof using genetic engineering techniques | |
| KR100535265B1 (en) | Process for preparation of polypeptides of interest from fusion polypeptides | |
| JPH0578398A (en) | Protein and its production | |
| JP3127246B2 (en) | Polypeptides, DNA and uses thereof | |
| CA2015313A1 (en) | Glycosylated fgf and production thereof | |
| JPH03184998A (en) | Hybrid protein, dna and use thereof | |
| JPH07126293A (en) | Hst-2 mutein, its production and its use | |
| JPH0541988A (en) | Production of rat bfgf protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |