HUT55798A

HUT55798A - Process for producing peptide derivatives and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Info

Publication number: HUT55798A
Application number: HU907234A
Authority: HU
Inventors: Judson Vincent Edwards; Bradford Otto Fanger
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1990-11-21
Publication date: 1991-06-28
Also published as: AU6679390A; JP2927936B2; EP0434979A1; EP0434979B1; PT95953A; FI905741A0; IE904211A1; JPH03261800A; IL96402A0; AU638775B2; KR910009730A; NO905038L; CN1051914A; ES2084635T3; CA2030212A1; HU907234D0; DE69024626T2; ATE132501T1; DE69024626D1; NO905038D0

Description

Λ találmány a 07/440,547 számú, 1909. november 22-én benyújtott Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentés folytatása.

A találmány tárgya eljárás új mitosis gátló és szekréció gátló fehérjék előállítására, amelyek a megfelelő bembasin ős gasztrin kibocsátó fehérjék antagonistái és alkalmasak;

(1) kis sejté tüdő és prosztata karcinomák kialakulásának kezelésére ős (2) gyomorsav kiválasztás szabályozására, amely a pepszin (nyelőcsövi, gyomor és nyomból) fekélyek okozója, illetve szimptémája.

A bombosin 14 arainésavból álló fehérje, amelyet eredetileg a Bombina bombina bóka bőréből izoláltak. A bombesin széleskörű hatással rendelkező fehérje, éc például a gyomor és hasnyálmirigy szekréció működésűnek aktiválúja, az idegrendszerre stimuláló hatást fejt ki, a bél izorasejtok izamolektromos és esszahúiási készségét aktiválja, a vese véráramot csökkenti, a hypophysis hormon szekréciót növeli és növekedést elősegítő hatással rendelkezik.

A gasztrin kibocsátó fehérje (GRP) egy 27 aminósévbél álló peptid, amelyet később emlősükben izoláltak, és kimutatták, hogy a bombesin fehérjével azonos karboxil-tcrminális egységgel rendelkezik, valamint azzal analóg jellemzőkkel rendelkezik. Ezen túlmenően a gasztrin kibocsátó fehérje ős a szerkezetileg hasonló bombesin kompetitíven kótűdik a kis sejtő tüdő karcinöma sejtek (SCLC) és a prosztata bolhám sejtek nagy affinitásé receptoraihoz. Ezekhez a növekedési faktorokhoz való kötődés mérhető (^H)-timidin felvételt és clonusos növekedést okoz.

Számos vizsgálatban alkalmaztak sejtnövekedés! faktorokat rákos sejtek növekedésében olyan módon, hogy a növekedési faktor receptorokat aktiválták. Ebben a vonatkozásban a bombesin/GRP és a receptor aktiválás más, jól ismert növekedési faktorokkal és daganatképzűkkel van összefüggésben. Széleskörű kutatásokat folytattak, hogy kifejlesszenek kompetitív bombesin receptor antagonistákat, amelyek mitosis ellenes szerként alkalmazhatók, mivel felfedezték, hogy ezek a peptidek a bombesin illetve a GRP mint potenciális növekedési faktor hatnak kis sejtő emberi tüdő karcinöma, és lehetségesen prosztata karcinöma rendszerekben. A kutatásokat alátámasztották azok a kísérletek, amelyekben anti-bombesin monoklóoos antitesteket alkalmaztak abból a célból, hogy megakadályozzák receptoruk kötődését és mitosisos választ hozzanak létre. A kísérletekben, amelyekben SCLC sejtekben in vitro és sárgásbarna egerek beültetett szöveteiben in vivő monoklón antipeptid antitesteket alkalmaztak, klónos növekedés inhibiálást tapasztaltak. A mitosisos válasz a ligandum-receptor komplex által sejten belül létrehozott jelképzo anyag termeléssel indul. A GRP/bombesin esetében ez egy G-fahérje aktiválását jelenti, amely ezt követően a foszfolipáz C (PLC) enzimet aktiválja. A PLC enzim a foszfatidil-inozitol-foszfátot (Pl) inozitül-i,4,3,-triioszfáttü (IP-) és diacil-glicerollá (QAG) alakítja. Feltételezik, hogy az IPj és a ÜA6 a GRP/ borabesin receptor rendszer aktiválásához szükséges sejten belüli jelző anyagok.

Miután az 5GLG sejtekben kimutatták a bombosin/GRP sajt receptorok jelenlétét, ilyen receptorokat találtak a humán prosztata sejtekben is. Későbbi kutatások kimutatták m vif.ro bombesin/GRP antitest alkalmazással, hogy a bombesin/GRP növekedési hatást 'fejt ki a prosztata hámsejtekben. Ezen túlmenően sejtburjánzási kísérletek PC3 (emberi prosztata karcinűma sajt) és PMU23 (XII állapotú prosztata karcinóma elsösleges tenyészetből vett hámsejt) esetében kimutatták, hogy b-oRbeöin/GRP dózisfűggá a növekedési görbe. Ez az adat azt mutatja, hogy a prosztata mirigyen belül autoerin vagy paraerin rákos sejt növekedés gyorsítás lehet jelen. Ennélfogva a GRP/bombesin hatásának megszakítása alkalmas lehet prosztata rákos megbetegedések kifejlődésének kezelésére olyan esetekben, ahol ezek a faktorok autocrin vagy paraerin mitosisos hatóanyagként szerepelnek.

A bombesin és a GRP továbbá tumor és hasnyálmirigy szekréciót indukáló hatással is rendelkezik, és kimutatható telíthető receptorokkal rendelkezik hasnyálmirigy (B-sejtet<) és bél (ΰ-sejtek) eredetű sejteken. Ennélfogva az ilyen receptorok antagonista anyagai alkalmazhatók gyamoríakúiyes megbetegedések és bél, valamint hasnyálmirigy be- 5 tagságok kezelésére, valamint ezen szövetek mirigyrákos megbetegedéseinek kezelésére.

Az anti-bombesin/GRP antitestekkel végzett kísérletek ahhoz a hipotézishez vezettek, hogy lehetséges a bombesin/ GRP autocrin nüvekudési ciklusának megszakítása tervezett fehérje receptor antagonisták alkalmazásával. Ennek felfedezésétől kezdődően számos típusú bombesin antagonistát írtak le. Ezeket az antagonista anyagokat a természetes szekvencia típusával és szubsztituenseinek helyzetével jellemzik. A korai időszakban kidolgozott antagonisták alacsony hatásossággal rendelkeztek, nem voltak specifikusak és toxikusak voltak, amely tulajdonságaik tudományos és terápiás alkalmazásukban nagy nehézséget jelentettek.

Az utóbbi években végzett kísérletek elsősorban a fehérjék karboxíl-végcsoportjainak (C-végcsoport) módosítását célozták meg ebbél a célból, hogy a receptor kölcsönhatást. megakadályozzák és számos, különböző típusú C--végcsoport módosított analógot kidolgoztak. Ezek az analógok pél dául D-aminósavakat, nem-peptid típusú kötéseket amidokat és észter módosított változatokat tartalmaztak.

Ezek a módos í*á sok azt eredményezték, hogy bizonyos peptidek javított jellemzőket mutattak.

Jelen feltalálók kidolgoztak és előállítottak ogy lineáris peptid analógot a természetes bombesinre, amely ana• · · » ·· · • « · · · · · · ········ · · • · ·· *tt · ·

- 6 lóg a 13 és 14 aminósavak között nőm peptid típusú kötést tartalmaz, amely kötés tiemetilén-csoport tartalmú (^(Cl^S)) abból a célból, hogy a kötés konformációs flexibilitása mcgnövekedjék, és ennélfogva a peptid teljes konformációs flexibilitása növekedjen. A feltalálók továbbá előállítottak olyan peptideket, amelyek a megfelelő metilén-szulfoxid-csoportot tartalmazták d(CH²S(0))) és azok előállítását a tiomstilén-vegyületek megfelelő oxidációjával végezték. A tiomotilén-csoport metilén-szulfoxid csoporttá történő oxidációja két izomert eredményez. A feltalálók fizikai módszerekkel elválasztották a metilún-Ezulfoxid izomereket, amelyeket (^(CHgSCO))^) és (^(CH₂S(C))¹¹) jellel jelöltek, és ezeket megfelelő kísérletekben tesztvizsgálatnak vetették alá. Jelen feltalálók kimutatták, hogy a bombcsin tiometilén-analógok és metilén-szulfoxid analógok in vitro éntagonistái a természetes molekulának és (1) a receptor kötődésben kompetitiv inhibitorként hatnak, valamint (2) a nasztrin kibocsátó pepiid biológiai hatására antagonista hatást fejtenek ki. A találmány szerinti popt.id antagonista anyagok potenciálisan jelentős mitosis ellenes és/vagy szekréció ellenes aktivitással rendelkeznek, és ennélfogva tudományos és terápiás vonatkozásban rákterápiában, illetve fekélyek kezelésében alkalmazhatók. Ezen túlmenően a molekulában a tiometiléncsoport vagy a metilén-szulfoxid csoport jelenléte megnövelt hatásosságot és megnövelt hatásidőt eredményezhet.

···· ····

A találmány tárgya eljárás az alábbi általános képiétű peptid származékok vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóik előállítására

Ahol az általános képletben

X jelentése amine-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-1C szénatemszámú alkilcsoport, egy vagy két 2* xG szünatomszámú acil-csoport, karbobenziloxi- . vagy t-butiloxi-karbonil-cscport; hacsak az amino-terminális aminősév nem valamely ciklikus származék, amely esetben X jelentése elhagyott;

N jelentése bumbesin^GRP vagy ezek bármely természetes variánsa, illetve szekvencia részletük variánsa egy kötés vagy egy 1-11 bármely aminősav maradékét tartalmazó peptid; hacsak a terminális amlnósav nem ciklikus származék, amely esetben M jelentése elhagyott;

Aj jelentése Glp, vagy alkalmas savas hidrofil maradék;

A₂ jelentése Gin, alkalmas semleges vagy hidrofób maradék, Hle,-amins-butánsav, pSubPhc, QNap, vagy egy kötés;

- 3 ·*·· ····

Aj jelentése Arg, alkalmas üázisos hidrofil maradék, vagy agy kétes;

A^ jelentőse Leu, vagy Ag jelentésével megegyező;

Aj jelontöse Gly, Ag jelentésével megegyező, Ü-Ala;

Ag jelentése Asn, Ag jelentésével megegyező, O-Ala, pGlu, Lys, Lys(Z), SubPhe, vagy GPnc;

Ay jelentése Gin, His, alkalmas semleges hidroíóü vagy eézisus Hidrofil maradék, Nap, íl-His, NeHis, His(T-we), His(^-Me), O-Glu(ÜMe), ü-Glp, ü—Leu, Műlüu, ü-rne, vagy Glu;

Αθ jelentése Trp valamely alkalmas semleges maradón vagy rtet, Helrp, SubPhe, Lys, Gha, vagy Lys(Z(2ül));

A₉ jelentése Alá, Ág jelentésével megegyező, í-taAla, Aib, O-Pho, L-Ual, Arg, vagy Glu;

Ajg jelentése Val, Ag jelentésével megegyező, McVal, Tnr(éHgPn), vagy űu-Flg;

A^ jelentése Gly, alkalmas semleges maradék, Phe, ü-Pno, Sár, ű-Ala, ö-5ar, G-dorCGngPh), Gubr’ho, é-Pro, ü-Lys, Asp, u-Arg, Ö-uyG<2(2Ől)), Ag'c,

1“ *

Áe^c, vagy Ac^uc;

A^g jelentése His, alkalmas semleges vagy eózíkus hidrofil maradék, Tyr, Ü-Phe, psuüPha, His, MoHis, His(T-Mü>, His(lf-MsÜH), ü-pef, Aib, Ahx, Apu, Gin, Lys, Lys(Z), Ser, Ser(CHgPh), Thr, Glu, Asp, Asp(üÖut), vagy N-íJal;

A|2 jelentése Leu, Phe, alkalmas hldroíőb vagy semleges maradék., Ahx, MeAhx, Apó, MeApa, D-Leu. Me-Leu, Melle, McVal, vagfcyGlu; jelentése az A^aa A-^aa dlpeptidet meghatározó kötés. ahol jelentése (CH,,S)_s(CH₂S(0)}, ^(CHgSdO)¹ és ^(CHjSO)¹¹, ahol A^ca és jelentése 3 szubsztituáló aminősevek;

jelentőse Leu, Met, t‘le. elkr?mas hidrofőb vagy semleges maradék, Ahx, McAhx_f Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal, vagy Glu;

C jelentése bonhenin. GRT, vagy ezek természetes variánsa illetve szekvencia részlete, egy kötés.. vagy 1-11 bármely aminésav maradékot tartalmazó peptid; és

Y jelentőse karboxll-terminális maradék amely

Ishet hlrfroxllcsoport, 1-3 szénatomszámú alkoxi-észter-csopart, karhexamid-csoport, τ.οηο- vagy dl- 1-4 széaatomszétnú alkll-amidcsoport, 1-4 szénatemazámú alkil-amln-csoport,

1-4 szénatomszámú tloalkil-étsr-csoport.

A találmány szerinti eljárás és anyagok leírásában az alábbi szokásos rövidítéseket elkalmezzuki (1) omlnósavak és ezek hárombetűs kádjai, (2) módosított és nem szokásos aminós8vak, és (3) terminális aminő és karboxll szubsztitu-

• · ·

- 10 ensek.

<1)s Aminősavak és hárombetűs kódjuk

L-AMINOSAVAK

Alá - alanin

Arg - arginin

Asn - aaparagin

Cys - cisttein

Gly - glicin

Glu - glutaminsav

Val - valin

Gin - glutamin

His - hisztidin

Ile - izoleucin

Leu - leucin

Lys - lizin

Phe - fenilalanin

Met - metionin

Pro - prolin

Ser -.Szerin

Thr - treonin

Trp - triptofán

Tyr - tirozin • ·« ··♦· ···· ··· « ·

- 11 D-AMINŐSAVAK

D-Ala - O-alanln

O-Arg - D-arglnin

D-Asn - D-eszparaginsav

D-Cys	- D-ciszteln
O-Glu	- D-glutarainsav
D-Val	- D-valin
0-Gln	- D-glutamin
O-His	— O-hisztldln
D-Ile	- D-izoleucin
D-Leu	- 0-loucin
O-Lys	- 0-lisin
O-Phe	- O-fanilalanin
O-Mot	- D-metionin
O-Pro	- D-prolin
D-Sor	- D-szerin
O-Thr	- O-tzeonin
D-Trp	- O-triptofán
D-Tyr	- D-tirozin

(2): Módosított ég , nőm szokásos arainósavak

Ac3c	- l-amino-l-ciklopropán-karbonsav
Ac5c	- l-amino-l-ciklopentán-karbonsav
Ac6c	- l-araino-l-ciklohoxán-karbonsav
Asp(OtBu)	- O-t-butil-aszparaginsav
Aha	- <-amino-butánsav

• ·

Ahx	- (2S)-2-amino-hexánsav (norleucin)
Apa	- (2S)-2-amino-psntánsav (norvalin)
Cha	- ciklohexil-alanin
Chg	- ciklohaxil-glicin
Cin	- cínnamoil-csoport
Deh	- (2,3-dietil-guanidino)-homoarginin
DhCin	- 3,4-dlhidro-cinnamoil-csoport
Hsa	- homcszarin-lakton
MiaC^-Ma)	- -metil-hisztldin
MisCí'-Me)	- N‘ -matil-hiaztidln
Hyp	- hidroxi-prolin
pGlu	- plroglutaminsav
Glu(Ome)	- gamma-fnatil-D-glutaminsav
I-Tyr	- 3-lőd-tirozin, 5-jód-tlrozin, 3,5dijpd-tlrozin
Lya(Z)	- benziéoxl-karbonil-lizin
Lys(ZCl)	- p-klór-benziloxi-lizin
MeLys	- N-matll-lizin
MeLau	- N-metil-leucin
MeHia	- N-matil-hiaztidln
MeTrp	- N-raatil-triptofán
MeAla	- N-metil-alanln
MeVal	- N-raetí1-valin
MeAhx	- N-matll-(2S)-2-amino-hexánsav
MeApe	- N-metil-(2£)-2-amlno-pentánsav
Melle	- N-matil-izoleucin

« · *···

MePhe	- N-metil-fonilalanin
MePgl	- N-metll-fenilglicin
Npa	- f’-naftll-alanin
OhPro	- 3,4-dihldro-prolin
Nlo	- norlaucin
Orn	- ornitin
Pip	- plpokolát
Pba	- p-amino-fenil-butánsav
pSubPhe	- para szubsztituált fenilalanin, pCIPhe - p-klór-fanilalanin, pSrPhe p-brdm-fenilalanin, pFIPhe - p-fluőrfenllalanin, pN0₂Phe - p-nitro-fönilalanin, pOHPhe - p-hidroxi-fenilalanin
Pgl	- fenllglicln
Sor(CH₂Ph) Sár	- benzll-szarin - szarkozin (N-oatil-glicin)
SubPhe	- orto-, méta--, vagy para-, mono- vagy dl- szubsztituált fonil-alanin
Tha	- f’-CZ-tieniD-alanin
Thr(CH₂Ph) Trp(CH₂Ph) Tiq	- benzil-treonln - benzil-triptofán - Tetrahidro-izokinolÍn-3-karboxilát

- 14 (3): Amino- és karboxi- terminális sav szubsztltuensek

Ac - acetll-csoport

Azt - azotidin-2-karbaxilát-csoport

Cin - cinnamoil-csoport

OhCin - 3,4-dihidro-cinnamoil-csoport

Bit - glutaril-csoport

Mai - maleil-csopott

Oac - 8-amino-oktánsav

Oct - -oktán

Suc - szukclnil-csoport

Glt - glutari-csoport

Tfa - trifluór-acetil-csoport # - C-terminális amid-caoport

Az alábbiakban leírjuk az ismert természetesen előforduló GRO és 3OMBESIN aminósav szekvencia vasriációkat:

GRP ÉS BOMBESIN AMINÓSAV SZEKVENCIA VARIÁCIÓK

GRP:

10 15

Val Pro Leu Pro Alá Gly Gly Gly Thr Val Leu Thr Lys Met Tyr Alá Val Ser Val Gin Ser Pro Alá Alá Ile Thr

Gin Pro Asp

Gly

4 ··· »·

444 • 4

20

Pro Arg Gly Asn His Trp Alá Val Gly His Leu Met-NH₂ (Humán) Ser

BOMBESINí

10 pGlu Gin Arg leu Gly Asn Gin Trp Alá Vei Gly His Leu Met-NH₂(Humán)

LITORIN:

10 pGlu Gin Trp Alá Val Gly His Phe Met-NH₂

Aminősavak és módosításaik

A szokásos leírásnak megfelelően a peptideket úgy ábrázoljuk» hogy az amino-terminális aminósav a baloldalon, ős a kerboxi-terminális aminósav a jobb oldalon található az aminósav láncban.

A természetben előforduló aminősavak a glicin kivételével királis szénatomot tartalmaznak. Hacsak másképp nem jelezzük, az optikailag aktív aminósavakat a leírásban L-konfigurációban értjük. Például az Aj vagy A^ csoportokkal jelzett eminósevek bármelyike 0- vegy L999 a ea

- 16 konfigurációjú lehet. Ezen túlmenően e leírásba beleértendő, hogy a tiometilén-csoport oxidációja után a metllén-szulfoxid-csoport kát peptld izomer előállítását teszi lehetővé, amelyeket CFCC^SCO))*) és (^(CH₂S(O))1I) jelöléssel adunk meg. Ezen túlmenően a leírásba beleértendő, hogy ezek az Izomerek elválaszthatók és abszolút konfigurációjuk meghatározható. A 'fíCHgSCO)) jelölés alatt a leírásban a két izomert értjük vagy együtt, vegy elválasztva.

Az alkilcsoport és sz alkoxl-csoport alkilcsoportja lehet egyenes vagy elágazó, illetve ciklusos szénléncú csoport, mint például metilcsoport, etilcsoport, propilcsoport, izoporopil-csoport, butil-csoport, izobutil-csoport, t-butil-csoport, pentil-csoport, izopontil-csoport, ezek-pentil-csoport, ciklopentil-csoport, hexil-csoport, izohexil-csoport, ciklohexil-csoport és ciklopentil-metilcsoport, heptil-csoport, oktil-csoport(Oct), 8-amlno-oktánsav-csoport(Oac). A 2-10 szénatomszámú acil-csoport lehet egyenes vagy elágazó szánláncú, illetve ciklusos, telített vagy telítetlen acil-csoport, amely 1 vagy 2 karbonllcsoportot tartalmazhat. Ilyen csoport lehet például acetilcsoport(Ac), ^zetidin-2-karboxilát-csoport(Azt), benzoilcsoport, szukcinil-csoport, cinnamoil-csoport(Cin), 3,4-dihidro-cinnamoil-csoport(0hCin), maleil-csoport(Mal), és glutaril-csoport (Glt). Mind az alkilcsoportok, mind az acil-csoportok lehetnek olyan csoportok, amelyek halót génatom szubsztituenseket tartalmaznak, ahol a halogénatom lehet fluóratom, klóratóm, brómatóm vagy jódatom. Például ilyen csoport lehet a triíluór-acetil-csoport (Tfa). Az N-termlnális aminósav maradék ciklusos származéka lehet például piroglutaminsav (pGlu) és homoszerln-lakton (Hsa).

A bármely aminósav elnevezés alatt nem bármely karbonsavat értünk, amely amlnócsoport szubsztituenst tartalmaz, hanem olyan aminósavakat értünk, amelyeket általában polipeptid származékok előállításéban alkalmaznak, száz természetesen előforduló aminósavakat, valamint más, nem fehérje típusú«(-aminósavakat értünk, mely utóbbiakat szokásosan a peptid kémiában alkalmaznak természetes peptidek szintetikus analógjainak előállításában. A természetesen előforduld aminősavak glicin, az slanln, a velln, a leucin, az izoleucin, a szerin, a metionin, a tzeonin, a fenilalanln, a tlrozin, a triptofán, a cisztein, a prolin, e hisztidin, az aszparaginsav, az aszparagin, a glutaminsav, a glutamin, az arginin, az ornitln és a lizln. Az elnevezésbe továbbá beleértjük a természetesen előforduló aminősavak i D-lzomerjeitj a D-alanint, a D-vslint, a 0-leucint, a D-izoleucint, a 0-szerint, a D-metionint, a D-treonint, a O-fenilalanlnt, a D-tirozint, a D-trlptofánt, a O-ciszteint, a D-prolint, a Q-hisztldint, a 0aazperaginsavat, a 0-aszparaglnt, a D-glutamlnsavet, a O-glutamlnt, a 0-arginint. Az elnevezésbe továbbá bele- 18 értjük a nea fehérje típusú c^-aalnósa vaka t, mint például az l-anino-l-ciklopropén-karbonsavat (Ac3c), az 1-amino-l-ciklopentán-karbonsavat (AcSc), az 1-aminol-ciklohexán-karbonsevat (Ac6c), az O-t-butil-eszparaginsavat (Asp(OtBu)), az ix-aaino-butánsavat (Aba)_t a (2S)-2-anino-haxánsavat (Nórleucint) (Ahx vagy Nle), a (2S)-2-aoino-pentánaavat (nórvallnt) (Apa), az Ν' -metil-hiaztidint (MisCr’-Me)), az N^-raetil-hisztidlnt (Mle(H-Me)), az N-rootll-lizint (MeLys), az N-metilleuclnt (MoLau), az N-aetll-hieztidint (MaHis), az N-metll-trlptofént (MaTrp), az N-matil-alanint (MeAla), az N-netll-vallnt (MeVal), az M-e»tll-(2S)-2-aeiinohexénsavat (MeAhx), az N-aetil-(2a)-2-anino-penténsavat (MaApe), az N-aetll-lzoleucint (Melle), az Nmetil-fenil-alanint (MePhe), az H-matil-fenil-glicint (MaPgl), a £ -(2-tienil)-alanint (The), a benzil-treonint (Thr(CH₂Ph)), a benzil-trlptofánt (TrpCCHjPH)), a nórleuclnt, a nórvallnt, az allo-izoleucint, a ho®oarginint, a tieprolint, a dihidroprolint, a hidroxi.prolint (Hyp), a hoaoazerint, a ciklohexil-glicint (Chg), ez ^-amino-butánsevat (Aba), a ciklohexilalanint (Cha), az aaino-fenil-buténeavet (Pba), a mono- vagy diszubsztituált orto, méta vagy para helyzetben szubsztituált fanil-alaminaket, mint például a para helyzetben szubsztituált fenil-alanint (PSubPhe) és a p-klór-fenil-alanint, a t-eaino-fenil-alenint és p-nitro-fanil-alenint (pNPhe), vagy a fenilesöpörtón egy vagy kőt alábbi szubsztituenst tartalmazó fenílalaninokat, amely szubsztituensck lehetnek 1-4 szénatomszámú alkilcsoport, 1-4 szénatomszámú alkoxi-csoport, halogőnatom vagy nltrocsoport, vagy a metilóndioxi-csoporttal szubsztituált fenil alaninokat. A f»-2 és 3-tienii-alanint a £-2- és a 3-furanil-alanlnt, a -f-2-, 3-, és 4-piridil-alani.nt, a ^-(benzotienil2- és 3-il)-alanint, a f-(l- és 2-naftil)-alanint (Npa), ez Q-alkilezett szerin , treonin vagy triozin származékokat, a glutaminsav ős aszparaginsav metilésztereket, az S-altilszett ciszteint, a tirozln 0-szulfát észtert ős a halogénezett tirozlnokat, mint például a 3-jód-tlrozint, az 5-jód-tlrozint és a 3,5-dijódtirozlnt.

A bombesin vagy GRP vagy ezek természetes variánsai elnevezés alatt a bombesin vagy GRP természetesen előforduló aminósav szekvenciáját értjük.

A bombesin ős a GRP vonatkozásában az ezek részletei elnevezés alatt a GRP a bombesin vagy variánsaik 1-11 aminósav vagy hosszabb szekvenciáját értjük.

Az <-aminósav8kat bizonyos jellemzők alapján csoportosíthatjuk. Az oldalláncok két jellemző tulajdonsággal rendelkeznek: polárosak vagy nem polérosak lehet • ·

- 20 nek. A nem poláros aminósavak azok, amelyek hidrofób oldallánccal rendelkeznek, amelyek lehetnek alifás szénhidrogén oldalláncot tartalmazó aminósavak: Oly, Alá, Val, Leu, He, Nle, Pro és aromás csoportot tartalmazó aminósavak Phe és Trp, valamint pszeudószénhidrogén csoportot tartalmazó aminósavak, Met. A poláros aminósavak három csoportba oszthatók: (1) Savas hidrofób csoportok, (2) semleges csoportok és (3) bázikus hidrofób csoportok. A semleges típusú aminósavak lehetnek hidroxilcsoportot tartalmazók, mint például Ser és Thr; amidok, mint például Asn és Gin; aromás gyűrűt tartalmazó aminósavak, mint például Tyr és Trp; szulfhidril-csoportot tartalmazó aminósavak, mint például Cys, és kis szerkezetű aminósavak, mint például Alá és Gly. A poláros csoportban találhatunk savas hidrofil maradékokat, amelyek lehetnek aazparaginsavak, glutarainsav és tirozin, valamint bázikus hidrofil” maradékokat, mint például His, Lys és Arg.

Az ”1-11 bármely aminósavat tartalmazó peptidcaoport elnevezés alatt azt értjük, hogy ez aminósev szekvenciát a mag aminósav egység (Aj-A^) akár aminovagy karboxi- végcsoportjához csatolva alkalmazzuk, úgy, hogy a vegyület megőrzi alapvető hatásosságát.

- 21 Y jelentése olyan kémiai csoport, amely alkalmazható a terminális aminósav helyettesítésére vagy módosítására.

Ennélfogva Y jelentése lehet karboxamid-csoport, alkoxiészter-csoport, alkilamid-csoport, alkilamin-csoport vagy tioalkil-éter-csoport.

A találmány szerinti (1) általános képletü polipcptidek bármely nem toxikus szerves vagy szervetlen savval gyógyszerészetileg elfogadható sót képezhetnek. Például alkalmazható szervetlen savak sóképzésre lehetnek sósav, a hidrogénbromid, a kénsav, a foszforsav és a savas kénsók, mint például a nátriummonohidrogénortofoszfát és a káliumhidrogénszulfát. Alkalmazható szerves savak, amelyak alkalmas sót képeznek lehetnek mono- di- és trikarbonsavak. Ilyen savak például az ecetsav, a glikolsav, a tejsav, a piroszőlősav, a malomsav, a borkősav, a glutársav, a fumársav, az almasav, a borostyánkősav, a citromsav, az aszkorbinsav, a maloinsav, a hidroximaleinsav, a benzoesav, a hidroxi-benzoesav, a fenilecetsav, a fahéjsav, a szaliclleav, a 2-fenoxi-benzoesav és a szulfonsavak, mint például a metánszulfonsav és a 2-hidroxi-etánszulfonsav. A karboxi-terminális aminősav sói lehetnek nem toxikus karbonsav sók, amelyeket bármely alkalmas szervetlen vagy szerves bázissal képezhetünk. Ilyen sók lehetnek például alkálifémsók* mint például nátrium és káliumsó) alkáli földfém sók, mint például kálcium és magnézium sók| könnyűfém sók, amely ···

- 22 féeak a ΠΙΑ csoporthoz tartoznak, mint például alumíniumsőt és szerves elsőrendű, másodrendű vagy harmadrendű aminokkal képzett sók, mint például trialkil-aminokkal képzett sók, például trietilaminnal, prokainnal, dibenzilaminnal, 1-eténeaminnal, N,N’-dibenzil-etilén-dlaminnal, dihidro-abist Heroinnal, N-kis szénatomszámú elkil-piperldinnel és bármely más, alkalmas aminnal képzett sók.

A szokásos peptid kémiában alkalmazott nevezéktan szerint amennyiben például az olyan vegyületet jelent, amelyben az A₁₃ maradék és az A^ maradék egyaránt Leu, és ezt egy redukált tiometilén-kotés kapcsolja össze, a Pho (CH₂S)Leu jelöléssel jelölhetjük. Ez e jelölés kifejezi, hogy az utolsóelőtti Phe egység karbonilcsoportja tlometilén-csoporttá redukált. Az (1) általános képletü peptid származékok előállítási eljárását, amelyekben ψjelentése - CHgS- csoport, azaz a vegyületek a (CH₂S) típusú vegyületek, Spatola és Oarlak, Tetrahedron Letters. 44 (3), 821-33 (1988) közleményükben leírták. Más, jelen találmány szerinti peptidszármazékok leíróiéra alkalmazott metilén-szulfoxid elnevezés ^(CH₂S(0|) megtalálható Edward és Spatola Journal of Liquid Chromatography, 915, 903-919 (1986) közleményében. Ezen túlmenően a tiometilőn-csoport metilén-szulfoxid csoporttá történő oxidációja után két metllén-szulfoxid-peptid-izomer létezik, amelyeket (^(CHgSCO))¹) és ( Y(CH₂S(O))ⁿ) jelöléssel különböztetünk meg. A leírásba beleértendő, hogy ezek az izomerek izolál

hatók és abszolút konfigurációjuk meghatározható. A leírásban alkalmazott ^(CHjSÍO}) jelölés mindkét Izomer együttes vagy elválasztott jelenlétét jelöli. A (^ (CH₂S(O))*) és a ( V(CH₂S(0))^) izomerek sorrendben 5»40 perc és 6.28 perc retenciós idővel rendelkeznek, C18 Vydac analitikai oszlopon végzett (4.6 mmlO x 25 cm, 5 mikron G18) végzett elválasztás során, amely elválasztásban az áramlási sebesség 2 ml/perc és az eluens 25-75% acetonitril/víz lineáris gradiens keverék, amely 0.1% trifluórecetsavat tartalmaz, valamint az elúciót 25 percig hajtjuk végre.

í

A találmány szerinti peptid származékok Bombesin/ GRP antagonista hatását kimutathatjuk azáltal, hogy ezek a peptidek kompetitív kötődést mutatnak radióaktív jódozott bombesin/GRP anyagokkal szemben emlős bombesin/ GRP receptorok esetében, amely tulajdonságukat Buck és munkatársai, Science 226: 987-989, 1984 közleményében leírt eljárással határozhatjuk meg. A találmány szerinti vegyületek bombesin/GRP indukált foszfatidil-inozitol felvételt stimuláló vagy inhibiáló hatását Bristow és munkatársai British 3. Pharmacol. 90: 211-21, 1987 közleményében leírt eljárással határozhatjuk meg.

A találmány szerinti vegyületek közül bizonyos vegyületek különösen előnyös tulajdonságaik. A feltalálók

szerint az (1) általános képletü vegyületek közül előnyösek az alábbiak:

Előnye peptid származékok a

általános képletü vegyületek vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói, ahol az általános képletben

X jelentése araino-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-10 szénatomszámú alkilcsoport, egy vagy két 2-10 szénatomszámú acil-csoport, karbobenziloxi-karbonil csoport, vagy t-butiloxi-karbonil csoport) hacsak az amlnoterminália aminósav nem ciklusos származék, amely esetben X jelentése elhagyott)

N jelentése Bombesin, GRP vagy ezek természetes variánsainak szekvenciája, vagy szekvencia részlete, egy kötés vagy 1-11 bármely AMInósavat tartalmazó peptid egység) hacsak a terminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben H jelentése elhegyotti ·· ·· • · ·

- 25 • · · ♦ ···· ···· ···

A| jelentése pGlu, vagy alkalmas savas hidrofil maradékι

A₂ jelentése Gin, vagy alkalmas semleges vagy hidrofób maradék, Nle, o(-amino-batánsav, pSubPhe, BNap, vagy egy kötési

A_? jelentése Arg, alkalmas bázikus hidrofil maradék vagy egy kötési

A^ jelentése Leu, vagy A₂ jelentősével megegyezői

Aj jelentése Gly, az A₂ jelentésével megegyező, D-Phe, vagy D-Als; _e

Ag jelentése Asn, A₂ jelentésével megegyező, O-Ala, PGlui

Ay jelentése Gin, His, alkalmas semleges hidrofób vagy bázisos hidrofil maradék, vagy

Napi

Αθ jelentése Trp, alkalmas semleges maradk, vagy Met;

A_? jelentése Alá, vagy A₂ jelehtésével megegyezői Α_χ0 jelentőse Val, vagy A₂ jelentésével megegyező; Ajj jelentése Gly, alkalmas semleges maradék, Phe, vagy O-Phei

A|₂ jelentése His, alkalmas semleges vagy bázisos hidrofil maradék, Tyr, D-Phe, vagy pSubPhe|

A|j jelentése Leu, Phe, vagy alkalmas hidrofób vagy semleges maradék

V jelentőse A13_ea a¹⁴aa dipeptid, ahol jelentőse (CH₂S), (CH₂S(O)), ^(CHjSCO))¹, ős ^(CH2SO)^H, ahol A13aa ős A^aa jelentőse szubsztituált aminósavak;

A₁₄ jelentőse Leu, Met, Nle, vagy alkalmas hidrofób vagy semleges maradék;

C jelentőse Bombeslg, GRP vagy természetes variánsuk szekvenciája, vagy ennek részlete, egy kötés, vagy 1-11 bármely aminósav maradékot tartalmazó peptid; ős

Y jelentőse karboxl-termlnálls maradék, amely le- het hidroxilcsoport, 1-8 szénatomszámú alkoxi-őszter, karboxamld-csoport, mono- vagy dl- 1-4 szénatomszámú alkil-amid, 1-4 szénatomszámu alkilamin, 1-4 szénatomszámú tloalkllőter.

Különösen előnyős találmány szerinti peptid származékok a x-n-a₁-a₂_a₃-a₄-a_|-a₆-a₇-a₈.a₉.a₁₀-a₁₁-a₁₂-a₁j-'Í-a_u-c-y általános képlete vegyületek, ahol az általános képletben:

X jelentése amino-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-10 szénatomszámú alkilcsoport, egy vagy két 2-10 ezénatomszámú acil-csoport, karbobenzlloxi- vagy t-butiloxi-karbonil-csoport; hacsak az amino-terminális acninősav nem ciklusos aáraazék, amely esetben

X jelentése törölt,

N jelentése gombsain, GRP, vagy természetes variánsaik, vagy ezek szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósavet tartalmazó peptid egység; hacsak a terminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben N jelentése törölt;

A| jelentése pGlu vagy egy kötés;

A^ jelentése Gin vagy egy kötés;

Aj jelentése Arg vagy egy kötés;

A^ jelentése Leu vagy egy kötés;

A₅ jelentése Gly vagy egy kötés;

A_fi jelentése Asn, pGlu, Gly, vagy 0-Phe;

Αγ jelentése Gin vagy Mis;

Αθ jelentése Trp;

Aj jelentése Alá;

A|q jelentése Vei;

Ajj jelentése Gly;

• « · · ·*· • » ·

jelentése A^ga^A^gg, dipeptid, ahol Ψ jelenté-

feleié szubsztituens aminősav;

A₁₄ jelentése Leu, vagy Nle;

C jelentése bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk, vagy szekvencia részletük, egy kötés vagy 1-11 bármely aminésavat tartalmazó peptid egység;

Y jelentése karboxi-terminális maradék, amely lehet hidroxilcsoport, 1-8 szénatomszámó alkoxi-csoport, aminócsoport, mono- vagy di- 1-4 szénatomszámú alkilcsoporttal szubsztituált aminésav, vagy egy alkoholterminális maradék;

és

X jelentése hidrogénatom, acetil-csoport vagy szukcinil-csoport.

Peptid előállítás;

A találmány szerinti peptideket a szakirodalomban Ismert számos eljárással könnyen előállíthatjuk. Ilyen eljárások lehetnek szilárdfázisú szekvenciális vagy blokk szintézis, glén«·· «··

- 29 klónozás és a fenti technikák kombinációi. A szilárdfázisú szekvenciális eljárást automatizált eljárással hajthatjuk végre, és például automata peptid szintetizátort alkalmazhatunk. Ebben az eljárásban a peptideket úgy állítjuk elő, hogy a szintézist a gyantán egy olyan dipeptid egységen kezdjük, amely védett dipeptid, a C-terminális aminósavval kapcsolódik a metil-benzhidril-amin-gyantéhoz és az aminósavak közötti tiometilén-metilén-szulfoxid hidat tartalmazza. A peptid szekvencia növelését standard eljárással végezzük, amely a berendezés gyártója által leírt, és a szakember előtt Ismert.

Miután a szekvencia kapcsolását befejezzük, a molekulán vagy rajta hagyjuk a Boc védőcsoportot, vagy ezt eltávolítjuk és az N-terminális aminócsoportot acilezzük. A védett fragmens gyantáról való eltávolítását hidrogénfluoridos eljárással végezzük.

Az egyes polipeptld szekvenciába bevezetett aminósavakon alkalmazott -aminócsoport védőcsoport bármely ilyen szakirodalomban ismert védőcsoport lehet. Az ide beleértett oC-aminócsoport védőcsoportok például lehetnek (1) acil típusú védőcsoportok, mint például: formil-csoport, trifluóracetll-csoport, ftalil-csoport, toluol-szulfonil-csoport (tozil-csoport), benzolszulfonil-csoport, nitro-fenil-szulfenil-csoport, tritil-szulfenil-csoport, o-nitro-fenoxiacetil-csoport és o(-klór-butiril-csoport; (2) aromás karbamid • · «· < ·« • · ·*···» «· ·· ·«· · »·» ««······ · « t

- 30 típusú védőcsoportok, mint például benziloxi-karbonilcsoport, és szubsztituált benziloxi-karbonil-csoport, mint például p-klór-benziloxi-karbonil-csoport, p-nitrobenzil-karbonil-csoport, p-bróm-benziloxi-karbonil-csoport, p-metoxirbenziloxi-karbonil-csoport, l-(pbifenilil)-l-metil-etoxi-karbonil-csoport, K, X -dimetll3,5-dimetoxi-benziloxi-karbonil-csoport és benzhidril□xi-karbonil-csoport; (3) alifás karbamid típusú védőcsoportok, mint például t-butiloxi-karbonil-csoport (Boc). Oiizopropil-metoxi-karbonil-csoport, izopropiloxi-karbonil-csoport, etoxi-karbonil-csoport és aliloxikarbonil-csoport; (4) cikloalkil típusú karbamid védőcsoportok, mint például ciklopentiloxi-karbonil-csoport, adamantiloxi-karbonil-csoport és ciklohexiloxi-karbonilcsoport; (5) tiokarbamid típusú védőcsoportok, mint például feniltio-karbonil-csoport; (6) alkil típusú védőcsoportok, mint például trifenil-metil-csoport (tritilcsoport) és benzil-csoport; és (7) trialkil-szilil-csoportok, mint például trimetil-szilil-csoport. Előnyösen alkalmazható PÁ-aminőcsoport védőcsoport a t-butiloxikarbonil-csoport (Boc).

Mint a szilárdfázisú pepiid szintézis szakirodalmában Ismert, számos aminósav olyan funkciőscsoportot tartalmaz, amely a lánc előállítása során védőcsoporttal látandó el. A megfelelő védőcsoportnak kiválasztása és alkalmazása a szakember előtt ismert, és attól függ, hogy « « · ···· ···«

- 31 aminósavat kívánunk védeni, valamint milyen más, védett aminősavak vannak a paptidláncban. Az ilyen oldallánc védőcsoportok kiválasztása kritikus, mivel a védőcsoportnak olyannak kell lennie, amely nem hasad le ez ^-aminőcsoport védőcsoport lehasítása során, például alkalmas oldallánc védőcsoportok lizin esetében a benziloxlkarbonil- csoport és a szubsztituált benziloxi-karbonilcsoport, ahol a szubsztituens lehet halogénatom (például klőratom, brómatom, fluóratom) és nitrocsoport (pl. 2-klór-benzlloxi-karbonil-csoport, p-nitro-benziloxi-karbont1-csoport, 3,4-diklór-benziloxl-karboniΙο söpört), tozil-csoport, t-amlloxl-karbonil-csoport, t-butiloxl-karbontl-csoport és dlizopropil-motoxi-karbonil-csoport. A troonin és szerin alkoholos hidroxilcsoportját acetil-csoporttal, benzoil-csoporttal, tbutil-csoporttal, tritil-csoporttal, benzil-csoporttal,

2.ó-diklór-benzll-capporttal vagy benziloxi-karbonilcsoporttal védhetjük. Előnyösen alkalmazott védőcsoport a benzil-csoport.

A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakirodalomban ismert, és a szakember felismeri. Különösen alkalmas kapcsoló reagens, amennyiben a kapcsolt aminósav Gin, Asn vagy Arg, az Ν,Ν'-diizopropil-karbodiimld és az 1-hldroxl-benzotriezol, Az ilyen reagensek alkalmazása megakadályozza nitril ée laktán képződését. Más alkalmazható kapcsoló reagensek (1) a karbodiimidek (pl. N,N’-di

- 32 ciklohexil-karbodiimid ős N-etil-N'-(γ-dlmetil-aminopropiD-karbodiimid); (2) a ciánamidok (pl. az N,N-dibenzil-ciánamld)} (3) 8 keténiminek; (4) az izoxazólium sók (pl. H-etil-5-fenil-izoxazólium-3'-szulfonát); (5) a monociklusos nitrogéntartalmú heterociklusos amidok, amelyek aromás jellegűek és 1-4 nitrogént tartalmaznak a gyűrűben, mint például az imidazolidok, a pirazolidok és az 1,2,4-triazolidok. Ilyen heterociklusos alkalmazható amidok például az Ν,Ν'-karbonil-diiimidazol és az N,Nkarbonil-di-1,4-triazol; (6) az alkoxilezett acetilének (pl. az etoxl-acetilén)i (7) az aminósav karboxilcsoportjával vegyes anhidridSt képező reagensek (pl. etil-klórformiát és izobutil-klór-formiát) vagy a kapcsolandó aminósav szimmetrikus anhidridjei (pl. Boc-Ala-O-tla-Boc), (8) a gyűrő egyik nitrogénatomján hidroxilcsoportot tartalmazó nitrogén tartalmú heterociklusos vegyületek (pl. N-hidroxi-ftálimid, N-hidroxi-szukcinlmid és I-hidroxi-benzotriazol) és (9) difenil-foszforilazid. Más aktiváló reagenseket és peptid kapcsolásban való alkalmazásukat írt le Kapoor, J, Pharm, Sci., 59. 1-27 (1970) közleményében. A feltalálók előnyösnek találják kapcsoló reagensként valamennyi aminósav esetében a szimmetrikus anhidrid alkalmazáát, kivéve az Arg, Asn és Gin esetét.

Valamennyi védett aminósavat vagy aminósav szekvenciát a szilárdfázisú reaktorba körülbelül négyszeres feleslegben tápláljuk be és a kapcsolást dimetilformamid:

- 33 diklórmetán (1:1) vagy tiszta dimetilformamid, vagy előnyösen tiszta diklórmetán oldószerben hajtjuk végre. Azokban az esetekben, amennyiben a kapcsolás nem teljes, a kapcsolási eljárást az K-sminócsoport védőcsoport eltávolítása előtt megismételjük, mielőtt a következő aminósavat a szilárdfázisú reaktorba betáplálnánk. Minden egyes fázisban a kapcsolási reakció sikerességét ninhidrin reakcióval ellenőrizhetjük az E. Kaiser ás munkatársai, Analyt, Biochem. 34, 595 (1970) közleményében leírt eljárás szerint.

Miután az K-aminócsoporton védett aminósavat a gyantahordozóhoz kapcsoltuk, a védőcsoportot bármely alkalmas eljárással, mint például trifluór-ecetsavat diklórmetánban, trlfluór ecetsavat önmagában, vagy sósavat dioxánban alkalmazva eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítást 0°C és szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Az egyes K-aminócsoport védőcsoportok eltávolítására más, standard hasító reagenseket is alkalmazhatunk. Miután az c^-aminócsoport védőcsoportot eltávolítjuk, lépésenként más aminócsoporton védett aminősavakat kívánt sorrendben a lánchoz kapcsolunk. Más eljárás szerint több aminésavból álló csoportokat kapcsolhatunk egymáshoz oldatban végzett eljárással azelőtt, mielőtt ezt az együttest a gyantahordozóra felvitt aminósav szekvenciához kapcsolnánk.

Miután a kívánt amlnósav szekvenciát előállítottuk, a pepiidet a gyantáról lehasítjuk. A hasítási eljárást például hidrolízissel végezhetjük, és például a gyantához kötött polipeptidet | amaly a gyantához egy aminósavon keresztül kapcsolódik, alkohol és ecetsav diklórmetános oldatával végezhetjük. A védőcsoportökat a szakirodalomban jól ismert eljárásokkal távolíthatjuk el. Oellemzően a védőcsoportok eltávolítását akkor végezzük, amikor a peptidlánc szintézise befejeződött, de a védőcsoportok kívánt esetben a szintézis bármely más lépésében is eltávolíthatók. A peptidek tisztítását alapvetően preparetív, reverz fázisé nagynyomású folyadékkromatográfie segítségével végezzük, amely a szakember előtt ismert.

Más eljárásban, amennyiben metilén-szulfoxid előállítása kívánatos, a tiometilén-csoport oxidációját számos oxidálószerrel elvégezhetjük. Az egyik eljárás szerint a tiometilán-psptidet hidrogénperoxid vizes oldatával reagáltatjuk, és így a pepiidet metilén-szulfoxid-származékká alakítjuk. Az izomerek elválasztását nagynyomású folyadékkromatográf la segítségével végezhetjük, amely a szakember előtt ismert. Például C18 reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást alkalmazhatunk a metilén-szulfoxid-peptid izomerek elválasztására.

• ·

- 15 Terápiás alkalmazás

Az emésztési fekélybetegségek általában súlyosbodások és enyhülések ismétlődé folyamatából állnak. Ebből következően a fékéiyes betegségeket krónikus betegségként kell kezelni. Az emésztőszervek fekélyei (nyelőcsövi, gyomor és nyombél) az emésztő-bélrendszer azon traktusában jönnek létre, amelyek savnak és pspszinnek vannak kitéve. A találmány szerinti vegyületek, amelyek alkalmasak bélemésztőrendszer és/vagy hasnyálmirigy fekélyek kezelésére, úgy hatnak, hogy a hasnyálmirigyben és/vagy gyomorban létrejövő túlzott szekréciót különösen sósav és pepszin szekréciót inhibiélják. Mint ilyenek, a találmány szerinti vegyületek alkalmasak emésztőrendszeri fekélyek kezelésére.

A találmány szerinti peptid származék alkalmas dózisa emésztőrendszerű fekélyek kezelésében 0.2 mg/kg - 250 mg/kg beteg testsúly/nap, és a dózis függ a betegtől, az emésztőrendszeri fekély súlyosságától, valamint a választott peptid származéktól. Az egyes beteg evetében alkalmazandó dózist könnyen meghatározhatjuk. Előnyösen 1-4 napi dózist alkalmazunk, amely jellemzően 5 mg - 100 mg aktív hatóanyagot jelent dózisonként. A gyomorsav szekréciót inhibiéló hatásos találmány szerinti peptid mennyiséget a szakember könnyen meghatározhatja.

- 36 A bombesin/QRP analógokat rák terápiában általában SCLC és prosztata karcinómák kezelésére alkalmazzák, valamint különféle más, rákos megbetegedések megelőzésére alkalmazzák. A szakember könnyen felismeri azokat a körülményeket, amelyek rák terápia alkalmazását igénylik. A beteg elnevezés alatt emlősöket, mint például főemlősöket, beleértve az embert, juhot, lovat, marhát, disznót, kutyát, macskát, patkányt és egeret értünk.

A rákos szövet elnevezés alatt jóindulatú és rosszindulatú rákos daganatokat, vagy neoplasmát értünk, és ez lehet melanoma, lymphoma, leukémia és sarcoma. Ilyen rákos szövetek például bőrhöz kötődő szövetek, mint páldául rosszindulatú melanóma és gombás fertőzési haematológiás rákos megbetegedések, mint például leukémiák, például akut nylrokszövsti leukémia, akut velősejt leukémia vagy krónikus velősejt leukémiái lymphoma, mint például Hodkin-betegség vagy rosszindulatú lymphoma; nőgyógyászati tumorok, mint például petefészek és méhtumoroki urológiai tumorok, mint például prosztata húgyhólyag vagy here tumorok} lágy szöveti sarcomák, csont vagy nem csont sarcomák, mellrákoki hypopysls, pajzsmirigy és mellékvesekéreg tumorok} gyomor-bél tumorok, mint például nyelőcső, gyomor, bél és vastagbél tumoroki hasnyálmirigy és májtumorok} gégecső papilloma és tüdőtumorok.

J

- 37 A növekedés kontrollja alatt a rákos betegségek kezelésén azt értjük, hogy melegvérű állatokban a gyorsan növekedő tumor növekedését lelassítjuk, megszakítjuk, leállítjuk vagy megállítjuk, és a metastasis kialakulását leállítjuk; a melegvérű állat kezelésébe beleértjük, hogy ez nem jelenti általában ezt, hogy a tumort meggyógyítjuk olyan értelemben, hogy a tumoros szövetet szétroncsoljuk vagy teljesen megszűntetjük.

A találmány szerinti peptid származékok alkalmas dózisa tumoros szövet vagy rákos daganat növekedésének kezelésére a kis sejtő tüdő karcinómát vagy prosztata rákos megbetegedést is bele értve, 0.2 mg/kg - 250 mg/kg beteg testsúly/nap, amely dózis függ e kezelt betegtől, a kis sejtű tüdfikercinóma betegség súlyosságától és az alkalmazott peptidszármazék fajtájától. Az adott beteg esetében alkalmazandó megfelelő dózist könnyen meghatározhatjuk. Előnyösen napi 1-4 dózist alkalmazunk, jellemzően 5 mg - 100 mg aktív hatóanyagot adagolunk dózisonként. A találmány szerinti peptid mennyisége, amely SCLC növekedés inhibiálásához szükséges, a szakember által könnyen meghatározható.

Általában ismert, hogy a rákos betegségek kezelésében alkalmazott terápiás szereket más terápiás szerekkel vagy rák kezelésében használt terápiákkal együttesen alkalmazzák. A találmány szerinti peptidek ugyancsak al« ·

I

- 38 kalmazhatők kapcsolt terápiás eljárásokban. Például az (1-5) általános képleté peptideket alkalmazhatjuk a rákos daganat sebészeti eltávolításával vagy besugárzásos terápiájával, immunoterápiával vagy helyi melegítéses terápiával kapcsoltan. Az (1-5) általános képletü peptidek előnyős rákos kezelésben való alkalmazási módja kémiai citotoxikumokkal együttes alkalmazás, amely citotoxikumokat rákos betegségek kezelésében alkalmazhatnak. Ilyen kémiai cltotoxikumok lehetnek például a ciklofoszíamid, a metotrexát, a prednison, a 6-merkapto-purin, a procarbazin, a danorubicin, a klórambucil, a cytosin, az arabinozid, a 6-tioguanin, a tio-TEPA, az 5-fluór-uracil, az 5-fluőr-2-deoxl-uridin, az 5-aza-citidin, a nitrogén mustár, az 1,3-bis<2-klór-etil)-l-nitrozo-karbamid (BCNU), az l-(2-klór-etil)-3-ciklohexil-l-nitrozokarbamid (CCNU), a busulfan, az adriamycin, a bleomycin, a vindesin, a cikloeucin vagy metilglioxál-bis(guanilhidrazon) (MGBG). Amennyiben ilyen kombinációs terápiát alkalmazunk, a citotoxikus hatóanyag hatásossága potencírozható. Ennélfogva az ilyen kombinált terápia alkalmazása lehetővé teszi, hogy a citotoxikus szerből kisebb dózist vagy kevesebb alkalma dózist alkalmazzunk. A kombinált terápia alatt azt értjük, hogy az (1-5) általános képleté pepiidet a citotoxikus szerrel végzett kezelés előtt ezzel párhuzamosan, vagy közvetlenül az ilyen kezelés befejezése után alkalmazzuk. Amennyiben ilyen kombinált terápiát alkalmazunk, rákos megbetegedés kezelésé • · ·»···· • · · · ··· β ··· ········ · · ·

- 39 re, a citotoxikus szert a szakirodalomban ismert, hatásos dózis mennyiségben alkalmazhatjuk. Azonban az alkalmazott (h5) általános képletü peptid additív vagy szinergetikus hatást eredményezhet a citotoxikus szerrel egy adott tumor esetében. Ennélfogva amennyiben ilyen kombinált rákellenes terápiát alkalmazunk, az adagolt citátoxikus szer mennyisége kisebb lehet, mint az egyedüli alkalmazáskor alkalmazott dózis. Az (1-5) általános képletü peptiddel kombinációban alkalmazva a citotoxikus szert kisebb dózisban alkalmazhatjuk, vagy kevésbé gyakori dózisban alkalmazhatjuk, mint olyan esetekben, amennyiben a citotoxikus szert önmagában használjuk. Hasonlóan, amennyiben kombinált terápiát alkalmazunk, az (1-5) általános képletü peptid dózisa illetve alkalmazásának gyakorisága kisebb lehet, mint amennyiben ezt a hatóanyagot citotoxikus szer nélkül alkalmazzuk.

Habár néhány peptidszármazék túlélheti a nyelőesövön keresztül haladást orális adagolás esetében, a feltalálók előnyösnek találják a találmány szerinti hatóanyag nem orális úton történő, például subcután, intravénás, lntramuszkulárls vagy intraparltoneális alkalmazását. Beültetett injekció formában történő alkalmazását, beültetett készítmény formában történő alkalmazását vagy nyálkahártyára történő alkalmazását, mint például orrban, torokban és hörgőkben történő alkalmazását, például a peptid származékot tartalmazó aerosol formában, vagy szárazpor

Parentárális adagolás céljára a találmány szerinti vegyületeket injektálható dózis formában alkalmazhatjuk, amely lehet a találmány szerinti vegyület oldat, vagy szuszpenzió formája, gyógyszerészetileg elfogadható hígitóanyagban, amely lehet steril folyadék, mint például víz vagy olajok, és amely kívánt esetben tartalmazhat felületaktív anyagot vagy más, gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagokat. Alkalmazható olajok például az ilyen formált alakokban a petróleum, az állati, a növényi vagy a szintetikus eredetű olajok, például a mogyoróolaj, a szójaolaj és az ásványi olaj. Általában előnyős folyadék hordozóanyagok különösen injektálható oldatok számára a víz, a fiziológiás sóoldat, a vizes dextróz és hasonló cukoroldatok, az etanol és a glikolok, mint például a propilén-glikol vagy polietilén-glikol.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

1. példa

A meghatározó A-^-aa (CHoS)A-^ea dipeptid előállítása

2-merkapto-4-aetil~pentánsav (merkapto-leucin: 1 vegyület) ·♦ ·· ···*

- 41 5 g D-leucln ás 114 g káliumbromld 400 ml 2.5 n kénsav oldatban készült oldatét jeges sós fürdővel -5°C hőmérsékletre hötjük. Az oldathoz 30 g nátriumnitrit 70 ml vízben készüli hideg oldatét csepegtetjük keverés közben (0-50°C). A reakcióelegyet körülbelül 14 éréig szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet háromszor 75 ml éterrel extraháljuk. Az éteres extraktumot vízmentes nátriumszulfáton megszárítjuk. Az oldatot leszűrjük és az étert elpárologtatjuk. A kapott világos olajos 2-bróm-4-metil-pentánsavat (18 g) (Martin és Greco, (1968)

3. Org. Chem. 33, 1275-¹²⁷⁶* 250 ml 33%-os nátriumtritiokarbonát oldathoz adjuk 0°C-on keverés közben. A reakcióelegyet 48 óráig keverjük, majd 0°C hőmérsékleten 10 n kénsav segítségével megsevanyítjuk. A megsavanyított oldatot ezután háromszor 75 ml éterrel extraháljukl Az éteres extraktumot vízmentes nátrlumszulféton megszárítjuk és az étert vákuumban elpárologtatjuk. A kapott sárgás olajos anyagot (17 g) vákuumdesztillációval tisztítjuk. A végső termelés 15.3 g (S)-2-merkapto~4-metil-pentánsavi f.p.: 92-93 (0.75 Hgmm)} (K)²⁵ _Q -23.2° (c « 1, MaOH).

(S)-(t-butlloxi-karbonil)-2-amino-3-fenil-propanll-ptoluolszulfonát (2 vegyület)

A címbeli vegyület előállításához alkalmazott kiindulási reagenst (S)-(t~butiloxi-karbonil)-2-amino-3-

fenil-propanolból (4.5 g, 0.0179 mól; amelyet L-fanilalaninolból (Sigma) és di-t-butil-dikarbonátból állítunk elő) állítjuk elő. A kiindulási reagenst ezután 20 ml piridinhez adjuk vízmentes körülmények köaOtt, és az elegyet szárazjeged acetonos fürdővel -40°C hőmérsékletre hűtjük. Az elegyhez ezután 6.9 g (3.6 romol) tozilkloridot adunk. A reakcióelegyet 4°C hőmérsékleten keverjük. A kiváló piridinium-kloridot nem távolítjuk el. A reakció befejeződése után a piridint vákuumban ledesztilláljuk és a kapott szilárd maradékot éterben oldjuk. Az éteres extraktumot vízmentes nátriumszulfáton megszáéátjuk, leszűrjük, és az étert vákuumban elpárologtatjuk. 10.5 g olajos terméket kapunk, amelyet etilacetát-hexén oldószerelegyből csapadékként leválasztunk* 9.0 g fehér szilárd terméket kapunk, o.p.: 109-110°C, (S)-(S)t-butl.bxl-k.rb₀nll-PheVcCH;S)L8U-OH .lWMtta

0.43 mol-os nátrium-etoxid oldatot (A oldat) készítünk frissen vágott nátriumból és vízmentes etanolból. 0.72 g (S)-2-merkapto-4-metil-pentánsavat (1 vegyület) oldunk 25 ml etanolban (B oldat), nitrogén atmoszférában 15 ml B oldathoz lassan 13.5 ml A oldatot adagolunk. Az elegyet 5 percig keverjük, majd az etanolt vákuumban elpárologtatjuk. A fehér szilárd maradékot benzollal is- 43 mételten bepároljuk, amíg szárazzá nem válik. A kapott merkapto-leucin dinátrium sót körülbelül 1 ml dimetilszulfoxldon (DMSO) oldjuk, és az oldathoz 1.58 g 2 vegyület 2 ml dimetilszulfoxidban készült oldatát adagoljuk. A reakcióelegyet éjjelen át keverjük,majd 175 ml desztillált vízzel elegyítjük. A keveréket háromszor 20 ml éterrel extraháljuk, majd 5n sósavval Qo_c hőmérsékleten keverés közben megsavanyítjuk. A vizes oldatot ezután ismét háromszor etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot telített sóoldattal mossuk, majd nátriumszulfáton megezári tjük, leszűrjük és az etilacetátot vákuumban elpárologtatjuk. 1.05 g világos színű olajat kapunk, amelyet etilacetát-hexán oldószerelegyböl kristályosítunk. 0.83 g fehér, szilárd terméket kapunk; o.p.: 110-111, *O²⁵ 52.50 _{(c B 0 88í} ϋΐθΐ 3^1^25)180

14)8ombesin (4 vegyület)

A 3 vegyület (0.20 g) 4-metil-benzhidril-amin-gyantához (MBHA) való acilkötését a 3 vegyület 0.113 g diciklohexil-karbodiimid 0.074 g hldroxi-benzotriazol és 0.414 g MBHA 20 ml diklórmetán: dimatilformamid (9:1; tí/tf) oldatban való elegyítésével végezzük. A 3 vegyület kapcsolását Vega szilárdfázisú peptid szintetizátorba végezzük, amelyet az irodalmi eljárás szerint félautomata módon működtetünk. Két óra kapcsolás után a reakciót nlnhidrin próbával ellenőrizzük. A kapott Boc-Phe^(CH2S) Leu MBHA gyanta amidot dimetilformamiddal majd etanollal mossuk és megszárítjuk. így 0.498 g terméket kapunk, amely 0.53 mmo/g gyanta szubsztitúciós szintű. Az aminősav szekvencia növelésének peptid szintézis szilárdfázisú eljárását egy Applied Biosystems peptid szintetizátoron végezzük standard eljárás szerint, amely a gyártó előírásainak felel meg, és amely a szakemberek előtt ismert.

A teljes, gyantához kötött peptidet (0.712 g termelés) a gyantáról hidrogénfluorid (10 ml/g gyanta) Q°C-on anizol jelenlétében (etán-ditiol 1 ml: 0.5 mg gyanta) alkalmazásával egy óra reakcióidőig végezzük. A hidrogéntluoridot eltávolítjuk, majd a gyantát 2 x 30 ml dietil-éterrel keverjük és extraháljuk, ezt követően 30%-os ecetsavvöl extraháljuk. Liofilozálással 250 mg nyers terméket kapunk. A termék 400 mg részletét preparatív reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével CX8 Oynamax oszlopon tisztítjuk, gradiens elúciót alkalmazunk (15 perc acetonitril gradiens 20-30% 40 ml/parc; amelyet acetonitril és 0.1% TFA-t tartalmazó víz tartályokból készítünk). A fő csúcs négy frakcióját gyűjtjük, amely az Agj* értéknél abszorbciót mutat.

Az eljárással előállított peptidek kívánt molekula ion csúccsal rendelkeznek FAB-MS vizsgálatban, és az aninóeav • · ····«* • » · · ·9· · ··· ·*·· ···· · · · « · ·· ··* ··

- 45 analízis eredménye a kívánt pepiidnek megfelel. Ezzel az eljárással az alábbi peptideket állítjuk elő, amelyek a leírt tulajdonságokkal rendelkeznek.

1) pGlu Gin Arg Leu Gly Asn Gin Trp Alá Val Gly His

Phe (CH₂S)leu-NH₂

MS 1637 FAB-MS (MH)* 1638 t_R

55¾ peptid tartalom

2) Ac-D-Phe Gin Trp Alá Val D-Ala His Phe (CH₂S)Leu-NH₂

MS 1160 FAB-MS (MH)* 1161 t_R

09¾ peptid tartalom

3) Asn Gin Trp Alá Val Gly His Phe (CH₂S)Leu-NH₂

MS 1089 FAB-MS (MH)* 1090 t_R

52¾ peptid tartalom

4) Asn Gin Trp Alá Val Gly His Phe (CH₂S(O))Leu-NH₂

MS 1072 FAB-MS (MH)* 1075 t_R

50¾ peptid tartalom

5) PGlu Gin Trp Alá Val Gly His Phe (CH₂S(0))Leu-N«₂

MS 1069 FAB-MS (MH*) 1070 t_o

R

80¾ peptid tartalom • · ·♦···· • · · · *·· · ··· ··*· ···· « · » • · · · ··« · ·

- 46 6) pGlu Gin Trp Alá Vei Gly His Phe (CH₂S)Nle-NH₂

MS 1069 FAB-MS (MH*> 1070 t_R

WgU.l.feszulXpxid l?ome,r.9h?...........

& (Ph_ei]4⁾(CH_tlS(0))L₉u₁₎)^Ikltorln mg (Pheg(CH₂S)Leu?)LÍtorin anyagból a nagynyomású folyadékkromatográfiában alkalmazott eluens oldószerrel (0.1% TFA: acetonitril, 75:25, tfstf) 3 ml oldatot készítünk. A mintaoldathoz 0.25 ml 5%-os hidrogénperoxld oldatot adunk. Az elegyet két óráig 0°C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd preparatív reverz-fázisú rendszerbe tápláljuk (C18 Oynamax 300A° oszlop). A peptid diasztereomer metilén-szulfoxid származékokká történő oxidációját nagynyomású folyadékkromatográíia segítségével követjük, és ezt két közöl jelentkező slúciós csúcs mutatja, amelyeknek retenclós ideje jelentősen kisebb, mint a tlometilén-csoportot tartalmazó pepiidé. A metilén-szulfoxidokat reverz-fázisú nagynyomású folyadékkromatográf ia segítségével választjuk el és tisztítjuk. A Phe'l^,(CH₂S(0))^Leu Litorin és a Phe^CCHjSÍOD^Leu Litorin jelölését a reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás analízisben mutatott retenclós Idejük alapján választottuk.

Az eljárással előállított peptidek FAB-MS vizsgálatban kívánt molekula Ion csúcsot mutatnak és aminósav analízis eredményük megfelel a kívánt szerkezetnek. Ezzel az eljárással az alábbi megadott jellemzőkkel rendelkező pepii dekát állítjuk elő.

7) pGlu Gin Trp Alá Val Gly His Phe (CH₂S(O))^ILeu-NH₂

MS 1085 FAB-MS (MH*) 1086 t_R

55% peptid tartalom

Retenciós idő 5.40 perc*

8) pGlu Gin Trp Alá Val Gly His Phe (CH₂S(O))^IILeu-NH₂

MS 1085 FAB-MS (MH*) 1086 t_R

63% peptid tartalom

Retenciós idő 6.28 perc.*

A retenciós időt Vydac analitikai oszlopra,

4.6 mm ID x 25 cm, 5 mikron C18$ 2 ml/perc áramlási sebesség mellett 25 perc alatt 25% - 75% acetonitril line áris gradiens eluens alkalmazásával, amelyet 0.1% trifluórecetsavat tartalmazó vízzel elegyítünk, és a gradienst 25 perc időtartam alatt fejlesztjük ki, adjuk meg.

9 · 9 99 9 ·

9 ·9 9·9 · ··· • 9 99 999 9 9 9 Λ • · ·· 99 9 99

- Α8 I^jgáláa

A(Ph^CH^)l_9uH) BOMBESIH

9SHB.ESJN . RECEPTOR AHTAGOHIZMUSA. AMELYET A RECEPTORHOZ ItALS JtoOZOTT GRP-YEL ÖSSZEHASONLÍTOTT KOMPETITIV KOTOoeSSEL HATÁROZTUNK MEG

Egy vagy több egér hasnyálmirigyét gyűjtjük, felvágjuk és 50 mmol HEPES (pH 7.4) oldatban, amely 120 mmol NaCl-t és 5 mmol KCl-t tartalmaz homogenizáljuk 4°C hőmérsékleten. Ezután az elegyet 37,500 x g alkalnazáaéval 15 percig centrifugáljuk. A labdacsot 50 mmol HEPES (pH 7.4) oldatban, amely 10 mmmol EOTA-t és 300 omol KCl-t tartalmaz, újra szuszpendáljuk, majd 30 percig 4^eC inkubáljuk. Ezután a szuszpenziót a fenti módon centrifugáljuk, és a labdacsot kétszer 50 monoi HEPES (pH 7.4) oldattal mossuk, soely proteáz inhibitorokat tartalmaz. (10 um fenilmetll-szulfonil-fluorld, 1 un tülorphan, 40 ug/ml bacltracin, 10 mmol jód-acetimid és 4 ug/ml leupeptin), maOJ ismét centrifugáljuk. A szövetet ezután inkubálási pufférben újra szuszpendáljuk (1 ml/4 mg hasnyálmirigy), és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Ezután minden egyes vizsgálati csőbe 250 ul mennyiséget adagolunk · A vizsgálati csövek inkubálási puffért tartalmaznak, amely 50 mmol HEPES (pH 7.4) 0.5¾ BSA, proteáz inhibitort, 2 mmol MnClg^ 1 ua somatostatlntés a végső 500 ul térfogathoz szűk- 49 séges 125I-GRP és peptid anyagot tartalmaz. A vizsgálati mintát hagyjuk egyensúlyba kerülni 90 percig szobahőmérsékleten. Ezután minden egyes cső tartalmát gyorsan átszűrjük előre 0.1%-os politetilén-.Imin oldattal nedvesített Whatman GF/B szűrőpapíron leszűrjük. A szűrőpapírt gyorsan háromszor jegesen hűtött 50 mmol HEPES oldattal mossuk (pH 7.4). A szűrőhöz kötött rádiőaktivitást gamma számláiéval mérjük. A jódozott GRP kötődésével kompetitív vizsgált vegyület kötődést vagy standard kötődést százalékban fejezzük ki azzal összehasonlítva, amely kötődést olyan esetben tapasztalunk, amikor peptid jelenléte nélkül csak 125I-RRP anyagot alkalmazunk. Ligand módszerrel az affinitást és a maximális kötődést számítjuk (Biosoft, Cambridge, UK) ( 1. és 2. ábrák).

példa (Phs¹³V(CH₂S)Leu¹⁴) BOMBESSIN BOMBESSIN RECEPTORRA KIFEJTETT ANTAGONIZMUSA, AMELYET FOSZFATIOILINOZITOL KÖRFOLYAMATRA KIFEJTETT HATÁSSAL MUTATUNK KI

Egér hasnyálmirigyet gyűjtünk, és sejtaprítóban

350 mikrométer méretre aprítjuk. Az aprított szövetet kétszer Krebs-Hepes oldattal mossuk, majd 30 percig 37°C hőmérsékleten Krebs-Hepes pufferben lnkubáljuk úgy, hogy

- 50 minden 15 percben friss puffért adagolunk. Ezután a szövetet a fenti pufferben inkubéljuk, amely puffer 100-200 mikron Cl ³H-inozltolt tartalmaz 37°C hőmérsékleten egy óráig. Ezután a szövetet kétszer mossuk, majd újabb 30 peerpercig Krebs-Hepes oldatban inkubéljuk (amely 10 mmol Ll* tartalmú) 37°C-on úgy, hogy 15 percenként friss puffért adagolunk. A szövet tömeg 10 mg részleteit adagoljuk mintacsövekbe, amely mintacsövek Li+ puffért és proteált inhibitorokat (40 ug/ml bacitracin, 4 ug/ml leupeptin, 4 ug/ml chymostatln, 20 ug/ml tbiorpén), továbbá 0.1% BSA-t tartalmaz, majd 0.1-1000 omol peptidet adagolunk 25 mikroliter térfogatba, és a végső térfogatot 250 mikroliterre állítjuk be. Az antagonizmus mérése céljából az Li+ pufferben levő szövet részleteit előkezeljük egy un potenciális antagonista anyaggal 5 percig 25°C hőmérsékleten, mielőtt az agonista anyagot (6RP) beadagoljuk. 60 perc szobahőmérsékleten történő reakció után a foszfatidil-inozitol forgalmat befejezzük úgy, hogy az elegyhez 940 mikroliter kloroform: metanol (1:2) elegyet, majd 310 mikroliter kloroformot, végül 310 mikroliter vizet adagolunk. Ezután minden csövet 5 másodpercig örvényeltetünk, majd 2500 x g erővel 8 percig centrifugálunk. 900 mikroliter belső (vizes) fázist ezután 7.1 ml vízzel elegyítünk, és 0.5 ml-es Biorad AG-1X8 (formiát) Ioncserélő oszlopra vlsszükk Minden csőből 50 mlkrollter alsófázist (kloroformos) veszünk, és számlálócsőbe helyezzük, megszárítjuk, majd szintilláclós folyadékkal

•s • ·· a ···· ···»

4· • a *·· ·· számláljuk. Az oszlopra vitt anyagot sorrendben: 1) 10ml vízzel, 2) 5 ml 5 mmol dinátrium-tetraborát/60 mmol nétrium-formiét oldattal, 3) 10 ml 1 mól ammóniumformiét 0.1 mólos hangyasavban készült oldattal mossuk. A végsó (harmadik) mosást gyűjtjük, ás ennek 1 ml-őt 10 ml Bio-Safe sclntlllációs folyadékkal elegyítjük, majd számláljuk. A fenti számlálások arányát (teljes inozitol foszfátok) a megfelelő szerves fázis számlálásával meghatározzuk minden egyes minta esetében. Az arányokat a tesztvizsgálati anyag jelenlétében és/vagy standard anyag jelenlétében összehasonlítjuk a kontroll csövekben tapasztalt arányokkal (amelyekben nincs stimuláló agonista). Dózis-válasz függvényt készítünk, és meghatározzuk, hogy a tesztvizsgálati vegyület milyen mértékben képes stimulálni vagy inhiblálni a GRP Indukált foszfatidil-inozitol forgalmat, amely meghatározást grafikus analízissel végezzük, kompjűter program segítségével. Ezt a 3. és 4. ábrán mutatjuk be.

Ábrák leírása

Az 1. ábrán bemutatjuk, hogy a ¹²⁵I-GRP hogyan kötődik az egér hasnyálmirigy membrán egyszeres osztályú kötődési helyeihez (a bombesin/GRP receptorhoz) (1. példa). A 25-1600 pm ¹²⁵I-GRP kötését háromszoros kísér• · ·· hs.:.:. *··:

- 52 .:

··· ♦·

V · ··· •e letban vizsgáltuk majd analizáltuk, és LIGAND módszerrel ábrázoltuk. Az adatokhoz legjobban illeszkedő érték 19 pm receptor/mint (körülbelül 100 fmol receptor/mg membrán fehérje), amelynek Kd értéke 47 pm. _a|j_32Ci_SZ. szán (x tengelyen) jelöltük a receptorhoz kötött koncentrációt. Az ordinátán (y tenelyen) jelöltük a receptorhoz kötött 125j-GRP koncentráció és a szabad (nem

125 kötött) I-GRP koncentráció hányadosát. Az egyenes vonal azt jelzi, hogy egyetlen hely típus ven jeleni Azaz azt mutatja, hogy a 125x_GRP minden egyes receptoráboz azonos affinitással kötődik. Más kísérletek, amelyekben 25-3200 pm ¹²⁵I-GRP vagy 10 pm ¹²⁵I-GRP ♦ 8-500 pm GRP oldatot alkalmaztunk, hasonló értéket mutatott. Ez azt mutatja, hogy a bombesin/GRP receptorhoz való kötődést mérhetjük egér hasnyálmirigy membránokon a ^²⁵I-GRP kötődéssel való versengés értékével.

A 2. ábrán bemutatjuk a bombesin analógok kötődési képességét a GRP receptorhoz úgy, hogy bemutatjuk, hogy ezek a peptidek milyen mértékben versengenek a kötődésben 125 a I-GRP anyaggal egér hasnyálmirigy membránokon való kötődés esetében (1. példa). A kötődést háromszoros pár125 huzamos vizsgálatban mértük, amelyekben 0.1 nm I-GRP-t és jelzett koncentráció pepiidet alkalmaztunk. Az abszcisszán (X tengely) logaritmikusán ábrázoltuk a GRP rsc aptor agonlStt vagy antagoniste koncentrációt. Az ordi-

nátán (Y tengely) ábrázoltuk az egyes vizsgált peptidek kö125 tödésének mértékét, mint a maximális I-GRP kötődés százalékát. (Amennyiben peptid nincs jelent) A LIGAND analízis ezekre a kísérletekre és más kísérletekre azt mutatja, hogy a bombesin és a (Phe^LeuJ^) bombesin egyaránt K . o.l nm d értékkel, és a (Phe¹³ (CH2S)Leu¹⁴) bombesin Kd 3 nm értékkel rendelkezik.

-o- bombesin

IX 1 A

-D- (Phe Leu )bombesin

-A- (Phe^^f(CH2S)Leu¹⁴)bombesin

A 3. ábrán bemutatjuk, hogy a GRP stimulálja a foszfatidil-inozitol (Pl) forgalmat dózisfüggő módon, és a (Phe 1?(CH2S)Leu^⁴)bombesin ezt nem stimulálja (2. példa). Az abszcisszán (X tengely) logaritmikusán jelöltük a jelenlevő peptid koncentrációját. Az ordinátán (Y tengely) a kontrollra vonatkoztatott százalékos Pl forgalmat jelöltük. Az értékek, átlagértékek + standard hibát tartalmaznak háromszoros párhuzamos mérésre; amennyiben nincsen jelölve, a hibák ** mértékűek az adatpontokhoz. Az, hogy a (Phe ¹³jtcH₂S) Leu¹⁴)bombesin nem befolyásolja a Pl forgalmat, még a GRP koncentrációjánál háromszor nagyobb koncentrációban sem, amely GRP koncentráció körülbelül maximális stimulálást idéz elő azt mutatja, hogy a peptid nem agonista aktivitású.

- 54 -o-GRP

-^-(Phe^³í(CH2S)Le^u^⁴)b°mbesiⁿ

A 4. ábrán bemutatjuk a (Phe^1,5^(CH₂S)Leul^)|_:)onit,e8Ín képességét, hggy antagonista hatást fejt ki egér hasnyálmirigyben GRP-indukált Pl forgalommal szemben. (2. példa) Az abszcisszán (X tengely) logaritmikusán ábrázoljuk a peptid koncentrációját. Az ordinátán (Y tengely) jelöljük a kontrollra vonatkozott százalékos értékben a Pl forgalmat. A 30 percig 1000 nm (Pha^^CHjSXeu^lbombesinnel végzett elóinkubálás lecsökkenti az 1-1000 nm GRP által kiváltott Pl forgalom stimulálást a csupán GRP-vel kiváltott értékhez képest. Az értékek átlagértékek ♦ standard hiba és háromszoros mérésből számitóttak; ahol nem jelezzük a hibák kisebb értékűek az adatpontokhoz képest. A (PhelS^QH^sXeu^jbombesin képessége, hogy inhibiálja a GRP hatást azt mutatja, hogy ez valódi antagonista anyag.

-o- GRP önmagában -A- GRP (Phe¹³l’(CH,S)Leu¹⁴)bo»be8Ín kezelés után

5. ábra: Reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárást alkalmaztunk a metilén-szulfoxid izomerek elválasztására, C10 stacionárius fázist alkalmaztunk (Vydac analitikai oszlop; 4»6 · ID x 25 cm, 5 mikron C18).

• · * ·

A mozgó fázis áramlási sebessége 2 ml/perc. A mozgó fázis perc alatt kifejlesztett lineáris gradiens eluens, amely 25%-75% acetonitril vizes elegye, amely víz 0.1% trifluór ecetsavat tartalmaz.

A Phe^(Ch2S(0))^Leu Litorin és a

Phe^(CH₂S(0))

II

Leu Litorin retenciós ideje sorrendben

5.40 perc és 6.28 perc. A reakcióban alkalmazott indulási anyag a (Pheg(CH₂S)Leu₉)Litorin ebben a rendszerben 10.92 perc retenciós idővel rendelkezik.

Az 1. Táblázatban összehasonlítjuk a korábbi kísérletek (1-4. ábrák) eredményeit a receptor affinitás (K^) és a Pl forgalom vonatkozásában számos bombesin analógra.

- 56 1. tAblAzat

Számos pepiid analóg affinitása és hatásossága

Pl Forgalom

Szekvencia Kd (na) Agonista Antaaonista

pQQRLGNQWAVGHF (CH.S)L	3	-	·♦·
pQQWAVGHF CH2S)L	3		*
Acf Q W A V G H F (CH2S)L	10	-
NQWAVGHF (CH2S)L	50	NO	NO
NQWAVGHF (CH2S(0))L	100	NO	NO
pQQWAVGHF (CH2S)Z	4	NO	NO
pQQWAVGHF (CH2S(O))^IL	2	-	♦
pQ QWAVGHF (CH2S(0))^IIL	1	-	♦

A K_d értékét az 1. példa szerint állapítjuk meg, a Pl Forgalom értéket a 2. példa szerint állapítjuk meg, az aktivitást jelöl, az azt jelöli, hogy nincs aktivitás, az NO jelöli, hogy az aktivitást nem határoztuk meg. Az agonista aktivitás az a képesség, hogy a vegyület a Pl forgalmat stimulálja. Az antagonista aktivitás az a képesség, hogy a vegyület a GRP-stimulált Pl Forgalmat blokkolja. Ac jelentése acetil-csoport, pQ jelentése piroglutamin-csoport, Q jelentése glutamin-csoport, A jelentése alanin, R jelentése arginin, N jelentése aszparaginsav, C jelentése cisztein, E jelentése glutaminsav, G jelentése gllcin, H jelentése

- 57 hisztidin, I jelentése izoleucln, L jelentése leucin, K jelentése lizin, M jelentése metionin, F jelentése fenilelanin, P jelentése prolin, S jelentése szerin, T jelentése treonin, W jelentése trlptofán, Y jelentése tirozin, V jelentése valin; falsé eset L-aminósav, alsó eset D-aminósav; Z jelentése nórleucin; ^jelentése amid kötés;(CH2S) jelentése, hogy a molekulában CHgS aminósav közti kötés van jelen; (CHgSÍO)) jelentése, hogy a molekulában CH₂S(0) aminósav közötti kötés van jelen; az I és II indexek a CH₂S(0) izomereket jelölik

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az általános képletü peptid származék vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói előállítására, ahol az általánops képletben

X jelentése amino-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-10 szénatom számú alkilcsoport, egy vagy két
2-10 szénatomszámú acil-csoport, karbobenziloxi- vagy t-butiloxi-karbonil-csoport; hacsak az amino-terminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben X jelentése törölt)

N jelentése bombesin, GRT, vagy természetes variánsuk szekvenciája, vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósav maradékot tartalmazó peptid) hacsak az amino-tarminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben N jelentése törölt) • ·

- 59 Λ

1 jelentése Glp, vagy alkalmas savas hidrofil ma- radék;

A₂ jelentése

Gin, alkalmas semleges vagy hidrofób maradék, Nle, X-amino-butánsav, pSubPhe, BNap vagy egy kötés;

^A3 jelentése

Arg, alkalmas bázisos hidrofil maradék, vagy egy kötés;

^A4 ^A5 jelentése jelentése

Leu,

Gly, vagy vagy A₂ jelentésével megegyező; A₂ jelentésével megegyező, D-Ala;

D-Phe, *6 jelentése

Asn, ^2 jelentésével megegyező,

D-Ala, pGlu, Lys, Lys(Z), SubPhe, vagy

D-Phe;

A_? jelentése Gin, Mis, alkalmas semleges hidrofób vagy bázikus hidrofil maradék, Nap, D-His, MeHis, HisOl-Me), His(KMc),

D-Glu(OMe), Ο-Glp, D-Leu, Me-Leu, D-Phe, vagy Glu;

Ag jelentése Trp, alkalmas semleges maradék, vagy

Met, MeTrp, SubPhe, Lys, Cha, vagy

Lys(Z(2Cl>);

A₉ jelentése

Α^θ jelentése

Alá, A₂ jelentésével megegyező, MoAla, Aib, D-Phe, L-Nal, Arg, vagy Glu;

Val, A₂ jelehtésével megegyező, MeVal,

Thr(CH₂Ph), vagy DL-Flg;

···· ···· *11 jelehtése

Aj2 jelentése

Aj₃ jelentése

A|₄ jelentése

C jelentése

Gly, alkalmas semleges maradék, Phe, 0-Phe, Sar₅ 0-Ala, 0-Ser, 0-Ser(Ch₂Ph), SubPhe, D-Pro, D-Lys, Asp, D-Arg, D-Lys(Z(2Cl)), Ac3c, Ac5c, vagy Acócj His, alkalmas semleges vagy bázisos hidrofil maradék, Tyr, D-Phe, pSubPhe, His, MeHis, HisCfl-He), HisCt-MeOH), D-pcF, Aib, Ahx, Ape, Gin, Lys, Lys(Z), Ser, Ser(CH₂?b), Thr, Glu, Asp, Asp(08u*) vagy N-Nalj

Leu, t/he, alkalmas hldrofób vagy semleges maradék, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, Meleu, Melle, MeVal, vagy Glu j

A¹⁵aa'ÍA¹*aa megjelölésű dipeptid, ahol ψ jelentése (C«2S), (CH2S(O)), (CHgSCO))¹ és (CH2S0)ⁿ és A_naa, valamint A^aa jelentése, a helyettesítő aminősavaki

Leu, Met, Nle alkalmas hidrofőb vagy semleges maradék, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, 0-Leu, MeLeu, Melle, MeVal, vagy Glui

Bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósavmaradékból álló peptid, és • · ⁴11 jelehtése

Α|2 jelentése jelentése

3BLBNTÉ8B

Aj^ jelentése

C jelehtése

- 60 Gly, alkalmas semleges maradék, Phe, D-Phe, Sár, D-Ala, D-Ser, D-Ser(Ch₂Ph), SubPhe, D-Pro, D-Lys, Asp, D-Arg, D-Lys(Z(2Cl)), Ac3c, Ac5c, vagy Acőcj His, alkalmas semleges vagy bázisos hidrofil maradék, Tyr, D-Phe, fSubPhe, His, MeHis, His(lt-Me), His(V-MeOH), D-pcF, Aib, Ahx, Ape, Gin, Lys, Lys(Z), Ser, Ser(CH₂Ph), Thr, Glu, Asp, Asp(OBut) vagy N-Nal;

Leu, Phe, alkalmas hidrofőb vagy semleges maradék, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal, vagy Glu;

13 Ψ 14

A aa'A aa megjelölésű dipeptid, ahol 'pjelentése (CH₂S), (CH₂S(0)), (CHjjSCO))¹ és (CH2SO)ⁿ és A13aa, valamint A^aa jelentése, a helyettesítő aminósavak;

Leu, íMet, Nle alkalmas hidrofőb vagy semleges maradék, Ahx, MeAhx, Ape, MeApe, D-Leu, MeLeu, Melle, MeVal, vagy Glu;

Bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája vagy szekvencia részle te, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósavmaradékból álló peptid, és • · ······ • · · · · · · * · · · ······*· · · · • * «β ··· ··

- 61 Υ jelentése karboxi-terminálls maradék, amely lehet hidroxilcsoport, 1-8 szénatomszámú alkoxi-észter, karboxaold, mono- vagy di- 1-4 szénatomszámú alkil-amid,

1-4 szénatomszámú alkil-amln, 1-4 szénatomszámú tioalkil-éter, · azzal jellemezve, hogy az alábbi reakciólépéseket hajtjuk végre.

a) egy alkalmasan C-terminálisan védett kötött dl- peptidet tartalmazó gyantát alkalmazunk, ahol a dipeptid általános képletú vegyület, ahol jelentése (CH₂S) csoport, és A₁₃ és A^ jelentése a szubsztituens aminósavj

b) az A₁₂~X egyéb védett aminósavakat sorrendben kapcsoljuk, és így a kívánt védett aminósav szekvenciát állítjuk elö|

c) a védőcsoportokat eltávolítjuk>

d) a kívánt pepiidet tisztítjuk, vagy kívánt esetbon 8¾^) peptid fycHgSCO))¹ és ψ(0Η₂50)^Πizomorjeit állítjuk elő, majd a kívánt lzomerpoptideket tisztítjuk.

c.

- 62 2» Az 1. igénypont szerinti eljárás az általános képletü peptid származék vagy gyógyszerészetileg elfogadható sói előállítására, ahol az általános képletben

X jelentése amino-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-10 seénatomszámú alkilcsoport, egy vagy két 2-10 szénatomszámú ecil-csoport, karbobsnziloxi- vagy t-butiloxi-karbonilcsoport; hacsak az amino-terminális aminősav nem ciklusos saéroazék, amely esetben X jeletése törölt; N jelentése Bombasin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminősav maradékot tartalmazó peptid; hacsak az aminó-termlnális aminősav nem ciklusos származék, amely esetben N jelentése törölt; jelentése A₂ jelentése PGlu, vagy alkalmas hidrofil maradék; Gin, alkalmas semleges vagy hidrofób maradék, Nle,iK-amino-butánsav,

’ - r r 9 99 • · ····♦· ·· ·· ··· · ··· ···· ···· · · · • · ·· ··· · · pSubPhe, BNap, vagy egy kötés;

A3 jelentése Arg, egy alkalmas bázlsos hidrofil maradék, vagy egy kötés;

A* jelentése Leu, vagy A2 jelentésével megegyező;

A5 jelentése Gly, A2 jelentésével megegyező, O-Phe, vagy D-Ala;

A6 jelentése Asn, A2 jelentésével megegyező, D-Ala, NAc-D-Ala, pGlu, D-0he;

A7 jelentése Gin, His, alkalmas semleges hidrofób vagy bázikus hidrofil maradék, Nap, vagy D-Gln;

A8 jelentése Trp, alkalmas semleges maradék, vagy Met;

A9 jelentése Alá, vagy A2 jelentésével megegyező;

Α^θ jelentése Val, vagy Ag jelentésével megegyező;

All jelentése Gly, alkalmas semleges maradék, Phe, vagy D-Phe, D-Ala;

A12 jelentése His, alkalmas semleges vagy bázlsos hidrofil maradék, Tyr, D-Phe, vagy pXPhe, (X-F, Cl, Br, OH, vagy CH3);

A13 jelentése Leu, Phe, Nle, vagy alkalmas hidrofób vagy semleges maradék;

ψ jelentése A¹³aa^A¹⁴ _aa általános képletü meghatározó dipeptid, ahol ψ jelentése (CSgS), (CM2S(O)>, (ΟΗΣΞίΟ))¹, és (CH2S0)¹¹ ás • · ······ • · · · ··· · »·· ♦······· · · · • · · · *·· · ·

- 64 Aj^aa valamint Ai^aa jelentése a szubsztituens aminósavak;

A14 jelentése Leu, Met, vagy alkalmas hidrofób vagy semleges maradók;

C jelentése Bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája, vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminóúsav maradékot tartalmazó peptid;

és

Y jelentése karboxi-terrainális maradék, amely lehet hidroxilcsoport, 1-8 szénatomsadmú alkoxi-észter, karboxamid, mono- vagy di1-4 szénatomszámú alkil-amid, 1-4 szénatomszámú alkil-emin, 1-4 szénatomszámú tioalkil-éter, azzal jellemezve, hegy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az általános képletü peptid származék, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója előállítására, ahol az általános képletben

X jelentése amino-terminális maradék, amely lehet hidrogénatom, egy vagy két 1-10 szénatomszámú alkilcsoport, egy vagy két 2-10 szénatomszámú acil-csoport, karbobenziloxi- vagy t-butiloxi-karbomilcsoport) hacsak az amino-terminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben X jelentése törölt;

N jelentése Bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája, vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósav maradékot tartalmazó peptid; hacsak az aminó-terminális aminósav nem ciklusos származék, amely esetben N jelentése törölt)

^A1 jelentése pGlu, vagy egy kötés a₂ jelentése Gin, vagy egy kötés; ^AJ jelentése Arg, vagy egy kötés; ^A4 jelentése Leu, vagy egy kötés; a₅ jelentése ciy, vagy egy kötés; ^Αβ jelentése Asn, vagy 0-Phe; ^A7 jelentése Gin, vagy His ^A8 jelentése Trp; ^A9 jelentése Alá;

•4 · · •949 ifit

-66Aj_C jelentése Val;

Ajj jelentése Gly, vagy D~Ala;

Ajg jelentése Hls;

Aj₃ jelentése Phe;

jelentése Aj^aa^Aj^aa képletü meghatározó dipeptid, ahol Ψ jelentése (CHgS), ^(CH₂S(0))^T, és^(CH₂S0)^TI és A-^aa, valamint Aj*aa jelentése a szubsztituens aminósavak;

⁴14 Jelentése Leu, vagy Nle;

C jelentése Bombesin, GRP, vagy természetes variánsuk szekvenciája, vagy szekvencia részlete, egy kötés, vagy egy 1-11 bármely aminósav maradékot tartalmazó peptid;

Y jelentése karboxi-terwlnális maradék, amely lehet hidroxilcsoport, 1-8 szénatomszámú al-koxi-észter, aminócsoport, mono- vagy di1-4 szénatomszámú alkil-amid, 1-4 szénatomszámú alkil-amin, 1-4 szénatomsámú tioalkil-éter, azzal jellemezve* hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

4. Az 1. Igénypont szerinti eljárás a pGlu-Gln-Arg-LeuGly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-PheY(CH₂S)Leu-NH₂ képletü peptid előállítására.

— 67 azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az Ac-D-Phe-Gln-TrpAla-Val-0-Ala-Hiá-Phe^Ví(CH₂S)Leu-NH₂ képlete peptid előállítására , azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az Asn-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Phe'V(CH₂S)Leu-NH₂ képletú peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az Asn-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Phe^KV(CH₂S(0))Leu-NH₂ képletü peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, a pGlu-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Phe^f (CH₂S(0))Lqu-NH₂ képletü peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

··· ·>
9. Az. 1. igénypont szerinti eljárás a pGlu-Gln-TrpAla-Va¹-Gly-His-Phe^Vl⁾(CH₂S)Nle-NH₂ képlete peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pGlu-Gln-TrpAla-Val-Gly-His-Phe^xí(CH2S(0))^ILeu-NH2 képletü peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás a pGlu-Gln-TrpAla-Val-Gly-His-Phe^Vf(CH2S(0))^IILeu-NH2 képletü peptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.
12. Eljárás gyógyszerészetileg elfogadható formált alak előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti vegyületet, vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóját gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagokkal formált alakká feldolgozzuk.

• ·.

*·· ··

-A • · 4 4 • ••4 ····

4 · ··»

4 •· ·«·
13. Eljárás kezelést igénylő beteg rákellenes kezelésére, beleértve a kis sejtő tüdő és prosztata karcinóma kezelést, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1-3. igénypontok szerinti peptid származék hatásos mennyiségét adagoljuk.
14. Eljárás betegben rákos szövet növekedésének szabályozására, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1-3. igénypont szerinti peptid származék hatásos mennyiségét adagoljuk.
15. Eljárás emésztőrendszerben! fekélyek kezelésére, ilyen kezelést igénylő betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1-3. igénypontok szerinti peptid származék hatásos mennyiségét adagoljuk.
16. EljáráB bombesin/GRP antagonizmus kialakítására ilyen kezelést igénylő betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1-3. igénypont szerinti peptid származék hatásos mennyiségét adagoljuk.