HU224315B1

HU224315B1 - Véralvadásgátló hatású peptidil-arginin-aldehid-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HU224315B1
Application number: HU9601526A
Authority: HU
Inventors: Sándor Bajusz; Attila Juhász; Éva Barabás; András Fehér; Gabriella Szabó; Györgyné Széll; Béláné dr. Véghelyi; Jánosné Lavich; Ocskay Klára Makkné; Éva Kaszás; Györgyné Szalkay; Gáborné Szeker; Istvánné Taschler; József Langó; Lászlóné Mohai; Imre Moravcsik; Gábor Tóth
Original assignee: Gyógyszerkutató Intézet Kft.
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2005-07-28
Also published as: AU726516B2; ES2182086T3; EP0922054A1; US6235707B1; DE69714745D1; EP0922054B1; CA2256391C; AU3043697A; HUP9601526A3; WO1997046576A1; CA2256391A1; PT922054E; DE69714745T2; JP3970935B2; ATE222261T1; DK0922054T3; HUP9601526A2; HU9601526D0; JP2000512278A

Abstract

A találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok – Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol Q jelentéseQ'–O–CO– képletű acilcsoport, mely képletben Q' jelentése 1–3szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése 3-ciklobutil-D-alanin-vagy 3-ciklopentil-D-alanin-gyök, Pro jelentése L-prolin-gyök és Argjelentése L-arginin-gyök – és ezek szerves vagy szervetlen savvalképzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazógyógyszerkészítmények képezik. A találmány szerinti (I) általánosképletű vegyületek gyógyászati, közelebbről véralvadást gátló hatássalrendelkeznek, amely vérlemezke-funkciót, valamint trombózisképződéstgátló hatással párosul.

Description

A találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q'-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése 3-ciklobutil-D-alanin- vagy 3-ciklopentil-D-alanin-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek értékes gyógyászati, közelebbről véralvadást gátló hatással rendelkeznek, amely jelentős vérlemezke-funkciót, valamint trombózisképződést gátló hatással párosul.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek különösen értékes képviselői az alábbiak: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-argininaldehid,

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-argininaldehid,

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-L-argininaldehid,

Metoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-L-argininaldehid, valamint a fenti vegyületek savaddíciós (elsősorban hidrogén-szulfát) sói.

Definíciók

A leírásban szereplő aminosavak és szubsztituensek, valamint az ezekből felépített peptidek rövidítése a peptidkémiai irodalomban használatosnak megfelelően az alábbi.

Aminosavak: Arg=L-arginin [(2R)-2-amino-5-guanidino-pentánsav], Asp=L-aszparaginsav [(2S)-2-amino-3-karboxi-propionsav], boro-Arg=L-boro-arginin [(1R)-1-amino-4-guanidino-butil-bórsavj, D-Cba=3-ciklobutil-D-alanin [(2R)-2-amino-3-ciklobutil-propionsavj, DL-Cbg=DL-2-ciklobutil-glicin [(2RS)-2-amino-2-ciklobutil-ecetsav], D-Chg=D-2-ciklohexil-glicin [(2R)-2-amino-ciklohexil-ecetsav], D-Cpa=3-ciklopentil-D-alanin [(2R)-2-amino-3-ciklopentil-propionsavj, Gla=gamma-karboxi-L-glutaminsav [(2S)-2-amino-4,4-dikarboxi-vajsavj, Glu=L-glutaminsav [(2S)-2-amino-4-karboxi-vajsav], Glp=L-piroglutaminsav [(5S)-2-pirrolidon-5-karbonsavj, Gly=glicin (2-amino-ecetsav), D-MePhe=N-metil-3-fenil-D-alanin [(2R)-2-metil-amino-3-fenil-propionsav], D-MePhg=D-N-metil-fenil-glicin [(2R)-2-amino-2-fenil-ecetsavj, Nal( 1 )=3-(naftil-1 )-L-alanin [(2S)-2-amino-3-(naftil-1 )-propionsav], D-Phe=3-fenil-D-alanin [(2R)-2-amino-3-fenil-propionsav], Pro=L-prolin [(2S)-pirrolidin-2-karbonsavj. Szubsztituensek: Ac=acetil, Boc=ferc-butoxi-karbonil, Bz=benzoil, Eoc=etoxi-karbonil, Et=etil, iPoc=izopropoxi-karbonil, Me=metil, 4MeP=4-metil-pentanoil, Moc=metoxi-karbonil, pNA=p-nitro-fenil-amino,

Poc=propoxi-karbonil, Tos=p-toluolszulfonil, Z=benzil-oxi-karbonil.

Peptidek és származékaik: Az aminosavrövidítések önmagukban az L-aminosavat jelölik. A D-aminosavat külön jelöljük, például a 3-fenil-D-alanin=D-Phe. Az aminosavrövidítések előtt és után álló kötőjel azt jelzi, hogy az aminocsoportról egy H-atom, illetve a karboxilcsoportról egy OH-csoport hiányzik. Ennek megfelelően az Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H jelentése etoxi-karbonil-3ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid, a Bz-lleGlu-Gly-Arg-pNA jelentése pedig benzoil-L-izoleucilL-glutamil-glicil-L-arginin-p-nitro-anilid.

A véralvadás a szervezet védekező mechanizmusának része. Érfalsérülés hatására indul el a folyamat, véralvadék keletkezik, hogy meggátolja az elvérzést. Emellett az ér betegsége, a vér pangása és az alvadási faktorok kóros aktiválódása is kiválthatja a véralvadást. Ilyenkor az éren belül keletkezik vérrög (trombus), ami azt részben vagy egészen eltörni, trombózis lép fel. A védekező mechanizmus másik része a fibrinolízis. Az ebben működő enzimek végzik a véralvadék feleslegének eltávolítását, és ezek vesznek részt a trombolízisben, a trombus oldásában is.

A véralvadás folyamata egy katalizált enzimreakció-sorozat, kaszkádreakció, amelyben plazmafehérjék, az úgynevezett alvadási faktorok aktiválódnak egymás után. A faktorokat római számokkal jelölik, az aktív formára a betű utal. Néhány esetében a triviális név (is) használatos: például fibrinogén=l faktor (fi), fibrin=la faktor (fia), protrombin=ll faktor (fii) és trombin=lla faktor (fila). Az alvadás során keletkeznek szerinproteázok (fXlla, fVlla, fXIa, fIXa, fXa és trombin), néhány gyorsító kofaktor (fVa és fVllla) és maga az alvadó anyag (fibrin). A keletkező proteázok sorában a fXa és a trombin a két utolsó. A fXa hatására képződik a trombin, ami a fibrinogén hasításával kialakítja a fibrinalvadékot.

A véralvadás korábbi mechanizmusa [R.G. MacFarlane: Natúré 202, 498 (1964); E. W. Davie és O. D. Ratnoff: Science 145, 1310 (1964)] szerint a fX aktiválása két úton, az úgynevezett belső vagy külső úton történik. Az előbbi esetben a valamilyen felületen aktiválódott fXII (fXlla) indítja el a folyamatot a fXI->fXla átalakítással, amit a fIX—> fIXa átalakulás követ; a fX aktiválását a fIXa végzi. A külső úton egy sejtfelszíni receptor, a szöveti faktor (TF, tissue factor) megjelenésével és a [fVII*TFJ, illetve [fVlla*TF] komplex kialakulásával indul a folyamat. A fX aktiválását a [fVlla*TF] komplex végzi.

Az újabb eredmények szerint az élő szervezetben lejátszódó véralvadás a fentiek kombinációja [E. W. Davie és munkatársai: Biochemistry 43, 10 363 (1991)], és a fontosabb lépései az alábbiak.

1. Az érfal sérülése vagy betegsége esetén a TF a felszínre kerül, és megköt valamennyit a vérben lévő VII faktorból. A képződött [fVII*TF] komplex egy alkalmas és legalább nyomnyi mennyiségben jelen lévő proteáz (például fXlla, fXa, fIXa és trombin) hatására átalakul az aktív [fVlla*TF] enzimkomplexszé, ami aktiválja a plazmában lévő IX és X faktor kis részét (keletkezik kevés fIXa és fXa), majd inaktiválódik a TFPI

HU 224 315 Β1 [Tissue Factor Pathway Inhibitor, korábbi nevén LACI (Lipoprotein-Associated Coagulation Inhibitor)] hatására, ami a plazmában a fXa és a [fVlla*TF] komplex közös inhibitora [T. J. Girard és munkatársai: Natúré, 338, 518-520 (1989)].

2. A keletkezett fIXa a X faktorral és a fVllla gyorsítómolekulával foszfolipid (PL)-felületen, Ca⁺⁺-ion jelenlétében létrehozza az úgynevezett „tenase” komplexet: [flXa*fVlllaxfX*PL*Ca⁺⁺], amiben a fX aktiválódik, keletkezik a fXa.

3. Az eddig keletkezett fXa a protrombinnal (fii) és a fVa gyorsítómolekulával kialakítja a „tenase”-hoz hasonló felépítésű úgynevezett protrombinázkomplexet: [fXa*fVa*fll*PL*Ca⁺⁺]. Ebben megy végbe a protrombin ->trombin átalakulás. A fV -> fVa és fVIII -+ fVllla átalakulást a fXa vagy a trombin tudja elvégezni.

4. A keletkezett kevés trombin átalakítja a fXI egy részét fXIa enzimmé, és aktivál valamennyit a Vili és V faktorból, hogy újabb fVllla, illetve fVa keletkezzen. Most már a fXIa végzi el a IX faktor átalakítását fIXa enzimmé. Ezzel újból elindulhat a Xáz-komplextől a trombin képződéséig vezető láncreakció. A folyamat ismétlődésével egyre több trombin keletkezik.

5. Kellően nagy trombinkoncentrációnál következik be a plazmában oldott fibrinogén részleges proteolízise, a fibrinmonomer képződése, ami előbb az úgynevezett oldható fibrinpolimerré asszociálódik, majd átalakul az oldhatatlan fibrinpolimerré. Ez utóbbi átalakulásban is szerepet játszik a trombin, mivel ennek hatására keletkezik a polimerizációt végző fXllla [L. Lorand és K. Konishi: Arch. Biochem. Biophys. 105, 58 (1964)].

Az oldhatatlan fibrinpolimer a véralvadék és a trombus egyik főkomponense, a másik összetevő a vérlemezke-aggregátum, mely ugyancsak a trombin hatására keletkezik elsősorban. A kialakuló trombus, illetve véralvadék magába zárja a folyamatban keletkezett trombin jelentős részét, ami újabb alvadási folyamatot indít el, amikor a trombus oldódása/oldása során oldatba kerül [A. K. Gash és munkatársai: Am. J. Cardiol. 57, 175 (1986); R. Kumar és munkatársai: Thromb. Haemost. 72, 713(1994)].

A fentiekből kitűnik a trombin kulcsszerepe a trombus képződésében. Emiatt a trombózisos betegségek gyógyításában rendkívüli jelentőséggel bírnak az olyan anyagok, melyek a trombin működését és/vagy keletkezését gátolják.

A trombózis kezelésében és megelőzésében a jelenleg legelterjedtebben és legsikeresebben alkalmazott készítmények a heparinok és a K-vitamin-antagonista kumarinok (például Syncumar és Warfarin), melyek közvetve gátolják a trombint.

A heparin katalizálja a trombin és természetes inhibitora, az antitrombin-lll (ΑΤ-III) közötti reakciót. A heparin ezen hatása azonban elmarad, ha az ΑΤ-III plazmakoncentrációja a normális 75%-ánál kisebb [R. Egbring és munkatársai: Thromb. Haemost. 42, 225 (1979)]. Nem kevésbé fontos, hogy e közvetett mechanizmussal nem gátolható az említett trombus által kötött trombin, mert a heparin-AT-lll komplex számára nem hozzáférhető [J. I. Weitz és munkatársai: J. Clin.

Invest. 86, 385 (1990)]. Mindemellett a kezelés hatására kialakuló vérzéses szövődmények és immunkórfolyamat következtében kialakuló trombembóliás esetek előfordulása sem elhanyagolható [lásd például J. M. Walenga és munkatársai: Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2(Suppí 1), S21-S27 (1996)].

A K-vitamin-antagonisták orálisan is adhatók. Hatásuk 16-24 óra után jelentkezik, és abban nyilvánul meg, hogy meggátolják némely alvadási faktor (például a protrombin) reaktív, Gla-tartalmú formáinak kialakulását. A terápiás hatáshoz részleges (60-70%-os) gátlás szükséges [Μ. P. Esnouf és C. V. Prowse: Biochim. Biophys. Acta 490, 471 (1977)], ami a gyógyszer megfelelő adagolásával érhető el. A K-vitamin-antagonisták alkalmazását megnehezíti a keskeny terápiás sáv, valamint a táplálék összetételétől (K-vitamin) való nagyfokú függőség és a változó egyedi érzékenység.

A trombint közvetlenül gátló első nagy hatású szintetikus anyag a D-Phe-Pro-Arg-H tripeptid-aldehid volt, amely egy reverzibilis inhibitor, és mind in vitro, mind in vivő jelentős alvadásgátló hatást mutatott [S. Bajusz és munkatársai: In: Peptides: Chemistry, Structure and Biology (R. Walter and J. Meienhofer, Eds.), Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 1975, pp. 603-608; Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)]. A D-Phe-Pro-Arg-H számos rokon vegyületét állították elő. Az elsők között volt a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H [S. Bajusz és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)], valamint a klór-metil-keton-analóg (D-Phe-Pro-Arg-CH₂CI), ami irreverzíbilis inhibitornak bizonyult [C. Kettner és E. Shaw: Thromb. Rés. 14, 969 (1979)]. A továbbiak közül kiemeljük a peptid és acilvegyületei boro-arginin-analógjait (D-Phe- és Boc-D-Phe-, valamint Ac-D-Phe-Pro-boro-Arg), melyek a trombin hatékony reverzibilis inhibitorai [C. Kettner és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 18 289 (1990)] és a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H egyéb analógjait, köztük a Boc-D-Chg-Pro-Arg-H analógot [P. D. Gesellchen és R. T. Shuman: EP 0 479 489 A2 (1992)].

Kitűnt, hogy a D-Phe-Pro-Arg-H vizes oldatban hajlamos spontán átalakulásra, de a terminális aminocsoport metilezésével kapott D-MePhe-Pro-Arg-H (GYKI-14 766) már megfelelően stabil és hasonlóan hatásos vegyület [S. Bajusz és munkatársai: 4,703,036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1987); J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)]. Kísérleti állatokban jelentősen gátolja a véralvadást és trombusképződést [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 és 68, 125 (1992); J. V. Jackson és munkatársai: J. Pharm. Ex. Ther. 261, 546 (1992)]; a fibrinolízis enzimjeire gyakorolt gátlóhatása jelentéktelen, trombolitikumokkal együtt adva hatékonyan segíti a trombus oldódását [C. V. Jackson és munkatársai: J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 587 (1993)], amire a heparin-AT-lll komplex nem képes. A D-MePhe-Pro-Arg-H rokon vegyületeinek a szintézisére is sor került, például a D-MePhg-Pro-Arg-H előállítására [R. T. Shuman és munkatársai: J. Med. Chem. 36, 314 (1993)].

A véralvadásgátló hatást (a folyamat proteolitikus reakcióinak gátlását) az alvadási tesztekben mérik, pél3

HU 224 315 Β1 dául a trombin idő (TT), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT) és protrombin idő (PT) tesztben (E. J. W. Bovie és munkatársai: Mayo Clinic Laboratory Manual of Hemostasis; W. B. Sanuders Co., Philadelphia, 1971).

A spontán alvadásban gátolt plazmát, például citrátplaz- 5 mát alvadásra késztetnek, és mérik az alvadási időt. Alvadásgátlók hatására az alvadási idő megnyúlik a rendszerben működő reakció(k) gátlásával arányosan. Az alvadásgátló hatás jellemezhető például azzal az anyagkoncentrációval, aminél az alvadási idő a kontroll két- 10 szeresére nyúlik (ICsq). Az alvadásgátlóknak az egyes alvadási proteázokra gyakorolt hatását pedig az úgynevezett amidolitikus módszerrel mérik [R. Lottenberg és munkatársai: Methods Enzymol. 80, 341 (1981); G. Cleason: Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411 15 (1994)]. Az izolált aktív faktort (például trombin, fXa) és ennek kromogén vagy fluorogén peptid-amid-szubsztrátját reagáltatják az inhibitor távollétében, illetve jelenlétében. Az enzimgátló hatást például az amidolízisben mért gátlási állandóval (IC₅₀) jellemzik. 20

A TT tesztben a citrátplazmához adott trombin váltja ki az alvadást. A rendszerben működő trombin 22 pmol/ml, ennek gátlása mérhető jelen lévő fibrinogénen (a trombin egyik természetes szubsztrátján) plazmakomponensek jelenlétében. Az APTT és PT 25 tesztben az alvadási folyamat egésze zajlik. Az aktivátortól függően az úgynevezett belső, illetve külső úton aktiválódik a fX. A keletkező fXa a protrombint aktiválja trombinná, ami végül kiváltja a plazma alvadását. Az alvadási idő megnyúlik, ha az inhibitor gátolja a tesz- 30 tekben működő enzimeket vagy ezek valamelyikét.

Amíg a Xa faktorból legfeljebb 40 pmol/ml keletkezhet az APTT és PT tesztben (ennyi X faktor van jelen a két rendszerben), a trombinból kb. 150 pmol/ml (APTT), illetve 350 pmol/ml (PT) képződik [vö. B. Kaiser és mun- 35 katársai: Thromb. Rés. 65, 157 (1992)].

A D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) esetében a TT, APTT és PT tesztben a kétszeres alvadási időt eredményező koncentráció 87, 622, illetve 2915 nM. Ezek az értékek és a tesztekben működő trombin mennyisége (22, 150, 40 illetve 350 pmol/ml) hasonlóan emelkedik, ami arra utal, hogy C1 az APTT és PT tesztben is trombingátlóként viselkedik, és például a fXa működését nem vagy alig befolyásolja. Ezzel összhangban van, hogy C1 IC₅₀=2 nM értékkel gátolja a trombin amidolitikus hatását a 45

Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráton, míg a fXa amidolitikus hatását a megfelelő Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztráton csak kevéssé, IC₅₀=9,1 mM értékkel gátolja (Bajusz S. és munkatársai: nem közölt eredmények).

A véralvadás mechanizmusából következik, hogy a folyamatot nemcsak a trombin közvetlen inhibitorai, de a trombin képződését akadályozó anyagok is gátolják, például a fXa inhibitorok. Jelentős véralvadást és trombusképződést gátló hatással rendelkező fXa inhibitor például a kullancsból izolált 60 tagú polipeptid, a TÁP (Tick Anticoagulant Peptide) [L. Waxman és munkatársai: Science 248, 593 (1990); A. B. Kelly és munkatársai: Circulation 86, 1411 (1992)] és a DX-9065a (C2), egy szintetikus nempeptid: (+)-(2S)-2-[4[[(3S)-1-acetimidoil-3-pirrolidinil]-oxi]-fenil]-3-[7-amidino-2-naftil]-propionsav-hidrogén-klorid-pentahidrát [T. Hara és munkatársai: Thromb. Haemost. 71, 314 (1994); T. Yokoyama és munkatársai: Circulation 92, 485 (1995)]. Ezek az anyagok erősen gátolják a fXa amidolitikus hatását és a plazma alvadását a PT és APTT tesztben. Vagyis egyaránt jól gátolják a szabad és a komplexben lévő Xa faktort. Ugyanakkor - mint specifikus fXa inhibitorok - a trombint nem gátolják, a TT tesztben nem hatnak. A fXa szintetikus peptid inhibitora például a 4MeP-Asp-Pro-Arg-H (C3) (WO 93/15756 számú alatt publikált nemzetközi bejelentés) és a Boc-D-Phe-Nal(1 )-Arg-H (C4) (WO 95/13693 számú alatt publikált nemzetközi bejelentés). A közlés szerint C3 és C4 IC₅₀=57, illetve 30 nM értékkel gátolja a fXa amidolitikus hatását a Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA szubsztráton; alvadásgátló hatásukra nincs adat. Saját méréseinkben Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztráton is jelentős gátlóhatást mutatott C3 és C4, míg alvadásgátló hatásuk a plazma alvadási tesztekben rendkívül kicsi. Az 1. táblázat mutatja a fenti szintetikus fXa inhibitorokra közölt (C2), illetve kapott (C3-C4) aktivitási értékeket összehasonlításban a C1 trombingátló adataival.

A fenti adatokból látszik, hogy a PT és APTT tesztben észlelt alvadásgátló hatás C1 esetében trombingátlásra, C2-nél pedig fXa gátlására vezethető vissza. C3 és C4 jelentős fXa-gátló hatása azonban nem jár együtt számottevő alvadásgátlással. Valószínű, hogy C3 és C4 számára nem hozzáférhető a protrombináz komplexben lévő fXa aktív centruma, ezek a peptidek csak a szabad, oldatban lévő Xa faktort képesek gátolni.

1. táblázat

Ismert szintetikus inhibitorok Xa faktort gátló (A) és alvadásgátló (B) hatása

Inhibitor	A:	B: IC₅₀, mM^a
IC₅₀, nM^b	PT	APTT	TT
C1	9133	2,91	0,62	0,09
C2	70	0,52	0,97	NA^C
C3	64	19,32	4,59	0,87
C4	86	53,62	9,96	17,24

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik a protrombin idő (PT), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT) és trombin idő (TT) tesztben.

^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

^c NA=nem aktív.

HU 224 315 Β1

Újabb közlés szerint [N. A. Prager és munkatársai: Circulation 92, 962 (1995)] a trombusba/véralvadékba zárt és az oldódás során onnan kiszabaduló alvadási enzimek közül nemcsak a trombin, de a Xa faktor is hozzájárul az újabb alvadási folyamat elindításához és 5 fenntartásához, például a [fVHxTF] komplex, illetve az V és Vili faktor aktiválása révén. Előnyös tehát, ha az alvadásgátlók a trombin mellett a Xa faktor gátlására is képesek, és különösen előnyös, ha e gátlóhatás az alvadókba zárt trombinra és Xa faktorra is kiterjed. 10

A találmány célja olyan új peptidszármazékok előállítása, melyek a véralvadás folyamatát az ismerteknél előnyösebben gátolják, és gátlóhatásuk orális adás esetén is megnyilvánul.

Korábbi megfigyelésünk volt, hogy a Boc-D-Phe- 15

Pro-Arg-H (C5) alvadásgátló hatása a TT és APTT tesztben ugyan kisebb, minta C1 tripeptid-aldehidé, de a PT tesztben már valamivel aktívabb, és a Xa faktort pedig 10-szer kisebb IC₅₀-értékkel gátolja, mint C1. Most meglepő módon azt találtuk, hogy C5 Boc-csoportjának Eoc-csoporttal történő helyettesítése előnyösen módosítja a peptid alvadásgátló hatását, mert az ily módon előállt Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H (C6) mindhárom tesztben nagyobb hatású, mint a C5, továbbá a C1 aktivitását már nemcsak a PT, de az APTT tesztben is meghaladja, miközben Xa faktort gátló hatása a C5 Boc-peptidéhez hasonló. A Moc-D-Phe-Pro-Arg-H (C7) alvadásgátló hatása a C6 Eoc-vegyületéhez hasonló, de Xa faktort gátló hatása valamivel nagyobb. Az elmondottakat a 2. táblázat szemlélteti.

2. táblázat

R-D-Phe-Pro-Arg-H szerkezetű peptid-aldehidek alvadásgátló (A) és Xa faktort (B) gátló hatása

Peptid-aldehid	A: IC₅₀, mM^a	B:
No.	R	TT	APTT	PT	IC₅₀, mM^b
C1	Me	0,09	0,62	2,93	9,13
C5	Boc	0,20	0,76	2,27	0,91
C6	Eoc	0,13	0,38	1,91	0,92
C7	Moc	0,20	0,29	1,96	0,13

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik. ^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

Azt találtuk továbbá, hogy még előnyösebb véralvadásgátló vegyületekhez jutunk, ha az N-terminálison lévő aminosav nem fenil-alanin, hanem 3-ciklobutil-alanin, míg például a homológ ciklobutil-glicin beépítésével csökkent aktivitást mutató analógot kapunk. A 3-ciklo- 35 butil-alanin mellett a 3-ciklopentil-alaninnal végzett szubsztitúció is előnyös tulajdonságú peptidil-arginin-aldehidet eredményez. További megfigyelésünk szerint az N-terminálison lévő etoxi-karbonil-csoport helyettesítése a metoxi-karbonil- vagy propoxi-karbonil-csoporttal 40 módosítja az aktivitásspektrumot, azaz az egyes tesztekben mért aktivitások egymás közötti viszonyát.

A fentiek alapján a találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidszármazékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) 45 ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport,

D-Xaa jelentése 3-ciklobutil-D-alanin- vagy 3-ciklopen- 50 til-D-alanin-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazó 55 gyógyszerkészítmények képezik.

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű mely képletben Q, Q’, valamint D-Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti - vegyületek előállításánál például úgy járunk el, hogy egy Q-D-Xaa-Pro acil-dipeptidet kon- 60 denzálunk guanidinocsoportján benzil-oxi-karbonil-csoporttal védett L-arginin-laktámhoz, majd a kapott védett tripeptid-laktámot Q-D-Xaa-Pro-Arg(Z)-H képletű védett tripeptid-aldehiddé redukáljuk, végül az arginin guanidinocsoportjáról a Z-csoportot hidrogenolízissel eltávolítjuk, és az (I) általános képletű peptidszármazékot valamilyen szerves vagy szervetlen savaddíciós só formájában elkülönítjük.

A kiindulási vegyületként alkalmazott új Q-D-Xaa-Pro acil-dipeptidet például úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő D-Xaa aminosavat bázikus közegben klór-szénsav valamely Q’ alkil-észterével acilezünk, majd a kapott Q-D-Xaa acil-aminosavat L-prolinhoz kapcsoljuk.

Az L-prolinhoz való kapcsoláshoz szükséges Q-D-Xaa acil-aminosavat előnyösen úgy is előállíthatjuk, hogy a DL-Xaa racém vegyületet acilezzük és metil-észterré alakítjuk, majd a kapott Q-DL-Xaa-OMe racém acil-aminosav-metil-észter enzimes hidrolízise után nyerhető Q-D-Xaa-OMe-t szappanosítjuk a kívánt Q-D-Xaa acil-aminosavvá.

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű mely képletben Q, Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti vegyületek erős véralvadásgátló hatást fejtenek ki in vitro és in vivő egyaránt, előnyös biológiai hasznosulás mellett.

Az (I) általános képletű vegyületek in vitro kifejtett véralvadásgátló hatását a protrombin idő (PT), az aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT) és a trombin idő (TT) tesztben határoztuk meg [D. Bagdy és munka5

HU 224 315 Β1 társai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. Ugyancsak meghatároztuk a vegyületek Xa faktort gátló hatását a Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton (lásd M6. módszer). A kapott eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be; a C1 trombingátló, a C6 Eoc-D-Phe-ve- 5 gyület és a C8 Eoc-DL-Cba analóg megfelelő adatai kontrollként szerepelnek. A táblázat a vegyületeket a

PT-aktivitás csökkenő sorrendjében tartalmazza, miáltal könnyen belátható a Cba és Cpa mint N-terminális aminosavrész előnyös befolyása a Phe-nal szemben (lásd 1, 2 és C6 jelű vegyületet), valamint például a homológ ciklobutil-glicinnel szemben (lásd 4, 6 és C8 jelű vegyületet).

3. táblázat

A Q-D-Xaa-Pro-Arg-H képletű új peptid-aldehidek (1-4) és kontrollvegyületek (C1, C6 és C8-C10) alvadásgátló (A) és Xa faktort gátló (B) hatása a PT-aktivitás csökkenő sorrendjében

Q-Xaa-Pro-Arg-H	A: IC₅₀, mM^a	B: IC₅₀
Szám^b	Q	Xaa	PT	APTT	TT	nM^c
1	Eoc	D-Cba	1,15	0,35	0,11	40
4	Eoc	D-Cpa	1,41	0,24	0,10	27
2	Moc	D-Cba	1,12	0,25	0,11	388
3	iPoc	D-Cba	1,70	0,60	0,19	36
Kontrollvegyületek
C8	Eoc	DL-Cba	1,49	0,50	0,13	68
C9	Eoc	DL-Cpa	1,90	0,48	0,26	43
C6	Eoc	D-Phe	1,91	0,38	0,13	917
C1	-	D-MePhe	2,91	0,62	0,09	9133
C10	Eoc	DL-Cbg	6,15	0,77	0,88	82

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik. ^b Azonos a vegyületet leíró példa számával.

^c Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

A találmány szerinti új vegyületeknek plazminra (PL), valamint a szöveti plazminogén aktivátorral (tPA) és urokinázzal (UK) kiváltott plazminképződésre gyakorolt gátlóhatását a fibrinlemezmódszerrel vizsgáltuk [D. 35 Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. Kontrollként a C1 és C5 vegyületet használtuk. Ismert ugyanis, hogy ezek közül C1 fibrinolízist gátló hatása jelentéktelennek bizonyult in vivő, és a kísérletes trombus oldásában jól volt használható adjuvánsként, 40 míg C5 fibrinolízist gátló hatása már in vivő is kimutatható volt [C. V. Jackson és munkatársai: J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 587 (1993)]. Példaként bemutatjuk az 1 és 2 számú új vegyülettel, valamint a C1 és C5 kontrollvegyülettel kapott eredményeket a 4. táblázatban.

Az IC₅₀-értékek mellett (A oszlopok) feltüntettük a vegyületeknek a Cf-re vonatkoztatott relatív hatékonyságát (B oszlopok). Ez utóbbiak jelzik, hogy az új 1 és 2 fibrinolízist gátló hatása a C1 vegyületéhez hasonlóan mérsékelt, a vizsgált három enzimmel szemben 3,2-4,5-39-szer kisebb aktivitásúak, mint a C5 vegyület.

4. táblázat

A találmány szerinti új peptidil-arginin-aldehidek és kontrollvegyületek gátlóhatása plazminra (PL), valamint a szöveti plazminogén aktivátorral (tPA) és urokinázzal (UK) kiváltott plazminképződésre fibrinlemezen vizsgálva³

Peptidil-arginin-aldehid (szám^c)	A: IC₅₀ és B: relatív hatékonyság^b
PL	tPA	UK
A	B	A	B	A	B
Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1)	39	1,4	27	4,9	120	0,7
Moc-D-Cba-Pro-Arg-H (2)	235	0,23	92	1,4	153	0,5
Eoc-D-Cpa-Pro-Arg-H (3)	98	0,55	38	3,5	46	1,8
D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)	54	1,0	132	1,0	82	1,0
Boc-D-Phe-Pro-Arg-H (C5)	12	4,5	6	22,0	3	27,3

^a IC50=peptidkoncentráció (μΜ), melynél a fibrinlemezen a hidrolizált terület a kontroll 50%-ára csökken. ^b A C1 hatékonyságára (1/IC50=1) vonatkoztatott értékek.

^c Azonos az új vegyületet leíró kiviteli példa számával, illetve kontrollvegyület (C1, C5).

HU 224 315 Β1

Az (I) általános képletű vegyületeknek a plazmaalvadékba zárt Xa faktort és trombint gátló hatását, valamint a fibringélhez kötött trombingátló hatását az 5. táblázatban mutatjuk be az 1-3 jelű vegyület példáján; a Cl esetében talált megfelelő értékeket kontrollként 5 tüntetjük fel. A plazmaalvadékot lemezkedús humán citrátplazma rekalcinálásával, a fibringélt pedig humán fibrinogén humán trombinnal történő alvasztásával nyertük, a Xa faktor és trombin aktivitásának mérésére a Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA, illetve Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátot használtuk az M1-M3. meghatározásban leírt módon.

5. táblázat

A találmány szerinti 1-3 új peptidil-arginin-aldehid, valamint C1 mint kontrollvegyület gátlóhatása (IC₅₀, μΜ) plazmaalvadékba zárt Xa faktorra és trombinra, valamint fibringélhez kötött trombinra³

Peptidil-arginin-aldehid (szám^b)	Plazmaalvadék	Fibringél
Xa faktor	trombin	trombin
Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1)	0,70	0,39	0,32
Moc-D-Cba-Pro-Arg-H (2)	0,39	0,68	0,64
Eoc-D-Cpa-Pro-Arg-H (3)	0,28	0,49	0,67
D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)	1,12	0,38	0,30

^a Az IC₅₀-értékek meghatározásánál a Xa faktor és trombin aktivitását Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA, illetve Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráttal mértük az M2. és M3. módszerben leírt módon. ^b Azonos az új vegyületet leíró kiviteli példa számával, illetve kontrollvegyület (C1).

Az adatokból látszik, hogy az 1 és 3 jelű Eoc-vegyület nemcsak a trombint, de a plazmaalvadékba zárt 25 Xa faktort is mikromól alatti IC₅₀-értékkel gátolja.

Az (I) általános képletű vegyületek véralvadást és lemezkeaggregációt gátló hatását új-zélandi fehér nyulakban vizsgáltuk ex vivő a korábban leírt módon [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 (1992)]. 30 A vegyületeket pufferolt fiziológiás konyhasóban oldva adtuk intravénás injekcióban (0,04-5,0 mg/kg) vagy infúzióban (0,25-5,0 mg/kg/h), illetve 0,5-6,0 mg/kg dózisban bőr alá vagy 2,5-20 mg/kg dózisban szájon át.

A vegyületek hatása a szájon át történő beadás után 35 <30 perccel már kimutatható, a legnagyobb értéket a 60-180. percben éri el, és a terápiás hatás dózisfüggő módon fennmarad 3->6 órán át.

Részletesen az etoxi-karbonil-3-ciklobutil-Dalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid (1) in vivő hatását mu- 40 tatjuk be a 6. és 7. táblázatban; a C1 esetében talált megfelelő értékeket kontrollként tüntetjük fel. A vegyületet 5 mg/kg dózisban adtuk szájon át. Az állatok fülvénájából 30-60 percenként vett vérmintákat analizáltuk. Meghatároztuk a teljes vér alvadási idejét (WBCT), valamint a trombinnal kiváltható vérlemezke-aggregáció gátoltságának mértékét (PAI). Meghatároztuk továbbá a vérmintából nyert citrátplazma aktivált parciális tromboplasztin idejét (APTT) és trombin idejét (TT). Az APTT és TT értékeket a 6. táblázat, a WBCT és PAI értékeket a 7. táblázat tartalmazza.

A 6. és 7. táblázat adataiból kitűnik, hogy az 1 számú új vegyület az antikoaguláns (véralvadást gátló) és vérlemezke-aggregációt gátló hatás szempontjából egyaránt nagyobb és tartósabb hatású, mint a C1 kontrollvegyület.

6. táblázat

Az Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1) és D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) mint kontroll véralvadásgátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál az APTT és TT tesztben talált relatív alvadási időkkel jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H	D-MePhe-Pro-Arg-H
APTT	TT	APTT	TT
0	1,0	1,0	1,0	1,0
30	1,73±0,47	8,30±5,67	1,27±0,38	1,52±0,17
45	1,84±0,50	9,04±5,50	1,30±0,02	2,50±0,44
60	1,94+0,51	9,28±5,45	1,37±0,03	4,75+1,38
90	1,92±0,31	13,58+5,43	1,45±0,0	10,50+5,49
120	1,75±0,26	16,33±5,89	1,43+0,11	5,51+3,59
180	1,59±0,12	6,95±3,73	1,39±0,09	2,05+0,38
240	1,38±0,08	2,03±0,42	1,31±0,11	1,81 ±0,39
300	1,28+0,08	1,77±0,50	1,25±0,22	-

³ A kezelt és nem kezelt állatokban mért alvadási idők hányadosa. A terápiás értékeket kiemeltük.

HU 224 315 Β1

7. táblázat

Az Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1) és D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) mint kontroll véralvadást és vérlemezke-aggregációt (PAI) gátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál a WBCT tesztben talált relatív alvadási idővel, illetve a %-os gátlással jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H	D-MePhe-Pro-Arg-H
WBCT	PAI (%)	WBCT	PAI (%)
0	1,0	0	1,0	0
30	1,52±0,22	71,3±16,6	1,07+0,13	52,8+14,7
45	1,58±0,17	55,8±17,4	1,26±0,07	58,4±15,6
60	1,88±0,45	63,8±21,2	1,55±0,17	54,2+ 11,6
90	1,73±0,33	85,6±10,0	1,61±0,34	83,2+8,9
120	1,98±0,30	73,6±19,1	1,45±0,21	75,2+12,3
180	1,43±0,13	81,8±11,6	1,44+0,08	47,5±20,9
240	1,12±0,24	59,4±19,1	1,22±0,08	32,2±16,0
300	1,18±0,08	75,8±11,8	-	-

^a Relatív alvadási idő=a kezelt és nem kezelt állatokban mért alvadási idő hányadosa. A terápiás értekeket kiemeltük.

A találmány szerinti (I) vegyületeket az alábbi, trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére alkalmazzuk: mélyvénás trombózis, tüdőembólia, artériás trombózis, instabil angina, szívizomelhalás, pitvarfibrilláció, vala- 25 mint trombózis alapon létrejött stroke. Használhatók még érelmeszesedés esetén a koronáriaartéria és agyi artéria trombotikus megbetegedéseinek megelőzése céljából, magas rizikójú betegek sebészi profilaxisára, illetve egyéb sebészi profilaxisra. Ezenkívül alkalmaz- 30 hatók trombolízis vagy perkután transzluminális angioplasztika kapcsán az újraelzáródás megelőzésére, továbbá hemodialízis esetén és nefrózisszindróma kiegészítő terápiájára, valamint a vér fokozott alvadékonyságával együtt járó kórképekben: a rosszindulatú 35 daganatos és gyulladásos megbetegedésekben (például ízületi gyulladás), valamint cukorbetegségben. Alkalmazhatók továbbá olyan esetekben, amikor az egyéb antikoagulánsok adása nem elég hatékony vagy kontraindikált: például heparin esetében antitrombin-lll 40 hiánya vagy HIT (heparin indukálta trombocitopénia), kumarinok esetében például graviditás.

Gyógyászati célokra a jelen találmány szerinti vegyületeket és ezek gyógyászatilag elfogadható sóit alkalmazhatjuk önmagukban vagy célszerűen gyógy- 45 szerkészítmény formájában. Az ilyen készítmények szintén beletartoznak a jelen találmány oltalmi körébe.

E gyógyszerkészítmények hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületnek vagy gyógyászatilag elfogadható sójának a hatás kifejtéséhez szükséges 50 mennyiségét tartalmazzák a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott, önmagában ismert vivő-, töltőanyagok, hígítószerek és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagok kíséretében.

A fentieknek megfelelő vivő-, hígító-, illetve töltő- 55 anyagok például a víz, alkoholok, zselatin, laktóz, szacharóz, keményítő, pektin, magnézium-sztearát, sztearinsav, talkum, különböző állati vagy növényi olajok, valamint glikolok, például propilénglikol vagy polietilénglikol. A gyógyászati segédanyagok közé tartoznak a 60 tartósítószerek, különböző természetes vagy szintetikus emulgeáló-, diszpergáló- vagy nedvesítőszerek, színezőanyagok, ízjavító szerek, pufferálóanyagok, szétesést elősegítő szerek és más, a hatóanyag biológiai hasznosulását elősegítő anyagok.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a szokásos formákban lehetnek. Ilyen szokásos gyógyszerformák például az orális (szájon át adagolt) készítmények (tabletta, kapszula, por, pirula, drazsé vagy granulátum), valamint a parenterális (a gyomor- és bélrendszer megkerülésével adagolt) készítmények (injekciós vagy infúziós készítmények, a végbélkúp, tapasz vagy kenőcs).

Habár a jelen találmány szerinti vegyületeknek a gyógyászati hatás kifejtéséhez szükséges dózisa a kezelendő betegek egyéni állapotától és életkorától függ, ettől függően változhat, és végső soron a kezelőorvos határozza meg; az olyan betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére, amelyben kívánatos a trombin működésének és/vagy keletkezésének gátlása, általában e vegyületeknek a testtömeg 1 kg-jára számítva körülbelül 0,01 mg és körülbelül 1000 mg közötti, és előnyösen 0,25 mg és 20 mg közötti napi orális vagy parenterális, például intravénás dózisait használhatjuk.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek trombolitikumokkal (például tPA-val vagy urokinázzal) együtt adagolva hatékonyan segíthetik elő az artériákban vagy vénákban kialakult trombusok oldódását, illetve hatékonyan gátolhatják a trombusok újraképződését. Ilyen esetekben a találmány szerinti vegyületeket trombolitikumokkal egyidejűleg vagy a trombolitikus kezelést követően célszerű adagolni.

A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákon mutatjuk be, anélkül hogy a találmányt e példákra korlátoznánk.

A példákban megadott R_rértékeket rétegkromatográfiával határoztuk meg szilikagélen (DC-Alufolien Kieselgel 60 F₂₅₄, Merck, Darmstadt) az alábbi oldószerekben:

HU 224 315 Β1

1. Etil-acetát

2. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:20:6:11)

5. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (45:20:6:11)

6. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11)

7. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:10:3:5.5)

9. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (120:20:6:11)

13. Etil-acetát-butanol-ecetsav-víz (1:1:1:1)

A példákban megadott kapacitás faktor értékeket (k') „Pharmacia LKB analytical HPLC System Two” berendezéssel határoztuk meg az alábbiak szerint. Oszlop: „VYDAC C-18 reversed phase: 10 mm, 300 A,

4*250 mm”.

A puffer: 0,1% trifluor-ecetsav vízben.

B puffer: 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben.

Az alkalmazott gradiens 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett

I: 0-5 min. 0-25% B, majd izokratikus 25% B;

II: 0-30 min. 0-60% B.

Az eluátum peptidtartalmának detektálása UV fénnyel történt 214 nm-en. A minta töménysége 1 mg/ml A puffer, az injekciós térfogat 25 μΙ.

A HPLC analízisnél az alkalmazott gradienst (I vagy II), a példa egyes lépéseinél a rövidítés után zárójelben adjuk meg.

Az acil-arginin-aldehidek egyensúlyi formákban léteznek: aldehid és aldehid-hidrát, valamint két amino-ciklol formában.

Ezek közül az aldehid-hidrát és egy vagy mindkét amino-ciklol külön csúcsban jelenik meg a HPLC során. Ennek megfelelően az acil-arginin-aldehideket a talált két vagy három k'-értékkel jellemezzük a példákban.

Tömegspektroszkópia. A FAB pozitív ionizációs mérések Finnigan MÁT 8430 típusú készüléken történtek. A mintákat m-nitro-benzil-alkohol-mátrixban oldottuk fel, közvetlen mintabevezetéssel vittük be az ionforrásba. A peptidil-arginin-aldehidek spektrumában a molekulaion mellett az m-nitro-benzil-alkohol (NBA) oldószerrel képzett addíciós vegyület molekulaionja is megjelenik: [M+H]⁺, illetve [M+H+NBA]⁺. Ennek megfelelően adjuk meg a FAB tömegspektrum adatait a példákban. Az ESI pozitív ionizációs mérések VG Quattro (Fisons) típusú készüléken történtek. A mintákat 1 térfogat% hangyasavat tartalmazó 1:1 arányú acetonitril-víz elegyben oldottuk fel, majd 10 ml-es mintahurok alkalmazásával, a vivőfolyadék 15-25 ml/perc áramlási sebessége mellett áramoltattuk az ionforrásba.

A fajlagos forgatási értékeket ([a,]_D) 20 °C-on mértük.

1. példa

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-argininaldehid (Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-ox i-karbonil-L-arginin-laktám

3,28 g (8,4 mmol) /erc-butil-oxi-karbonil-NGbenxil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] szuszpendálunk 8 ml kloroformban, majd keverés és jeges hűtés mellett hozzáadunk 8 ml sósavas etil-acetátot (töménysége 0,11-0,15 g/ml). A Boc-csoport lehasadását rétegkromatográfiával követjük [R_f(9)=0,91 (Boc-vegyület); 0,07 (szabad vegyület)]. A reakció végén a szuszpenziót 16-18 ml dietil-éterrel hígítjuk, a kivált kristályos anyagot kiszűrjük, mossuk 5 ml acetonnal és 5 ml dietil-éterrel, majd mintegy két órán át szárítjuk vákuumexszikkátorban kálium-hidroxid mellett. A kapott N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám-klór-hidrátot feloldjuk 8 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra és az alábbi vegyes anhidridhez adjuk.

2,5 g (8 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolint [1. példa, E) lépés] feloldunk 8 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra, és keverés közben hozzáadunk 0,9 ml (8 mmol) N-metil-morfolint, 1,05 ml (8 mmol) klór-szénsav-izobutil-észtert, majd 10 perc keverés után az N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot tartalmazó fenti dimetil-formamidos oldatot, és végül 2,35 ml (16,8 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 30 percen át keverjük -10 °C-on, majd 1 órán át 0 °C-on. Ezt követően a sókat kiszűrjük, és a szűrletet hígítjuk 40 ml benzollal. A kapott oldatot mossuk 3*10 ml vízzel, 10 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal és 3x10 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott terméket 70 g Kieselgel 60-nal készített szilikagéloszlopon kromatografáljuk etil-acetátot alkalmazva eluensként. A terméket [R_f(1 )=0,50] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajos párlási maradékot petroléterrel eldörzsöljük. 3,0 g (64%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,5. [a]_D=-47,4° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (585 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-ox i-karbonil-L-arginín-aldehid

2,27 g (4,6 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutilD-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. példa, 1. lépés) feloldunk 15 ml tetrahidrofuránban, és keverés közben, -50 °C alatt hozzáadunk

3,6 mmol lítium-alumínium-hidridet tetrahidrofuránban oldva. A redukció előrehaladását rétegkromatográfiával követjük etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11) rendszerben, és szükség szerint adagolunk további lítium-alumínium-hidridet. A reakcióelegyhez hűtés és keverés mellett annyi hűtött 0,5 M kénsavat csepegtetünk, hogy a pH 3 legyen, majd 35 ml vízzel hígítjuk. A kapott oldatot 2*15 ml n-hexánnal kirázzuk, majd 3^χ20 ml metilén-kloriddal kivonatoljuk. A metilén-kloridos oldatokat egyesítjük, mossuk 3x15 ml vízzel, 15 ml hideg 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és 15 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 10 ml benzolban feloldjuk, majd ciklohexánnal kicsapjuk. A csapadékot szűrjük és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,8 g (65%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,30. [a]_D=-30,8° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (587 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

HU 224 315 Β1

3. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-ald ehid-hemiszulfát

1,58 g (2,7 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil- D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. példa, 2. lépés) feloldunk 14 ml etanolban, hozzáadunk 2,7 ml 0,5 M kénsavat és 3,2 ml vizet, majd 6 ml etanolban szuszpendált 0,17 g csontszenes palládiumkatalizátort, és kb. 10 °C-on hidrogénezzük. A reakció - aminek előrehaladását rétegkromatográfiával követjük - mintegy 15 perc alatt lejátszódik. A katalizátort kiszűrjük, és az oldatot 2,0-2,5 kPa nyomáson kb. 7-9 ml térfogatra töményítjük. A maradékot 20 ml vízzel hígítjuk, 6 ml metilén-kloriddal kirázzuk, és a vizes oldatot 24 órán át állni hagyjuk 20-22 °C-on. Ezt követően az oldat pH-ját 3,5-re állítjuk hidroxil ciklusú Dowex AG 1-X8 ioncserélő gyantával, majd lefagyasztjuk és liofilizáljuk. 1,0 g (78%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(5)=0,44. [a]_D=-75,5° (c=1; vízben). HPLC(I): k’=5,53; 6,20 és 7,17. A FAB tömegspektrum (453 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-3-ciklobutÍI-D-alanil-L-prolin (Eoc-D-Cba-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanin g (70 mmol) 3-ciklobutil-DL-alanint [A. Burger és munkatársai: J. Med. Chem. 6, 221 (1963)] feloldunk 70 ml 2 M nátrium-hidroxidban, lehűtjük +5 °C-ra, és keverés közben 11,1 ml (116,2 mmol) klór-szénsav-etil-észtert csepegtetünk hozzá. A keverést tovább folytatjuk 2 órán át hűtés mellett és 2 órán át hűtés nélkül. Ezután a reakcióelegyet 20 ml dietil-éterrel mossuk, majd 6 M sósavval pH=1-re savanyítjuk és 3*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített szerves fázisokat telített konyhasóoldattal mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajat a cím szerinti terméknek tekintjük [13,1 g (87%), R_f(7)=0,8], és változatlanul használjuk fel a következő lépéshez.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanin-metil-észter g (51 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanint [1. példa, A) lépés] feloldunk 100 ml metanolban, -15 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 10 ml (137 mmol) tionil-kloridot. A reakcióelegyet tovább keverjük hűtés nélkül. Amikor a hőmérséklet elérte a 20 °C-ot, a keverést még 2 óra hosszat folytatjuk. Az oldatot 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olajat feloldjuk 40 ml etil-acetátban, mossuk 10 ml 1 N sósavval, 2x10 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és 2x10 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson szárazra pároljuk. A kapott olajat a cím szerinti terméknek tekintjük [10,8 g (92%), R,(1 )=0,85; R_f(6)=0,65], és változatlanul használjuk fel a következő lépéshez.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanin-metil-észter

Az acil-aminosav-metil-észterek enzimes hidrolízisét 7,5-es pH-η végezzük automata titrátorban, melynek 100 ml-es és 250 ml-es reakcióedénye van, az adagolt reagens: 1 M nátrium-hidroxid.

A fenti B) lépésben kapott 10,8 g (47 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanin-metil-észtert feloldjuk 20 ml benzolban, belehelyezzük az automata titrátor 250 ml-es reakcióedényébe, és hozzáadunk 100 ml desztillált vizet. Erős keverés mellett az emulzió pH-ját 7,5-re állítjuk 1 M nátrium-hidroxiddal, hozzáadunk 40 mg enzimet [Subtilisin Carlsberg, Protease, Type Vili (Sigma)j, a pH-t ismét 7,5-re állítjuk, és ezen az értéken tartjuk a titrátor segítségével. Kb. 3 óra alatt megy végbe az etoxi-karbonil-3-ciklobutil-L-alanin-metil-észter hidrolízise. Ekkor a fázisokat elválasztjuk. A vizes fázisból különíthetjük el az etoxi-karbonil-3-ciklobutil-L-alanint. A benzolos fázist előbb 2x10 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és 2^x10 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az így nyert sárga olajat a cím szerinti terméknek tekintjük, és változatlanul használjuk fel a következő lépésben.

D) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanin

Az előző, C) lépésben kapott olajat feloldjuk 20 ml etanolban, és hozzáadunk 10 ml 2,5 M nátrium-hidroxidot. Az oldatot 2 órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 30 ml vízben feloldjuk, mossuk 10 ml dietil-éterrel, 3 M sósavval pH=1-re savanyítjuk, majd 3^χ10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, telített konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. 4,3 g (90%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában [R_f(2)=0,8j, melynek nagyobb részét közvetlenül felhasználjuk a példa E) lépésében, kisebb részét pedig kristályos sóvá alakítjuk az alábbi módon.

0,43 g (2 mmol) olajos etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanint feloldunk 10 ml dietil-éterben és hozzáadunk 0,23 ml (2,1 mmol) ciklohexil-amint, a kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,57 g (90%) etoxi-karbonil-3ciklobutil-D-alanin-ciklohexil-ammónium-sót kapunk. Olvadáspont: 129-131 °C. [a]_D=3,93° (c=1, metanolban). Elemzési eredmény a C₁₆H3₀N₂O₄ (314,42) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=61,12; H%=9,62; N%=8,91; talált; C%=61,3; H%=9,8; N%=8,6.

E) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolin

3,7 g (17,2 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanint [1. példa, D) lépés] feloldunk 60 ml tetrahidrofuránban, lehűtjük 0 °C-ra, majd hozzáadunk 4,85 g (24,5 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt és 5,06 g (24,5 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 2 óra hosszat keverjük hűtés nélkül. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, tetrahidrofuránnal mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 25 ml dietil-éter és petroléter 1:1 arányú elegyében oldjuk, a nem oldódó diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, a szűrletet ismét bepároljuk [a kinyert diciklohexil-karbamid: 4,9 g (89%) és 0,6 g (11%)]. Az így kapott olajszerű etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észtert 40 ml

HU 224 315 Β1 piridinben feloldjuk, és hozzáadunk 2,12 g (18,4 mmol) finoman elporított L-prolint, valamint 3,43 ml (24,6 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 3 óra hosszat keverjük, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 50 ml etil-acetát és 50 mM M sósav között megoszlatjuk. A szerves fázist előbb mossuk 10 ml 1 M sósavval és 2*10 ml vízzel, majd 3*100 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal kivonatoljuk. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 6 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, majd 3*20 ml dietil-éterrel kivonatoljuk. Az egyesített dietil-éteres oldatokat vízzel savmentesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után szárazra pároljuk.

3,2 g (60%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. [Rf(6)=0,49], A FAB tömegspektrum (313 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. példa

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-argini n-aldehid (Moc-D-Cba-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,64 g (4,2 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,25 g (4,0 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolinból [2. példa C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon végezzük arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával. A végterméket [Rf(1 )=0,55] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 1,15 g (50%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(2)=0,45-0,47. [a]_D=-43,5° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (571 [M+H]⁺, 724 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,06 g (1,8 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-Dalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot [2. példa, 1. lépés] az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagens és oldószer felhasználásával - redukálunk. 0,76 g (73%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(9)=0,47. [a]_D=-37,5° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (573 [M+H]⁺, 726 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-al dehid-hemiszulfát

0,69 g (1,2 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-Dalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet [2. példa, 2. lépés] az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,53 g (91%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(II): k'=4,74; 5,47 és 5,82. [a]_D=-60,9° (c=1; víz). A FAB tömegspektrum (439 [M+H]⁺, 592 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolin (Moc-D-Cba-Pro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanin

4,3 g (30 mmol) 3-ciklobutil-DL-alanint [A. Burger és munkatársai: J. Med. Chem. 6, 221 (1963)] feloldunk 15 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk párhuzamosan

16,5 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 2,55 ml (33 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A keverést folytatjuk fél órán át hűtés mellett és 2 órán át szobahőmérsékleten. Ezután a reakcióelegyet hígítjuk 40 ml vízzel, kirázzuk 10 ml dietil-éterrel, majd 3-as pH-ra savanyítjuk 3 M sósavval, és 4*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, 20 ml vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olajat a cím szerinti terméknek tekintjük [5,3 g (88%), R_f(7)=0,61], és változatlanul felhasználjuk a következő lépéshez.

B) lépés: Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanin

5,03 g (25 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanint [2. példa, A) lépés] az 1. példa B)-D) lépéseiben leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 2,22 g (11 mmol) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. [Rf(7)=0,61].

C) lépés: Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolin

1,21 g (6 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanint [2. példa, B) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 1,6 g (5,4 mmol, 90%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában [R_f(9)=0,48], melynek nagyobb részét közvetlenül felhasználjuk a példa 1. lépésében, kisebb részét pedig kristályos sóvá alakítjuk az alábbi módon.

0,30 g (1 mmol) olajos metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolint feloldunk 5 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 0,21 ml (1,05 mmol) diciklohexil-amint, a kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,43 g (90%) metoxi-karbonil-3ciklobutil-D-alanil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-sót kapunk. Olvadáspont: 149,5-164 °C. Elemzési eredmény a C26H4₅N₃O₅ (479,64) képletre vonatkoztatva: számított: C%=65,10; H%=9,46; N%=8,76;

talált: C%=60,4; H%=8,98; N%=10,47.

3. példa lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-ar ginin-aldehid (iPoc-D-Cba-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-ben zil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

0,43 g (1,1 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munka11

HU 224 315 Β1 társai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,33 g (1,0 mmol) izopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolinból [3. példa C) lépés] kiindulva az 1. példa

1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [R_f(1 )=0,55] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 0,3 g (50%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,55. A FAB tömegspektrum (599 [M+H]⁺, 752 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-N^G-ben zil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,26 g (0,43 mmol) izopropoxi-karbonil-3-ciklobutilD-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot [2. példa, 1. lépés] az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagens és oldószer felhasználásával - redukálunk. 0,15 g (58%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,30. A FAB tömegspektrum (601 [M+H]⁺, 754 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-argini n-aldehid-hemiszulfát

0,13 g (0,2 mmol) izopropoxi-karbonil-3-ciklobutilD-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet [2. példa, 2. lépés] az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,07 g (75%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,69; 4,15 és 5,04. A FAB tömegspektrum (467 [M+H]⁺, 620 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolin (iPoc-D-Cba-Pro) előállítása

A) lépés: 3-Ciklobutil-D-alanin

1,0 g (5 mmol) metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alaninhoz [2. példa, B) lépés] 10 ml 6 M sósavat adunk és 3 órán át forraljuk. Az oldatot 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot 5 ml vízben oldva még kétszer szárazra pároljuk. A víznyomokat etanol-benzol ledesztillálásával távolítjuk el. A maradék olajat 10 ml etanolban oldjuk, és 5 mmol 1,2-epoxi-propánt adunk hozzá. Hűtés után a csapadékot kiszűrjük, acetonnal és dietil-éterrel mosva 0,65 g (90%) 3-ciklobutil-D-alanint kapunk. R_f(13)=0,65. [<x]_D=-34,7° (c=1, 1 M sósavban). Elemzési eredmény a C₇H₁₃NO₂(314,42) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=58,71; H%=9,15; N%=9,78; talált: C%=58,7; H%=9,3; N%=9,5.

B) lépés: lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanin

0,57 g (4 mmol) 3-ciklobutil-D-alanint feloldunk 4 ml

M nátrium-hidroxid és 4 ml dioxán elegyében. Keverés és hűtés (0 °C) mellett párhuzamosan hozzácsepegtetünk 4 ml 1 M nátrium-hidroxidot és 4 ml izopropil-oxi-karbonil-kloridot 1 M-os toluolos oldatban, majd a keverést tovább folytatjuk 1 órán át 0 °C-on és 5 órán át szobahőmérsékleten. A reakcióelegyből a dioxánt és toluolt kidesztilláljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradék vizes oldatot 5 ml dietil-éterrel kirázzuk, majd 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk. A keletkezett emulziót 3*5 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. 0,83 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,60. [a]_D=+9,5° (c=0,5; metanolban).

C) lépés: lzopropoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolin

0,46 g (2 mmol) izopropoxi-karbonil-3-cíklobutil-D-alanint [3. példa, B) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 1,3 g (4,35 mmol, 87%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. R_f(2)=0,40. A FAB tömegspektrum (327 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

4. példa

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-L-argini n-aldehid (Eoc-D-Cpa-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-o xi-karbonil-L-arginin-laktám

2,93 g (7,5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,3 g (7,1 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolinból [4. példa, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [Rf(1 )=0,55] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük, szűrjük, n-hexánnal mossuk, majd exszikkátorban szárítjuk. 2,5 g (59%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,55. [a]_D=-48,6° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (599 [M+H]⁺, 752 [M+H+NBA]⁴) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-o xi-karbonil-L-arginin-aldehid

2,34 g (3,9 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D- alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (4. példa, 1. lépés] az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 1,75 g (74,7%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,42. [a]_D=-34,4° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (601 [M+H]⁺, 754 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-al dehid-hemiszulfát

1,59 g (2,65 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-Dalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (4. példa, 2. lépés] az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldó12

HU 224 315 Β1 szereket alkalmazva - alakítunk át. 1,13 g (83%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=4,76; 5,4 és 7,32. R_f(3)=0,37. [a]_D=-34,4° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (467 [M+H]⁺, 620 [M+H+NBAf) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolin (Eoc-D-Cpa-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanin

7,87 g (50 mmol) 3-ciklopentil-DL-alanint [P. R. Pál és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 78, 5116 (1956)] az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozásánál a végterméket 2^50 ml dietil-éterrel vonjuk ki. A dietil-éteres oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. 10,55 g (98%) cím szerinti terméket kapunk fehér amorf por formájában [Rf(2)=0,084)], amit változatlanul felhasználunk a következő lépésben.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanin

7,8 g (34 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanint [4. példa A) lépés] az 1. példa B), C) és D) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - átalakítunk. 3,45 g (88,6%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában [Rf(6)=0,62], melynek nagyobb részét közvetlenül felhasználjuk a példa C) lépésében, kisebb részét pedig kristályos diciklohexil-ammónium-sóvá alakítjuk az alábbi módon.

0,46 g (2 mmol) olajos etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanint feloldunk 10 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 0,42 ml (2,1 mmol) diciklohexil-amint, a kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,74 g (90%) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanin-diciklohexil-amin-sót kapunk. Olvadáspont: 138-140 °C. [a]_D=-1,5° (c=1, metanolban). Elemzési eredmény a C23H42N2O4 (410,58) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=67,28; H%=10,31; N%=6,81; talált: C%=67,4; H%=10,4; N%=6,8.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolin

2,43 g (10,5 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanint [4. példa, B) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - 2,4,5-triklór-fenil-észterré alakítva, majd 1,15 g (10 mmol) L-prolinnal kapcsolva

2,3 g (71%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában, [Rf(6)=0,53]. A FAB tömegspektrum (327 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

Kontrollvegyületek szintézise

1. szintézis

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid (Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés:

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-kar bonil-L-arginin-laktám

2,3 g (5,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,67 g (5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [1. szintézis, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon végezzük arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva. A végterméket [R_f(1 )=0,37] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot exszikkátorban szárítjuk. 1,18 g (60%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. A FAB tömegspektrum (607 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-kar bonil-L-arginin-aldehid

0,9 g (1,5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,33 g (36%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,16.

3. lépés:

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehidhemiszulfát

0,33 g (0,54 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanilL-prolil-N^G-benzi!-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. 0,26 g (92%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=4,0; 4,45 és 5,45. A FAB tömegspektrum (475 [M+H]⁺, 628 [M+H+NBAf) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Eoc-D-Phe-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin

16.5 g (0,1 mól) 3-fenil-D-alanint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozásánál a végterméket tartalmazó etil-acetát bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 14,6 g (55%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(9)=0,70.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-N-hidroxi-szukcinimid-észter

14.5 g (55,4 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [1. szintézis, A) lépés] és 6,4 g (56 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet feloldunk 60 ml tetrahidrofuránban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 11,5 g (56 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keverjük, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot benzollal kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, benzollal és dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 11,3 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(10)=0,53. [a]_D=+58,1° (c=1, dimetil-formamid). Elemzési eredmény a Ci₆H₁₈N₂O₆ (334,33) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,48; H%=5,42; N%=8,30;

talált: C%=57,4; H%=5,4; N%=8,3.

HU 224 315 Β1

A FAB tömegspektrum (335 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin

3,34 g (10 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alaninN-hidroxi-szukcinimid-észtert [1. szintézis, B) lépés] feloldunk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,15 g (10 mmol) L-prolint és 1,4 ml (10 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 10 órán át, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban és 10 ml dietil-éterben. A vizes fázist kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,6 g (77%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 141-143 °C. R_f(6)=0,40. Elemzési eredmény a 0₁₇Η₂₂Ν₂Ο₅ (334,33) képletre vonatkoztatva: számított: C%=61,06; H%=6,63; N%=8,38;

talált: C%=61,1; H%=6,7; N%=8,1.

A FAB tömegspektrum (335 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. szintézis

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid (Moc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés:

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-k arbonil-L-arginin-laktám

4,1 g (10,5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,88 g (9 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [2. szintézis, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a nyers végtermék elkülönítését. A nyers végterméket ciklohexánból történő kristályosítással tisztítjuk. 4,65 g (86%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 72-82,7 °C. R_f(2)=0,56.

[a]_D=+72,9° (c=1, tetrahidrofuránban).

A FAB tömegspektrum (593 [M+H]⁺, 746 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-k arbonil-L-arginin-aldehid

4,13 g (7 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (2. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén, a metilén-kloridos oldat bepárlása után kapott olajos terméket dietil-éterrel kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 3,06 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 103-107 °C. R_f(6)=0,44.

[a]_D=—69° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (595 [M+H]⁺, 748 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehi d-hemiszulfát

2,68 g (4,5 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (2. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. Ily módon 2,15 g (94%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,3; 3,57 és 4,09. [a]_D=-87,6° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (461 [M+H]⁺, 614 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Moc-D-Phe-Pro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-diciklohexil-ammónium-só g (30 mmol) D-fenil-alanint feloldunk 15 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 16,5 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 2,55 ml (33 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet fél órán át hűtés mellett és 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet hígítjuk 40 ml vízzel, kirázzuk 10 ml dietil-éterrel, majd 3-as pH-ra savanyítjuk 3 M sósavval, és 4*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 60 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 6 ml (30 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 11,5 g (28,5%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,56. Olvadáspont: 167-170 °C. [«]_D=-37,9° (c=0,5, etanolban).

Elemzési eredmény a C23H₃₆N₂O4 (404,53) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=68,28; H%=8,97; N%=6,92. talált: C%=68,3; H%=9,15; N%=6,75.

B) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észter

11,3 g (28 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [2. szintézis, A) lépés] feloldunk 75 ml etil-acetátban és

30,5 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson mintegy 15 ml térfogatra töményítjük. A maradék oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 5,5 g (28 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 5,75 g (28 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olajos végterméket etanolból kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 6,86 g (61%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 109-110 °C. R_f(4)=0,84.

HU 224 315 Β1

Elemzési eredmény a C₁₇H₁₄NO₄Cl3 (402,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=50,70;H%=3,50; N%=3,48; Cl=26,42; talált: C%=50,8; H%=3,2; N%=3,4; Cl=26,6.

C) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin

4,83 g (12 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észtert [2. szintézis, B) lépés] feloldunk 12 ml piridinben, hozzáadunk 1,38 g (12 mmol) L-prolint és 1,68 ml (12 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 40 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban, és az oldatot kirázzuk 3*7 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 7 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk, a kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 3,05 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 154-157 °C. R_f(2)=0,47.

A FAB tömegspektrum (321 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. szintézis

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolil-L-argini n-aldehid (Eoc-DL-Cba-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolil-N^G-benzil-o xi-karbonil-L-arginin-laktám

1,35 g (3,46 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,03 g (3,3 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolinból [3. szintézis, A) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [R_f(1 )=0,50] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük, szűrjük, n-hexánnal mossuk, majd exszikkátorban szárítjuk. 1,0 g (51%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,50. Az ESI tömegspektrum (585 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolil-N^G-benzil-o xi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,94 g (1,6 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DLalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (3. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,64 g (68%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,30. Az ESI tömegspektrum (587 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolil-L-arginin-al dehid-hemiszulfát

0,59 g (1,0 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DLalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (3. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. 0,39 g (78%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k-5,55; 6,27 és 7,09. A FAB tömegspektrum (453 [M+H]⁺,

606 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolin (Eoc-DL-Cba-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanil-L-prolin

1,13 g (5,25 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklobutil-DL-alanint [1. példa, A) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - 2,4,5-triklór-fenil-észterré alakítunk, majd 0,58 g (5,0 mmol) L-prolinnal kapcsolunk. Ily módon 1,1 g (71%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. R_f(6)=0,53. Az ESI tömegspektrum (313 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

4. szintézis

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolil-L-argin in-aldehid (Eoc-DL-Cpa-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktám

3,7 g (9,5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,94 g (9,0 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolinból [4. szintézis, A) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [Rf( 1 )=0,55] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük, szűrjük, n-hexánnal mossuk, majd exszikkátorban szárítjuk. 2,87 g (54%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,55. Az ESI tömegspektrum (599 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolil-N^G-benziloxi-karbonil-L-arginin-aldehid

2,75 g (4,6 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DLalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (4. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 1,74 g (64%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,42. Az ESI tömegspektrum (601 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés:

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolil-L-argininaldehid-hemiszulfát

1,2 g (2,0 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DLalanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehi15

HU 224 315 Β1 det (4. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - átalakítunk. Ily módon 0,8 g (78%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,96; 4,4 és 4,92. A FAB tömegspektrum (467 [M+H]⁺, 620 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolin (Eoc-DL-Cpa-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanil-L-prolin

3.1 g (13,5 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklopentil-DL-alanint [4. példa, A) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - 2,4,5-triklór-fenil-észterré alakítunk, majd L-prolinnal kapcsolunk. Ily módon 3,1 g (74%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában, [R_f(6)=0,5]. Az ESI tömegspektrum (327 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

5. szintézis

Etoxi-karbonil-DL-ciklobutil-glicil-L-prolil-L-arginin-a

Idehid (Eoc-DL-Cbg-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1.2 g (3,0 mmol) terc-butoxi-karbonil-N^G-benzil-oxikarbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J, Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,69 g (2,3 mmol) etoxi-karbonil-DL-ciklobutil-glicil-L-prolinból [5. szintézis, A) lépés] kiindulva az 1. példa 1., 2. és 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását a megfelelő védett tripeptid-laktámmá [R_f(1 )=0,32], ennek redukcióját védett tripeptid-aldehiddé [Rf(9)=0,53], valamint a védőcsoport eltávolítását. Ily módon 0,22 g cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k-2,74; 2,96 és 3,41. A FAB tömegspektrum (439 [M+H]⁺, 592 [M+H+NBAf) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő.

Etoxi-karbonil-DL-ciklobutil-glicil-L-prolin (Eoc-DL-Cbg-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-DL-ciklobutil-glicil-L-prolin

0,78 g (6,0 mmol) DL-ciklobutil-glicint [T. H. Porter és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 179, 266 (1977)] az 1. példa A) és E) lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk [R_f(7)=0,60], 2,4,5-triklór-fenil-észterré alakítunk [R_f(4)=0,84], majd L-prolinnal kapcsolunk. Ily módon 0,68 g (50%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. R_f(2)=0,17 és 0,22. A FAB tömegspektrum (299 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

Módszerek M1. módszer

Plazmaalvadék készítése

a) Lemezkedús plazmát (PRP) készítünk olyan módon, hogy humán vér és 3,8%-os nátrium-citrát-víz(1 /2) 9:1 arányú elegyét 240*g-n centrifugáljuk 5 percig.

b) Egy-egy reakcióedénybe 200 μΙ PRP-t teszünk, hozzáadunk 80 μΙ 40 mM-os kalcium-kloridot, és állni hagyjuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A kialakult plazmaalvadékot 6*2 ml 0,9%-os nátrium-kloriddal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt enzimeket (Xa faktor és trombin) eltávolítsuk. A mosófolyadék trombintartalmát a következő módon határozzuk meg.

c) 400 μΙ mosófolyadékhoz 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot adunk, 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. Az elegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). Eredményes mosás esetén az extinkció értéke kisebb, mint a kontroll 5%-a.

M2. módszer

Plazmaalvadékba zárt Xa faktor gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból 0,1-1,0-10 és 100 μg/ml-es oldatot készítünk 0,1 M Tris-pufferrel, mely 0,02% humán albumint tartalmaz, pH=8,5.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 2 mM-os Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót.

c) Minden reakcióelegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). A kontrolihoz viszonyított, átlagolt extinkcióértékekből grafikusan meghatározzuk az 50%-os gátláshoz szükséges peptidkoncentrációt (ic₅₀).

M3. módszer

Plazmaalvadékba zárt trombin gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból oldatokat készítünk az M2. módszer a) pontjában leírtak szerint.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. A továbbiakban az M2. módszer c) pontja szerint járunk el.

M4. módszer

Fibríngél készítése

a) Egy-egy reakcióedénybe 200 μί 6 mg/ml-es humán fibrinogént (SIGMA), 25 μΙ 25 NIH E/ml-es

HU 224 315 Β1 humán trombint (SIGMA) és 40 μΙ 100 mM-os kalcium-kloridot teszünk, és állni hagyjuk 1 órán át 20-22 °C-on. A kialakult fibringélt 3*2 ml fiziológiás konyhasóoldattal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt 5 trombint eltávolítsuk. A mosás eredményességét az M1. módszer c) pontja szerint ellenőrizzük.

M5. módszer

Fibringélhez kötött trombin gátlásának meghatározása 10

a) A peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 pg/ml-es oldatot készítünk Hepes/NaCI pufferrel (0,01 M Hepes és 0,1 M nátrium-klorid, pH=7,4).

b) A továbbiakban az M3. módszer b) pontja szerint járunk el. 15

M6. módszer

Xa faktor gátlásának mérése oldatban 96 lyukú lemezen (96-well microtitre plate)

a) A Xa faktorból (humán, SIGMA) 1,3 E/ml-es, a peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 pg/ml-es oldatokat készítünk foszfátpuferrel (0,1 M nátrium-foszfát és 0,05 M nátrium-klorid, pH=7,4). A Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztrátból 0,33 nM-os desztillált vizes oldatot használunk.

b) A kontroliból és minden egyes peptidoldatból 3-3 reakcióelegyet készítünk. A lemez mélyedésébe teszünk 30 μΙ peptidet, illetve kontrollként puffért, 30 μΙ Xa faktort, 90 μΙ puffért és 150 μΙ szubsztrátot, majd 10 perc múlva 405 nm-en leolvassuk az extinkcióértékeket. A továbbiakban az M2. módszer

c) pontja szerint járunk el.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) általános képletű új peptidil-arginin-aldehid-származékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése 3-ciklobutil-D-alanin- vagy 3-ciklopentil-D-alanin-gyök,

Pro jelentése L-prolin-gyök és Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói.
2. Etoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
3. Metoxi-karbonil-3-ciklobutil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
4. Etoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
5. Metoxi-karbonil-3-ciklopentil-D-alanil-L-prolil-Larginin-aldehid és savaddíciós sói.
6. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületet, ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy ennek valamely gyógyászatilag elfogadható sóját - tartalmazza, a gyógyászatban szokásosan alkalmazott oldó-, hígító-, hordozó- és töltőanyagok kíséretében.
7. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott gyógyszerként való alkalmazásra.
8. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - alkalmazása trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.