HUT50876A - Process for producing hepatitis b virus surface antigenes and hybrid antigenes containing same, as well as pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing hepatitis b virus surface antigenes and hybrid antigenes containing same, as well as pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HUT50876A
HUT50876A HU88409A HU40988A HUT50876A HU T50876 A HUT50876 A HU T50876A HU 88409 A HU88409 A HU 88409A HU 40988 A HU40988 A HU 40988A HU T50876 A HUT50876 A HU T50876A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pro
protein
gly
coding sequence
ser
Prior art date
Application number
HU88409A
Other languages
English (en)
Inventor
Teresa Cabezon
Wilde Michel De
Nigel Harford
Original Assignee
Smith Kline Rit
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smith Kline Rit filed Critical Smith Kline Rit
Publication of HUT50876A publication Critical patent/HUT50876A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány hepatitisz B vírus antigénekkel és ezeket tartalmazó hibrid antigénekkel foglalkozik, valamint azoknak a géneknek a klónozásával, amelyek az említett antigéneket klónozzák élesztőkben, rekombináns DNS technikát alkalmazva.
A jelen találmány hátterét az alábbiakban világítjuk meg.
A. Hepatitisz B vakcinák
A hepatitisz B vírus (HBV) által kiváltott fertőzés súlyos, széles körben elterjedt egészségügyi probléma. A fertőzés akut vagy krónikus fázisban mutatkozik meg. Az Egyesült Államokban az akut hepatitiszes esetek száma évenként 100000-re becsülhető 1-2 % halálozási aránnyal, és a HBV krónikus hordozóinak gyakorisága az egészséges felnőttek között 0j1-1 % között van, a kortól és a társadalmi osztályoktól függően. Dél-Amerikában a krónikus hordozók gyakorisága mintegy 1-3 %, a Szovjetunióban és Dél-Európában mintegy 3-6 %, és Ázsiában és Afrikában több, mint 10 %.
A fejlett országokban tehát igény van vakcinára olyan embereknél, akik a fertőzés kockázatának ki vannak téve, ilyenek pl. a betegek és alkalmazottak olyan orvosi egységeknél, ahol vért kezelnek, katonai személyzetek, krónikus hordozók házastársai, magas HBV elterjedtségű területekre utazók, krónikus hordozók újszülöttjei, homoszexuálisak, prostituáltak és kábítószerélvezők. A harmadik világ országaiban igény van olcsó vakcinára tömeges immunizáláshoz. A tömeges immunizálási program végülis nemcsak az akut hepatitisz előfordulására és a krónikus hordozók tömegének számára hat, hanem csökkentheti a krónikus aktív hepatitiszből és hepatocelluláris rákból eredő súlyos megbetegedések és halálozások számát is.
A Dane-részecskék, amelyekről úgy véljük, hogy a hepatitisz • · · ·
- 3 a
B virionjai, és amelyek a fertőzött betegekből izolálhatók, mintegy 42 n m átmérőjűek. Mindegyikük tartalmaz egy burkolatot, amely a hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazza, egy kapszidot (HBcAg), egy endogén polimerázt és egy DNS genomot. A genom cirkuláris és kettős szálú egy egyszálú területtel, amely mintegy 200 bázist tartalmaz. Az egyszálú területet in vitro be lehet tölteni az endogén polimeráz működtetésével. A hosszabb szál mintegy 3200 bázist tartalmaz.
Régóta nehéz HBV vakcinákat előállítani, mivel nehéznek bizonyult a vírust szaporítani szövettenyészetben, és mivel az egyetlen ismert gazdaszervezet az ember. A csimpánzok azonban szintén fertőzhetők laboratóriumban a vírussal.
Valenzuela és munkatársai ^Natúré, 298, 347-350 (1982)J beszámolnak a HBsAg szintéziséről élesztőkben, olyan kifejező vektort alkalmazva, amelyben a HBsAg kódoló szekvencia 835 bázispáros (bp) Taql - Hpal fragmentum és a promotor az élesztő alkohol dehidrogenáz I promotor. Számos korábbi rövid közlemény is említ meg kutatásokat, amelyek megelőzik ezt a közleményt. Ilyenek pl. Valenzuela és munkatársai közleménye pArch. Bioi. Med. Exp. (Chile), 14( 1), 21-22 (1981 )J, amely beszámol egy DNS fragmentum kifejeződéséről élesztőben, amely DNS fragmentum olyan szekvenciát tartalmaz élesztő alkohol dehidrogenáz promotor területhez ligáivá, amely HBsAg-höz hasonló fehérjét kódol; a
Scrip 616. számában a 14. oldalon található beszámoló (1981. augusztus 12), amely megállapítja, hogy amerikai egyesült államokbeli kutatók egy csoportja, amelynek Valenzuela P. és Rutter W.J. is tagjai voltak, közölte hepatitisz B vírust körülvevő fehér-jje-burkolat'’ termelését élesztőben; és Zucskerman Natúré
295, 98-99 (19Ö2)J, beszámolója, amely azt közli, hogy Rutter
W.J. leírta glikozilezett HBsAg kifejeződését élesztősejtekben.
HBV antigén komponensekről, pl. HBsAg-ről leírták, hogy előállították ezeket baktériumokban, egy olyan gént tartalmazó rekombináns DNS molekula beiktatását követően, amely az antigént kódolja. Burrell és munkatársai beszámolnak pBR322-ben klónozott HBV DNS szekvenciák kifejezéséről E. coli HB101 törzsben ^Natúré, 279, 5708 szám, 43-47 (1979)J.
Murray és munkatársai leírják olyan rekombináns vektor előállítását, amely kódolni képes HBV antigéneket (13,828 számú Európa Szabadalmi Közzétételi Irat, 1980). A vektort Dane-részecske DNS-ből és pBR322 plazmidból készítik. A szerzők kinyilvánítják, hogy a hasznos hordozók közé értendők más bakteriális gazdaszervezetek, élesztők és más gombák, állati és növényi sejtek és más gazdaszervezetek, bár az egyetlen gazdaszervezet, amelyre a bejelentésben példa található, az Eí. coli.
Charnay és munkatársai ^Natúré, 286, 893-895 (1980)J beszámolnak olyan bakteriofág megalkotásáról, amely a β-galaktozidáz gén és a HBsAg strukturgén fúziós termékét hordozza. A bakteriofág olyan fúziós fehérje szintézisét irányítja, amely mind a HBsAg, mind a ^-galaktozidáz antigén determinánsait tartalmazza.
Tiollais és munkatársai olyan kóli-fágok előállítását írják le, amelyek HBV DNS-t tartalmaznak (2,034,323 bejelentési számú nagy-britanniai szabadalmi leírás). A fuzionált fág-HBV DNS-t E. coli C600 törzsbe transzformálják.
A 2,070,621 bejelentési számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban olyan plazmidot írnak le, amely a HBsAg gén egy ré- 5 szét, valamint a laktőz operon promotorját és Z-génjét tartalmazza, és amely E. coli-ba klónozható.
Rutter és munkatársai rekombináns vektorokat írnak le, beleértve olyan rekombináns vektorokat is, amelyek pBR322 plazmidot és a HBV DNS BamHI fragmentumait tartalmazzák, amelyeket lehet alkalmazni E. coli transzformálására ^20,251 számú Európa Szabadalmi Közzétételi Irat (1980)]. Egy másik plazmidot, amely a HBV DNS BamHI fragmentumát és a triptofán operon egy részletét tartalmazza, alkalmazták, hogy kifejeződést érjenek el E. poli HB101 törzsben.
Edman és munkatársai olyan plazmidok megalkotását írják le, amelyek HBcAg szintézisét és egy p-laktamáz-HBsAg fúziós fehérje szintézisét irányítják a triptofán operon szabályozó terület ellenőrzése alatt E. coli-ban ^Natúré, 291 , 5815· szám, 503-506 (1981)].
Pumpen és munkatársai leírják, hogy HBsAg monomer fehérjék és fúziós fehérjék kis mennyiségét szintetizálják E. coli-ban, a denaturált HBsAg monomer ellen fellépő antitesteket alkalmazva a kimutatáshoz j^Gene, 30, 201-210 (1984)J.
Más közlemények is számolnak be HBV DNS beiktatásáról baktériumokba, ezek, között találjuk pl. az alábbiakat: Charnay és munkatársai: Prog. Med. Virol. 27 88-92 (1981); MacKay és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. US. 78 (7), 4510-4514 (1981); Fritsch és munkatársai: C.R.Acad.Sci. 287,(16), 1453 (1978); 2,034,323 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás (Derwent 46874C); és Pasek és munkatársai: Natúré, 282(6), 575 (1979).
A HBV DNS-t klónozták már emlős sejtekben is. Ezek között a sejtek között találjuk az emberi, egér, és emberi hepatóma sejt-
vonalakat. így pl. Dubois és munkatársai beszámolnak egérsejtek transzformálásáról olyan plazmiddal, amely HBV genomot tartalmaz, valamint a HBsAg kifejeződéséről £proc. Natl. Acad. Sci.
US. 77,(8), 4549-4553 (1980)]; Hirschman és munkatársai pedig beszámolnak HBV-szerű részecskék előállításáról HBV DNS-sel transzformált Hela sejtekkel £proc. Natl. Acad. Sci. US. 77(9), 5507-5511 (1980)].
Emberi vérből eredő HBsAg-t alkalmazó HBV vakcina előállí tására szolgáló eljárásról számolnak be Funakoshi és munkatársai [Prog. Med. Virol. 27, 163-167 (1981)], és társai ^Prog. Med. Virol. 27, 185-201 (1981 )].
Maupas és munkaA Funakoshi és munkatársai által készített vakcina jKg tisztított, formaiinnal kezelt HBsAg-t, foszfátot, nátrium-kloridot, 20 mg mannitot, valamint adjuvánsként 0,1 % alumínium-hidroxidot tartalmaz. Az utóbbi közleményben Maupas és munkatársai beszámolnak arról, hogy a vakcina dózisa 1 ml tisztított, formaiinnal kezelt HBsAg, amely 2-10^Hg/ml fehérjét (Lowry-módszerrel mérve) és 0,1 % alumínium-hidroxidot tartalmaz. A Maupas és munkatársai által közölt tanulmányban alkalmazott munkamenetben három injekciót írnak elő egy hónapos időközökben, egy év múlva emlékeztető injekcióval; a szerzők javasolnak olyan munkamenetét is, amely koncentrált HBsAg két injekciójából áll három hónapos időközzel.
HBV vakcinák előállításával kapcsolatos további referenciák pl. az alábbiak: 18. Hepatitis B Vaccine INSERM Symposium, 3·, 37·, és 57. oldalak (Maupas és munkatársai, Adamowicz és munkatársai, illetve Funakoshi és munkatársai közleményei), szerkesztők: Maupas és Guesry, Elsevier/North-Holland Biomedical Press (1981).
• · ·
Az élesztőket is alkalmazták már gazdaszervezetként’ bizonyos más nem-HBV DNS szekvenciák kifejeződéséhez. így pl. Fraser és munkatársai leírják csirke ovalbumin előállítását élesztőben (2,068,969 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés^; a Scrip, N-^640, 11. oldala (1981. november 4) beszámolót tartalmaz arról, hogy az interferon egyik típusát készítik élesztőben. A 11,562 számú európai szabadalmi leírásban (Derwent 38762C) beszámolnak olyan hibrid élesztő plazmidokról, amelyek az ura-+ élesztő gént tartalmazzák a 2 plazmidban.
Az autentikus hepatitisz B vírus felületi antigént (HBsAg) fertőzött egyének plazmájából lehet kinyerni mintegy 2?nm-es, két fehérjéből összetevődő részecskeként, amely fehérjék P24-ként és ennek glikozilezett származékaként, GP28-ként ismeretesek, amelyek mindegyikét az S-fehérje kódoló szekvenciaként ismert HBV genomon levő, a 226 aminosavat kódoló szekvencia kódolja. A teljes 163 aminosavat kódoló szekvenciát, amely közvetlenül megelőzi az S fehérje kódoló szekvenciát a HBV genomon, itt ezután Pre S kódoló szekvenciának nevezzük. A Pre S kódoló szekvencia 55 aminosavát, amely közvetlenül megelőzi az S fehérjét kódoló szekvenciát, itt ezután Pre S2 kódoló szekvenciának nevezzük, és a Pre S kódoló szekvencia további 108 aminosavát itt ezután Pre S1 kódoló szekvenciának nevezzük. A Pre S kódoló szekvenciát, vagy bármilyen kisebb részletét HBsAg prekurzor fehérje kódolóként is nevezhetjük.
A teljesség kedvéért meg kell jegyeznünk, hogy a teljes Pre S kódoló szekvencia bizonyos HBV altípusoknál (pl. ayw-nél) 163 kodonból áll, míg a teljes Pre S kódoló szekvencia más HBV altípusoknál (pl. adv^-nél) 174 kodonból áll. A Pre S2 terület
• · · mindig 55 kodonból áll, amely közvetlenül megelőzi az S fehérje kódoló szekvenciát.
A Pre S2 kódoló szekvencia a P°lialbumin kódoló- vagy receptor helyet kódolja, amely a HBV-vel fertőzött betegek szérumából izolált Dane-részecskék felületén és bizonyos HBsAg részecskék felületén található. Bár a Pre S2 terület közvetlenül megelőzi az S fehérje kódoló területet a HBV genomon, a Pre S2 terület nem vesz részt a HBsAg részecskék összeállításában, lásd pl. Persing és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 34403444 (1985).
Valenzuela és munkatársai feltárják, hogy HBsAg-re hasonlító részecskék találhatók az S fehérje kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált élesztősejtek szétzúzása után, és arra a következtetésre jutnak, hogy HBsAg részecskék szintetizálódnak élesztőben Natúré, 298, 347-350 (1982) .
Harford és munkatársai feltárják, hogy HBsAg-re hasonlító részecskék találhatók egy olyan vektorral transzformált élesztősejtek szétzúzása után, amely vektor az S fehérje kódoló szekvenciát közvetlenül megelőző Pre S2 terminális aminosavát kódoló szekvenciát közvetlenül megelőző, ornitin-karbamoil transzferáz 18 aminosavát kódoló szekvenciát tartalmaz ÍDevelopments in Bio logical Standardization, 54, 125-139 (1983)J.
Laub és munkatársai Simian Vírus 40 korai helyettesítő vektorának megalkotását ismertetik, amely tartalmazza a HBV genom DNS nagy részletét, beleértve a Pre S-S fehérje kódoló szekvenciát, és ismertetik az ilyen részlet kifejeződését az ilyen vektorral transzformált, SV40-nel transzformált CV-1 sejtek (COS sejtek) révén £j. Virology, 48(1), 271-280 (1983)J.
···· ··
- 9 Stibbe és munkatársai ismertetik, hogy kisebb HBsAg glikoproteinek, nevezetesen a GP33 és GP36 glikoproteinek kódolódnak a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciák révén . Virology, 46(2), 626-628 (1983)]. Stibbe és munkatársai azt is feltárják, hogy a GP33 és GP36 nagy mennyiségét tartalmazó HBsAg részecskék nem indukálnak nagyobb anti S fehérje antitest titereket, mint azok a HBsAg részecskék, amelyek csaknem mentesek a GP33-tól és GP36tól [üev. Bioi. Stand. 54, 33-43 (1983)J.
Heerman és munkatársai ismertetik, hogy a mind az S fehérjét kódoló szekvenciát, mind a Pre S kódoló szekvenciát tartalmazó, teljes 389 aminosavat kódoló szekvencia egy olyan polipeptidet, P39-et, kódol, amely megtalálható a HBV részecskékben és a vírus felületi antigén szálaiban glikozilezett formájával, a GP42vel együtt, és más, HBV felületi antigénnel asszociált polipeptidekkel, így a P24-gyel, GP27-tel, GP33-mal és GP36-tal együtt [j. Virol. 52(2), 396-402 (1984)].
Neurath és munkatársai feltárják, hogy a Pre-S2 kódoló szekvenciával kialakított polipeptid-szekvencia 26 amino-terminális aminosavával rendelkező polipeptidek immunogénként tevékenykednek, és feltételezik, hogy az immunogén által kiváltott antitesteket hasznosítani lehet diagnosztikai vizsgálatokban £science, 224, 392-394 (1984)].
Michel és munkatársai ismertetik humán szérum polialbumin receptorokat hordozó BHsAg szintézisét a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát hordozó plazmiddal átfertőzött kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 , 7708-7712 (1984)].
···· «· • · ·· · · · · • · · · · ·· • 9 9999 9 · ·
999 999 * · 9 99
- 10 Persing és munkatársai ismertetik, hogy Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával transzformált egér L sejtek három, HBsAg-vel rokon polipeptidet (24000, 27000 és 35000 dalion) termelnek, amelyek mindegyike 22 nm átmérőjű HBsAg részecskékkel immunreaktív komplexszé szerveződhet, amely komplex polimerizált humán szérum albuminhoz (HSA) kötődikj ugyanakkor a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával, amely keretelcsúszásos (frame-shift) mutációt visel a Pre S2 terület 3' végének közelében, transzformált egér L sejtek csak a 24000 és 27000 daltonos polipeptideket termelik, ezek 22 nm átmérőjű HBsAg részecskékkel immunreaktív komplexszé szerveződnek, amely nem képes kötődni a HSA-hoz £proc. Natl.Acad. Sci. USA 82, 3440-34444 (1985)J. Persing és munkatársai arra a következtetésre jutnak, hogy Pre S2-S fehérjét kódoló szekvencia kódolja a 35000 daltonos fajtát, és hogy a Pre S2 fehérje megmagyarázza a HBsAg HSA-kötő aktivitását, de nem szükséges a HBsAg részecskék összeállításához és kiválasztásához; és hogy a HBsAg fő polipeptidje (azaz a 24000 daltonos fajta) elsődlegesen nem a Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt nagyobb prekurzorok (azaz a 27000 és 35000 daltonos fajták) hasításából származik.
Milich és munkatársai bemutatják, hogy azok a vakcinák, amelyek mind Pre S2-vel, mind HBsAg-vel rendelkező HBV részecskéket tartalmaznak, ahol a HBV részecskék a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal fertőzött kínai hörcsög petesejt (CHO) sejtekből vannak előállítva, felfüggeszthetik az érzéketlenségét bizonyos egerekben olyan vakcinákra, amelyek éppen csak HBsAg-t tartalmaznak; és hogy a Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt 33000 daltonos polipeptid NHg-terminálisánál levő 26 aminosav-gyök domináns antitest-kötő helyet képvisel a
X • * · ·»·· ·· ·· ·· · « · « * · · · · ·· • · *···· · · · / ··· ··· * * ·» '
- 11 Pre S2 területen. Michel és munkatársai a Vaccines 86” című kaidványban (1986; szerkesztők: Brown és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory), a 359-363 oldalon a Pre S2 területtel kifejezett terméket tartalmazó hepatitisz B felületi antigén részecskék szintézisét tárgyalják CHO sejtekben.
Neurath és munkatársai leírják, hogy a Pre S terület olyan, HBV burkolaton levő fehérjéket kódol, amelyek a májsejtek által fajlagosan felismert tartományokat tartalmaznak; a Pre S2-S fehérjét kódoló szekvencia olyan fehérjét kódol, amely jelen van a HBV részecskékben; a Pre-S fehérjéket kódoló génnek megfelelő szintetikus peptidek immunogének, és végül arra a következtetésre jutnak, hogy a HBV vakcinák tartalmazzanak Pre S determinánsokat [Natúré, 315, 154-156 (1985)|.
Valenzuela és munkatársai leírják a teljes Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia kifejeződését ilyen kódoló szekvenciával· transzformált élesztőkben; valamint azt is leírják, hogy az ilyen élesztősejtek valóban szintetizálnak olyan részecskéket, amelyek tartalmaznak mind HBsAg-t, mind Pre S2-t, és amely/^agyon hasonló 1<anak elektronmikroszkópiával és ülepedési tulajdonságok szerint azokra a részecskékre, amelyek csak HBsAg-t tartalmaznak, és hogy a Pre S2 terület nem befolyásolja azt a képességet, hogy a 22 nm-es HBsAg részecskékre hasonlító részecskék keletkezzenek ^Biotechnology 3., 317-320 (1985)J. Valenzuela és munkatársai közlik elméletüket is, hogy a HBV olyan módon hatol be a májba, hogy poli- 1 albumin kötődik a HBV polialbumin-receptorához, amely viszont a májsejteken levő polialbumin-receptorhoz kötődik, és így a vírus bekerül a májba; a HBV polialbumin-receptorát a Pre S2 terület
- 12 kódolja. Valenzuela arra a következtetésre jut, hogy egy Pre
S2-t tartalmazó vakcina kialakíthat olyan antitesteket, amelyek, a normális mechanizmuson át történő HBV inaktiváláson kívül, ,k/ megakadályozhatja/azt az utat, amelyen a vírus a májsejtbe lép.
A Takeda Chemical Ind. KK cég a 171.908-A számú európai szabadalmi közzétételi iratban a P31 nevű, nem-glikozilezett hepatitisz B vírus felületi antigén élesztőben való előállítására kér oltalmat.
A Chicon Corporation cég a 0,174,444A2 számú európai szabadalmi közzétételi iratban P31 fehérjét tartalmazó HBsAg részecskék élesztőben való előállítási módszerére kér oltalmat.
Az alábbi I. Táblázat összehasonlítja az ismert Pre S2 terület aminosavszekvenciákat a jelen találmány szerinti HBV Pre S2 aminosavszekvenciákkal.
I. TÁBLÁZAT. Pre-S2 terület aminosavszekvenoiák összehasonlítása HBV különböző szerotípusaiból
HBV altípus Pre S2 kódoló terület
-55 -50 -40 -30 -20 -10 0 Referencia
OJ cd -p <D <D P Γ—I
Dm :fi
P
Ό <U bű-Pv- c\j cn in uo i> co P
Ο Ό
Pm <-t o fi nd «3 Ό 3 44 Ό N CO <
E-I > (X, Q Cd Eh K
CD
Dm Dm μπ t-4 <5 <;
CD l-l
CD CD l-l 3 CD n 3 Dm «aj Dm 3 > Eh cfi CD CD CD CÜ Cd -ü Dm Dm >h Pl Cd 3 > ed Dm q a? i-4
Cf 3 Dm
Eh CD 3 3 <y s
I—I l-l l-l c
I—I Μ -rl fi fi fi
CD CD CD CD •rl tö •rl
Dm tx. Dm O fi i—1
l-l l-l 1—1 1—1 fi fi •rl (Ú •H
d> •rl N f-1 -P fi
I—1 Ο O •rl N •rl
i-4 O fi P Xíl N
Dm Dm Dm 3 N <D •rl Φ •H •rl
1—1 i-4 Eh Pl
Eh
E-< Eh Eh Eh
Eh Eh Eh Eh
i-4
> > > > 1—1 Pl >h K
d> fi P <ü ra ra
r-l <D >> X •rl
Pl Pl Eh 3 »-q
k4 i-4
Pl
i-4 i-4
E-t E-t
H Eh ra
o i—1
EH Eh £
> «3 cn fi •rl bű
5 5 5
TJ nd nd nd nd
CÖ «3 «3 CÖ «3
PP ndnd «3(Ö •rl
OT XD -P W £ nd •rl > :o
P >»>
>> t<β (Ö <Öto o fi •rí
E
<ö fi
P •rl fi
«3 fi •rl
P< o P
N Φ <D
cn P Isi
< Eh CD
> Π3 CO fi •H
E fi £
n3 rí •rl
-P i—1 Q
fi O •H
r—1 P |-—i
cd Dm o
Q Eh CD D4 Dm Cd
P. P P 3 o >>
co 3 <U r-1 P j—l
< Η CD O PU O
r tű -p £
X r-lco
Φa •rdQ tx.
ra £ 44XÖ
X£
TÁBLÁZAT (folytatás)
-P •rl •
N x
ra E CO
φ o cn
X X V*
£ φ
Φ K —
N V—z x
ra o
x E
o kJ
£ £ r—1 >
kJ kJ 1—1
X φ
t» ra
£ φ -P
XÖ « ι—1 •
> :£ z-x
X • <4 ca • Ό
kJ z—X a Φ z-x co
•rl o Q >» CO cn
X CO bű 00 X—
a cn -P M σ> x—'
£ •rH χ— £ χ— •
xö £ bű E o kJ •rl X—· co Z~X
£ cn •rl «J 'rl £ kJ co CO
•rl o ε £ O X •rl X O m CO
£ -P a a £ X •rH X— 1 cn
Ή Pd -P a — O Ξ £ Kű OJ x~ •
hű •rH N ra >H o Φ <f· co z*x
£ £ ι—1 ra o o E 1 m cn
< Eh CÜ c •rl Φ X— Γ- o- •
-P Φ Ctí o — in cn Z-^
Φ a Ό oj| Ο- X— cn
£ £ o <b Χ- X^· o·
Φ - o bű • KJ Ι OX
X m «ΙΗ Φ - E 44 o- o X-
04 13 c? a ra •rl o £ -4 m X—z
ra φ ra Q v-| o £ O- Ό
£ ra E x— 1 cn
£ CU φ £ • • Ό o-
•rl £ kJ ra ra -P - -4 n
> o bű CQ φ φ -P X—I O 1
bű P< c £ •rl £ cü CÜ Φ X—1 n
£ £ rH ra ι—1 E O - ra o-
Eh CÜ kJ φ O ta • XD • χ— m
E X kJ X ta x ra 00
•rl kJ rH ca rd >» xH φ OJ
c o kJ £ o x OJ
<4 «4 £ ra <4 P. X - CO
— £ ta o X • Φ OJ
- £ ca • •H φ £
N <—1 -4 φ 1—1 m -P •rl £ —
kJ kJ £ o £ O -P φ
X x bű £ • Φ «4 a £
·· ι—1 -P £ a E «Μ a £
•rl o £ o Φ • -P
kJ £ M ·· X ·· r-l ·· a
ra o O •rl o rd O •rd a
£ O- |x< •rl «a o a £ a
xö 1 -P ra •H m a ra ··
£ £ -P 0- ·· £ £ CQ £ £ •rl
•rl •rH te m •rl XD xö XtJ .· XÖ a
£ Φ c X kJ X -P ·· -P •rl -P ra
•rl +> £ o £ - ra £ te •H a a a £
£ N •H •rH 5 s-\ £ Φ 44 a 44 ra 44 xö
CÖ 10 rH -P E X xö > £ ra £ £ £ -P
rH •rl cC Φ o -P Ή £ £ £ xe £ a
< o > s ra fcd kJ E xö E -P E 44
ra XD X X -P a £
o ra £ Ή ra KJ Cl 44 ra £
1—1 kJ XD £ X XD X XD £ XD E
3 i—1 E Φ £ £
X Φ x >» <e £ a E -P ra
u > s 1 3 o ra bű s E 5 £ XD
«5 ra ra XD Φ kJ a ra Φ
•rl £ •rl a ra » CQ XD X 44
O φ £ * •r! XD -rH •rH Φ
£ ι—1 Φ o ra •ra *T3 o rH ra
Φ kJ O x XtJ O £ a
£ > X o -P X ίχ» O CÜ f£
Φ
tö ca «-Η -P z-x Z—< z“s Z-x zs z-s z—X
ι—1 >» a φ Φ • • • • • • • •
< O > s Ctí V- OJ cn in Ό O CO
• ·*···· · · · ······ · · ·«
- 15 Β. Malária vakcinák
Számos újabb tanulmány sugallja azt, hogy a Plasmodium adott fajai sporozoita stádiuma által előidézett fertőzésekre való védő immunitást érzékeny gazdaszervezetekben olyan antitestek közvetíthetik, amelyeket az adott sporozoiták cirkumsporozoita fehérjéjére (CS fehérje) nézve gazdaszervezetek termelnek .
A Plasmodium bizonyos típusainak sporozoita fehérjéit klónozták már, és ezek közül néhányat ^-fejeztek rekombináns DNS technikákkal.
Nussenzweig és munkatársai bemutatnak egy sporozoita polipeptidet, amelyet P-44 fehérjének azonosítanak, és bemutatják ennek klónozását és kifejeződését E. coli-ban (4 466 917 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás).
Sharma és munkatársai leírják a Plasmodium knowlesi cirkumsporozoita (CS) fehérjéje egy részletének kifejeződését élesztőben, olyan kifejező vektort alkalmazva, amely az élesztő alkohol dehidrogenáz I gén 5' szabályozó területet tartalmazza a P. knowlesi CS génszekvencia 5’ felfelé” területe helyett pScience, 228, 879-882 (1985)J.
A New York University bemutatja a P. knowlesi cirkumsporozoita (CS) fehérje ismétlődő egységet kódoló terület egy részének klónozását és ennek béta-laktamázzal és béta-galaktozidázzal alkotott fúziós termékeinek kifejeződését E. coli-ban (WO 8402922-A számú PCT szabadalmi közzétételi irat).
Kemp és munkatársai leírják a vér-stádiumban levő P. falei— parumból származó CS fehérjét kódoló szekvencia klónozását és kifejeződését E. coli-ban (WO 84-02917-A számú PCT szabadalmi ·····
- 16 közzétételi irat).
Dame és munkatársai beszámolnak P. falciparum CS fehérjének klónozásáról és kifejezéséről E. coli-ban [Science, 225, 593 (1984)3· k fehérjéről azt írják, hogy mintegy 412 aminosavat tartalmaz mintegy 44 000 molekulatömeggel. Ez egy tetrapeptid 41 tandem (egymás utáni) ismétlődését tartalmazza. Monoklonális antitestekhez kötött ismétlődő területből származó, szintetikus
7-, 11- és 15-gyökös peptidek alakulnak ki a CS fehérje ellen.
Ellis és munkatársai beszámolnak béta-laktamáz-P. knowlesi CS fehérje fúziós termék kifejezéséről E. coli-ban ^Natúré, 302, 536-538 (1983)].
Enea és munkatársai ismertetnek egy analóg ismétlődő egység szerkezetet a P. cynomolgi CS fehérjéjén belül, valamint ismertetik a CS fehérje klónozását és kifejeződését E. coli-ban, valamint ennek kódoló szekvenciájának a feltárását ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7520-7524 (1984)].
Ballou. és munkatársai leírják, hogy a Plasmodium falciparum CS fehérjék ismétlődő területének szintetikus peptidjei szarvasmarha szérum albuminhoz (BSA) vagy tiroglobulinhoz konjugálva antitest válaszokat alakítanak ki egerekben és nyulakban, és arra a következtetésre jutnak, hogy a malária parazita sporozoita stádiuma elleni vakcinát lehet kifejleszteni az egy hordozó fehérjéhez konjugált CS fehérje ismétlődő területei szintetikus peptidjeinek alkalmazása révén £Sc ience, 228, 996-999 (1985)].
Weber és munkatársai ismertetik a P. falciparum egyik brazil törzse klónozott CS fehérje génjének alkalmazását vizsgáló mintaként 17 másik P. falciparum törzs szerkezetének elemzésére nukleinsav hibridízálással, és arra a következtetésre jutnak,
hogy a CS fehérje gén nagy mértékben meg van őrizve, és hogy a malária vakcina kifejlesztése CS fehérjével valószínűleg nem komplikálódik a törzs variációkkal ^Molecular and Bacterial Parasitology 15, 305-316 (1985)J.
Arnot és munkatársai ismertetik a P. vivax CS fehérjéjének klónozását és ismertetik ennek teljes klónozó szekvenciáját; arra a következtetésre jutnak, hogy a P. vivax CS fehérjéjének kódoló szekvenciája homológ a P. knowlesi CS génjének szekvenciájával, de nem homológ a P. falciparuméval ^Science, 230, 815-818 (1985)J.
Sharma és munkatársai feltárják a P. knowlesi Nuri-törzse CS génje kódoló területének teljes nukleotid szekvenciáját ^Science, 229, 779-782 (1985)].
Young és munkatársai ismertetik a P. falciparum CS fehérjéjének kifejeződését E. coli-ban, emberek számára alkalmas malária vakcinához való lehetséges alkalmazásra ^Science, 228, 958-962 (1985)].
A Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research olyan, mesterségesen megalkotott polinukleotid szekvenciát ismertet, amely a P. falciparum mRNS vagy genom DNS egészének vagy részének felel meg, valamint ismerteti az ilyen szekvenciának megfelelő peptidet, ennek előállítási eljárását, és olyan kompozíciót, amely ilyen peptidet tartalmaz és stimulálja a P. falciparum antigének elleni immunválaszt emlősökben (WO 84/02917 számú PCT szabadalmi közzétételi irat, 1984).
Mazier és munkatársai leírják, hogy a P. falciparum cirkumsporozoita fehérjéjének számos rekombináns és szintetikus peptidjével immunizált egerekben kiváltott antitesteket értékelték védő aktivitásra humán hepatocita tenyészet rendszerben, és úgy
• · ·
találták, hogy ezek a parazita ellen a védő hatást három ponton mutatják: a sporozoita kötődésénél a hepatocita felületre, a belépésnél, és az ezt követő sejten belüli kifejlődésnél fscience, 231 , 156-159 (1986)].
C. Polivalens vakcinák
Valenzuela és munkatársai leírják a Pre S2 kódoló szekvencia által kódolt HBsAg polialbumin receptor alkalmazását eszközként polivalens vakcinák előállításához ^Biotechnology 3, 323-327 (1985)]. Valenzuela és munkatársai leírják egy HBsAg-Herpes simplex 1 vírus glikoprotein D hibrid (HSV-lgD) előállítását hibrid HSV-lgD-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia kifejezése révén élesztőben.
Valenzuela ismerteti azt is, hogy egy hibriddel, pl. a fentebb leírt HBsAG-HSV-lgD részecskével kapcsolatban a HBsAg immundominanciájának problémája áll fenn a felületén mutatkozó idegen immunogének felett [/'Hepatitis B subunit vaccines using recombinant DNA Techniques (Hepatitisz B alegység-vakcinák rekombináns DNS technikákat alkalmazva), Bio-Expo-5 Meeting, 1985. május 15, Boston, Massachussets].
A Chiron Corporation cég új hibrid részecskékre nyújt be igényt, amelyek a hepatitisz B felületi antigén legalább nagyobbik részét tartalmazzá^egy vagy több oligopeptidhez fuzionálva, ahol a hibrid polipeptid képes olyan részecskét képezni sejtgazdaszervezetben, amelyben legalább egy oligopeptid legalább egy epitópja van jelen (0,175,261 számú európai szabadalmi közzétételi irat).
A fehérjéket alá lehet vetni transzláció utáni módosításoknak, és ezek közül néhány mélyrehatóan befolyásolja a fehérje • · · · · · · • ·*·♦·· · « · ··· ··· · · ·· konformációját és működését. Az oligoszacharid láncok jelenléte az emberi eredetű pre-S1-pre-S2-S és pre S2-S fehérjében Jjíeerman és munkatársai: J. Virology, 52, 396-402 (1984); Stibbe és Gerlich: Virology, 123, 436-442 (1982),* Stibbe és Gerlich: J. Virol. 46, 626-628 (1983)], és valószínűleg a mirisztinsav jelenléte a preS1-preS2-S fehérjén (Persing és munkatársai: a Molecular Biology of Hepatitis B viruses címmel 1986. augusztus 2831 közt tartott tudományos ülés előadásainak kivonatai, Cold Spring Harbor Laboratory) befolyásolhatja a részecskék képződését, a fehérjék konformációját a részecskékben, és ezeknek a részecskéknek az antigenicitását és immunogenicitását.
Az élesztő (Saccharomyces cerevisiae) rendelkezik a fehérje glikozilezésének enzimes képességével ^BalloU: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces; Metabolism and Gene Expression (A Saccharomyces élesztők molekuláris biológiája; Metabolizmus és gén-kifejeződés), szerkesztők: Strathern, Jones és Broach; Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 335-360 oldalj, és a zsírsav-acilezés enzimes képességével ^Towler és Glasler: Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 2812-2816 (1986)], hasonlóan a magasabbrendű eukarióta sejtek ilyen jellegű képességeihez.
Az élesztőben kifejezett vírus felületi glikoproteinekről úgy találták, hogy glikozilezett formában vannak. Jabbar és munkatársai leírják, hogy az influenza vírus hemagglutinin gén kifejeződése élesztőben glikozilezett hemagglutinin fehérjét eredményezett ^Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 2019-2023 (1985)J. Wen és Schlesinger leírják, hogy a Sindbis és vezikuláris stomatitisz vírus glikoproteinek kifejeződése élesztőkben ezeknek a vírus fehérjéknek a glikozilezett formáit adta [_Proc. Natl. Acad. Sci.
• « • · · ·
- 20 83, 3649-3643 (1986)]. Fujisawa és munkatársai leírják, hogy a preS2-S gén kifejeződése élesztőben a preS2-S fehérje két glikozilezett formájának szintézisét eredményezi (a ”Molecular Biology of Hepatitis B viruses címmel 1986. augusztus 28-31 közt tartott tudományos ülés előadásainak kivonatai, Cold Spring Harbor Laboratory, 62. oldal). Kniskern és munkatársai- leírják, hogy a preS1-preS2-S gén kifejeződése élesztőben két preS1-preS2-S fehérje szintézisét eredményezi, 45 kD és 39 kD molekulatömeggel, ^a Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS (Modern közelítés az új vakcinákhoz, beleértve az AIDS megelőzését is) címmel 1986. szeptember 9-14 közt tartott tudományos ülés előadásának kivonatai, Cold Spring Harbor Laboratory, 89. oldal^]. Persing és munkatársai leírják, hogy a preS1-preS2S, preS2-S és S fehérjéket kifejező C0S7 sejtek jelzése ^H mirisztinsavval a jelzés jelenlétét eredményezi a preS1-preS2-S fehérjében (a Molecular Biology of Hepatitis B viruses címmel 1986. augusztus 28-31 közt tartott tudományos ülés előadásainak kivonatai, Cold Spring Harbor Laboratory, 19. oldal).
Az élesztőben kifejezett és részecskékben összeállt fúziós fehérjéket az alábbi általános vázlat szerint tisztítják.
Aerosil adszorpció és deszorpció(1) —CaClg kicsapás(2) fenil-agaróz vagy fenilkarbonát-agaróz adszorpció és deszorpció(3) —^-CsCl gradiens centrifugálás vagy DEAE ioncserélő kromatográf ia.
Az (1) lépést a 0 204 680 számú európai szabadalmi közzétételi iratban és a (3) lépést a 0 199 698 számú európai szabadalmi közzétételi iratban írják le, ami a fenilagapózt illeti. Az (1) és (3) lépések speciális kombinációja lehetővé teszi, hogy a »··· • · . · · · ·· • ··«··· · · ··♦··· · · (ι
- 21 szennyező anyag drasztikus eltávolítását hajtsák végre (a fehérje és szénhidrát 90 %-ának és a lipidek 50 %-ának eltávolítása). Ez az új kombináció lehetővé teszi az ez után következő kromatográfiás lépések jó működését.
Abban az esetben, ha a fúziós fehérjék glikozilezettek, fenilboronátot (PBA) alkalmaznak affinitásos adszorbensként. pH 9,0-nál a boronát csoport kovalens komplexeket alakít ki lehetséges cisz-diol csoportokkal a glikozilezett oldalláncokon. A PBA jeleket alkalmanként használták oldható glikoproteinek tisztításához, de nem használták a lipid kettős rétégbe ágyazott glikoproteineket tartalmazó részecskék tisztításához ^lásd: Cook és munkatársai: Analytical Biochemistry, 14-9, 349-353 (1985); Middle és munkatársai: Biochemical Journal, 209, 771-779 (1983); Cook és munkatársai: Biochimica et Biophisica Acta, 828, 205212 (1985); Maestasane és munkatársai: Journal of Chromatography, 189, 225-231 (1980)^]. A többszörös ligandum kötés miatt a részecskén nagyon kis PB-ligandum sűrűségű PBA jeleket kell alkalmazni, pl. PBA géleket 10/^g/ml gél boronát-tartal ómmal, előnyösen 5 J4g b oronát/ml gél koncentrációban. A fenilboronát gélek alkalmazása nagyon kis boronát-tartalommal lehetővé teszi a beágyazott glikoproteineket tartalmazó részecskék affinitás-kromatográfiáját.
Az alábbiakban a találmány szerinti eljárás rövid ismertetését írjuk le.
A jelen találmány olyan rekombináns DNS molekulákra vonatkozik, amelyek egy funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmaznak fázisban fuzionálva egy hepatitisz B vírus (HBV) Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részével. A * · · ····«· «· ·· · · · · • · · · · 4 ·« • · ···· · · · ··♦ ··· » «
- 22 •'kódoló szekvencia vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, körülöleli ezek bármiféle funkcionális származékát is. A funkcionális származék kifejezés egy kódoló szekvenciát jelent aminosav-változtatásokkal, amelyek, ahol megfelelők, nem akadályozzák a részecske-képződést és/vagy amelyek megőrzik immunogenicitásukat, ahol az ilyen megőrzés kívánatos. Az ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagenezissel lehet előállítani, pl. a Botstein és munkatársai által leírt módszerekkel ^Science, 229, 1193-1201 (1985)J. Előnyösen az ilyen DNS molekula tartalmaz egy szabályozó területet is, amely előnyö3 sen az élesztő arg génjéből származik.
A jelen találmány foglalkozik egy olyan rekombináns vektorral is, amely egy rekombináns DNS molekulát tartalmaz operatívan összekapcsolva egy szabályozó területtel, ahol a DNS molekula egy funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmaz fázisban fuzionálva a HBV Pre S2-S fehérje Pre S2 területének egy részéhez. A szabályozó terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, olyan DNS szekvenciát jelent, amely egy promotor területet tartalmaz, valamint más szekvenciákat, amelyek szükségesek egy kódoló szekvencia átírásához és transzlációjához.
A jelen találmány foglalkozik egy rekombináns vektorral transzformált eukarióta gazdaszervezettel is, ahol az említett vektor egy DNS molekulát tartalmaz működőképesen kapcsolva egy szabályozó területhez, ahol az említett DNS molekula egy funkciorélis DNS kódoló szekvenciát tartalmaz fázisban fuzionálva egy HBV Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részéhez. A jelen találmány foglalkozik az ilyen transzformált gazdasejtek előállításának módszerével is, amely egy eukarióta * · ♦ ·*«· ·· ·♦ ·· ♦ · · « • · · · · · ·· • *·····« · ··♦ ♦·· · · ··
- 23 gazdasejt transzformálásából áll ilyen rekombináns vektorral.
A jelen találmány foglalkozik egy HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskék előállításának módszerével is, amely HBsAg fehérje tartalmaz és/vagy átad egy funkcionális DNS kódoló szekvencia által kódolt peptidet; a módszer abból áll, hogy égy rekombináns vektorral transzformált eukarióta gazdasejtet tenyésztünk megfelelő tápközegben, és az ilyen gazdasejt-tenyészet sejtlizátumából vagy extraktumából a részecskéket izoláljuk, ahol a fentebb emlytett vektor egy DNS molekulát tartalmaz operatívan összekapcsolva egy szabályozó területtel, ahol ez a DNS molekula a funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmazza fázisban fuzionálva a HBV Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részéhez.
A jelen találmány foglalkozik egy hepatitisz B vírus felületi antigén (HBsAg) részecskét tartalmazó hibrid immunogén rész ecskével is, amely tartalmaz és/vagy átad egy funkcionális DNS kódoló szekvencia által kódolt peptidet.
A jelen találmány foglalkozik ilyen hibrid részecskék immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával is.
A jelen találmány foglalkozik ilyen hibrid részecskéket és poliszorbátot tartalmazó micellával is, és ilyen micellák immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinákkal is.
A funkcionális DNS kódoló szekvencia kifejezés olyan DNS kódoló szekvenciát jelent, amely, amikor fázisban fuzionálva van a HBV Pre S2-S fehérje kódoló terület Pre S2 területének egy részéhez, nem működik közre a HBsAg részecskék összeállításában és nem akadályozza azt. Az előnyös funkcionális DNS kódoló szekvenciák közt találhatók (de nemcsak ezekre korlátozódnak) pl. az ···· ·· ·· · · · · • .· · · ·· • ···· · · · ··· · · ·· alábbiak: (a) a teljes HBV Pre S fehérje kódoló szekvencia vagy ennek valamely immunogén származéka, pl. (a korlátozás szándéka nélkül) a Pre S2, Pre S1 vagy PreS1-PreS2 fehérje kódoló szekvenciák; és (b) más immunogén kódoló szekvenciák, mint pl. a Plasmodium cirkumsporozoita fehérjéjének kódoló szekvenciája, vagy ennek bármilyen immunogén származéka, a HBV burkolati gén kódoló szekvenciája vagy ennek bármilyen immunogén származéka, különösen a C? peptid, 121. peptid vagy Dreesman peptid kódoló szekvencia vagy ezek valamely immunogén származéka.
A jelen találmány foglalkozik egy HBV Pre S1 fehérje kódoló területtel is, amely az alábbi aminosav-szekvenciát kódolja: -163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Alá Phe Gly Alá Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá
i
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCT ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Alá, 1
vagy foglalkozik egy HBV Pre S2 fehérje kódoló területtel, vagy egy HBV Pre S2-S fehérje kódoló területtel, ahol ennek Pre S2 része a következő aminosavszerkvenciát kódolja:
-55 -50 Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-40
Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-SerSer-
• · ···· ··♦· ·· • ·
Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala'-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-10
Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;
egy ilyen Pre S1 , Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje kódoló területet egy szabályozó területhez operatívan összekapcsolva tartalmazó rekombináns DNS vektorral; egy ilyen vektort tartalmazó transzformált gazdasejttel; ilyen transzformált sejt előállításának műveletével, amely egy gazdasejt transzformálásából áll egy ilyen vektorral; az ilyen kódoló terület által kódolt fehérjével; egy ilyen fehérje előállításának módszerével; egy ilyen fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával; ilyen Pre S2-S fehérje kódoló terület által kódolt részecskékkel; az ilyen részecskék előállításának módszerével; egy ilyen részecske immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával; ilyen részecskét és poliszorbátot tartalmazó micellával; és ilyen micellák immunpro— tektív mennyiségét tartalmazó vakcinával.
A jelen találmány foglalkozik egy teljes Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát vagy ezek immunogén származékát egy szabályozó területhez operatívan összekapcsolva tartalmazó rekombináns DNS vektorral; ilyen vektorral transzformált élesztő gazdasejttel; ilyen transzformált gazdasejtek előállításának módszerével, amely egy élesztő gazdasejt transzformálásából áll ilyen vektorral; a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia, vagy Pre-S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre
S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérje vagy ennek bármely immunogén származéka előállítási módszerével; az ilyen módszerrel előállított fehérjével; ilyen fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával; a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia által kódolt polipeptidet vagy ennek immunogén származékát tartalmazó részecskével; eljárással ennek előállítására; ilyen részecskék immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával; . ilyen részecskét és poliszorbátot tartalmazó micellával; és ilyen micella immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával.
A jelen találmány foglalkozik a Pre S1-Pre S2 fehérje kódoló szekvenciával vagy a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával, amelyek közül a Pre S1-Pre S2 rész az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza.
PRE-S1 TERÜLET
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Alá Phe Gly Alá Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
Trp Asp Phe Asn Pro He Lys Asp His Trp
·♦·<· ··
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Alá
PRE-S2 TERÜLET
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA
Met Gin Trp Asn Ser Thr Alá Phe His Gin ·*· ··
- 29 GCT CTG CAG GAT CCC
Alá Leu Gin Asp Pro
TAT TTT CCT GCT GGT
Tyr Phe Pro Alá Gly
ACA GTA AAC CCT GCT
Thr Val Asn Pro Alá
CAC ATA TCG TCA AGC
His Ile Ser Ser Ser
AGA GCT AGG GGT CTG
Arg Val Arg Gly Leu
GGC TCC AGT TCA GGA
Gly Ser Ser Ser Gly
CCG AAT ATT GCC TCT
Pro Asn Ile Alá Ser
TCC GCG AGG ACT GGG
Ser Alá Arg Thr Gly
GAC CCT GTG ACG AAC
Asp Pro Val Thr Asn
A jelen találmány foglalkozik ilyen új Pre S1-Pre S2 vagy Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát egy kifejeződést szabályozó szekvenciához operatívan kapcsolva tartalmazó rekombináns vektorral is; valamint ilyen vektorral transzformált gazdasejttel; ilyen transzformált gazdaszervezet előállításának módszerével, amely gazdasejt transzformálásából áll ilyen vektorral; ilyen Pre S1-Pre S2 vagy Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával kódolt fehérje, vagy valamely immunogén származéka előállításának módszerével; az ilyen módszerrel előállított fehérjével; ilyen fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával; ilyen Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjét vagy immunogén származékát tartalmazó részecskével; az ennek előállítására szolgáló módszerrel; ilyen részecskék im30 munprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával, és ilyen részecskét és poliszorbátot tartalmazó micellával.
Az alábbiakban megadjuk az aminosavak rövidítésének kulcsát, ahogyan ezt a jelen bejelentésben használjuk.
Asp Aszparáginsav Ile Izoleucin
Thr Treonin Leu Leucin
Ser Szerin Tyr Tirozin
Glu Glutaminsav Phe Fenilalanin
Pro Prolin His Hisztidin
Gly Glicin Lys Lizin
Alá Alanin Arg Arginin
Cys Cisztein Trp Triptofán
Val Valin Gin Glutamin
Met Metionin Asn Aszparagin
Az alábbiakban röviden leírjuk az ábrák tartalmát.
Az 1. ábra a pRIT10601 restrikciós Qndonukleázos hasítási térképe.
A 2. ábra a pRIT106l6 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 3. ábra a pMC200 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 4. ábra a 3300 bp-s HindlII élesztő beiktatás egy részletének nukleotid szekvenciája pMC200-ban, amely részlet tartalmaz HincII, BglII és EcoRI helyeket.
Az 5. ábra a pRIT10671 és pRIT10673 előállítását bemutató f olyamatábra.
A 6. ábra a pRIT10749 előállítását bemutató folyamatábra.
A 7. ábra a pRIT10761 és pRIT10764 előállítását bemutató ·►·· «·
- 31 folyamatábra.
A 8. ábra a PRIT1O167 (1. példa); pRIT10158 és PRIT1O162 (3. példa); pRIT10158, pRIT1O677 és pRIT10909 (4. példa); pRIT 10911 (5. példa); pRIT10679, pRIT10903, pRIT10914 (6. példa); pRIT12211, pRIT12209 és pRIT12230 (7. példa); és pRIT12288 és pRIT12322 (8. példa) előállítását bemutató folyamatábra.
A 9· ábra a pRIT10172 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 10. ábra a pRIT12290 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 11. ábra a pRIT12322 restrikciós endonukleázos hasítási térképe, amely bemutatja, hogy ennek mely részletei származnak a pRIT12230-ból és pRIT12288-ból.
A 12. ábra a pRIT12571; pRIT12573; pRIT12572 és pRIT12574 előállítását bemutató folyamatábra.
A 13· ábra a pRIT12309 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 14. ábra a pRIT12314 és pRLT12544 előállítását bemutató folyamatábra.
A 15· ábra a pRIT12658 előállítását bemutató folyamatábra.
A 16. ábra a pRIT12662 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
A 17. ábra a pRIT12660 előállítását bemutató folyamatábra.
A 18. ábra a pRIT12845 előállítását bemutató folyamatábra (a, b, c, d, e, f).
Az 1A. ábra a pRIT12662 előállítását bemutató folyamatábra.
A 2A. ábra a ^MPfl klón sematikus restrikciós térképét és szekvenciaelemzési stratégiáját mutatja be.
- 32 A 3A. ábra a P. falciparumból származó cirkumsporozoita fehérje gén nukleotid szekvenciáját mutatja be.
A 4A. ábra a pRIT12792-ben levő PreS1-PreS2 DNS kódoló szekvenciáját mutatja be.
Az 1B. ábra a HÍV B vírus burkoló terület sematikus restrikciós térképét mutatja be.
A 2B. ábra a pRIT12893 plazmid megalkotását mutatja be.
A 3B. ábra a pRIT12897 plazmid megalkotását mutatja be.
A 4B. ábra a pRIT12899 plazmid megalkotását mutatja be.
Az 5B. ábra a pRITX plazmid megalkotását mutatja be.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.
A szabályozó terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, olyan DNS szekvenciát jelent, amely egy kódoló szekvencia átírásához és transzlációjához szükséges vagy kívánatos szekvenciákat tartalmaz. Az ilyen szabályozó területek általában 5' irányban és a kifejezendő kódoló szekvenciával szomszédosán helyezkednek el. Előnyösen élesztő DNS-nek egy további területe, amely az átírás kifejezéséhez szükséges szignált tartalmazza, van elhelyezve közvetlenül 3' felé a kifejezendő kódoló területtől úgy, hogy hasson az átírás befejezésére.
A HBsAg, ahogyan itt használjuk, olyan antigént jelent, amely a HBV genom S fehérje kódoló szekvenciája által kódolt fehérjéket tartalmaz, ahol az ilyen HBsAg szerkezetileg hasonló az autentikus HBsAg-hez, vagy lényegében azonos, antigén determinánsok által kódolt S fehérje kódoló szekvenciával bír, mint az autentikus HBsAg, vagyis ez képes olyan immunválaszt stimulálni, amely fajlagosan felismeri az autentikus HBsAg-t és reagál vele, vagy ezt az anti-HBsAg antitestek fajlagosan felismerik.
A HBsAg kódoló szekvenciát fertőzött emberi szérumban levő D^ne-részecskékből kivont DNS-ből lehet izolálni, az egyedi szál területben betöltéssel DNS polimeráz, előnyösen endogén polimeráz, segítségével, majd restrikciós endonukleázzal végzett emésztéssel. Az endonukleáz kiválasztása részben függ a szóban forgó Dane-részecskéktől. így pl. bizonyos adw szerotípusú Dane részecskék HBV DNS-ének HBsAg kódoló szekvenciáját egy egyedi BamHl fragmentumon lehet izolálni; bizonyos gy w szerotípusú Dane részecskék HBV DNS-ének HBsAg kódoló szekvenciáját Hhal fragmentumon lehet izolálni. Azonos szerotípusú Dane-részecskék HBV DNS-e is mutathatja a restrikciós helyek eltérő elrendezését.
A DNS hasítását a jelen találmányban alkalmazott DNS fragmentumok előállítására, az ilyen fragmentumok ligálását a jelen találmányban alkalmazott rekombináns DNS molekulák előállítására, és a mikroorganizmusokba való beiktatást ismert technikákkal hajtjuk végre, így pl. olyan technikákkal, amelyek az eddig és ez után idézett irodalmi helyeken le vannak írva. A körülményeket úgy kell kiválasztani, hogy elkerüljük a DNS és az enzimek denaturálódását. így pl. a pH-t úgy pufféróljuk, hogy 7,0 - 11,0 közti érték maradjon fenn, és a hőmérsékletet is 60°C alatt tartjuk. A restrikciót előnyösen 30-40°C hőmérsékleten végezzük, és a ligálást 0-10°C hőmérsékleten hajtjuk végre. A jelen találmány szerinti eljárás végrehajtásában alkalmazott restrikciós enzimek a kereskedelmi forgalomban kaphatók, és ezeket az ezekhez mellékelt útmutatókkal összhangban kell alkalmazni. A T4 DNS ligáz az előnyös ligáz.
I •ί ·: ·’ ···: .··.
·.:. ·ί. *’:· ·**·
- 34 A különböző fragmentumokat és végleges konstrukciókat hagyományos eljárásokkal lehet összeforrasztani. Több esetben a géneket izoláljuk és restrikciós térképezésnek, valamint szekvenciaelemzésnek vetjük alá. Megfelelő mértékig ki lehet választani a szóban forgó szekvenciát, pl. a HBsAg szekvenciát, a gén hasításával, a szükséges további manipulációkat, pl. Bal31-gyel végzett csonkítást, in vitro mutagenezist, primer helyreállítást, vagy hasonlókat alkalmazva, hogy a kívánt méretű, a kívánt szekvenciát magában foglaló, és a megfelelő végződésekkel rendelkező fragmentumot megkapjuk. Kapcsolókat (linkereket) és adaptereket lehet alkalmazni a szekvenciák egyesítéséhez, valamint az elvesztett szekvenciák helyettesítéséhez, ahol egy alkalmazott restrikciós hely a szóban forgó területen belül van. A különböző fragmentumokat, amelyeket izolálunk, lehet tisztítani elektroforézissel, elektroelucióval, lehet ligálni más szekvenciákhoz, lehet klónozni, újra izolálni és további műveleteknek alávetni.
A szabályozó terület alkalmazása a szóban forgó strukturgén, mint pl. a HBsAg szekvencia, átírásának szabályozásához lehetővé teszi a gazdasejtek növesztését nagy sűrűségig a strukturgén, pl. a HBsAg szekvencia kifejeződése nélkül vagy csekély kifejezésével, majd a kifejeződés indukálását a környezeti körülmények, pl. a tápközeg, hőmérséklet, stb. megváltoztatásával.
így pl. a GAL4 szabályozó területtel az élesztősejteket glicerin-tejsav kombinációjú dús tápközegen lehet növeszteni nagy sűrűségig, pl. a középső vagy késői lóg fázisig, majd ezt követi a szénforrás átváltása galaktózra. Egy másik példa a PH05 szabályozásra, hogy a sejteket nagy foszfátkoncentrációnál, pl. mintegy 7 mmól/l KH^PO^ koncentrációnálnöveszthetjük, majd ezeket kinyer• ·
- 35 jük és újra szuszpendáljuk olyan tápközegben, amelyből a foszfát hiányzik, és így hatunk a depresszióra és kifejeződésre. A hőmérséklet-érzékenységre példa, hogy a sejteket valamely 25-37°C közti hőmérsékleten növesztjük, majd a hőmérsékletet a megfelelő módon megváltoztatjuk 5-20°C-szal. A gazdasejtnek olyan szabályozó rendszerének kell lennie, amely az alkalmazott szabályozó területtel társult.
A HBsAg szekvencia fuzionálását a szabályozó területbe egy köztes vektor alkalmazásával lehet végrehajtani. Egy másik módszer szerint a HBsAg szekvenciát közvetlenül egy olyan vektorba lehet beiktatni, amely tartalmazza a szabályozó területet. Egy vektor olyan DNS, amely hordozhatja és fenntarthatja a találmány szerinti DNS fragmentumot, ilyenek pl. a fágok és plazmidok. A DNS fragmentumok fágokban való klónozására szolgáló technikákat írják le pl. Charnay és munkatársai ^Natúré, 286, 893-895 (1980)J és Tiollais (2,034,323 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés). A HBsAg szekvencia előnyösen úgy helyezkedik el a szabályozó területhez viszonyítva, hogy a HBsAg szekvencia kifejeződése révén szintetizált HBsAg mentes legyen a többlet aminosavszekvenciáktól.
A jelen találmány egyik kiviteli módjában a HBsAg kódoló szekvencia a HBsAg prekurzor (preS-S) fehérje 42 kodonjával együtt fázisban fuzionálva van az élesztő OCT fehérje 18 aminosava sze3 rinti kódoló szekvenciával, amely az arg promotorból van átírva. Ez a konstrukció a megfelelő S-fehérje 226 aminosaván túl további 60 N-terminális aminosavat tartalmazó HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskét szolgáltat.
Egy példa szerinti szabályozó terület származik az élesztő
ο argJ génből, amely az ornitin-karbamoil transzferázt (OCT) kódol3 ja. Az arg szabályozó terület alá van vetve mind specifikus, mind általános szabályozó mechanizmusoknak. Ezt klónozták már
3
E. coliban pYeura arg plazmidon, amint ezt Crabeel és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6026 (1981)]. Előnyös gazdaszervezetek az olyan S. cerevisiae törzsek, amelyekben az arginin bioszintetikus út derepresszált, pl. az 1c1697 d törzsben. Az ilyen törzsek alkalmazása megnövekedett kifejeződést eredményez az arg promotorból, a DC5 törzzsel összehasonlítva. Más hasznos szabályozó területekre példák lehetnek azok, amelyek a glikolitikus út élesztő-génjeiből származnak, pl. az enolázt, aldalázt, foszfoglicerát kinázt és gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázt kódoló gének; az élesztő alkohol dehidrogenáz gén; és általában azok a gének, amelyek a katabolizmusban érdekeltek, pl. az argináz gén.
A fuzionált DNS fragmentumok élesztőben való klónozásához előnyös az YEp13 plazmid, amely képes a replikálódásra és fennmaradásra mind E. coli-ban, mind S. cerevisiae—bán, ez ennek megfelelően ingázó vektor-ként ismeretes. Számos más élesztő vektor ismeretes és áll rendelkezésre. A HBsAg-t és a szabályozó területeket be lehet iktatni az élesztő vektorba egymás után vagy egyidejűleg. Az élesztőben működőképes autonóm replikációs szekvenciákat (replikonokat) tartalmazó plazmidokkal végzett transzformáció normálisan a találmány szerinti DNS molekula extrakromoszomális fennmaradását eredményezi plazmidként. Az ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. Az élesztőben működőképes replikonokat nem tartalmazó plazmidokkal végzett transzformálás a DNS molekula beépülését eredményezheti a kromoszomális DNS-be,
A jelen találmány szerinti, élesztővel termelt HBsAg-t és megfelelő hordozót tartalmazó vakcinákat HBV emberben történő fertőzése elleni védelem stimulálására ismert technikákkal lehet előállítani. Valamilyen adjuváns, pl. aluminium-hidroxid vagy alumínium-foszfát, kívánatos. Az így termelt HBsAg-t lehet kombinálni más immunogénekkel is kombinált vakcinák előállítására. A HBV vagy kombinált vakcinákat be lehet adni pl. szubkután, intravénás vagy intramuszkuláris úton. A jelen találmány szerinti DNS fragmentumot és az ennek segítségével előállított HBsAg-t lehet 'vizsgáló mintaként is alkalmazni HBV kimutatására biológiai mintákban DNS hibridizációs technika és különböző immunassayk segítségével .
HBV PRE S2-S FEHÉRJE KÓDOLÓ SZEKVENCIA PRE S2 TERÜLETE EGY RÉSZLETÉHEZ FÁZISBAN FUZIONÁLT FUNKCIONÁLIS DNS KÓDOLÓ SZEKVENCIÁT TARTALMAZÓ DNS MOLEKULA KIFEJEZŐDÉSE
A jelen találmány foglalkozik HBV Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részletéhez fázisban fuzionált funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekulával is. A kódoló szekvencia, vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, körülöleli ezek bármilyen funkcionális származékát is. A funkcionális származék kifejezés olyan kódoló szekvenciát jelent, amely aminosav-változásokat foglal magában, amelyek, ha ez így kívánatos, nem akadályozzák meg a részecskék képződését és/vagy megőrzik az immunogenicitást. Az ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagenezissel lehet előállítani. A helyspecifikus mutagenezis technikájáról Botstein és munkatársai adnak kitanítást ^Science, 229, 1193-1201 (1985)J· Ilyen fúzió létrejöhet a Pre S2 terület • ·
- 38 N-terminálisánál vagy bizonyos pontoknál a Pre S2 területen belül. A fúzió négy típusa lehetséges, azaz a teljes Pre S2 terület 5'terminálisánál; a Pre S2 területen belül bizonyos pontoknál úgy, hogy a Pre S2 DNS a funkcionális DNS kódoló szekvencia mindkét oldalát szegélyezze; a Pre S2 terület megcsonkított részletének 5'-terminálisánál; vagy az S-fehérje kódoló terület 5'-terminálisánál úgy, hogy a fúziós termék ne tartalmazzon Pre S2 DNS-t. Különféle Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciák ismeretesek, és előállíthatók vagy izolálhatók ismert technikákkal (lásd pl. az itt fentebb idézett irodalmi helyeket). A jelen találmány egyik kiviteli módjában az ARG3 szabályozó területet az élesztő OCT fehérje 18 aminosavához tartozó területtel együtt fázisban fuzionáljuk egy megcsonkított Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciához úgy, hogy a fuzionált szekvencia a Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia 42 kodonját tartalmazza a teljes S fehérje kódoló szekvenciával együtt. Az előnyös funkcionális DNS szekvenciák közt találjuk a Plasmodium cirkumsporozoita fehérje kódoló szekvenciát vagy ennek bármilyen immunogén származékát, a HÍV burkolat gén kódoló szekvenciát vagy ennek bármely immunogén származékát, és főleg a C? peptidet, a 121. peptidet vagy a Dreesman peptidet kódoló szekvenciákat, vagy ezek bármely immunogén származékát, valamint a Pre S2, Pre S1, vagy a teljes Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciákat vagy ezek bármilyen immunogén származékát. így pl. előnyös funkcionális DNS szekvencia a Pre S2 kódoló szekvencia első 13 N-terminális kodonja, amelyet azután a Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia megcsonkított Pre S2 területének 42 C-terminális kodonjához ligálunk. Az immunogén származék kifejezés olyan szekvenciát jelent, amely egy természetben előforduló szekvencia származéka vagy módo-
sított változata, amely megőrzi vagy megnöveli a természetes szekvencia protektív immunogén aktivitását. Ilyen immunogén származékokat hagyományos technikákkal lehet előállítani. A Pre S2, Pre S1, vagy a teljes Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia kifejezés, ahogyan itt használjuk, magában foglalja ezek bármilyen immunogén származékát is.
A Plasmodium cirkumsporozoita fehérje kifejezés a Plasmodium sporozoitáján levő, immundomináns felületi antigént vagy ennek bármely immunogén származékát jelenti. Használható cirkumsporozoita fehérjék (CS) lehetnek azok (de nemcsak ezek re korlátozódnak), amelyek a Plasmodium falciparumból, P. vivax-ból, P. ovale-ból és P. malariae-ből származnak. A P. falciparum, P. vivax, P. ovale és P. malariae fertőzi az embereket.
A Plasmodium falciparum CS fehérje kódoló szekvenciát Dame és munkatársai írják le ence 225, 593-599 ( . vivax
CS kódoló szekvenciát Arnot és munkatársai írják le £Science, 230, 815-818 (1985)]· A P. knowlesi CS fehérje kódoló szekvenciáját Sharma és munkatársai írják le ^Science 229, 779-782 (1985)] · Enea és munkatársai írják le a P. cynomolgi CS fehérje kódoló szekvenciáját j^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 , 7520-7524 (1984)]. Plasmodiumok más fajainak CS fehérje kódoló szekvenciái is ismeretesek (lásd a fentebb idézett irodalmi helyeket) és/vagy hagyományos technikákkal vezethetjük le ezeket.
Ahogyan itt alkalmazzuk, a CSP vagy CS fehérje kifejezések magukban foglalják mind a Plasmodium természetes, teljes hosszúságú cirkumsporozoita fehérjéjét, mind ezek immunogén származékait. A Plasmodium cirkumsporozoita fehérjéjének immunogén származéka kifejezés jelenti ··
(a) a Plasmodium cirkumsporozoita fehérjéjének bármely származékát, amely megtartja protektív immunogén aktivitását, vagy (b) a Plasmodium cirkumsporozoita fehérje módosított kódoló szekvenciájából származó bármely fehérjét, amely protektív immunogén aktivitással rendelkezik. Ilyen immunogén származékokat hagyományos technikákkal lehet előállítani. A P. falciparum CS fehérje kódoló szekvencia bizonyos szintetikus immunogén származékait írják le BalloU és munkatársai ^Science, 228, 996-999 (1985)^· Ezzel kapcsolatban lásd még: Mazier és munkatársai: Science, 231, 156-159 (1986).
A Plasmodium különböző fajának kódoló szekvenciája ismeretes és ismert technikákkal lehet ezeket előállítani vagy izolálni lásd: pl. Colman és munkatársai: W084-02922A PCT közzétételi irat (P. knowlesi CS fehérje), valamint Dame és munkatársai: Science, 225, 593 (1984) (P_. falciparum CS fehérje) . A CS kódoló szekvenciát, vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvenciát HBV Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területe egy részletéhez fázisban fuzionálva tartalmazó DNS molekulát hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. CS kódoló szekvencia vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvencia ligálásával fázisban a Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 kódoló terület 55 aminosaván belüli bármilyen kodonhoz.
Előnyösen a Pre S2 kódoló szekvenciából elegendő marad a CS kódoló szekvencia ligálása, vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvencia ligálása után, hogy a CS fehérje, vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérje optimális megjelenése biztosítva legyen a HBsAg részecske fe♦··· ··
- 41 lületen, vagyis elegendő Pre S2 terület maradjon úgy, hogy a Pre S2 területet kódoló polipeptid hídként működjön a funkcionális DNS fehérje kódoló szekvencia terméke és a HBsAg részecske felülete között. Beszámoltak arról, hogy a Pre S2 kódoló szekvencia 26 amino-terminális aminosava .domináns antitest kötőhelyet képvisel a Pre S2 területen j_lásd pl. Milich és munkatársai: Science, 228, 1195-1199 (1985)J. így ha olyan hibrid részecskét kívánatos előállítani, amely tartalmazza és/vagy átadja mind a Pre S2 epitópokat, mind a CS, vagy bármilyen más funkcionális szekvencia epitópokat, előnyös beiktatni a CS kódoló szekvenciát, vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvenciát, annál a pontnál a Pre S2 kódoló területen belül, amely lehetővé teszi egy olyan hibrid részecske előállítását, amely tartalmazza és/vagy átadja mind a Pre S2 epitópokat, mind a CS, vagy bármilyen más funkcionális DNS kódoló szekvencia epitópokat.
A jelen találmány szerinti rekombináns vektor tartalmazza a jelen találmány szerinti rekombináns DNS molekulát (azaz egy funkcionális DNS kódoló szekvenciát fázisban fuzionálva a HBV Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részletéhez) működőképesen összekapcsolva egy szabályozó területtel. Egy ilyen vektor tartalmazhat még egy élesztőben működőképes replikont is. A ’'replikon kifejezés a DNS-nek azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy fenntartsa stabilan és extrakromoszomálisan az ilyen rekombináns vektort az ilyen vektorral transzformált élesztő gazdaorganizmusban. Ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A szabályozó terület kifejezés bármilyen olyan DNS területet jelent, amely szabályozza a kifejezendő, kívánt kódoló szekvencia átírását és transz42 lációját. Ilyen szabályozó területek jól ismertek a szakterületen. Ilyen vektort hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. egy jelen találmány szerinti DNS molekula fázisban való beiktatásával egy olyan vektorba, amely már tartalmaz replikon- és szabályozó területet, olyan módon, hogy a DNS molekula operatívan kapcsolódjék az ilyen szabályozó területhez. Előnyösen a DNS molekulát olyan vektorba ligáljuk, amely képes kifejeződni a Saccharomyces nemzetség élesztőiben.
A jelen találmány foglalkozik ilyen rekombináns vektorral transzformált élesztő gazdasejttel is, valamint foglalkozik az ilyen transzformált gazdaszervezet előállításának módszerével, amely módszer az élesztő gazdasejt transzformálásából áll a jelen találmány szerinti rekombináns vektorral. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal lehet végrehajtani, pl. olyanokkal, amelyeket itt már leírtunk. Előnyös élesztősejtek közé tartoznak a Saccharomyces nemzetséghez tartozó élesztők, és különösen azok, amelyek a Saccharomyces cerevisiae és Saccharomyces carlsbergensis fajokhoz tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskék előállítási eljárásával is, amely részecskék a funkcionális DNS kódoló szekvencia terméket tartalmazzák és/vagy átadják; az ilyen eljárás magában foglalja a jelen találmány szerinti transzformált élesztő gazdasejt tenyésztését megfelelő tápközegben, és a részecskék izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából. Az átadott vagy tartalmaz és/vagy átad kifejezések azt jelentik, hogy a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérjét a HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecske tartalmazza olyan ···♦ ··
- 43 módon, hogy lehetséges legyen az immunválasz az előállítandó, a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérjére. Ha kívánatos (bár ez nem döntő jelentőségű), a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérje átadása ne befolyásolja a HBsAg epitópok immunogén aktivitását, így hozhatunk létre bivalens vakcinákat. A legelőnyösebben a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérje úgy adódik át a HBsAg részecskére, hogy vagy a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérje epitópjainak, vagy mind a funkcionális DNS kódoló szekvenciának megfelelő fehérje, mind a HBsAg epitópjainak maximális száma legyen megfelelően a felszínre hozva. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely lehetővé teszi a transzformált gazdaszervezet túlélését, és amely lehetővé teszi azt is, hogy az ilyen gazdaszervezet kifejezze annak a vektornak funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia hibrid termékét megfelelő mennyiségben, amely vektorral a gazdaszervezet transzformálva van. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az alkalmazandó megfelelő tenyésztő tápközeg függ az alkalmazott gazdaszervezettől. A jelen találmány szerinti hibrid részecskék izolálását a gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából hagyományos fehér je-izolálási technikákkal hajtjuk végre.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti hibrid részecskéket tartalmazó vakcinákkal is. Az ilyen vakcinák a jelen találmány szerinti hibrid részecskék immun-protektív mennyiségét tartalmazzák, és hagyományos technikákkal készülnek. Az immun-protektív kifejezés azt jelenti, hogy a jelen találmány szerinti hibrid részecskék elegendő mennyiségét vezetjük • ·· ·*·· • ♦ · • ··
- 44 be, hogy megfelelő védő antitest választ idézzünk elő az ellen a szer ellen, amely ellen védekeznünk szükséges, súlyosabb mellékhatások nélkül. A jelen találmány szerinti vakcina előnyösen jelen találmány szerinti micellát tartalmaz, vagyis olyan micellát, amely jelen találmány szerinti részecskét és poliszorbátot tartalmaz. Az ilyen micella által tartalmazott poliszorbát előnyös mennyisége 5-50j^g poliszorbát 100^(g fehérjére. A micellát a 0 199 698 számú európai szabadalmi közzétételi iratban leírt módszerrel állíthatjuk elő.
A jelen találmány szerinti vakcinában a jelen találmány szerinti hibrid részecskék vizes oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül lehet alkalmazni. Egy másik módszer szerint a részecskéket össze lehet keverni különböző ismert adjuvánsokkal, vagy adszorbeálni lehet ezeken. Ilyen adjuváns lehet többek között az alumínium-hidroxid.
A vakcina készítés általában le van írva az alábbi szakkönyvben: New Trends an^í)evelopments in Vaccines (Űj irányzatok és fejlődés a vakcinák területén), szerkesztők: Voller és munkatársai, kiadó: University Park^Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978.
A jelen találmány szerinti hibrid részecskék mennyiségét az egyes vakcina adagokban úgy választjuk meg, mint olyan mennyiséget, amely immun-protektív választ vált ki jelentősebb kedvezőtlen mellékhatás nélkül. Ez a mennyiség változik attól függően, hogy milyen fajlagos immunogént alkalmazunk, és vájjon alkalmazunk-e a vakcinához adjuvánst vagy sem.
Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-1000 ^;g fehérjét, előnyösen 1-200 Mg fehérjét tartalmaznak. Az adott vak45 cina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet megállapítani, amely magában foglalja az antitest-titerek és más válaszok megfigyelését a tanulmány tárgyain. A kezdeti vakcinálást követően a paciensek általában emlékeztető oltást kapnak 4 hét múlva, majd ezt ismételt emlékeztető oltás követi hat hónaponként mindaddig, amíg a fertőzés kockázata fennáll.
A jelen találmány szerinti hibrid részecskék immunválaszát növelni lehet adjuváns alkalmazásával, ilyen adjuváns lehet az alumínium-hidroxid, de a találmány szerinti eljárás nemcsak erre korlátozódik.
Hogy példaszerűen megvilágítsuk a jelen találmány szerinti hibrid részecskéket, a Plasmodium falciparum cirkumsporozoita fehérjéje (CS) ismétlődő epitópját kódoló 64 kodonos DNS szekvenciát és egy nyolc kodonos CS kódoló szekvenciát £lásd Dame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)J egyenként beiktatunk fázisban a Pre S2 kódoló szekvencia egy részletébe olyan élesztő kifejező vektorban, amely replikont, a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát és megfelelő szabályozó területet tartalmaz. Mindkét kifejező vektort, azaz az egyiket, amelyik a 64 .kodonos CS szekvenciát tartalmazza és a másikat, amelyeik a 8 kodonos CS szekvenciát tartalmazza, élesztő gazdasejtekbe vezetjük be, és az ilyen transzformált sejteket elemezzük HBsAg epitópok és CS epitópok jelenlétére ugyanabban a molekulában.
Az immunfolt-elemzésekkel kapott eredmények olyan gyűjteményt alkalmazva, amely CS-re fajlagos öt monoklonális antitestet és egy tisztított, élesztő-eredetű HBsAg ellen kiváltódott antitestet tartalmaz, azt mutatták, hogy egy 37000 kilodaltonos (Kd) hibrid fehérjét kaptunk a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával ·*·♦ ··
- 46 fázisban fuzionált 64 kodonos CS kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált élesztő lizátumaiból, és egy 30000 Kd-s hibrid fehérjét kaptunk a Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával fázisban fuzionált 8 kodonos CS kódoló szekvenciát tartalmazó vektorral transzformált élesztő lizátumaiból. Ezeknek a fehérjéknek az összeállítását HBsAg részecske-szerű szerkezetekké CsCl és szacharóz gradiens elemzéssel, nagy nyomású folyadékkromatográfiával és elektronmikroszkóppal mutatjuk ki. A CS epitópok átadását az ilyen részecskék külsején a CS epitópok hozzáférhetőségével mutatjuk ki CS-re fajlagos antitestek számára, ELISA vizsgálatot alkalmazva. A HBsAg epitópok átadását az ilyen részecskék külsején radioimmunassay-val (AUSRIA II, Abbot), vagy ELISA vizsgálattal (Enzygnost-HBsAg, Behringwerke) mutatjuk ki.
ÚJ PRE S2 ÉS PRE S2-S FEHÉRJE KÓDOLÓ SZEKVENCIÁK
A jelen találmány szerinti új, HBV Pre S2 és Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciák HBV adw altípusból származnak, amelyet pRIT106l6 plazmidból izoláltunk. A ''kódoló szekvencia vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használ j-uk, körülöleli ezek funkcionális származékait is. A funkcionális származék kifejezés aminosav-változásokat tartalmazó kódoló szekvenciát jelent, ahol ez a változás, ha ez így szükséges, nem hat a részecskeképződésre és/vagy megőrzi az immunogenicitást, ha ez a megőrzés kívánatos. Ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagenezissel lehet előállítani, pl. Botstein és munkatársai módszerével fScience, 229, 1193-1201 (1985)J Ilyen Pre S2 és Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciákat hagyományos rekombináns DNS eljárásokkal pRIT10616 plazmidból lehet kinyerni, amely»plazmid (E. coli K12 C600 törzsön belül) deponálva lett a Budapesti
• w ·♦·#
Szerződéssel összhangban az Amerikai Típustenyészet Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, 1982. június 2-án, ATCC 38131 letéti számon. Az ilyen új fehérje kódoló szekvenciák Pre S2 területe az alábbi aminosavszekvenciát kódolja:
Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp-40
Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-20
Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-10 Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn
Ilyen területeket kaphatunk hagyományos szintetikus oligonukleotid szintézissel is. A jelen találmány szerinti Pre S2-S kódoló szekvencia egyik előnyös funkcionális származéka az, ahol az alanin aminosavat kódoló triplet (GCT) a -45-nél módosítva van treonin aminosavat kódoló tripletre (ACT). Az ilyen funkcionális származék kétszer magasabb kifejezési szintet eredményez az ezzel transzformált Saccharomyces cerevisiae-ban, összehasonlítva a jelen találmány szerinti nem módosított kódoló szekvenciával.
Egy jelen találmány szerinti rekombináns vektor tartalmazza a jelen találmány szerinti Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje kódoló szekvenicát, operatívan összekapcsolva egy szabályozó terű-
• · ·«·# ·· * 4· ·· lettel. Egy ilyen vektor továbbá tartalmazhat replikont is, ha ez előnyös, és/vagy az alkalmazandó gazdaszervezettől függően. A replikon kifejezés a DNS szekvenciának azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy stabilan és extrakromoszomálisan fenntartsa az ilyen rekombináns vektort az ilyen vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta gazdaszervezetben. Ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A szabályozó terület kifejezés bármilyen DNS szekvenciát jelent, amely promotor területet és egy kódoló szekvencia átírásához szükséges egyéb szekvenciákat tartalmaz. Az ilyen szabályozó területek jól ismertek a szakterületen. Ilyen vektort hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. a jelen találmány szerinti Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia beiktatásával fázisban egy olyan vektorba, amely már tartalmaz egy replikont és egy szabályozó területet, olyan módon, hogy a DNS molekula operatívan kapcsolódjék az ilyen szabályozó területhez. A DNS molekula előnyösen olyan vektorhoz van ligáivá, amely képes kifejeződni élesztőben, pl. valamely Saccharomyces-ben.
A jelen találmány foglalkozik az ilyen rekombináns vektorral transzformált gazdasejtekkel, valamint az ilyen transzformált gazdaszervezetek előállításának módszerével is. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal lehet végrehajtani. A gazdasejt lehet prokarióta vagy eukarióta. Az előnyös gazdasejtek eukarióták, főleg élesztősejtek, beleértve azokat, amelyek a Saccharomyces nemzetségbe tartoznak, és főleg azokat, amelyek a Saccharomyces cerevisiae és Saccharomyces carlsbergiensis fajba tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti • »
- 49 Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjék előállításának módszerével is, ahol az ilyen módszer magában foglalja a jelen találmány szerinti transzformált gazdasejt tenyésztését megfelelő tenyésztő tápközegben, és a fehérje izolálását a gazdasejt tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejtlizátumából vagy kivonatából, attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e kiválasztani az ilyen fehérjét. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti transzformált gazdaszervezetet, hogy tovább éljen, és amely képessé teszi ezeket a gazdaszervezeteket, hogy kinyerhető mennyiségben kifejeznék a jelen találmány szerinti Pre S2 vagy Pre S2S fehérje kódoló szekvenciát. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy megfelelő alkalmazandó tenyésztő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől. A jelen találmány szerinti Pre S2-S fehérje izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos fehérje-izolálási technikákkal hajtjuk végre. A jelen találmány szerinti módszerrel előállított fehérje lehet glikozilezett, attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e erre, vagy sem. Ha deglikozilezett fehérjét kívánunk előállítani, a jelen találmány szerinti fehérjét olyan gazdasejt alkalmazásával állítjuk elő, amely nem képes elvégezni az ilyen glikozilezést, vagy hagyományos helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk a fehérjét kódoló szekvencián, mielőtt a jelen találmány szerinti eljárást végrehajtanánk, ilyen pl. Botstein és munkatársainak módszere £science, 229,1193~1201 (1985)]·
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti
Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje immun-protektív mennyiségét tártál50 mázó vakcinával is. Az ilyen vakcinát hagyományos technikákkal lehet előállítani.
A jelen találmány foglalkozik HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskék előállításának módszerével is, ahol ez a módszer abból áll, hogy a jelen találmány szerinti transzformált eukarióta gazdaszervezeteket megfelelő tenyésztő tápközegben tenyésztjük, és a részecskéket izoláljuk a gazdaszervezet tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából, attól függően, hogy a transzformált gazdasejtek képesek-e kiválasztani az ilyen részecskéket, vagy sem. A megfelelő tenyésztő tápközeg olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti transzformált gazdaszervezetet, hogy életben maradjon, és amely arra is képessé teszi ezt a gazdaszervezetet, hogy kifejezze a jelen találmány szerinti Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát, részecske formában és megfelelő mennyiségben. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják hogy a használandó megfelelő tenyésztő tápközeg függ az alkalmazandó gazdasejttől. A jelen találmány szerinti hibrid részecskék izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos izolálási technikákkal hajtjuk végre.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti hibrid részecskéket tartalmazó vakcinákkal is. Az ilyen vakcinák a jelen találmány szerinti hibrid részecskék immun-protektív mennyiségét tartalmazzák, és hagyományos technikákkal készülnek. Előnyösen a jelen találmány szerinti vakcina a jelen találmány szerinti micellákat tartalmazza, vagyis azokat a micellákat, amelyek a jelen találmány szerinti részecskéket és poliszorbátot • · · · · · • ♦ · • · · • · · • · · tartalmaznak. Az ilyen micellákban benne levő poliszorbát előnyös mennyisége 5-50jv{g poliszorbát 100^/íg fehérjére számítva. A micellákat a 0 199 698 számú európai szabadalmi közzétételi iratban leírt módszerrel lehet előállítani.
A jelen találmány szerinti vakcinákban a Pre S2-S fehérje vagy a találmány szerinti hibrid részecske vizes oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül lehet alkalmazni. Egy másik módszer szerint a fehérjét vagy részecskéket különböző ismert adjuvánsokkal lehet összekeverni, vagy ezeken adszorbeálni. Ilyen adjuváns lehet többek között az alumínium-hidroxid.
A vakcina készítést általában az alábbi szakkönyv írja le: New Trends and Developments in Vaccines (Új irányzatok és fejlődés a vakcináknál), szerkesztő: Voller és munkatársai, kiadó: University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978. A liposzómákba való bezárást írja le pl. Fullerton (4 235 877 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A fehérjék makromolekulákhoz való konjugációját írja le pl. Likhite (4 372 945 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás) és Armor és munkatársai (4 474 757 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás).
A jelen találmány szerinti Pre S2-S fehérjének vagy hibrid részecskéknek azt a mennyiségét, amelyet az egyes vakcina-anyagok tartalmaznak, úgy választjuk meg, hogy olyan mennyiség legyen, amely immun-protektív választ indukál jelentősebb káros mellékhatás nélkül tipikus vakcinákban. Az ilyen mennyiség változhat attól függően, milyen speciális immunogént alkalmazunk, és attól, hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst vagy sem. Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-1000JUg, előnyösen 1-200y4g fehér52 jét tartalmaznak. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet beállítani, ezek közé beleértve a vizsgálat tárgyai antitest titereinek és egyéb válaszainak meg- . figyelését. A kezdeti vakcinálást követően a paciensek előnyösen emlékeztető oltást kapnak mintegy 4 hét múlva, ezt követik ismételt emlékeztető oltások hat hónaponként mindaddig, amíg a fertőzés kockázata fennáll.
A jelen találmány szerinti Pre S2-S fehérje vagy hibrid részecske immunválaszát fokozni lehet adjuváns alkalmazásával, pl. alumínium-hidroxid alkalmazásával, de az eljárás nemcsak erre korlátozódik.
ÚJ PRE S1 FEHÉRJE KÓDOLÓ SZEKVENCIA
A jelen találmány szerinti új HBV Pre S1 fehérje kódoló szekvencia HBV adw altípusból származik, amelyet pRIT106l6 plazmidból izoláltunk. A kódoló szekvencia vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, körülöleli ezek funkcionális származékait is. A funkcionális származék kifejezés aminosav változásoknak megfelelő változásokat magában foglaló kódoló szekvenciát jelent, amely aminosav-változások, ha így kívánatos, nem hatnak a részecske-képződésre és/vagy megőrzik az immunogenicitást. Az ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagenezissel állíthatjuk elő, pl. Botstein és munkatársai módszerével fScience, 229, 1193-1201 (1985)]. Ilyen Pre S1 fehérje kódoló szekvenciákat hagyományos rekombináns DNS eljárásokkal a pRIT106l6 plazmidból lehet kinyerni, amely (E. coli K12 0600 törzsbe foglalva) deponálva lett a Budapesti Szerződéssel összhangban az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, 1982. június 2-án ATCC 38131 letéti számon. A • 9 /
Pre S1 terület az alábbi amiosav szekvenciát kódolja:
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Alá Phe Gly Alá Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leü Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Alá.
Ilyen területeket lehet kapni hagyomnyos szintetikus oligonukleotid szintézissel is.
Egy jelen találmány szerinti rekombináns vektor tartalmazza a jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje kódoló szekvenciát, operatívan összekapcsolva egy szabályozó területtel, tartalmazhat továbbá replikont is attól függően, hogy ez előnyös-e, és/ vagy függően az alkalmazott gazdaszervezettől. A replikon kifejezés a DNS szekvenciának azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy stabilan és extrakromoszomálisan fenntartsa az ilyen rekombináns vektort az ilyen vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta gazdaszervezetben. Ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A szabályozó terület kifejezés olyan DNS szekvenciát jelent, amely promotor területet és egy kódoló szekvencia átírásához szükséges egyéb szekvenciákat tartalmaz. Az ilyen szabályozó területek jól ismertek a szakterületen. Ilyen vektort hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. a jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje kódoló szekvencia beiktatásával fázisban egy olyan vektorba, amely már tartalmaz egy replikont és egy szabályozó területet, olyan módon, • ·
- 55 hogy a DNS molekula operatívan kapcsolódjék az ilyen szabályozó területhez. A DNS molekula előnyösen olyan vektorhoz van ligáivá, amely képes kifejeződni élesztőben, pl. valamely Saccharomycesben.
A jelen találmány foglalkozik az ilyen rekombináns vektorral transzformált gazdasejtekkel, valamint az ilyen transzformált gazdaszervezetek előállításának módszerével is. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal lehet végrehajtani. A gazdasejt lehet prokarióta vagy eukarióta. Az előnyös gazdasejtek eukarióták, főleg élesztősejtek, beleértve azokat, amelyek a Saccharomyces nemzetségbe tartoznak, és főleg azokat, amelyek a Saccharomyces cerevisiae és Saccharomyces carlsbergiensis fajba tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjék előállításának módszerével is, ahol az ilyen módszer magában foglalja a jelen találmány szerinti transzformált gazdasejt tenyésztését megfelelő tenyésztő tápközegben, és a fehérje izolálását a gazdasejt tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejtlizátumából vagy kivonatából, attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e kiválasztani az ilyen fehérjét. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti transzformált gazdaszervezetet, hogy tovább éljen, és amely képessé teszi ezeket a gazdaszervezeteket, hogy kinyerhető mennyiségben kifejezzék a jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje kódoló szekvenciát. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a megfelelő alkalmazandó tenyésztő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől.
• · ···· • 9 ···· ·« • · · • ·· • · · • ··
- 56 A jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos fehérje-izolálási technikákkal hajtjuk végre. A jelen találmány szerinti módszerrel előállított fehérje lehet glikozilezett, attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e erre, vagy sem. Ha deglikozilezett fehérjét kívánunk előállítani, a jelen találmány szerinti fehérjét olyan gazdasejt alkalmazásával állítjuk elő, amely nem képes elvégezni az ilyen glikozilezést, vagy hagyományos helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk a fehérjét kódoló szekvencián, mielőtt a jelen találmány szerinti eljárást végrehajtanánk. Ilyen helyspecifikus mutagenezist pl. Botstein rés munkatársai módszerével hajthatunk végre [Science, 229, 11931201 (1985)].
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti Pre S1 fehérjét tartalmazó vakcinával is. Az ilyen vakcinák a Pre S1 fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazzák, és ezeket hagyományos technikákkal lehet előállítani.
A jelen találmány szerinti vakcinában a találmány szerinti Pre S1 fehérje vírus oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül lehet alkalmazni. Egy másik módszer szerint a Pre S1 fehérjét különböző ismert adjuvánsokkal lehet összekeverni, vagy ezeken adszorbeálni. Ilyen adjuváns lehet többek között az alum ínium-hidroxid.
A vakcina készítést általában az alábbi szakkönyv írja le: New Trends and Developments in Vaccines (Új irányzatok és fejlődés a vakcináknál), szerkesztő: Voller és munkatársai, kiadó: University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978. A liposzómákba való bezárást írja le pl. FullerΛ
- 57 tón (4 235 877 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A fehérjék makromolekulákhoz való konjugációját írja le pl. Likhite (4 372 945 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás), és Armor és munkatársai (4 474 757 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás ) .
A jelen találmány szerinti Pre S1 fehréjének azt a mennyiségét, amelyet az egyes vakcina-adagok tartalmaznak, úgy választjuk meg, hogy olyan mennyiség legyen, amely immun-protektív választ indukál jelentősebb káros mellékhatás nélkül tipikus vakcinákban. Az ilyen mennyiség változhat attól függően, hogy milyen speciális immunogént alkalmaznak, és attól, hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst, vagy sem. Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-1OOOjng, előnyösen 1-200^Mg fehérjét tartalmaznak. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet beállítani, ezek közé beleértve a vizsgálat tárgyai antitest titereinek és egyéb válaszainak megfigyelését. A kezdeti vakcinálást követően a paciensek előnyösen emlékeztető oltást kapnak mintegy 4 hét múlva, ezt követik ismételt emlékeztető oltások hat hónaponként mindaddig, amíg a fertőzés kockázata fennáll.
A jelen találmány szerinti Pre S1 fehérje immunválaszát fokozni lehet adjuváns alkalmazásával, pl. alumínium-hidroxid alkalmazásával, de az eljárás nemcsak erre korlátozódik.
ÚJ PRE S1-PRE S2-S FEHÉRJE KÓDOLÓ SZEKVENCIA
A jelen találmány foglalkozik egy HBV Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szek^ficiával is, amelynek Pre S1-Pre S2 részlete az alábbi aminosavszekvenciával rendelkezik.
···· ·· • · ·· • · ···· · • t
- 58 PRE S1-TERÜLET
-163
ATG GGG ACG AAT CCT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT
Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro
GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT
Alá Phe Gly Alá Asn Ser Asn Asn Pro Asp
TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG
Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp
CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC
Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly
GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG
Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin
GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT
Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro •··· ··
CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA
Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly
AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT ' CCA . CCT ' CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC
Arg Asp Ser His Pro Gin Alá
PRE-S2 TERÜLET
-55
ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA
Met Gin Trp Asn Ser Thr Alá Phe His Gin
GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG
Alá Leu Gin Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA
Tyr Phe Pro Alá Gly Gly Ser Ser Ser Gly
ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT
Thr Val Asn Pro Alá Pro Asn Ile Alá Ser
CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG
His Ile Ser Ser Ser Ser Alá Arg Thr Gly
• · • ·ν·
- 60 GAC CCT GTG ACG AAC
Asp Pro Val Thr Asn
A jelen találmány szerinti új HBV Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia HBV adw altípusból származik, amelyet pRIT106l6 plazmidból izoláltunk, amely, amint fentebb leszögeztük, az Amerikai Típustörzs Gyűjteménynél, Rockville, Maryland, rendelkezésre áll ATCC 38131 letéti számon. A kódoló szekvencia vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, körülöleli ezek funkcionális származékait is. A funkcionális származék kifejezés aminosav változásoknak megfelelő változásokat magában foglaló kódoló szekvenciát jelent, amely aminosav-változások, ha így kívánatos, nem hatnak a részecske-képződésre és/vagy megőrzik az immunogenicitást, ha ennek megőrzése kívánatos. Az ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagnezissel állíthatjuk elő, pl. Botstein és munkatársai módszerével ^Science, 229, 1193-1201 (1985)].
Egy jelen találmány szerinti rekombináns vektor tartalmazza a jelen találmány szerinti Pre S1-PreS2-S fehérje kódoló szekvenciát, operatívan összekapcsolva egy szabályozó területtel. Egy ilyen vektor tartalmazhat továbbá replikont is attól függően, hogy ez előnyös-e, és/vagy függően az alkalmazott gazdaszervezettől. A replikon kifejezés a DNS szekvenciának azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy stabilan és extrakromoszomálisan fenntartsa az ilyen rekombináns vektort az ilyen vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta gazdaszervezetben. Ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A szabályozó terület kifejezés olyan DNS szekvenciát jelent, amely promotor » · 4 ·*«·«« ·« »« « » · · • t · * ··· • · ···* « · · ··· ··· b ···
- 61 területet és egy kódoló szekvencia átírásához szükséges egyéb szekvenciákat tartalmaz. Az ilyen szabályozó területek jól ismertek a szakterületen. Ilyen vektort hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló terület beiktatásával fázisban egy olyan vektorba, amely már tartalmaz egy replikont és egy szabályozó területet, olyan módon, hogy a DNS molekula operatívan kapcsolódjék az ilyen szabályozó területhez. A DNS molekula előnyösen olyan vektorhoz van ligáivá, amely képes kifejeződni élesztőben, pl. valamely Saccharomycesben.
A jelen találmány foglalkozik az ilyen rekombináns vektorral transzformált gazdasejtekkel, valamint az ilyen transzformált gazdaszervezetek előállításának módszerével is. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal lehet végrehajtani. A gazdaszervezet lehet prokarióta vagy eukarióta. Az előnyös gazdasejtek eukariőták, főleg élesztősejtek, beleértve azokat, amelyek a Saccharomyces nemzetségbe tartoznak, és főleg azokat, amelyek a Saccharomyces cerevisiae és Saccharomyces carlsbergiensis fajba tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjék előállításának módszerével is, ahol az ilyen módszer magában foglalja a jelen találmány szerinti transzformált gazdasejt tenyésztését megfelelő tenyésztő tápközegben, és a fehérje izolálását a gazdasejt tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejtlizátumából vagy kivonatából attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e kiválasztani az ilyen fehérjét. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely ké62 pessé teszi a jelen találmány szerinti transzformált gazdaszervezetet, hogy tovább éljen, és amely képessé teszi ezeket a gazdaszervezeteket, hogy kinyerhető mennyiségben kifejezzék a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia jelen találmány szerinti terméked. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a megfelelő alkalmazandó tenyésztő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől. A jelen találmány szerinti Pre. S1-Pre S2-S fehérje izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos fehér je-izolálási technikákkal hajtjuk végre. A jelen találmány szerinti módszerrel előállított fehérje lehet glikozilezett, attól függően, hogy a gazdasejtek képesek-e erre, vagy sem. Ha deglikozilezett fehérjét kívánunk előállítani, a jelen találmány szerinti fehérjét olyan gazdasejt alkalmazásával állítjuk elő, amely nem képes elvégezni az ilyen glikozilezést, vagy hagyományos helyspecifikus mutagenezist alkalmazunk a fehérjét kódoló szekvencián, mielőtt a jelen találmány szerinti eljárást végrehajtanánk, ilyen módszer pl. Botstein és munkatársai módszere ^Science, 229, 1193-1201 (1985)J. A jelen találmány szerinti
Pre S1-Pre S2-S kódoló szekvencia glikozilezett fehérjeként fejeződik ki az ezzel transzformált élesztőkben vagy emlős gazdasejtekben. A jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S kódoló szekvencia N-mirisztilezett fehérjeként fejeződik ki az ezzel transzformált élesztő gazdasejtekben.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérjék immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinákkal is. Ezeket a vakcinákat hagyományos technikákkal lehet előállítani.
A jelen találmány foglalkozik HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskék előállításának módszerével is, amely Pre S1Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjét tartalmaz; a módszer a jelen találmány szerinti transzformált eukarióta gazdasejtek tenyésztéséből áll megfelelő tenyésztő tápközegben, és a részecskék izolálásából a gazdasejt tenyészlevéből vagy a gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy extraktumából, attól függően, hogy a transzformált gazdasejt képes-e kiválasztani az ilyen fehérjét, vagy sem. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti transzformált gazdaszervezetet, hogy tovább éljen, és amely képessé teszi ezeket a gazdaszervezeteket, hogy részecske formában és kinyerhető'mennyiségben kifejezzék a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a megfelelő alkalmazandó tenyésztő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől. A jelen találmány szerinti részecskék izolálását az ilyen gazdaszervezet tenyészet-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos fehérje-izolálási technikákkal hajtjuk végre.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti hibrid részecskéket tartalmazó vakcinákkal is. Az ilyen vakcinák a jelen találmny szerinti hibrid részecskék immunprotektív mennyiségét tartalmazzák, és hagyományos technikákkal készülnek. A jelen találmány szerinti vakcinák előnyösen a jelen találmány szerinti micellákat tartalmazzák, azaz olyan micellákat, amelyek a jelen találmány szerinti részecskéket és poliszorbátot tartalmaznak. Az ilyen micellákban található poliszorbát előnyös mennyisége 5~50^*g poliszorbát 100j4g fehérjére számítva. A micellát a • 9 9 ··· ·· · · · ··
- 64 Ο 199 698 számú európai szabadalmi közzétételi iratban leírt módszerrel lehet előállítani.
A jelen találmány szerinti vakcinákban a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje vagy hibrid részecske vizes oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül lehet alkalmazni. Egy másik módszer szerint a fehérjét vagy részecskét különböző ismert adjuvánsokkal lehet összekverni vagy ezeken adszorbeálni. Ilyen adjuváns lehet többek között az alumíniumhidroxid.
A vakcina-készítést általában az alábbi szakkönyv írja le: New Trends and Developments is Vaccines (Új irányzatok és fejlődés a vakcináknál), szerkesztő: Voller és munkatársai, kiadó: University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1378. A liposzómákba való bezárást írja le pl. Fullerton (4 235 877 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A fehérjék makromolekulákhoz való konjugációját írja le pl. Likhite (4 372 945 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás), és Armor és munkatársai (4 474 757 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás).
A jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérjének vagy hibrid részecskének azt a mennyiségét, amelyet az egyes vakcinaadagok tartalmaznak, úgy választjuk meg, hogy olyan mennyiség legyen, amely immunprotektív választ indukál jelentősebb káros mellékhatás nélkül tipikus vakcinákban. Az ilyen mennyiség változhat attól függően, hogy milyen speciális immunogént alkalmazunk, és attól, hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst, vagy sem. Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-IOOO^g, előnyösen • · · · • · • · *·· ··· • · · · · · · • · ···· · · · ··· ··· · · ·· • - 65
1-200 ^íg, fehérjét tartalmaznak. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet beállítani, ezek közé beleértve a vizsgálat tárgyai antitest titereinek és egyéb válaszainak megfigyelését. A kezdeti vakcinálást követően a paciensek előnyösen emlékeztető oltást kapnak mintegy 4 hét múlva, ezt követik ismételt emlékeztető oltások hat hónaponként mindaddig, amíg a fertőzés kockázata fennáll.
A jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje vagy hibrid részecske immunválaszát fokozni lehet adjuváns alkalmazásával, pl. alumínium-hidroxid alkalmazásával, de az eljárás nemcsak erre korlátozódik.
A PRE S1-PRE S2-S FEHÉRJE KIFEJEZÉSE ÉLESZTŐKBEN
A jelen találmány foglalkozik olyan rekombináns DNS vektorral is, amely teljes Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát tartalmaz operatívan kapcsolva kifejeződést szabályozó szekvenciával. A kódoló szekvencia vagy kódoló terület kifejezés, ahogyan itt használjuk, körülöleli ezek funkcionális származékait is. A funkcionális származék kifejezés aminosav-változásoknak megfelelő változásokat magában foglaló kódoló szekvenciát jelent, amely aminosav-változások, ha így kívánatos, nem hatnak a részecske-képződésre és/vagy megőrzik az immunogenicitást, ha ennek megőrzése kívánatos. Az ilyen funkcionális származékokat hagyományos helyspecifikus mutagenezissel állíthatjuk elő, pl. Botstein és munkatársai módszerével ^Science, 229, 1193-1201 (1985)J· Egy ilyen vektor tartalmazhat továbbá replikont is attól függően, hogy ez előnyös-e és/vagy függően az alkalmazott gazdaszervezettől. Az alkalmazott Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia a jelen találmány egyik előnyös kiviteli formája.
• · · · • · •· ··· ··· • · · · · · · • * · ···· * · · ··· ··· · · ··
- 66 A replikon kifejezés a DNS szekvenciának azt a minimális területét jelenti, amely úgy működik, hogy stabilan és extrakromoszomálisan fenntartsa az ilyen rekombináns vektort az ilyen találmány szerinti vektorral transzformált élesztő gazdaszervezetben. Ilyen replikonok jól ismertek a szakterületen. A szabályozó terület kifejezés olyan DNS szekvenciát jelent, amely promotor területet és egy kódoló szekvencia átírásához szükséges egyéb szekvenciákat tartalmaz, és amely szabályozza a strukturgén kódoló szekvenciájának átírását. Az ilyen szabályozó területek jól ismertek a szakterületen. Ilyen vektort hagyományos technikákkal lehet előállítani, pl. a jelen találmány szerinti Pre S1Pre S2-S fehérje kódoló terület beiktatásával fázisban egy olyan vektorba, amely már tartalmaz egy replikont és egy szabályozó területet, olyan módon, hogy a DNS szekvencia operatívan kapcsolódjék az ilyen szabályozó területhez. A DNS molekula előnyösen olyan vektorhoz van ligáivá, amely képes kifejeződni élesztőben, pl. valamely Saccharomycesben. A Pre S1-Pre S2—S fehérje kódoló szekvencia, amelyet a jelen találmány szerinti vektor tartalmaz, előnyösen a fentebb leírt Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia. Az ilyen vektorok hasznosak arra a célra, hogy funkcionális DNS kódoló szekvenciákat iktassanak beléjük, hogy lehetővé váljék az ilyen vektorok által magában foglalt Pre S1 - funkcionális DNS kódoló szekvencia - Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia kifejeződése. Ennek megfelelően a jelen találmány foglalkozik olyan rekombináns DNS molekulával is, amely fázisban van fuzionálva Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia Pre S1 területébe olyan módon, hogy a funkcionális DNS szekvencia vagy beiktatást képezzen a Pre S1 területben, vagy helyettesítse a Pre S1 • · · · terület egy részét és esetleg a Pre S2 terület egy részét, valamint foglalkozik az ilyen rekombináns DNS molekulát tartalmazó vektorral (lásd pl. az alábbi 21A példát). A funkcionális DNS kódoló szekvencia kifejezés olyan DNS kódoló szekvenciát jelent, amely, amikor fázisban fuzionálva van a HBV Pre S1-Pre S2-S kódoló terület Pre S1 területéhez, nem működik közre a HBsAg részecskék összeállításában és nem akadályozza azt. Az előnyös funkcionális DNS kódoló szekvenciák közt találhatók (de nemcsak ezekre korlátozódnak) pl. a Plasmodium cirkumsporozoita fehérjéjének kódoló szekvenciája vagy ennek bármilyen immunogén származéka, a HBV burkolati gén kódoló szekvenciája vagy ennek bármilyen immunogén származéka, különösen a C? peptid, 121. peptid vagy Dreesman peptid kódoló szekvencia, vagy ezek valamely immunogén származéka, amint ezt az alábbiakban példákkal alátámasztjuk, vagy más vírusokból származó adott peptideket kódoló szekvenciák, és főleg olyan szekvenciák, amelyek más paraziták burkolati fehérjéit kódolják.
A jelen találmány foglalkozik az ilyen rekombináns vektorral transzformált élesztő gazdasejttel és a transzformált gazdaszervezet előállításának módszereivel. Az ilyen transzformálást hagyományos technikákkal hajtjuk végre. Az előnyösek azok az élesztősejtek, amelyek a Saccharomyces nemzetségbe tartoznak, különösen azok, amelyek a Saccharomyces cerevisiae fajba tartoznak.
A jelen találmány foglalkozik a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvenciaPre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérje előállítási módszerével is, ahol az ilyen eljárás a jelen találmány szerinti transzformált gazdasejtek tenyésztéséből áll megfelelő tenyésztő tápközegben, valamint a fehérje izolálásából a gazdasejt tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából attól függően, hogy a gazdasejt képes-e kiválasztani az ilyen fehérjét, vagy sem. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti gazdaszervezetet, hogy túléljen, és amely képessé teszi az ilyen gazdaszervezetet arra is, hogy kinyerhető mennyiségben kifejezze a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia vagy a Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia termékét. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az alkalmazandó, megfelelő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől. A Pre S1Pre S2-S fehérje vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvenciaPre S2-S fehérje izolálását az ilyen gazdasejt-tenyészet sejtlizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos fehérje izolálási technikákkal hajtjuk végre. A jelen találmhy szerinti eljárással készített fehérje lehet glikozilezett attól függően, hogy a gazdasejt képes-e erre a glikozilezésre, vagy sem. Ha deglikozilezett fehérje kívánatos, a jelen találmány szerinti fehérjét olyan gazdasejt alkalmazásával kell előállítani, amely nem képes ilyen glikozilezés elvégzésére, vagy a fehérjét kódoló szekvencián a jelen találmány szerinti eljárás végrehajtása előtt hagyományos helyspecifikus mutagenezist kell alkalmazni, pl. Botstein és munkatársai módszere szerint Tscience, 229, 1193-1201 (1985)J.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti módszerrel előállított Pre S1-Pre S2-S fehérje vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje immunprotektív mennyiségét tartalmazó vakcinával is. Az ilyen vakcinát hagyomá• · · ·
- 69 nyos technikákkal állíthatjuk elő.
A jelen találmány foglalkozik hibrid részecskék előállításának módszerével is, amely részecskék a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciával kódolt fehérjét tartalmaznak, és ahol ez a módszer a jelen találmány szerinti transzformált élesztő gazdasejtek tenyésztéséből áll megfelelő tenyésztő tápközegben, valamint a részecskék izolálásából a gazdasejt tenyészlevéből vagy az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejtlizátumából vagy kivonatából attól függően, hogy a gazdasejt képes-e kiválasztani az ilyen részecskéket, vagy sem. A megfelelő tenyésztő tápközeg kifejezés olyan tápközeget jelent, amely képessé teszi a jelen találmány szerinti gazdaszervezetet, hogy túléljen, és amely képessé teszi az ilyen gazdaszervezetet arra is, hogy részecske formában és kinyerhető mennyiségben kifejezze a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát vagy a Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az alkalmazandó, megfelelő tápközeg függ az alkalmazott gazdasejttől. A jelen találmány szerinti részecskék izolálását az ilyen gazdaszervezet sejt-lizátumából vagy tenyészlevéből hagyományos izolálás! technikákkal hajtjuk végre.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti részecskéket tartalmazó vakcinákkal is. Az ilyen vakcinák a jelen találmány szerinti részecskék immunprotektív mennyiségét tartalmazzák, és hagyományos technikákkal készülnek. A jelen találmány szerinti vakcinák előnyösen a jelen találmány szerinti micellákat tartalmazzák, azaz olyan micellákat, amelyek a jelen • *
- 70 találmány szerinti részecskéket és poliszorbátot tartalmaznak. Az ilyen micellákban található poliszorbát előnyös mennyisége 5-50 j\\g poliszorbát 10 Jkg fehérjére számítva. A micellát a 0 199 698 számú európai szabadalémi közzétételi iratban leírt módszerrel lehet előállítani.
A jelen találmány szerinti vakcinákban a jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje, vagy a jelen találmány szerinti részecskék vizes oldatát, előnyösen fiziológiás pH-η pufferolva, közvetlenül lehet alkalmazni. Egy másik módszer szerint a fehérjét vagy részecskét különböző ismert adjuvánsokkal lehet összekeverni, vagy ezeken adszorbeálni. Ilyen adjuváns lehet többek között az alumínium-hidroxid.
A vakcina-készítést általában az alábbi szakkönyv írja le: New Trends and Developments in Vaccines (Új irányzatok és fejlődés a vakcináknál), szerkesztő: Voller és munkatársai, kiadó: University Park Press, Baltimore, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, 1978. A liposzómákba való bezárást írja le pl. Fullerton (4 235 877 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A fehérjék makromolekulákhoz való konjugációját írja le pl. Likhite (4 372 945 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás), és Armor és munkatársai (4 474 757 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás).
A jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérjének vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérjének vagy egy jelen találmány szerinti részecskének azt a mennyiségét, amelyet az egyes vakcina-adagok tartalmaznak, úgy választjuk ···· ·· • · ····
- 71 meg, hogy olyan mennyiség legyen, amely immunprotektív választ indukál jelentősebb káros mellékhatás nélkül tipikus vakcinákban. Az ilyen mennyiség változhat attól függően, hogy milyen speciális immunogént alkalmazunk, és attól, hogy a vakcina tartalmaz-e adjuvánst, vagy sem. Általában az várható, hogy az egyes dózisok 1-1OOOj^g, előnyösen 1-200^g fehérjét tartalmaznak. Egy adott vakcina optimális mennyiségét standard tanulmányokkal lehet beállítani, ezek közé beleértve a vizsgálat tárgyai antitest titereinek egyéb válaszainak megfigyelését. A kezdeti vakcinálást követően a paciensek előnyösen emlékeztető oltást kapnak mintegy 4 hét múlva, ezt követik ismételt emlékeztető oltások hat hónaponként mindaddig, amíg a fertőzés kockázata fennáll.
A jelen találmány szerinti Pre S1-Pre S2-S fehérje vagy Pre S1-funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2-S fehérje vagy részecske immunválaszát fokozni lehet adjuváns alkalmazásával, pl. alumínium—hidroxid alkalmazásával, de az eljárás nemcsak erre korlátozódik.
PÉLDÁK
A találmány ez után következő példáihoz, amelyek a bemutatás és nem a korlátozás célját szolgálják, az alábbi magyarázatok szolgálnak.
- Az összes százalékok tömegszázalékban és a hőmérsékletek Celsius fokban vannak megadva.
- A DNS manipulációkban alkalmazott enzimeket a Bethesda Research Laboratories-t.ől, New England Biolabs—tói és/vagy a Boehringer-től szereztük be, és a szállító cég. útmutatása szerint alkalmaztuk.
- Élesztő növesztő tápközeg.: szelektív tápközeg: YNB ···· · • · ···· • · · • · · • · « ··
- 72 Qélesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül (Difco Labs)J 0,675 % (tömeg/térfogat) , amely 2 % (tömeg/térfogat) glükózt tartalmaz.
- YEPD tápközeg: 1 % (tömeg/térfogat) élesztőkivonat, 2 % (tömeg/térfogat) pepton és 2 % (tömeg/térfogat) glükóz.
- DNS rekombináns módszerek: a Molecular Cloning c. szakkönyv sezrint (Maniatis T. és munkatársai, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
- PMSF: fenil-metil-szulfonil-fluorid.
- Az alábbi rövidítéseket alkalmazhatjuk:
PBS: foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat (pH 7,4), 1 literre:
8,0 g NaCl
0,2 g KC1
1,15 g Na2HP04
0,2 g KH2P04
0,1 g CaCl
0,1 g MgCl2.6H20
BSA: szarvasmarha szérum albumin (Α^γθ* Sigma)
X-gal: 5-bróm-4-klór-indoil-^3-D-galakt opiranozid, ez kereskedelmi forgalomban kapható á Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, Missouri) .
L-tápközeg (1 literre):
g tripton g NaCl g élesztőkivonat ml 0,1 mól/l-es MgSO^
Tiamin aszeptikus oldatából (1 mg/ml) ml-t adunk hozzá autoklávozás után. Szilárd, tápközegnél 15 g agart adunk ···· ·β ·· ·· · · 4· • 4 4 4 44·
4*4 4444 4 44 • 44 ·4Φ 4 4··
- 73hozzá literenként.
1. példa A pRIT101ó7 plazmid megalkotása
A kiindulási anyag a pBR322-ben klónozott TDH3~at tartalmazó élesztő DNS 2,1 kb-s HindlII fragmentumát tartalmazó p6y plazmid. A pBR322-t Bolivár és munkatársai írták le Γ Gene, 2^, 95-113 (1977)J. A p6y plazmidot Musti és munkatársai alkották meg és jellemezték ^Gene, 25., 133 (1983)J , és Dr. Rosenberg M.nél van letétben a National Institute of Health-nál. A HindlII fragmentumot újból klónozzuk egy olyan pBR322 származékban, amelyben az EcoRI helyet előzőleg elroncsoltuk, így kapjuk meg a pRIT1Ol64 plazmidot (nem feltétlenül szükséges manőver). Az alábbi manipulációkat hajtjuk végre, hogy BamHI helyet hozzunk létre a TDH3 kódoló szekvencia ATG kodonjának G gyökénél elhelyezve, és hogy HindlII-BamHI DNS fragmentumot kapjunk TDH3 promotor aktivitással, amelyben a TDH3 szekvenciák érintetlenek és változatlanok maradnak a manipuláció során. A fentebb leírt módon előállított pRIT10l64 DNS-ét CsCl-etidium-bromid sűrűséggradiens centrifugálás két ciklusával tisztítjuk, lényegében úgy, ahogyan ezt Kahn és munkatársai leírták ^Methods in Enzymology, 68, 268 (1979)J· 150j^g pRIT10164 DNS-t teljesen emésztünk 75 egység Xbal endonukleázzal, fenollal és éterrel extraháljuk, etanollal kicsapjuk és a DNS-t újra szuszpendáljuk 0,01 mól/les trometamin-HCl pufferban 1 vMg/(/41 koncentrációnál. Ennek az Xbal-gyel kezelt DNS-nek 20%/<g-ját Bal31 nukleázzal emésztjük, hogy kivágjuk a DNS 61 bázispárját az ATG kodon és az Xbal hely között. A Bal31-gyel végzett emésztést 30°q hőmérsékleten .1-3 percig végezzük olyan pufferban, amely 600 mmól/1 NaCl-t, 12 mmól/1 CaCl2_t, 12 mmól/1 MgCl2-t, 1 mmól/1 EDTA-t, 20 mmól/1 • · ♦ ···· ·· ·· ·· · · · · • · · · · ·· • · · ···· · · ♦ • ·· ··· · fr ··
- 74 trometamin HCl-t tartalmaz (pH 3,1), egy egység Bal31 nukleázt alkalmazva 20j«g DNS-re 200 1 végső reakciótérfogatra.
Az enzimreakciót annyi etilén-bisz(oxi-etilén-emtrilo)tetraecetsav (EGTA) hozzáadásával állítjuk le, hogy ennek végső koncentrációja 20 mmól/1 legyen, és a mintákat azonos térfogat fenollal, majd éterrel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az egyes DNS mintákat újra szuszpendáljuk 20 ml 10 mmól/l-es trometamin-HCl pufferban (pH 7,5). A Bal31 emésztés mértékét úgy mérjük, hogy az egyes DNS minták mintegy 2,5 /wg-ját Hpal endonukleázzal emésztjük, és a Hpal-Xbal fragmentumok méretét összehasonlítjuk a pRIT10164-ből kapott 335 bp-s Hpal-Xbal fragmentummal. A 2 percen át végzett Bal31 emésztésről úgy találjuk, hogy mintegy 41-88 nukleotidot távolít el a pRIT10l64 Xbal-Hpal fragmentumáról .
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy hasonló számú bázispárt távolítottunk el a másik Xbal végen is az ATG kodon irányában. 5yvig, 2 perces Bal31 emésztésből kinyert DNS-t emésztünk BamHI endonukleázzal, extraháljuk fenollal, és etanolos kicsapással kinyerjük. Ezt a DNS-t 5 egység T4 polimerázzal kezeljük dezoxinukleotid-trifoszfátok jelenlétében, hogy betöltsük és egyforma végűvé tegyük a BamHI és bármiféle Bal31 egyszálú végeket, fenollal extraháljuk és etanolos kicsapással kinyerjük. Ennek a DNS-nek 2,3/lg-ját 5 egység T4 DNS ligázzal kezeljük, és a ligálási keverék felét használjuk E. coli K1 2 MM294 törzs kompetens sejtjének transzformálására, amelyeket Cohen és munkatársai eljárásával készítettünk elő ^Proc. Natl.
··*: .·· « · · « · ·· • · · ♦··· ♦ · · ··· »·· · · ··
- 75 Acad. Sci. 69, 2110 (1972) . A transzformált E. coli populáció 1 ml-ét 350 ml, 200 j^g/ml ampicillinnel kiegészített L-tápközegbe hígítjuk, és az így létrejött tenyészetből a teljes plazmid DNS-t tisztítjuk.
Ezt a plazmid DNS-t, amely a Bal31-gyel végzett emésztés révén 40-80 bázispárt elvesztett plazmid molekulák populációját tartalmazza, egymás után emésztjük 75 egység HindlII endonukleázzal és 96 egység BamHI endonukleázzal, hogy kiszabadítsunk DNS fragmentumokat azokból a plazmidokból, amelyekben BamHI hely alakult ki újból a fentebb leírt kezelések következtében, vagyis ahol a Bal31 emésztés egy G gyöknél fejeződött be. Ezt a DNS emésztési keveréket 1 %-os preparatív agaróz gélen futtatjuk és a kívánt HindlII-BamHI fragmentumokat,amelyek 1100-1000 bp mérettartománynak felelnek meg, két szeletben kimetsszük a gélből; az egyik a mintegy 1070 bp-s DNS-nek, és a másik a mintegy 1030 bp-s DNS-nek felel meg. A DNS-t a két agaróz gél szeletből kinyerjük olyan módon, hogy a szeleteket fagyasztás és felengedtetés két ciklusának vetjük alá, amelyet nagy sebességű centrifugálást követ, hogy az agarózt üledékbe vigyük. A felülúszó folyadékot Millipore GV Millex szűrőn át leszűrjük, és a DNS-t etanolos kicsapás és 20^41 0,01 mól/l-es trometaminHC1 pufferban (pH 7,5) végzett újra szuszpendálás műveletének kétszeres ciklusát elvégezve kinyerjük.
Az agaróz gél elektroforézissel végzett emésztés és az összehasonlítás a pRIT10l64 DNS HindlII-mal és Xbal-gyel emésztett termékével és a /1fág DNS HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztett termékeivel azt mutatja, hogy a HindlII-BamHI fragmentu « « ···<
• 9 itt· ··
- · « · • ·· a · · • ··
- 76 mok két elkülönült populációját kapjuk, egyiket mintegy 1070 bp becsült mérettel, és egy másikat mintegy 1030 bp becsült mérettel, összehasonlítva a pRIT10164-ból származó szülő HindlIIXbal fragmentummal. Az 1030 bp-s HindlII-BamHI fragmentum populáció mintegy 100 ng-ját ligáljuk 200 ng pUC9 plazmiddal, amelyet előzőleg HindlII és BamHl endonukleázzal ©resztet/—a^_ kálikus foszfatázzal kezeltünk (lásd Shine: 4 264 731 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás) és a ligálási keveréket alkalmazzuk E. coli JM103 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ahol a szelekciót ampicillin rezisztenciával lehet megvalósítani. Az E. coli JM103 törzs transzformálását Cohen és munkatársai (lásd fentebb idézett munka) módszere szerint végezzük el.
Mind a pUC9 vektor plazmidot, mind a befogadó E. coli JM103 törzset Vieira és Messing írták le Qlene, 1_9, 259 (1982)J, és ezeket Messing J.-től (University of Minnesota) kaptuk, a pUC9 vektor kereskedelmi forgalomban is kapható az Amershamtól (Buckinghamshire, Nagy-Britannia) és a Pharmacia-tól (Uppsala, Svédország). Az E. coli JM103 törzs Messing J.-től (University of Minnesota) szerezhető be. Más törzseket az E. coli JM103 jellemzőivel az Amerikai Típustörzs Gyűjteményből (ATCC, Rockville, Maryland) lehet beszerezni, pl. az ATCC 33876 letéti számon található JM101 törzset, amely szintén alkalmazható gazdaszervezetként. Mintegy 400 ampicillin rezisztens telepet kapunk ml-enként, és 98 telepet .vizsgálunk meg X-gal-t tartalmazó tápközegen. Ezek között 95 fehér telep jelzi az idegen DNS fragmentum sikeres beiktatását a vektoron levő HindlII és BamHl helyek közé.
- 77 Az egyes transzformáns telepek plazmidjait kisléptékű eljárással állítjuk elő [Bimbóim és Dolyf Nucl. Acid. Rés./, 1513 (1979)j a plazmidok sokszorozása után ISO/íg/ml spektinomicin hozzáadásával a növekvő tenyézsetekhez.
A rekombináns plazmidokat 7,5 %-os akrilamid géleken elemezzük Avall és BamHI endonukleázokkal végzett kettős emésztés után, és összehasonlítjuk a pRIT10l64 promotor-N-terminális kódoló területeket tartalmazó 450 bp-s Aval-Xbal fragmentummal és a pBR322 DNS Hpall emésztési termékének fragmentumaival. 20-90 bázispáros kiiktatásoknak megfelelő AvalI-BamHI fragmentum van jelen a vizsgált 36 plazmid közül 35-ben, amikor a pRIT10164-gyel összehasonlítjuk. Három plazmidot választunk ki a további vizsgálatokhoz: a mintegy 80 bázispár kiiktatásának megfelelőt (pRIT10l66), 50 bázispár kiiktatásnak megfelőt (pRIT10l67 - 8. ábra), és 45 bázispár kiiktatásnak megfelelőt (pRIT101ö5). Plazmid DNS-t nyerünk ki CsCl-etidium-bromidos sűrűség-centrifugálással, és ezekből PS^g-nyi mennyiségeket emésztünk EcoRI-vel. Az EcoRI végződéseket y- P-ATP-vel jelezzük kinázos cserekezeléssel, és az egyes plazmidokból kapott HindlII-EcoRI fragmentumok nukleotid-szekvenciáját Maxam és Gilbert kémiai módosítási módszerével meghatározzuk [Methods is Enzymology, 65, 499 (1980)]. A jelzés és a szekvenciaelemzés az egyes rekombináns plazmidok pUC9 vektor részében levő EcoRI helyétől kényelmes módja a szekvencia meghatározásának a szomszédos BamHI hely körül, a kiiktatás végét megjelölve a TDH3 DNS fragmentumon. Ez a szekvenciaelemzés azt mutatja, hogy a PRIT10166 plazmidban a BamHI hely helyreáll az 5’-transzlációnak alá nem vetett területben elhelyezett G gyöknél, 25 bázis ···♦ ··
- 78 párral az ATG kodontól felfelé; a pRIT10165-ben a BamHI hely a harmadik kodon második bázisánál helyezkedik el; és a pRIT 10167-ben a BamHI hely az ATG kodon G gyökénél helyezkedik el.
A pRIT10167-ben így megalkotott TDH3 DNS HindlII-BamHI fragmentumok változatlan formában tartalmazzák az összes szekvenciát, amely a TDH3 promotor aktivitásához szükséges 2. példo. pRIT1 01 72 vektor megalkotása
Az 1. példában leírt módon készített pRIT10172-ből származó 1050 bp-s HindlII-BamHI TDH3 DNS beiktatást újra klónozzuk a Broach és munkatársai által leírt ^Gene 8, 121 (1979)J YEp13 ingázó vektorba a vektor 2 mikronos DNS részletében levő HindlII hely és a BamHI hely közé, így kapjuk meg a pRIT12159 rekombináns plazmidot. A pRIT12159 DNS-ét azután Xbal- és
BamHI endonukleázokkal emésztjük, és az így létrejött 1650 bp-s fragmentumot ligáljuk egy, a pRIT10774 plazmidon levő arg promotort tartalmazó hasonló Xbal-BamHI fragmentum helyébe. A pRIT10774 plazmidot Cabezon és munkatársai írják le ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 , 6594-6598 (1986)J, és ez tartalmazza az Yep13 replikont, amelyből a természetes vektor BamHI és Xbal helyei el vannak távolítva in vitro manipulációval az arg promotort tartalmazó, 1470 bp-s HindlII-BamHI beiktatással együtt és az arg átírás termináciős területet tartalmazó, 1150 bp-s
BamHI-HindlII fragmentummal együtt. Az arg promotor beiktatás helyettesítése a pRIT10774-en a TDH3 promotor beiktatással a pRIT10172 plazmidot adja, amely ezért egy egyedi BamHI helyet tartalmaz a TDH3 promotor beiktatás ATG kodonjánál elhelyezve és megelőzve az átírási termináció funkcionális szignálját az 1150 bp-s BamHI-HindlII arg DNS fragmentumon. Ennek megfele·· *· ·
9·♦·· • · • · · • «··· • 4« ·· lően ennél a helynél idegen DNS-t lehet klónozni. Ezen kívül a két DNS beiktatást HindlII helyek is kötik, amelyek lehetővé teszik a kifejezési egység-modul (kazetta) eltávolítását 2200 bp-s HindlII fragmentumként más vektorokon történő beiktatáshoz. A 9· ábra mutatja be a pRIT10172 restrikciós endonukleázos hasítási térképét.
3. példa pRIT12290 megalkotása
1050 bp-s HindlII-EcoRI fragmentumot, amelyet az 1. példa szerint leírt módszerrel pRIT10167-ből állítunk elő (8. ábra), és amely tartalmazza a HindlII-BamHI TDH3 promotor fragmentumot a pUC9 polilinker BamHI-Smal-EcoRI részével együtt, újra klónozunk egy pBR322 plazmid származék HindlII-EcoRI helyei közé, amely származékból korábban a BamHI helyet eltávolítottuk, T4 DNS polimerizálással végzett betöltéssel és religálással. Az így létrejött rekombináns plazmidot pRIT12176-ként azonosítjuk.
Az alábbi 4(b) példában leírt módon készített pRIT1O158 (8. ábra) plazmid DNS-ét EcoRI endonukleázzal kezeljük és T4 DNS polimerázzal kezeljük, hogy betöltsük az EcoRI egyszálú végződéseket. Az így kapott készítményt tovább emésztjük Clal endonukleázzal. A pRIT10158 további mintáját Clal és HaelII endonukleázokkal kezeljük, és egy 1150 bp-s Clal-HaelII frag3 mentumot, amely hordozza az arg gén átírási terminációs területét, preparatív agaróz gél elektroforézissel és elektroelucióval kinyerjük. Ezt a fragmentumot ligáljuk EcoRI-gyel, T4 DNS polimerázzal és Clal-gyel kezelt pRIT10158 DNS-sel, és a ligációs keveréket alkalmazzuk E. coli MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ahol a sejtek előkészítését a ·· ··· s ··’!
• · -* .... ;
Cohen és munkatársai által leírt módszerrel végezzük (lásd fentebb idézett munka), ampicillin rezisztencia vizsgálatának lehetőségével. A transzformált telepekből a pRIT10162-nek azonosított plazmidot izoláljuk, amelyben a Clal-HaelII arg átírási terminációs fragmentum be van iktatva a pRIT10158-ba a Clal és a betöltött EcoRI helyek közé, és amelyben az EcoRI hely helyre lett állítva. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT10l62 elkészítését mutatja be. A pRIT10l62 plazmid DNS-t EcoRI és PstI endonukleázokkal emésztjük, összekeverjük a fentebbiekben leírtak szerint készített pRIT12176 plazmid DNS-sel (amely szintén emésztve van EcoRI és PstI endonukleázokkal), és a keveréket ligáljuk, és E. coli K12 MM294 sejtek transzformálására használjuk fel, ampicillin rezisztencia alkalmazási lehetőséggel, Cohen és munkatársai fentebb idézett módszere szerint. A pRIT 12208 plazmidot ennek a transzformációnak a telepeiből kinyerjük, amelyben a pRIT12176-ból származó nagy 4630 bp-s EcoRIPstl fragmentum ligáivá van a pRIT10162-ből származó kis 1930 bp-s EcoRI-PstI fragmentumhoz, és amelyben az arg átírási terminációs terület most közelebb került a TDH3 promotorhoz. Az arg^ és a TDH3 DNS területeket ki lehet metszeni a pRIT12208ból egyedi 2200 bp-s fragmentumként HindlII endonukleázzal végzett emésztéssel. Hogy ennek a fragmentumnak más orientációját kapjuk meg a vektor szekvenciák szempontjából, a pRIT12208-ból származó 2200 bp-s HindlII fragmentumot egy pBR322 plazmid származék HindlII helyébe újra klónozzuk, amely származékban a természetes EcoRI és BamHI helyeket külön-külön eltávolítottuk T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel és újra ligálással. Az így létrejött plazmidot, a pRIT12208-cal összehasonlítva a • · · · vektor szekvenciák szempontjából ellenkező orientációban be- . iktatott 2200 bp—s HindlII fragmentummal, pRIT12290-ként azonosítjuk. A 10. ábra a pRIT12290 restrikciós endonukleázos hasítási térképe. Mind a pRIT12208 vektorban, mind a pRIT12290 vektorban a TDH3 promotor és az átírási terminációs fragmentumok el vannak különítve egyedi BamHI, Smal és EcoRI restrikciós helyekkel, amelyek kódoló szekvenciákat tartalmazó DNS fragmentumok klónozásához használhatók, és a promotor és átírási terminációs területeket ki lehet metszeni egy 2200 bp-s HindlII fragmentummal együtt, mint modult vagy kazettát más vektorok átviteléhez.
A BamHI hely különösen használható, mivel ez a TDH3 gén ATG kodonjánál helyezkedik el, és lehet alkalmazni más gének fúziójára TDH3 promotorhoz azzal a céllal, hogy ezeket élesztőben fejezzük ki, amint ezt később példákkal is alátámasztjuk. Az ilyen fúziós termékeket pRIT12208 vagy pRIT1229 származékokból kazetták vagy modulok formájában nyerhetjük ki élesztő ingázó vektorokba való beiktatáshoz, HindlII endonukleázzal végzett emésztéssel vagy más, olyan restrikciós endonukleáz alkalmazásával^ amelyek a szegélyező restrikciós helyeknél ha sítanak .
4. példa A pRIT10677, pRITI-0909 és pRIT10158 plazmidok megal kotása
a.) pRIT10677
Klónozott HBV DNS 1372 bp-s BamHI fragmentumát kimetsszük a pRIT10616-ból[Harford és munkatársai: Dev. Bioi. Standard, 54, 125-130 (1983)], és összekeverjük és ligáljuk BamHI endo82 • · ··«· ·· ·· · · · · • · · · · · • · ···· · · · •·· · · ·· nukleázzal emésztett pBR327 DNS-sel. Ez a BamHI fragmentum tartalmazza a HBsAg prekurzor terület egy részét, a HBsAg kódoló szekvenciát és a 3’-nem-kódoló szekvenciákat. A ligációs keverékből a pRIT10677 plazmidot kiválasztjuk, amely a vektor BamHI helyénél beiktatott HBV BamHI fragmentummal rendelkezik olyan orientációban, hogy az Xbal hely a HBV DNS-ben proximális a pBR327 vektorban levő Sáli helyhez. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT10677 előállítását mutatja be.
b.) pRIT10909
A pMC200 plazmid (amely az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, rendelkezésre áll nem hasított formában, ATCC 39131 letéti számon), amelyet Crabeel M. és munkatársai írtak le ^EMBO J. 2_, 205-212 (1983)J, 3300 bp-s HindlII fragmentumát újra klónozzuk pBR332 plazmid olyan származékában, amelyből a természetes EcoRI helyet előzőleg eltávolítottuk T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel és újra ligálással. Az így létrejött pRIT10158 rekombináns plazmidót kiválasztjuk (8. ábra), amelyben a HindlII argJ gén beikta3 tás az arg gén 3' területével rendelkezik a Clal helyhez proximálisan a módosított pBR322 vektoron. A pRIT10158-ból egy 1150 bp-s Clal-HaelII fragmentumot nyerünk ki, amely hordozza az arg gén átírási terminációs területét. Ezt az 1150 bp-s fragmentumot pRIT10677 plazmid Clal és Hpal endonukleázokkal emésztett DNS-ével ligáljuk (amely plazmidot a fenti a.) részben leírt módszer szerint állítottunk elő), így fuzionáljuk az arg terminációs területet a Hpal helynél a HBsAg kódoló területtől lefelé. Az így létrejövő plazmid a pRIT10909- A 8. ábra az a * folyamatábra, amely bemutatja a pRIT10909 előállítását. A 3· ábra a pMC200 restrikciós endonukleázos hasítási térképe.
5. példa A pRIT10911 és pRIT10912 megalkotása
A BamHI hely a pRIT10167-ben (1. példa) és egy adw szerotípusú HBV vírusból származó, pRIT10616-ban klónozott HBsAg gén prekurzor területében elhelyezett természetes BamHI hely ^Harford és munkatársai, Dev. Bioi. Standard, 54, 125-130 (1983)] azonos transzlációs leolvasó keretben vannak, így lehetővé válik a TDH3 promotor fragmentum fúziójának megvalósítása, amely fragmentum ATG kodont szolgáltat a HBsAg prekurzor szekvencia 42 kodonjához, amelyet a megfelelő HBsAg kódoló szekvencia 226 kodon ja követ. A HBV DNS fragmentum forrása ehhez a fúzióhoz a pRIT 10909 plazmid (lásd fentebb a 4. példa b. részét), amely tartalmazza a HBsAg prekurzor terület kódoló részét, a teljes HBsAg kódoló szekvenciát, és a 3'-transzlációnak alá nem vetett DNS 128 bp-ját, amelyhez a fúzió történt, a Hpal helytől lefelé, és egy, a pRIT10158-ból származó 1150 bp-s HaelII-ClalII DNS fragmentumot, amely az arg átírási terminációs területet tartalmazza. A pRIT10158-at a fenti 4. példa b. részében írtuk le. pRIT10909ből a 2085 bp-s EcoRI-BamHI fragmentumot kimetsszük és beiktatjuk az A. példában leírt módon készített pRIT10l67 EcoRI és BamHI helyei közé, így alkotva meg a pRIT10911 plazmidot. A pRIT10911-bői származó, 3135 bp-s HindlII fragmentumot, amely az élesztő DNS átírási szignáljait és a HBsAg kódoló szekvenciákat tartalmazza, ezután beiktatjuk az YEp13 ingázó vektorba, így kapva a pRIT10912 plazmidot. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT10911 előállítását mutatja be.
»
6. példa A pRIT10903 és pRIT10914 plazmidok megalkotása.
• ·
Az alább leírt konstrukciók célja, hogy eltávolítsuk a fölösleges nukleotidokat annak a DNS fragmentumnak a végéről, amely az érett HBsAg kódoló szekvencia legalább N-terminális részét kódolja, az eltávolítást olyan módon végezve, hogy egy 6 bázispáros restrikciós helyet alkossunk meg a második kodon első bázisánál. Az így létrejövő fragmentumot lehet azután fuzionálni a 6 bázispáros restrikciós hellyel rendelkező promotor fragmentumokkal az iniciációs kodonnál, Mung bab vagy S1 nukleázokat alkalmazva, hogy lenyírjuk az egyszálú túlnyúló végeket és tompa végeket alkossunk meg a ligáláshoz, ahogyan ezt Rosenberg és munkatársai leírták j^Methods in Enzymology, 101C, 123 (1983)].
A pRIT10616-ból származó HBV DNS ^Harford és munkatársai: Devel. Bioi. Standard, 54, 125-130 (1983)] 1225 bp-s FnuDII fragmentumé^ amely a HBsAg gént tartalmazza, kimetsszük ebből a plazmidból, és ligáijuk szintetikus EcoRI oktamer kapcsolókkal, és a fragmentumot pACYCl84 vektor EcoRI helyébe klónozzuk, így kapjuk meg a pRIT10679-et (8. ábra). A pACYCl84 vektort Cohen S.-től kaptuk, ezt Chang A.C.Y. és Cohen S. írták le £j. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)]. A pACYC184 rendelkezésre áll az Amerikai Típustörzs Gyűjteménynél, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, is, ATCC 37033 letéti számon. Ebből az EcoRI (FnuDII) fragmentumból egy 125 bp-s EcoRI-Xbal fragmentumot kapunk, amely tartalmazza a HBsAg prekurzor C terminális területét, a HBsAg ATG kodont és a HBsAg kódoló szekvencia 90 bp-ját. Ezt a 125 bp-s EcoRI-Xbal fragmentumot bevezetjük pRIT10158 (lásd a fenti 4(b) példát) EcoRI és Xbal helyei közé. Az így létrejövő plazmid, a pRIT10903, ennek megfelelően tarI
- 85 3 talmaz egy egyedi EcoRI helyet az arg DNS és a HBV DNS találko3 zásánál, és rendelkezik egy egyedi Xhol hellyel az arg promotor területben elhelyezve. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT10903 előállítását mutatja be.
150j<g pRIT10903 plaZMID DNS-t, amelyet CsCl-etidiumbromid sűrűséggradiens centrifugálással állítottunk elő, emésztünk 80 egység EcoRI endonukleázzal, fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és újra szuszpendáljuk 1 ^Mg/t<l koncentrációra 10 mmól/l-es trometamin-HCl pufferban (pH 7,5). A DNS-t 3 db 50 íi^l-es mintára osztjuk szét, és inkubáljuk 50, 75 és 90 másodpercig Bal31 nukleázzal 30°C hőmérsékleten. Az egyes reakciókeverékek azonos, 1. példában idézett reakciópuff ért, 50y^tg EcoRI-gyel emésztett pRIT10903 DNS-t és 2,5 egység Bal31 nukleázt tartalmaznak 500^1 végső térfogatban. A reakciókat EGTA hozzáadásával állítjuk le 20 mmól/1 végső koncentrációra, jégen hűtjük, azonos térfogatú fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A Bal31-gyel kezelt DNS mintákat egyenként felvesszük 50^1 10 mmól/l-es trometamin-HCl pufferban és 2,5(/(g BstEII endonukleázzal emésztjük, majd 7,5 %-os akrilamid gélen összehasonlítjuk pRIT10903 EcoRI és BstEII endonukleázokkal emésztett termékével, amely egy 285 bp-s fragmentumot jelent. A kezelésről Bal31 nukleázzal 75 másodpercen át 30°C hőmérsékleten az derült ki, hogy 10-60 bázispárral csökkenti ennek az EcoRI-BstEII fragmentumnak a méretét, diszkrét csíkok sorozatát adva, amelyek 10, 30, 45 és 60 bázispárnyi DNS eltávolítását képviselik. 29 bázispár lemetszése az eredeti FnuDII helyről eltávolítja az összes HBsAg prekurzor DNS-t és a HBsAg ATG kodont.
5j^g pRIT10903 DNS-t, amelyet előzőleg 75 másodpercig • · · · • · • · · · ·
Bal31-gyel kezeltünk, emésztünk 8 egység Xhol nukleázzal, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t inkubáljuk 5 egység T4 DNS polimerázzal dezoxinukleotid trifoszfátok jelenlétében, hogy betöltsük és egy síkban levő végűvé tegyül az Xhol és Bal31 végeket, fenollal kezeljük és etanollal kicsapjuk. A DNS-t azután 5 egység T4 DNS ligázzal inkubáljuk 16 órán át 16°C hőmérsékleten, és a keveréket E. coli K1 2 MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására használjuk fel, ampicillin rezisztencia alkalmazási lehetőséggel, Cohen és munkatársai módszere szerint (fentebb idézett munka). Milliliterenként mintegy 2000 ampicillin rezisztens telepet nyerünk ki szélesztés után. 47 egyedi telepből plazmidokat állítunk elő kis léptékű eljárással (lásd Bimbóim és munkatársai, fentebb idézett munka), és a 47-ből 23-nál találjuk úgy, hogy megőrzi az Xhol betöltése helyet, amely azt jelenti, hogy az eredeti Xho és a ligálás egy G gyökben végződő 3' véghez sikeresen megtörtént. Ezt a 23 plazmidot tovább emésztjük Xhol és Xbal endonuk— leázokkal, hogy meghatározzuk a kis restrikciós fragmentum méretét, összehasonlítva a pRIT10903-ból származó eredeti EcoRI-Xbal fragmentummal.
Számos, kiiktatásokkal (deléciókkal) rendelkező plazmidot azonosítunk, 25-40 bázispár tartományban becsült kiiktatásokkal. Az egyik plazmidot, a pRIT10914-et, amelyről úgy becsüljük, hogy egy 95-100 bázispáros Xhol-Xbal fragmentumot tartalmaz, választjuk ki a további tanulmányokhoz. A 8. ábra mutatja be azt a folyamatábrát, amely a pRIT10914 előállítására szolgál. Ennek a plazmidnak a DNS—ét CsCl-etidiumbromid sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk, és ebből a DNS-ből 25 Mg-ot emésztünk • · · · · • ♦ • · · • · ···· ·· • ·
140 egység Xbal endonukleázzal.
Az Xbal végződéseket kicseréljük y - P-ATP-vel jelzett végződésekre, és a jelzett DNS-t 15 egység HindlII endonukleázemésgtí ük?
zal/. A kis, 765 bp-s HindlII-Xbal fragmentumot akrilamid-gélelektroforézissel és elektroeluciőval izoláljuk és etanollal kicsapjuk. A nukleotid szekvenciát az Xhol helynél és a körül áy meghatírozzuk, ennek a fragmentumnak a szekvenciaelemezésével a jelzett Xbal végződéstől, Maxam és Gilbert korábban idézett kémiai módosítási módszerét alkalmazva. A szekvenciaadatok azt mutatják, hogy az Xhol hely a HBsAg kódoló szekvencia második kodonjának első bázisánál helyezkedik el.
Xhol
CTCGAGAAC
HBsAg nukleotidok
Ez a fragmentum ennek megfelelően alkalmas a pRIT10l67-en (1. példa) levő TDH3 promotor fragmentum BamHI végződéséhez való fúzióra az egyszálú végek eltávolítása után.
7. példa A pRIT12211, pRIT12209, pRIT12230 és pRIT12265 plazmidok megalkotása
A pRIT10911 plazmidot, amelyet az 5. példában írtunk le, alkalmazzuk alapként a további műveletekhez. Hogy a kívánt restrikciós helyeket bevezessük, a plazmidot BamHI és Xbal endonukleázokkal emésztjük és a kimetszett fragmentumot a pRIT 10158 plazmidból (4. példa) származó, 2275 bp-s BamHI-Xbal fragmentummal helyettesítjük. Ez a manipuláció a pRIT12211 plazmidot eredményezi, amelyben a HindlII-BamHI TDH3 promotor fragmentum közel van egy Xhol helyet tartalmazó BamHI-Xbal fragmentumhoz, és ezt követi a HBsAg kódoló szekvencia C-termi•··· ·· • · ····
- 88 nális területét tartalmazó Xbal-HindlII fragmentum, valamint a 3' nem-kódoló DNS 128 bp-ja az 1150 bp-s arg^ átírási terminációs területhez fuzionálva. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT12211 előállítását mutatja be. A pRIT12211-et Xhol és Xbal endonukleázokkal emésztjük, és ezáltal eltávolítunk egy 1600 bp-s fragmentumot, amelyet az 5· példában leírt módon előállított pRIT10914-ből származó, módosított HBsAg DNS 94 bp-s Xhol-Xbal fragmentumával helyettesítünk. Ezt a 94 bp-s fragmentumot a pRIT10914 DNS Xhol és Xbal emésztéssel kapott termékéből tisztítással kapjuk meg, a tisztítást akrilamid gél elektroforézissel, majd a megfelelő gél-szelet elektroeluciójával, végül a DNS etanolos kicsapásával végezve el.
A 94 bp-s fragmentum bevezetésének eredményeképpen létrejött pRIT12209 plazmidot (lásd 8. ábra) CsCl-etidium-bromid sűrűség-gradiens centrifugálással tisztítjuk, és 30^ι{^ pRIT 12209 DNS-t emésztünk 90 egység BamHI endonukleázzal és 60 egység Xhol endonukleázzal, hogy eltávolítsunk 990 bp többlet-DNS-t a TDH3 promotor és a HBsAg kódoló terület között, majd a keveréket fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Ebből a DNSből 10jAg-ot inkubálunk 30 percen át 30°C hőmérsékleten 20 egység mung-bab nukleázzal (PL Biochemicals) 1 50 va^1 térfogatban. Az inkubáláshoz alkalmazott puffer 30 mmól/1 nátrium-acetátot (pH 4,6), 250 mmól/1 NaCl-t, 1 mmól/1 ZnCl-t és 5 % glicerint tartalmaz. A reakciót annyi nátrium-dodecil-szulfát hozzáadásával állítjuk le, hogy a végső koncentráció 0,2 % legyen, majd azonos térfogat fenollal extrahálunk, ezt pedig etanolos kicsapás követi. Ennek a mung bab nukleázzal kezelt mintának 0,5 Jkgos alikvotját 2 egység T4 DNS ligázzal inkubáljuk 16 órán át • · · ······ •· ··· · • · · · · „··.
• φ ···· · «· ······ · · ··
- 8916°C hőmérsékleten, majd emésztjük 2 egység BamHI endonukleázzal, hogy elroncsoljunk minden olyan vektor molekulát, amely elkerülte ezt a kezelést. Ezt a keveréket alkalmazzuk E. coli K1 2 MM
294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ampicillin rezisztenciával végzett szelekció lehetőséggel, olyan módon, ahogyan ezt Cohen és munkatársai leírták (fentebb idézett munka). A transzformációs keverék milliliteréire számítva mintegy
2000 ampicillin rezisztens telepet nyerünk ki, és ezeknek a transzformánsoknak a sokszorozott tenyészeteiből plazmidokat állítunk elő kis léptékű eljárással (Bimbóim és munkatársai fentebb idézett eljárása szerint).
plazmidból 16 ad két DNS csíkot HindlII endonukleázzal végzett emésztés után, 2700 bp (pUC9 vektor) és 3000 bp mérettel. A 3000 bp-s csík mérete az a méret, amely elvárható a
HBsAg kódoló szekvencia és a TDH3 promotor fragmentum arg terminációs területe fúziós termékétől.
Négy kijelölt plazmidot viszünk további vizsgálatokra. Az egyes plazmidok DNS-ét Xbal endonukleázzal emésztjük és jelöl32 jük kinázzal végzett cserével, P-ATP-t alkalmazva, ezt követi az emésztés HindlII endonukleázzal, majd a jelzett 1190 bp-s HindlII-Xbal fragmentum izolálása akrilamid gél elektroforézist követő elektroelucióval és etanolos kicsapással. Az egyes fragmentumok szekvenciáját Maxam és Gilbert fentebb már idézett kémiai módosítási módszereivel határozzuk meg. Két plazmidról úgy találjuk, hogy a korrekt ATGGAGAAC szekvenciával rendelkeznek a TDH3 promotor terület és a HBsAg gén tökéletes fúziójához. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely bemutatja a pRIT 12230 előállítsát. Ennek a plazmidnak (pRIT12230) a DNS-ét
-- 90 • · · · · ·· , · ···· » · · ··· ··· · · ··
HindlII endonukleázzal kezeljük, és a TDH3 promotorhoz fuzionált HBsAG kódoló szekvenciát tartalmazó 3000 bp-s fragmentumot az YEp13 ingázó vektorba ligáijuk. Az így létrejövő pRIT12265 plazmidot a DC5 élesztőtörzsbe transzformáljuk (MATa, leu2-4, leu2-112, his3, can1-11) £ezt a törzset Broach J.-től (State University of New York, Stany Brook) kaptuk , és amely élesztőtörzs korlátozás nélkül rendelkezésre áll az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC) is, ATCC' 20630 letéti számonj, Ito és munkatársai transzformációs eljárását alkalmazva £j. Bact. 153, 163 (1983)]-
8. példa A pRIT12288 és pRIT12322 plazmid megalkotása.
A pRIT12230 plazmid (7. példa) konstrukciója tartalmaz
128 bp nem-kódoló HBV DNS-t, a HBsAg strukturgén stop kodonjától 3' irányban lefelé elhelyezve.
Hogy a DNS-nek 128 bp-ját eltávolítsuk, a fenti 7. példában leírt módon készített pRIT12230 mintegy 25v/\tg-ját emésztjük AccI és EcoRI endonukleázokkal. A pRIT 12230 egy egyedi AccI helyet tartalmaz az S-gén kódoló szekvenciában elhelyezve 7 nukleotiddal a TAA stop kodon előtt. Az emésztett DNS-t elektroforézisnek vetjük alá 1 %-os agaróz gélen, és a nagyobb, 4200 bp-s vektor fragmentumokat kinyerjük a gélről, elektroelucióval és etanolos kicsapással.
Egy 12-mer szálból és egy 14-mer szálból összeállított mesterséges DNS kapcsoló molekulákat szintetizálunk az alábbi szekvenciákkal, a pRIT12330 AccI és EcoRI helyei közé való beiktatáshoz :
5' ATACATTTAACG 3'
- mer
3' TGTAAATTGCTTAA 5'
- mer
Ez helyreállítja a korrekt C-terminális HBsAg kodonokat és a TAA stop kodont, és olyan EcoRI helyet szolgáltat az átírási terminációs fragmentumok hozzáadásához, amely másutt nincs jelen a TDH3 promotorban vagy HBsAg kódoló szekvenciákban.
100 pikomól szintetikus 12-mer és 100 pikomól szintetikus 14-mer egyedi szálakat összekeverünk 10-20^1 végső térfogatban, 70°C hőmérsékleten melegítjük 15 percen át, és hagyjuk lassan visszahűlni szobahőmérsékletre 3 óra alatt, így téve lehetővé, hogy a két szál összeforrjon komplementer szekvenciái mentén. Ehhez az összeforrasztott keverékhez hozzáadunk mintegy 0,15 pikomólt (400 ng) a pRIT12230 4200 bp-s AccI-EcoRI fragmentumából, valamint 10 x koncentrált ligáló puffért és 2 egység T4 DNS ligázt.
Ezt a keveréket 4 órán át inkubáljuk 16°C hőmérsékleten, majd további 2 egység T4 DNS ligázt adunk hozzá, és egy éjszakán át jégen inkubáljuk. A ligálási keveréket alkalmazzuk MM 294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, ampicillin rezisztencia szelektálás! lehetőséggel, Cohen és munkatársai módszere szerint Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69., 2110 (1972)J. 12 vagy több egyedi telepből plazmidot állítunk elő Bimbóim és Doly gyors eljárása szerint jjTucl. Acids Rés. 7, 1513 (1979)J, és restrikciós endonukleázos elemzéssel vizsgáljuk. AccI-EcoRI kapcsoló beiktatással bíró plazmidok 4200 bp-s egyedi csík DNS-t mutatnak vagy AccI, vagy EcoRI enzimmel végzett emésztés
• · ···· ···« ·· • · » ·· • · ·· után. A kapcsoló beiktatásának korrektségét DNS szekvenciaelem— zéssel lehet igazolni vagy az EcoRI helytől vagy az AccI helytől, Maxam és Gilbert kémiai módosítási módszerével jMethods in Enzymology, 65, 499 (1980)j.
Hogy átírási terminációs fragmentumhoz jussunk, a fentebb leírtak szerint kapott, AccI-EcoRI kapcsoló beiktatással bíró plazmidot EcoRI endonukleázzal emésztjük, és alkálikus foszfatázzal kezeljük (Shine J.: 4 264 731 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A pRIT1CH62 2650 bp-s HindlII fragmentumát, amelyet a 3. példában leírt módon kaptunk, újra klónozzuk a pBR327 vektor plazmid HindlII helyére, így alakítjuk ki a pRIT12288 plazmidot. A pBR327-et Soberon és munkatársai írják le ^Gene, £, 287-305 (1980)^], és ezt úgy lehet előállítani, .amint ezt az alábbi 10. példa b.) részében leírjuk, a pRIT12309 plazmidból, amelyet viszont az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben ATCC 67187 letéti számon levő törzsből nyerhetünk ki. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT 12288 megalkotását mutatja be.
A pRIT12288-on levő HindlII fragmentum orientációja olyan hogy az arg átírási terminációs terület a pBR327 rész EcoRI és Clal restrikciós helyei mellé kerül. A pRIT12288-ból egy 1180 átírási termináciős területet hordozza. Ezt a fragmentumot ligáljuk az EcoRI-gyel emésztett, alkálikus foszfatázzal kezelt, fentebb leírt pRIT12230 származékkal, és az ebből a ligálási keverékből származó plazmidokat az 1180 bp-s EcoRI fragmentum beiktatására és orientációjára vizsgáljuk. A beiktatás orientációját HindlII endonukleázzal végzett emésztéssel kaphatjuk meg, amely 2880 és 2720 bp-s frag- 93 meritumokat szabadít fel, ha a beiktatás a megfelelő orientációjú.
Olyan plazmidot, a pRIT12322-t(alkotunk meg, amelyben az AccI-EcoRI kapcsoló helyettesíti a nem kívánt DNS 128 bp-ját, és amelyben a pRIT12288-ból származó 1180 bp-s EcoRI fragmentum a kívánt orientációban van jelen a HBsAg kódoló szekvenciától lefelé. Egy 2900 bp-s HindlII fragmentumot lehet kimetszeni a pRIT12322-ből, amely hordozza a HBsAg szintézishez szükséges kifejező modult, beleértve a TDH3 promotort, a HBsAg kódoló szekven3 ciát és az arg átírási terminációs területet. A 8. ábra olyan folyamatábra, amely bemutatja a pRIT12322 megalkotását. Lásd még a 11. ábrát is, amely a pRIT12232 restrikciós endonukleázos térképe, és bemutatja, hogy ennek mely részei származnak a pRIT12288-ból és mely részei a pRIT12230-ból.
9. példa A pRIT12329 plazmid megalkotása
Amint a fenti 8. példában leírtuk, a pRIT12322 tartalmaz egy 2900 bp-s HindlII fragmentumot, a HBsAg kifejeződéséhez szükséges, TDH3 promotorból származó összes szükséges szignállal. Ezt a modult ligáljuk egy ingázó vektorba, élesztő sejtekbe való bevezetés céljából. Az YEp13 ingázó vektor DNS-t emésztjük HindlII endonukleázzal és alkálikus foszfátázzál, és befogadóként alkalmazzuk a fenti 8. példában leírt módon előállított pRIT12322 HindlII fragmentumának bevezetéséhez. A pRIT 12329 plazmidot izoláljuk, amely tartalmazza az YEp13 replikont a 8. példában leírt 2900 bp-s HindlII modul fragmentummal együtt.
10. példa Plazmid vektorok megalkotása a HBsAg-CS hibrid antigén kifejeződéséhez élesztőben.
a. A pRIT12573 és pRIT12574 plazmidok megalkotása
A WR201 plazmidot a Walter Reed Army Institute of Research···· ··
- 94 tői kaptunk, és ez a Plasmodium falciparum teljes cirkumsporozoita fehérje génjét kódoló A mPf1 j^Dame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)] 2,3 kilobázisos (kb) EcoRI fragmentuma beiktatásának eredményeként jön létre pUC8 vektorba. A 2A ábra mutatja be a AmPfl klón sematikus restrikciós térképét és szék— venciaelemzési stratégiáját. Az ábrában bemutatott restrikciós enzimes hasítási helyek helyzeteit a szekvenciából határozzuk meg, és emésztéssel igazoljuk, a rövidítések az alábbiakat jelentik: A: Avall; Ac: AccI; B: BstnI; D: Dral; Dd: Ddl; F: Foki; N: Ndel; R: Rsal; S: Stul; T: TthlII; Tq: Taql; X: Xhol. A nyilak jelzik az origót, az irányt és a meghatározott szekvenciák kiterjedését. A CS fehérje kódoló területét vastag vonalként mutatjuk. A 3A. ábra mutatja be a P. falciparumból származó CS fehérje gén nukleotidszekvenciáját. A ^mPfl-ben levő CS fehérje gén nukleotid szekvenciáját bemutatjuk. A pUC8 vektort Vieira és munkatársai írják le [Gene, 1_9, 259 (1982)]. A pUC8 kereskedelmi forgalomban van, az Amersham és a Pharmacia termékeként. A WR201 plazmid 1215 bázispáros (bp) Stul-Rsal fragmentumát, amely tartalmazza a CS fehérje kódoló szekvenciát az első 52 bp nélkülf (12. ábra) elektroelucióval tisztítjuk 7,5 %-os poliakrilamid elektroforézis géljéről. Ezt a fragmentumot Sau3A-val emésztjük, hogy kisebb fragmentumokat alakítsunk ki, amelyek közt található pl. egy 192 bp-s Sau3A fragmentum, amely a CS fehérje 16 tetrapeptidből álló ismétlődő részét kódolja, és három azonos, 24 bp-s Sau3A fragmentum, amelyek a CS fehérje két tetrapeptidből álló ismétlődő részét kódolják.
A pRIT10911 (amelyet az 5. példában leírtak szerint állítunk elő) pUC9 származék, amely egy 3136 bp-s HindlII kazettát hordoz, ··»· *· ez a kazetta egy 1050 bp-s HindlII-BamHI élesztő gliceraldehid3P-dehidrogenáz (TDH3) promotor fragmentumot hordoz (amely az ATG-t szolgáltatja) a BamHI helynél fuzionálva a pre-S 2 terület 42 C-terminális aminosavát, az S-gén 226 aminosavát (adw szerotípus) kódoló és a 3'-nem kódoló DNS 128 bp-jét tartalmazó HBV DNS 935 bp-s BamHI-Hpal fragmentumához. Az S gén egy 1150 bp-s élesztő DNS fragmentummal van szegélyezve, amely hordozza az arg átírási terminátort. A pUC9-et Vieira és munkatársai írják le [Gene, 19, 259-268 (1982)]. A pRIT10911 BamHI helye, amely az ATG iniciációs kodonnál helyezkedik el, fázisban van a Plasmodium falciparum CS ismétlődő epitópjának Sau3A helyeivel. A pRITöO911 plazmid DNS-t BamHI endonukleázzal emésztjük, alkálikus foszfatázzal kezeljük, fenollal extraháljuk és etanolos kicsapással nyerjük ki. Ebből a DNS-ből O^^g-ot összekeverünk a fentebb leírtak szerint előállított Stul-Rsal CS gén fragmentum Sau3A emésztési termékének 0,2 ^g-jával, kezeljük T4 DNS ligázzal, és a ligálási keveréket alkalmazzuk E. coli K12 MM294 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, a sejteket Cohen és munkatársai módszerével állítva elő [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]. Az egyes transzformáns telepekből 32 plazmidot állítunk elő a kis léptékű eljárással ^Bimbóim és munkatársai: Nucleic Acids Research 7> 1513 (1979)J a plazmid sokszorozása után, a sokszorozást úgy végezve, hogy spektinomicint (300^g/ml) adunk a növekvő tenyészetekhez. A rekombináns plazmidokat 7,5 %-os akrilamid elektroforézis gélen elemezzük BamHI és Xbal endonukleázokkal végzett kettős emésztés után, és összehasonlítjuk a pRIT10911 219 bp-s BamHI-Xbal fragmentumával (amely tartalmazza a Pre S2 terület prekurzor első 42 aminosavát • · · * ’ ·· Λ • « ·*»· · -· · e·· ··· · * ·· kódoló szekvenciát és a HBsAg terület kezdetét) és a ψχ174 DNS HaelII emésztési termékének fragmentumaival.
A 32 plazmid közül egy rekombináns mutat 411 bp-s BamHIXbal fragmentumot, amely megfelel a 192 bp-s Sau3A fragmentum beiktatásának korrekt orientációban, ezt pRIT12572-nek nevezzük. Egy másik rekombináns 243 bp-s BamHI-Xbal fragmentumot mutat, amely a 24 bp-s Sau3A fragmentum beiktatásának felel meg korrekt orientációban, ezt pRIT12571-nek nevezzük. A 12. ábra mutatja be a pRIT12571 és pRIT12572 előállítására vonatkozó folyamatábrát.
A pRIT12572 és pRIT12571 HindlII fragmentumait, amelyek tartalmazzák a TDH3 promotort, a CS-HBsAg hibrid kódoló szek3 venciát és az arg terminációs területet, újra klónozzuk YEp13ba, hogy megkapjuk a pRIT12574 illetve pRIT12573 plazmidokat (12. ábra). Az YEp13-at Broach és munkatársai írják le [jlene, 8, 121-133 (1979)]. A 12. ábra a pRIT12573 és pRIT12574 előállítását mutatja be folyamatábrában.
A pRIT10912, pRIT12574 és pRIT12573 plazmidokat S. cerevisiae DC-5 (a, leu2-3, leu2-112, his3, can1-11) törzsbe és S. cerevisiae 10S44C(pep4-3, leu2-3, leu12-112) törzsbe ^amelyet Czabeel M.-től kaptunk, a Ceria Institute- bői, Anderlecht, Belgium; lásd még ezzel a törzzsel kapcsolatban: Cabezon T. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 ; 6594-6598 (1984)] vezetjük be litium-acetáttal kezelt törzsek transzformációjával [lto és munkatársai: J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)] és leucj.nfüggőségre végzett szelekcióval. A DC5 élesztőtözset letétbe helyeztük az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, a Budapesti Szerződés elő• · • · · · • · ·
- '97 írásai szerint, '1982. június 2-án, ATCC 20630 letéti számon. A
10S44C élesztőtörzset letétbe helyeztük az Amerikai Típustörzs
Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült
Államok, 1986. augusztus letéti számon. A várt hibrid fehérjéről a pRIT12573-nál az jósolható meg, hogy 277 aminosavat tartalmaz, míg a pRIT12574-nél az, hogy 333 aminosavat tartalmaz.
Lehetséges a találmány szerinti vektorhoz CS epitóp területet hozzáadni, vagy ezt a területet megnagyobbítani. így pl. a pRIT12572 és pRIT12571 plazmidokba a CS fehérje DNS további Sau3A fragmentumait, pl. egy 192 bp-s vagy 24 bp-s Sau3A fragmentumot, lehet ligálni a BamHI helybe a következő módon.
pRIT12572 vagy pRIT12571 plazmid DNS-t emésztünk BamHI endonukleázzal és kezeljük alkálikus foszfátázzál. A WR201 plazmid 1215 bp-s Stul-Rsal fragmentumát, amelyet a fentebb leírt módon kapunk, emésztjük Sau3A endonukleázzal, hogy felszabadítsuk az ismétlődő tetrapeptideket hordozó 192 bp-s és 24 bp-s fragmentumokat. Ezeket a fragmentumokat összekeverjük BamHI-gyel és alkálikus foszfatázzal kezelt pRIT12572 vagy pRIT12571 vektorokkal, T4 DNS ligázzal kezeljük, és a keveréket E. coli K12 törzsekbe transzforrnáljuk hagyományos eljárásokkal, ampicillin rezisztencia szelekciós lehetőséggel. A transzformáns telepekből kapott plazmidokat átvizsgáljuk a BamHI-Xbal fragmentumok méretére endonukleázos emésztéssel, és összehasonlítjuk a hasonlóképpen emésztett pRIT12572 vagy pRIT12571 DNS-sel, különösen a pRIT12572ből és pRIT12571-bői származó 243 bp-s BamHI-Xbal fragmentumokkal, amelyek hordozzák a CS ismétlődések és a Pre S2-S kódoló szekvencia egy része közti fúziós területet. Ezeknek a fragmen• · ·
- -98 turnéiknak méretnö-vekedése 192 bp-vel vagy 24 bp-vel jelzi, hogy egy ismétlődő tetrapeptid fragmentum beépítése megtörtént a pRIT12572 és a pRIT12571 BamHI helyénél. A BamHI hely jelenléte ilyen plazmidokon azt jelzi, hogy a 192 bp-s vagy 24 bp-s Sau3A fragmentumok beiktatása megfelelő orientációban történt a fúzióhoz az ATG kodonnál. Ezt a fentebb leírt folyamatot meg lehet ismételni, ha kívánatos, hogy további 192 bp-s vagy 24 bp-s Sau3A fragmentumokat vezessünk be, amelyek az ismétlődő CS tetrapeptideket kódolják, és a CS tetrapeptid területet a hibrid részecskén meg lehet hosszabbítani. Amint fentebb megállapítottuk, a pRIT12572 vagy pRIT12571 ilyen származékaiból eredő HindlII fragmentumokat, amelyek a kifejező modult vagy kazettákat hordozzák, ki lehet metszeni és be lehet iktatni YEp13-ba vagy más alkalmas élesztő klónozó vektorba, élesztő sejtekbe való bejuttatás céljából hagyományos technikákkal.
(B) Az élesztőből származó teljes 2 mikronos DNS szekvenciát tartalmazó pRIT12309, pRIT12314 és a pRIT12377 kifejező ingázó vektorok megalkotása
A pRIT12309 plazmid tartalmazza az élesztőből eredő, 6318 bp-s komplett 2 mikronos DNS szekvenciát a pBR327 vektor plazmid EcoRI helyébe klónozva. A 6318 bp-s, 2 mikronos DNS szekvenciát a pCV19 plazmidból nyerjük ki, ezt a plazmidot Broach J.tői (Princeton University, New Jersey) kaptuk. A pRIT12309 plazmidot letétbe helyeztük 1986. augusztus 18-án az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok, E. coli K12 MM924 törzsben a Budapesti Szerződés előírásai szerint, ATCC 67187 letéti számon. A 13- ábra a pRIT 12309 restrikciós endonukleázos térképe. A 2 mikronos DNS szék• · · · • · ··· · · · • · · · · · · • « ·»· · ♦ · · · ··· ··· · · ··
- 99 vencia beiktatása pBR327-be az ezen molekulán jelen levő két EcoRl hely egyikén megszakítja a 2 mikronos A kódoló területet, és az így létrejövő pRIT12309 hibrid molekulát hatástalanná teszi az A” gén funkcióra, amelyet FLP funkciónak is nevezünk. A 2 mikronos terület szerkezetének és működésének leírásával kapcsolatban lásd Broach J. The Molecular Biology of the yeast Saccharomyces: Life cycle an Inheritance(A Saccharomyces élesztők molekuláris biológiája: életciklus és öröklődés), 445—470; szerkesztők: Strathern J.N., Jones E.W. és Broach J.R.; kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981).
A pBR327-et Soberon és munkatársai írják le föene, 9., 287— 305 (198O)J és ezt Bolivár F.-től kaptuk (Department of Molecular Biology, National University of Mexico, Mexico 20DF). Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a pBR327-et a fenti pRIT 12309-plazmidból ki lehet nyerni az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben ATCC 67187 letéti számon letétbe helyezett E. coli törzsből kinyert pRIT12309 plazmid előállításával a nagyszámú hagyományos módszer bármelyikével, ennek a DNS-nek az emésztésével EcoRl endonukleázzal, az emésztett termék ligálásával és E. coli K12 kompetens sejtjeinek a ligálási keverékkel való transzformálásával, ampicillin vagy tetraciklin rezisztenciát alakítva ki.
A transzformáns telepek jelentős száma tartalmaz olyan plazmidokat, amelyekben csak a pRIT12309 pBR327 része van jelen a két 2 mikronos DNS fragmentum bármelyikétől mentesen.
A TDH3 arg kifejező kazetták tartalmazó, és a fentebb leírt, 3. példa szerinti pRIT12290-ből származó pBR322 szekvenciákat szegélyező 2850 bp-s Clal-Sall fragmentumot újra klónozzuk a pRIT12309 vektorba a Clal és Sáli helyek közé. Az így létrejövő
100 pRIT12314 plazmidot Sáli endonukleázzal emésztjük és az YEp13ból származó, az élesztő LEU2 gént tartalmazó 2218 bp-s Sall-Xhol fragmentummal ligáljuk. A 14. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT12314 előállítását mutatja be. Az YEp13 rendelkezésre áll az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben ATCC 37115 letéti számon. A ligálási keveréket alkalmazzuk a JA221 törzs kompetens sejtjeinek transzformálására, a sejteket Cohen és munkatársai fentebb idézett módszerével állítva elő, és mind leucin-függőség, mind ampicillin rezisztencia szelekciós lehetőséggel.
A JA221 a köz számára hozzáférhető, mi Rosenberg M.-től (Smith Kline and French Laboratories, Inc., Philadelphia) kaptuk, de beszerezhető az Amerikai Típustörzs Gyűjteményből is ATCC 33875 letéti számon.
A pRIT12544 plazmidot ennek a transzformálásnak egyik telepéből kapjuk, amelyben a 2218 bp-s Sall-Xhol LEU2 gén fragmentum be van iktatva a pRIT12314 Sáli helyénél. A beiktatás orientációja olyan, hogy a Sáli hely alakuljon ki újra a TDH3arg kifejező kazettához legközelebbi oldalon. A pRIT12544 E. coli-élesztő ingázó vektor egyedi BamHI és Smal helyekkel a TDH3 promotor és az arg átírási terminációs területek között elhelyezve, amely helyek alkalmasak DNS kódoló szekvenciák beiktatására, hogy a TDH3 promotorból való kifejeződésükre hassanak. A 14. ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT12544 előállítását mutatja be.
(C) A pRIT12658 plazmid megalkotása
A pRIT12574 3328 bp-s HindlII fragmentumát, amely a 10.
példa A. részében leírtak szerint készített YEp13 származék, újra klónozzuk pBR322 BamHI plazmidban (ahol a BamHI hely el van
101 roncsolva T4 DNS polimerázzal végzett betöltéssel), hogy a pRIT 12608-at kapjuk meg, ahol a BamHl hely, amely a CS-HBsAg kódoló szekvencia ATG iniciációs kodonjánál helyezkedik el, egyedi (15. ábra). A pRIT12608-ból származó 2550 bp-s BamHI-Sall fragmentu3 mot, amely tartalmazza a CS-HBsAg kódoló szekvenciát, az arg átírási terminációs területet és a szegélyező pBR322 szekvenciát, újra klónozzuk a fentebb leírt pRIT12544 (15. ábra) BamHl és Sáli helyei közé, hogy megkapjuk a pRIT12658 plazmidot (15. ábra). Ez a csere a CS-HBsAg kódoló szekvenciát a TDH3 promotor szabályozása alá helyezi egy komplett 2 mikronos élesztő ingázó vektorban. A 15. ábra a pRIT12658 előállítását bemutató folyamatábra.
11. példa A hibrid fehérje szintézise élesztőben
Saccharomyces cerevisiae DC5 vagy 10S44C élesztő törzseket transzformálunk Ito és munkatársai módszere szerint / J. Bacteriol.
153, 163-168 (1983)] a pRIT10912 (5. példa), pRIT12573 (10. példa), pRIT12574 (10. példa) vagy pRIT12658 plazmidok (10. példa) mindegyikével, vagy pRIT12329 (9· példa) vagy pRIT10172 (2. példa) plazmidokkal, és külön-külön növesztjük olyan folyékony tápközegben, amelyből a leucin hiányzik (YNB vagy YNB+80 VM g/mlhisztidin), és a közép-log fázisban a sejteket kinyerjük. 1 vagy 2 ml-es tenyészetekből sejteket gyűjtünk össze centrifugálással, és újra szuszpendáljuk 50^1 0,125 mól/l-es trisz-HCl-ben (pH 6,8), amely még 20 % glicerint, 4 % SDS-t, 6 mól/1 karbamidot és 10 %
2-merkapto-etanolt tartalmaz. 5 percen át 100°C hőmérsékleten végzett inkubálás után a mintát megfelezzük és mindkét felet elektroforézisnek vetjük alá 12,5 %-os szeparáló gélen, illetve 5 %-os rétegelt gélen Laemmli módszere szerint [Natúré 227, 680 (1971)].
X t ··· • · · · · · • · · • · · • · · ··· · · · · · · ·
- 102 A HBsAg és CS fehérje szekvenciákat a fehérje immunfoltképzési technikával azonosítjuk £lásd: Burnette: Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Gershoni és Palade: Anal. Biochem. 131, 1-15 (1983); Towbin és Gordon: J. Immunoi. Methods 72, 313-340 (1984)J. A fehérjék elektrofoltképzése után nitrocellulóz szűrőn (Schleicher és Schüll, 0,45/0 jjTowbin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (1979)] a szűrőt egy órán át előinkubáljuk 37°C hőmérsékleten 3 %, PBS-ben levő zselatinnal. Ezt követően a szűrőt ötször öt percig mossuk, mindig 0,1 % Tween20-at (polioxietilén szorbitán monolaurát) tartalmazó PBS-sel, és a lemez egyik felét egy órán át szobahőmérsékleten kezeljük öt, CS fehérje elleni monoklonális antitest keverékével ^Dame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)J, PBS-ben, amely 1 % zselatint is tartalmaz. A lemez másik felét HBsAg és HepYTAS12 monoklonális antitestekkel kezeljük 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben.
A HepYTAS12 tisztított, élesztő eredetű HBsAg ellen kiváltott antitest, amely egy redukciónak és denaturálódásnak ellenálló epitóp ellen irányul. A szűrőlemezeket ötször 5 percig mossuk, minden esetben PBS-0,1 % Tween20-szal, és egy másodszor biotinilezett birka anti-egér antitestet (Amersham) adunk hozzá 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben egy órára, szobahőmérsékleten. A lemezeket újra mossuk PBS-0,1 % Tween20-szal, ötször 5 percig, majd 30 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk streptavidinbiotinilezett torma-peroxidáz (HRP) komplexszel (Amersham). A lemezeket háromszor mossuk PBS-0,1 % Tween20—szál, és végül inkubáljuk 30/41 Η202-νβ1 és HRP színkifejlesztő reagenssel (HRP Color Development Reagent, Bio-Rad), amelynek 30 mg-ja 10 ml metanolban van oldva, mindezek 50 ml PBS-ben találhatók. Az • · ·»· · ·
- 103 antigének molekulatömegét az előfestett fehérje-markerek segítségével becsüljük meg, ilyen fehérjék pl. az ovalbumin, alfakimotripszinogén, béta-laktoglobin, lizozim vagy citokróm C (BRL).
Mind a DC5, mind a 10S44C élesztőtörzsek, amelyek pRIT12573~ mal vannak transzformálva, olyan antigén termelését mutatják, amely reagál mind anti-CS, mind anti-HBsAg antitestekkel, és amelynek becsült molekulatömege 30000 kilodalton (kd). Mind a DC5, mind a 10S44C élesztőtörzsek, amelyek vagy pRIT12574-gyei, vagy pRIT12658-cal vannak transzformálva, olyan antigén termelését mutatják, amely reagál mind anti-CS, mind anti-HBsAg antitestekkel, és amelynek becsült molekulatömege 37000 kd. Kimutatható néhány kisebb molekulatömegű antigén is, jelezve a hibrid fehérje bizonyos degradálódását. CS vagy HBsAg szekvenciák nélküli plazmidokat (pRIT10172) tartalmazó sejtek kontroll mintái nem mutatnak semmiféle reakciót. Csupán HBsAg szekvenciákkal rendelkező plazmidokat (pRIT12329 vagy pRIT10912) tartalmazó sejtek kontroll mintái csak az anti-HBsAg antitestekkel mutatnak reakciót.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy mind CS, mind HBsAg szekvenciákat tartalmazó, várt molekulatömegű hibrid fehérje szintetizálódik olyan plazmiddal transzformált élesztőkben, na k/ amelyek CS kódoló szekvenciát tartalmaz/Tázisban fuzionálva a Pre S2-HBsAg kódoló szekvenciához.
Ezen kívül miközben a kötési intenzitás az anti-HBsAg reakcióban közel azonos a pRIT12573-nál és pRIT12574-nél, az antiCS-reakció intenzitása a pRIT12574-nél lényegesen erősebb, mint a pRIT12573-nál. Ez azt jelzi, hogy azonos mennyiségű HBsAg szekvencia mellett a CS fehérje ismétlődő epitópjának nagyobb
104 mennyisége van jelen a pRIT12574-ben, mint a pRIT12573-ban.
12. példa A CSP epitőpot nyújtó hibrid részecskék szintézise
Saccharomyces cerevisiae DC5 vagy 10S44C élesztőtörzseket, amelyek pRIT10172-t (2. példa), pRIT12329~et (9. példa), pRIT 12573-at (10. példa), vagy pRIT12574-et (10. példa) tartalmaznak, növesztünk szelektív tápközegben (200 ml YNB vagy YNB+80 jAg/ml hisztidin) a lóg fázis végéig. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 10 ml 50 mmól/l-es nátriumfoszfátpufferban (pH 7,4), amely 0,5 % Tween20-at (polioxietilén szorbitán monooleát), 1 mmól/1 PMSF-et (fenil-metil-szulfonil-fluorid) és 2,5 % izopropanolt tartalmaz. A sejteket szétzúzzuk olyan módon, hogy kétszer átengedjük francia présen (French Press) 20000 psi (1,38.10°Pa) nyomásnál. A szuszpenziót centrifugáljuk 30 percen át 30000 g-nél. A felülúszó folyadék (nyers sejtkivonat) teljes fehérjekoncentrációját Lowry és munkatársai módszerével £j. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951)] mérjük, standardként szarvasmarha szérum albumint alkalmazva. A HBsAg jelenlétét radioimmunassay készletet ( AUSRIA II) alkalmazva - amely j készlet az Abbot Laboratories-nél, North Chicago, Illinois, kapható -, vagy ELISA készletet (Enzygnost-HBsAg micro) alkalmazva
- amely készlet a Behringwerke, Marburg, Német Szövetségi .Köztársaság, kereskedelmi forgalomban levő terméke - határozzuk meg.
az/
A CS szekvenciák hozzáférhetőségét a HBsAg részecskékben /immuni reakció számára a fentebb említett ELISA vizsgálattal vizsgáljuk.J
A vizsgálandó minták megfelelő higitásait (0,2 % BSA-t tartalmazó.]
PBS-ben) kötődni hagyjuk (egy éjszakán át szobahőmérsékleten) a szilárd fázisú anti-HBsAg-hez (Enzygnost készlet). A kötött f
HBsAg részecskéket egy órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a
105
CS fehérje ellen irányuló öt monoklonális antitest |JDame és munkatársai: Science, 225, 593-599 (1984)J keverékének 1/10000 arányú higitásával (0,1 % BSA-t tartalmazó PBS-ben), mint első antitesttel, majd biotinilezett birka anti-egér lg (Amersham) 1/500 arányú higitásával (0,1 % BSA-t tartalmazó PBS-ben), mint második antitesttel inkubáljuk egy órán át 37°C hőmérsékleten. A kimutatás úgy történik, hogy streptavidin-biotinilezett torma peroxidáz komplex (Amersham) 1/1000 higitásával (0,1 % BSA-t tartalmazó PBS-ben) és az Enzygnost készletből származó kromogénnel inkubálunk 30 percen át 37°C hőmérsékleten. Az inkubálások között a tálcákat négyszer mossuk az Enzygnost készletből származó mosó oldattal. A színkifejlődést 510 nm-nél mérjük Titertek Multiskan műszerben (Dynatech).
A fehérje koncentráció és az AUSRIA aktivitás (II.Táblázat) mérése nyers sejtkivonatokban azt mutatja, hogy a pRIT12573 ugyanolyan szinten irányítja a HBsAg kifejeződést, mint a pRIT 12329. A pRIT12574 azonban tízszer kisebb AUSRIA aktivitást mutat. Ezeknek az extraktumoknak az immunfolt-elemzése mintegy azonos mennyiségű szintetizált HBsAg-vel rokon fehérjét mutat ebben a három esetben.
II. TÁBLÁZAT - AUSRIA aktivitás nyers se jtextráktumokban
Plazmid Gén Fehérje (mg/ml) HBsAg(RIA) (ng/ml) HBsAg ng/ml fehérje
pRIT10172 - 5,6 0 0
pRIT12329 S 3,3 5700 1730
pRIT12573 CS(24bp)PreS2-S 3,6 4000 . 1130
pRIT12574 CS(192bp)PreS2-S 2,8 450 160
• · · ···· ·· »· ·· · · · · • · · * · «· • · ···· · · · ··· ··· · · · ··
- 106 Az ELISA mérés azt mutatja, hogy olyan szerkezet van jelen a pRIT12573 és a pRIT12574 extraktumaiban, amely mind HBsAg, mind CS epitópokat fejez ki (III. Táblázat) és hogy több reagáló CS epitóp van a HBsAg epitópokra számítva a PRIT12574 extraktumokban, mint a pRIT12573 extraktumokban.
Hogy megvizsgáljuk ezeknek a RIA és ELISA pozitív szerkezeteknek a természetét, 1 ml nyers sejtkivonatot összekeverünk 1,5 mól/1 CsCl2 oldattal (50 mmól/1 nátrium-foszfátban, pH 7,4) és 40 órán keresztül centrifugálunk 40000 g-nél, Beckman SW50.1 rotorban. Az összegyűjtött frakciókat HBsAg és CS antitest kötő aktivitás jelenlétére vizsgáljuk a fentebb leírt RIA és ELISA módszerekkel. A HBsAg és CS antigén aktivitásokról úgy találjuk, . hogy együtt egyensúlyozódnak ki mind a pRIT12573, mind a pRIT 12574 gradiensekben. Felülúszó sűrűségük kicsit nagyobb ( ^ 1,20 g/cm^), mint a pRIT12329 felülúszó sűrűsége ( = 1,18 g/cm^)·
A gradiens frakciók immunfolt-elemzése igazolja a RIA/ELISA eredményeket. A HBsAg és/vagy CS szekvenciákat csak azokban a frakciókban találjuk meg, amelyek reagálnak a RIA/ELISA vizsgálatokban.
II. TÁBLÁZAT - Immobilizált anti-HBsAg antitesthez kötött antigénben jelen levő HBsAg és CS epitópok
Nyers sejtkivonat az alábbiakból: Hígítás ELISA (HBsAg) 0D510 nm ELISA (CS) 0D510 nm
10S44C (pRIT10172) 100x 0,000 0,065
10S44C (pRIT12329) 100x 0,580 0,054
200x 0,341 0,041
• ♦··· ·· • · · « • · · ·· ·*·· ♦ · ·
107
400x 0,188 0,056
10S44C (pRIT12573) 100x 1,298 1,596
200x 1 ,080 1,299
400x 0,702 0,898
800x 0,336 0,560
1600x 0,155 0,323
3200x 0,075 0,189
10S44C (pRIT12574) 1 OOx 0,662 1,678
200x 0,370 1 ,506
400x 0,183 1,130
800x 0,079 0,798
1600x 0,044 0,449
3200x 0,061 0,205
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a pRIT12573 és pRIT12574 kifejeződése útján termelt hibrid fehérje a HBsAg részecskékhez hasonlatos részecskékbe áll össze az élesztőkben történő szintézis során. A pRIT12573 és pRIT12574 kifejeződése révén termelt részecskék a CS szekvenciákat külső részükön hordják, amint ez abban a képességükben mutatkozik, hogy reagálnak CS antitestekkel. A pRIT12574 esetében ezek a CS szekvenciák részlegesen elzárják a HBsAg a determináns hozzáférhetőségét a RIA vizsgálatban (ez a determináns felelős főleg az AUSRIA aktivitásért).
13. példa
A,A hibrid részecskék tisztítása
A 10. példában leírt módon készített pRIT12574-et tartalmazó 10S44C élesztőtörzs nyers sejt kivonatot polietilénglikol (PEG) 400 kicsapással tisztítjuk és AMICON DC-ben végzett ultra···· ··
- 108 szűré qfel koncentráljuk, ahol a berendezés olyan gyertyával van felszerelve, amely 100000 daltonos kizárással bír.
A hibrid részecskék további tisztítását a szakterületen ismert módszerekkel végezzük, pl. CsCl centrifugálással, hidroxiapatit kromatográfiával és gélszűréssel.
A pRIT12574-et tartalmazó 10S44C törzs sejtkivonatából származó végsó tisztított készítmény egy fő csúcsot mutat egy HPLC TSK-3000 oszlop (LKB) kizárási térfogatban, amely csúcs tartalmaz mind HBsAg, mind CS antigenicitást. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis j^Laemmli: Natúré, 227, 680 (1971 )J, amelyet ezüst-festés követ £Wray és munkatársai: Anal. Biochem. 118, 197-203 (1981 egyetlen fő csíkot mutat 37000 kd becsült molekulatömeggel. Az uranil-acetáttal végzett negatív festés utáni elektronmikroszkópia mintegy ugyanolyan méretű és alakú részecskéket mutat, mint az élesztő eredetű HBsAg.
B. A hibrid részecskék tisztítása
Dyno Mill berendezésen végzett szétzúzással nyers élesztőkivonatokat készítünk mosott élesztősejtekből azonos tömegű, 50 mmól/l-es nátrium-foszfát extrakciós puffer (pH 8,1) jelenlétében, ahol a puffer 4 mmól/1 Titriplex III-mal, 1 % Tween20szal, 4 mmól/1 PMSF-fel és 10 % izopropanollal van kiegészítve.
A sejttörmeléket 11000 g-nél, 90 percen át végzett centrifugálással eltávolítjuk, 500 ml centrifugált nyers kivonatot pH 7,2-re állítunk be 1 n ecetsavval, és egy éjszakán át kevertetjük 4°C hőmérsékleten 10 g kolloidális szilicium-dioxid jelenlétében (Aerosil 380, Degussa). Ezt követően a szuszpenziót 3500 g-tól 1 órán át centrifugáljuk, és az üledéket háromszor mossuk 15 percig 150 ml 0,15 mól/l-es NaCl-lel, amely 2 mmól/1 ·»Μ
·· · ··*· • ·
109
PMSF-fel és 5 mmól/1 EDTA-val van kiegészítve. Végül az Aerosil üledéket eluáljuk 250 ml, 2 % Tween20-at tartalmazó 10 mmól/1 pirofoszfát pufferral (pH 9,5),, 37°C hőmérsékleten 3 órán át. A deszorpció termékéhez Cseppenként 1 mól/l-es CaClg oldatot adunk 30 mmól/1 CaC^ végső koncentrációig, és a pH-t 7-re állítjuk be. Az oldatot egy éjszakán át 4°C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd 6500 g-nél centrifugáljuk 15 percen át. A felülúszót 2x5 1 10 mmól/1 trisz-HCl-lel (pH 7,1) szemben dializáljuk 4°C hőmérsékleten, majd ezt követően négyszeresre hígítjuk dialízis pufferral.
Miután 30 mmól/1 CaClg-t és 1 mól/1 NaCl-t adtunk hozzá, a hígított, pH 7,1-re beállított antigén oldatot átengedjük 150 ml-es Phenyl Sepharose FF oszlopon, amely oszlop ugyanolyan CaClg/NaCl tartalmú trisz-pufferral van kiegyensúlyozva, az áramlási sebesség 30 cm/óra. Ezt követően az oszlopot kiegyensúlyozó pufferral mossuk mindaddig, amíg az 0^280nm zér<5ra csökken, és ugyanilyen áramlási sebességgel eluáljuk 6 mól/l-es, 10 mmól/1 trisz-HCl-ben (pH 9) levő karbamidoldattal.
Egy másik módszer szerint a dializált és négyszer hígított antigénoldatot kiegészítjük 20 % (NH^^SO^-re (pH 7), és átengedjük 150 ml-es«Phenyl Sepharose FF oszlopon, amely oszlop 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,1) és 20 % (NH^^SO^-et tartalmazó oldattal van kiegyensúlyozva, az áramlási sebesség 30 cm/óra. Az oszlop kiegyensúlyozó pufferral végzett mosása után az oszlopot ugyanolyan áramlási sebességgel 10 mmól/1 trisz-HCl-lel (pH 7,1) eluáljuk .
Az antigén-pozitív frakciókat összegyűjtjük és végül centrifugáljuk egy vagy két egymást követő CsCl sűrűség gradienssel »
• · • •I»
4°C hőmérsékleten 245000 g-nél, 65 órán át. A tisztított hibrid •·ν· ·· · • ·· «·
110
CS-HBsAg részecskék felülúszó sűrűsége 1,23
14. példa A hibrid részecskék immunogenicitása
A 13· példa módszerével előállított pRIT12574-et tartalmazó
S. cerevisiae 10S44C törzsből tisztított hibrid részecskéket laboratóriumi állatokba inokuláljuk, önmagában, vagy adjuvánsként alkalmazott alumínium-hidroxiddal együtt és munkatársai:
Science, 228, 958-962 (1985)]·
C57B1/6 egereket (6-8 hetesek), tengeri malacokat és nyulakat immunizálunk szubkután és intraperitoneálisan a 0„ 21. és 49. napokon. Állatokat véreztetünk el a 7-, 28., 56., és 84. napon. A vért hagyjuk alvadni 4°C hőmérsékleten egy éjszakán át, és a szérumokat elkülönítjük, és felhasználásig -70°C hőmérsékleten tároljuk.
A nyulak, 2-2 állatból álló 2 csoportban, 10yv(g hibrid CSHBsAg fehérjét kapnak 1,0 ml-es adagokban, aluminium-hidroxiddal vagy a nélkül, az egyes immunizálásoknál. Kontrollként 2 nyulat immunizálunk 10j4g Heptavax B-vel (Merek Sharpé & Dohme), ugyanazt az inokulálási munkamenetet alkalmazva. Az egerek és a tengeri malacok, 5 állatból álló csoportokban, 1 illetve 5JAg hibrid fehérjét kapnak 0,5 ml-es adagokban az egyes immunizálásoknál. Kontrollként nem immunizált állatok szolgálnak.
Az antitest válaszok meghatározása céljából az egerekből származó szérumokat csoportonként gyűjtjük össze, míg a tengeri malac és nyúl szérumokat egyenként vizsgáljuk. Az anti-CS antitest titereket ELISA vizsgálattal határozzuk meg, antigénként az R32tet32 rekombináns CS fehérjét alkalmazva £lásd Young és munkatársai: Science, 228, 958-962 (1985)]· Az anti-HBsAg titereket • · ·· V
- 111 az AUSAB készletet (Abbot Laboratories) és a WHO referenciákat alkalmazva határozzuk meg.
Sem a tengeri malacok, sem az egerek nem fe jleszte-nek . ki felmérhető antitest választ a HBsAg ellen az ismételt emlékeztető oltás ellenére sem. Ezzel ellentétben viszont mindkét állatfajta fejleszt . ki anti-CS antitesteket, és ezeket a válaszokat az emlékeztető oltások növelik. 1,0 abszorbciőt kapunk ELISA mérésben 1600-szoros (egereknél) és 9000-szeres (tengeri malacoknál) higitásoknál. A hibrid részecskék immunogenicitását az adszorpció alumínium-hidroxidra nem növeli.
Ezzel ellentétben a nyulak fejlesztenek ki antitesteket mind CS-re, mind HBsAg-ra. A reciprok titerek 1,0 abszorbanciánál az anti-CS ELISA vizsgálatban 800 és 3200 között vannak. Az alumínium-hidroxidra adszorbeált hibrid részecskékkel kapott anti-HBsAg titerek 4000 és 20000 mUI/ml között vannak, míg a
6
Heptavax-szal immunizált nyulak 10-10 mUI/ml titereket adnak.
A hibrid részecskék adszorpciója alumínium-hidroxidra növeli az immunválaszt.
Az összes, egerekből, tengeri malacokból és nyulakból kapott szérum erőteljesen reagál a cirkumsporozoita precipitin reakcióban, valamint mind gátolja a hepatóma sejtek sporozoita behatolását in vitro [jíoung és munkatársai: Science, 228, 958-962 (1985)J (lásd IV. Táblázat). Mindkét reakció a védő immunválaszt jelzi.
• · > - 112 IV. TÁBLÁZAT Cirkumsporozoita precipitin (CSP) reaktivitás, és a HepG2-A 16 hepatóma sejtek sporozoita behatolásának százalékos gátlása (% ISI)
Állat(ok) CSP reaktivitás % ISI héttel a 2. emlékeztető (4+ 2+ 0) oltás után
Összegyűjtött egér szé-
rumok 14 9 2 91 %
Nyúl, N— 36 22 3 0 96 %
Tengeri malac N— 1107 24 1 0 100 %
A CSP reaktivitás zárójelben bemutatva:
= nincs kimutatható reaktivitás
2+ = szemcsés csapadék a sporozoita felszínén
4+ = fonalszerű szövedék a sporozoita végéről
15. példa Vakcina készítése
A jelen találmány szerinti egy példaszerű vakcinát a következőképpen állítunk elő: Alumínium-hidroxid 3 %—os, pufférőit vizes oldatához (10 mmól/1 nátrium-foszfát, 150 mmól/1 NaCl, pH 6,8, sterilezés szűréssel), a jelen találmány szerinti részecskéket adjuk hozzá hasonló pufferban keverés közben, 100/lg/ml polipeptid és 0,5 mg/ml alumínium (Al^+) végső koncentrációra.
A pH-t 6,8 értéken tartjuk. A keveréket egy éjszakán át állni hagyjuk mintegy 0°C hőmérsékleten. Thimersolt adunk hozzá 0,005 % végső koncentrációig. A pH-t ellenőrizzük, és ha szükséges, beállítjuk 6,8 értékre.
Bár a fentiek teljes mértékben leírják a találmányt és minden előnyös kiviteli módját, figyelembe kell venni, hogy a talál• · • · ···· ·· • · · · · · • · · · · · • · · · · · ··
- 113 mány nem korlátozódik az éppen itt leírt kiviteli módokra, hanem magába foglalja az összes olyan módosításokat, amelyek a később leírt igénypontok oltalmi körén belül vannak.
PÉLDÁK A PRE S2-S FEHÉRJE ÉS PRE S1-PRE S2-S FEHÉRJE ELŐÁLLÍTÁSÁRA ÉLESZTŐVEL
Felfedeztük, hogy a jelen találmány szerinti Pre S2-S fehérje kódoló terület beiktatása valamilyen élesztő kifejező vektorban élesztőbe olyan részecskék szintézisét eredményezi, amelyek az autentikus 22 nm-es HBsAg részecskékre hasonlítanak, amelyek glikozilezett Pre S2 fehérjét viselnek felületükön. Korábban korrekt módon nem számoltak be arról, hogy a HBV genom bármilyen részletével transzformált élesztő glikozilezett terméket fejezett volna ki.
A következő példák olyan fehérjék glikozilezett formáinak kifejezésére vonatkoznak élesztőkben, amely fehérjék a hepatitisz B felületi antigén S fehérjéjén kívül a Pre S2 területet is tartalmazzák. A fehérjéket részecskék formájában lehet kivonni és tisztítani az élesztősejtekből humán vakcinákhoz való felhasználásra. Az élesztőben kifejezett Pre S1—Pre S2-S fehérje is glikozilezve van és ebből szintén részecskék formájában lehet kivonni és tisztítani hepatitisz B vírus elleni vakcinákhoz való felhasználásra.
A glikozilezés jelenlétére tekintettel az alábbiakat kell megjegyeznünk:
1.) A 25·, 26., és 27. példák a konkavalin A kötéssel, illetve tunikamicin hatással, illetve Endo H-ra való érzékenységgel foglalkoznak. Mindegyik azt bizonyítja, hogy a 33 Kd-s Pre S2-S fehérje fajták glikozilezettek. így a glikozilezés három függetο ·
- 114 len módszerrel van bebizonyítva.
2. ) Ezeknek a reagenseknek a fajlagossága, általában, a következő:
a. ) a konkanavalin A előnyösen köt a mannóz maradékokhoz;
b. ) a tunikamicin gátolja a glikozilezés minden olyan típusát, amely N-glikozidon keresztül aszparaginhoz köt;
c. ) az endoglikozidáz H elhasítja az aszparaginhoz kötött sok-mannóz/oligoszacharidokat, ott hagyva egy N-acetil-glukóz- amin maradékot az aszparaginhoz kötve.
3. ) A 25-, 26., és 27. példák eredményeiből és a fentebb leírtakból (tunikamicin gátlás, érzékenység Endo-H-ra) arra lehet következtetni, hogy egy N-kapcsolt oligoszacharid lánc van jelen a
Pre S2-S fehérje 33 Kd- s. formáján, amely sok-mannóz-tartalmú típus (az Endo-H-ra való érzékenység alapján). A megfigyelt változás a molekulatömegben (mintegy 3000) a tunikamicin kezelés és”· Endo H emésztés után azt jelzi, hogy az oligoszacharid szerkezet mintegy 10 cukorgyökből áll. Ez mintegy egy belső glikozilezés méretének felel meg élesztőkben. így valószínűleg csak egy hely glikozilezett a Pre S2-S fehérje lehetséges glikozilezési helyei körül.
4. ) A 28. és 29. példákban leírt tisztítási munkamenetek mind tartalmaznak olyan affinitás-kromatográfiás lépést, amely a glikoprotein cukorgyökére alapozódik.
5. ) A fenil.-boronát fajlagos az 1,2-cisz-diol csoportokra (2 szomszédos OH csoport helyezkedik el sztérikusan azonos irányban).
6. ) A lencse-eredetű Lentil Sepharose glükóz/mannóz fajlagos.
16. példa pRIT12662 megalkotása - olyan E. coli vektor megalkotása, amely a Pre S2-S kifejező kazettát tartalmazza (16. ábra).
A korábbi 3· példában leírtak szerint kapott pRIT12290 «
- 115 plazmidot módosítjuk egy szintetikus BamHI-EcoRI adapter fragmentum beiktatásával, amely a Pre S2 terület N-terminális aminosavait kódolja a TDH3 promotor és ARG3 terminátor fragmentumok között. Ezt a beiktatást a következőképpen végezzük el.
A pRIT12290 plazmidot BamHI és EcoRI enzimekkel emésztjük és defoszforilezzük alkálikus foszfátázzál. 200 pikomól alábbi foszforilezett szintetikus adaptert
Gin Trp
BamHI 5’ GATC CAG TGG 3’ EcoRI
3' GTC ACCTTAA 5'
ligálunk 0,1 pikomól BamHI-EcoRI-vel kezelt és defoszforilezett pRIT12290 plazmiddal 1 egység T4 ligázt alkalmazva; a ligáit terméket alkalmazzuk E. coli MM294 törzs transzformálására, ampicillin rezisztencia vizsgálati lehetőséggel. Egy transzformánst azonosítunk és tartunk fenn, amely befogadta a szintetikus adaptert a BamHI és EcoRI helyek közé. A plazmidot pRIT12621-nek nevezzük. A pRIT12621 plazmiddal kiindulva a következő lépések a négy többlet bázispár (a BamHI hely belső része) eltüntetése abból a célból, hogy ATG kodont helyezzünk el fázisban a Pre S2 terület második kodonjával, és egy EcoRI fragmentum beiktatása a pRIT12621 EcoRI helyébe, hogy teljessé tegyük az egész Pre S2-S kódoló területet, ahol az említett EcoRI fragmentum a Pre S2 kódoló terület maradékát és a teljes S kódoló területet tartalmazza.
Ebben a fázisban a DNS manipulációkat, beleértve a pRIT12621 plazmid egymást követő linearizálását, delécióját és újra köralakúvá tételét,, sokszorozás nélkül hajtjuk végre, intermedier plazmidok transzformálásával, az eljárás a következő.
pikomól (120^g) pRIT12621 DNS-t linearizálunk 120 egy116 • · · · · · · • · · · • · · · · • · · · · · * • · · · ség BamHI-gyel. A restrikciós enzim fenolos extrakcióval végzett eltüntetése után a plazmidot etanollal kicsapjuk és megfelelő pufferban újra szuszpendáljuk, hogy emésszük a BamHI egyedi szál végződéseket 280 egység mung bab nukleázzal. A nukleázt fenolos extrakcióval eltüntetjük, majd ezután etanolos kicsapás következik. Az így kezelt plazmidot ligáló pufferban újra szuszpendál juk és újra köralakúvá tesszük 10 egység T4 ligázzal.
A ligáit plazmidot tartalmazó készítményt fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és megfelelő pufferban újra szuszpendáljuk, és EcoRl enzimmel emésztjük. Az EcoRl endonukleáz eltávolítása után fenolos kezeléssel és etanolos kicsapással 0,05 pikomől (0,2jig) DNS-t újra szuszpendálunk a ligáló pufferban abból a célból, hogy 0,4 pikomól (0,2^g), pRIT12581-bői izolált, 838 bázispáros EcoRl fragmentummal ligáljuk, amely fragmentum tartalmazza a Pre-S2-S fehérje teljes C-terminális kódoló területét. A pRIT 12581-re lényegében hasonló plazmidot alkothatunk meg a következőképpen. A pUC9 vektort (amely kereskedelmi forgalomban van és az Amershamtól, valamint a Pharmacia-tól szerezhető be) EcoRl endonukleázzal emésztjük és alkálikus foszfatázzal kezeljük (Shine: 4 264 731 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás). A pRIT106l6 plazmidot (ATCC 39131) EcoRl és AccI restrikciós endonukleázokkal kezeljük és a Pre S2-S kódoló terület egy részét tartalmazó 826 bp-s EcoRI-AccI fragmentumot preparatív akrilamid gélelektroforézissel és elektroelucióval kinyerjük. Ennek a fragmentumnak mintegy 0,4 pikomólját (0,2^<g) összekeverjük mintegy 10 pikomól szintetikus adapterrel, amely az alábbi, 12 bp-s, előzőleg összef orra.sztott, a fenti 8. példában leírt szintetikus adapter:
• · · ·
Ile
Tyr Stop
ATACATTTAACG
117
3'
AccI
EcoRI
3’
TGTAAATTGCTTAA 5' és a keveréket T4 DNS ligázzal kezeljük, és EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük. Az így kezelt keverékhez mintegy 0,2 Mg, EcoRI-gyel emésztett és alkálikus foszfatázzal kezelt pUC9 vektort adunk, amelyet a fentebbiek szerint állítottunk elő, és a keveréket T4 DNS ligázzal kezeljük, majd ezt E. coli K1 2 kompetens sejtjeinek hagyományos módon történő transzformálására használjuk fel, ampicillin rezisztencia szelekciós lehetőséggel. A transzformánsokból eredő telepeket olyan plazmid jelenlétére vizsgáljuk, amely a 2650 bp-s pUC9 vektort tartalmazza egy 838 bp-s EcoRI fragmentummal együtt; ez a fragmentum a 826 bp-s EcoRI-AccI Pre S2-S fragmentumból és egy 12 bp-s AccI-EcoRI szintetikus kapcsolóból áll. Az így azonosított konstrukció korrektségét DNS szekvenciaelemzéssel igazoljuk, Maxam és Gilbert kémiai módosítási módszerét alkalmazva ^Methods in Enzymology 65, 499 (1980)], előnyösen a pUC9 polilinkerben levő egyedi szegélyező restrikciós helyből.
A fentebb leírtak szerint kezelt pRIT12621 plazmid DNS-t és a pRIT12581 838 bp-s EcoRI fragmentumot tartalmazó ligálási keveréket használjuk E. coli MM294 törzs transzformálására Cohen és munkatársai módszere szerint (fentebb idézett munka). Az egyik transzformánst, amelynek korrekt orientációban levő EcoRI fragmentummal rendelkező plazmidja van, kinyerjük, ezt a plazmi » « • · · ·
- 118 dót pRIT12662-ként azonosítjuk (lásd 1A. és 16. ábrák). Az 1A ábra olyan folyamatábra, amely a pRIT12662 előállítását mutatja be. A 16. ábra a pRIT12662 restrikciós endonukleázos térképe. A pRIT12662-ből származó Pre S2 terület szekvenciaelemzését Maxam és Gilbert kémiai módosítási eljárásával végezzük jTMethods in Enzymology 65., 499 (1980)], hogy ellenőrizzük: a kódoló leolvasó keret az N-terminálisnál az alábbi:
Met Gin Trp Asn Ser
AAAC AAAC AAA ATG CAG TGG AAT TCC pTDH3 Pre S2-S kódoló terület
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a pRIT12662 vektort lehet alkalmazni további funkcionális DNS szekvenciák bevezetésére is Pre S2 területbe, vektor DNS megfelelő in vitro manipulációjával. A Pre S2 kódoló szekvencia tartalmaz restrikciós helyeket EcoRI, PstI és BamHI endonukleázokhoz. Ezeknek a helyeknek bármelyikét lehet alkalmazni a szóban forgó peptideket kódoló funkcionális DNS szekvenciák bevezetéséhez, hogy fázisban levő fúziót hozzunk létre a Pre S2 területtel. Az ilyen fúziók Pre S2-bevezetett szekvencia-Pre S2-S típusúak. Ezeket a restrikciós helyeket lehet in vitro is manipulálni, hogy további vektorokat hozzunk létre és további helyeket vagy leolvasó kereteket szolgáltassunk funkcionális DNS szekvenciák beiktatásához, ilyen módszer pl. Botstein és munkatársai módszere £science 229, 1193-1201 (1985)].
17. példa pRIT12377 és a Pre S2-S fehérjét kifejező pRIT12660 élesztő-plazmid megalkotása
A 10(B) példában leirt módon kapott pRIT12309 plazmid DNS-t • φ φ φφφφ ·♦ φ* φφ φ φ φ · φ φ φ · φ · · φ φ φφφφ φ φ · • φ · *· φ φ · φ «·
- 119 Sáli endonukleázzal emésztjük és ligáijuk egy 2218 bp-s, az élesztő LEU2 génjét tartalmazó Xhol-Sall DNS fragmentummal, ez utóbbi fragmentumot YEp1 3 emésztésével és a fragmentum akrilamid gélen végzett tisztításával kapjuk. A ligáit keveréket alkalmazzuk E. coli K12 JA1221 törzs transzformálására, amelyet Cohen és munkatársai fentebb idézett eljárása szerint készítünk elő; a szelekciós lehetőség adott mind ampicillin rezisztenciára, mind leucin függetlenségre. A JA221 törzset Rosenberg M.-től (Smith Kline and French Laboratories, Philadelphia, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok) kaptuk, ez a törzs az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC) is rendelkezésre áll ATCC 33875 letéti számon. Az egyik transzformált telepből a pRIT12377 plazmidot azonosítjuk, ez tartalmazza a 2218 bp-s LEU2 Xhol-Sall fragmentumot a pRIT12309 Sáli helyére beiktatva.
A fragmentum orientációja a vektoron olyan, hogy a Sáli hely helyreálljon a vektor pBR327 részének Aval oldalán. A pRIT12377 plazmid olyan E. coli-élesztő ingázó vektor, amely rendelkezik a szükséges funkciókkal a szelekcióhoz, replikációhoz és fenntartáshoz mindkét organizmusban.
A Pre S2-S kifejező kazettát tartalmazó, pRIT12662-ből (16. példa) eredő, 3050 bázispáros HindlII fragmentumot akrilamid gél elektroforézissel tisztítjuk, T4 polimerázzal kezeljük és ligáijuk olyan pRIT12377-tel, amelyet előzőleg BamHI enzimmel kinyitottunk és T4 polimerázzal helyreállítottunk. Ezt a készítményt használjuk E. coli MM294 törzs transzformálására ampicillin rezisztencia szelekciós lehetőséggel, Cohen és munkatársai fentebb idézett eljárása szerint. pRIT12660 plazmidot tartalmazó E. coli transzformánst nyerünk ki. A 17. ábra olyan folyamatáb···· ·· • · · ····
- 120 ra, amely a pRIT12660 készítését mutatja be.
A pRIT12660 plazmidot alkalmazzuk S. cerevisiae két törzsének, a DC5 cir° és 10S44C cir° törzseknek, transzformálására a Hinnen és munkatársai által leírt módszer szerint ^Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2157-2161 (1978)^.
Mind a DC5 cir°, mind a 10S44C cir° törzs deponálva lett az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) a Budapesti Szerződéssel összhangban, 1986. augusztus 18-án ATCC 20820 illetve ATCC 20818 letéti számokon.
18. példa A Pre S2 terület a pRIT12662 plazmidban
A pRIT12662 plazmidban levő Pre S2 területet szekvenciaelemzésnek vetjük alá Maxam és Gilbert kémiai módosítási módszerével £proc. Natl. Acad. Sci. 74, 560-564 (1977)J, és úgy találjuk, hogy négy bázispár változás van, amely három aminosav változáshoz vezet, összehasonlítva az adw2 szerotípus egy másik vírusával (Valenzuela és munkatársai, 1980 - I. Táblázat, 11. sor).
A változások: alanin gyök treonin gyök helyett a —45· helynél; fenilalanin leucin helyett a -34. helynél; és szerin gyök az izoleucin gyök helyett a -11. helynél. Az utóbbi változás olyan gyökre hat, amelyet váltakozónak találtak eddig is az összes ismert szerotípusban /Lo és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Com.
2, 382-388 (1986)J.
19· példa Polimerizált humán szérum albuminhoz (pHSA) szolgáló receptort hordozó részecskék szintézise
DC5 cir° vagy 10S44C cir° élesztőtörzseket (S. cerevisiae), amelyek vagy pRIT12660-at, vagy pRIT12363-at tartalmaznak (16. példa) növesztünk szelektív tápközegben ^200 ml YNB+80 jvfl/ml ···♦ 99 ···· hisztidin (DC5 cir°) vagy YNB (10S44C cir°)J lóg fázisig. (A pRIT12363 azonos a pRIT12660-nal a hepatitisz eredetű gén kivételével: a pRIT12363 csak az S gént tartalmazza). A sejteket centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 50 mmól/1 nátriumfoszfátban (pH 8,0), amely 0,5 % Tween20-at (polietilén szorbitan monooleát), 1 mmól/1 PMSF-et (fenil-metil-szulfonil-fluorid) és 2,5 % izopropanolt is tartalmaz. A sejteket szétzúzzuk olyan módon, hogy kétszer átengedjük francia présen (French Press) 20000 psi-nél (1,38.10® Pa). A szuszpenziót 30 percen át centrifugáljuk 30000 g-nél. A felülúszó folyadék (nyers sejtkivonat) teljes fehérjekoncentrációját Lowry és munkatársa módszerével mérjük £<J. Bioi. Chem. 193, 265-275 (1951 )], standardként szarvasmarha szérum albumint alkalmazva. A HBsAg-vel rokon anyag jelenlétét radioimmunassay készletet (AUSRIA II) alkalmazva mérjük, ez a kész*let kereskedelmi forgalomban kapható az Abbott Laboratories termékeként. Az eredmények (V. Táblázat) azt jelzik, hogy a pRIT 12660 irányítja a HBsAg részecskékkel antigenicitás szempontjából rokon anyag szintézisét. Az AUSRIA aktivitás mérésén alapuló kifejeződési szint mintegy azonos mind a DC5 cir°, mind a 10S44C cir° élesztő törzsekben.
Abban a radioimmunassay-ban, amelynek célja polimerizált humán szérum albumin (pHSA) számára szolgáló receptor kimutatása ^Pontisso és munkatársai: J. Virol. Methods, 6, 151-159 (1983)], a pRIT12660-at tartalmazó sejtekből származó nyers sejtkivonatok pozitív reakciót adnak, míg a pRIT12363-at tartalmazó sejtekből származó nyers sejtkivonatok nem. A háttérértéken túl nem figyelhetünk meg reakciót a polimerizált szarvasmarha szérum albuminnal .
···· ·· • · ·
·· • · · ·
-122 ··
A pRIT12660-at tartalmazó sejtekből származó nyers sejtextraktum CsClp egyensúlyi Centrifugálása AUSRIA pozitív anyagot mutat a vagy élesztő-eredetű HBsAg részecskék. A gradiensnek ebből a részéből kinyert anyag pozitív eredményt ad a pHSA vizsgálatban.
A fentebb említett eredmények azt mutatják, hogy a pRIT 12660-at tartalmazó élesztősejtekben HBsAg-vel rokon fehérje fejeződik ki, amely olyan szerkezetbe áll össze, mint a szérumból származó 22 nm-es részecskék, és pHSA-hoz való receptort mutat a felületén.
VA. TÁBLÁZAT. AUSRIA akti vitás a nyers sejtkivonatban
Törzs Plazmid Fehérje mg/ml HBsAg-vel kapcsolatos antigenicitás, ng/ml HBsAg-vel kap csolatos anti genicitás, ng/mg fehérje
CD5 cir° pRIT12660 13,4 7 522
DC5 cir° PRIT1266O 12,6 7 555
10S44C cir° pRIT12660 10,8 6 556
10S44C cir° PRIT12660 9,5 6 631
20. példa Négy S-rokon fehérjéről találjuk azt, hogy pRIT12660val transzformált élesztőben kifejeződnek
Abból a célból, hogy pRIT12660-ban kifejezett, HBsAg-vel % rokon fehérje monomereket elemezzük, sejteket növesztünk szelektív tápközegben, vagy Erlenmeyer lombikban, vagy fermentorokban, lóg fázisig, és centrifugálással gyűjtjük össze a sejteket.
A kigyűjtött sejtekhez (0,1 g) először 20^/41 40 mmól/l-es
PMSF-et (izopropanolban) adunk, majd 200 /4.1, SDS-poliakrilamid *
• · ··· »··· ·· • · • ·· • « ♦ ··
-1 23 gélelektroforézishez szolgáló minta-puffért [θ,125 mól/1 triszHC1 (pH 6,8), amely 20 % glicerint, 4 % SDS-t, 6 mól/1 karbamidot és 10 % 2-merkapto-etanolt tartalmaz^. A mintákat Vortex-berendezésben összekeverjük, és 2-20j^l-es alikvotokat tovább hígítunk a fenti minta-pufferral 40^1 végső térfogatra, 5 percig inkubáljuk ezeket 100°C hőmérsékleten, és elektroforézisnek vetjük alá
12,5 % elkülönítő és 5 % tartó gélen, Laemmli módszere szerint [Natúré, 227, 680 (1971)]·
A fehérjék elektromos foltképzése [Towbin és munkatársai:
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354 (1979)] után nitrocel lulóz szűrőre. (0,45^m, BioRad), a szűrőt előinkubáljuk egy órán át 37°C hőmérsékleten PBS-ben levő 3 % zselatinnal. A szűrőt olyan monoklonális antitesttel inkubáljuk, amely humán eredetű
HBsAg denaturálásra és redukcióra rezisztens epitópja ellen irányul [ö. monoklón, amelyet Thomas H.-tól (Royal Free Hospital, London, Anglia) kaptunk^, és az antitest-kötődést az alábbi szerekkel egymás után végzett inkubálással mutatjuk ki: biotinile zett birka anti-egér lg (RPN 1021, Amersham, 1/250 hígítás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben); steptavidin—biotinilezett torma peroxidáz-komplex (RPN 1051, Amersham(1/400 hígítás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben); és végül 50 ml PBS-ben 30^1 HgOg, és 30 mg/ 1 HRP Color Development reagens, amely 4-klőr-l-naftolt (BioRad) tartalmaz, 10 ml metanolban oldva. Az inkubálások között a szűrőt
0,1 % Tween20-at tartalmazó PBS-sel mossuk.
Az immunfolt elemzés 4, az S-fehérjéhez hasonló je csíkot mutat mintegy 33 Kd, 30 Kd, 28 Kd és 25 Kd lekulatömeggel, amelyeket a monoklonális antitesttel (p23) fehérbecsült momutatunk ki. Az S-fehérjével rokon anyag többségét a 33K fehérje csíkban
424 találjuk, és erről úgy találjuk, hogy valamivel gyorsabban mozog, mint a Stibbe és Gerlich által leírt gp33 fehérje Tvirology, 123,
W
436-442 (1982)]. A legkisebb kimutatott fehérje csík lassabban mozog, mint az élesztőben szintetizált S fehérje (p23).
21. példa A négy, S-fehérjéhez hasonló fehérje-fajta (33 Kd, 30
Kd, 28 Kd és 25 Kd) részecskékben áll össze:
A pRIT12660—at (16. példa) tartalmazó élesztősejtek nyers sejtkivonatait úgy állítjuk elő, amint ez a 19. példában leírtuk, vagy az élesztősejtek őrlésével Dynomillben, azonos tömegű extrakciós puffer jelenlétében {^200 mmól/1 trisz, 3 mól/1 NaCl, 10 mmól/1 EDTA, 10 mmól/1 etilén-glikol-bisz(béta-aminoetil-éter)-N,Ν,Ν’,N' tetraecetsav (EGTA), 4 mmól/1 PMSF, 10 zopr s az ezt követő, 45 perces, 30000 g-vel végzett centrifugálással állítjuk
A pRIT12660—nal irányított részecskéket részlegesen tisztítjuk a nyers sejtkivonatból ultraszűréssel, CsCl egyensúlyi centrif ugálással és hidroxi-apatit kromatográfiával, ezek a módszerek a szakterületen jól ismertek. A Western folt elemzéssel kimutatott S. fehérje-rokon anyag négy fehérje csíkja együtt tisztul ezeknek a tisztítási lépéseknek a során. Az egyensúlyi centrifugálás utáni AUSRIA pozitív CsCl frakciók immunfoltelemzése (amint ezt a 20. példában leírtuk) azt mutatja, hogy a négy S-fehérje rokon csík az egyes frakcióknak ugyanabban a viszonylagos részében van jelen.
Az anyag így homogén módon oszlik el a gradiens csúcs-frakcióin keresztül.
22. példa A 33 Kd és 30 Kd fehérjék polimerizált humán szérum albuminhoz alkalmas receptort hordoznak.
- 125 -
Humán szérum albumint (Sigma, A 8763) polimerizálunk glutáraldehid kezeléssel (Merek, A-12179) és tisztítjuk Pontisso és munkatársai szerint £j. Virol. Methods, 6, 151-159 (1973)J. A négy S-rokon fehérje reaktivitását vizsgáljuk pHSA irányában Western folt eljárással. pRIT12660-nal irányított részecskék (21. példa) részben tisztított készítményeit különítjük el SDS poliakrilamid gél elektroforézissel és átvisszük nitrocellulőz membránra, amint ezt a 20. példában leírtuk. A nitrocellulőz szűrőt egymás után inkubáljuk pHSA-val (15jutg/ml 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben), emberi albumin elleni nyúl-antiszérummal (Behringwerke, ORCB 04/05, 1/125 higitás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben), majd biotinilezett szamár anti-nyúl Ig-vel (Amersham RPN 1004, 1/250 higitás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben), majd streptavidin-biotinilezett torma peroxidázzal (Amersham RPN 1051, 1/400 higitás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben), végül Hg02-vel és 4-klór-1-naftollal, amint ezt a 20. példában leírtuk.
A két legnagyobb S-rokon fehérje csík (a 33 Kd-s és 30 Kd-s) reagál pHSA-val, a két legkisebb csík (a 28 Kd-s és 25 Kd-s) nem ad reakciót.
23. példa A 33 Kd és 30 Kd fehérjék olyan szekvenciát tartalmaznak, amely fajlagos a Pre S2-S fehérje Pre S2 területére.
A Pre S2-S fehérje 26 N-terminális aminosavának megfelelő peptidet, amely a 26 helyből 23-at tartalmaz, szintetizáljuk (NHg-Met-Glu-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-AspPro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Ala-Gly-Cys-COOH) és összekapcsoljuk a C-terminálison keresztül kulcslyuk-kagyló hemocianinnal (Keyhole Limpet Hemocyanin, Peninsula Laboratories). Nyulakat immunizálunk szubkután 100 Mg konjugátummal (amely megfelel ··*· ·· »9 »»99 * · 9 · 999 • 9 999» 9 ·· ·····« * « *·
- 126 20 pepiidnek) komplett Freund adjuvánsban, a 8. és 15. napon további 100y4g konjugátumot adunk be komplett Freund adjuvánsban, a 28., 69. és 149· napon 100 Ml konjugátumot PBS-ben, emléV keztető oltásként. Az antitest titer kifejlődését vérminták vételével követjük szabályos időközönként, és szérum hígítások vizsgálatával szilárd fázison rögzített szintetikus peptiden végzett inkubálással. A kötött antitesteket jődozott ”A fehérjével (New England Nuclear) mutatjuk ki. Az immun foltban való alkalmazáshoz 1/5120-nál nagyobb vagy azzal egyenlő anti-peptid titerű szérumokat választunk. A szérumot 100-szoros hígítás után vagy az IgG részleges tisztítása után alkalmazzuk. Az IgG részleges tisztítását úgy végezzük, hogy kicsapást hajtunk végre NagSO^-gyel (100 mg/ml szérum), újra szuszpendáljuk PBS-ben és újból kicsapjuk 14 % NagSO^-gyel. Az újra szuszpendált IgG oldatot sómentesítjük PD10 oszlopon való átengedéssel (Pharmacia).
Ezen antitestek reaktivitásának kimutatását az S-rokon fe“ hérjék irányában immunfolt-vizsgálatokban biotinilezett szamárnyúl Ig-vel, streptavidin-biotinilezett tormaperoxidázzal, valamint HgOg-vel és 4-klór-1-naftollal hajtjuk végre, amint ezt a 22. példában leírtuk.
A pRIT12660-nal irányított részecskék részben tisztított készítményeiből (21. példa) fehérjéket különítünk el SDS poliakrilamid gél elektroforézissel, és átvisszük nitrocellulózra, amint ezt a 20. példában leírtuk. A gélen futtatunk S fehérjét is (p23), pRIT12363-at magában foglaló élesztőkből tisztított részecskékből előállítva. Az immunfolt-vizsgálat azt mutatja, hogy a két legnagyobb S-rokon fehérje csík (a 33 Kd-s és 30 Kd-s) reagál az anti-peptid antitestekkel, míg a két legkisebb csík (a 28 Kd-s és f*··
- ,127 25 Kd-s) nem ad reakciót. Az S-fehérje (p23) nem ad reakciót az anti-peptid antitestekkel.
24. példa A humán anti-hepatitisz B antitestek, amelyeket természetesen fertőződött személyektől kaptunk, felismerik a 33 Kd-s és 30 Kd-s Pre S2-S fehérjében levő epitópo(ka)t, amelyek az S fehérjén nincsenek jelen.
Az anti-hepatitisz B pozitív emberi paciensekből gyűjtött gamma globulin (Belga Vöröskereszt, 100-150 nemzetközi egység/ml, Lót 85108) reaktivitását vizsgáljuk a négy S-rokon fehérje irányában, a 20. példában leírt immunfolt eljárással. A pRIT12660nal irányított részecskék részben tisztított készítményét (21. példa) disszociáljuk SDS-sel és a fehérjéket SDS poliakrilamid gélelektroforézissel elkülönítjük. A fehérjék átvitele után nitrocellulózra a membránt anti-hepatitisz B gamma globulin tízszeres hígításával inkubáljuk, a hígítást 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben végezve. Az antitest kötést úgy mutatjuk ki, hogy egymás után inkubálunk biotinilezett birka anti-humán Ig-vel (Amersham RPN1003,1/250 hígítás 1 % zselatint tartalmazó PBS-ben), majd streptavidin-biotinilezett torma peroxidázzal és végül HgOg-vel és
4-klór-1-naftollal, amint ezt a 20. példában leírtuk.
A két legnagyobb S-rokon fehérje csík (a 33 Kd-s és a 30 Kd-s csíkok) reagál a humán antitestekkel, a két legkisebb csík (a 28 Kd-s és a 25 Kd-s csík) nem ad reakciót. A pRIT12363-at tartalmazó élesztősejtekből származó részecskékből eredő S fehérje (p23) nem reagál ezekkel a humán antitestekkel. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fertőzött személyektől kapott gamma-globulin fajlagosan felismeri a denaturált és redukált Pre S2-S fehérjéken jelen levő epitópokat, amelyek nincsenek jelen a denaturált és .128 redukált S fehérjéken. Ismeretes, hogy az emberi szérumból és az élesztőből származó S-fehérjéken jelen levő epitópok zömmel azonos felépítésűek.
10.A. példa A 33 Kd fehérje fajták mannozil-tartalmú oligoszacharid·szerkezetet hordoznak.
A pRIT12660-at tartalmazó 10S44C cir° sejtekből eredő részecskék részlegesen tisztított készítményeiből származó Pre S2-S fehérjét elektroforetikus úton elkülönítjük és átvisszük nitrocellulózra, amint ezt a 20. példában leírtuk. A gélen a pRIT12363~at tartalmazó élesztőből tisztított részecskékből és fertőzött humán szérumból származó részecskékből (amelyeket Dr.Gerlich W.H.-tól kaptunk, Department of Medical Microbiology, Göttingeni Egyetem, Német Szövetségi Köztársaság) nyert S fehérjét is futtatunk.
A nitrocellulóz szűrő egyik felét SO^g/ml konkavalin A-val (Calbiochem A minőség) inkubáljuk, ahol az anyag 10 mmól/1 triszt (pH 7,5), 150 mmól/1 NaCl-t, 1 mmól/1 CaClg-t, 1 mmól/1 MnClg-t és 0,05 % Tween20-at tartalmazó oldatban van oldva, majd 30(/fg/ml torma-peroxidázzal inkubáljuk (Sigma VIP 8375 típus), ahol az anyag 10 mmól/liter triszt (pH 7,5), 150 mmól/1 NaCl-t és 0,05 % Tween20-at tartalmazó oldatban van oldva , végül HgOg-vel és 4klór-1-naftollal inkubáljuk, amint ezt a 20. példában leírtuk.
Az inkubálások között a szűrőt 10 mmól/1 triszt (pH 7,5), 150 mmól/1 NaCl-t, és 0,05 % Tween20-at tartalmazó oldattal mossuk [_Hawkes: Anal. Biochem. 127, 389-394 (1984)]. A nitrocellulóz szűrő másik felét 6. monoklonális antitesttel inkubáljuk, amint ezt a 20. példában leírtuk.
A 33K fehérje esik reagál a konkanavalin A-peroxidáz reagenssel, míg a 30 Kd-s, 28 Kd-s, 25 Kd-s fehérje csíkok vagy a /
• · ·
- -129 pRIT12363-at tartalmazó sejtekből származó S fehérje egyike sem reagál. 0,1 mól/1 metil-alfa-D-mannopiranozid jelenlétében a konkanavalin A kötődése a 33K fehérjéhez megszűnik.
Az>
26. példa,Pligoszacharid szerkezet N-glikozilezve kötődik az aszparaginhoz.
pRIT12660-at és pRIT12377-et (17. példa) tartalmazó törzseket növesztünk szelektív tápközegen ΓυΝΒ + 80 g/ml hisztidin (DC5 cir°) vagy YNB (10S44C οΐτθ^Οϋ^θ nm= 0,2 értékig. Tunikanamicint (Calbiochem) adunk 10 ng/ml végső koncentrációig és a tenyészeteket 30 percig inkubáljuk 30°C hőmérsékleten. Ezután 20
Ci J>S-metionint (1000 Ci/mmól; New England Nuclear) adunk hozzá milliliterenként és a tenyészeteket további 15 percen át inkubáljuk. 2 ml jelzett sejttenyészetet, vagy kezelve tunikamicinnel, vagy sem, centrifugálunk mikrocentrifugában és az üledékbe vitt sejteket újra szuszpendáljuk 40^*41 1 % SDS-ben és szétzúzzuk Vortex keverővei végzett 2 perces keveréssel 0,3 g üveggyöngy (0,45-0,50 mm átmérő) jelenlétében.
Az immun-kicsapást lényegében Julius és munkatársai szerint végezzük pCell, 36, 309-318 (1984]. A lizátumot 3 percig melegítjük 100°C hőmérsékleten, majd 0,5 ml 1 % Tritonl00-at, 0,5 % nátrium-dezoxi-kolátot és 0,1 % SDS-t tartalmazó PBS-sel hígítjuk, majd újból melegítjük 1 percen át 100°C hőmérsékleten.
Előmosott Immunoprecipitin (formalinnal rögzített Staphylo— coccus A sejtek, Bethesda Research Laboratories) 10 %-os szuszpenziójának 25^1-ét adjuk a felfőzött kivonathoz és 0°C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A keveréket centrifugálással derítjük 5 percen át mikrocentrifugában. A felülúszó folyadékhoz 2,5
JAl 6. monoklonális antitestet adunk, amely S fehérjére fajlagos • · · · • · • ····· ·· ··· ··· · · ··
- -130 (lásd 20. példa)és a keveréket 1 órán át 0°C hőmérsékleten inkubáljuk. Az Immunoprecipitin másik részletét (25/41) adjuk ezután hozzá és 30 percig inkubálunk 0°C hőmérsékleten. Az immunkom— plexeket centrifugálással összegyűjtjük (5 perc mikrocentrifugában) és mossuk 2 mól/1 karbamidot tartalmazó PBS-sel, majd 1 % 2-merkapto-etanolt tartalmazó PBS-sel, végül PBS-sel. Az utoljára mosott üledéket újból szuszpendáljuk elektroforézishez szolgáló minta-puff erban , akárcsak a 20. példában.
cpm-et tartalmazó mintákat elektroforézisnek vetünk alá
12,5 %-os SDS poliakrilamid gélen (lásd 20. példa). Elektroforézis után a géleket 40 % metanol tartalmú 10 %-os ecetsavval rögzítjük, Amplify-jal (Amersham) kezeljük fluorográfiához, szűrőpapíron szárítjuk vákuum alatt és fluorográfiának vétjük alá Kodak X-Omat S filmet alkalmazva -70°C hőmérsékleten.
Ez azt mutatja, hogy a pRIT12660-at tartalmazó sejtek egy
Kd-s fehérjét szintetizálnak tunikamicin távollétében és egy
Kd-s fehérjét tunikamicin jelenlétében. Mindkét csík hiányzik a pRIT12377-hez tartozó sejtek megfelelő mintáiban.
Ezek az előzmények azt mutatják, hogy a DC5 cir° élesztő törzsekben kifejezett 33 Kd-s Pre S2-S fehérje olyan oligoszacharid részt hordoz, amely N-glikozid kötéssel kötődik aszparaginhoz. Itt legvalószínűbben csak egy oligoszacharid lánc van a Pre S2-S fehérje 33 Kd-s formájához rögzítve, amely nem sokkal nagyobb, mint a belső glikozilezés.
27. példa A sok mannóz típusú oligoszacharid szerkezet pRIT12660-at tartalmazó sejtekből nyert nyers sejtkivonatokat vagy ezekből a kivonatokból származó Pre S2-S tartalmú részecskéket tartalmazó részben tisztított készítményeket kezelünk Strep- ,1.31 • · · · · · · • ······ · · ··· «·· · · ·· tomyces plicatusb.ól származó Endo-N-acetilglükózaminidázzal (Endo H. ; EC.3·2.1.96), amelyet a New England Nuclear-tól szereztünk be.
Részben tisztított részecskéket (50 ml, 450^/Mg/ml fehérje) 3 percben át forralunk 100°C hőmérsékleten 0,1 % nátrium-dodecil szulfát jelenlétében, tízszeresére hígítjuk 100 mmól/1 nátriumcitráttal (pH 5), és ennek a keveréknek 240/Al-éhez 2,4/11 Endo H-t adunk. Hozzáadott Endo H-val rendelkező és nem rendelkező mintákat inkubálunk 4 órán át 37°C hőmérsékleten. Az Endo H-val kezelt és nem kezelt minták elemzése SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel és immunfolt-képzéssel az S-fehérje ellen irányuló 6. monoklonális antitesttel végzett kimutatást alkalmazva, amint ezt a 20. példában leírtuk, megmutatja a 33 Kd-s csík eltűnését és egy 31 Kd-s csík megjelenését az Endo H kezelés hatására. A 31 Kd-s csík még reagál a fentebb leírt konkanavalin A-peroxidáz reagensekkel. A további csíkok (30 Kd, 28 Kd és 25 Kd) nem mutatnak eltolódást az Endo H kezelés h atására. Hosszabb inkubálási idők és nagyobb Endo H koncentrációk azonos eredményeket adnak. Az eredmények azt mutatják, hogy a 33 Kd fehérjéhez kapcsolt oligoszacharid szerkezet sok mannóz típusú, és mintegy a belső glikozilezés mértékével bír.
28. példa Pre S2-S fehérjét tartalmazó részecskék tisztítása
Pre S2-S részecskéket tartalmazó nyers élesztőkivonatot készítünk olyan módon, hogy a mosott élesztősejteket Dynomill-ben megőröljük azonos tömegű extrakciós pufferral, ennek összetétele vagy 50 mmól/1 nátrium-foszfát (pH 9,0), 4 mmól/1 EDTA, 1,0 % Tween20, 4 mmól/1 PMSF és 10 % izopropanol, vagy 200 mmól/1 triszHC1 (pH 9,0), 3,0 mól/1 NaCl, 10 mmól/1 EDTA, 10 mmól/1 EGTA « ·
- -132 £etilénglikol-bis.z-(béta)amino-etil-éter-N ,Ν ,Ν' , Ν'-tetraecetsavj , 1 % Tween20, 4 mmól/1 PMSF és 10 % izopropanol.
A homogenizátumot pH 8,0-ra illetve 9,0-ra állítjuk be, majd 45 percen át centrifugáljuk 30000 g-nél.
500 ml, pH 7,2-re beállított nyers élesztőkivonathoz 10 g kolloid szilicium-dioxidot (Aerosil 380, Degussa) adunk. A kolloid szuszpenziót egy éjszakán át kevertetjük és ezt követően kis sebességgel centrifugáljuk. Az Aerosil üledéket ezután háromszor mossuk 150 ml 0,15 mól/1 NaCl-lel 114 órán át, majd adagonként eluáljuk 250 ml 10 mmól/l-es pirofoszfát pufferrel (pH 9,3), amely 2 % Tween20-at is tartalmaz, 37°C hőmérsékleten 3 órán át. A deszorpció termékét, egy sárgás, enyhén opaleszkáló oldatot, átengedjük egy 50 ml-es fenil -boronát agaróz oszlopon (Amicon), amely 10 mmól/1 pirofoszfát pufferral van kiegyensúlyozva (pH 9,0). Az átfolyási sebesség 15 ml/óra.Az oszlopot tovább mossuk 2 oszloptérfogatnyi kiegyensúlyozó pufferral, majd fordított irányban eluáljuk 100 mmól/1 szorbittal [^50 mmól/1 trisz-ben (pH 7,2)J 15 ml/óra átáramlási sebességgel.
Az eluált csúcsfrakciókat összegyűjtjük és pH 8,1-re beállítás után átengedjük ezeket 50 mmől/1 trisz-HCl-lel (pH 8,1) kiegyensúlyozott DEAE-Fractogel TSK oszlopon. A részecskéket azonos pufferral, amely 75 mmól NaCl-t is tartalmaz, eluáljuk. Ez után a lépés után a megmaradt nukleinsavakat eltávolítjuk ( ti 1/{g/20/tg fehérje). Az anyag-mérleget a VI. Táblázat mutatja be.
133 • · »
VI. TÁBLÁZAT A Pre S2-S tartalmú részecskék két lépéses tisztítása
mg S-rokon
fehérje mg mg mg poli-
Frakció ml (RIA) fehérje lipid szacharid
Nyers kivonat 500 11,3 14600 5286 7850
Aerosilről de-
szorbeálva 270 5,96 385 554 249
Átáramoltatva
PBA-oszlopon 315 2,83* 365 360 267
Eluálva a
PBA-oszlopról 70 2,8 2,9 5 2,5
* nem kielégítően glikozilezett, hogy visszamaradjon az‘oszlopon
A pRIT12660-at tartalmazó sejtek extraktumaiból tisztított anyagot állítunk elő, amint ezt a műveletet a 28. példában leírtuk, és ezt CsCl egyensúlyi centrifugálásnak vetjük alá, így elektronmikroszkópos vizsgálathoz alkalmas anyagot kapunk, a vizsgálat előtt a mintát uranil-acetáttal festve. A vizsgálat elkülönült részecske szerkezet jelenlétét mutatja, ahol az ilyen részecskék 19 mikron átmérőjűek, és az ilyen hibrid részecskék 5-20 Tween20-at tartalmaznak lOO^vtg fehérjére számolva.
29. példa Affinitás kromatográfia lencse Sepharose-on
Ebben a példában a fenil-boronát agaróz kromatográfiás lépést lencse Sepharose-on (Lentil Sepharose, Pharmacia) végzett affinitás kromatográfiával helyettesítjük.
A 28. példában leírt módon kapott Aerosil deszorpciós termék 50 ml-ét átengedjük 5 ml-es Lentil Agarose oszlopon, amely kiegyen súlyozó pufferral van kiegyensúlyozva, ilyen puffer pl. az alábbi: 10 mmól/1 trisz-puffer (pH 7,2), 0,14 mól/1 NaCl és 0,3 % Tween. Az oszlopot 2 oszloptérfogat kiegyensúlyozó pufferral, pl. 10 mmól/1 trisz-pufferral (pH 7,2) mossuk, majd a lencsére való fajlagossággal rendelkező cukoradalékkal mossuk, pl. kiegyensúlyozó pufferban oldott 0,5 mól/1 alfa-metil-mannopiranoziddal. Az anyagmérleget a VII. Táblázatban mutatjuk be.
VII. TÁBLÁZAT L encse Sepharose affinitás-kromatográfia alkalmazása a Pre S2-S-t tartalmazó részecskék tisztítására
Térfogat ^íg S-rokon Teljes
Frakció (ml) f ehér je(RXA) fehérje
Nyers 100 2170 3 g
Aerosilről
deszorpcióval 50 1700 1 38 mg
Átáramoltatva lencse-
Sepharose-on 50 428 —
Eluálva lencse-
Sepharose- ról 12,5 925 1,26 mg
A vizsgálat feltárja, hogy a fentebb leírt módon tisztított hibrid részecskék 5-50 jAg Tween20-at tartalmaz/100 ^g fehérjére számítva.
30. példa A Pre S2-S részecske immunogenicitása
A pRIT12660-at tartalmazó sejtek (16. példa) kivonatából készített részecskék immunogenicitását tanulmányozzuk 2 egértörzsben: Balb/c (H2~d)-ben és NMRI(H2~Q)-ban. A részecskéket AIÍOH)^on abszorbeáljuk injekció előtt és az egereket (5 egér csoporton• · · ·
- -135 - ként) intraperitoneálisan (IP) injektáljuk 0,3 RIA reagáló anyaggal. Az immunizálás után egy hónappal az egereket elvéreztetjük és az azonos csoportba tartozó egerekből a szérumokat egyesítjük. Az egyesített mintákban az anti-S-antitestek titerét megB/ határozzuk AUSA/ készletet (Abbott Laboratories) és a WHO standardokat alkalmazva. A titereket milli-egység/ml-re (mIU/ml) alakítjuk át, a Hollinger képletet alkalmazva THollinger és munkaL.
társai: A Viral Hepatitis c. szakkönyv 451-466- oldalán; szerkesztők: Szmuness és munkatársai; kiadó: Franklin Institute Press, Philadelphia (1982)^. Az anti-Pre S2 antitesteket szilárd fázisú vizsgálatot (RIA) alkalmazva határozzuk meg, amelyben a 23· példában megadott szintetikus Pre S2 peptidet abszorbeáljuk műanyagra és a kötött antitesteket I-vel jelzett kecske-anti-egér IgG— vei mutatjuk ki. A VIII. Táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy a pRIT12660-at tartalmazó sejtekből nyert részecskék indukálnak mind anti-S, mind anti-Pre-S2 peptid antitesteket mindkét egértörzsben, de nagyobb anti-Pre-S2 peptid antitest titerek indukálódnak NMR1 egerekben, mint Balb/c egerekben. A Balb/c vagy NMR1 egerekben kapott anti-S titer 2-3-szor nagyobb, mint a pRIT12363-at tartalmazó sejtekből származó részecskék nagyobb dózisával kapott titer, ahol ezek a sejtek nem tartalmaznak Pre-S2 szekvenciát. A Pre S determinánsok növelik a választ az S-determinánsokra. Ez a növelő hatás nem mutatható ki, ha a szintetikus Pre S2 peptidet olyan részecskékkel együtt injektáljuk be, amelyekből a Pre S2 hiányzik. Ezen kívül a Pre S2 szintetikus peptid egyedül nem képes kiváltani anti-Pre S2 antitesteket.
Ez azt jelzi, hogy a Pre S2 determinánsok és S determinánsok együttese azonos részecskén szükséges ahhoz, hogy anti-Pre S2 vá.136 • ♦ · · · · · ♦ · • ι · · · ·«· f · · · · · · • ·····♦ · · ··· ··» · · ·· laszt kapjunk. Ezen kívül ez az egyesülés javult anti-S választ eredményez.
A Pre S2-S részecskékre vonatkozó immunogenicitási tanulmányok eredményeit'* a VIII. Táblázatban foglaljuk össze.
VIII. TÁBLÁZAT A Pre S2-S részecske immunogenicitása
Az injektált Az S.rokon T i t e r e k
készítmény ‘ ant igén adag- Anti-S-antitestekre Anti Pre S2 anti
ja (jHg) (D (mIU/ml) (2) testekre (3)
Balb/c NMR1 Balb/c NMR1
pRIT12363 által
irányított, élesz-
tő eredetű S ré-
szecske 1 ,7 1404 719 0 2
pRIT12363 által
irányított, élesz-
tő eredetű S-ré-
szecske + szín-
tetikus Pre S2 pép-
tid: O.Oe^g. 1 ,55 748 1163 0 4
Szintetikus Pre S2 peptid: 0,08 . PRIT12660 által irányított, élesztő eredetű Pre S2-S - 2 1 0 4
részecske 0,3 3344 2418 8 120
(1) AUSRIA készletet (Abbott Laboratories) alkalmazva határozzuk /37 • · 4 ·*·· ff • · ··· ··· • · · · · * ·
444444 4 · ··· ·4 4 4 ·. ·· meg, standardként a javasolt nemzetközi referencia-készítményt (Proposed International Reference Preparation) alkalmazva, amely Dr. Schild-nél áll rendelkezésre (National Institute of Biological Standardization, London).
(2) AUSAB készletet (Abbott Laboratories) alkalmazva határozzuk meg, a WHO (World Health Organization) standardját használva.
(3) Szilárd fázisú radioimmunassay és műanyaghoz adszorbeált szintetikus Pre S2 peptid alkalmazásával határozzuk meg.
A titer az a higitás, amely az antitest szignifikáns kötését adja (2,5-szöröse a negatív kontroll szérummal kapott érték-·; nek) .
PÉLDÁK A TELJES PRE S1-PRE S2-S FEHÉRJE KÓDOLÓ SZEKVENCIA KIFEJEZŐDÉSÉRE ÉLESZTŐBEN
31. példa pRIT12845 plazmid megalkotása, amely a Pre S1-Pre S2-S fehérjét fejezi ki élesztőben.
Az első lépés a TDH3 promotor terület fúziója a HBV genomból származó Pre S1 N-terminális területtel. A kiindulási anyag a pRIT12792 plazmid, amely magában foglalja a Pre S1-Pre S2 kódoló szekvenciát az utolsó aszparagin kivételével tartalmazó 495 bp-s Ncol-Xbal fragmentumot. Az Ncol hely átfedi a HBV Pre S1 szekvencia -163 aminosavgyökének ATG kodonját. Az Ncol-Xbal fragmentum szekvenciáját a 4A. ábra mutatja be.
A pRIT12792-re lényegében hasonló plazmidot, amelyet pRIT 12793-nak nevezünk (5940 bp), letétbe helyeztük az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) a Budapesti Szerződés szabályai szerint ATCC 67193 letéti számon, 1986. szeptember 5-én. A pRIT12793 plazmidból egy 495 bp-s Ncol-Xbal fragmentumot nyerhetünk ki, amely tartalmaz • * · ···· ·· ♦ · ♦· · · · · « · · · · · · • ·····♦ · · • · Λ ··· · · ··
- -138 egy teljes Pre S1-Pre S2 kódoló szekvenciát. Ez a fragmentum egy nukleotiddal különbözik a 4A ábrában látható fragmentumtól, és a fragmentum 3' végénél ACGAACTAATAATCTAGA szekvenciával bír. A nukleotid különbség alá van húzva. A következő példákban a pRIT12792-t lehet helyettesíteni pRIT12793-mal. Mind a pRIT12792-n, mind a pRIT12793-on levő Ncol-Xbal fragmentum a pRIT10616 plazmidban klónozott hepatitisz B vírustörzs (adw szerotípus) DNS-e Pre S1-Pre S2 területéből származó DNS in vitro manipulációjából származik.
A pRIT106l6 plazmid rendelkezésre áll az Amerikai Típustörzs Gyűjteményben ATCC 39131 letéti számon.
pRIT12792-t emésztünk Ncol és Xbal restrikciós enzimekkel és kezelünk Mung bab nukleázzal abból a célból, hogy eltüntessük az 5' túlnyúló végeket. 600 ng (2 pikomól) kezelt és tisztított, 495 bp-s Ncol-Xbal fragmentumot ligálunk 170 ng (0,02 pikomól) pRIT12314 vektorhoz, amelyet előzőleg BamHI és Smal enzimekkel felnyitottunk és mung bab nukleázzal kezeltünk. A pRIT12314 tartalmazza a S. cerevisiae-ból származó teljes 2 mikronos fragmentumot, és egy olyan kifejező kazettát, amelyben a TDH3 promotor az ARG3 terminátortól egy alábbi BamHI-Smal-EcoRI kapcsolóval van elválasztva :
BamHI EcoRI
Smal
ATGGATCCCCGGGAATTC
A pRIT123l4 megalkotásának részletesebb leírása található meg a fenti 10(B) példában. A fentebb leírt ligálási keveréket alkalmazzuk E. coli MM294 transzformálására, ampicillin rezisztencia szelekciós lehetőséggel, Cohen és munkatársai fentebb • · · · · ·· • · ···· · · · *·· ··· · ♦ ··
- -139 idézett módszere szerint. Hat transzformánst őrzünk meg, amelyek olyan plazmidot tartalmaznak, amelyben a Pre S1-Pre S2 fragmentum korrekt orientációban van beiktatva. Ezek a pRIT1 2843(a....f) plazmidok (18. ábra).
A második lépés az S kódoló terület beiktatása a fentebb leírt pRIT12843(a....f) plazmidokba, hogy helyreállítsuk a teljes Pre S1-S2-S gént.
Ezt a következőképpen végezzük el. pRIT12843(a....f) plazmidokat egyenként emésztjük BamHI és Sáli enzimekkel. A BamHI hely a Pre S2 terület kezdeténél helyezkedik el, a Sáli hely a pBR327-ben levő ARG3 terminátor mögött helyezkedik el. 80 ng (0,012 mól) legnagyobb BamHI-Sall fragmentumot (10400 bp) , amelyet a pRIT12843(a....f) egyes plazmidjaiból tisztítottunk, ligáljuk a pRIT12660-ból (16. példa) származó kis BamHI-Sall fragmentum 30 ng-jával (0,11 pmól). A pRIT12660 kis (4800 bp-s) BamHI-Sall fragmentuma tartalmazza a Pre S2-S kódoló szekvencia egy részét, amelyet az ARG terminátor szekvenciák és a LEU2 élesztő szekvencia követ. A ligálás és az egyes pRIT12843(a....f) plazmidok transzformálása után E. coli MM294-be Cohen és munkatársai fentebb idézett mód32 ere szerint a pRIT12845(a....f) nevű plazmidokat tartalmazó ampicillin rezisztens kiónok sorozatát kapjuk. A 18. ábra a pRIT12845(a....f) előállítását bemutató folyamatábra. Ezeket a pRIT12845(a....f) plazmidokat alkalmazzuk egyenként S. cerevisiae 10S44C cir° transzformálására Ito és munkatársai fentebb idézett módszere szerint. Az élesztő transzformációkból származó egyes kiónokból növesztett tenyészetek átvizsgálását a nyers.sejtkivonatok vizsgálatával végezzük a kereskedelemben beszerezhető AUSRIA vizsgáló készlet (Abbott) segítségével. A nyers sejtkivona···· ··
-140 ·· · • · · • ···· ··· · tót úgy készítjük, hogy a 0,5 % Tween20-at, 2 mmól/1 PMSF-et és % izopropanolt tartalmazó PBS-ben újra szuszpendált élesztősejteket összezúzzuk. A hat különböző transzformáció £pRIT12845 (a. . . . f )-fel] mindegyikéből egy transzformánst vizsgálunk. A hat vizsgált transzformánsból öt ad pozitív eredményt AUSRIA vizsgálattal .
Hogy megvizsgáljuk, vájjon egy korrekt méretű fehérje adja-e az AUSRIA-val kimutatható antigenicitást, a fentebb leírt nyers extraktumok mintáit a 20. példában leírt immunfolt eljárásnak vetjük alá- Az öt AUSRJA pozitív transzformáns közzül négy mutat mintegy
K-s S-rokon feherjet. Az egyik transz formans /a kivonat/
K-s S-rokon fehérjét mutat. pRIT12845-ként tartjuk meg azt az élesztő transzf ormánst, amely az e_ kivonatban jelen levő 39K fehérjét fejezi ki.
32. példa A Pre S1-Pre S2-S fehérje olyan részecskékbe áll össze, * amelyek polimerizált humán szérum receptort és Pre S1 epitópot hordoznak a felületükön.
pRlT12845, pRIT12660 vagy pRIT12377 plazmidokat magában foglaló 10S44 cir° élesztőtörzsből és pRIT12363-at magában foglaló DC5 cir° élesztőtörzsből nyers sejtkivonatokat készítünk, amint ezt a 19. példában leírtuk. A teljes fehérje koncentrác
HBsAg-rokon antigenicitás vizsgálatát és polimerizált humán szérum albuminhoz tartozó receptor kimutatását végezzük el. Az eredmény erős kötő aktivitást' mutat polimerizált humán szérum albuminhoz a pRIT12843-at és pRIT12660-at tartalmazó (lásd a 10. példát is) 10S44C cir°-ból készült kivonatokban, de ez az aktivitás nincs jelen a pRIT12377-et magában foglaló 10S44 cir° vagy a pRÍT12363~at magában foglaló törzsekből származó kivonatokban.
A pRIT12845-öt (amelyet a 12. példában írtunk le) tartalmazó
.141
10S44C cir° sejtekből származó nyers sejtkivonatok CsCl egyensúlyi centrifugálása és a HBsAg-rokon antigenicitás mérése AUSRIA vizsgálattal a CsCl frakciókban azt mutatja, hogy az antigén a ζ = 1 ,2 g/cnr körül kapcsol. Ezt a CsCl frakciók immunfolt-elemzése erő síti meg. A Pre S1 antitest kötő aktivitást a CsCl frakciókban a 12. példában leírt ELISA méréssel vizsgáljuk. Miután az antigént kötődni hagytuk a szilárd fázisú anti-HBsAg-hez, a kötött antigént MA18/7 monoklonális antitesttel (31· példa) inkubáljuk, amelyet azután biotinilezett anti-egér Ig-vel, streptavidin-biotinilezett torma peroxidáz komplexszel és kromogénnel mutatunk ki, amint ezt a 12. példában leírtuk.
A Pre Sí-fajlagos antitest kötő aktivitásról úgy találjuk, hogy együtt egyensúlyozódik ki a HBsAg-rokon antigenicitással a CsCl gradienssel. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a pRIT 12845-öt magában foglaló 10S44C cir° sejtekben termelt Pre S1Pre S2-S fehérje részecskékben áll össze, a szérumból eredő 22 nm-es HBsAg részecskékhez hasonlóan. A részecskék Pre S1 fajlagos szekvenciákat, valamint polimerizált humán szérum albuminhoz szolgáló receptort mutatnak felületükön. Ezeknek a részecskéknek az aktivitási szintjéből AUSRIA vizsgálattal, és a Pre S1-Pre S2-S fehérje reakciójának intenzitásából immunfolt-elemzésben arra a következtetésre lehet jutni, hogy a részecske S-determinánsait a részecskében levő Pre S szekvenciák jelenléte részben gátolja vagy deformálja.
33. példa Két fehérje mintegy 38 és 45 Kd mérettel, amelyek mindegyike hordoz Pre S1, Pre S2 és S epitópokat, fejeződik ki a pRIT12845-tel transzformált élesztőben.
A celluláris fehérje vándorlását és immunreaktivitását ősz···· • ·· • · · ··· ··* · · ··
- 142 szehasonlítjuk a humán szérumból tisztított HBsAg részecskékből (ad szerotípus) származó fehérjékkel (ahol a szérumot Dr. Gerlich W.H.-tól kaptuk, Department os Medical Microbiology, Göttingeni Egyetem, Német Szövetségi Köztársaság).
Három immun-reagenst alkalmazunk a fehérjék elemzéséhez:
- S epitópot felismerő monoklonális antitest (amelyet Thomas H.-tól kaptunk - 20. példa);
- szintetikus Pre S2 peptid (amelyet a 23· példában írtunk le) ellen kiváltott polivalens nyúl antiszérum;
- Pre S1 epitópra fajlagos MA18/7 monoklonális antitest, amelyet Heermann és munkatársai írtak le £j. Virol. 52, 396-402 (1984)].
Az immunfolt elemzés megmutatja, hogy a pRIT12845-öt tartalmazó 10S44C sejtekből származó celluláris fehérjék között két olyan fehérje van jelen, amely fajlagosan reagál mind a három fentebb leírt immunreagenssel. Ennek a két fehérjének a molekulatömegét mintegy 38000 illetve 45000 daltonra becsüljük. A molekulatömeg becslés a fehérjék vándorlásán alapul a HBsAg-ból származó szérumtól, amint ezt Heerman és munkatársai meghatározták Γ J., Virol. 52, 396-402 (1984)]. A pRIT12845-tel irányított,
38000 daltonos Pre S1-Pre S2-S fehérje valamivel gyorsabban vándorol, mint a HBsAg részecskékből származó p39 Pre S1-Pre S2-S fehérje. Az ad szerotípusú humán szérum részecskékből származó p39 fehérje valószínűleg 119 aminosavból álló Pre S1 területtel bír ^Heermann és munkatársai: J. Virol. 52, 396-402 (19Q4)J.
A pRIT12845 egy 108 aminosavas Pre S1 területet kódol.
34. példa A 45 Kd-s Pre S1-Pre S2-S fehérje fajta N-glikozid kötésen át kötött sok-mannóz típusú oligoszacharid láncot hordoz.
*>»·· «· • ·
- -143 pRIT12845-et magában foglaló sejteket azonos tömegű üveggyöngygyei (0,45-0,50 mm átmérőjű) szétzúzunk azonos tömegű 10 mmól/l-es nátrium-foszfát pufferban (pH 7,4), amely puffer 2 % SDS-t és mmól/1 EDTA-t tartalmaz, a szétzúzást Vortex keverővei végzett kevertetéssel hajtva végre.
Centrifugálás után a felülúszót 4 percen át 100°C hőmérsékleten melegítjük.
A melegített felülúszó folyadék 10^v(l-ét 40^1 25 mmól/l-es nátrium-citrát pufferral (pH 5,0) hígítjuk, és 2 ^H.1 Endo H-t (74 ^Wg/ml) adunk hozzá (lásd 27. példa). A mintákat hozzáadott Endo H-val, illetve Endo H nélkül 2,5 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten .
Az Endo H-val kezelt, illetve nem kezelt mintákat SDS poliakrilamid gél elektroforézissel elemezzük és immunfolt elemzésnek vetjük alá, amint ezt a 20. példában leírtuk.
A foltot 6. monoklonális antitesttel (S-fajlagos) és MA18/7 antitesttel (Pre Sí-fajlagos, lásd 33. példa) elemezzük.
Az immun folt elemzés mind 6. monoklonális antitesttel, mind
MA18/7 monoklonális antitesttel megmutatja a 45 Kd-s csík eltűné sét és egy 41 Kd-s csík megjelenését Endo H kezelés hatására. A
Kd-s csík vándorlására az Endo H kezelés nincsen hatással.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 45 kD-s Pre S1-Pre
S2-S fehérje N-glikozid kötésű, sok mannóz típusú oligoszacharid láncot hordoz.
35. példa A 38 Kd-s Pre S1-Pre S2-S fehérje kovalensen kötött mirisztinsavat tartalmaz, amely egy amid-kötésben van jelen.
pRIT12845-öt, pRIT12660-at vagy pRIT12377-et magában foglaló 10S44C cir° élesztőtörzs sejtjeit növesztjük YNB tápközegΊ44 • · · ♦ · ·· « · ···· · · · «·· ··· · · ·· ben 0,4 0D520 nm értékig.
ml tenyészet sejtjeit jelöljük 60 percen át 1 mCi H-jelzett mirisztinsavval (New England Nuclear), majd centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket hideg HgO-val mossuk, újra szuszpendáljuk 100 Ml 5 mmól/1 trisz-HCl-ben (pH 7,4), amely 3 mmól/1 DTT-t, 1 % SDS-t és 1 mmól/1 PMSF-et is tartalmaz, és 100 mg üveggyöngyöt alkalmazva összezúzzuk Vortex keverőben olyan módon, hogy hatszor 30 másodperces élénk kevertetést végzünk, az egyes keverések közt a keveréket jégen hűtve. Az üledéket 1 perces, Eppendorf 5414 centrif ugában £ Towler és Glaser: Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 2812-2816 (1986) J végzett centrifugálással távolitjuk el. A kivonat 20^1-ét
3,5 órán át, szobahőmérsékleten kezeljük 7^1 frissen készített oldattal, amely 4 mól/1 hidroxil-amint és 20 mmól/1 glicint tartalmaz (pH 10) .
A hidroxil-aminnal kezelt illetve nem kezelt mintákat SDS poliakrilamid gélelektroforézisnek és fluorográfiának vetjük alá, amint ezt a 26. példában leírtuk. A hidroxil-aminnal nem kezelt mintákat immunfolt elemzésnek is alávetjük olyan monoklonális antitesttel, amely S-epitópot ismer fel, amint ezt a 20. példában leírtuk.
Az immunfolt elemzés azonos eredményeket mutat, mint amelyeket a 20. és 33. példákban leírtunk.
A fluorográfia egy 38 Kd-s jelzett csíkot mutat, amely csak a pRIT12845-öt magában foglaló sejtekből származó sjetkivonatokban van jelen, amely hidroxil-amin-stabil, jelezve, hogy a 3Hmirisztát jelzés jelen van, amid-kötésben. pRIT12660-at magában foglaló sejtkivonatokra fajlagos jelzett csík nem mutatható ki.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 38 kD-s Pre S1-S2-S
-145 • t · ······ ·· ·· · » · · * · · » · ·· • · ···· 9 99 ··* ·«· · *99 fehérje kovalensen kötött mirisztinsavat tartalmaz, amid-kötéssel kötve. Általában a mirisztátok kovalensen, amid csoporton át kötve amino-terminális glicinhez kötődnek. Ez azt sugallja, hogy az indító Met a Pre S1-Pre S2-S fehérjéről eltávolítódott, és hogy a 2. helyzetben levő Gly gyök hozzáférhetővé vált mirisztinsavval való acilezéshez.
36. példa Pre S1 vektorok alkalmazása funkcionális DNS kódoló szekvenciák beiktatásához.
A kiindulási anyag a fenti 31. példában leírt pRIT12793 plazmid DNS-e. A pRIT12793 tartalmazza a Pre S1-Pre S2-kódoló szekvenciát egy 495 bp-s Ncol-Xbal fragmentumon. A pRIT12793 plazmid DNS-ét Ncol restrikciós endonukleázzal emésztjük T4 DNS polimerázzal kezeljük, hogy a tapadós végeket betöltsük, és Xbal endonukleázzal kezeljük. Az Ncol/T4 DNS polimeráz/Xbal fragmentumot poliakrilamid gélelektroforézissel és elektroelucióval tisztítjuk, és beiktatjuk előzőleg Smal és Xbal endonukleázokkal emésztett pUC12 vektorba. A pUC12 klónozó vektor kereskedelmi forgalomban van, az Amersham-nál (Little Chalfont, Bucks, Egyesült Királyság) és a Pharmaciánál (Piscawatay, New Jersey) kapható. A pRITX plazmidot úgy kapjuk meg, ahogyan ezt az 5B. ábrában ábrázoljuk. A pRITX plazmid Pre S1-Pre S2 területében egy egyedi Ncol hely átfedi a Pre S1 terület ATG start kodonját, és egy Xbal hely van jelen a Pre S2 kódoló szekvenciák C-terminálisánál levő TAA stop kodon közelében, attól lefelé. Egy egyedi BstX restrikciós hely van jelen a plazmidon, a Pre S1 kódoló terület N-terminális végéhez közel.
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a pRITX vektort vagy a Pre S1-S2 szekvenciákat tartalmazó hasonló vektorszármazékokat lehet alkalmazni adott peptidet kódoló további fűnk-146 cionális DNS kódoló szekvenciák bevezetésére olyan módon, hogy fázisban levő fúziókat hozunk létre a Pre S1 területen belül, a BstX helynél végezve a beiktatást.
Ezen kívül funkcionális DNS kódoló szekvenciákat lehet beiktatni olyan módon is, hogy pRITX-et és származékait BstX és BamHI, vagy EcoRI, vagy PstI endonukleázok kombinációival emésztjük és a funkcionális DNS kódoló szekvenciákat ezek közé a helyek közé iktatjuk be, így eltávolítjuk a Pre S1 kódoló terület nagyobb részét és a Pre S2 szekvencia N-terminális részét. Az ilyen fúziós termékek Pre S1-bevezetett funkcionális DNS kódoló szekvencia-Pre S2 típusúak. Ha ilyen fúziókat végzünk, ezeket lehet rekombinálni olyan más plazmidokkal, amelyek a Pre S1-Pre S2 szekvenciák maradékait tartalmazzák, valamint az E. coli-ban és S , cerevisiae-ban való fenntartáshoz és replikációhoz szükséges szekvenciákat tartalmazzák, amelyre a 16A. példában adtunk példát.
37- példa HTLV-III vírus fehérjéiből származó peptid fúziója a Pre S2-S szekvenciák Pre S2 területéhez, hogy új hibrid részecskéket alkossunk meg.
A HBV Pre S2-S kódoló szekvencia Pre S2 területét alkalmazhatjuk más vírus-antigének peptid-szekvenciáinak beiktatásához vagy fúziójához is, ilyen vírus-antigének pl. a humán AIDS tüneteket okozó vírus-antigének, így a HIV-ként, HTLV-III-ként vagy LAV-ként ismert retrovírusok antigénjei.
Egy HÍV vírus klónozott genomját írják le Ratner L. és munkatársai [^Natúré, 313, 277-284 (1985)7, valamint Shaw G. és munkatársai j^Science, 226, 1165-1171 (1984)] . Ezekből a genom klónokból különböző szub-fragmentumokat lehet kinyerni funkcionális DNS kódoló szekvenciákként, amelyek megfelelnek egyes adott peptid-
'147 területeknek, ezéket lehet fuzionálni a Pre S2-S szekvenciához, hogy olyan új hibrid részecskéket képezzünk, amelyek tartalmazzák a HÍV vírusfehérjék epitópjait. Az ilyen hibrid részecskék szolgálhatnak humán vakcina alapanyagaként a HÍV fertőző anyaga elleni védelemhez.
A szóban forgó peptid területek közt lehetnek az alábbiak:
a. ) 07 peptid. Ez a terület megfelel egy 45 aminosavgyökből álló távtartó szakasznak, amely közvetlenül szomszédos a burkolat prekurzor működési helyével, ezt Starcich B.R. és munkatársai határozták meg^Cell. 45, 637-648 (1986) J.
b. ) 121 . peptid Ez a terület egy viszonylag megőrzött aminosavszekvenciának felel meg, amely számos retrovírus transzmembrán burkolati fehérjében jelen van [lásd Cionciolo G.J. és munkatársai: Science, 230, 453-455 (1985)J. Erről a szekvenciáról úgy vélik, hogy részt vesz a retrovírusok által indukált immun-szup presszió patogenezisében rman R. és Cionciolo G.J.: Immunol. Today, 5, 240 (1984)J.
c.3 Dreesman peptid. Egy szintetikus peptidet, amely a
HÍV prekurzor burkolati glikoproteinje 735-752 közti aminosavszekvenciá jának felel meg, alkalmaztak Kennedy R.C. és munkatársai [Science, 231 , 1556-1559 (1986)^], hogy nyulakat immunizáljanak, és nyúl antiszérumot alkalmaztak, hogy megvizsgálják a HÍV burkolati fehérjék felismerését indukált antitestek révén.
Az eredmények azt sugallják, hogy ez a terület indukálhatja a natív glikoprotein ellen irányuló immunválaszt.
A. A HTLV-III izolátumból származó C7 pepiidnek megfelelő DNS szekvencia fúziója a pRIT10911-en levő Pre S2-S területhez.
A kiindulási anyag a BH10 HIV-izolátum klónozott genomját • · • · · · · · · • ····· · · · ··· ··· · · ··
- 148 tartalmazó pBH10-R2 plazmid. Ezt a plazmidot Gallo R.C.-től kaptuk (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). A vírus eredetű DNS 3108 bp-s Sall-Xhol fragmentumát, amelyet pBH10R2-ből metszettünk ki, pUCl8 Sáli és Xhol helyei közé k.lónozzuk, hogy megalkossuk a pRIT12901 plazmidot. Ennek a Sall-Xhol fragmentumnak a restrikciós térképét az 1B ábrában mutatjuk be. A pUCl8 plazmidot Norrander J. és munkatársai írják le |*Gene, 26, 101-106 (1983)J, ez kereskedelmi forgalomban kapható, mint a Pharmacia Inc. (Piscataway, New Jersey) terméke.
Hogy a fúziós terméket létrehozzuk, a pRIT12901 DNS-t emésztjük BglII és MboHendonukleázokkal, és a 117 bp-s fragmentumot izoláljuk akrilamid gélelektroforézissel és elektroelucióval (lásd az I.B. ábrát). Ennek a fragmentumnak a DNS-ét >Uung bab nukleázzal kezeljük, hogy eltávolítsuk az egyszálú végződéseket, és ligáljuk pRIT10911 DNS-sel (lásd a korábbi 5· példát), amelyet előzőleg BamHI endonukleázzal emésztettünk és mung bab nukleázzal kezeltünk. Ebből a ligálási keverékből a pRIT12893 plazmidot izoláljuk, amelybe/a pRIT12901-bői származó 118 bp-s BglII-MboII fragmentumot beiktattuk a pRIT10911-be. A TDH3 promoter és a 117 bp-s HTLV-III BglII-MboII közti fúziós találkozás mentén levő, pRIT12893-ban található, mung bab nukleázzal kezelt fragmentum beiktatás nukleotid szekvenciáját meghatározzuk; ez azt mutatja, hogy 10 fölöslegben levő nukleotidot eltávolítottunk a fragmentum BglII végéről.
A talált szekvencia az alábbi:
5' ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA 3' , ahol az első aláhúzott ATG kodon a pRIT10911-bői származó TDH3 promotor terület ATG kodonja, míg a második aláhúzott ATG kodon • · · ·
--149 a C7 peptid fragmentum belsejében van. A második ATG kodon átfed egy TGA terminációs kodont. Ez a terminációs kodon ugyanabban a leolvasó keretben van, mint az első ATG kodon. A pRIT12893-on levő fúziós terület 3' végének DNS szekvencia meghatározása a korrekt szekvenciát mutatja a HTLV-III fragmentum MboII-val és mung bab nukleázzal kezelt végének fázisban való fúziójához a pRIT10911-en levő Pre S2 szekvenciához, amint ezt a 2B ábrában bemutatjuk.
A pRIT12893 DNS-ét azután HindlII endonukleázzal emésztjük és a 3250 bp-s fragmentumot izoláljuk és agaróz gél elektroforézissel, valamint elektroelucióval tisztítjuk. A 3250 bp-s HindlII fragmentumot azután az YEp13 plazmid HindlII helyénél beiktatjuk, hogy létrehozzuk a pRIT12894-et. A plazmid DNS-ét alkalmazzuk azután DC5 és 10S44C élesztőtörzsek sejtjeinek transzformálására, leucin függetlenség szelekciós lehetőséggel, Ito és munkatársai módszerével, amelyet a korábbi 10. példában már idéztünk.
A pRIT12894-ben levő C7-Pre S2-S fúziós DNS átírása és transzlációja egy kis, 5 gyükből álló peptid szintézisét eredményezi, amely a TDH3 ATG kodonnál kezdődik és a fentebb aláhúzott TGA kodonnál végződik, és a C7-Pre S2-S fúziós peptid szintézisét eredményezi, amely a 07 szekvencián belül levő második ATG kodonnál kezdődik. Ez a fúziós termék a C7 peptidből 38 aminosav gyököt tartalmaz, a BglII-vel, MboII-vel és mung bab nukleázzal kezelt érintetlen C7 fragmentumból származó 45 gyök helyett. Világosan felismerhető, hogy más plazmidokat is lehet vizsgálni és szekvenciaelemzésnek alávetni ugyanabból a ligálási keverékből, amelyből a pRIT12893~at kapjuk, hogy meghatározzuk, vájjon hordoznak-e a teljes fragmentumnak megfelelő fúziós terméket.
• · · ···· ·· • · ··· ··· • ······ · · • · · ··· · · ··
-.150 -
B. A 121. pepiidnek megfelelő DNS szekvencia fúziója a pRIT 10911-en levő Pre S2-S területhez.
Hogy a fúziós terméket megalkossuk, a pRIT12901 (amelyet a fenti A. részben írtunk le) DNS-ét emésztjük Hhal és HindlII endonukleázokkal, hogy felszabadítsuk az 1B. ábrában bemutatott 230 bp-s fragmentumot. Ezt a fragmentumot akrilamid gél elektroforézissel és elektroelucióval tisztítjuk és T4 DNS polimerázzal kezeljük, hogy az egyszálú túlnyúló végeket betöltsük. Az így kezelt fragmentumot a pRIT10911 DNS-sel ligáijuk, amelyet előzőleg BamHI-gyel és mung bab nukleázzal kezeltünk. Ebből a ligálási keverékből a pRIT12897 plazmidot nyerjük ki és azonosítjuk, amelybe a HÍV DNS 230 bp-s fragmentuma a pRIT10911 Pre S2 szekvenciájához való fúzióhoz korrekt leolvasó keretben van beiktatva, amint ez a 3B. ábrában látható. A pRIT12897 plazmid DNS-ét azután HindlII endonukleázzal emésztjük, és a TDH3 promotort, HIV-Pre S2-S fúziós terméket és az ARG3 terminátort tartalmazó 3365 bp-s fragmentumot agaróz gél elektroforézissel és elektroelucióval tisztítjuk. Ezt a 3365 bp-s fragmentumot HindlII endonukleázzal emésztett'YEp13-ba ligáljuk, így képezzük a pRIT12898 plazmidot. Ennek a plazmdinak (pRIT12898) a DNS-ét alkalmazzuk azután DC5 és 10S44C élesztőtörzsek transzformálására leucin-függetlenség izolálási lehetőséggel Ito és munkatársai módszere szerint, amelyet más a korábbi 10. példában idéztünk.
C. A Dreesman peptid-nek megfelelő DNS szekvencia fúziója a pRIT10911-en levő Pre S2 területhez.
Egy 60 bp-s szintetikus DNS-t szintetizálunk hagyományos módon két egyedi szálként, amelyeket azután összeforrasztunk, ezek szekvenciája az alábbi:
• · • · • ··
5' GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA 3'
3’ AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT 5'
5' GACAGAGACAGATCCCCG 3'
3' CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC 5’
Ez a fragmentum 5' BglII és 3' BamHI egyedi szál túlnyúló végekkel rendelkezik. Mintegy 200 ng kettős szálú fragmentumot és
300 ng, BamHI-gyel emésztett pRIT10911 plazmid DNS-t összekeverünk és ligálunk. Ebből a ligálási keverékből egy plazmidot, a pRIT
12899-et azonosítunk és nyerünk ki, ezen a plazmidon a 60 bp-s fragmentum a pRIT10911 BamHI helyénél van beiktatva úgy, hogy egy kereten belüli fúzió jön létre, amint ezt a 4B. ábrán bemutatjuk. A pRIT12899 DNS-t HindlII endonukleázzal emésztjük, és a 3200 bp-s HindlII fragmentumot agarőz gél elektroforézissel és elektroelucióval tisztítjuk. Ezt a HindlII fragmentumot a YEp13 HindlII helyénél iktatjuk be, hogy a pRIT12900 plazmidot hozzuk létre. A pRIT12900 plazmid DNS-t alkalmazzuk azután a DC5 és 10S44C élesz tőtörzsek sejtjeinek transzformálására, leucin függetlenség szelekciós lehetőséggel, Ito és munkatársai módszere szerint, amelyet a fenti 10. példában már idéztünk.
38. példa pRIT12894 és pRIT12898-ból származó fúziós fehérjék kifejezése
YEp13-at, pRIT12363-at, pRIT10912-t, pRIT12894-et vagy pRIT
12898-at tartalmazó DC5 vagy 10S44C élesztőtörzseket külön-külön növesztünk leucint nélkülöző folyékony tápközegben (YNB + 80^/g/ml hisztidin, vagy YNB), és a celluláris fehérjéket immunfolt eljárással elemezzük, amint ezt a 11. példában leírtuk, első antitestként humán eredetű HBsAg denaturálásra és redukcióra rezisztens • · epitópja ellen irányuló monoklonális antitestet alkalmazva £6. monoklonális antitest , amelyet Thomas H.-tól (Royal Free Hospital, London, Anglia) kaptunk]. A pRIT12894-et és pRIT12898-at a fenti 37. példában írtuk le. A pRIT12363 hordozza a HBV S génjét a TDH3 promotorhoz fuzionálva, mint a pRIT12322-ből származó 2900 bp-s HindlII fragmentumot (8. példa), beiktatva egy pRIT12377tel azonos élesztő vektor plazmidba (10. példa, B rész), és a pRIT 12363 HBsAg-t termel a TDH3 promotor szabályozása alatt.
Az immunfolt elemzés mintegy 32 kD becsült molekula tömegű
S fehérje-rokon fehérje-csíkot mutat a pRIT12894-gyei transzformált DC5 vagy 10S44C élesztőtörzsből származó teljes celluláris fehér'jék között. Mintegy 45 kD becsült molekulatömegű S-fehérje-rokon fehérje csík van jelen a pRIT12898-at magában foglaló DC5 vagy 10S44C élesztőtörzsekből származó teljes celluláris fehérjék között, míg mintegy 29 kD becsült molekulatömegű S-fehérje-rokon fehérje csík van jelen a pRIT10912-t magában foglaló DC5 élesztőtörzsből kapott teljes celluláris fehérjék között.
A pRIT12363-at, pRIT10912-t vagy pRIT12894-et magában foglaló DC5 élesztőtörzsből nyers sejtkivonatot készítünk, amint ezt a 12. példában leírtuk. Ezeknek a kivonatoknak az immunfolt elemzését a fentebb leírtak szerint végezzük el.
A nyers sejtkivonatok CsCl egyensúlyi centrifugálása (a 12. példában leírtak szerint) és a HBsAg-rokon antigenicitás mérése AUSRIA méréssel a CsCl frakciókban azt mutatja, hogy az antigén mintegy § = 1,2 g/rrr értékkel kötődik. Ezt a CsCl frakciók immunfolt-elemzése is megerősíti.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 32 kD-s fúziós fehérje, amely a pRIT12894-et hordozó DC5 élesztőtörzs sejtjeiben .153 termelődik, a humán szérumból származó 22 nm-es HBsAg részecskékhez hasonlóan részecskékbe áll össze. Ezeknek a részecskéknek aktivitási szintjéből az AUSRIA vizsgálatban, valamint a 32 kD-s fehérje reakciójának intenzitásából az immunfolt elemzésben arra a következtetésre lehet jutni, hogy a részecskék S determinánsai részlegesen gátolva vagy deformálva vannak a C7 szekvenciák jelenléte révén.
Ezekből az eredményekből arra a következtetésre lehet jutni, hogy a vagy pRIT12894-gyel, vagy pRIT12898-cal transzformált DC5 és 10S44C élesztőtörzsek sejtjei 32 kD illetve 45 kD molekulatömegű fúziós fehérjét szintetizálnak, amelyek mindegyike hordoz S epitópot.
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a HÍV vírus peptid epitópokat hordozó hibrid részecskéket hagyományos módon lehet extrahálni és tisztítani a pRIT12894-gyel, pRIT12898cal vagy pRIT12900-zal transzformált élesztősejtek tenyészetéből. Az ilyen tisztított részecskéket lehet azután kiszerelni vakcinaként humán felhasználásra olyan adjuvánsok jelenlétében, mint pl. Al(OH)^ vagy AlPO^. Az előnyös dózis 1-1000v4(g fehérje tartományban van, és ezt hagyományos kísérletekkel határozhatjuk meg. Az is érthető, hogy a jelen találmányban az itt leírt példák alapján HÍV vírus fehérjékből származó más peptid területek is szóba jöhetnek, amelyeket a HBV kódoló szekvenciák Pre S2-S területéhez lehet fuzionálni, hogy olyan hibrid részecskéket alakítsunk ki, amelyek a szóban forgó HÍV epitópot szolgáltatják.

Claims (20)

1. ) Eljárás transzformált eukarióta gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtet transzformálunk olyan vektorral, amely valamely rekombináns DNS molekulát tartalmaz egy szabályozó területtel operatívan összekapcsolva, ahol a rekombináns DNS molekula egy funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmaz fázisban fuzionálva egy HBV Pre S2-S fehérjét kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részével, és ahol a funkcionális DNS kódoló szekvencia kódolja még a Plasmodium circum sporozoita (CS) fehérjéjét, vagy kódol egy HÍV burkolati gén szekvenciát, pl. HÍV C7 fehérje kódoló szekvenciát, HÍV 121. peptid fehérje-kódoló szekvenciát vagy HÍV Dreesman peptid kódoló szekvenciát.
2. ) Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet élesztősejt.
3. ) A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a Saccharomyces nemzetségbe tartozik.
4. ) A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a Saccharomyces cerevisiae vagy Saccharomyces carlsbergiensis fajba tartozik.
5. ) A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet DC5, DC5 cir°, 10S44C vagy 10S44C cir° törzs.
6. ) Eljárás HBsAg fehérjét tartalmazó hibrid részecskék élőállí gy funkcionális DNS kódoló szekvencia által kódolt peptidet tartalma vagy szolgáltatj-r^azzal jellemezve, hogy valamely vektorral transzformált eukarióta gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztünk és a részecskéket az ilyen gazdasejt tenyészetének sejtlizátumából vagy kivonatából izoláljuk, ahol az említett vektor olyan vektor, amely valamely rekombináns DNS mo• · • · ··· ·· • · · · • · · ·· • · · · · · · • · · · ·
- 155 lekulát tartalmaz egy szabályozó területtel operatívan összekapcsolva, ahol a rekombináns DNS molekula egy funkcionális DNS kódoló szekvenciát tartalmaz fázisban fuzionálva egy HBV Pre S2-S fehérjét kódoló szekvencia Pre S2 területének egy részével, és ahol a funkcionális DNS kódoló szekvencia kódolja még a Plasmodium cirkumsporozoita (CS) fehérjéjét, vagy kódol egy HÍV burkolati gén szekvenciát, pl. HIVC7 fehérje kódoló szekvenciát, HÍV 121. peptid fehérje-kódoló szekvenciát vagy HÍV Dreesman peptid kódoló szekvenciát.
7.) Eljárás transzformált gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy valamely gazdasejtet a HBV Pre S1 fehérje kódoló területtel transzformáljuk, amely az alábbi aminosavszekvenciát kódolja:
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Alá Phe Gly Alá Asn. Ser Asn Asn Pro Asp TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp CCA GCA GCC AAC €AG GTA GGA GTG GGA GCA
Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá • · *··· ·· ·· · · · · • · · · ·· • · · · ♦ · · · ··· · · ··
- 156
TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly GOT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin GGC ATA TGG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Alá.
8. ) A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a nevezett területet rekombináns DNS vektor tartalmazza.
9. ) A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet élesztősejt.
10. ) A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet a Saccharomyces nemzetségbe tartozik.
11. ) Eljárás a 7. igénypont szerinti Pre S1 fehérje kódoló terület által kódolt fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy a nevezett területtel transzformált gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a fehérjét az ilyen gazdaszervezet tenyésze- • · • · *··
157 tének sejt-lizátümából vagy kivonatából izoláljuk.
12.) Eljárás transzformált gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy egy gazdasejtet HBV Pre S2 fehérje kódoló területtel vagy olyan HBV Pre S2-S fehérje kódoló területtel transzformálunk, ahol ennek Pre S2 része az alábbi aminosav szekvenciát kódolja: -55 -50 Thr vagy
Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp
Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-SerSer-20
Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser-10
Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.
13·) A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a nevezett területet rekombináns DNS vektor tartalmazza.
14. ) Eljárás a 12. igénypont szerinti Pre S2 vagy Pre S2-S fehérje kódoló terület által kódolt fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy a nevezett területtel transzformált gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a fehérjét az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából izoláljuk.
15. ) Eljárás a 12. igénypont szerinti Pre S2-S fehérje kódoló terület által kódolt részecskék előállítására azzal jellemezve, hogy a nevezett területtel transzformált gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a részecskéket az ilyen gazdaszervezet ···· ·«· ··· · « ··
-158 « ··· ·· tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából izoláljuk.
16. ) Eljárás transzformált élesztő gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy élesztő gazdasejtet transzformálunk olyan rekombináns DNS vektorral, amely Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát tartalmaz operatívan kapcsolva valamely szabályozó területhez .
17. ) Eljárás a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy valamely szabályozó szekvenciához kapcsolt Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztünk és a fehérjét az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából izoláljuk.
18. ) Eljárás a Pre S1-Pre S2-S fehérje kódoló szekvencia által kódolt fehérjét tartalmazó részecskék előállítására azzal jellemezve, hogy valamely szabályozó szekvenciához kapcsolt Pre &1Pre S2-S fehérje kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformált élesztő gazdasejtet megfelelő tápközegben tenyésztünk és a részecskéket az ilyen gazdaszervezet tenyészetének sejt-lizátumából vagy kivonatából izoláljuk.
19. ) Eljárás transzformált élesztő gazdasejt előállítására azzal jellemezve, hogy élesztő gazdasejtet transzformálunk olyan rekombináns DNS vektorral, amely az alábbi Pre S1-Pre S2-fehérje kódoló szekvenciát tartalmazza operatívan kapcsolva valamely szabályozó területhez:
Pre S1 terület
-163
ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTG
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu ·»··
--159 -
GGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCT Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp Pro GCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GAT Alá Phe Gly Alá Asn Ser Asn Asn Pro Asp TGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGG Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp CCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCA Pro Alá Alá Asn Gin Val Gly Val Gly Alá TTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGC Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly X GGT AAT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gin Alá Gin GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro CCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA Pro Pro Alá Ser Thr Asn Arg Gin Ser Gly AGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA
Arg Gin Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu *· · · ·?·· ·· • · ·· » · » a • · · * · ·· • · ···· · · · «·· ··· 4 · « «
-160
AGA GAC AGT CAT CCT CAG GCC Arg Asp Ser His Pro Gin Alá Pre S2 terület -55 ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAA Met Gin Trp Asn Ser Thr Alá Phe His Gin GCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTG Alá Leu Gin Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu TAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGA Tyr Phe Pro Alá Gly Gly Ser Ser Sér Gly ACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCT Thr Val Asn Pro Alá Pro Asn Ile Alá Ser CAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGG His Ile Ser Ser Ser Ser Alá Arg Thr Gly GAC CCT GTG ACG AAC Asp Pro Val Thr Asn.
20.) Eljárás fehérje előállítására azzal jellemezve, hogy a 19. igénypont szerinti Pre S1 Pre S2 fehérje kódoló területnek megfelelő fehérjét állítjuk elő.
HU88409A 1987-01-30 1988-01-29 Process for producing hepatitis b virus surface antigenes and hybrid antigenes containing same, as well as pharmaceutical compositions comprising same HUT50876A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US932587A 1987-01-30 1987-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT50876A true HUT50876A (en) 1990-03-28

Family

ID=21736956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU88409A HUT50876A (en) 1987-01-30 1988-01-29 Process for producing hepatitis b virus surface antigenes and hybrid antigenes containing same, as well as pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (20)

Country Link
EP (1) EP0278940A3 (hu)
JP (1) JPS6463382A (hu)
KR (1) KR880009130A (hu)
CN (1) CN1031395A (hu)
AP (1) AP56A (hu)
AU (1) AU1093088A (hu)
DD (3) DD284899A5 (hu)
DK (1) DK43188A (hu)
FI (1) FI880428A (hu)
HU (1) HUT50876A (hu)
IL (1) IL85216A0 (hu)
MA (1) MA21169A1 (hu)
NO (1) NO880395L (hu)
NZ (1) NZ223297A (hu)
OA (1) OA08801A (hu)
PT (1) PT86640B (hu)
SU (1) SU1746887A3 (hu)
TN (1) TNSN88004A1 (hu)
YU (1) YU17488A (hu)
ZA (1) ZA88488B (hu)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988010300A1 (en) * 1987-06-22 1988-12-29 Medico Labs Ag Heterologous viral peptide particle immunogens
IL89991A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts
EP0345792A3 (en) * 1988-06-10 1991-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Htlv-i / hiv-1 fusion proteins
FR2635532B1 (fr) * 1988-07-29 1992-05-22 Pasteur Institut Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant
US5130247A (en) * 1989-09-19 1992-07-14 Merck & Co., Inc. Expression of fusion protein of HIV envelope and HBsAG
EP0421626A1 (en) * 1989-09-19 1991-04-10 Merck & Co. Inc. Vaccine for aids and hepatitis B
US5130248A (en) * 1989-09-19 1992-07-14 Merck & Co., Inc. Expression of fusion protein of HIV envelope and HBsAg
EP0491077A1 (en) * 1990-12-19 1992-06-24 Medeva Holdings B.V. A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases
EP0614465B1 (en) * 1991-11-16 1999-03-17 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
CA2124928C (en) * 1991-12-23 2003-06-17 Bruce D. Irvine Hbv amplifier probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
US6297048B1 (en) 1992-02-04 2001-10-02 Chiron Corporation Hepatitis therapeutics
US6169171B1 (en) 1992-02-27 2001-01-02 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBSAG
US5928902A (en) * 1992-02-27 1999-07-27 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
US6667387B1 (en) 1996-09-30 2003-12-23 N.V. Innogenetics S.A. HCV core peptides
US6709828B1 (en) 1992-03-06 2004-03-23 N.V. Innogenetics S.A. Process for the determination of peptides corresponding to immunologically important epitopes and their use in a process for determination of antibodies or biotinylated peptides corresponding to immunologically important epitopes, a process for preparing them and compositions containing them
US6165730A (en) * 1992-03-06 2000-12-26 N.V. Innogenetics S.A. Hepatitis C virus peptides obtained from the NS4 coding region and their use in diagnostic assays
WO1993020840A1 (en) * 1992-04-14 1993-10-28 British Bio-Technology Limited Induction of ctl responses
EP0642355B1 (en) 1992-05-23 1998-07-15 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. Combined vaccines comprising hepatitis b surface antigen and other antigens
CN1063343C (zh) * 1993-04-27 2001-03-21 中国科学院上海生物化学研究所 氨端带前表面抗原决定簇的乙型肝炎表面抗原蛋白
US6235888B1 (en) 1994-10-05 2001-05-22 The General Hospital Corporation Hepatitis C virus vaccine
RU2189254C2 (ru) * 1995-06-06 2002-09-20 Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн Вакцины против вирусов гепатита
DE69738521T2 (de) 1996-04-05 2009-05-07 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville Alphaviren-vektors mit einer reduzierten inhibierung der synthese von zellmakromolekülen
CA2266656A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Chiron Corporation Compositions and methods for treating intracellular diseases
GB9623233D0 (en) 1996-11-07 1997-01-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
EP2266604A3 (en) 1998-10-16 2011-05-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvant systems and vaccines
UA79735C2 (uk) 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищення антигенів вірусу гепатиту b (hbv) для використання у вакцинах
CN100381171C (zh) * 2004-12-30 2008-04-16 成都生物制品研究所 含前s1、前s2和s抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒
CN102675430B (zh) * 2005-08-12 2014-08-27 上海贺普药业股份有限公司 乙型肝炎病毒表面l蛋白相关肽
BRPI0708865A8 (pt) 2006-03-14 2019-01-22 Univ Oregon Health & Science métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose
EP2066344B2 (en) 2006-09-07 2016-06-29 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Inactivated Poliovirus combination vaccine
KR100836745B1 (ko) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 Ｈｂｖ 백신 및 그의 제조 방법
AU2008221383B2 (en) 2007-02-28 2012-09-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Brachyury polypeptides and methods for use
UY31064A1 (es) 2007-05-02 2009-01-05 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
US9415006B2 (en) 2008-05-23 2016-08-16 The Regents Of The University Of Michigan Immunogenic compositions comprising nanoemulsion and hepatitis B virus immunogen and methods of using the same
WO2010099472A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 The U.S.A. Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Spanx-b polypeptides and their use
GB201105981D0 (en) 2011-04-08 2011-05-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
ES2752190T3 (es) 2012-09-14 2020-04-03 Us Health Proteína Brachyury, vectores adenovirales que codifican proteína Brachyury y su uso
CA2994694A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2145092B (en) * 1983-01-28 1988-04-07 Univ New York Protective peptide antigen
IL69202A (en) * 1982-09-08 1991-08-16 Smith Kline Rit Surface antigen polypeptides of hbv virus produced in yeast and the preparation thereof
EP0174444B1 (en) * 1984-06-18 1992-03-11 Chiron Corporation Hepatitis surface antigen particle vaccine
EP0171908A3 (en) * 1984-07-11 1987-07-15 Takeda Chemical Industries, Ltd. Hepatitis b virus surface antigen and production thereof
GB8421282D0 (en) * 1984-08-22 1984-09-26 Connaught Lab Multispecific antigenic proteins
EP0175261B1 (en) * 1984-09-12 1991-12-11 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
EP0180012A1 (de) * 1984-10-27 1986-05-07 Wolfram H. Prof. Dr. Gerlich Immunogene Polypeptidsequenz des Hepatitis B-Virus
CN86100979A (zh) * 1985-02-07 1986-12-17 史密丝克莱恩贝克曼公司 疟疾疫苗的制备方法
US4774175A (en) * 1985-03-01 1988-09-27 Centocor, Inc. Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III
US4683294A (en) * 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
WO1986006077A1 (en) * 1985-04-08 1986-10-23 Amgen A method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
FR2581394B1 (fr) * 1985-05-02 1988-08-05 Grp Genie Genetique Particules ayant les proprietes immunogenes de l'antigene hbs et portant un site antigenique etranger aux epitopes portes par l'antigene hbs, vecteurs et cellules animales pour la production de telles particules et compositions contenant de telles particules pour la production de vaccins mixtes
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
CA1310602C (en) * 1986-06-03 1992-11-24 Hajime Horii Yeast promoter and process for preparing heterologous protein

Also Published As

Publication number Publication date
YU17488A (en) 1991-02-28
DD284899A5 (de) 1990-11-28
DK43188A (da) 1988-07-31
DD285612A5 (de) 1990-12-19
SU1746887A3 (ru) 1992-07-07
PT86640A (pt) 1988-02-01
MA21169A1 (fr) 1988-10-01
IL85216A0 (en) 1988-07-31
OA08801A (fr) 1989-03-31
FI880428A (fi) 1988-09-13
EP0278940A3 (en) 1988-12-07
DD285994A5 (de) 1991-01-10
KR880009130A (ko) 1988-09-14
FI880428A0 (fi) 1988-01-29
AU1093088A (en) 1988-08-04
DK43188D0 (da) 1988-01-28
JPS6463382A (en) 1989-03-09
NO880395L (no) 1988-08-01
AP8800078A0 (en) 1987-11-01
ZA88488B (en) 1988-10-26
PT86640B (pt) 1992-01-31
NZ223297A (en) 1991-06-25
NO880395D0 (no) 1988-01-29
AP56A (en) 1989-09-26
CN1031395A (zh) 1989-03-01
EP0278940A2 (en) 1988-08-17
TNSN88004A1 (fr) 1990-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT50876A (en) Process for producing hepatitis b virus surface antigenes and hybrid antigenes containing same, as well as pharmaceutical compositions comprising same
KR100251505B1 (ko) 말라리아원충으로부터의 cs 및 hbsag 사이의 혼성 단백질(hybrid protein between cs from plasmodium and hbsag)
US4722840A (en) Hybrid particle immunogens
EP0522030B1 (en) Hepatitis b vaccine
EP0414374B1 (en) Novel antigens and methods for their preparation
CA1263618A (en) Hybrid particle immunogens
US6306625B1 (en) Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
US5928902A (en) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
JP2522825B2 (ja) 肝炎ｂ型ウィルスワクチン用組換型ｄｎａ分子
US5639637A (en) Hepatitis B vaccine
EP1390397B1 (en) Pre-s protein of hepatitis b virus (hbv) as an adjuvant and a component of hbv vaccine
WO2002072625A1 (fr) Preparation et utilisation d&#39;un antigene de fusion du plasmodium
US6103519A (en) Antigens and methods therefor
IE910966A1 (en) Plasmodium Sporozoite Antigen
AU642729C (en) Hepatitis B vaccine
US5989865A (en) Hepatitis B vaccine
DD274052A5 (de) Verfahren zur Herstellung von Rekombinanten Hbv-, Hiv- oder Plasmodium-Oberflächenproteinen bzw. Hybridpartikeln

Legal Events

Date Code Title Description
DFC9 Refusal of application