HUT61884A - Method for producing foodstuffs additives - Google Patents

Description

Α találmány tárgya eljárás élelmiszerek és hasonló biológiai anyagok és adalékanyagok fagyasztása során jég krlstálygócok kialakítására.

Az élelmiszerek és hasonló biológiai anyagok fagyasztása során fontos, hogy minimalizáljuk a nagy jégkristályok képződését, mivel ennek általánosan káros hatása van az anyag szerkezetére vagy állapotára a felolvasztás után, ügy találták, hogy ha a fagyasztást nagyszámú jég kristályosodási góc jelenlétében végzik, akkor az összes jelenlevő víz kis kristályok formájában fagyhat meg. Azonban szigorú korlátozások vannak arra nézve, hogy milyen anyag adható az élelmiszerhez, ezért a Jég kristályosodási gócokat eleddig nem használták jelentős mértékben.

újabban Javasolták, hogy az élelmiszerekhez Pseudomonas syringiae sejteket adjanak, amelyek jégkrlstályosodási gócként működő természetes fehérjét tartalmaznak. Ez a mikroorganizmus széles körben elterjedt, és felelős növekedésben levő növények, például szőlő, eper, burgonya, paradicsom növények és hasonlók idő előtti megfagyásáért. Azt találták, hogy ha a P.syringiae sejtek jelen vannak az élelmiszerben a fagyasztás közben, akkor képesek elősegíteni Jég krlstálygócok kialakulását és kis jégkristályok képződését. Emellett a 4200226 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírásban leírják ennek a mikroorganizmusnak az alkalmazását a hókészitésben, míg a wo 63/03631 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés leírja bizonyos gazda mikroorganizmusok transzformálását a krlstálygóc fehérjét kódoló génnel, igy »4« 4 4 · · · ···

4 4 4 4 · állítanak elő olyan mikrobiológiai ágenseket, amelyekkel megakadályozzák a túlhűtést.

Azonban annak ellenére, hogy az élesztőket és más gombákat megfelelő gazdaszervezetnek gondoltak a fenti módszerekben, csak az E.colit és a természetes mikroorganizmusokat, például a P.syrlngiae-t említik. Tehát nem történik említés semmilyen gazdaszervezetről, amelyet a gyakorlatban alkalmazni lehetne megemészthető biológiai anyagok, például élelmiszer adalékanyagaként.

A P.syringiae a Pseudomonas nemzetségbe tartozik. A nemzetség egyes tagjai patogének, például a humán patogén P. aeruginosa. A P. syringiae néhány törzse is patogén bizonyos növényekre. Hasonlóképpen, az E.coll egyes törzsei is jól ismert humán patogének. Tehát a gyakorlatban nem használhatók élelmiszer adalékanyagként. Hég ha elpusztított sejtek formájában alkalmazzák is, akkor is mindig megvan a veszélye a nem teljes pusztításnak, majd a túlélő mikroorganizmusok elszaporodásának az élelmiszer tárolása és felolvasztása során, ezért ezek a mikroorganizmusok nem szerepelnek a GRAS-nak tartott mikroorganizmusok listáján (GRAS: Generally Regarded as Safe) (USA Code of Federal Regulations 21, 170-199-es rész, 1956 április), kiadja az

U.s. Government Printing Oflce.

A jelen találmány azon az elképzelésen alapul, hogy a P.syrlnglae-ből és más szervezetekből izoláljuk a Jég kristályosodási gócaként működő fehérje expresszálásáért felelős gént, majd ezt egy megfelelő vektorban alkalmazva az élelmiszerek, élelmiszer adalékanyagok és más emészthető

4 ·« · ·····

4··· • 4 · 4 · »·♦··· • · · · 44 biológiai anyagok szempontjából a GRAS listán akár éló, akár elpusztított formában szereplő egyik mikroorganizmus transzformálására használjuk.

A jelen találmány egyik tárgya tehát olyan adalékanyag, amely elősegíti a Jég krlstálygócok kialakulását emészthető biológiai anyagokban nulla fok alatti hőmérsékleten. A találmány szerinti adalékanyag egy fehérjét tartalmaz, amely képes az említett Jég krlstálygócok kialakulását elősegíteni, ahol a fehérjét olyan GRAS mikroorganizmusok, vagy ezek frakciói hordozzák, amelyek az említett fehérje expresszálására képes egy vagy több gént tartalmazó vektorral vannak transzformálva.

A jelen találmány tárgyai továbbá emészthető biológiai anyagok, amelyek a találmány szerinti említett adalékanyagokból egyet vagy többet tartalmaznak.

Az élelmiszerek, amelyeket előnyösen lehet kezelni a jelen találmány szerint, lehetnek zöldségek, gyümölcsök, hal, húsok, fagyasztott készételek, Jégkrém, fagyasztott gyümölcslé és fagyasztva szárított élelmiszerek.

A fontos gyógyszeripari termékek közé tartoznak a fagyasztva szárított anyagok éS vérfrakciók, úgymint krlopreclpitátumok.

A Jelen találmány tárgya továbbá eljárás a Jég krlstálygócok kialakulásának elősegítésére emészthető biológiai anyagokban, ami abban áll, hogy az anyagokat egy vagy több találmány szerinti adalékanyaggal kezeljük.

A Jelen találmány tárgya továbbá eljárás emészthető biológiai anyagok lefagyasztására, ami abban áll, hogy az

-5 anyagokat egy vagy több Jelen találmány szerinti adalékanyaggal kezeljük, majd a hőmérsékletüket a fagyás kiváltására lecsökkentjük. Ez a hőmérséklet előnyösen -5'C és -2O’C között van.

A GRAS szakkifejezést a továbbiakban a fentiekben említett U.S. Federal Regulations-ban megadott értelemben alkalmazzuk. Az ilyen mikroorganizmusok közé tartoznak például az élesztők, úgymint a Saccharomyces cerevislae vagy carlsberglensls, a tejsav baktériumok, úgymint a Lactococcus lactls, Lactococcus bulgarlcus, etc. az ecetbaktériumok, bizonyos fonalas gombák, például az Aspergillus faj.

A mikroorganizmusok alkalmazhatók ép sejt formájában, vagy azok frakciói formájában. Bizonyíték van arra, hogy a teljes sejtek hatékonyak akkor Is, ha a krlstálygóc képző fehérje a sejten belül van. Néhány esetben azonban előnyös lehet, ha feltárjuk a sejteket, és csak azokat a frakciókat használjuk amelyek az aktív fehérjét tartalmazzák, például a sejtfal fragmenteket.

A mikroorganizmusokat a célnak megfelelő vektorral transzformáljuk. Általában plazmldokat használunk, ha prokarlóta gazdaszervezeteket, például baktériumokat transzformálunk. Az élesztőket olyan plazmldokkal transzformálhatjuk, amelyeket úgy szerkesztünk meg, hogy az aktív géneket Integrálják a kromoszómálls DNS-be.

A Jég krlstálygóc fehérjét kódoló DNS-t természetben előforduló mikroorganizmusokból nyerhetjük ki, például P.syrlnglae-böl, P.f luorescens-ből, p.coronaf asclens-böl, Xanthomonas translucens-ből, vagy Erwinia herbicola-ból. Egy ·· ·· ·· ··· · • · · · · ··· · · ··· ··· • · · · · ·

-6másik módszer szerint a DNS-t a már megszekvenált gének, pl. IHAW [R.L. Green and G.J. Warren, Natúré,317, 545-546 (1965)] és INAZ [G.J. Warren et al., Nuclelc Aclds Research, 14(20), 6047-8060 (1966)] alapján szintetizálhat juk meg, vagy az alábbiakban ismertetett génszekvencia alapján.

Az izolált géneket megfelelő terminális restrikciós helyekkel láthatjuk el, ezáltal be tudjuk építeni a kiválasztott gazdaszervezetnek megfelelő vektorba.

Tehát ahol a kiválasztott gazdaszervezet élesztő, például YP42, egy alkalmas plazmld vektor a pDP34 (European Patent No. 69610297.5-), amely a pUC19 E.coli vektor megfelelően módosított változata, tartalmazza a teljes élesztő 2 mikronos plazmldot és két élesztőben szelekcióra alkalmas auxotróf markert, például az URA3 gént az élesztő könnyű transzformálása és a plazmld alacsony kópiaszámű szelekciója céljából, valamint a LEU2 gén dLEU2 alléljét az Indukált magas kópiaszám elérése céljából.

Hegjegyzendő, hogy biztosítani kell azt, hogy az inlcláclós kodon a gén első ATG trlplettje legyen, mivel az élesztő mindig az első megtalált ATG-ről indítja a transzlációt, és ha szükséges, akkor az igazi ATG-től 5' irányban levő összes ATG-t el kell távolítani.

A plazmidok ezután használhatók a megfelelő élesztő törzs transzformálására, a szelekciót az auxotróf markerek Jelenléte alapján végezzük.

Azt találtuk, hogy a fentiek szerint transzformált élesztő sejtek nem mindig termelik a Jég kristálygócképző fehérjét hozzáférhető formában, ezért előnyös, ha egy olyan • ·· ·· ·· · ··· ·····*·4 • ···· a · · ···· • · · 4 · ·· ··· ·· ·· ·· ···

-7éiesztő szignál szekvenciát alkalmazunk, amely a fehérjét a sejt felszínére irányítja. Ilyen szekvencia lehet például a PH05 szignál szekvencia [B. Wajeeh et al., Nuclelc Aclds Research, 12(20), 7721-7739 (1964)], vagy az alfa faktor pre-pro leader szekvenciája [J. Kurjan and I. Herskowitz, celi, 30, 933-943 (1962)]. Azt találtuk továbbá, hogy ha az alfa faktor leader szekvenciáját alkalmazzuk, akkor előnyösen egy linker szekvenciának kell lennie a pre-pro peptld és a kiválasztott gén között, például a természetes alfa faktorban levő 8 amlnosavböl álló linker.

Az is lehetséges, hogy a Jég krlstálygöc-képzö fehérjét a sejten belül egy specifikus sejtszervbe irányítjuk, Például a vakuolumba. Erre a célra a karboxlpeptldáz Y (CPY) pre-pro szekvenciája építhető be, mivel erről a fehérjéről Ismert, hogy a vakuolumban gyűlik össze.

A Lactococcus lactis egy különösen biztonságos és elfogadott élelmiszer fokozatú mikroorganizmus, például az LH0230 törzs. Egy ennek a mikroorganizmusnak a transzformálására alkalmas megfelelő plazmld a PSC12VN, amely tartalmazza a puciö E.coll vektort, a nem indukálható erltromicin rezisztencia gént a pVAö3ö plazmldből (1. irodalom, lásd alább), valamint a L,lactis plazmld replikáclós origó. Ehhez azonban a kiválasztott gén mellett egy promoter beépítésére Is szükség van. Azt találtuk, hogy a módosított tacll promoter különösen alkalmas erre a célra. Egy közvetlenebb megközelítése a L.lactis-ban való expresszlőnak egy L.lactls gén promoterének, például a Z26ö törzs foszfo-B-galaktozidáz gén promoterének alkalmazása (2.

irodalom).

1. [B.Brigltte et al„ Gene, 62, 249-261 (1968)]

2. [F.L.Macrina et al„ Gene, 19, 345-353 (1982)]

Az alábbi mikroorganizmusokat letétbe Helyeztük a National Culture of Industrlal and Maríné Organlsms-nál, (Aberdeen, Skócia), 1989. október 24-én, az alábbi letéti számokon:

S.cerevislae	YP42	NCIMB	40215
L.lactls	LMO23O	NCIMB	40216
E.coll	BZ234(PUC21ENA3)	NCIMB	40217

A fenti E.coll NCIMB 402217 törzset az alábbiakban bemutatott pUC21ENA3 plazmiddal transzformáltuk.

Az alábbi példákat csak illusztrálás céljából adjuk meg:

1. Példa

A jég krlstálygóc-képző Pseudomonasok Izolálása

A Nestlé Research Centre (Vers-chez-les-Blanc) szomszédságában levő erdőben leve növényekről körülbelül / · g levél és virág mintát gyűjtünk, majd egy steril 500 ml-es rázólombikba tesszük. 100 ml steril peptont (0.1X) és foszfát puffért (50 mmól, pH=7) adunk hozzá, majd 1 órán át 300/perc fordulatszámmal 30’C-on rázatjuk. A folyadékot eltávolítjuk, majd a sejttörmeléket és a baktériumokat centrif ugálással eltávolítjuk (10 000/perc, 5 perc). A felülüszöt elöntjük, majd az üledéket 10 ml pepton/foszfát pufferben szuszpendáljuk. Ebből 5 db 0.04 ml-es alikvot részt kiveszünk, és 40 yg/ml clkloheximlddel valamint 0.1Z cetrimlddel kiegészített Kings agarlemezekre szélesztjük, és

4 4 4 ·· 4 44 4

4 4 ·· ··· 4 · 444 44 4

4 4 4 44

-946 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A lemezek fontosak, meglehetősen Pseudomonas specifikusak (a ciklohexlmld elpusztítja a gombákat illetve a csírázó spóráit, a cetrimld pedig egy biológiai detergens, amely a legtöbb baktériumot elpusztítja, kivétel a Pseudomonasok).

A lemezek kétféle típusú telepet tartalmaznak. Az első kicsi és külön telepek hátterét képezi, míg ezen találhatok meg a második, nagyobb méretű telepek (emiatt nem lehet kijelenteni, hogy a nagy telepet nem fertőzi egy kisebb).

A lemezek közül kettőt megvizsgálunk, hogy hordoz-e általában jég krlstálygöc-képzO aktivitást (INA), olymödon, hogy a sejteket lemossuk a lemezről 5 ml pepton/foszfát pufferben, majd cseppfagyás tesztben vizsgáljuk. Ehhez szükség van egy parafinnal borított alumínium tálra (ezt úgy állítjuk elő, hogy szilárd paraffin 1 Z-os xilolos oldatát juttatjuk az alumínium felszínére, és hagyjuk a xilolt elpárologni). A táptalajról lemosott szuszpenziöböl 10 pl-es cseppeket teszünk ki az alumínium tálcára a megfelelő kontrollokkal együtt -9’C-ra, majd a fagyást vizsgáljuk. Mindkét táptalajról lemosott szuszpenziö reprodukálhatöan megfagy ilyen körülmények között 30 másodperc alatt, míg a kontrollok csak elszórtan fagynak neg, ha megfagynak egyáltalán. Ezt a vizsgálatot megismételjük a sokkal kritikusabb -5'C-os hőmérsékleten, aholis a táptalajról lemosott szuszpenzlök ismét gyorsan és reprodukálhatöan megfagytak, míg a kontrollok nem fagytak meg ezen a hőmérsékleten. Ez megerősítette az INA baktériumok Jelenlétét ezen a hőmérsékleten.

·· » ’ ·· ···· • · « · · ··· < · **· ··· • · · · · ·

-10A megmaradt lemezekről 300 különálló telepet veszünk le steril fogplszkálövai mlkrotiter lemezekre, majd szobahőmérsékleten növesztjük 3 napig. 10 μΐ-es cseppeket viszünk át egy többcsatornás pipettával egy paraflnnal borított alumínium tálcára, majd -5’C-ra helyezzük. Ezek közül 10 INA baktériumot azonosítottunk, az egyik gyenge aktivitással rendelkezett. Kettőt, az INA5 és INA7 baktériumot tiszta tenyészet formájában állítottuk elő, amit ügy állapíthatunk meg, hogy a sejteket különálló telepek formájában kiszélesztjük, majd véletlenszerűen leveszünk 50 telepet, és -5*C-on levizsgáljuk a Jég kristálygőc-képző aktivitásukat.

Standard minőségi cseppfagyasztási vizsgálat

ΙΟμΐ-es térfogatú cseppet elrendezünk egy paraflnnal borított alumínium tálca felszínén, majd egy előre meghatározott hőmérsékletű alkohol fürdő felszínére helyezzük. A tálcát egy perc múlva megvizsgáljuk, és a megfagyott cseppek számát feljegyezzük. Ezt az adott hőmérsékleten megfagyott cseppek százalékában fejezzük ki. A vízzel (A), MIT táptalajjal (B), M17 táptalaj plusz LHO23O a PSC12VN plazmiddal (C) és az H17 táptalaj plusz LM0230 a PDP135 plazmiddal (D) kapott eredmények összehasonlítását az

1. ábrán mutatjuk be, aholis a megfagyott cseppek százalékát az Y tengelyen ábrázoljuk, az X tengelyre felvitt hőmérséklettel (-»C) szemben.

Standard mennyiségi cseppfagyasztási vizsgálat

-11Ez G.Vall számításain alapul [J.Atmos.Scl., 2ö, 402-409 (1971)], amelyet a Jég krlstálygóc-képző anyagok mannylségl meghatározására dolgozott Ki. A standard vizsgálatban 1 ml tenyészetet veszünk, majd a sejteket 2 percig centrifugálva leülepítjük. A táptalajt elöntjük, majd a sejteket 1 ml TE pufferben szuszpendáljuk (TE: 10 mmöl TRISZ, 1 mmöl EDTA, pH=7.0). Sorozathlgítást készítünk egészen iO^-7-ig TE pufferben. Mindegyik hígításból 10 cseppet parafinnal borított alumínium tálcára plpettázunk, majd a tálcát előre meghatározott nulla fok alatti hőmérsékletű alkoholos vízfürdőre helyezzük. 3 perc elteltével meghatározzuk a megfagyott cseppek számát, valamint azt, hogy melyik hígításból származnak. az adott hőmérsékleten a jég Krlstálygócok számát Vall egyenletével számítjuk ki:

10^D

H(t)=ln (1-f) ahol N(t) Jelentése

Jég Krlstálygócok száma az adott hőmérsékleten;

f a megfagyott cseppek frakciója;

hígítás a sorozatban;

V a csepp térfogata ml-ben.

Ezt azután normallzáljuk a sejtkoncentrációra, és végül a kapott szám logaritmusa formájában fejezzük ki.

Ez egy kvantitatív számítás egy Jég krlstálygóc-képzö anyagra, és sor rendezett fagyásán alapul, azaz, ahogy a a hígítás!

hőmérséklet csökken először a hlgítatlan cseppek fagynak meg, majd a

10^-1-es hlgltásű cseppek, és így tovább. Ez nem könnyen használható a tiszta víz fagyásának a meghatározására, ami ·< ·«»»·

-12lényegében egy véletlenszerű folyamat. Innen származik a Kvalitatív vizsgálat ezekre a nem-Jég-krlstálygóc Képző anyagot tartalmazó oldatokra.

Kromoszómálls DNS Izolálása

100 ml Klng táptalajt oltunk be INA5-tel és INAT-tel, majd éjszakán át 30’C-on növesztjük. A sejteket lecentrifugáljuk (10 000/perc, 5 perc), majd a felülúszót elöntjük. A sejteket felszuszpendáljuk 5 ml 50 mmól TRIS, 50 mmól EDTA pH=ö.0 összetételű oldatban, majd 0.5 ml 10 mg/ml Koncentrációjú friss lizozlm oldatot adunk Hozzá (összetétele 250 mmól TRIS, pH=6.0), majd Jégen lnkubáljuk 45 percig. Ehhez 1 mi step oldatot adunk (0.5 x sds, 50 mmól TRIS pH=T.5, 0.4 mól EDTA és 1 mg/ml proteináz K) és 60’C-on lnkubáljuk 3 órán át. Ezt kétszer extraháljuk 7 ml 1:1 arányú f enol:klorof orm eleggyel, majd a fázisokat centrlfugálással elválasztjuk. 15 ml etanolt adunk Hozzá a DNS kicsapása céljából, majd a folyadékot óvatosan elöntjük. A DNS-t 5 ml 10 mmól TRIS pH=Ő.O, 10 mmól EDTA, 0.1 mg/ml RN-áz összetételű oldatban oldjuk, majd 60’C-on 2-3 órán át lnkubáljuk (ez egy összekapcsolt beoldás és RN-áz kezelés). A DNS-t ismét kicsapjuk 10 ml etanollal, és a DNS-t egy steril fogplszkálóra csavarva eltávolítjuk a csőből. Ezt a DNS-t 5 ml 10 mmól TRIS PH=7.5, 0.1 mmól EDTA összetételű oldatban oldjuk, így kapunk egy körülbelül 1 mg/ml koncentrációjú oldatot.

Az INA gén klónozása «V »·1·

-13Αζ ollgo 17 egy Kevert ollgonuKleotld, amely mind a P.syringiae-ben, [R.L.Green & S.J.Varren, Natúré, 317, 645-648 (1985)], mind a P.f luorescens-ben, [G.j.Warren et al„ Nuclelc Aclds Research, 14(20), 8047-8060 (1986)], az iNAZ-ben és az iNAW-ben megőrződött, és minden egyes esetben majdnem harmicszor Ismétlődő 8 amlnosavas motívum alapján Készült (lásd alább).

A	G	Y	G S	T Q T
Alá	Gly	Tyr	Gly Ser Thr Gin Thr
T	T	T	T T	T A	23 tagú
5' GCC	GGC	TAC	GGC AGC	ACC CAG AC	3'
G	G		G	G	1024 tagú KeveréK
A	A		A	A

AnalitlKal restriKclős emésztéseKet mind az INA5 mind az INA7 DNS-ével, majd a fragmenteKet agaróz géleleKtrof orézlssel elválasztjuk Ezt azután Zetaprobe nylon membránra visszük át, és radloaKtlvan Klnázolt Ollgo 17-tel hibridlzálJuK (T.Hanlatls et al., Molecular Clonlng. A Laboratory Hanual, Cold Sprlng Harbor, NY, 1982). Mosás után a szűrőt -70*C-on autoradlografáljuK 6 órán át erősítő fóliával. Az autoradlográfla mutatott némi hátteret, nem-speclflKus hibridizációt, de Jó JeleKet Is. Először is, az INA5 és az INA7 azonosaK. A fragment-méreteK a KövetKezőK (az INAZ zárójelben van); Sac 7Kb (?), Sac+BglII 6Kb (3.4 Kb), Bglll 16-19 Kb (nagyon nagy!), BglII+EcoRI 5 Kb (5 Kb), •u »4·· ··»··«· · • ··· · · ··> ··« • · » · 4 · · ··· ·· ·· ·· ···

-14ECORI 9 Kb (23 Kb), EcoRI+Pvu 7kb (3.5 Kb), Pvul 6Kb (?) és a Sáli 1 kb (1 Kb). Tehát, Jóllehet az EcoRI-BglII valamint a Sáli fragmentek azonosak, a legtöbb más restrikciós emésztés más Képet mutat.

Elhatároztuk, hogy az 5 kb méretű BglII+EcoRI fragmentet egy pUC vektorba klónozzuk, majd Oligo 17-tel vizsgáljuk át. 60 pg INA5 DNS-t emésztünk BglII és EcoRl restrikciós enzimekkel, majd a fragmenteket egy o.7Z-os agaróz gélen elválasztjuk. A 4.4-5.5 Kb méretű fragmentet tartalmazó területet kivágjuk a gélből és elektroeluáljuk. Ezt az elegyet klónozzuk a pUC2i plazmldba [ez egy pUC19 alapú plazmid C.Yanlsh-Perron et ai., Gene, 33, 103-119 (1965), egy alternatív klónozó tömbbel, amelyet a BamHI-SacI restrikciós enzimekkel emésztett emésztett pUC19-be klónozott szintetikus oligonukleotidokkal állítottak elől az alábbiak szerint (A lacZ gén érett amlnosav szekvenciáját a felső sorban mutatjuk; a DNS szekvencia és a komplementer szál a két középső sorban látható; a restrikciós enzim felismerési helyek az alsó sorban láthatók. A szintetikus ollgonukleotidokat nagybetűvel ábrázoljuk.):

β

Thr

Met

Ile

Thr

Pro

Ser

Leu

Hls

Alá

Cys

Arg

Ser

Thr

5'atg

acc

atg

att

acg

cca

agc

ttg

cat

gcc

tgc

agg

tgc

act

3'tac

tgg

tac

taa

tgc

ggt

tcg

aac

gta

cgg

acg

tcc

acg

tga

<Hind3x

Sphl

X

PstI

X

Sál

>

Leu

Glu

ASP

Pro

Arg

Val

Pro

Alá

Leu

Alá

Asp

Leu

Ser

Arg

Ser

cta

gag

GAT

CCA

CGC

GTG

CCG

GCG

CTA

GCA

GAT

CTC

TCG

AGG

AGC

gat

ctc

cta

gGT

GCG

CAC

GGC

CGT

GAT

CGT

CTA

GAG

AGC

TCC

tcg

Xbal χ BamHI xHluI x Nael >< Nhel >< BglIIx Xhol x SacI

Ser	Asn	Ser	Leu
Tcg	aat	tea	ctg	3
agc	tta	agt	gac	5

<EcoRI>

Példa llgálás

0.4 pmól (1 pl) BglII - EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett pUC21, 1.5 pmól (3 pl) tisztított BglII - EcoRI INA5 fragment, 13 pl TE puffer,

Jól összekeverjük egy centrlfugacsöben, majd 2 percre 56’C-ra melegítjük. Hozzáadunk 2 pl 10 x T4 ligáz puffért [660 mmól TRIS PH=7.5; 50 mmól HgCl₂; 50 mmól dltiotreitol (DTT); 10 mmól adenozin-5'-trlfoszf át (ATP); 200 pg/ml szarvasmarha szérum-albumin (BSA)], 1 pl = 1 egység T4 DNS ligázt. Jól összekeverjük, és 3-4 órán át 4’C-on inkubáljuk. Példa E.coll kompetens sejtekre

100 ml YT táptalajt (ö g/1 Bacto tryptone; 5 g/1 Bacto Yeast Extrect; 5 g/ml Náci) BZ234 sejtek friss, éjszakán át növesztett tenyészete 1 ml-vel beoltunk.

A tenyészetet addig inkubáljuk 37’C-on, amíg az ODgoo érték el nem éri a 0.4-es értéket. A sejteket centrifugában ülepítjük (10 OOO/perc, 5 perc). A felülúszót elöntjük, és a sejteket azonos térfogatú steril 50 mmólos CaClg-ban szuszpendáljuk 4’C-on. Jégen inkubáljuk 20 percig. A sejteket centrifugálással ülepítjük (10 OOO/perc 5 perc). A felülúszót elöntjük, és az eredeti térfogat 1/10-ét kitevő térfogatú 50 mmól CaClg; 29 7. glicerin összetételű oldatban szuszpendáljuk.

Ezek az E.coll sejtek kompetensek, és vagy azonnal felhasználhatók, vagy -70’C-on tárolhatók a későbbi felhasználás céljára.

Transzformálás

A kompetens sejtekből egy 100 yl-es alikvot részt előre hűtött steril üvegcsőbe helyezünk.

A fenti ligálási reakcióelegyet adjuk hozzá, Jól összekeverjük, majd 20 percig Jégen inkubáljuk. 2 percre 42’C-ra melegítjük.

Ezeket a sejteket azután közvetlenül rátehetjük a szelektív tápagarra (például az ampiclllines szelekció esetében), vagy hozzáadunk 500 yl YT táptalajt és 37’C-on t

inkubáljuk 2 órán át (mint például a kanamlcines és erltromicines szelekció esetében).

*··· ···· ··· • · · · · ·

-17Ezekről a szelektív transzformációs lemezekről ő míkrotíter lemeznyl telepet (766) Izolálunk. Ezeket Zetaprobe nylon filterre replikázzuk, amelyet amplcllllnnel kiegészített YT agarlemezre helyezünk, majd éjszakán át 37»c-on inkubálunk. A telepeket közvetlenül a szűrőn lizáljuk el, majd radioaktivan klnázolt Ollgo 17-tel hlbrldizáljuk. Mosás után a filtereket autoradiografáljuk szobahőmérsékleten 45 percig, így azonosítjuk a 10 hlbridizálódó kiónt:

ENA = E.coli

Lemez jég kristálygóc

Pozíció képző aktivitás

ENA ö

FI

F2

H9

D5

F6

A3

Cö

C5

E10

B1 ö

0

Az összes említett telepről Igazolható hogy fagyást okoz -5*C-on, általában 20-30 másodpercen belül, míg a kontrollok egyáltalán nem okoznak fagyást 10 perc elteltével sem. Mind

-iő a 10 klónból izolálunk klsmennyiségfl DNS-t, majd a DNS-t EcoRI és Bglll restrikciós enzimekkel emésztjük (a gén klónozására használt enzimek, amelyek hatására egyetlen 4.5 kb méretű inszert és a 2.7 kb méretű plazmld vektor keletkezését kell látni). Az ENA4 és ENA10 két inszert csíkot mutattak, ezért félretettük. Az analitikai emésztések kimutatták, hogy az ENAi és az ENA6 plazmidok keverékét tartalmazzák. Az adatok alapján az ENA3-at választjuk a további analízis céljára. A PUC21/ENA3 plazmld térképét a kísérő rajzok között a 2A ábrán mutatjuk be; a 2B ábra az ENA3 gén restrikciós térképét mutatja.

Kiindulásként elkészítjük az ENA3 plazmld alapos restrikciós térképét. Ez lényeges, de nem teljes homológiát mutatott az ENA3 ínszert és a Pseudomonas syrmgiae-bői származó INAZ gén között. A restrikciós térképet használjuk az ENA3 inszert extenzív szubklónozására, majd ezt követően ezeknek a szubklónoknak a DNS szekvencia analízisére.

A teljes Bglll-EcoRI fragmentet megszekvenáljuk; 4446 bp-t tartalmaz, azaz 12 bázispárral rövidebb mint a publikált INAZ gén. Van benne két minor (1 nukleotidot érintő) inszerció/deléció, mindegyik a fehérje kódoló

szekvencián	kívül. Ezek a következők: egy G lnszerció az INA
génben az	594-es bázispárnál, valamint egy nukleotld

deléciója a 4396-os bázispárnál. Egy fontosabb deléció fordul elő az llőő-1179-es bázispárok között, ez 12 bázispárra terjed ki, és nem rontja el a fehérje leolvasási keretet (4 aminosavas deléció). Ez a négyszer ismétlődő AACGCC szekvenciában fordul elő. Legvalószínűbb, hogy ezek

az ismétlődések a felelősek a deléclóért.

A két P.syrlnglae szekvencia egy körülbelül 93Z-os általános homológiát mutat (az UWGCG Bestfit programjával meghatározva) DNS szinten, a változások zöme a szokásos T->C és G->C csere. Fehérjeszinten a homológia körülbelül 9őZ-ra emelkedik. A változás 4 aminosav deléciőja plusz 37 aminosav szubsztitúciója, ezek közül csak 13 konzervatív.

2. Példa az ENA3 kifejezése élesztőben

Az ENA3 Jég kristálygóc képző gén élesztőben való expressziójának egy fontos első lépése a két ATG triplett eltávolítása, amelyek közvetlenül (14 bp illetve ő bp) a valódi ATG triplett előtt találhatók. Erre azért van szükség, mert az élesztő mindig a mRNS lnlciácó utáni elsőként megtalálható ATG triplettet használja, ennek eredménye egy 4 aminosavból álló fehérje lenne, amely túl kicsi ahhoz hogy Jég kristálygóc fehérjeként működjön. Egy második megfontolandó dolog hasznos restrikciós hasítási helyek beépítése, hogy ezzel segítsük az élesztő promoterek és/vagy szignál szekvenciák beépülését.

ENA3-ter előállítása

Az ENA3 plazmldot EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a túlnyúló 5' véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt követően BglII és Pvul restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a DNS fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk egymástól. A 4.5 kb méretű fragmentet kivágjuk, majd elektroeluáljuk. A

-20pUC21/LYS2-term2 plazmid (R.D. Prldmore közöletlen eredmények) egy olyan E.coli pUC21 vektor, amely az élesztő LYS2 bldirekciós termlnátorát tartalmazza [U.N.Fleig et al., Gene, 46, 237-245 (1966)]. Ezt a plazmidot Nliel restrikciós enzimmel emésztjük, majd az 5' túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük (Manlatls et al). Ezután PstI enzimmel emésztünk, és a fragmenteket 2Z-os agaróz gélen elválasztjuk. A 190 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a két fragmentet elegyítjük PstI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pK19 vektorral [R.D.Prldmore, Gene, 56, 309-312 (1967)], majd összellgáljuk. A transzformánsokat először megvizsgáljuk, van-e Jég kristálygóc- képző tulajdonságuk. Ezek közül az egyiket restrikciós enzimes analízissel tovább vizsgáljuk, hogy megerősítsük, hogy ez a pK19/ENA3-term plazmid, melyet a kísérő rajzok között a 3A ábrán mutatunk be. A 3B ábrán az ENA3-term restrikciós térképét látjuk, amelyen LYS2 T az élesztő bldirekcionális termlnátorát Jelenti.

Ezt a plazmidot AatlI és sacl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az 5 kb méretű fragmentet gélen tisztítjuk és defoszforilezzük (Manlatls et al.). Ezt a fragmentet azért állítjuk elő, hogy elfogadja a későbbi promoter-ENA3 5' konstrukciókat.

A PDP105 előállítása

A PDP105 előállítása magába foglalja a Taql restrikciós helyen induló DNS fragment előállítását, (körülbelül ö bp-ral az ENA3 gén ATG triplettje előtt) az Sphl restrikciós ·· ·· ·· ···· • · · · · ···· · ··· ··· • · · · · · helyig (+165 bp). Az ATG-től az ENA3 génnek a Taql restrikciós helyéig terjedő DNS szekvenciáját szintetikus oligonukleotidokkal helyettesítjük, amelyek az ATG mellett új restrikciós hasítási helyeket (EcoRI és Ndel) is szolgáltatnak.

Az EC1 plazmld egy ENA3 szubklón, amely az ATG-t és a promotert tartalmazó Sphl fragmentet hordozza. Az EC1 plazmidot Sphl és Taql restrikciós enzimekkel emésztjük, a fragmenteket 2Z.-os agaróz gélen elválasztjuk, majd a 180 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a fragmentet a 124-es és 125-ös szintetikus ollgonukleotlddal keverjük össze majd az Sphl és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 klónozó vektorba klónozzuk. A helyes inszertet tartalmazó plazmldokat restrikciós elemzéssel azonosítjuk, majd DNS szekvencia analízissel megerősítjük a szerkezetüket. Ez az EcoRI és Ndel restrikciós helyet 5' irányban helyezi el, az ATG-vel átfedően.

Az ENA3 gén ATG körüli DNS szekvenciája, a Taql restrikciós hasítási hellyel együtt:

Taql

175 bp

5' ATGCTGTAATGAATATCGACAAA 3'-------- - 3' TACGACATTACTTATAGCTGTTT 5'

Sphl ·· ·· *« ···♦ • β · t> · ··· · · ··· ··· • · · · · ·

-22A linkenként használt oligonukleotidok DNS szekvenciája:

<NdeI> Taql <EcoRI>

5'AATTCATATGAATAT 3'

3' GTATACTTATAGC 5'

A GAPDH promoter hozzáadása

Két GAPDH promoter konstrukciót készítünk és vizsgálunk meg. A teljes GAPDH gént tartalmazó 2 kb méretű Hindin fragmentet [J.P.Holland &M.J.Holland, The Journal of Blologlcal Chemlstry, 256(19), 9639-9645 (1979)] a Ciha Geigy szolgáltatta. A gént HindlII restrikciós enzimmel kihasítjuk, majd a pK19 E.coli vektorba visszük át. Két deléciót készítünk a promoter lerövidítésére, a plazmldot Smal restrikciós enzimmel emésztve (ezzel a pK19 linker szakaszába hasítunk), majd SnaBI (424 bp) vagy Sspl (645 bp) enzimekkel emésztve, mindegyik enzimmel kompatibilis tompa végeket kapunk, mindegyik önmagával összellgálható. így kapjuk a 600 illetve 400 bp hosszúságú promotereket a pK19/GAPDH-dSna illetve a pK19/GAPDH-dSsp plazmidokban.

A dSna és dSsp promotereket a kővetkezőképpen izoláljuk. A plazmldokat AsuII restrikciós enzimmel emésztjük, majd az 5' túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután SacI restrikciós enzimmel emésztjük, és a termékeket ÍZ agaróz gélen választjuk el. A megfelelő méretű DNS csíkokat kivágjuk, és a DNS-t elektroelúcióval kinyerjük a géldarabból.

• · · · ·· ♦··· • · · t · ···· ···· ··· • · · * · ·

-23A pDP105 plazmldot EcoRl restrikciós enzimmel emésztjük, és a túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután Sphl restrikciós enzimmel emésztjük, és a fragmenteket 2Z-os gélen elválasztjuk. A megfelelő 200 bp méretű fragmentet kivágjuk a gélből és elektroeluáljuk.

A pDP105 ENA3 5' DNS fragmentet a két promoterhez ligáljuk párhuzamosan a pUC19 E.coll vektorba, amelyet sacl és Sphl restrikciós enzimekkel emésztettünk. Tgy kapjuk a PDP106 (dSsp) és pDP107 (dSna) plazmldokat.

A pDPlOö és PDP107 plazmldokat Sphl és Sacl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. Az 550 bp és 750 bp méretű fragmenteket kivágjuk a gélből és elektroeluáljuk. Az ENA3 plazmldot AatlI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. Az 1.3 kb méretű fragmentet kivágjuk a gélből és elektroeluáljuk. Ezt az ENA3 5' 1.3 kb AatlI - sphl fragmentet külön-külön elkeverjük a PDP106 és pDP107 izolált f ragmentekkel, valamint az előzetesen elkészített pK19/ENA3-term AatlI -Sacl 5 kb méretű fragmenttel, és összellgáljuk. Ebből azonosítjuk a pDPlOő illetve a pDP109 plazmldokat.

GAPDH/CAT promoterek

A promotereknek egy második sorozatát is előállítottuk, amelyek szintén egy E.coll promotert tartalmaznak az élesztő GAPDH promotere és az ENA3 gén között. Ezt azért csináljuk, hogy megkönnyítsük a konstrukcióink aktivitásának vizsgálatát élesztőbe való transzformálás előtt.A Tn9 • · ·· » · ···· • · · · f ··♦ · ···· ··· • · · · · · kloramfenikol rezisztencia gén E.coli promoterét választjuk [N.K.Alton & D.Vapnek. Natúré, 262, 664-669 (1979)], Emellett, Hogy elkerüljük felesleges E.coli szekvenciák beépülését a konstrukcióba, a promotert megszlntetizáljuk és linkerként alkalmazzuk a GAPDH promoter és az ENA3 gén között, az alábbiak szerint:

GAPDH ENA3 promoter gén

AsuII EcoRI Ndel ö'ttCGAATTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGaattcatatig 3' 3'aagCTTAAAAACTCAATAGCTCTAAAAGTCCTCGATTCCTTAAgtatac 5'

A nagybetűk a szintetizált nukleotldokat jelzik, a felső szál az Oligo 141, az alsó szál az Oligo 142. Ezeket az oligonukleotldokat szokásos módon tisztítjuk, majd leszárítjuk, és 300 pikomói per mlkroliter koncentrációban feloldjuk. Mindegyik ollgonukleotidból

300 plkomólt 10 pl térfogatú hibridizációs pufferben (150 mmól NaCl,

100 mmól

TRIS pH = 6.0, 1 mmól EDTA) keverünk össze.

Az elegyet 5 percre 95»C-ra melegítjük, majd éjszakán át 55’C-on inkubáljuk, hogy a két komplementer oligonukleotld hibridizáiódjon.

A kővetkező DNS fragmenteket is pK 19/GAPDH -dSsp és -dSsna plazmidokat izoláljuk.

AsuII és Sacl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 400 bp és 600 bp méretű fragmenteket kivágjuk a gélből, majd elektroeluáljuk. A pDPlOö plazmldot ·« ·β ······ * ♦ · ·t «·· «. · · ·« ··· * · · · «4

-25EcoRI és AatlI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az 1.5 kb méretű DNS fragmentet Izoláljuk a gélből. Ezt az

1.5 kb méretű pDPlOő f ragmentet külön-külön összekeverjük a két

AsuII-SacI

SacI-AatlI

GAPDH f ragmenttel, a pK19/ENA3-term 5 kb tisztított fragmenttel, valamint az AsuII-EcoRI linkeméi (CAT promoter), éS összellgál juk.

transzformánsokat mind klsmennylségű DNS preparátumok restrikciós analízisével, mind Jég krlstálygőc vizsgálattal, mind DNS szekvenálással megvizsgáljuk. Ezek a vizsgálatok pontosan egyeztek, így kaptuk a pDOUO (dSsp) és pDPill (dSna) plazmldokat.

élesztő expressziős plazmldba való átvitel

Az ezeknek a konstrukcióknak a levizsgálására használt élesztő expresszlős plazmldot a Ciba-Geigy Blotechnology

Department-től kaptuk. Ez a

PDP34-Xho plazmld (a pDP34 plazmldot lásd a 59010297.5 számú európai szabadalmi bejelentésben) .

Az Xho módosítás azt Jelenti, hogy a pDP34-et Sacl és

BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pUC21 készítésében használt oligonukleotidot adjuk hozzá) , amely a pUC19 E.coll plazmidből, a teljes E.coll 2 mikronos plazmidből és két élesztőben szelektálható auxotrófla markerből áll. Az első az URA3 gén, a plazmld élesztőben való könnyű transzformálása és alacsony kőplaszámban való szelektálása céljából, a második a LEU2 gén dLEUZ alléi Je, az indukált magas kőplaszám elérése céljából.

A pDP34-Xho plazmldot

Sacl és

Miül restrikciós enzimekkel emésztjük. A pDPlOő, 109, 110 és

111 plazmldokat • · · « * ·· ···« ··*·*·« · * ··· « «·«· ··· • · · · · · · is megemésztjük a SacI és Miül restrikciós enzimekkel. A pDP34 plazmidot egyenként összeligáljuk a négy emésztett plazmiddal, majd E.coliba transzformáljuk. A transzf ormánsokat amplcillln tartalmú táptalajon szelektáljuk, a pDP34 plazmld kiválasztása céljából. A restrikciós elemzés alapján azonosítottuk a PDP112 plazmidot (a pDP106-ból tartalmazza az ENA3 konstrukciót), a PDP113 plazmidot (109), a pDP114 plazmidot (110) és a pDP115 (111) plazmidot. A PDP114, PDP115 és pDP34Xho plazmldokat a 4A, 5A és 6. ábrákon mutatjuk be, a kísérő rajzok között. Az ENA-110 (a pDP110-ből) és ENA Ili (a pDPlll-ből) restrikciós térképeit a 4B. és 5B. ábrákon mutatjuk be, aholls P Jelentése promoter, T Jelentése terminátor.

élesztő transzformálás

Az élesztő sejteket egy éjszakán át növesztett tenyészetből oltjuk YPD táptalajra (ÍZ Bacto-yeast extract,

27. Bacto-peptone, 27. dextróz), majd éjszakán át növesztjük 3O*C-on.

A tenyészetet az ODgoQ=2.0 elérésekor leállítjuk.

A sejtszuszpenzióból 50 ml-t lecentrifugálunk (3000/perc, 5 perc).

A felülúszót elöntjük, és a sejteket 50 ml TE pufferben mossuk.

A sejteket 20 ml 1 mólos lltium-acetát oldatban szuszpendáljuk (TE-ben).

percig enyhe rázatás közben 30’C-on lnkubáljuk.

A sejteket lecentrifugáljuk (3000/perc, 5 perc).

··

-27A felülúszőt elöntjük, majd a sejteket 1 ml 1 mólos LiOAc-ban szuszpendáljuk.

200 μΐ kompetens sejthez 1 pg DNS-t adunk.

percig 3O*C-on inkubáljuk.

ml 5OZ-os PEG oldatot adunk hozzá (TE pufferben).

összekeverjük, majd 60 percig 30’C-on inkubáljuk.

öt percig 42’C-on tartjuk (hősokk).

A sejteket mlkrofugában ülepítjük (5 mp-es forgatás).

A felülúszőt elöntjük.

A sejteket 300 pl 600 mmólos szorbltban szuszpendáljuk, és szelektív lemezekre visszük ki.

Az EHA3 gén expressziója élesztőben

A PDP112, PDP113, pDP114 és pDP115 plazmidokat az YP42 törzsbe transzformáljuk (Genotípus: a, ura3-52, hls4-580, leu2), a fentiek szerint. A transzformánsokat hisztidinnel (20 mg/liter) és leucinnal (30 mg/liter) kiegészített SD minimál táptalajon szelektáljuk (0.67Z. Bacto-yeast nitrogén alap aminosavak nélkül, 2Z dextróz) 30'C-on. A transzformált telepeket ugyanarra a szelektív táptalajra szélesztjük ki kétszer, hogy a transzformánsokat megtisztítsuk. Az egyes plazmid konstrukciókat hordozó telepeket használjuk arra, hogy YPD táptalajt oltsunk velük, majd 37'C-on növesztjük rázatás közben. A növesztést a korai lóg fázisig folytatjuk (ODgQQ= kb. 0.1), majd a sejteket ülepítjük, stb. Az YP42 plus pDP114 és pDP115 plazmid Jég krlstálygócképző spektrumát a 7. illetve a 8. ábrán mutatjuk be, a kísérő rajzok között. Ezek az ábrák a Jég krlstálygóc/sejt ·♦ *· ·4«**| • » · « ·· ··· · · ······ • · · i ·· logaritmusát ábrázolják az Y tengelyen a túlhűtés (-‘C) függvényében az YPD táptalajra (o).

Az YP42 plusz pDP114 illetve pDP115 plazmidokat SD2 táptalajban is növesztjük (0.67. Bacto-yeast nitrogén bázis amlnosavak nélkül, plusz 0.5 7. kazaminosav, 27. dextröz és 50 mmól nátrium-citrát pH=6.0) 30’C-on kevertetés közben. A megfelelő fagyasztási spektrumot az SD2 táptalajra a 7. és ö. ábrán mutatjuk be a kísérő rajzok között (·).

A PDP140 előállítása

A pDP133 plazmidot a későbbiekben írjuk le. Ezt a plazmldot Miül és SacI restrikciós enzimekkel emésztjük, összekeverjük az Miül és SacI restrikciós enzimekkel emésztett pD34Xho plazmiddal, majd ligáljuk. Ezt a llgátumot transzformáljuk kompetens E.coli sejtekbe, majd a transzformánsokat amplcilllnnel kiegészített YT lemezeken szelektáljuk. A telepeket a fagyási próbával és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáljuk át, így kapjuk a PDP140 plazmidot, amelyet a kísérő rajzok között a 9A. ábrán mutatunk be. A 9B. ábra mutatja az ENA-133 (a pDP133-ből) restrlkciős térképét, amelyben P jelentése promoter, T jelentése termlnátor.

A pDP140 plazmidot a fentiek szerint transzformáljuk YP42 sejtekbe. A telepeket SD2 táptalajban tenyésztjük 30’C-on kevertetés közben. Az YP42 plusz pD140 plazmld fagyási spektrumát a kisérő rajzok között mutatjuk be a 10. ábrán, aholls a (jég krlstálygóc képző sejtek) logaritmusát • ·· ·« e*·· • ··· · · ··· ··« • · · · · · «

-29ábrázoljuk a tűlhűtés függvényében (-’C).

Az UBI4 promoter elkészítése és hozzáadása

A kiindulási anyag a Clba Gelgy féle KS+/UBI4 plazmld, amely az UBI4 gént tartalmazó S2Ő6C vad típusú élesztő törzsből Izolált 6 kb méretű genomlálls SacI fragmentet tartalmazza [E.Ozkaynak et al., The EHBO Journal, 6(5), 1429-1439 (1967)] a Bluescrlpt KS+ plazmld SacI helyére klónozva (Stratagene Clonlng Systems, USA). A KS+/UBI4 plazmldot Hindin és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük, a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk, az 1 kb méretű csíkot kivágjuk és elektroeluáljuk. A Bluescrlpt SK+ plazmldot (Stratagene Clonlng Systems, USA) HlndlII és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük. A két DNS fragmentet összekeverjük, llgáljuk, majd a llgáló eleggyel kompetens E.coll sejteket transzformálunk. A transzf ormánsokat amplcilllnnel kiegészített YT lemezeken szelektáljuk, plazmld DNS-üket restrikciós enzimes emésztéssel analizáljuk, és a BA1 plazmldot azonosítjuk. A BA1 plazmldot tartalmazó E.coll törzset az M13/KO7 helper fággal fertőzzük a Stratagene instrukciók szerint, majd a BA1 egyszálú formáját kinyerjük a felülúszóból. Ezt tisztítjuk a további felhasználás céljából.

Az UBI4 promotert oligonukleotiddal irányított helyspecifikus mutagenezlssel módosítjuk, hogy egy EcoRV restrikciós hasítási helyet építsünk be közvetlanül az UBI4 gén ATG trlplettje elé az alábbiak szerint:

• ·*« 4ν· • » · · « · ··· · · ··· ·«« ·· ·· ···

-305' actttaactaatagattATGcagattttcgtcaa 3'

3' AACTAATAGATATCGCAGATTTTCG 5' <EcorV>

ahol a felső szekvencia a genomiális UBI4 gén az ATG triplett körül (nagybetűkkel jelezve), míg az alsö szekvencia a mutagenezisre használt Ollgo 166 (nagybetűkkel) (az új EcoRV restrikciós helyet alul jelöljük). A mutagenezist a gyártó előírásai szerint végeztük (Ollgonucleotlde-dlrected in vitro mutagenesis system, Version 2, Amersham, Anglia). A transzformánsokat amplcilllnnel kiegészített YT lemezeken szelektáljuk, az EcoRV restrikciós enzimmel emésztve vizsgáljuk, majd az SK+/UBI4-EcoRV plazmldot azonosítjuk.

A pDPlOő plazmldot Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, majd a túlnyúló véget Klenow enzimmel töltjük fel. Ezt azután AatlI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen választjuk el. Az 1.5 kb méretű DNS fragmentet kivágjuk a gélből és elektro-eluáljuk. A PGEH7 plazmid vektort (Promega, USA) Hindin és AatlI restrikciós enzimekkel emésztjük. A pGEMT vektort, az UBI4 promotert és a pDPiOő 5' ENA3 DNS fragmentet összekeverjük, és összeligáljuk. Ezzel a ligáié eleggyel transzformálunk kompetens E.coll sejteket, majd amplcilllnnel kiegészített YT lemezekre szélesztjük. A transzformánsokat elemezzük, és a BF1 plazmldot azonosítjuk.

A BF1 plazmldot SacI és AatlI restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáljuk, a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk, és 2 kb méretű fragmentet elektro-eluáljuk.

-31Ezt elegyítjük a korábban leírt 5 kb méretű pK19/INA3-term, SacI-AatlI tisztított és defoszforllezett fragmenttel, llgáljuk, majd kompetens E.coli sejtekbe transzformáljuk. A transzformánsokat kanamlclnnel kiegészített YT lemezeken szelektáljuk, majd restrikciós enzimes elemzéssel, fagyasztással és DNS szekvenálással elemezzük, igy kapjuk a PDP120 plazmldot. A pDPilö ENA3 inszertjét ezután a pDP34 élesztő expresszlós vektorba visszük át, igy kapjuk a pDP120 plazmldot. A pDP120 plazmid a kísérő rajzok között a 11A. ábrán látható. A 11B ábrán az ENA-116 (pDPllö-ból) restrikciós térképét látjuk, ahol P Jelentése promoter, T Jelentése terminátor.

A PDP12O plazmldot a fentiek szerint Y42 sejtekbe visszük át. A telepeket SD2 táptalajon növesztjük 3O*C-on, rázatás közben. Az Y42 plusz pDP12O fagyási spektrumát a kísérő rajzok között a 12. ábrán láthatjuk, aholls a (Jég krlstálygócképző sejtek száma) logaritmusát ábrázoljuk a tülhűtés függvényében.

Az ENA3 gén irányítása az élesztő sejtben

Hogy megjavítsuk a Jég krlstálygócképző fehérje lokallzáltságát, és ezáltal fenotlplkus expresszióját, olyan konstrukciókat készítettünk, amelyekben a természetes élesztő szignál szekvenciát az ΞΝΑ3 fehérje amino terminálisához füzlonáltatjuk. Kettőt választottunk, a PHO5 szignál szekvenciát [B.WaJeeh et al., Nuclelc Acids Research, 12(20), 7721-7739 (1964)], valamint az alfa faktor pre-pro leader szekvenciát [J.Kurjan & T.Herskowitz, Cell,

-3230, 933-943 (19Ő2)].

ΡΗ05 szignál szekvencia

A PH05 szignál szekvenciát két, linkerként is működő komplementer oligonukleotld szintézisével állítjuk elő, amely emellett az alábbi, szükséges amlnosav szekvenciát is

tartalmazza jelöljük):	(a	szintetikus	ollgonukleotldokat	nagybetűkkel
	«	» K M	M « * «
EcoRI met	phe	lys ser val	val tyr ser lle leu ala	ala

5' gAATTCA ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT 3' CttaaGT TAC AAA TTT AGA CAA CAA ATA AGT TAA AAT CGG CGA szignál hasítási hely

I ser leu ala asn ala gly MET

TCT TTG GCC AAT GCA GGt atg 3' ENA3 gén

AGA AAC CGC TTA CGT CCA Tac 5'

A felső oligonukleotld az ollgo 174 (59 tagú), az alsó az ollgo 175 (57 tagú). Ezt a két ollgonukleotldot összekeverjük hozzávetőlegesen ekvlmolárls mennyiségben, majd magas sótartalmú oldatban hlbrldlzáljuk. A hlbrldlzálódott ollgonukleotldokat a következő tisztított

-33fragmentekkel keverjük össze: a korábban leírt pK19/ENA3-term 5 kb, SacI és AatlI restrikciós enzimekkel emésztett, gélen tisztított és defoszforllezett fragment; valamint az 1.45 kb méretű Kdei és AatlI restrikciós enzimekkel emésztett és gélen tisztított pDPlll fragment. Ezeket ligáljuk, majd E.coli-ba transzformáljuk. A transzformánsokat először E.coli-ban mutatott aktivitásuk alapján, majd restrikciós enzimes elemzésük alapján szelektáljuk, igy kapjuk a pDP117 plazmldot és a pDP34-ben a PDP12O plazmldot. A DNS szekvencia analízis kimutatta, hogy a PHO5 szignál egy része megkettőződött. A ö aminosav (*-gal jelölve, lásd fent) megkettőződött, így a következő szignál szekvencia Jött létre:

1	2	3	4	5	6	7	ő	9	10	11	12	13	14
met	phe	íys	ser	val	val	tyr	ser	met	phe	lys	ser	val	val
15	lő	17	lő	19	20	21	22	23	24	25
tyr	ser	lle	leu	ala	ala	ser	leu	ala	asn	ala	giy	MET	ΞΝΑ3 gén

	szignál	hasítási	hely
A pDP121 plazmldot a kísérő	rajzok	között a	13A ábrán
mutatjuk be. A 13B. ábrán	az ENA-117 (a	pDP117-ből)
restrikciós térképét látjuk,	aholis	P, SS	illetve T

Jelentése promoter, szignál szekvencia és terminátor.

A PDP121 plazmldot az YP42 élesztő törzsbe transzformáljuk, majd a telepeket SD+His+Leu összetételű

lemezeken szelektáljuk. A transzformánsokat SD2 táptalajon növesztjük, majd vizsgáljuk a jég kristálygöcképző aktivitásukat. Az YP42 plusz pDP121 fagyasztásl spektrumát a kísérő rajzok között a 14. ábrán mutatjuk be, aholis a (Jég kr istálygőc/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a tülhűtéssel szemben (-’C).

Alfa faktor leader szekvencia

A pre-pro-alfa faktor leader szekvencia kiindulási anyaga a Ciha Geigy féle pUC/PHO5-alfa faktor leader plazmld. Ezt ügy módosítjuk, hogy tartalmazzon egy EcoRI restrikciós helyet, ö bp távolságban a PHO5 promotert, ezt kővetően egy ATG-t és egy alfa faktor leader szekvenciát. A pre-pro hasítási helyet is módosítjuk, a KEX2 hasítási helyre egy BglII restrikciós hasítási helyet építünk be, majd ez elé 6 bp távolságra egy PvuII restrikciós hasítási helyet (ez a Chiron Corp. módosítása).

A pUC/PHO5-alfa faktor leader szekvenciát EcoRI és Hindin restrikciós enzimmel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 300 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. A pDPill plazmidot EcoRI és SacI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 650 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Az alfa-faktor leadernek ezt a két komponensét és a GAPDH-dSna-CAT promotert összekeverjük a SacI és Hindin restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmiddal, összeligáljuk, majd E.coli sejtekbe transzformáljuk. A transzformánsokat elemezzük, majd azonosítjuk a pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa faktor leader plazmidot.

A pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa faktor leader plazmidot BglII restrikciós enzimmel emésztjük, majd az 5' túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután SacI restrikciós enzimmel emésztjük, és a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 940 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. A pDPlll plazmidot Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, majd az 5' túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután AatlI restrikciós enzimmel emésztjük, és a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. Az 1400 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a két tisztított fragmentet összekeverjük a pK19/ENA3-term 5kb, SacI és AatlI restrikciós enzimmel emésztett, gélen tisztított és defoszforilezett fragmenttel ligáljuk, majd E.coll-ba transzformáljuk. A transzformánsokat először a jég kristálygócképző aktivitás alapján választjuk ki, majd restrikciós enzimes elemzés alapján, végül DNS szekvencia analízissel, így kapjuk a pDP126 plazmidot. Az lnszertet ezután átvisszük a pDP34 plazmldba élesztőben való levizsgálás céljából, így kapjuk a pDP129 plazmidot, amelyet a kísérő rajzok között a 15A. ábrán mutatunk be. A 15B. ábra mutatja az ENA-126 (a pDP12ő-ból) restrikciós térképét, amelyen P, T és L Jelentése promoter, terminátor illetve leader szekvencia. A pDP129 plazmidot az YP42 élesztő törzsbe visszük át a fentiek szerint. A transzformánsokat használjuk SD2 táptalaj oltására, majd a tenyészeteket • ·

-3630’C-on rázatjuk. Az YP42 plusz pDP129 plazmld fagyasztást spektrumát a kísérő rajzok között a 16. ábrán mutatjuk be, aholls a (Jég krlstálygőcképző/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a túlhűtés függvényében (-’C).

Alfa faktor leader plusz llnker

Az újabb információk az alfa fakteor leader peptid felhasználásáról rekombináns fehérjék előállítására élesztőben egy további követelményt fogalmaznak meg. A natív alfa faktorban a pre-pro peptidet egy ö aminosavból álló llnker követi, majd ezután Jön az alfa faktor peptid. A llnker-alfa faktor elrendezés ötször Ismétlődik a génben, és a linkerek eltávolítódnak az alfa faktor processzálása során. Az információ magában foglalja, hogy a linkért a pre-pro leader szekvencia után, és a beépített gén elé kell berakni. Ezt szintetikus ollgonukleotidok mint llnkerek segítségével érik el, hogy a szükséges aminosavakat beépítsék.

A pUC/GAPDH-dSna-CAT-alfa faktor leader szerkezetet SacI és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen választjuk szét. A 940 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. A pDPlll plazmidot Ndel és AatlI restrlkcós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen választjuk el. Az 1400 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. A két tisztított fragmentet összekeverjük a 20ő és 209 két hibrldizálódott ollgonukleotiddal és a korábban leírt pK19/ENA3-term SacI-AatlI fragmenttel, összeligáljuk, majd E.coli-ba * *· · * ·» «··· ··· ·· * * · * »«» · *»·· r·· • « « · · · · transzformáljuk. A transzformánsokat restrikciós enzimes emésztéssel majd DNS szekvenálással analizáljuk, ezek alapján azonosítjuk a PDP127 plazmldot, amely szintén mutat Jég kristálygéc képző aktivitást. Az inszertet átvisszük az élesztő pDP34 plazmldba, így kapjuk a pDP13O plazmldot, amelyet a kísérő rajzok között a 17A. ábrán mutatunk be. A 17B. ábrán az ENA-127 (a pDP127-ből) restrikciós térképét látjuk, amelyen P, T és L jelentése promoter, terminátor, valamint leader+linker szekvencia. A pDP13O plazmldot a fentiek szerint YP42 élesztő törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokkal SD2 táptalajt oltunk, majd 30'C-on rázatjuk a tenyészeteket. Az YP42 plusz PDP13O plazmld fagyasztási spektrumát a kísérő rajzok között a lő. ábrán mutatjuk be aholls a (jég krlstálygóc/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a túlhűtés függvényében (-*C).

Irányítás a vakuolumba

A fentiekben ismertetett példákban csak egy natív élesztő szignál szekvenciát adunk az ENA3 fehérjéhez, és ez vagy irányítja, vagy nem irányítja a fehérjét a membránokhoz valószínűleg az endoplazmatikus retlkulum útján. Ha egyszer egy fehérje belép az endoplazmatikus retikulumba, akkor az alap anyagcseréit a sejtből való kiválasztás, vagy a ml esetünkben, a külső membránba való beépítés. Ml az alábbiakban az ENA3 fehérjét a sejten belül egy specifikus sejtszervbe irányítjuk, nevezetesen a vakuolumba.

A fehérje karboxi-peptidáz Y (CPY) a vakuolumba Irányul [L.A.Valis et al., cell, 4Ő, ŐŐ7-Ö97 (1907)] pre-pro • · · · ··· *

-36formában, és ott a protelnáz B (a PEP4 gén terméke) processzálja.

Azt is kimutatták, hogy az irányításhoz szükséges szekvencia a pre-pro leader szekvenciában található. Ezért mi ezt az ENA3 fehérje elé illesztjük.

Kiindulásként a Ciha Gelgy féle pBR322/PHO5-pre-pro CPY plazmldot használjuk. Szintetikus ollgonukleotldokra van szükség mint specifikus llnkerekre a GAPDH/CAT promoter és a természetes Stul restrikciós hasítási hely között, körülbelül 35 bp-nylra a CPY pepiidben:

Stul

EcoRI HetLysAlaPheThrSerLeuLeuCysGlyLeuGlyLeu

5' gAATTCATATGAAAGCATTCACCAGTTTACTATGTGGACTAGGCCTG 3'

3' cttaaGTATACTTTCGTAAGTGGTCAAATGATACACCTGATCCggac 5'

A szintetikus oligonukleotldokat nagybetűkkel jelöljük, a felső Jelzése Ollgo 206, az alsóé Ollgo 207. A pBR322/PHO5-pre-pro CPY plazmldot Hindin és Stul restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 600 bp méretű fragmentet kivágjuk, elektroeluáljuk, majd a hlbridizált Ollgo 206 és Ollgo 207 ollgonukleotidokkal valamint az EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmiddal keverjük össze és ligáljuk. A llgáló elegyet E.coli-ba transzformáljuk, majd a transzformánsokat restrikciós enzimes analízissel elemezzük, így kapjuk a pUC19/CPY(p-p) plazmldot. A pUC19/CPY(p-p) plazmldot EcoRI és HlncII restrikciós enzimekkel emésztjük, * ··♦

-39a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk, majd a 340 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a fragmentet EcoRI és HincII restrikciós enzimekkel emésztett pUClö plazmiddal keverjük össze, llgáljuk, majd kompetens E.coli törzsekbe transzformáljuk. A telepeket átvizsgáljuk, és a pUClö/pre-pro-CPY plazmidot azonosítjuk.

A pUClö/pre-pro-CPY plazmidot EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a termékeket agaróz gélen elválasztjuk. A 350 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ehhez hozzáadjuk a pDPllO plazmidból Sacl és EcoRI restrikciós enzimekkel kihasított 660 bp méretű, gélen tisztított GAPDHdSna/CAT promotert valamint a Sacl és Hindin restrikciós enzimekkel emésztett pUC19 plazmidot, összeligáljuk, majd kompetens E.coli sejtekbe transzformáljuk. A telepeket átvizsgáljuk és a pUC18/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY plazmidot azonosítjuk. A pUClö/GAPDHdSna-CAT-pre-pro-CPY plazmidot Sáli restrikciós enzimmel emésztjük,majd a túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután Sacl restrikciós enzimmel emésztjük, és a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 750 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. A pDPlOö plazmidot Ndel restrikciós enzimmel emésztjük, és a túlnyúló véget Klenow enzimmel feltöltjük. Ezt azután AatlI restrikciós enzimmel emésztjük és a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. Az 1500 bp méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a két Izolált fragmentet összekeverjük a korábban izolált pK19/ENA3-term 5 kb, Sacl és AatlI restrikciós enzimekkel emésztett, gélen tisztított és defoszforilezett fragmenttel, Ugáljuk őket, majd kompetens E.coli sejtekbe transzformáljuk. A telepeket restrikciós enzimes analízissel és fagyasztási próbával vizsgáljuk meg, mindkettővel ugyanazt a plazmidot azonosítottuk, a pDP136 plazmidot. A pDP136 plazmid lnszertjét a pDP34 élesztő expressziós plazmldba visszük át, így kapjuk a pDP143 plazmidot, amelyet a kísérő rajzok között a 19A. ábrán mutatjuk be. A 19B. ábrán az ENA-136 (a pDP136-ból) restrikciós térképét mutatjuk be, amelyen P jelentése promoter, T Jelentése termlnátor.

A pDP134 plazmidot a fentiek szerint YP42 törzsbe visszük át. A transzformánsokat használjuk SD2 táptalaj beoltására, majd a tenyészetet 30’C-on rázatjuk. Az YP42 plusz pDP142 plazmid fagyasztási spektrumát a kísérő rajzok között a 20. ábrán mutatjuk be, aholls a (Jég krlstálygóc képző/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a túlhűtéssel szemben (-•C).

4. Példa

Expresszió Lactococcus lactls-ban

Az ENA3 gén expresszióját megpróbáltuk az eredeti Pseudomonas promoterről, sikertelenül (az adatokat nem közöljük), Jóllehet a fontos -35-ös és -10-es régiók nagyon hasonlítanak a Lactococcus lactls foszfo-p-galaktozidáz promoterre [B.Boizet et al., Gene, 52, 249-251 (1965)] (az adatokat nem közöljük). De ami fontos lehet, az a lehetséges 60-65 bázispár Hosszúságú mRNS leader szekvencia Jelenléte közvetlenül az iniciálé ATG előtt. Ezt a lehetőséget

-41megvizsgáltuk olymódon, hogy egy hibrid állítottunk elő, az ENA3 promoter -35-ös szekvenciájából és a f oszf o-B-galaktozidáz potenciális leader szekvenciájából.

• ·♦ ·· ···» ♦ · »· * • *·· · · V·· ♦·· • · · » · · · promotert és -10-es promoter

Ezt az alábbi szintetikus oligonukleotidok felhasználásával értük el:

AsuII |-35| |-1O| < Oligo 1Ö6

5' ttCGAATGCTTGATAAGTGCGCTGCTTTTATTTAAAGGAT

3' aagcTTACGAACTATTCACGCGACGAAAATAAATTTCCTA < Oligo 1Ö7

20 3040 ><. Oligo 214X

CTAGGAATTTTCCATTTCCTTGGTTTTCAGCCCACAGAAT GATCCTTAAAAGGTAAAGGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTA

X Oligo 217

60 70ŐO

Ndel

Oligo 215>

CTCGTCTCAAATGCTTTTTTTGAAAGGACTTACACAtatg 3'

GAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTCCTGAATGTGTATac 5'

X Oligo 216>

100

110 • 44 ·4 ··*44· ·· · · 4 4 «4 • »44 4 · ·44··* » 4 4 4 · <»

-42Az 1-45 bázisok a módosított ENA3 promoter. A 46-115 bázisok a foszfo-B-galaktozldáz megfelelő szekvenciája. A 146—120 bázispárok az Ndel restrikciós enzim felismerési helyét követik, beleértve az ENA3 gén ATG trlplettjét. A szintetikus ollgonukleotldokat nagybetűk Jelzik.

Az ollgonukleotldokat klnázoljuk és egymáshoz hibrldlzáljuk a leírtak szerint. A pDP108 plazmldot Ndel és AatlI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fragmenteket agaróz gélen választjuk el. Az ENA3 gén 5' végét tartalmazó

1.5 kb méretű fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a DNS fragmentet összekeverjük a fenti szintetikus oligonukleotldokkal, a korábban leírt pK19/GAPDH-dSna-ból származó 600 bp méretű élesztő promoter fragmenttel, a pK19/ENA3-ból származó, tisztított és foszfatázozott 5 kb méretű SacI-AatlI fragmenttel, majd llgáljuk. Ezt a llgáló elegyet kompetens E.coli sejtekbe transzformáljuk, majd kanamlcinnel kiegészített YT lemezekre szélesztjük. A transzf ormánsokat restrikciós enzimes emésztéssel, Jég kristálygóc képző aktivitás alapján és DNS szekvenálás alapján vizsgáljuk át, így kapjuk a pDP133 plazmldot.

A pDP133 plazmldot AsuII és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk, majd a

3.5 kb méretű fragmentet Kivágjuk és elektroeluáljuk. A pSC12vN plazmld egy Clba Gelgy konstrukció, amely tartalmazza a pUClő E.coli plazmldot, a pVA63ő plazmidból származó erltromlcin rezisztencia gént [F.L. Hacrina et al„ Gene, 19, 345-353 (1982)], valamint egy Lactococcus lactls plazmld repllkációs origót, a plazmldot a Clba Gelgy • · ·· • ·

-43laboratórlumban készítették. A pSC12vN plazmidot Clal és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd alkalikus foszfatázzal kezeljük, Hogy a vektor visszazáródását megakadályozzuk. Az INAZ-BGAL-ENA3 DNS fragmentet és a Clal-Xbal restrikciós enzimekkel emésztett pSC12vN plazmidot összekeverjük, majd llgáljuk. A ligáló elegyet E.coll-ba transzformáljuk, majd a telepeket restrikciós enzimes analízis és Jég kristálygócképzó aktivitás alapján vizsgáljuk át. így azonosítjuk a pDO135 plazmidot A pSC12vN és pPD135 plazmidokat a kísérő rajzok között a 21. és 22A. ábrán mutatjuk be, aholis az L.lactis o Jelenti az L.lactis plazmld replikációs origóját. A 22B. ábrán láthatjuk az ENA-133 restrikciós térképét (a pDP133-ból), aholls P Jelentése promoter, T Jelentése termlnátor.

A Lactococcus lactls LM0230 törzs transzformálása

Az L.lactis LHO23O M17G táptalajon éjszakán át növesztett tenyészetét (M17G=H17 plusz 0.5/. glükóz) használjuk l’Z-os inokulumként friss H17G táptalajhoz. Ezt a tenyészetet 30'C-on növesztjük körülbelül ODgoo=0.4-es optikai sűrűségig, majd a sejteket centrifugálással ülepítjük (10 000/perc, 5 perc). A felülúszót elöntjük, és a sejteket azonos térfogatú PS pufferben szuszpendáljuk (7 mmól Na-foszfát pH:6.6, 0.5 mól szacharóz) 4*C-on. A sejteket ismét ülepítjük, majd végül az eredeti térfogat 1/100-át kitevő PS pufferben szuszpendáljuk, és felhasználásig Jégen tároljuk (kompetens sejtek). A transzformálást Blorad Gene Pulser™ berenddezéssel »· ·· • · c ·· · · • · ···· a

végezzük, Pulse Controller és Gene Pulser Cuvettes (0.2 cm-es elektróda hézag) felhasználásával. 100 pl kompetens sejtet elegyítünk 1-4 pl térfogatú DNS-sel akár vízben akár TE pufferben, majd az előre behútött küvetta aljára plpettázzuk. A mintát 2000 volt feszültséggel 400 Ohm ellenállás mellett pulzáltat Juk. A mintát ezután eltávolítjuk a küvettáből, steril mlkrocentrlf uga csőbe helyezzük, majd jégbe tesszük. A sejteket végül mlkrocentrlfugában ülepítjük 1 percig, 300 pl M17G táptalajban szuszpendáljuk, majd 1 óráig 3Ο·Ο-οη inkubáljuk. A sejteket ezután H17G lemezekre visszük ki, amelyek 4 pg/ml erltromiclnt tartalmaznak, és 30'C-on inkubáljuk éjszakán át.

A pDP135 plazmidot L.lactis LM0230 sejtekbe transzformáljuk, a fentiek szerint. A transzformánsokkal oltunk 4 pg/ml eritromlclnnel kiegészített M17G táptalajt, majd 20'C-on addig kevertetjük, amígy az OD^qq értéke a körülbelül 1.0 értéket eléri. A kapott tenyészeteket a fentiek szerint megvizsgáljuk, és a kapott eredményeket ábrázoljuk. Az LH0230 plusz pDP135 plazmld fagyási spektrumát a kísérő rajzok között a 23. ábrán mutatjuk be, aholis a (Jég kristálygóc képző/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a túlhfltéssel szemben (-’C).

P-g-gal promoter

Egy másik, közvetlen megközelítés idegen gének

L.lactlsban való expressziójához jól ismert, eredeti

L.lactis gén promoterének alkalmazása. Egy Ilyen publikált gén a Z26ő törzs foszfo-B-galaktozidáz génje. A szintézis az alábbiak szerint megy:

AsuII | < OllgO 220 X # Oligo 221

5' ttCGAACAACAGTTTGATTAATAAATTTGTAAAAGTTATTTGAGACGAGATCACTCA

3' aagcTTGTTGTCAAACTAATTATTTAAACATTTTCAATAAACTCTGCTCTAGTGAGT < Oligo 222>

X # Oligo 215

TTCCATTTCCTTGGTTTTCAGAACACAGAATCTCGTCTCAAATGCTTTTTTTGAAAG AAGGTAAAGGAACCAAAAGTCTTGTGTCTTAGAGCAGAGTTTACGAAAAAAACTTTC < Oligo 217X |NdeI >

GACTTACACAtatg3 ’

CTGAATGTGTATac5'

Oligo 216>

A 6 ollgonukleotldot a szokásos módszerekkel szintetizáljuk és tisztítjuk. Mindegyik oligonukleotldból 100 pikomólt veszünk és összekeverjük egy mlkrocentrlfuga csőben, majd T4 pollnukleotld-kináz enzim segítségével felvisszük rájuk az 5' foszfát csoportokat, [gamma-³²P]ATP-t használva foszfát donorként. Ezeket az ollgonukleotldokat ·· 1J ·* *·· · · ··· • ♦ » 9 · ···>« « *··

-46azután a leírtak szerint hlbrldlzálJuk egymással. A pJDC9 plazmldot [J-D. Chen and D. A. Horrlson, Gene, 64, 155-164 (1968)] SacI és Hindin restrikciós enzimmel emésztjük, majd alkallkus foszfatázzal kezeljük. A pDPIOő plazmldot Ndel és Hindin restrikciós enzimmel kezeljük, majd a fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk és a teljes ENA3 gént, valamint a LYS2 termlnátort tartalmazó fragmentet kivágjuk és elektroeluáljuk. Ezt a DNS fragmentet keverjük a HindlII-SacI restrikciós enzimmel emésztett pJDC9 plazmiddal, az ollgonukleotid pK19/GAPDH-dSna SacI-AsuII 600 keverékkel, plazmidból bp méretű valamint az előállított élesztő promoter előzőkben a és tisztított fragmenttel, és ligáljuk. A ligáié eleggyel azután kompetens E. coli sejteket transzformálunk, két órán át 37’C-on 500 pl friss YT táptalajban expresszálJuk, majd 100 yg/ml erltromlclnnél

kiegészített	YT	lemezre szélesztjük,	és	éjszakán át	37’C-on
inkubáljuk.	A	telepeket először	restrikciós	enzimes
analízissel	és	Jég kristálygóc képző	aktivitás	alapján

vizsgáljuk át, majd DNS szekvenálással. így kapjuk a PDP137 plazmldot, amely két egybázlspáros deléclót tartalmaz a szekvenált promoterben (az előzőkben #-kal Jelölve).

A pDP137 plazmldot AsuII és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a DNS fragmenteket agaróz gélen elválasztjuk. A 3. 95 kb méretű fragmentet kivágjuk, és a DNS-t elektroeluálJuk. Ezt a fragmentet összekeverjük a korábban leírt Xbal-Clal restrikciós enzimekkel emésztett

PSC12VN plazmiddal, ligáljuk, majd a ligáié eleggyel kompetens E.coll sejteket transzformálunk. A telepeket a jég •· ····

-47kristálygóc képző aktivitás és restrikciós enzimes emésztéssel szelektáljuk, igy kapjuk a PDP14Ő plazmidot, amelyet a kísérő rajzok között a 24A. ábrán mutatunk be, aholis az L. lactis o Jelentése L. lactis replikáélós origó. A 24B. ábrán az ENA-137 (a pDP137-ből) restrikciós térképét is bemutatjuk, ahol is P Jelentése promoter, T Jelentése terminátor. A pDP14ő plazmidot a fentiekben leírtak szerint LHO23O törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokkal 4 pg/ml erltromlclnnél kiegészített H17G táptalajt oltunk, majd 20'C-on Kevertetjük. Az LMO23O plusz pDP14ö plazmid fagyási spektrumát a kísérő rajzok között a 25. ábrán mutatjuk be, aholls a (Jég krlstálygóc/sejt) logaritmusát ábrázoljuk a túlhűtés függvényében (-*C).

Claims (22)

SZABADALHI IGÉNYPONTOK

1.

Igénypont szerinti ada1 ékanyag g a1

Kezeljük, majd hőmérsékletüket a fagyás elősegítésére lecsökkentJük.

1.

Igénypont szerinti adalékanyaggal kezeljük.

1. Adalékanyag, amely emészthető biológiai anyagokban nulla fok alatti hőmérsékleten elősegíti képződését, azzal jellemezve, hogy az

Jég kristálygócok adalékanyag GRAS mikroorganizmusok vagy mikroorganizmus frakciók által hordozott, az említett

Jég kristálygóc képzésre alkalmas fehérjét tartalmaz, ahol fehérje expresszálására a mikroorganizmusok az említett alkalmas egy vagy több gént tartalmazó vektorral vannak transzformálva, az említett vektor egy plazmld, amely a helyes leolvasási fázisban tartalmaz egy klónozó vektort, valamint az említett, Jég kristálygóc képzésre alkalmas fehérjét kódoló DNS-t, élesztő GRAS mikroorganizmus esetében lényegében a teljes élesztő 2 mikronos plazmldot, legalább egy, élesztőben való szelekcióra alkalmas auxotrófia markert és a LEU2 gén dLEU2 alléljét, Lactococcus GRAS mikroorganizmus esetében emellett egy nem-indukálható eritromicin rezisztencia gént és egy lactococcus plazmld promotert és replikáciős origót.

2. Az i. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy a klónozó vektor egy Ξ. coli klónozó vektor.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy a klónozó vektor élesztő GRAS mikroorganizmus esetében az élesztő sejt felszínére irányuló fúziós fehérje előállítását biztosító élesztő szignál szekvenciát tartalmaz.

4. A 3. igénypont szerinti adalékanyag, azzal

I··· ··· · · ·«· ··· • · « « · ·

-49Jellemezve, hogy az élesztő szignál szekvencia a PHO5 vagy az alfa faktor prepro leader szekvenciája.

5. A 4. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy az alfa faktor szekvenciáját a jég krlstálygőcképző fehérjét kódoló DNS-től egy linker szekvencia választja el.

6. Az 1. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy az említett vektor a s. cerevlslae NCIMB40215 törzsben levő pDP143 plazmld.

7. Az 1. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy lactococcus GRAS mikroorganizmus esetében a vektor egy L. lactls gén promoterét tartalmazza.

ő.

Az 1. igénypont szerinti adalékanyag, azzal Jellemezve, hogy lactococcus GRAS mikroorganizmus esetében a vektor az L. lactls NCIMB4O216 törzsben levő pDP14ő plazmld.

9. Plazmld egy GRAS élesztő törzs transzformálására, azzal Jellemezve, hogy helyes leolvasási fázisban tartalmaz egy klónozó vektort, a nulla fok alatti hőmérsékleten Jég krlstálygóc képződést elősegítő fehérjét kódoló DNS-t, lényegében a teljes 2 mikronos élesztő plazmidot, legalább egy élesztőben szelekcióra alkalmas auxotróf markert, valamint a LEU2 gén dLEU2 alléljét.

10. A pDP143 plazmld.

11. A pDP143 plazmlddal transzformált S. cerevlslae NCIMB40215 törzs.

12. Plazmld egy GRAS lactococcus mikroorganizmus transzformálására, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy klónozó vektort, a nulla fok alatti hőmérsékleten Jég r· ··· kristálygóc Képződést elősegítő fehérjét Kődolő DNS-t, egy nem-indukálható erltromlcln rezisztencia gént, és egy lactococcus plazmld promoterét.

13. A pDP14ö plazmld.

14. A pDP14ő plazmlddal transzformált L.lactls NCIMB4021Ő törzs.

15. A PUC21ENA3 plazmld.

16. AZ E.COli NCIHB40217 törzs.

17. A 9. vagy 12. igénypont szerinti plazmld, azzal Jellemezve, hogy a klónozó vektor egy E.coll klónozó vektor.

lő.

Emészthető biológiai anyagok, azzal Jellemezve, hogy egy vagy több, az 1. igénypont szerinti adalékanyagot tartalmaznak.

19. Zöldségek, gyümölcsök, hal, húsok, fagyasztott Készételek, Jégkrém, fagyasztott tészták, fagyasztott gyümölcslevek, fagyasztva szárított élelmiszerek, fagyasztva szárított gyógyszerek és vér krlopreclpltátumok, azzal Jellemezve, hogy égy vagy több, az 1. igénypont szerinti adalékanyagot tartalmaznak.

20.

Eljárás Jég kristálygóc képzés elősegítésére emészthető biológiai anyagokban, azzal Jellemezve, hogy az említett anyagokat egy vagy több, az

21.

Eljárás emészthető biológiai anyagok lefagyasztására, azzal

Jellemezve, hogy az említett anyagokat egy vagy több, az

22. A 21. Igénypont hogy a hőmérsékletet -5»C mányba süllyesztjük.