HU222810B1 - Interleukin-1 inhibitors - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát tisztított, az interleukin–1 alfa és interleukin–1béta közül legalább az egyikkel szemben aktív in- terleukin–1-inhibitorok (IL–1i) képezik, továbbá az ezeket kódoló DNS-szekvenciák,a DNS-szekvenciákat tartal- mazó vektorok és rekombináns gazdasejtek.A találmány szerinti megoldás az interleukin–1-gyel kapcsolatosrendellenességek kezelése és megelőzése területén alkalmazható. ŕThe present invention relates to purified interleukin-1 alpha and interleukin-1beta-active interleukin-1 inhibitors (IL-1i), and to DNA sequences encoding them, vectors containing DNA sequences. and recombinant host cells. The present invention is applicable to the treatment and prevention of interleukin-1 related disorders. ŕ

Description

A találmány tárgya interleukin-l-inhibitorok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, a szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS-vektorok, a vektort tartalmazó gazdasejtek és rekombináns GT-10-IL-li-2a DNS-molekula.The present invention relates to interleukin-1 inhibitors, DNA sequences encoding them, recombinant DNA vectors containing the sequences, host cells comprising the vector, and recombinant GT-10-IL-li-2a DNA molecule.

A) IL-1A) IL-1

Az interleukin-l-ek a fehérjéknek számos sejttípus, köztük monociták és egyes makrofágok által előállított csoportja. Ez a csoport legalább két 17-18 kilodalton molekulatömegű fehérjét foglal magában, amelyek interleukin-1 a és interleukin-1 β néven ismertek. Ezek a fehérjék számos, a gyulladásos folyamatokban és az immunválaszokban szerepet játszó különböző célsejtekre fontos fiziológiás hatást fejtenek ki. Ezek a fehérjék a T-sejtekre komitogének (fitohemagglutininnel), a kötőszöveti sejteket és a porcsejteket látens kollagenáz kiválasztására késztetik, továbbá növelik az endothelialis sejteknek a neutrofil sejtek iránti felületi tapadóerejét. Ezenkívül a hypothalamusra pirogénként hatnak, fokozzák az izomfehérje katabolizmusát, és a hepatocitákat a fehérjék-egy „akut fázis reaktáns” néven ismert csoportjának szintetizálására késztetik. így az interleukin-l-ek (IL-1) nyilvánvalóan fontos szerepet játszanak a szervezet fertőzéssel és sérüléssel szembeni válaszában.Interleukin-1 is a group of proteins produced by many cell types, including monocytes and certain macrophages. This group includes at least two 17-18 kilodalton proteins known as interleukin-1α and interleukin-1β. These proteins exert important physiological effects on a variety of target cells involved in the inflammatory processes and immune responses. These proteins induce the secretion of T-cells by comitogens (phytohemagglutinin), connective tissue cells and chondrocytes, and increase the surface adhesion of endothelial cells to neutrophils. In addition, they act as a pyrogen on the hypothalamus, increase catabolism of muscle protein, and induce hepatocytes to synthesize a group of proteins known as 'acute phase reactants'. Thus, interleukin-1 (IL-1) obviously plays an important role in the body's response to infection and injury.

B) Az IL-1 patológiás szerepeB) Pathological role of IL-1

Szokásosan jótékony hatása ellenére azonban ismeretessé váltak olyan körülmények, amelyek mellett az IL-1 káros hatású. Például az IL-1 növelheti a kollagenáz szintjét a gyulladásos ízületben, és a reumatoid arthritis immunpatológiájának mind akut, mind krónikus szakaszában mediátorként vehet részt. Az IL-1 felelős lehet az endothelialis sejtek működésének megváltozásáért, a leukociták és limfociták kemotaxisának irányításával és az ízületi szövetbe való vándorlásuk irányításával, hajszálérburjánzás kiváltásával, és a makrofágoknak az ízületi burokban való felgyűlésének fokozásával a betegség akut fázisa során. A szövetpusztulás fázisában az IL-1 mediátorként vesz részt a kötőszöveti és porcsejtekből felszabaduló enzimek stimulálása révén a szövetkárosodás kiváltásában.However, despite its usual beneficial effects, the circumstances under which IL-1 is harmful have become known. For example, IL-1 can increase collagenase levels in the inflamed joint and act as a mediator in both the acute and chronic stages of the immune pathology of rheumatoid arthritis. IL-1 may be responsible for altering the function of endothelial cells, directing leukocyte and lymphocyte chemotaxis, and controlling their migration into joint tissue, inducing capillary proliferation, and enhancing macrophage assembly in the synovial envelope. In the phase of tissue destruction, IL-1 acts as a mediator in the induction of tissue damage by stimulating enzymes released from connective tissue and cartilage cells.

Túlzott IL-1-termelést mutattak ki továbbá pszoriázisban szenvedő betegek bőrében, és magas IL—1szinteket találtak pszoriázisos arthritisben szenvedő betegek ízületi folyadékában. A pszoriázisos arthritisben szenvedő betegek gyulladt ízületében lévő sejtek által szabaddá tett IL-1 szövetpusztulást közvetíthet azáltal, hogy fokozza enzim szabaddá válását más sejtekből. A Reiter-féle szindróma ízületi patológiája hasonló ahhoz, amit pszoriázisos arthritis és reumatoid arthritis esetén észlelünk. A gyulladásos arthritisek e három különböző formájában az IL-1 a szövetpusztulásban mediátorként vesz részt. IL-1 található továbbá az osteoarthritisben szenvedő betegek ízületi folyadékában is. A porcsejtek által felszabadított IL-1 ebben a betegségben részt vesz az ízületi porcok pusztításában.Excessive IL-1 production has also been detected in the skin of patients with psoriasis, and high levels of IL-1 have been found in the synovial fluid of patients with psoriatic arthritis. IL-1 released by cells in inflamed joints of patients with psoriatic arthritis may mediate tissue destruction by enhancing the release of enzyme from other cells. The joint pathology of Reiter's syndrome is similar to that seen in psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis. In these three forms of inflammatory arthritis, IL-1 acts as a mediator of tissue destruction. IL-1 is also found in the joint fluid of patients with osteoarthritis. IL-1 released by cartilage cells is involved in the destruction of articular cartilage in this disease.

Az IL-1 növelheti az autoimmun betegségek súlyosságát is. Például szisztémás lupus erithemában szenvedő betegek perifériás vérsejtjeiben csökkent IL-1-termelést észleltek. Továbbá, a B-limfocita-fiinkcióban bekövetkező bizonyos változások kapcsolatosak lehetnek az IL-l-termelés vagy az IL-1 hozzáférhetőségének rendellenességeivel.IL-1 can also increase the severity of autoimmune diseases. For example, patients with systemic lupus erythema have been shown to have reduced IL-1 production in peripheral blood cells. Further, certain changes in B lymphocyte function may be related to abnormalities in IL-1 production or availability of IL-1.

Túlzott IL-l-termelést észleltek bőrkeményedéses betegek perifériás monocitáiban, és az IL-l-et a kötőszöveti sejtek kollagéntermelésének fokozása révén a fibrózis egy lehetséges okozójaként említették. A dermatomyositisben bekövetkező szövetkárosodás mechanizmusa ugyancsak kapcsolatos lehet sejt által közvetített immunitással, ezért az IL-1 ebben a patofiziológiás folyamatban mediátorként vehet részt.Excessive IL-1 production has been observed in peripheral monocytes of patients with dermatitis, and IL-1 has been identified as a potential cause of fibrosis by increasing collagen production of connective tissue cells. The mechanism of tissue damage in dermatomyositis may also be related to cell-mediated immunity, and therefore IL-1 may be involved as a mediator in this pathophysiological process.

Az akut és krónikus szövetközi tüdőbetegségre a tüdő kötőszöveti sejtjeinek fokozott kollagéntermelése jellemző, amit az IL-1 fokozhat. Fokozott kisvérköri nyomás állatmodellen való legújabb vizsgálatai azt mutatják, hogy az IL-1 felelős lehet az endothelialis sejtek változásának kiváltásáért, ami a tüdőartériák szűkülésével jár. Ez a szűkülés az oka a fokozott kisvérköri nyomás bekövetkezésének, és további másodlagos károsodásoknak. így az IL-l-inhibitorok az ilyen tüdőbetegségek kezelésében hasznosak lehetnek.Acute and chronic interstitial lung disease are characterized by increased collagen production of lung connective tissue cells, which may be enhanced by IL-1. Recent studies in animal models of hypertension have shown that IL-1 may be responsible for inducing endothelial cellular changes, which are associated with narrowing of the pulmonary arteries. This narrowing is the cause of increased blood pressure in the blood and further secondary damage. Thus, IL-1 inhibitors may be useful in the treatment of such lung diseases.

A legújabb vizsgálatok alapján azt ismertették, hogy az IL-1 képes az inzulintermelésben részt vevő Langerhans-szigetek β-sejtjeinek közvetlen károsítására. Feltételezések szerint az IL-1 sejtkárosító hatása a fiatalkori diabetes mellitus akut fázisának elsődleges eseménye.Recent studies have shown that IL-1 is capable of directly damaging the β-cells of the Langerhans Islands involved in insulin production. The cellular damage of IL-1 is thought to be the primary event in the acute phase of juvenile diabetes mellitus.

Az akut és krónikus glomerulonephrítis számos formájában a monociták és makrofágok vesékbe való beszűrődése jut érvényre. Ezen sejtek IL-1-kibocsátása okozhatja az egyéb gyulladásos sejtek helyi felszaporodását, ami végül a vesékben fibrotikus reakciókhoz és gyulladásos károsodáshoz vezet.In many forms of acute and chronic glomerulonephritis, monocytes and macrophages infiltrate the kidneys. IL-1 release from these cells can cause localized proliferation of other inflammatory cells, which ultimately leads to fibrotic reactions and inflammatory damage in the kidneys.

Kimutatták, hogy köszvény és pszeudoköszvény esetén a szövetekben vagy folyadékokban található kristályok közvetlenül fokozzák a makrofágok IL-1-felszabadítását. így ezekben a betegségekben az IL-1 a gyulladásos ciklus fontos mediátora lehet.Crystals in tissues or fluids have been shown to directly increase macrophage IL-1 release in gout and pseudo gout. Thus, in these diseases, IL-1 can be an important mediator of the inflammatory cycle.

Az IL-1 képes a csontok kalciumvesztésének kiváltására, és gyulladásos ízületi betegségeknél előforduló oszteoporózisért felelős lehet.IL-1 is capable of inducing calcium loss in bone and may be responsible for osteoporosis in inflammatory joint disease.

A pszoriázisban szenvedő betegek keratinocitái nagy mennyiségű IL-l-et szabadítanak fel. Ez a mediátor lehet felelős azért a másodlagos sejtburjánzásért és -felszaporodásért, ami az ebben a betegségben szenvedő betegek bőrén bekövetkezik.Keratinocytes from patients with psoriasis release large amounts of IL-1. This mediator may be responsible for the secondary cell proliferation and proliferation that occurs in the skin of patients suffering from this disease.

Az IL-1 a fontos endogén pirogének egyike, és felelős lehet bizonyos fertőzéses betegségekben bekövetkező láz jelentős részének kiváltásában, például baktériumok vagy vírusok okozta akut lázas betegségek esetén.IL-1 is one of the important endogenous pyrogens and may be responsible for inducing a significant proportion of fever in certain infectious diseases, such as acute fever diseases caused by bacteria or viruses.

A szarkoidózisra a test sok különböző szervében bekövetkező granulomás elváltozás jellemző. Az IL-1 képesnek bizonyult arra, hogy in vitro granulomaképződést váltson ki, és részt vehet ebben a folyamatban szarkoidózisban szenvedő betegek esetén.Sarcoidosis is characterized by granulomatous lesions in many different organs of the body. IL-1 has been shown to be able to induce granuloma formation in vitro and to participate in this process in patients with sarcoidosis.

A perifériás monociták fokozott IL-l-termelését figyelték meg mind Crohn-féle kórban, mind fekélyes colitisben. Az IL-1 bélben történő helyi felszabadulása ezen betegségek gyulladásos ciklusa fokozásában fontos mediátor lehet.Increased IL-1 production of peripheral monocytes has been observed in both Crohn's disease and ulcerative colitis. Local release of IL-1 into the intestine may be an important mediator in enhancing the inflammatory cycle of these diseases.

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

Egyes limfomákra láz, oszteoporózis, továbbá szekunder arthritis is jellemző. Egyes limfomasejtek esetén in vitro fokozott IL-l-kiválasztást észleltek, ezek felelősek lehetnek ezen rosszindulatú betegség egyes klinikai tüneteiért. Ugyancsak egyes malignans limfociták által termelt IL-1 lehet felelős a leukémiák esetében jelentkező láz, akut fázisbeli válasz és leromlás bekövetkeztéért.Some lymphomas are characterized by fever, osteoporosis and secondary arthritis. Increased IL-1 secretion has been observed in some lymphoma cells in vitro and may be responsible for some of the clinical symptoms of this malignancy. Also, IL-1 produced by some malignant lymphocytes may be responsible for fever, acute phase response, and degeneration in leukemias.

Az agyban lévő asztrociták IL-1-kibocsátását tartják felelősnek a fibrózis kiváltásában, ami érelzáródás folytán az agy károsodását eredményezheti.IL-1 release from astrocytes in the brain is thought to be responsible for triggering fibrosis, which can result in brain damage due to vascular occlusion.

C) IL-1-inhibitor alkalmazásaC) Use of an IL-1 inhibitor

A fenti és egyéb olyan körülmények esetén, amelyekben az IL-1 káros hatást fejt ki, nyilvánvalóan klinikáikig hasznosítható az IL-l-inhibitor hatás. Mivel az IL-1 a T-sejtek komitogénje, központi szerepe van az autoimmun és egyéb immunbetegségek kifejlődésében, így szisztémásán adagolva az IL-1-inhibitorok hasznos immunszupresszív szerek lehetnek. Helyi alkalmazás esetén az ilyen IL-1-inhibitorok a gyulladt ízület és más gyulladásos helyek szövetkárosodásainak megelőzésére szolgálhatnak. Valójában a szövetkárosodások megelőzésére egyes IL- 1-inhibitorok még hatékonyabban alkalmazhatók kollagenázinhibitorokkal együttesen.In the foregoing and other conditions in which IL-1 exerts its deleterious effects, the effect of IL-1 inhibition will obviously be useful to their clinics. Because IL-1 is a T-cell comitogen, it plays a central role in the development of autoimmune and other immune disorders, and, when administered systemically, IL-1 inhibitors may be useful immunosuppressive agents. When used topically, such IL-1 inhibitors may serve to prevent tissue damage to the inflamed joint and other sites of inflammation. In fact, some IL-1 inhibitors can be used more effectively in combination with collagenase inhibitors to prevent tissue damage.

Az IL-1 hatásába való terápiás beavatkozás lehetséges a szintézis, a kiválasztás, a célsejt kötődése vagy a fehérjére adott válasz szintjén. Az IL-l-et a monocita/makrofág és egyéb sejtek szintetizálják lipopoliszacharidokra, komplementfragmentumokra és vírusokra adott válaszként. Minden olyan molekula, amely megakadályozza ezeknek az indukálószereknek a termelősejtekhez való kötődését, vagy amelyik ezen sejtek fiziológiájára kifejtett hatásukba beleavatkozik, az IL-1-hatás regulátoraként szolgálhat. Az IL-1 nem egy hagyományos kiválasztórendszer révén választódik ki, mivel az izolált mRNS-ek, amelyek a fehérjéknek legalább két 30 kD-os prekurzorát kódolják, nem tartalmaznak hidrofób szignálszekvenciát. Az aktív feltétjének az inaktív prekurzorból való szabaddá válásához valószínűleg ennek a prekurzomak a proteolízise szükséges. Elméletileg egy olyan inhibitor, amely gátolja az IL-1 vagy IL-l-ek prekurzoraikból való felszabadulását, szabályozhatná az IL-1-hatást. Az IL-1 feltehetően egy klasszikus, receptor által közvetített úton hat a célsejtekre, bár ezt a receptort még nem izolálták. így lehetséges, hogy egy olyan molekula, amely megakadályozza az IL-1-nek a receptoraihoz való kötődését, szabályozhatja az IL-l-hatást is. Továbbá, bár még nem teljesen ismertek a receptorkötődést követő intracelluláris események, lehetséges, hogy léteznek olyan szerek, amelyek megakadályozhatják a sejteknek más receptor által közvetített eseményekre való válaszát, és így gátolhatják az IL-l-hatást. A fentiek folytán feltételeztük, hogy fehéqék és más kis molekulák képesek lehetnek az IL-1 egy vagy több ilyen módon való hatásának gátlására.Therapeutic interference with IL-1 activity is possible at the level of synthesis, excretion, target cell binding or protein response. IL-1 is synthesized by monocyte / macrophage and other cells in response to lipopolysaccharides, complement fragments and viruses. Any molecule that prevents the binding of these inducers to production cells or that interferes with their effect on the physiology of these cells can serve as a regulator of IL-1 activity. IL-1 is not secreted through a conventional selection system, since the isolated mRNAs encoding at least two 30 kD protein precursors do not contain a hydrophobic signal sequence. Proteolysis of this precursor is probably required to release its active attachment from the inactive precursor. In theory, an inhibitor that inhibits the release of IL-1 or IL-1 from their precursors could regulate the effect of IL-1. IL-1 is thought to act through a classical receptor-mediated pathway to target cells, although this receptor has not yet been isolated. Thus, it is possible that a molecule that prevents the binding of IL-1 to its receptors may also regulate the action of IL-1. Furthermore, although intracellular events following receptor binding are not yet fully known, there may be agents that may prevent cells from responding to other receptor-mediated events and thus inhibit IL-1 activity. Therefore, it has been suggested that whites and other small molecules may be capable of inhibiting one or more of the effects of IL-1 in this manner.

Nem várt módon legalább két ilyen IL- 1-gátló fehérjét találtunk, amelyek IL-1-gátló tulajdonságokkal bírnak. Ezeket a molekulákat olyan tisztított formában nyertük ki, amelyek szakembert képessé tesznek arra, hogy meghatározza aminosavszekvenciájukat. Továbbá, egy olyan sejtkészítményt jellemeztünk, amely ezeket a fehérjéket termeli, és egy olyan mRNS-t, amely ezeknek a szintéziséhez vezet. Végül, antiszérumot fejlesztettünk ki, amely megkönnyíti a cDNS expressziós könyvtárak átvizsgálását olyan gének keresésére, amelyek ezeket az inhibitorokat kódolják. Ezek a reagensek együtt lehetővé teszik a klónozandó IL-l-inhibitorokat kódoló cDNS-ek nyerését. Ezek a gének továbbá lehetővé teszik az IL-1 által közvetített patofiziológiás állapotok kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekben használható IL-1-inhibitorok nagyléptékű termelését.Unexpectedly, at least two such IL-1 inhibitory proteins have been found which possess IL-1 inhibitory properties. These molecules were obtained in a purified form which enables one skilled in the art to determine their amino acid sequence. Furthermore, a cellular composition that produces these proteins and an mRNA that leads to their synthesis have been characterized. Finally, an antiserum was developed to facilitate screening of cDNA expression libraries for genes encoding these inhibitors. Together, these reagents allow the production of cDNAs encoding the IL-1 inhibitors to be cloned. These genes further enable large-scale production of IL-1 inhibitors useful in pharmaceutical compositions for the treatment of IL-1 mediated pathophysiological conditions.

A találmány tárgya IL- 1-inhibitorok („IL- li”) általában, és különösen monocitaeredetű IL-1-inhibitorok. A találmány tárgyát képezik még ezen inhibitorok biológiailag aktív analógjai, valamint az inhibitorokat és analógjaikat kódoló DNS-szekvenciák.The present invention relates to IL-1 inhibitors ("IL-1") in general, and monocyte-derived IL-1 inhibitors in particular. The invention also provides biologically active analogs of these inhibitors and DNA sequences encoding the inhibitors and analogs thereof.

A találmány tárgya az IL-Ία vagy IL-Ιβ vagy ezek kombinációja ellen hatásos IL-1-inhibitorok tisztított formában való előállítása. A találmány további célja ezen inhibitorok olyan tiszta formában való előállítása, amely lehetővé teszi aminosavszekvenciájuk megállapítását. A találmány célja továbbá bizonyos IL- 1-inhibitorok aminosavszekvenciájának meghatározása. A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen IL-1-inhibitorok olyan biológiailag aktív analógjainak azonosítása, amelyek azonos vagy fokozott tulajdonságokkal bírnak.The present invention relates to the preparation of purified IL-1 inhibitors effective against IL-Ία or IL-Ιβ or a combination thereof. It is a further object of the present invention to provide these inhibitors in pure form which allows their amino acid sequence to be determined. It is another object of the present invention to determine the amino acid sequence of certain IL-1 inhibitors. The invention further relates to the identification of biologically active analogs of such IL-1 inhibitors having the same or enhanced properties.

A találmány tárgya továbbá az ismertetett IL-1-inhibitorok termelésére szolgáló rekombináns DNS-rendszer. A találmány tárgya még olyan tisztított IL- 1-inhibitorok, amelyek IL-1 ellen hatásos gyógyászati készítmények hatóanyagaiként használhatók.The invention also relates to a recombinant DNA system for the production of the described IL-1 inhibitors. The invention also relates to purified IL-1 inhibitors which are useful as active ingredients in pharmaceutical compositions effective against IL-1.

A találmány további tárgyai és előnyei a leírás további részében találhatók, vagy abból nyilvánvalóvá válnak, vagy a találmány gyakorlatából ismerhetők meg.Other objects and advantages of the invention will be apparent from, or become apparent from, the remainder of the specification.

A találmány céljának elérése érdekében olyan IL-1inhibitorokat ismertetünk, amelyek IL-1 ellen gátló hatást fejtenek ki. Az előnyös inhibitorokat tisztított formában izoláltuk monocitakondicionált tápközegből, ahol a monocitákat IgG-bevonatú lemezeken tenyésztettük.In order to achieve the object of the present invention, inhibitors of IL-1 which inhibit IL-1 are described. Preferred inhibitors were isolated in purified form from monocyte-conditioned media, wherein the monocytes were cultured on IgG-coated plates.

A találmány szerinti előnyös inhibitorok az 1, 2 és 3 inhibitorok. Az 1 és 2 inhibitorok olyan fehéijék, amelyek nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid-gélelektroforézis (SDS-PAGE) végzésekor a 22-23 kDa fehérjéknek jellemző helyzetig futnak, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 52 mmol/l-es, illetve 60 mmol/l-es nátrium-kloriddal eluálhatók. A 3 inhibitor SDS-PAGE elvégzésekor egy 20 kDa fehérjének jellemző helyig fut, és Mono Q FPLC oszlopról megszabott körülmények között 48 mmol/l-es nátriumkloriddal eluálható. A találmány céljának elérésére a találmány magában foglal egy olyan gyógyászati készítményt is, amely legalább egy, a találmány szerinti IL-l-inhibitort vagy biológiailag aktív analógját tartalmazza.Preferred inhibitors of the invention are inhibitors 1, 2 and 3. Inhibitors 1 and 2 are proteins that run at the position typical of 22-23 kDa proteins when performing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and are 52 mM and 60 mM respectively under mono Q FPLC column conditions. They may be eluted with mmol / l sodium chloride. The 3 inhibitor runs on SDS-PAGE up to a typical site of a 20 kDa protein and can be eluted from the Mono Q FPLC column with 48 mM NaCl under standard conditions. To achieve the object of the invention, the invention also includes a pharmaceutical composition comprising at least one IL-1 inhibitor or a biologically active analog of the invention.

A találmány céljával összhangban a találmány tárgyát képezi az IL-1-inhibitorok és analógjaik létrehozására alkalmas rekombináns DNS-rendszer. Ennek a rendszernek egy előnyös megvalósítási formája IL-13In accordance with the object of the present invention, there is provided a recombinant DNA system capable of producing IL-1 inhibitors and analogs thereof. A preferred embodiment of this system is IL-13

HU 222 810 Bl inhibitor kódolására alkalmas legalább egy cDNS-klónt vagy szintetikus ekvivalensét és a fenti IL-l-inhibitorok kifejezésére alkalmas expressziós rendszert alkotó vektorokat és sejteket tartalmaz. A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti cDNS-klónok azonosítására alkalmas antiszérumok. Az IL-1-inhibitorok termelésére alkalmas expressziós rendszerek, amelyek a fenti cDNSklónokat, analógjaikat vagy más, a fenti inhibitorokat kódoló DNS-szekvenciákat tartalmazzák, ugyancsak a találmány tárgyát képezik.It comprises at least one cDNA clone or synthetic equivalent thereof capable of encoding an inhibitor and vectors and cells constituting an expression system capable of expressing the above IL-1 inhibitors. The present invention also provides antisera suitable for the identification of the above cDNA clones. Expression systems for the production of IL-1 inhibitors comprising the above cDNA clones, analogs or other DNA sequences encoding the above inhibitors are also within the scope of the present invention.

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetését adjuk. Az 1A. és IB. ábrákon két, metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett monocita felülúszó Mono Q oszlopon való kromatografálásával kapott proteinprofilt ábrázoljuk. Az 1A. ábrán bemutatott profilt IgG-bevonatú Petri-csészén tenyésztett sejtek felülúszójából, az IB. ábrán szereplőt magzati borjúszérummal bevont Petri-csészéken tenyésztett sejtek felülúszójából nyertük.The following is a brief description of the figures. 1A. and IB. Figures 1 to 5 show protein profiles obtained by chromatographing two metabolically labeled ³⁵ S-methionine monocyte supernatants on a Mono Q column. 1A. Figure 1B shows the supernatant of cells cultured in IgG-coated Petri dishes; Figure 1B is obtained from the supernatant of cells grown in petri dishes coated with fetal calf serum.

A 2A. ábrán az 1A. és IB. ábrákon bemutatott tartományokon lévő frakciókat tartalmazó gél ezüsttel festett képét mutatjuk be.2A. 1A. and IB. Figures 1 to 5 show a silver-colored image of a gel containing fractions in the ranges shown in Figs.

A 2B. ábra a 2A. ábrán látható gél autoradiogramja.2B. 2A. Figure 4A is an autoradiogram of the gel.

A 3A., 3B. és 3C. ábrák az 1. példa szerint előállított tisztított IL-li adatait tartalmazzák. A 3A. ábra a kromatográfiás adatokat tartalmazza, ezekre ráillesztettük a radioaktivitásmintát. A 3B. ábra a 3A. ábrán megjelölt frakciókat mutatja a gélen futtatott minta ezüsttel festett formájában. A 3C. ábra a 3B. ábrán bemutatott gél autoradiogramja.3A, 3B. and 3C. Figures 1 to 8 show data for purified IL-li prepared according to Example 1. 3A. Figure 1B shows the chromatographic data with a radioactivity sample attached thereto. 3B. 3A. The fractions depicted in Figs. 3C. 3B. The autoradiogram of the gel shown in FIG.

A 4A. ábrán a Mono Q oszlopon tisztított IL-la Superose 12 gélen gélszűréssel kapott frakcióit mutatjuk be, a 4B. ábra a 4A. ábra jelölt 37-38. frakcióinak azonos körülmények között ismételt gélszűrésével kapott frakciókat mutatja.4A. Figure 4B shows fractions obtained by gel filtration on a Mono Q column purified by Superose 12 gel; 4A. 37-38; fractions obtained by repeated gel filtration under the same conditions.

Az 5A. és 5B. ábrákon egérantiszérumok Westemanalízisének eredményeit mutatjuk be. Az 5A. ábra az immunogén (Mono Q oszlopon tisztított IL-li) normál egérantiszérum (NMS) és az 5 egér antiszérumának elegye alkalmazásával történő elemzésének eredményét mutatja. Az 5B. ábrán az 5 egér (A-E) vérének külön alkalmazásával történt elemzés eredménye látható.5A. 5B and 5B. Figures 3 to 5 show the results of Westmanalysis of mouse antisera. 5A. Figure 5A shows the result of immunogen (Mono Q-purified IL-li) analysis using a mixture of normal mouse antiserum (NMS) and 5 mouse antiserum. 5B. Figure 5A shows the result of an analysis of 5 mouse (A-E) blood separately.

A 6. ábrán a pSVXVPL2IL-li plazmidszerkezetét mutatjuk be.Figure 6 shows the structure of plasmid pSVXVPL2IL-li.

A 7. ábrán a pMK-SGE:IL-li plazmidszerkezetét mutatjuk be.Figure 7 shows the plasmid structure of pMK-SGE: IL-li.

A 8A-D. ábrákon az IL-li-a-ra vonatkozó jellemzőket mutatunk be. A 8A. és 8B. ábrákon kromatográfiás eredmények láthatók, a 8C. ábrán a 8B. ábrán látható frakcióknak megfelelő, gélen futtatott, ezüsttel színezett minta látható. A 8D. ábra az előbbi autoradiogramja.8A-D. Figures 1 to 5 show the characteristics of IL-li-a. 8A. and 8B. Figures 8C and 2C show chromatographic results; 8B. A gel-colored, silver-colored sample running on the fractions shown in FIG. 8D. FIG. 4A is the autoradiogram of the former.

A 9A. és 9B. ábrák az IL-Ιί-β-ra vonatkozó eredményeket tartalmaznak. A 9A. ábrán kromatográfiás eredményeinket mutatjuk be, a 9B. ábrán az SDS-PAGE eredménye látható.9A. 9B and 9B. Figures 1 to 5 show results for IL-Ιί-β. 9A. Figure 9B shows our chromatographic results; Figure 1B shows the result of SDS-PAGE.

A 10. ábrán az IL-li-α peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.Figure 10 shows the result of the separation of IL-li-α peptide.

A 11. ábrán az IL—li—β peptid elválasztásának eredményét mutatjuk be.Figure 11 shows the result of the separation of IL-li-β peptide.

A 12A. ábrán a GT10-IL1Í-2A a 6. példa szerint EcoRI-gyel emésztett mintájának gélen való elektroforézisével kapott minta fényképét mutatjuk be.12A. Fig. 4A shows a photograph of a sample obtained by gel electrophoresis of a sample of GT10-IL11I-2A from Example 6 digested with EcoRI.

A 12B. ábrán a 12A. ábrán bemutatott gél Southem-blot-módszerrel kapott autoradiogramját mutatjuk be.12B. 12A. Figure 4A shows the South radi blot autoradiogram of the gel.

A 13. ábrán a lambda GT10-IL1Í-2A proteint kódoló tartománya DNS-szekvenciájának egy részét, valamint a várható aminosavszekvenciát mutatjuk be a 6. példa szerint.Figure 13 shows a portion of the DNA sequence of the lambda GT10-IL1-1-2A coding region as well as the expected amino acid sequence as in Example 6.

A 14. ábrán a GT10-IL1Í-2A nukleotidszekvenciáját mutatjuk be.Figure 14 shows the nucleotide sequence of GT10-IL11-2A.

A 15. ábrán egy peptidet mutatunk be, amely magában foglal többek között egy IL-li szekvenciát és egy szekréciós vezetőszekvenciát.Figure 15 shows a peptide comprising, inter alia, an IL-li sequence and a secretory leader.

A következőkben a találmány előnyös megvalósítási módját írjuk le. Ez a leírás a példákkal együtt a találmány lényegének bemutatására szolgál.The following describes a preferred embodiment of the invention. This description, together with examples, is intended to illustrate the invention.

A) Humán monocitákból származó inhibitorA) Inhibitor derived from human monocytes

Amint azt az előzőekben már ismertettük, a találmány tárgya tisztított formában elkülönített IL-1-inhibitorok. Előnyösen az IL-l-inhibitorok humán monocitákkal kondicionált tápközegből származóak, ahol a monocitákat IgG-bevonatú edényeken tenyésztjük. Ezenkívül a találmány magában foglal bármilyen lényegében tisztított IL-l-inhibitort, amely biológiailag ekvivalens a humánmonocita-tartalmú tápközegből származó inhibitorral.As described above, the present invention relates to isolated IL-1 inhibitors in purified form. Preferably, the IL-1 inhibitors are derived from media conditioned on human monocytes, wherein the monocytes are cultured in IgG-coated dishes. In addition, the invention encompasses any substantially purified IL-1 inhibitor that is biologically equivalent to an inhibitor derived from human monocyte-containing media.

A „biológiailag ekvivalens” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban is azt értjük, hogy az IL-1inhibitor-kompozíció hasonló módon képes meggátolni az IL-1 hatását, mint a monocitákból izolált natív IL-l-inhibitor, de a hatás mértéke nem szükségszerűen azonos. A „lényegében homológ” megjelölésen a leírásban és az igénypontokban a monocitákkal kondicionált tápközegből származó natív IL-l-inhibitorhoz való olyan mértékű homológiát értünk, amely meghaladja bármely előzőekben ismertetett IL-1-inhibitor homológiáját. Előnyösen a homológia mértéke 70% fölötti, még előnyösebben 80% fölötti, ennél is előnyösebben 90% fölötti. Különösen előnyös az inhibitoroknak az a köre, amely a 95%-ot meghaladó mérték4As used herein, the term "bioequivalent" means that the IL-1 inhibitor composition is capable of inhibiting the action of IL-1 in a manner similar to that of the native IL-1 inhibitor isolated from monocytes, but not necessarily to the same extent. . The term "substantially homologous" as used herein refers to homology to a native IL-1 inhibitor derived from monocyte-conditioned media that exceeds the homology of any of the IL-1 inhibitors described above. Preferably, the degree of homology is greater than 70%, more preferably greater than 80%, more preferably greater than 90%. Particularly preferred is a range of inhibitors greater than 95% 4

II

HU 222 810 Β1 ben homológ a natív inhibitorral. A homológia százalékos értékét Dayhoff, M. D. módszerével számítjuk ki [Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 124 (1972), National Biochemical Research Foundation Washington, D. C.], amelyet leírásunka referenciaként 5 beépítünk, azaz azon két szekvencia közül a kisebb aminosav egységeinek számát adjuk meg, amely a szekvenciában azonos aminosavegységeket tartalmaz, ha az összehasonlítást olyan aminosavláncon végezzük, amely 100 aminosavegységre 4 megszakítással 10 bír.HU 222 810 Β1 is homologous to the native inhibitor. Percent homology is calculated by Dayhoff, MD (Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 124, 1972, National Biochemical Research Foundation, Washington, DC), which is incorporated herein by reference as the number of smaller amino acid units of the two sequences. which contains the same amino acid units in the sequence when the comparison is made on an amino acid chain having 4 interruptions per 100 amino acid units.

A találmány szerinti IL-1-inhibitorok monocitakondicionált tápközegből származnak, és első ízben kerültek tisztított formában elkülönítésre. Az IL-l-inhibitorok vonatkozásában „tiszta forma” vagy „tisztított fór- 15 ma” megjelölésen azt értjük, hogy a készítmény lényegében mentes más olyan fehéijéktől, amelyek nem IL- 1-inhibitor fehérjék. Előnyösen a találmány szerinti IL-l-inhibitorok legalább 90% tisztaságúak, még előnyösebben 95%-os tisztaságúak. 20The IL-1 inhibitors of the present invention are derived from monocyte conditioned media and have been isolated for the first time in purified form. By "pure form" or "purified phosphorus" with respect to IL-1 inhibitors, it is meant that the composition is substantially free of other proteins that are not IL-1 inhibitor proteins. Preferably, the IL-1 inhibitors of the invention are at least 90% pure, more preferably 95% pure. 20

A példában leírt eljárásokkal legalább háromféle tisztított IL-l-inhibitort izoláltunk. Ezek az 1 inhibitor, a 2 inhibitor és a 3 inhibitor. Az 1 inhibitor SDS-PAGE szerint 22-23 kDa molekulatömegű, izoelektromos pontja mintegy 4,8, és Mono Q FPLC ősz- 25 lopról pH=7,6-os trisz-pufferben mintegy 52 mmol/1es nátrium-klorid-oldattal eluálható. A 2 inhibitor 22-23 kDa molekulatömegű fehérje, pl=4,8, Mono Q oszlopról 60 mmol/l-es nátrium-klorid-oldattal eluálható. A 3 inhibitor 20 kDa molekulatömegű fehérje, a 30 Mono Q oszlopról 48 mmol/l-es nátrium-klorid-oldattal eluálható. Az 1, 2 és 3 inhibitorok immunológiai és funkcionális szempontból hasonlóak. Ezeket az inhibitorokat tisztított formában előállítottuk, és így aminosavszekvenciájukat is meg tudtuk határozni. A tiszti- 35 tott inhibitorokat az ABI fehérjeanalizátor (ABI Protein Sequencer) és az ehhez adott technikai módszertani leírás alkalmazásával vizsgálva az aminosavszekvencia lényeges részét meghatároztuk.At least three types of purified IL-1 inhibitors were isolated by the methods described in the example. These are inhibitor 1, inhibitor 2 and inhibitor 3. The inhibitor 1 according to SDS-PAGE has an isoelectric point of about 22-23 kDa, about 4.8, and can be eluted from about 25 mmol / l of Mono Q FPLC in autumn in Tris buffer, pH 7.6. Inhibitor 2 can be eluted from a Mono Q column with a molecular weight of 22-23 kDa pI = 4.8 with 60 mM sodium chloride. The 3 inhibitor is a 20 kDa protein eluted from the 30 Mono Q column with 48 mM NaCl. Inhibitors 1, 2 and 3 are immunologically and functionally similar. These inhibitors were prepared in purified form so that their amino acid sequence could also be determined. Purified inhibitors were assayed using the ABI Protein Sequencer and the technical specifications provided to determine a substantial portion of the amino acid sequence.

A 3. példában ismertetjük a három IL-1-inhibitor, nevezetesen az IL-li-X, IL-li-α és IL-li-β aminosavszekvenciájára vonatkozó adatokat.Example 3 describes the amino acid sequence data for the three IL-1 inhibitors, namely IL-li-X, IL-li-α and IL-li-β.

Felismertünk és előállítottunk legalább egy, egy IL-1-inhibitor ellen termelődő antitestet is. Más, azonos vagy különböző IL-1-inhibitorok ellen ható poliklonális és monoklonális antitestek is előállíthatók szakember számára ismert módon. Egy adott poliklonális antitest előállítását a 4. példában ismertetjük.At least one antibody directed against an IL-1 inhibitor has also been identified and prepared. Other polyclonal and monoclonal antibodies directed against the same or different IL-1 inhibitors may be prepared in a manner known to those skilled in the art. The preparation of a particular polyclonal antibody is described in Example 4.

B) Rekombináns inhibitorB) Recombinant inhibitor

1. Általános ismertetés1. General introduction

Rekombináns DNS-eljárást ismertetünk IL-1-inhibitor előállítására. A találmány egy megvalósítási formája szerint az aktív funkciós helyek biológiailag ekvivalensek az emberből izolált natív IL-1 megfelelő funkciós helyeivel. Az IL-l-inhibitorok előállításának irányítására természetes vagy szintetikus DNS-szekvencia használható. Az eljárás a következő műveleteket foglalja magában:A recombinant DNA method for the preparation of an IL-1 inhibitor is described. In one embodiment, the active functional sites are bioequivalent to the corresponding functional sites of native IL-1 isolated from human. A natural or synthetic DNA sequence may be used to direct the production of IL-1 inhibitors. The procedure involves the following operations:

a) olyan DNS-szekvencia előállítása, amely képes a gazdasejtet úgy irányítani, hogy az IL-1-inhibitor-aktivitással bíró fehérjét termeljen;(a) providing a DNA sequence capable of directing a host cell to produce a protein having IL-1 inhibitory activity;

b) a DNS-szekvenciának olyan vektorba való klónozása, amely bevihető egy gazdasejtbe és ott szaporítható, a vektornak olyan operációs elemeket kell tartalmaznia, amelyek a DNS-szekvencia kifejezését lehetővé teszik;(b) cloning of the DNA sequence into a vector which can be introduced into a host cell and propagated therein, the vector must contain operative elements which allow expression of the DNA sequence;

c) a szintetikus DNS-szekvenciát és az operációs elemeket tartalmazó vektor bevitele olyan gazdasejtbe, amely képes az IL-l-inhibitort kódoló DNS kifejezésére;c) introducing a vector comprising the synthetic DNA sequence and the operative elements into a host cell capable of expressing DNA encoding the IL-1 inhibitor;

d) a gazdasejt tenyésztése olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a vektor megsokszorozódását és az inhibitor kifejeződését;d) culturing the host cell under conditions that allow for vector multiplication and expression of the inhibitor;

e) az inhibitor elkülönítése és(e) isolating the inhibitor; and

f) annak lehetővé tétele, hogy az inhibitor aktív tercier szerkezetet vegyen fel, miáltal IL-l-inhibitor-aktivitással fog rendelkezni.f) allowing the inhibitor to take up an active tertiary structure, thereby having IL-1 inhibitor activity.

A találmány oltalmi körébe tartozik az alábbi szekvenciájú fehérje is:The invention also encompasses a protein having the following sequence:

M M E E I I X X R R G G L L R R s s H L H L I I T T L L L L L L F F L L F H F H 30 30 40 40 S S E E T T I I X X Z Z P P S S G G R K RK S S S S K K M M Q Q A THE F F R I R I 50 50 60 60 W W D D V V N N Q Q K K T T F F Y Y L R L R N N N N Q Q L L V V A THE G G Y L Y L 70 70 80 80 Q Q G G P P N N V V N N L L E E E E K. I Q. I D D V V V V P P I I E E P P H A H A 90 90 100 100 L L F F L L G G I I H H G G G G K K Μ X Μ X L L S S X X V V K K S S G G D E D E 110 110 120 120 T T R R L L Q Q L L E E A THE V V N N I T I T D D L L s s E E N N R R K. K. Q D Q D 130 130 140 140 K K R R F F A THE F F I I R R S S D D S G S G P P T T T T S S F F E E s s A A The A 150 150 160 160 X X P P G G W W F F L L X X T T A THE Μ E Μ E A THE D D Q Q P P V V S S L L T N T N 170 170 M M P P D D E E G G V V M M V V T T K F K F Y Y F F Q Q E E D D E E

ahol X jelentése risztéin, szerin vagy alanin, és Z jelentése arginin vagy prolin.wherein X is rysteine, serine or alanine, and Z is arginine or proline.

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

2. DNS-szekvenciák2. DNA sequences

A találmány szerinti eljárásban való használatra szánt DNS-szekvenciákat az 5. és 6. példákban ismertetjük. Ezek a szekvenciák szintetikus és természetes DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Természetes szekvenciák továbbá tartalmaznak cDNS- vagy genom-DNSszegmenseket.DNA sequences for use in the method of the invention are described in Examples 5 and 6. These sequences contain synthetic and natural DNA sequences. Natural sequences further comprise cDNA or genomic DNA segments.

A 6. példa szerint olyan DNS molekuláris kiónját állítjuk elő, amely az 1-3. példák szerint izolált fehérjével azonos fehérje kódolására képes. A 6. példa szerinti eljárásban egy GT10-IL1Í-2A plakkot izolálunk a GT-10 könyvtárból. A plakkban lévő fágot tenyésztjük, a DNS-t elkülönítjük és EcoRI-gyel emésztjük. Az 1850 bázispárból álló EcoRI-fragmens hordozza az IL—1 -inhibitor kódolására alkalmas szekvenciát. A 13. ábrán bemutatjuk az EcoRI-fragmens részleges DNS-szekvenciáját.According to Example 6, a molecular clone of DNA having the amino acids 1-3 is prepared. is capable of encoding the same protein as the isolated protein. In the procedure of Example 6, a GT10-IL11I-2A plaque was isolated from the GT-10 library. The phage in the plaque was cultured, the DNA was isolated and digested with EcoRI. The 1850 bp EcoRI fragment carries the sequence encoding the IL-1 inhibitor. Figure 13 shows the partial DNA sequence of the EcoRI fragment.

A leírásban adott kitanítás és az ismert eljárások alkalmazásával szakember más szintetikus polinukleotidszekvenciák előállítására is képes. A polinukleotidszintézis jelenlegi állását bemutató munkákként említjük a következőket:Other synthetic polynucleotide sequences can be prepared by one skilled in the art using the teachings herein and the known methods. Among the work presenting the state of the art in polynucleotide synthesis are the following:

Matteucci, M. D. és Caruthers, Μ. H.; J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981) és Beaucage S. L. és Caruthers, Μ. H.; Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981), valamint az ABI oligonukleotidszintetizátorhoz adott használati utasításokat, amelyek mindegyikét leírásunkba referenciaként építjük be.Matteucci, M.D. and Caruthers, Μ. H .; Chem. Soc. 103, 3185 (1981) and Beaucage, S.L. and Caruthers, Μ. H .; Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981), and the instructions for use of the ABI oligonucleotide synthesizer, each of which is incorporated herein by reference.

Ezek a szintetikus szekvenciák lehetnek a következőkben részletesebben ismertetésre kerülő természetes szekvenciákkal azonosak, vagy tartalmazhatnak az abban lévőtől eltérő nukleotidokat. A találmány egy olyan megvalósítási módjában, amelyben olyan szintetikus szekvenciákat alkalmazunk, amelyek a természetes DNS-szekvenciában jelen lévőtől eltérő nukleotidokat tartalmaznak, úgy választjuk meg ezeket a különböző szekvenciákat, hogy azok még a monocitákból izolált IL— li primer szerkezetével egyező primer szerkezetű polipeptidet kódoljanak. Egy másik megvalósítási mód szerint a természetestől eltérő nukleotidokat tartalmazó szintetikus szekvencia olyan polipeptidet kódol, amelynek biológiai aktivitása azonos az IL— li itt leírt aktivitásával.These synthetic sequences may be identical to the natural sequences described below, or may contain nucleotides other than those contained therein. In one embodiment of the invention, using synthetic sequences that contain nucleotides other than those present in the natural DNA sequence, these different sequences are selected such that they still encode a polypeptide of the same primary structure as the IL-1i primer isolated from the monocytes. In another embodiment, the synthetic sequence containing the unnatural nucleotides encodes a polypeptide having the same biological activity as the IL-li activity described herein.

Továbbá a DNS-szekvencia lehet a természetes szekvenciának egy töredéke, azaz a természetben előforduló polinukleotid egy töredéke, az ilyen töredék elkülönítését és tisztítását sem valósították meg ez ideig. Egy megvalósítási mód szerint a DNS-szekvencia a cDNSkönyvtárból izolált restrikciós fragmens.Further, the DNA sequence may be a fragment of a natural sequence, that is, a fragment of a naturally occurring polynucleotide, and no such fragment has been isolated and purified so far. In one embodiment, the DNA sequence is a restriction fragment isolated from a cDNA library.

Egy további megvalósítási mód szerint a DNS-szekvenciát humán genomkönyvtárból izoláljuk. Ilyen, ebben a megvalósítási módban alkalmazható könyvtárat ismertetnek például Lawn és munkatársai [Cell 15, 1157-1174 (1978)], munkájukat leírásunkba referenciaként építjük be.In another embodiment, the DNA sequence is isolated from a human genomic library. Such a library for use in this embodiment is described, for example, by Lawn et al., Cell 15: 1157-1174 (1978) and is incorporated herein by reference.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a természetes DNS-szekvenciát az alábbi lépésekből álló eljárással állítjuk elő:In a preferred embodiment of the invention, the natural DNA sequence is prepared by a process comprising the following steps:

a) humán cDNS-könyvtár készítése olyan sejtekből, előnyösen monocitákból, amelyek képesek az IL-1-inhibitornak egy vektorba, majd egy sejtbe való bevitelére, amely utóbbiban a cDNS sokszorozódásra és részben vagy teljesen való kifejeződésre képes;(a) making a human cDNA library from cells, preferably monocytes, capable of introducing an IL-1 inhibitor into a vector and then into a cell capable of replicating and partially or completely expressing the cDNA;

b) a humán DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely képes az IL-1-inhibitor génhez vagy fehérjéjéhez kötődni;b) screening the human DNA library with at least one sample capable of binding to the IL-1 inhibitor gene or protein;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására képes gént tartalmaz, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a génnek vagy fehéijetermékének legalább egy mintáját képes megkötni;c) identifying at least one clone containing a gene capable of encoding the inhibitor, the identification being based on the ability of the clone to bind at least one sample of the gene or protein product thereof;

d) a kiválasztott kiónból vagy kiónokból az inhibitor kódolására képes gén vagy génrészlet elkülönítése;d) isolating a gene or gene fragment capable of encoding the inhibitor from the selected clone or clones;

e) a génnek vagy megfelelő részletének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a gén a gazdasejtbe bevihető legyen, és ott kifejeződjön.(e) attaching the gene or an appropriate portion thereof to operative elements necessary to introduce the gene into the host cell and to express it there.

Az eljárásban alkalmazható DNS-szekvencia is azonosítható és elkülöníthető az alábbi műveleti sor segítségével :The DNA sequence used in the method can also be identified and isolated using the following sequence:

a) humán genom-DNS-könyvtár készítése, előnyösen recArecBC E. coli gazdaszervezetben szaporítva;a) preparing a human genomic DNA library, preferably propagated in recArecBC in E. coli;

b) a humán genom-DNS-könyvtár vizsgálata legalább egy olyan mintával, amely egy IL-1-inhibitor génhez vagy annak fehérjetermékéhez képes kötődni;b) screening the human genomic DNA library with at least one sample capable of binding to an IL-1 inhibitor gene or protein product thereof;

c) legalább egy olyan klón azonosítása, amely az inhibitor kódolására alkalmas gént tartalmazza, az azonosítás a kiónnak azon a képességén alapszik, hogy a gén vagy fehéijeterméke legalább egy mintájához kötődik;c) identifying at least one clone containing a gene capable of encoding the inhibitor, the identification being based on the ability of the clone to bind to at least one sample of the gene or its protein product;

d) az inhibitort kódoló gén izolálása az azonosított kiónból (klónokból); ésd) isolating the gene encoding the inhibitor from the identified clone (s); and

e) a génnek vagy megfelelő fragmensének olyan operációs elemekhez való kötése, amelyek a génnek a gazdasejtbe való beviteléhez és kifejeződéséhez szükségesek.e) binding of the gene or a corresponding fragment thereof to operative elements necessary for the introduction and expression of the gene into the host cell.

A fenti eljáráshoz alkalmas természetes DNS-szekvencia izolálásánál előnyös a két restrikciós hely olyan meghatározása, hogy azok a megfelelő génen vagy génrészleten belül, annak végéhez legközelebbi részén helyezkedjenek el.In isolating a natural DNA sequence suitable for the above method, it is preferable to determine the two restriction sites to be located within the appropriate gene or fragment thereof, at the portion closest to its end.

Ezután a megfelelő gént tartalmazó DNS-szegmenst megfelelő restrikciós endonukleázok alkalmazásával eltávolítjuk a maradék genomanyágtól. A kimetszést követően a DNS-szekvencia 3’ és 5’ végeit és minden exonkapcsolódást helyreállítunk, hogy olyan megfelelő DNS-szekvenciát nyerjünk, amely az IL-1-inhibitor fehérje N- és C-terminálisát kódolni képes, és képes a DNS-szekvenciának operációs elemeihez való kapcsolására.The DNA segment containing the appropriate gene is then removed from the rest of the genome using appropriate restriction endonucleases. Following excision, the 3 'and 5' ends of the DNA sequence and all exon linkages are restored to obtain a suitable DNA sequence capable of encoding the N- and C-termini of the IL-1 inhibitor protein and capable of to your batteries.

3. Vektorok3. Vectors

a) Mikroorganizmusok, különösen E. coli(a) Microorganisms, in particular E. coli

A találmány szerinti eljárásban használható vektorok közé tartozik bármely olyan vektor, amelybe egy, az előzőekben ismertetett DNS-szekvencia és előnyös vagy kívánt operációs elemei beépíthetők, és amely vektor ezt követően egy gazdasejtbe bevihető, és ebben a sejtben szaporodik. Előnyösek azok a vektorok, amelyeknek restrikciós helyei jól dokumentáltak, és amelyek a DNS-szekvencia transzkripciójához előnyös vagy szükséges operációs elemeket tartalmazzák. Le6Vectors useful in the method of the invention include any vector into which a DNA sequence as described above and its preferred or desired operative elements can be inserted, which vector can then be introduced into a host cell and propagated in that cell. Vectors which have well-documented restriction sites and which contain operative elements that are beneficial or necessary for transcription of the DNA sequence are preferred. Le6

HU 222 810 Β1 hetnek a találmánynak azonban olyan megvalósítási módjai is, amelyekben jelenleg még nem ismert olyan vektorokat alkalmaznak, amelyek egy vagy több itt leírt cDNS-szekvenciát tartalmaznak. Különösen előnyös azonban, ha ezen vektorok mindegyike rendelkezik az alábbi jellemzők közül néhánnyal, vagy ezek mindegyikével:However, embodiments of the present invention which do not yet employ vectors containing one or more of the cDNA sequences described herein are used. However, it is particularly preferred that each of these vectors exhibit some or all of the following characteristics:

(1) rendelkezik a gazdaszervezet szekvenciáinak egy minimális számával; (2) képes a kívánt gazdaszervezetben való stabil fennmaradásra és szaporodásra; (3) képes arra, hogy a kívánt gazdaszervezetben nagy számban legyen jelen; (4) szabályozható promoterrel bír, amelyik úgy helyezkedik el, hogy elősegíti az érdeklődésre számot tartó gén transzkripcióját; (5) legalább egy olyan marker DNS-szekvenciája van, amely a plazmádnak egy, a DNS-szekvencia beiktatási helyétől eltérő részén egy megválasztható sajátosságot kódol; és (6) a transzkripció lezárására képes DNS-szekvencia.(1) has a minimum number of host sequences; (2) is capable of stable survival and reproduction in the desired host; (3) is capable of being present in large numbers in the desired host; (4) has a regulatable promoter which is positioned to facilitate transcription of the gene of interest; (5) has at least one marker DNA sequence encoding an selectable feature in a portion of your plasmid other than the insertion site of the DNA sequence; and (6) a DNA sequence capable of terminating transcription.

A találmány szerinti, a DNS-szekvenciát tartalmazó és annak kifejezésére képes klónozóvektorok egy előnyös megvalósítási módban különböző operációs elemeket tartalmaznak. Ezek az „operációs elemek” legalább egy promotert, legalább egy Shine-Dalgamo-szekvenciát és iniciátorkodont, továbbá legalább egy terminátorkodont tartalmaznak. Előnyösen ezen „operációs elemek” magukban foglalnak még legalább egy operátort, legalább egy vezetőszekvenciát a fehérjéknek az intracelluláris térből való kivitelére, legalább egy, egy regulátorproteinre vonatkozó gént, és bármely más olyan DNS-szekvenciát, amely a vektor-DNS megfelelő transzkripciójához és ezt követő transzlációjához szükséges vagy előnyös.In a preferred embodiment, the cloning vectors of the invention, comprising the DNA sequence and capable of expressing it, comprise various operative elements. These "operative elements" comprise at least one promoter, at least one Shine-Dalgamo sequence and an initiator codon, and at least one terminator codon. Preferably, these "operative elements" include at least one operator, at least one leader sequence for delivering proteins from the intracellular space, at least one gene for a regulatory protein, and any other DNA sequence that is suitable for proper transcription of the vector DNA and subsequent necessary or advantageous for translation.

Ezen operációs elemek közül bizonyosak jelen lehetnek a találmány szerinti előnyös vektorok mindegyikében. Bármely további szükséges operációs elem hozzáadható ezekhez a vektorokhoz szakember számára ismert módon, különösen a leírásban adott kitanítás figyelembevételével.Some of these operating elements may be present in each of the preferred vectors of the invention. Any other necessary operating element may be added to these vectors in a manner known to those skilled in the art, particularly in light of the teachings herein.

A gyakorlatban ezen vektorok előállítása olyan módon lehetséges, ami lehetővé teszi, hogy könnyen elkülöníthetők, összeállíthatók és felcserélhetők legyenek. Ez lehetővé teszi számos funkcionális gén összeállítását ezen elemek és a DNS-szekvenciák kódolórégióinak kombinálásával. Továbbá, ezen elemek közül számos több mint egy gazdaszervezetben alkalmazható. Továbbá, ezen vektorok bizonyos előnyös megvalósítási mód mellett olyan DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek lehetővé teszik regulátorként („operátorként”) való működésüket, más DNS-szekvenciák regulátorfehétjék kódolására képesek.In practice, the production of these vectors is possible in a manner that allows them to be easily separated, assembled, and interchanged. This allows the assembly of a number of functional genes by combining these elements with the coding regions of the DNA sequences. Furthermore, many of these elements can be used in more than one host. Furthermore, in some preferred embodiments, these vectors contain DNA sequences that allow them to function as regulators ("operators") and are capable of encoding regulatory proteins of other DNA sequences.

i) Regulatoroki) Regulators

Ezen regulátorok az egyik megvalósítási mód szerint bizonyos környezeti feltételek mellett megakadályozzák a DNS-szekvencia kifejeződését, míg más környezeti körülmények mellett lehetővé teszik a DNSszekvencia transzkripcióját, és az ezt követően a DNS által kódolt fehérje kifejeződését. Különösen előnyös, ha a regulátorszegmensek a vektorba úgy iktatódnak be, hogy a DNS-szekvencia kifejeződése nem következik be, vagy rendkívül csökkent mértékben következik be akkor, ha például nincs jelen izopropil-tio-P-Dgalaktozid. Ebben az esetben a DNS-szekvenciát tartalmazó transzformált mikroorganizmus kívánt sűrűségig szaporítható az IL-li kifejeződésének megkezdődését megelőzően. Ebben a megvalósítási módban a kívánt fehérje kifejeződését úgy indítjuk meg, hogy a kívánt sűrűség elérését követően olyan anyagot adunk a mikrobiális környezetbe, amely a DNS-szekvencia kifejeződését váltja ki.In one embodiment, these regulators prevent expression of the DNA sequence under certain environmental conditions, while under other environmental conditions they allow transcription of the DNA sequence and subsequent expression of the protein encoded by the DNA. It is particularly advantageous for the regulatory segments to be inserted into the vector such that expression of the DNA sequence does not occur or is extremely reduced in the absence of, for example, isopropylthio-β-Dgalactoside. In this case, the transformed microorganism containing the DNA sequence may be grown to the desired density before IL-li expression begins. In this embodiment, expression of the desired protein is initiated by adding to the microbial environment a substance which induces expression of the DNA sequence after reaching the desired density.

ii) Promoterekii) Promoters

Az expressziós vektoroknak olyan promotereket kell tartalmazniuk, amelyeket a gazdaszervezet a saját fehérjéinek kifejezésére használhat. Bár általánosan használt a laktózpromoter-rendszer, más mikrobiális promotereket is izoláltak és jellemeztek már, szakember ezeket is alkalmazhatja a rekombináns IL-li kifejezésére.Expression vectors must contain promoters that can be used by the host to express its own proteins. Although the lactose promoter system is commonly used, other microbial promoters have been isolated and characterized, and can be used by one skilled in the art to express recombinant IL-li.

iii) Transzkripcióterminátoriii) Transcription Terminator

A transzkripcióterminátorok a vektor stabilizálására szolgálnak. Különösen a Rosenberg, M. és Court J. [Ann. Rév. Génét. 13, 319-353 (1979)] által leírt szekvenciák alkalmasak a találmány szerinti eljárásban, ezeket leírásunkba referenciaként építjük be.The transcription terminators serve to stabilize the vector. In particular, Rosenberg, M. and Court J. Ann. Port. Genet. 13, 319-353 (1979)], which are incorporated herein by reference.

iv) Nem transzlatált szekvenciaiv) Non-translated sequence

Megjegyezzük, hogy egy előnyös megvalósítási formában kívánatos lehet a kódolórégió 3’ vagy 5’ végének olyan helyreállítása, hogy nem átfordított 3’ vagy 5’ szekvenciák beépülése legyen lehetséges a géntranszkriptumba. Az ilyen nem átfordított szekvenciák közé tartoznak azok, amelyek az mRNS-t stabilizálják, ezeket Schmeissner, U., McKenney, K. Rosenberg, M. és Court, D. ismertetik a J. Mól. Bioi. 176, 39-53 (1984) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.It will be appreciated that, in a preferred embodiment, it may be desirable to repair the 3 'or 5' end of the coding region to allow for the insertion of untranslated 3 'or 5' sequences into the gene transcript. Such non-translated sequences include those that stabilize the mRNA and are described by Schmeissner, U., McKenney, K. Rosenberg, M., and Court, D. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984), which is incorporated herein by reference.

v) Riboszómakötö helyek(v) Ribosomal binding sites

Az idegen fehérjék mikrobiális kifejezéséhez néhány operációs elem szükséges, amelyek közé tartoznak - bár nem ezekre korlátozottak - a riboszómakötö helyek. Egy riboszómakötö hely egy olyan szekvencia, amelyet egy riboszóma felismer, és a fehérjeszintézis kezdeteként ehhez kötődik; ezt Gold, L. és munkatársai [Ann. Rév. Microbio. 35, 557-580] és Marquis, D. M. és munkatársai [Gene 42, 175-183 (1986)] ismertetik, mindkét szakirodalmi helyet referenciaként építjük be leírásunkba. Egy előnyös riboszómakötö hely a következő: GAGGCGCAAAAA (ATG).Microbial expression of foreign proteins requires some operative elements, which include, but are not limited to, ribosome binding sites. A ribosome binding site is a sequence recognized by a ribosome and bound to it as the start of protein synthesis; Gold et al., Ann. Port. Microbiol. 35, 557-580] and Marquis, D.M., et al., Gene 42, 175-183 (1986), both of which are incorporated herein by reference. A preferred ribosome binding site is GAGGCGCAAAAA (ATG).

vi) Vezetőszekvencia és transzlációkapcsolóvi) Lead sequence and translation switch

Előnyös továbbá, ha egy megfelelő kiválasztó vezető (szignál)-szekvenciát kódoló DNS van jelen a DNSszekvencia 5’ végén, amint azt Watson, Μ. E.; [Nucleic Acids Rés. 12, 5145-5163] ismerteti, ha a fehérjét a citoplazmából kell kiválasztani. Watson előbbi munkáját referenciaként beépítjük leírásunkba. A vezetőszekvenciát kódoló DNS-nek olyan helyzetben kell lennie, amelyik lehetővé teszi egy olyan fúziós fehérje képződését, amelyben a vezetőszekvencia közvetlenül szomszédos és kovalensen kötött az inhibitorhoz, azaz a két DNS kódolószekvencia között nem lehet semmiféle transzkripciós vagy transzlációs terminációs jel. A vezetőszekvencia jelenléte az alábbi okok közül egy vagy több miattIt is further preferred that DNA encoding an appropriate select leader (signal) sequence is present at the 5 'end of the DNA sequence, as described by Watson, Μ. E .; [Nucleic Acids Slit. 12, 5145-5163] if the protein is to be selected from the cytoplasm. Watson's earlier work is incorporated herein by reference. The DNA encoding the leader sequence must be in a position that permits the formation of a fusion protein in which the leader sequence is directly adjacent and covalently bound to the inhibitor, i.e., there must be no transcriptional or translational termination signal between the two DNA coding sequences. Presence of the leader sequence for one or more of the following reasons

HU 222 810 Bl kívánatos. Először is, a vezetőszekvencia jelenléte megkönnyítheti a gazdaszervezet számára az IL- li termelését. Közelebbről, a vezetőszekvencia irányíthatja a kezdeti transzlációs terméknek egy vezetőpeptidázzal való lehasítását, hogy a vezetőszekvenciát eltávolítsa, és visszamaradjon a potenciális proteinaktivitással bíró aminosavszekvencia. Másodszor, a szignálszekvencia jelenléte megkönnyítheti az IL—li tisztítását azáltal, hogy a fehérjét hozzásegíti a sejtcitoplazma elhagyásához. Egyes gazda-mikroorganizmusfajok esetén a megfelelő vezetőszekvencia lehetővé teszi a teljes kész fehérjének a periplazmatikus térbe való kivitelét, ilyen eset áll fenn például az E. coli esetén. Bizonyos E. coli, Saccharomyces, Bacillus és Pseudomonas törzsek esetén a megfelelő vezetőszekvencia lehetővé teszi a fehérjének a sejtmembránon át az extracelluláris közegbe való transzportját. Ebben az esetben a fehérje az extracelluláris proteintől megtisztítható. Harmadszor, egyes, a találmány szerint előállított fehérjék esetében a vezetőszekvencia jelenléte szükséges lehet ahhoz, hogy a kész fehéijét egy olyan környezetben helyezzük el, ahol az hajtogatódhat aktív szerkezetének elnyerésére, amely szerkezet a megfelelő proteinaktivitással bír.EN 222 810 B1 is desired. First, the presence of the leader sequence may facilitate the production of IL-II by the host. In particular, the leader sequence may direct the cleavage of the initial translation product by a leader peptidase to remove the leader sequence and retain the amino acid sequence having potential protein activity. Second, the presence of the signal sequence may facilitate purification of IL-li by aiding the protein to leave the cell cytoplasm. For certain host microorganism species, the appropriate leader sequence allows the delivery of the complete protein to the periplasmic space, such as in E. coli. In certain E. coli, Saccharomyces, Bacillus, and Pseudomonas strains, the appropriate leader sequence allows the protein to be transported through the cell membrane to the extracellular medium. In this case, the protein can be purified from the extracellular protein. Third, for some proteins of the invention, the presence of the leader sequence may be required to place the finished protein in an environment where it can be folded to obtain its active structure, which has the appropriate protein activity.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában egy további DNS-szekvenciát helyezünk el közvetlenül azt a DNS-szekvenciát megelőzően, amely az IL-l-inhibitort kódolja. Ez a további DNS-szekvencia transzlációs kapcsolóként való működésre képes, azaz ez egy olyan DNS-szekvencia, amely egy olyan RNS-t kódol, amely riboszómák elhelyezésére képes közvetlenül a vele határos RNS-inhibitor riboszómakötési helye mellett. A találmány egy megvalósítási módjában a transzlációs kapcsoló a TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG DNS-szekvencia alkalmazásával, a transzlációs kapcsolók terén jártas szakember számára ismert eljárásokkal állítható elő.In a preferred embodiment of the invention, an additional DNA sequence is inserted immediately before the DNA sequence encoding the IL-1 inhibitor. This additional DNA sequence is capable of acting as a translation linker, i.e., a DNA sequence encoding an RNA capable of positioning ribosomes directly adjacent to the ribosome binding site of an adjacent RNA inhibitor. In one embodiment of the invention, the translational switch can be prepared using the DNA sequence TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG according to methods known to those skilled in the art of translational switching.

vii) Transzlációs terminátorvii) Translational Terminator

A transzlációs terminátorok szerepe az mRNStranszláció megállítása. Ezek lehetnek természetesek, amint azt Kohli, J. [Mól. Gén. Génét.; 182, 430-439] ismerteti, vagy szintetikusak, amint azt Pettersson, R. F.; [Gene 24, 15-27 (1983)] leírja, mindkét hivatkozást referenciaként építjük be leírásunkba.The role of translation terminators is to stop mRNA translation. These may be natural, as Kohli, J. [Mol. Gene. Gene .; 182, 430-439], or synthetic as described by Pettersson, R. F .; Gene 24: 15-27 (1983), both references are incorporated herein by reference.

viii) Szelekciós markerek(viii) Selection markers

Előnyös továbbá, ha a klónozóvektor egy szelekciós markert tartalmaz, például egy gyógyszerrezisztencia-markert, vagy egyéb más markert, amelynek folytán a gazdamikroorganizmus egy szelektálható sajátosságot fejez ki. A találmány egyik megvalósítási módjában a vektorba ampicillinrezisztencia-gént viszünk be, míg más plazmidokba tetraciklinrezisztencia- vagy kloramfenicolrezisztencia-gént viszünk be.It is further preferred that the cloning vector contains a selectable marker, such as a drug resistance marker or other marker, which causes the host microorganism to exhibit a selectable property. In one embodiment of the invention, an ampicillin resistance gene is introduced into a vector, while other plasmids contain a tetracycline resistance or chloramphenicol resistance gene.

Az ilyen gyógyszerrezisztencia- vagy más kiválasztó marker részben arra szolgál, hogy megkönnyítse a transzformánsok szelekcióját. Továbbá, az ilyen kiválasztó marker jelenléte a klónozóvektorban hasznos lehet a szennyező mikroorganizmusoknak a tápközegben való szaporodásának megakadályozására. Ebben a megvalósítási formában a transzformált gazdamikroorganizmusok tiszta tenyészetét nyeljük a mikroorganizmusnak olyan körülmények között történő tenyésztésével, amelyek az indukált fenotípus életben maradásához szükségesek.Such drug resistance or other selectable markers serve, in part, to facilitate selection of transformants. Furthermore, the presence of such a selectable marker in the cloning vector may be useful in preventing the growth of contaminating microorganisms in the medium. In this embodiment, pure culture of the transformed host microorganisms is ingested by culturing the microorganism under conditions necessary for the induced phenotype to survive.

Az előzőekben említett operációs elemeket szakember rutinszerűen választhatja ki az előzőekben ismertetett szakirodalom és a leírásban szereplő kitanítás alapján. Az ilyen operációs elemek általános példáit ismertetik a B. Lewin; Genes, Wiley & Sons, New York (1983) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az előzőekben ismertetett vektorokon számos különböző megfelelő operációs elem található, ezek megismerhetők az előzőekben említett vektorok alapvető jellemzőivel foglalkozó szakirodalom áttekintése révén.The operative elements mentioned above may be routinely selected by one of ordinary skill in the art, based upon the literature described above and the teachings herein. General examples of such operating elements are described in B. Lewin; Genes, Wiley & Sons, New York (1983), which is incorporated herein by reference. The vectors described above have a variety of suitable operating elements, and will be apparent from a review of the literature on the basic characteristics of the aforementioned vectors.

Úgy véljük, hogy az ilyen vektorok összeállítása a szakembertől elvárható kötelességek és feladatok körén belül esik, így szakember ennek megvalósítására túlzott kísérletek nélkül képes. Például, megfelelő klónozóvektorokba hasonló DNS-szekvenciákat ligálunk, mint amilyeneket Maniatis és munkatársai [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984)] leírnak, közleményüket leírásunkba referenciaként építjük be.It is believed that the construction of such vectors is within the scope of the duties and tasks expected of one skilled in the art, so that one skilled in the art can accomplish this without undue experimentation. For example, DNA sequences similar to those described by Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984) are ligated into suitable cloning vectors and incorporated herein by reference.

A találmány szerint összeállított klónozóvektorok tekintetében megjegyezzük továbbá, hogy minden egyes vektorba a DNS-szekvenciának és az azt kísérő operációs elemeknek több másolata építhető be. Az egy vektorba beépíthető DNS-szekvencia több másolatának számát csak a kapott vektornak a méretéből adódó az a képessége korlátozza, hogy a megfelelő gazdasejtbe bevihető legyen, és ott szaporodásra és transzkripcióra képes legyen.In addition, with respect to the cloning vectors constructed in accordance with the present invention, it is noted that multiple copies of the DNA sequence and accompanying operative elements may be incorporated into each vector. The number of copies of a DNA sequence that can be inserted into a single vector is limited only by the size of the resulting vector, its ability to be introduced into the appropriate host cell, and to be able to reproduce and transcribe there.

ó) Egyéb mikroorganizmusokó) Other micro-organisms

A találmány körébe tartoznak más, az E. colitól eltérő mikroorganizmusokba bevihető vektorok is. Ilyen vektorokat ismertetünk az I. táblázatban. Az alábbiakban néhány előnyös vektort ismertetünk.Other vectors that can be introduced into microorganisms other than E. coli are within the scope of the invention. Such vectors are described in Table I below. The following are some preferred vectors.

1. táblázatTable 1

Gazda- szervezetek Farmer- organizations Szabályozott promoterek Regulated promoters Inducer inducer Transzkripció- terminátor transcription terminator MRNS- stabilizálás mRNA stabilization Transzkripciós kezdőhely és szignálpcptid Transcription start site and signal peptide Marker marker RS- kötési hely RS binding site E. coli E. coli Lac¹, Tac² lambda pL Trp⁵ Lac ¹ , Tac ² lambda pL Trp ⁵ IPTG emelt hőmérséklet IAA- adagolás vagy tripto- fánkiürítés IPTG raised temperature IAA dosage or tripto- fánkiürítés rmB⁶ rmC⁷ rmB ⁶ rmC ⁷ ompA⁸ lambda int⁹ trp¹⁰ ompA ⁸ lambda int ⁹ trp ¹⁰ bla ompA¹² phoSbla ompA ¹² phoS ampicillin¹⁴ tetraciklin¹⁴·¹⁵ kloram- fenicol¹⁶ ampicillin ¹⁴ tetracycline ¹⁴ · ¹⁵ chloramphenicol ¹⁶

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

I. táblázat (folytatás)Table I (continued)

Gazda- szervezetek Farmer- organizations Szabályozott promoterek Regulated promoters Inducer inducer Transzkripció- terminátor transcription terminator MRNS- stabilizálás mRNA stabilization Transzkripciós kezdőhely és szignálpeptid Transcription start site and signal peptide Marker marker RS- kötési hely RS binding site Bacillus Bacillus *a-amiláz¹⁷ *szubtilizin¹⁸ *p-43¹⁹ spac-I²⁶ * a-amylase ¹⁷ * subtilisin ¹⁸ * p-43 ¹⁹ spac-I ²⁶ IPTG IPTG E. coli rm rmBT.T²⁰ E. coli rm rmBT.T ²⁰ B. ami neutrális proteáz²¹ B. ami a-amiláz²² B. subt. szubtilizin²³ B. which is a neutral protease ²¹ B. which is a-amylase ²² B. subt. subtilisin ²³ Kan'²⁴ Cam^r25 Kan 'Cam ^{24 r25} B. ami neutrális proteáz B. ami aamiláz²² B. which is a neutral protease B. which is aamylase ²² Pseudomonas Pseudomonas Trp²⁷ (E. coli) Lac (E. coli) Tac (E. coli)Trp ²⁷ (E. coli) Lac (E. coli) Tac (E. coli) IAAadagolás vagy triptofánkiürítés IPTG IAAdosing or removal of tryptophan IPTG foszfolipáz C²⁸ exotoxin A²⁹ phospholipase C ²⁸ exotoxin A ²⁹ szulfonamid³⁰ sztrepto- micin³⁰ sulfonamide ³⁰ streptomycin ³⁰ Ttp (E. coli) ttp (E. coli) Gál l³', 1032 Adh I³³ II³⁴ Pho5Gal l ³ ', 1032 Adh I ³³ II ³⁴ Pho5 Glükózkiürítés és galaktóz-glükóz kiürítés foszfátkiürítés Glucose Elimination And Galactose Glucose Elimination Phosphate Elimination Cyc 1 Una a-faktor Sac 2 Cyc 1 Una ? -factor Sac 2 Invertáz³⁶ Savas foszfatáz³⁶ a-faktorInvertase ³⁶ Acid phosphatase ^{36 is} a factor Ura 3³⁷ Leu 2³⁸ His 3 Táp 1Lord 3 ³⁷ Leu 2 ³⁸ His 3 Feed 1

1. Backman, K. Ptasnne, M. és Gilbert, W.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).1. Backman, K. Ptasnne, M. and Gilbert, W .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).

2. de Boer, H. A., Comstock, L. J., és Vasser, M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).2. de Boer, H.A., Comstock, L.J., and Vasser, M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983).

3. Shimatake, H. és Rosenberg, M.; Natúré 292, 128-132 (1981).3. Shimatake, H. and Rosenberg, M.; Natur. 292, 128-132 (1981).

4. Derom. C., Gheysen, D. és Fiers, W.; Gene 17, 15-51 (1982).4. Derom. C., Gheysen, D. and Fiers, W .; Gene 17, 15-51 (1982).

5. Hallawell R. A. és Entage, S.; Gene 9, 27-47 (1980).5. Hallawell, R.A. and Entage, S.; Gene 9, 27-47 (1980).

6. Grosius, J., Dűli. T. J., Sleeter, D. D., és Noller, H. F.; J. Mól. Bioi. 148 107-127 (1981).6. Grosius, J., Dûli. T. J., Sleeter, D. D., and Noller, H. F.; J. Mole. Biol. 148: 107-127 (1981).

7. Normanly, J., Ogden, R. C., Horváth, S. J. és Abelson, J.; Natúré 321, 213-219 (1986).7. Normanly, J., Ogden, R.C., Horváth, S.J. and Abelson, J.; Natura 321: 213-219 (1986).

8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. és Conen, S. N.; Cell 46, 245-251 (1986).8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. and Conen, S. N .; Cell 46: 245-251 (1986).

9. Schmelssner, W., McKenney, K., Rosenberg M. és Court, D.; J. Mól. Bioi. 176, 39-53 (1984).9. Schmelssner, W., McKenney, K., Rosenberg, M., and Court, D.; J. Mole. Biol. 176: 39-53 (1984).

10. Mott. J. E., Galloway, J. L. és Platt, T.; EMBO J. 4 1887-1891 (1985).10. Mott. J. E., Galloway, J. L. and Platt, T.; EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).

11. Koshlés, D. és Botstein, D.; Cell 20, 749-760 (1980).11. Koshlés, D. and Botstein, D.; Cell 20: 749-760 (1980).

12. Movva. N. R., Kakamura, K. és Inouye, M.; J. Mól. Bioi. 143, 317-328 (1980).12. Movva. N. R., Kakamura, K. and Inouye, M.; J. Mole. Biol. 143: 317-328 (1980).

13. Surin, Β. P., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Shaw, D. C., Cox, G. B. és Rosenberg, M.; J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).13. Surin, Β. P., Jans, D.A., Fimmel, A.L., Shaw, D.C., Cox, G.B. and Rosenberg, M .; J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).

14. Sutcliffe, J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978).14. Sutcliffe, J. G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3737-3741 (1978).

15. Peden, K. W. C.; Gene 22, 277-280 (1983).15. Peden, K. W. C.; Gene 22: 277-280 (1983).

16. Alton, N. K. és Vapnek, D.; Natúré 282, 864-869 (1979).16. Alton, N. K. and Vapnek, D .; Natur. 282, 864-869 (1979).

17. Yang, M., Galizzi, A., és Henner, D.; Nuc. Acids Rés. 11(2), 237-248 (1983).17. Yang, M., Galizzi, A., and Henner, D.; Nuc. Acids Slit. 11 (2): 237-248 (1983).

18. Wong. S.-L., Price, C. W., Goldfarb, D. S., és Dói, R. M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).18. Wong. S.-L., Price, C.W., Goldfarb, D.S., and Dói, R.M.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1184-1188 (1984).

19. Wang. P.-Z., és Dói, R. M.; J. Bioi. Chem. 259, 8619-8625 (1984).19. Wang. P.-Z., and Dói, R.M .; J. Bioi. Chem. 259: 8619-8625 (1984).

20. Lin. C.-K., Quinn, L. A. Rodriquez, R. L.; J. Cell Biochem. Suppl. (9B), p. 198 (1985).20. Lin. C.-K., Quinn, L.A. Rodriquez, R.L.; J. Cell Biochem. Suppl. (9B), p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., és Filpula, D.; J. Bact. 159(3), 811-819(1984).21. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., and Filpula, D.; J. Bact. 159 (3): 811-819 (1984).

22. Palva, I., Sarvas, m., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., és Kaariainen, L.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).22. Palva, I., Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., and Kaariainen, L .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).

23. Wong. S.-L., Pricee, C. W., Goldfarb, D. S„ és Dói, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).23. Wong. S.-L., Pricee, C.W., Goldfarb, D.S., and Dói, R.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M. A., Yasbin, R. E., és Young, F. E.; Gene 29, 21-46(1984).24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., and Young, F.E .; Gene 29, 21-46 (1984).

25. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., és Filpula, D.; J. Bact. 159(3), 811-819(1984).25. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J., and Filpula, D.; J. Bact. 159 (3): 811-819 (1984).

26. Yansura, D. G. és Henner, D. J.; PNAS 81, 439-443 (1984).26. Yansura, D.G. and Henner, D.J.; PNAS 81, 439-443 (1984).

27. Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. és Heyneker, H. L.; Biotechnology, 161-165(1984).27. Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H., and Heyneker, H. L.; Biotechnology, 161-165 (1984).

28. Lory, S„ és Tai, P. C.; Gene 22, 95-101 (1983).28. Lory, S.S. and Tai, P.C.; Gene 22: 95-101 (1983).

29. Liu, P. V.; J. Infect. Dis. 130 (supl), 594-599 (1974).29. Liu, P. V.; J. Infect. Dis. 130 (supl), 594-599 (1974).

30. Wood, D. G., Hollinger, M. F. és Tindol, Μ. B.; J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).30. Wood, D.G., Hollinger, M.F. and Tindol, Μ. B .; J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).

31. St. John, T. P. és Davis, R. W.; J. Mól. Bioi. 152, 285-315 (1981).31. St. John, T. P. and Davis, R. W.; J. Mole. Biol. 152: 285-315 (1981).

32. Hopper, J. E. és Rowe, L. B.; J. Bioi. Chem. 253, 7566-7569 (1978).32. Hopper, J. E. and Rowe, L. B.; J. Bioi. Chem. 253: 7566-7569 (1978).

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

33. Denis, C. L., Ferguson, J. és Young, E. T.; J. Bioi.33. Denis, C. L., Ferguson, J. and Young, E. T.; J. Bioi.

Chem. 258, 1165-1171 (1983).Chem. 258: 1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf. L. és Megnet, R.; Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944(1968).34. Lutsdorf. L. and Megnet, R .; Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968).

35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, M. és Hinnen,35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, M. and Hinnen,

A.; EMBO. J. S. 675-680 (1982).THE.; EMBO. J. S. 675-680 (1982).

36. Watson, Μ. E.; Nucleic Acid Research 12,36. Watson, Μ. E .; Nucleic Acid Research 12,

5145-5164(1984).5145-5164 (1984).

37. Gerband, C. és Guerineau, M.; Curr. Génét. 1,37. Gerband, C. and Guerineau, M.; Curr. Genet. 1

219-223 (1980).219-223 (1980).

38. Hinnen, A., Hicks, J. B. és Fink, G. R.; Proc. Natl.38. Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R.; Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M. A., Sivasubbramamian, N. és Nayak, D.39. Jabbar, M.A., Sivasubbramamian, N. and Nayak, D..

P.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).P .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

i) Pseudomonas-vektoroki) Pseudomonas vectors

Néhány, a Gram-negatív baktériumok széles tartományában autonóm replikációra képes vektorplazmid előnyösen használható a Pseudomonas nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben klónozóvektorként. Ezek közül néhányat a következő szakirodalmi helyeken ismertetnek: Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, M. Rodriguez, R. L. és Kado, C. I., Biotechnology, 1983. május, 269-275; Panopoulos, N. J.: Genetic Engineering in the Plánt Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, 163-185. oldal (1981); és Sakagucki, K. : Current Topic in Microbiology and Immunology 96, 31-45 (1982); ezeket a szakirodalmi helyeket leírásunkba referenciaként építjük be.Some vector plasmids capable of autonomous replication in a wide range of Gram-negative bacteria can be advantageously used as a cloning vector in hosts of the genus Pseudomonas. Some of these are described in Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, M. Rodriguez, R. L. and Kado, C. I., Biotechnology, May 1983, 269-275; Panopoulos, N.J .: Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, 163-185. (1981); and Sakagucki, K., Current Topic in Microbiology and Immunology 96, 31-45 (1982); these references are incorporated herein by reference.

Egy különösen előnyös konstrukció az RSF1010 plazmidot és származékait tartalmazza, amelyeket a Bagdasarian, M., Bagdasarian, Μ. M., Coleman, S., és Timmis, K. N.; Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, szerk: Timmis, K. N. és Puhler, A., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979) szakirodalmi helyen ismertetnek, ezt referenciaként leírásunkba beépítjük. Az RSF1010 előnye, hogy viszonylag kicsi, nagy másolati számú plazmid, amely könnyen transzformálható mind E. coli, mind Pseudomonas fajokba, és azokban stabilan fenntartható. Ebben a rendszerben előnyös az Escherichia esetére leírt Tac expressziós rendszer alkalmazása, mivel úgy tűnik, hogy az E. coli trp promoter könnyen felismerhető a Pseudomonas RNS-polimeráz számára, amint azt Sakagucki, K. [Current Topics in Microbiology and Immunology 96; 31-45 (1982)] és Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H., and Heyneker, H. L. [Biotechnology, 1984. febr., 161-165.] ismertetik. Az előbbi szakirodalmakat leírásunkba referenciaként építjük be. A transzkripciós aktivitás tovább maximalizálható a promoter kicserélésével, például E. coli vagy P. aeruginosa trp promoterre. Továbbá, az E. coli lacl-génje is beépíthető a plazmidba, hogy szabályozó szerepet töltsön be.A particularly preferred construct contains the plasmid RSF1010 and its derivatives as described in Bagdasarian, M., Bagdasarian, Μ. M., Coleman, S., and Timmis, K.N .; Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, eds., Timmis, K.N. and Puhler, A., Elsevier / North Holland Biomedical Press (1979), incorporated herein by reference. The advantage of RSF1010 is that it is a relatively small, high copy plasmid that is easily transformed into and stably maintained in both E. coli and Pseudomonas species. In this system, the Tac expression system described for Escherichia is preferred because the E. coli trp promoter appears to be readily recognized by Pseudomonas RNA polymerase as reported by Sakagucki, K., Current Topics in Microbiology and Immunology 96; 31-45 (1982) and Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H., and Heyneker, H.L. (Biotechnology, Feb. 1984, 161-165). The foregoing literature is incorporated herein by reference. Transcriptional activity can be further maximized by replacing the promoter, for example, with the E. coli or P. aeruginosa trp promoter. Furthermore, the E. coli lacl gene can also be inserted into the plasmid to play a regulatory role.

A transzláció bármely Pseudomonas fehérje esetén transzlációiniciáláshoz köthető, valamint bármely, az inhibitor intracelluláris kifejeződését kiváltó típusú, nagy expressziójú fehérje iniciációs helyéhez.The translation can be linked to translation initiation for any Pseudomonas protein, as well as to the initiation site of any type of high expression protein that induces the intracellular expression of the inhibitor.

Azokban az esetekben, amikor nem hozzáférhető egy mínusz restrikciós Pseudomonas fajba tartozó gazdatörzs, az E. coliból izolált plazmidszerkezet transzformációs hatékonysága igen gyenge. Ezért szükséges a Pseudomonas klónozóvektomak a kívánt gazdaszervezetbe való transzformálását megelőzően egy másik faj r- m+ törzsén át való passzálása, amint azt Bagdasarian, M., és munkatársai [Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, 411-422. oldal, szerkesztők: Timmis és Puhler, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979)] leírják, ezt a munkát leírásunkba referenciaként építjük be.In those cases where a minus restriction host Pseudomonas strain is not available, the transformation efficiency of the plasmid construct isolated from E. coli is very poor. Therefore, it is necessary to passage the rm m + strain of another species prior to transformation of the Pseudomonas cloning vector into the desired host, as described by Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, 411-422. (eds. Timmis and Puhler, Elsevier / North Holland Biomedical Press (1979)), which is incorporated herein by reference.

ii) Bacillus-vektorokii) Bacillus vectors

Egy további előnyös expressziós rendszer a Bacillus fajba tartozó gazdaszervezetben pUBl 10 plazmid alkalmazása klónhordozóként. Mint más gazdavektorrendszerekben, a Bacillus gazdaszervezet esetén is lehetséges a találmány szerinti IL— li intracelluláris vagy kiválasztott fehérjeként való kifejezése. A találmány megvalósítási módja mindkét rendszert magában foglalja. Különböző gének létrehozására és vizsgálatára alkalmas, mind Bacillus, mind E. coli fajokban replikációra képes szállítóvektorok hozzáférhetőek, ezek leírása a Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., és Shivakumar, A. G. [Genetic Engineering, 2. kötet, szerkesztők: Setlow és Hollander, Plenum Press, New York, New York, 115-131. oldal (1980)] szakirodalmi helyen található, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Az IL-li-nek B. subtilisből való kifejezése és kiválasztása céljából az α-amiláz szignálszekvenciát előnyösen a fehérjét kódoló régióhoz kapcsoljuk. Intracelluláris inhibitor szintézisére a változtatható helyű DNS-szekvenciát az α-amiláz vezetőszekvencia riboszómakötési helyéhez kapcsoljuk transzlációsán.Another preferred expression system in the host species of Bacillus is the use of plasmid pUB110 as a clone carrier. As with other host vector systems, it is possible for the Bacillus host to express the IL-li of the invention as an intracellular or selected protein. The embodiment of the invention includes both systems. Transport vectors capable of generating and screening various genes that are replicable in both Bacillus and E. coli species are available and are described in Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., and Shivakumar, A.G., Genetic Engineering, Vol. editors Setlow and Hollander, Plenum Press, New York, New York, 115-131. (1980)], which is incorporated herein by reference. Preferably, the α-amylase signal sequence is linked to the protein coding region for expression and selection of IL-li from B. subtilis. For the synthesis of an intracellular inhibitor, the variable region DNA sequence is translated to the ribosome binding site of the α-amylase leader sequence.

Ezen konstrukciók bármelyikének transzkripcióját előnyösen α-amiláz-promoterrel vagy származékával irányítjuk. Ez a származék tartalmazza a natív a-amiláz-promoter RNS-polimeráz-felismerő szekvenciáját, de tartalmazza a lac operátorrégiót is. Hasonló hibrid promoterek konstruálhatok a penicillinázgén-promoterből és a lac operátorból, ezek Bacillus gazdaszervezetben szabályozható módon működnek, amint azt Yansura, D. G. és Henner [Genetics and Biotechnology of Bacilli, szerkesztők: Ganesan, A. T. és Hoch, J. A., Academic Press, 249-263. oldal (1984)] ismerteti. Ezt a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Az E. coli lacl-génje ugyancsak bevihető a plazmidba, hogy szabályozó hatást fejtsen ki.Preferably, the transcription of any of these constructs is directed by the α-amylase promoter or derivative thereof. This derivative contains the RNA polymerase recognition sequence of the native α-amylase promoter, but also contains the lac operator region. Similar hybrid promoters can be constructed from the penicillinase gene promoter and the lac operator, and they operate in a Bacillus host in a controllable manner as described by Yansura, DG and Henner, Ganesan, AT and Hoch, JA, Academic Press, 249-23. . (1984). This reference is incorporated herein by reference. The E. coli lacl gene can also be introduced into the plasmid to exert a regulatory effect.

iii) Clostridium-vektorokiii) Clostridium vectors

Egy, a Clostridiumban való kifejeződésre alkalmas előnyös konstrukció a pJU12 plazmidban van, amelyet Squires, C. H. és munkatársai [J. Bacteriol. 159, 465-471 (1984)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be, ez a konstrukció C. perfringensbe transzformálható Heefher, D. L. és munkatársai [J. Bacteriol. 159, 460-464 (1984)] eljárásával, amely eljárást leírásunkba referenciaként építünk be. A transzkripciót a tetraciklinrezisztencia-gén promoterje irányítja. A transzláció az azonos tet^r gén Shine-Dalgamoszekvenciájához kötődik szorosan analóg módon azzal az eljárással, amelyet az előzőekben egyéb gazdaszervezetekben való alkalmazásra megfelelő vektorok esetén leírtunk.A preferred construct suitable for expression in Clostridium is contained in plasmid pJU12, as described by Squires, CH et al. Bacteriology. 159: 465-471 (1984), the reference being incorporated herein by reference, which can be transformed into C. perfringens by Heefher, DL et al., J. Med. Bacteriology. 159, 460-464 (1984)], which is incorporated herein by reference. Transcription is driven by the promoter of the tetracycline resistance gene. The translation binds closely to the Shine-Dalgamos sequence of the same tet ^r gene in a manner analogous to that described above for vectors suitable for use in other hosts.

HU 222 810 Bl iv) ÉlesztővektorokEN 222 810 Bl iv) Yeast vectors

Élesztőbe bevitt idegen DNS fenntartása néhány különböző módon végezhető, amelyeket Botstein, D. és Davis, R. W.: [The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathem, Jones és Broach szerkesztők, 607-636. oldal (1982)] ismertetnek, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. Egy, a Saccharomyces nemzetségbe tartozó gazdaszervezetekben való alkalmazás esetén előnyös kifejeződési rendszer az IL-li gént a 2 mikron plazmidhoz köti. A 2 mikron kör előnye abban áll, hogy cir° törzsekbe bevive viszonylag nagy másolati számú és stabilitású. Ezek a vektorok előnyösen magukban foglalják a replikációkezdést és a pBR322-ből legalább egy antibiotikumrezisztencia-markert, hogy lehetővé tegyék az E. coliban való replikációt és szelekciót. Ezenkívül a plazmid előnyösen tartalmazza a két mikron szekvenciát és az élesztő-LEU2 gént, amely azonos célt szolgál a LEU2 élesztő hiánymutánsban.Maintenance of foreign DNA introduced into yeast can be accomplished in a number of different ways, as described by Botstein, D. and Davis, R.W., in Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathem, Jones and Broach, 607-636. (1982), which is incorporated herein by reference. A preferred expression system for use in hosts belonging to the genus Saccharomyces binds the IL-li gene to the 2 micron plasmid. The advantage of the 2 micron circle is that it is introduced into cir ° strains with relatively high copy number and stability. Preferably, these vectors include replication initiation and at least one antibiotic resistance marker from pBR322 to allow replication and selection in E. coli. In addition, the plasmid preferably contains the two micron sequence and the yeast LEU2 gene, which serves the same purpose in the yeast deficient mutant LEU2.

Ha a rekombináns IL-1-inhibitort végül élesztőben kívánjuk kifejezni, előnyös, ha a klónozóvektort először Escherichia coliba visszük, ahol a vektor szaporodni képes, és ahonnan a vektort szaporodás után tisztított formában nyerjük ki. A vektort ezután az IL-l-inhibitor végső kifejezése céljából az élesztőbe visszük.If the recombinant IL-1 inhibitor is ultimately to be expressed in yeast, it is preferred that the cloning vector is first introduced into Escherichia coli, where the vector is capable of replication and from which the vector is recovered after purification. The vector is then introduced into yeast for the final expression of the IL-1 inhibitor.

c) Emlőssejtek(c) Mammalian cells

Az IL-1-inhibitor cDNS szolgál génként az inhibitornak emlőssejtekben való kifejeződéséhez. Olyan szekvenciával kell bírnia, amely a riboszómákhoz való kötődésben hatékony, például olyannak, amint azt Kozák: [Nucleic Acids Research 75: 8125-8132 (1987)] ismerteti, a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be; és vezetőszekvencia kódolására alkalmas kapacitással kell bírnia [lásd a 3. a) vi) helyen], amely az érett fehérjét a sejtből kész formában eltávolítja. A teljes cDNS-szekvenciát hordozó DNS restrikciós fragmens beiktatható egy olyan expressziós vektorba, amely transzkripciós promoterrel és transzkripciófokozóval bír, amint azt Guarente, L. [Cell 52: 303-305 (1988)] és Kadonaga, J. T. és munkatársai [Cell 57, 1079-1090 (1987)] ismertetik, mindkét hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A promoter szabályozható lehet, mint például a pMSG-plazmidban (Pharmacia Cat. No. 27450601), ha az inhibitor konstitutív expressziója káros a sejtszaporodásra nézve. A vektornak egy teljes poliadenilezőszignállal kell bírnia, amint azt Ausubel, F. M. és munkatársai [Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)] ismertetik - a hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be -, ahhoz, hogy az mRNS transzkripciója ebből a vektorból rendesen történjen. Végül, a vektor tartalmazni fogja a replikációkezdést és legalább egy, a pBR322-ből származó antibiotikumrezisztencia-markert, hogy E. coliban való replikációja és szelekciója megvalósuljon.The IL-1 inhibitor cDNA serves as a gene for expression of the inhibitor in mammalian cells. It must have a sequence that is effective in binding to ribosomes, such as that described by Kozak, (Nucleic Acids Research 75: 8125-8132 (1987)), which is incorporated herein by reference; and must have the capacity to encode a leader sequence (see paragraph 3 (a) (vi)) which removes the mature protein from the cell in its ready form. A DNA restriction fragment carrying the entire cDNA sequence can be inserted into an expression vector having a transcriptional promoter and transcription enhancer as described by Guarente, L. (Cell 52: 303-305 (1988)) and Kadonaga, J.T., et al., Cell 57: 1079 -1090 (1987), both of which are incorporated herein by reference. The promoter may be regulated, such as in the pMSG plasmid (Pharmacia Cat. No. 27450601), when constitutive expression of the inhibitor is detrimental to cell growth. The vector must have a complete polyadenylation signal as described by Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987), incorporated herein by reference, for proper transcription of mRNA from this vector. Finally, the vector will include the initiation of replication and at least one antibiotic resistance marker from pBR322 to effect replication and selection in E. coli.

Az IL-l-inhibitor termelésére alkalmas stabil sejtvonal kiválasztása érdekében az expressziós vektor tartalmazhatja egy kiválasztó marker génjét, például egy gyógyszerrezisztencia-markert, vagy hordozhatja egy hiányos sejtvonal komplementer génjét, például a dhffsejtvonal transzformálására szolgáló dihidrofolát-reduktáz (dhfir)-gént, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben idézett hivatkozási helyen leírják. Más megoldás szerint az expressziós vektorral együtt transzformálható egy külön plazmid, amely a kiválasztó markert hordozza.To select a stable cell line for production of the IL-1 inhibitor, the expression vector may contain a gene for a selectable marker, such as a drug resistance marker, or carry a complementary gene for a defective cell line, such as the dihydrofolate reductase (dhfir) gene it is described in Ausubel et al., supra. Alternatively, a separate plasmid carrying the selectable marker can be co-transformed with the expression vector.

4. Gazdasejtek/transzformáció4. Host Cells / Transformation

Az így kapott vektort egy megfelelő gazdasejtbe visszük be. A gazdasejtek lehetnek mikroorganizmusok vagy emlőssejtek.The vector thus obtained is introduced into a suitable host cell. The host cells may be microorganisms or mammalian cells.

a) Mikroorganizmusok(a) Microorganisms

Úgy véljük, hogy bármely olyan mikroorganizmus alkalmazható, amely képes az exogén DNS felvételére, és annak génjei és kísérő operációs elemei kifejezésére. Ha a gazdaszervezetet megválasztottuk, a vektort a gazdaorganizmusba szakember számára ismert módon visszük be. Ilyen eljárásokat ismertetnek például az Advanced Bacterial Genetics, R. W. Davis és munkatársai, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980) szakirodalmi helyen, amely hivatkozást leírásunkba referenciaként építjük be. A megvalósítási formák egyikében előnyös, ha a transzformáció alacsony hőmérsékleten történik, mivel a hőmérsékletszabályozás eszközül szolgál a regulációs géneknek az operációs elemek révén való kifejeződéséhez, amint azt az előzőekben ismertettük. Egy másik megvalósítási mód szerint, amennyiben ozmoláris regulátorokat építünk a vektorba, az idegen gének megfelelő szabályozásának biztosítására a transzformáció során a sókoncentráció szabályozása szükséges.It is believed that any microorganism capable of uptake of exogenous DNA and expression of its genes and accompanying operative elements may be used. Once the host is selected, the vector is introduced into the host in a manner known to those skilled in the art. Such methods are described, for example, in Advanced Bacterial Genetics, R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980), the disclosure of which is incorporated herein by reference. In one embodiment, it is preferred that the transformation take place at low temperature, since temperature control serves as a means of expressing regulatory genes via the operating elements, as described above. In another embodiment, when osmolar regulators are incorporated into the vector, salt concentration control during transformation is required to ensure proper regulation of foreign genes.

Előnyös, ha a gazdamikroorganizmus fakultatív anaerob vagy aerob mikroorganizmus. Ebben az eljárásban előnyösen használható gazdaszervezetek közé tartoznak az élesztők és baktériumok. Előnyösek a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztők, különösen a Saccharomyces cerevisiae. Előnyösek a Bacillus, Escherichia és Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumok, különösen a Bacillus subtilis és Escherichia coli. További gazdasejteket ismertettünk az előzőekben szereplő I. táblázatban.Preferably, the host microorganism is an optional anaerobic or aerobic microorganism. Preferred hosts for use in this process include yeasts and bacteria. Yeasts of the genus Saccharomyces, in particular Saccharomyces cerevisiae, are preferred. Bacteria of the genera Bacillus, Escherichia and Pseudomonas, especially Bacillus subtilis and Escherichia coli, are preferred. Additional host cells are described in Table I above.

b) Emlőssejtek(b) Mammalian cells

A vektor bevihető emlőssejttenyészetbe, erre néhány különféle eljárás alkalmas, például kalcium-foszfát/DNS koprecipitáció, elektroporációval vagy protoplasztfuzióval. Előnyös eljárás a kalcium-foszfáttal való koprecipitáció, amint azt Ausubel és munkatársai az előzőekben hivatkozott irodalmi helyen ismertetik.The vector can be introduced into a mammalian cell culture by a variety of methods, such as calcium phosphate / DNA coprecipitation, electroporation or protoplast fusion. A preferred process is co-precipitation with calcium phosphate as described in Ausubel et al., Supra.

Számos olyan stabil sejttípus létezik, amely transzformálható, képes a cDNS-szekvencia transzkripciójára és transzlációjára, előállítja az IL-li prekurzort, és kiválasztja az érett fehéijét. A sejttípusok azonban különbözőek lehetnek a kiválasztott fehéije glükozilezését illetően, illetve az esetlegesen jelen lévő aminosavmaradékok transzlációt követő módosításában. így ideálisak azok a sejttípusok, amelyek a természetes molekulával azonos rekombináns IL-1-inhibitort termelnek.There are many stable cell types that are transformable, capable of transcription and translation of the cDNA sequence, produce the IL-li precursor, and select the mature protein. However, cell types may differ in glycosylation of the selected protein or in post-translational modification of any amino acid residues present. Thus, cell types that produce the same recombinant IL-1 inhibitor as the natural molecule are ideal.

5. Génsebészeti úton előállított sejtek tenyésztése5. Cultivation of genetically engineered cells

A gazdasejteket az IL-1-inhibitor kifejeződésének megfelelő körülmények között tenyésztjük. Ezek a körülmények általában a gazdasejtre fajlagosak, és szakem11The host cells are cultured under conditions appropriate for expression of the IL-1 inhibitor. These conditions are generally host cell specific and skilled11

HU 222 810 ΒΙ bér könnyen meghatározhatja ezeket az ilyen sejtek tenyésztési körülményeire vonatkozó szakirodalom és a leírásban adott kitanítás alapján. Ilyen ismereteket közölnek például baktériumok tenyésztési körülményeire vonatkozóan a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be. Hasonló információk találhatók élesztő és emlőssejtek tenyésztésére vonatkozóan a Pollack, R.: Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975) szakirodalmi helyen, amelyet leírásunkba referenciaként építünk be.These wages can be readily determined by reference to the literature on the culture conditions of such cells and the teachings herein. Such knowledge of, for example, culture conditions for bacteria is described in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, which is incorporated herein by reference. Similar information on yeast and mammalian cell culture can be found in Pollack, R .: Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975), which is incorporated herein by reference.

Minden olyan körülmény, amely a vektorban jelen lévő vagy abba beépített operációs elemektől függően a DNS-szekvencia expressziójának regulációjához szükséges, hatással van a transzformáció és a tenyésztési szakasz során. Egy megvalósítási mód szerint a sejteket olyan megfelelő regulációs körülmények között szaporítjuk nagy sűrűségig, amelyek gátolják a DNS-szekvencia kifejeződését. Az optimális sejtsűrűség elérése után a környezeti körülményeket oly módon változtatjuk meg, hogy azok kedvezőek legyenek a DNS-szekvencia kifejeződésének. Ennek megfelelően az IL- 1-inhibitor-termelés a gazdasejteknek közel optimális sűrűségig való szaporodása után következő időszakaszban következik be, és a kapott IL-1-inhibitort a kifejeződéséhez szükséges regulációs körülmények megvalósítása után némi idő elteltével nyerhetjük ki.Any condition that is required to regulate the expression of the DNA sequence, depending on the operating elements present in or incorporated into the vector, will have an effect during the transformation and the culture phase. In one embodiment, the cells are grown to high density under appropriate regulatory conditions that inhibit expression of the DNA sequence. Once the optimum cell density is reached, the ambient conditions are altered to favor expression of the DNA sequence. Accordingly, IL-1 inhibitor production occurs in the period following the growth of host cells to near optimal density, and the resulting IL-1 inhibitor may be recovered after some time under the regulatory conditions necessary for its expression.

6. Tisztítás6. Cleaning

a) Mikroorganizmusok által termelt IL-li(a) IL-li produced by micro-organisms

A találmány egy megvalósítási formája szerint a rekombináns IL-1 -inhibitort kinyerését követően, de aktív szerkezetének elnyerését megelőzően tisztítjuk. Ezt a megvalósítási módot azért tartjuk előnyösnek, mert úgy hisszük, hogy megkönnyíti az újrahajtogatódott fehérje nagy hozamának elérését, ha a fehérjét először tisztítjuk. Azonban egy másik előnyös eljárás szerint az IL-1-inhibitort először hagyjuk hajtogatódni, hogy megszerezze aktív szerkezetét a tisztítást megelőzően. Egy harmadik előnyös megoldás szerint az IL-1 -inhibitort újrahajtogatódott, aktív állapotában nyerjük ki a tápközegből.In one embodiment of the invention, the recombinant IL-1 inhibitor is purified after recovery but prior to obtaining its active structure. This embodiment is preferred because we believe it facilitates the achievement of a high yield of refolded protein when the protein is first purified. However, in another preferred method, the IL-1 inhibitor is first allowed to fold to obtain its active structure prior to purification. In a third preferred embodiment, the IL-1 inhibitor is recovered from the medium when it is refolded, in its active state.

Bizonyos körülmények mellett az IL-1-inhibitor elnyeri rendes, aktiv szerkezetét a gazdamikroorganizmusban való kifejeződéskor, és aktív állapotban jut át a sejtfalon vagy membránon, vagy kerül a periplazmatikus térbe. Ez általában akkor következik be, ha a rekombináns fehérjét kódoló DNS-hez a megfelelő vezetőszekvenciát kötjük. Ha az IL-l-inhibitor nem nyeri el rendes aktív szerkezetét, a képződött diszulfrdkötéseket és/vagy az előforduló nem kovalens kölcsönhatásokat kell először szétroncsolni, denaturáló- vagy redukálószerekkel, például guanidin-kloriddal és β-merkapto-etanollal, majd hígítás és ezen szerek szabályozott körülmények között történő oxidálása után az IL-1-inhibitor elnyeri aktív szerkezetét. Az újrahajtogatást megelőző és követő tisztítás során előnyösen az alábbi lépések néhány kombinációját alkalmazzuk: anioncserélő kromatográfia (MonoQ vagy DEAE-Sepharose), gélszűréses kromatográfia (Superose), kromatofokuszálás (MonoP) és hidrofób kromatográfiás interakció (oktil- vagy fenil-sepharose). Különösen értékes művelet az antitestaffinitás-kromatográfia, amelyet IL—lispecifikus monoklonális antitestekkel végzünk (ezt a 3. példában írjuk le).Under certain circumstances, the IL-1 inhibitor acquires its normal, active structure upon expression in the host microorganism and, when activated, passes through the cell wall or membrane or into the periplasmic space. This usually occurs when the appropriate leader sequence is bound to the DNA encoding the recombinant protein. If the IL-1 inhibitor does not regain its normal active structure, the disulfide bonds formed and / or the non-covalent interactions that occur are first broken down with denaturing or reducing agents such as guanidine chloride and β-mercaptoethanol, and then dilution and these agents. upon oxidation under controlled conditions, the IL-1 inhibitor retains its active structure. Preferably, some combinations of the following steps are used in the purification before and after refolding: anion exchange chromatography (MonoQ or DEAE-Sepharose), gel filtration chromatography (Superose), chromatofocusing (MonoP), and hydrophobic chromatographic interaction (oko). Particularly valuable is the antibody test affinity chromatography with IL-specific monoclonal antibodies (described in Example 3).

b) Emlőssejtekből származó IL-lib) IL-li from mammalian cells

Az emlőssejtek által termelt IL-l-inhibitort kondicionált tápközegből tisztítjuk az alábbi lépések alkalmazásával: ioncserélő kromatográfia és immunaffinitáskromatográfia a 3. példában leírt monoklonális antitestek alkalmazásával. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárás és termékek számos módosítása és variációja képzelhető el. így a találmány magában foglalja mindazokat a módosításokat és variációkat, amelyek az oltalmi körön belül esnek, valamint ezek ekvivalenseit.The IL-1 inhibitor produced by mammalian cells is purified from conditioned medium using ion exchange chromatography and immunoaffinity chromatography using the monoclonal antibodies described in Example 3. One skilled in the art will recognize that many modifications and variations of the process and products of the present invention are contemplated. Thus, the invention encompasses all modifications and variations within the scope of the invention and their equivalents.

Megjegyezzük, hogy a leírásban adott kitanítás alkalmazása egy adott problémára vagy környezetre szakember köteles tudásához tartozik. A következőkben a találmány szerinti termékekre és elkülönítésük és feldolgozásuk módjára vonatkozóan adunk példákat.Note that the application of the teachings in this specification to a particular problem or environment is within the skill of the art. The following are examples of products of the present invention and methods of isolating and processing them.

A példák a találmány különféle, előnyösnek tartott megvalósítási módjait ismertetik. A példákban szereplő közleményeket leírásunkba referenciaként építjük be.The examples illustrate various preferred embodiments of the invention. The examples in the publications are incorporated herein by reference.

1. példaExample 1

Fehérje készítéseProtein preparation

A) AnyagokA) Materials

A Hank-féle kiegyenlített sóoldatot [Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)] és az RPMI-t a Mediatech, Washington, D. C. cégtől szereztük be. A Lymphoprep az Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N. Y. cégtől származik. A humán IgG, MTT, a nyúl-antiprosztaglandin E₂ antiszérum, az ammónium-hidrogén-karbonát, a ditiotreitol, a komplett és inkomplett Freund-adjuváns, a hipoxantin, az aminopterin és a timidin a Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri) terméke. A C3H/HeJ egereket a Jakcson Labs, Bar Harbor, Maine laboratóriumból szereztük be. BALB/c egereket és a P3 mielomasejteket John Kappler és Philippa Marrack doktoroktól [the National Jewish Center fór Immunology and Respiratory Medicine (NJC/IRM), Denver, Colorado] kaptuk [Natúré 256, 495-497 (1975)]. A rekombináns humán IL-1 a Cistron Biotechnology, Pine Brook, N. J. cégtől származik. A tisztított fitohemagglutinin a Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N. C. terméke. A humán fitymafibroblasztokat primer tenyészetből dr. Richard Clarktól (NJC/IRM, Denver, Colorado) kaptuk. A monoklonális egér antinyúl-IgG antitesteket az AIA reagensgyártó cégtől (Aurora, Colorado) szereztük be. Az alacsony metionintartalmú RPMI-t Select-Amine kit (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.) alkalmazásával készítettük. A [³⁵S]-metionint, a difenil-oxazolt és a [¹⁴C]-jódecetsavat a DuPont-NEN, Chicago, Illinois cégtől szereztük be. A magzati borjúszérum származási helye a HyClone Laboratories, Logan, Utah. A Mono Q és Superose 12 oszlopok a Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J. cégtől származnak. A C4-fordított fázisú oszlopokat a Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana cégtől kaptuk.Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) and RPMI were purchased from Mediatech, Washington, DC. Lymphoprep is from Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY. Human IgG, MTT, rabbit antiprostaglandin E ₂ antiserum, ammonium bicarbonate, dithiothreitol, complete and incomplete Freund's adjuvant, hypoxanthine, aminopterin and thymidine are all from Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). C3H / HeJ mice were obtained from Jakcson Labs, Bar Harbor, Maine. BALB / c mice and P3 myeloma cells were obtained from Doctors John Kappler and Philippa Marrack of the National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicine (NJC / IRM), Denver, Colorado (Natura 256: 495-497 (1975)). Recombinant human IL-1 is from Cistron Biotechnology, Pine Brook, NJ. Purified phytohemagglutinin is a product of Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, NC. Human foreskin fibroblasts from primary culture were dr. It was obtained from Richard Clark (NJC / IRM, Denver, Colorado). Monoclonal mouse anti-rabbit IgG antibodies were obtained from the AIA reagent manufacturer (Aurora, Colorado). Low methionine RPMI was prepared using the Select-Amine kit (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY). [ ³⁵ S] -methionine, diphenyloxazole and [ ¹⁴ C] -iodoacetic acid were purchased from DuPont-NEN, Chicago, Illinois. Fetal calf serum is from HyClone Laboratories, Logan, Utah. Mono Q and Superose 12 columns are from Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ. C4 reverse phase columns were obtained from Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana.

HU 222 810 Β1HU 222 810 Β1

A C-8-fordított fázisú oszlopokat az Applied Biosystems, Inc., Foster City, Kalifornia cégtől kaptuk. Az acetonitrilt és a polietilénglikol 8000-et a J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N. J. cégtől szereztük be. A trifluor-ecetsav és a guanidin-hidrogén-klorid a Pierce Chemicals, Rockford, Illinois cégtől származik. Az endoproteináz Lys C-t a Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana cégtől kaptuk. A PGE₂ ELISA-hoz alkalmazott Nunc-Immuno Plate I mikrotiterlemezeket az Intermountain Scientific Corporation, Bountiful, Utah cégtől kaptuk. A hibridómatermelésre alkalmazott lemezek származási helye Costar, Cambridge, Massachusetts.C-8 reverse phase columns were obtained from Applied Biosystems, Inc., Foster City, California. Acetonitrile and polyethylene glycol 8000 were purchased from JT Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ. Trifluoroacetic acid and guanidine hydrochloride are from Pierce Chemicals, Rockford, Illinois. Endoproteinase Lys C was obtained from Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Nunc-Immuno Plate I microtiter plates used for PGE ₂ ELISA were obtained from Intermountain Scientific Corporation, Bountiful, Utah. Plates used for hybridoma production are from Costar, Cambridge, Massachusetts.

B) Monocita IL-1-inhibitor létrehozásaB) Generation of monocyte IL-1 inhibitor

Humán leukocitákat nyerünk normál donoroktól leukoforézissel, a leukocitákat Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (HBSS) 1 rész sejt: 1 rész HBSS arányban szuszpendáljuk, Lymphoprepet rétegezünk alá, és 30 percig szobahőmérsékleten 400xg értéken centrifugáljuk. A mononukleáris frakciót elkülönítjük (egy donortól jellemzően 4-5 xlO⁹ sejtet nyerünk), Ca⁺⁺ vagy Mg⁺⁺ nélküli HBSS-sel mossuk, szérummentes RPMI-ben szuszpendáljuk, és Sephadex G200 kromatográfiás eljárással LPS-mentessé tett normál humán IgG-vel bevont Petri-csészékre szélesztjük (6xl0⁷ sejt 10 ml oldatban/100 mm-es csésze). Minden reagens 10 pg/ml alatti mennyiségű LPS-tartalmú. A sejteket 24-48 órán át tenyésztjük, a kapott kondicionált tápközeg tartalmazza a nyers IL-1-inhibitor (IL-li) felülúszót. Jellemzően egy donortól származó sejtek 700-900 ml nyers IL- li felülúszót eredményeznek.Human leukocytes are obtained from normal donors by leukophoresis, the leukocytes are resuspended in Hank's Balanced Saline (HBSS) 1 part cell: 1 part HBSS, and Lymphoprep is layered and centrifuged at 400xg for 30 minutes at room temperature. The mononuclear fraction was separated (typically 4-5 x ^{10 9} cells from a donor), washed with HBSS without Ca ⁺⁺ or Mg ⁺⁺ , suspended in serum-free RPMI, and LPS-free normal human IgG by Sephadex G200 chromatography. plated on coated Petri dishes (6x10 ⁷ cells in 10 ml solution / 100 mm dish). Each reagent contained less than 10 pg / ml of LPS. The cells are cultured for 24-48 hours and the conditioned medium obtained contains the crude IL-1 inhibitor (IL-li) supernatant. Typically, cells from a donor will yield 700-900 ml of crude IL-li supernatant.

C) Az IL-1-inhibitor vizsgálataC) Assay for IL-1 inhibitor

Az IL-li kimutatására rutinszerűen két IL-1 vizsgálati eljárást alkalmazunk. Timociták szaporodása (4-6 hetes, C3H/HeJ egerekből származó 1 χ 10⁶ sejt) 1,0 egység/ml rekombináns humán IL-1 és 1 pg/ml fitohemagglutinin hatására adott válaszként a 3 napos stimulálással elért maximális érték felére csökken, ezt ³H-timidin-beépüléssel vagy MTT tetrazóliumsófelvétellel [Mosmann, T. J., Immunoi. Method, 65, 55-61 (1983)] méljük. A nyers IL-li felülúszó 10szeres hígításban teljes mértékben gátolja ezt a szaporodási választ. Humán dermális fibroblasztok (1 χ 10⁵ sejt lyukanként egy 96 lyukú lemezen) jellemzően válaszolnak 0,5 egység/ml rekombináns humán IL-1 hatására úgy, hogy 6 órás stimulálás után mintegy 50 000 pg/ml PGE₂-t választanak ki, amely ELISA-val mérhető. Ez a vizsgálat éppoly érzékeny IL-li hatására, mint a fenti timocitavizsgálat.Two IL-1 assays are routinely used to detect IL-li. Thymocyte proliferation (4-6 weeks, 1 3 10 ⁶ cells from C3H / HeJ mice) is halved in response to 1.0 U / ml recombinant human IL-1 and 1 pg / ml phytohemagglutinin, ³ H-thymidine incorporation or MTT tetrazolium salt uptake [Mosmann, TJ, Immunol. 65: 55-61 (1983)]. Crude IL-li supernatant at 10-fold dilution completely inhibited this proliferation response. Human dermal fibroblasts (1 × 10 ⁵ cells / well in a 96-well plate) typically respond to 0.5 units / ml recombinant human IL-1 by secreting approximately 50,000 pg / ml PGE ₂ after 6 hours of stimulation. Measured by ELISA. This assay is as sensitive to IL-li as the above thymocyte assay.

D) Az IL-1-inhibitor metabolikus jelzéseD) Metabolic labeling of IL-1 inhibitor

Az IL-l-inhibitort metabolikusan jelezzük oly módon, hogy mononukleáris leukocitákat 48 órán át [a B) lépésben leírt] IgG-bevonatú lemezeken szérummentes, csak 0,75 pg/ml hideg metionint tartalmazó (a normál érték 15 pg/ml) RPMI-ben, amelyhez 10⁷ sejtenként 0,5 mCi ³⁵S-metionint (1151 Ci/mmol) adtunk, tenyésztünk. Kontrolljelzést végzünk a fentivel azonos módon, azzal az eltéréssel, hogy a lemezeket IgG helyett magzati borjúszérummal vonjuk be. Az ilyen kontrollfelülúszókkal végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy igen kevés IL-li választódik ki, ha a sejteket magzati boíjúszérummal bevont lemezeken tenyésztjük.The IL-1 inhibitor is metabolically labeled by serum-free RPG containing 0.75 pg / ml cold methionine (normal value 15 pg / ml) for 48 hours in IgG coated plates (described in step B). in culture, to which 0.5 mCi of ³⁵ S-methionine (1151 Ci / mmol) was added per 10 ⁷ cells. Controls were performed in the same manner as above, except that the plates were coated with fetal calf serum instead of IgG. Studies with such control supernatants show that very little IL-1i is secreted when cells are cultured on plates coated with fetal calf serum.

E) Az IL-1-inhibitor fehérje tisztításaE) Purification of the IL-1 inhibitor protein

A nyers IL-li felülúszót nátrium-kloriddal 1,0 mol/l-es oldattá alakítjuk, jégen 1 órán át inkubáljuk, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. A teljes inhibitoraktivitást, de a kiindulási fehérjének csak 20%-át tartalmazó felülúszót 4 °C hőmérsékleten 0,025 mol/l-es, pH=7,6-os, 0,1% szacharózt tartalmazó trisz-pufferrel (A puffer) szemben kimerítően dializáljuk, a fehérjék gradiensffakcionálását egy Mono Q anioncserélő oszlopon végezzük. Az inhibitortartalmú oldat dialízisét folytatjuk, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáljuk. Ezután az oldatot 0,22 μ-os nejlonszűrőkön visszük át. A felülúszókat 10 ml, metabolikus jelzéssel készült, hasonlóan feldolgozott felülúszóval egyesítjük, és 1,0 ml vagy 8,0 ml ágytérfogatú Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC) oszlopokra visszük, és A pufferrel mossuk mindaddig, amíg az elfolyó OD₂₈₀ értéke az alapvonalra visszatér, ezután az A pufferben készült 0,025 mol/1 és 0,10 mol/1 közötti lineáris koncentrációgradiensű oldattal eluáljuk az oszlopot. Az oszlopról vett frakciókat gyűjtjük, és elemezzük radioaktivitásukat és bioaktivitásukat. Az egyes frakciókból vett mintákat redukált 12,5%-os SDS-PAGE alkalmazásával futtatjuk, ezüsttel színezzük, difenil-oxazollal átitatjuk, szárítjuk, majd filmre helyezve autoradiográfrás adatokat nyerünk. Az 1A. ábrán 40 ml nyers IL-li felülúszó és 3 ml metabolikusan jelzett IL-li felülúszó elegyének Mono Q kromatográfiával nyert proteinprofilját mutatjuk be. Erre az ábrára ráhelyezve láthatók az egyenként 50 pl-es frakciók radioaktivitásadatai, valamint az IL-1 i PGE₂-termelés révén mért bioaktivitása. Két nagyobb és egy kisebb radioaktív csúcs látható, amely teljes korrelációban van a három bioaktivitáscsúccsal. Az 1B. ábrán hasonló kromatogramot látunk, amely 15 ml nyers IL-li felülúszónak 3 ml olyan metabolikusan jelzett monocita felülúszóval való elegyéből származik, amelyet IgG helyett magzati boíjúszérummal (FCS) bevont lemezen tenyésztettünk. Az előzőekben tárgyalt három radioaktív csúcs jelentősen kisebbé vált. A 2A. ábrán az 1A. és 1B. ábrán látható kromatogram alapján érdeklődésre számot tartó tartomány frakcióinak ezüsttel festett gélkromatogramját mutatjuk be. Megjegyezzük, hogy az 1A. ábrán radioaktív és bioaktív csúcsot adó frakciók (52. és 59. frakció) mindegyike egy nagy sávot ad 22 kD-nál (nyíllal jelölve) SDS-PAGE-ben. A harmadik csúcs (az 1A. ábra 48. frakciója) SDS-PAGE-ben 20 kD-nál sávot ad. A nyers IL-li gélszűréses vizsgálata az aktív molekula 18-25 kD-os molekulatömegére utal. A 2B. ábra a 2A. ábrán bemutatott gél autoradiogramja. Jól látható, hogy a 20 és 22 kD-os fehéijesávok a legnagyobb radioaktivitással bíróak a frakciók közül.The crude IL-li supernatant was reconstituted with 1.0 M NaCl, incubated on ice for 1 hour, and centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. The total inhibitory activity but the supernatant containing only 20% of the starting protein was dialyzed extensively at 4 ° C against 0.025 M Tris buffer (pH A) containing 0.1% sucrose (buffer A). , gradient fractionation of proteins was performed on a Mono Q anion exchange column. Dialysis of the inhibitor-containing solution was continued and centrifuged at 10,000 rpm for 15 minutes. The solution was then passed through 0.22 μ nylon filters. The supernatants were combined with 10 ml of metabolically labeled similarly processed supernatant and applied to 1.0 ml or 8.0 ml bed volume Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC) columns and washed with buffer A until the effluent OD ₂₈₀ reached baseline. then elute the column with a linear concentration gradient of 0.025 mol / l to 0.10 mol / l in buffer A. Fractions taken from the column are collected and analyzed for radioactivity and bioactivity. Samples from each fraction were run using reduced 12.5% SDS-PAGE, stained with silver, impregnated with diphenyloxazole, dried and then loaded onto film to obtain autoradiographic data. 1A. Fig. 1A shows the protein profile obtained by Mono Q chromatography of a mixture of 40 ml of crude IL-li supernatant and 3 ml of metabolically labeled IL-li supernatant. Placed on this figure is the radioactivity data for each 50 µl fraction as well as the bioactivity of IL-1 by PGE ₂ production. Two larger and one smaller radioactive peak are shown which are fully correlated with the three peaks of bioactivity. 1B. Fig. 5A shows a similar chromatogram obtained from a mixture of 15 ml of crude IL-li supernatant with 3 ml of metabolically labeled monocyte supernatant grown on IgS-coated fetal calf serum (FCS) plate. The three radioactive peaks discussed above have become significantly smaller. 2A. 1A. 1B and 1B. Fig. 6B shows a silver-colored gel chromatogram of fractions of interest in the region of interest. Note that FIG. In Fig. 1A, the radioactive and bioactive peak fractions (fractions 52 and 59) each give a large band at 22 kD (arrowed) in SDS-PAGE. The third peak (fraction 48 of Figure 1A) gives a band at 20 kD in SDS-PAGE. Gel filtration assay of crude IL-li indicates a molecular weight of 18-25 kD of the active molecule. 2B. 2A. autoradiogram of the gel shown in FIG. It can be clearly seen that the 20 and 22 kD protein bands have the highest radioactivity among the fractions.

Az eredményeket összegezve megállapítjuk, hogy az IgG-vel bevont Petri-csészén szélesztett monociták metabolikus jelzésével radioaktív mintát kapunk, ilyen minta alig képződik, ha a sejteket magzati borjúszérummal (FCS) bevont lemezeken szélesztjük. Ezek az indu13Summarizing the results, it is established that metabolic labeling of IgG-coated Petri dish-plated monocytes yields a radioactive sample that is hardly formed when cells are plated on fetal calf serum (FCS) coated plates. These are indu13

HU 222 810 Bl kált radioaktivitással bíró minták tökéletesen együtt kromatografálhatók néhány bioaktivitással bíró IL-1-inhibitorral Mono Q oszlopon, géleken, és olyan autoradiogramot adnak, amelyről megállapítható, hogy a három legnagyobb indukált molekula az IL-li molekulá- 5 ra előzetesen várt molekulatömegnek megfelelő.Samples with radioactivity are perfectly co-chromatographed with some bioactivated IL-1 inhibitors on a Mono Q column, on gels, and give an autoradiogram showing that the three largest induced molecules have the molecular weight previously expected for the IL-li molecule. appropriate.

A szekvenciameghatározáshoz az IL-li molekulákat tovább tisztítjuk. Ezt két módon végezzük. Elsőként a bioaktivitás és radioaktivitás terén csúcsot adó Mono Q frakciókat C4-fordított fázisú oszlopra visszük, és 10 eluensként 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti gradienst alkalmazunk. Mivel az IL-li molekula izotóppal jelzett, az egyes frakciókból vett minták radioaktivitását számlálón közvetlenül mérjük, ezenkívül a 15 mintákat SDS-PAGE-vel elemezzük, majd autoradiográfiás értékelést végzünk. A 3A. ábra egy ilyen kromatogramot mutat, amelyre ráhelyeztük a radioaktivitásmintát is. Az egyes frakciókból vett mintákat gélen hittatjuk, majd ezüsttel festjük (3B. ábra), ezt köve- 20 tőén a gélek autoradiogramját készítjük el (3C. ábra), ezek azt mutatják, hogy az IL-li molekula a 32-36. frakciókban található. Ezeket a frakciókat beszárítjuk és szekvenáljuk. Más megoldás szerint a fő Mono Q frakciókat szárítjuk be Speed-Vac alkalmazásával, a be- 25 szárított anyagot 0,4 ml 0,05 mol/l-es ammónium-hidrogén-karbonátban újra szuszpendáljuk, majd előzetesen azonos pufferrel egyensúlyba hozott 10x300 mm-es, Superose 12 géllel töltött oszlopon (Pharmacia FPLC) gélszűréssel kétszer közvetlenül kromatografáljuk. En- 30 nek eredményét mutatjuk be a 4A. és 4B. ábrákon.The IL-II molecules are further purified for sequencing. We do this in two ways. First, the Mono Q fractions which peak in bioactivity and radioactivity were applied to a C4 reverse phase column using a gradient of 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile as the eluent. Since the IL-li molecule is directly labeled with radioactivity on isotope-labeled samples from each fraction, the samples are also analyzed by SDS-PAGE and autoradiographic evaluation. 3A. Figure 1B shows such a chromatogram with a sample of radioactivity on it. Samples from each fraction were gel-stained, then stained with silver (Fig. 3B), and then autoradiographed on gels (Fig. 3C), showing that IL-li molecule 32-36. fractions. These fractions were dried and sequenced. Alternatively, the major Mono Q fractions were dried using Speed-Vac, resuspended in 0.4 mL of 0.05 M ammonium bicarbonate, and pre-equilibrated with the same buffer at 10 x 300 mm. and chromatographed twice directly on a Superose 12 gel packed column (Pharmacia FPLC). The results of this are shown in Fig. 4A. 4B and 4B. FIGS.

A frakciókat gyűjtjük, minden frakcióból mintát veszünk, és radioaktivitás és bioaktivitás szempontjából elemezzük, SDS-PAGE-t végzünk, a gélt ezüsttel festjük, és autoradiogramot készítünk róla. A megfelelő 35 frakciókat Speed-Vac berendezésen szárítjuk, majd szekvenáljuk.Fractions were collected, sampled from each fraction and analyzed for radioactivity and bioactivity, SDS-PAGE, silver stained with gel and autoradiographed. The appropriate fractions were dried on a Speed-Vac and sequenced.

2. példaExample 2

Az IL-l-inhibitor tervezett szekvenálása 40Planned sequencing of IL-1 inhibitor 40

A szekvenálást megelőzően a mintákat 6 mol/l-es, pH=8,6-os guanidin-hidrogén-kloridban oldjuk, 4 órán át 37 °C hőmérsékleten nitrogéngáz-atmoszférában a feltétjéhez viszonyított 100-szoros moláris ditiotreitolfeleslegben redukáljuk, majd 400-szoros ¹⁴C-jód-ecet- 45 sav-felesleggel 1 órán át alkilezzük. A reakcióelegyet C8-fordított fázisú oszlopon sómentesítjük, eluáljuk, majd részlegesen beszárítjuk. Az N-terminális szekven1 5 10Prior to sequencing, the samples were dissolved in 6 mol / L guanidine hydrochloride, pH 8.6, reduced to 100 times molar dithiothreitol excess at 37 ° C under nitrogen atmosphere for 4 hours, and then 400 times. ^{It is} alkylated with an excess of ¹⁴ C-iodoacetic acid-45 for 1 hour. The reaction mixture was desalted on a C8 reverse phase column, eluted and partially dried. The N-terminal sequence1 5 10

RPSGRKSSKMQ majd ezt követően C4 RP-HPLC eljárással hasonlóan tisztított IL-li-X preparátum elemzésével az alábbi szekvenciát kaptuk: 55Analysis of RPSGRKSSKMQ and subsequently C4 RP-HPLC similarly purified IL-li-X preparation gave the following sequence:

55

PrepKxF24 ______ ésPrepKxF24 ______ and

PrepKxF23 R P__ R K ciát szekvenciaanalizátorral (Applied Biosystems Protein Sequencer) határozzuk meg. A belső szekvenciák meghatározására az előzetesen adott esetben redukált és alkilezett mintákat cianogén-bromiddal vagy proteolitikus enzimmel emésztjük, az emésztési eljárást szakember számára ismert módon végezzük. A reakcióelegyet beszárítjuk, 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben oldjuk, és a peptideket C8-fordított fázisú oszlopon elkülönítjük.PrepKxF23 R P__ R K cation was determined using a sequence analyzer (Applied Biosystems Protein Sequencer). For the determination of internal sequences, previously reduced and alkylated samples are digested with cyanogen bromide or a proteolytic enzyme, and the digestion is carried out in a manner known to those skilled in the art. The reaction mixture was dried, dissolved in water containing 0.1% trifluoroacetic acid, and the peptides were separated on a C8 reverse phase column.

3. példaExample 3

Az IL-1-inhibitorokfajtáinak tisztítása és szekvenálásaPurification and sequencing of types of IL-1 inhibitors

A) IL-li-X, IL-li-a és IL-li-b fajtákA) IL-li-X, IL-li-a and IL-li-b

Az IL-li Mono Q oszlopon való tisztításával a biológiai aktivitás három nagy részre válik szét, ezt az 1 A. ábrán mutatjuk be, és az 1. példában írjuk le, az aktivitással bíró csúcsok az előbbiek szerinti 48., 52. és 59. csúcsok. Ezen frakciók SDS-PAGE útján való elemzése - amely a 2A. ábrán látható - 20, 22, illetve egy további 22 kD-os inhibitorfajta jelenlétét mutatják. Az ilyen gélek Westem-elemzésekor - amelyet egérantiszérum alkalmazásával az alábbi 4. példában ismertetünk - mindhárom fajta inhibitor festődik. Ha az IL-li-t metabolikusan ³⁵S-metioninnal jelzett sejtekből készítjük, a jelzést a sejteknek IgG-vel bevont lemezen való szaporítása során végezzük, ezen frakciók mindegyike radioaktív lesz (ezt a 2B. ábrán az előzőekben említett gél autoradiogramján mutatjuk be). Az 1. példa szerinti logikát követve, azaz azt, hogy a fentivel párhuzamosan, de nem indukáló körülmények között tenyésztett sejtek nem hoznak létre IL-li bioaktivitást, és nem jelentkeznek a radioaktív sávok, arra a következtetésre juthatunk, hogy ez a három fajta adja a biológiai aktivitást. Ezt a három inhibitorfajtát a következő módon neveztük el: IL-li-X, IL-li-a és IL-li-b.Purification of the IL-li on a Mono Q column divides the biological activity into three major portions, as shown in Figure 1A and described in Example 1, the peaks having activity, as shown in Figures 48, 52 and 59, respectively. peaks. Analysis of these fractions by SDS-PAGE - which is shown in Figure 2A. Figures 2A and 4B show the presence of 20, 22 and another 22 kD inhibitors. All three types of inhibitors are stained by Westem analysis of such gels using mouse antiserum as described in Example 4 below. When IL-li is metabolically prepared from ³⁵ S-methionine-labeled cells, the labeling is performed by proliferation of the cells in an IgG-coated plate, each of these fractions being radioactive (as shown in the autoradiogram of the above-mentioned gel in Figure 2B). Following the logic of Example 1, that is, cells cultured in parallel but not under inducing conditions do not produce IL-li bioactivity and do not exhibit radioactive bands, it can be concluded that these three species give biological activity. These three types of inhibitors were named as IL-li-X, IL-li-a and IL-li-b.

B) IL-li-X tisztítása és szekvenálásaB) Purification and sequencing of IL-li-X

Az IL-li-X- és/vagy IL-li-a-tartalmú Mono Q frakciókat fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) Synchropak RP-4 (C4) oszlopon tisztítjuk, és a radioaktív mintákat szekvenciaanalízisnek tesszük ki. Az RP-HPLC eljárással tisztított IL-li-a és IL-li-b közvetlen szekvenálására irányuló számos kísérlet kudarca azt a feltételezést alapozta meg, hogy ezek az inhibitorok N-terminálisukon kémiailag blokkoltak. Azonban egy IL-li-a (IL-li-aB2p2) preparátum elemzésekor az alábbi szekvenciát kaptuk:Mono Q fractions containing IL-li-X and / or IL-li-a were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) on a Synchropak RP-4 (C4) column and the radioactive samples were subjected to sequence analysis. The failure of many attempts to directly sequester RP-HPLC-purified IL-li-a and IL-li-b has led to the assumption that these inhibitors are chemically blocked at their N-terminus. However, when analyzing an IL-li-a (IL-li-aB2p2) preparation, the following sequence was obtained:

2020

AFISDVNQ,AFISDVNQ,

15 20 __M Q A F _ I D _ VN K _ F15 20 __M Q A F _ I D _ VN K _ F

L K M Q A F IL K M Q A F I

HU 222 810 Β1HU 222 810 Β1

Ezek a szekvenciák nyilvánvalóan részei az IL-li-a szekvenálására irányuló kezdeti kísérletekor kapott szekvenciának. Feltételezésünk szerint ezek a szekvenciaadatok az IL-li-X elnevezésű 20 kD-os fajta N-terminálisának felelnek meg.These sequences are obviously part of the sequence obtained during the initial experiment of sequencing IL-li-a. It is believed that these sequence data correspond to the N-terminus of the 20 kD species IL-li-X.

A fenti és minden ezt követó szekvencia esetén az aláhúzással jelölt helyzet vagy azt jelenti, hogy az adott egységet nem tudtuk azonosítani, vagy hogy az azonosítást illetően kétségeink vannak. Ha egy helyzetben két vagy több egység megjelölése szerepel, ez azt jelzi, 10 hogy a szekvenálási lépésben egynél több aminosavat észleltünk, a több jelölés közül a legfelső jelenti a legvalószínűbbnek tartott egységet.For the above and all subsequent sequences, an underscore position either means that the unit in question could not be identified or that we have doubts about its identification. When two or more moieties are represented in one position, this indicates that more than one amino acid residue has been detected in the sequencing step, the highest of which is the most likely moiety.

C) Az IL-li-a és IL-li-bpeptidjeinek létrehozása, tisztítása és szekvenálása Minthogy az IL-li-a és IL—li—b N-terminálisukon nyilvánvalóan kémiailag blokkoltak, ezek peptidjeit endoproteinázos emésztéssel hozzuk létre. Közelebbről, az IL-li-a vagy IL— li—b mintákat tartalmazó Mono Q frakciókat egy 4,6x250 mm-es C3-RPHPLC 20 oszlopon (Zorbax Protein Plus) engedjük át, minden megelőző kísérletben a C-4 oszlopok megfelelő alternatíváit alkalmaztuk. Az IL-li-a-t (8A. és B. ábrák), vagy az IL—li—b-t (9A. ábra) igen fokozatos gradiens alkalmazása mellett (0,2% acetonitril/perc 0,5 ml/perc 25 áramlási sebesség mellett) választjuk el a legnagyobb szennyező radioaktív kísérőjétől, a humán lizozimtól.C) Generation, Purification and Sequencing of IL-li-a and IL-li-b Peptides Since IL-li-a and IL-li-b are obviously chemically blocked at their N-terminus, their peptides are generated by endoproteinase digestion. Specifically, the Mono Q fractions containing IL-li-a or IL-li-b samples were passed through a 4.6x250 mm C3-RPHPLC 20 column (Zorbax Protein Plus), with appropriate alternatives to the C-4 columns in each previous experiment. . IL-li (Figs. 8A and B) or IL-li-bt (Fig. 9A) using a very gradient gradient (0.2% acetonitrile / min at 0.5 ml / min at 25 ) from its major contaminant radioactive companion, human lysozyme.

A tisztított minták azonosítását SDS-PAGE alkalmazásával, majd ezt követően autoradiogramok készítésével (8C. és D., valamint 9B. ábrák) ellenőrizzük, a megfe- 30 lelő tisztaságú minta a gélen egyetlen, 22 kD-os radioaktív fehérjeként jelentkezik. A fehérjéket manuálisan szilikonnal bevont üvegcsövekbe gyűjtjük, és 25 ml 0,2%-os Tween-20 oldatot adunk hozzájuk. Az IL-litartalmú frakciókat Speed-Vac készüléken 50 ml-re pá5 roljuk be, majd 1%-os ammónium-hidrogén-karbonát hozzáadásával 300 ml-re egészítjük ki, ezután 1 mg endoproteinázt adunk az elegyhez. IL-li-a esetén enzimként endoproteináz Lys C-t (Boehringer-Mannheim) alkalmazunk, míg IL-li-b esetén a hasítást endoproteináz Asp N-nel (Boehringer-Mannheim) végezzük. A hasítást 37 °C hőmérsékleten végezzük 16 órán át, majd a reakcióelegy térfogatát Speed-Vac készüléken 50 ml-re pároljuk be.The identity of the purified samples is verified by SDS-PAGE followed by autoradiograms (Figures 8C, D and 9B), with a sample of appropriate purity appearing on the gel as the only 22 kD radioactive protein. Proteins were manually collected into silicone-coated glass tubes and 25 ml of 0.2% Tween-20 solution was added. The IL-containing fractions were evaporated to 50 ml in a Speed-Vac and then made up to 300 ml with 1% ammonium bicarbonate followed by addition of 1 mg of endoproteinase. For IL-li-a, the enzyme is endoproteinase Lys C (Boehringer-Mannheim), whereas for IL-li-b, cleavage is performed with endoproteinase Asp N (Boehringer-Mannheim). The cleavage is carried out at 37 ° C for 16 hours and the reaction mixture is concentrated to 50 ml on a Speed-Vac.

Az II—li—a mintát közvetlenül kromatografáljuk, 15 míg az IL-li-b mintát először 5 ml, 2 mol/l-es, pH=8,0 -as trisz-pufferben készült 50 mmol/l-es ditiotreitol adagolásával redukáljuk, a reagáltatást 30 percig végezzük 37 °C hőmérsékleten, majd 10 ml, 1,1 pmol/les etanolos ³H-jód-ecetsav adagolásával karboxi-metilezzük, a reagáltatást 30 percig, 37 °C hőmérsékleten, sötétben végezzük. A peptidek elválasztását 2,1 χ 250 mmes, Brownlee Aquaporee RP-300 (C8) szűkfúratú oszlopon végezzük, 100 ml/perc áramlási sebesség mellett, mikrofuratú hardverrel, és mikrofúrattal kompatibilis szivattyúkkal felszerelt Beckman nagynyomású folyadékkromatográf alkalmazásával. Eluensként 0,1% trifluorecetsavat tartalmazó víz és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitril közötti 0- 100%-os lineáris gradienst alkalmazunk, az eluálást 200 perc alatt végezzük el. A peptidek elválasztását a 10. és 11. ábrákon mutatjuk be. A szekvenciákra kapott információk a következők:Sample II-li-a is directly chromatographed while IL-li-b sample is first reduced by addition of 5 ml 50 mM dithiothreitol in 2 M Tris buffer pH 8.0 , the reaction is carried out for 30 minutes at 37 ° C and then carboxymethylated with 10 ml of 1.1 pmol / L ethanolic ³ H-iodoacetic acid, and the reaction is carried out for 30 minutes at 37 ° C in the dark. Peptide separation was performed on a 2.1 χ 250 m Brownlee Aquaporee RP-300 (C8) narrow bore column at a flow rate of 100 ml / min using a Beckman high performance liquid chromatograph with microcore hardware and microcore compatible pumps. The eluent was a linear gradient of 0-100% water containing 0.1% trifluoroacetic acid in water and 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile over 200 minutes. The separation of peptides is shown in Figures 10 and 11. The information obtained for the sequences is as follows:

RaLysC-41RaLysC-41

5 105 10

M Q A F _ I D V N Q KM Q A F _ I D V N Q K

RaLysC-53RaLysC-53

10 15 20 K 25 P10 15 20 K 25 P

FYL NNQLVA YLQGPNVNLEEQ I D N _ NFYL NNQLVA YLQGPNVNLEEQ I D N _ N

RaLysC-61RaLysC-61

55

I YI Y

FATJRHVHFATJRHVH

RaLysC-31RaLysC-31

55

F Y F Q E DF Y F Q E D

RaLysC-37RaLysC-37

1 5 G E 1 5 G 10 10 V S V S I I 15 T 15 T N S N S 20 20 _ Q D F T RaLysC-35 _ Q D F T RaLysC-35 — - L L Q Q L L E A E A N N R R Q Q s Q s Q L L G G E E Q Q 1 5 1 5 10 10 15 15 20 20 E T E T R R L L Q Q L L E A E A V V I I T D T D L L L L E E N N RpAspN-51 1 5 RpAspN-51 1 5 10 10 15 15 20 25 20 25 Q K Q K. T T F F L L G G D V N P I D V N P I E E P P Y Y A THE R N R N N N Q Q L L V A A A S S Y Y L L Q G P N V N L Q G P N V N L

RPAspN-43RPAspN-43

5 105 10

DEGVMVTKFYFQDEGVMVTKFYFQ

HU 222 810 Β1HU 222 810 Β1

RPAspN-39RPAspN-39

5 K 10 15 _PSGRKSSFMQAFRTQ5 K 10 15 _PSGRKSSFMQAFRTQ

RpAspN-25RpAspN-25

55

D K R F A F I RD K R F A F I R

RpAspN-30RpAspN-30

115 10115 10

S L QS L Q

D EVNHLKKISD EVNHLKKIS

A kapott peptidszekvenciák közül kettő nyilvánvalóan rokon azzal, amit a korábbiakban az IL- li-X esetén nyertünk. Ezek egyike, az RaLysC-41 egy Il-li-a szekvencia, a másik, az RpAspN-51 egy IL-li-b szekvencia, ami érvként szolgál amellett, hogy a háromféle IL- li legalábbis közel rokon fehérjék, hacsak nem egyetlen eredeti IL—li molekulának a kémiailag és/vagy fizikailag módosított formái. Ha a felsorolt szekvenciákat kombináljuk, az alábbi szekvenciakompozíciót kapjuk (ld. alább).Two of the resulting peptide sequences are obviously related to what was obtained above for IL-li-X. One of these, RaLysC-41, is an Il-li-a sequence, and the other, RpAspN-51, is an IL-li-b sequence, which argues that the three types of IL-li are at least closely related proteins, unless one of the original Chemically and / or physically modified forms of the IL-li molecule. When the listed sequences are combined, the following sequence composition is obtained (see below).

Úgy tűnik, hogy ez a szekvenciakompozíció nincs jelen egyetlen olyan ismert polipeptidben sem, amelyet a legújabb gyűjteményben, a „Protein Identification Resource Database” (PÍR 16.0) szakirodalmi helyen ismertetnek. Úgy véljük, hogy ezek a szekvenciák vagy ettől kevéssé eltérő variánsok a molekuláknak egy IL-1-inhibitorként hatni képes új csoportját képviselik.This sequence composition does not appear to be present in any of the known polypeptides described in the most recent collection, "Protein Identification Resource Database" (PIR 16.0). These sequences, or minor variants thereof, are believed to represent a novel class of molecules capable of acting as an IL-1 inhibitor.

/.......RaLysC-41.......1 |.....................RaLysC-53............../.......RaLysC-41.......1 | ..................... RaLysC-53 ....... ........

).........RBAsp N-39........4 _t....................REAspnN-51.....................|) ......... RBAsp N-39 ........ 4 _t .................... REAspnN-51 .... .................. |

(..............IL-Kp 2ρΛ2 ..............₄ (.............. IL-Kp 2ρΛ2 .............. ₄

EPSGRKSSKMQAFRISDVNQKTFYLRNNQLVaÍyLQGPNVNLEE^ID^ ID EPSGRKSSKMQAFRISDVNQKTFYLRNNQLVaÍyLQGPNVNLEE

ξ.ξ.

(,. .RaLysC-31{(,. .RaLysC-31 {

|.......RBAspnM-43..........1| RBAspnM-43 ....... .......... 1

DEGVMVTKFYFQEDDEGVMVTKFYFQED

(..............ReLysC-35,37..............i(35,37-ReLysC .............. .............. i

NN

SS

G IGGG IGG

HSDETBLOLEAVRfiTDLLEjjHSDETBLOLEAVRfiTDLLEjj

... .RaLysC-61......|... .RaLysC-61 ...... |

|.. .R8AepN-25. . .4| .. .R8AepN-25. . .4

VV

DKRFAFIRHYHDKRFAFIRHYH

4. példaExample 4

Az IL-1-inhibitorral szemben fajlagos antitestek ké- 45 szítése hetes BALB/c egerekbe [Exp. Cell. Rés. 60, 61-77 (1970)] szubkután olyan IL-1-inhibitort injektálunk, amelyet előzetesen nyers felülúszóból Mono Q kromatográfiás úton részlegesen (négyszázszorosan) 50 tisztítottunk, PBS-sel szemben dializáltunk, és komplett Freund-adjuvánsban emulgeáltunk. Egy-egy egérnek 5 ml nyers felülúszóból származó tisztított IL-1-inhibitort adunk be. Az egereknek kéthetenként a fentivel azonos mennyiségű, nem komplett Freund-adjuváns- 55 bán emulgeált IL-1-inhibitort adunk, és a beadagolás után minden alkalommal 7 nap múlva farkukból szérummintákat veszünk. Az antiszérumok anti-IL-liaktivitását az SDS-PAGE alkalmazásával végzett immunogén futtatás keresztreakcióinak Westem-analí- 60 zisével vizsgáljuk. Az 5A. és 5B. ábrákon látható, hogy három IL-li-beinjektálást követően az egerek mindegyike termelt anti-IL-li antitesteket.Preparation of antibodies specific for the IL-1 inhibitor in BALB / c 7-week-old mice [Exp. Cell. Gap. 60: 61-77 (1970)] injected subcutaneously with IL-1 inhibitor partially purified (four hundred times) from a crude supernatant by Mono Q chromatography, dialyzed against PBS and emulsified in complete Freund's adjuvant. Purified IL-1 inhibitor from crude supernatant (5 ml) was administered to each mouse. Mice were given the same amount of incomplete Freund's adjuvanted IL-1 inhibitor every two weeks and serum samples were taken from their tails 7 days after administration. The anti-IL-activity of the antisera is assayed by Westem analysis of cross-reactions of the immunogenic run using SDS-PAGE. 5A. 5B and 5B. Figures 3A-5c show that after three injections of IL-li each mouse produced anti-IL-li antibodies.

Minthogy a monoklonális antitestek igen nagy jelentőséggel bírnak az IL— li génnek az expressziós könyvtárból való klónozásánál, a rekombináns IL— li protein tisztításánál és a molekula biológiai hatásának vizsgálatánál, hozzáláttunk az IL-li-re fajlagos monoklonális antitestek sorozatának gyártásához. A B-sejt-hibridómák előállítására a fenti egereknek intravénásán a fentivel azonos mennyiségű IL-1-inhibitort adunk be sóoldatban 24 órával lépük eltávolítása előtt. A lépből a splenocitákat hideg kiegyensúlyozott sóoldatba (BSS) vonjuk ki, BSS-sel kétszer mossuk, P3 mielomasejtekkel 2χ10⁷ P3 sejt/10⁸ lép B-sejt arányban elegyítjük, majd lecentrifúgáljuk. A száraz csapadékhoz cseppenként 1 ml meleg, 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó PEGBecause of the importance of monoclonal antibodies for the cloning of the IL-li gene from the expression library, purification of the recombinant IL-li protein, and assay of the biological activity of the molecule, we have begun to produce a series of IL-li specific monoclonal antibodies. For the production of B cell hybridomas, the above mice were intravenously administered the same amount of IL-1 inhibitor in saline 24 hours prior to spleen removal. The splenocytes were extracted from the spleen into cold equilibrated saline (BSS), washed twice with BSS, mixed with P3 myeloma cells at a ratio of ^{2 to} 10 ⁷ P3 cells / 10 ⁸ spleen B cells, and centrifuged. To the dry precipitate was added dropwise 1 mL of warm PEG containing 5% carbon dioxide

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

6000-et (40% polietilénglikol 6000:60% minimális eszenciális tápközeg) adunk, ezzel a sejteket összeolvasztjuk. Az összeolvadt sejteket BSS-sel mossuk, mlenként 2 χ 10⁵ peritoneális sejtet tartalmazó 10 ml gazdag tápközegben (10% FBS) újra szuszpendáljuk, és a csapadékot 10 ml-es pipetta alkalmazásával finoman feltöijük. Az elegy térfogatát peritoneális sejteket tartalmazó tápközeg további hozzáadásával 20 ml-re egészítjük ki, majd a sejteket 96 lyukú, egyenként 0,1 ml-es lyukakat tartalmazó lemezre visszük fel. A lemezeket gázinkubátorba visszük, és a következő módon kezeljük:6000 (40% polyethylene glycol 6000: 60% minimum essential medium) was added to fuse the cells. The fused cells were washed with BSS, containing 2 χ 10 ⁵ peritoneal cells mlenként 10 ml of rich media (10% FBS) are resuspended and the precipitate feltöijük gently using a 10 ml pipette. The volume of the mixture was further added to 20 ml with media containing peritoneal cells, and the cells were plated in a 96-well plate containing 0.1 ml each. Plates were transferred to a gas incubator and treated as follows:

1. nap - dús tápközegben lévő 3 xHAT (hipoxantin, aminopterin, timidin) adagolása 1 χ végkoncentrációig,Day 1 - administration of 3 xHAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) in rich media to a final concentration of 1 1,

5. nap - a tápközeg kicserélése dús tápközegben lévő 1 χ HAT 200 μΐ-ével helyettesítve,Day 5 - Medium replacement with 200 μΐ of 1 χ HAT in rich medium,

10. nap - a hibrid szaporodás ellenőrzése, a tápközeg kicserélése, ml-enként 1,5 χ 10⁶ peritoneális sejtet tartalmazó dús tápközegben lévő 1 χ HAT 200 μΐ-ével helyettesítve.Day 10 - Hybrid Growth Control, Medium Replacement, replaced with 200 μχ of 1 χ HAT in 1.5 1,5 10 ⁶ peritoneal cells rich media per ml.

Ha a hibrid sejtek már közel összefolyóak, a lyukban lévő felülúszókat vizsgálatra visszük, a sejteket pipetta hegyével finoman lekaparjuk, és átvisszük egy olyan 1 ml-es tenyésztőlyukba, amely dús tápközegben 1 χ HAT-t és ml-enként 3 χ 10⁶ peritoneális sejtet tartalmaz.Once the hybrid cells are close to confluence, the supernatants in the well are gently scraped and pipetted into a 1 ml culture well containing 1 χ HAT in rich medium and 3 χ 10 ⁶ peritoneal cells per ml. contain.

Az összenőtt sejtekkel fedett lyukakból származó felülúszó anti-IL-li-aktivitását ELISA alkalmazásával vizsgáljuk, amely vizsgálatban a mikrotitrálólyukakhoz részlegesen tisztított IL-1-inhibitort kötünk (az IL—li azonos az egereknek beinjektált Mono Q oszlopon tisztított anyaggal). Negatív és pozitív kontrollként normál egérszérumot és hiperimmun antiszérumot alkalmazunk. A pozitív felülúszókon az ELISA-t ismételten elvégezzük homogénen tisztított IL-1 -inhibitorral bevont lemezeken, és vizsgáljuk tisztított, metabolikusan jelzett IL—li immunprecipitációjával. A pozitív sejteket a hígítás limitálásával klónozzuk, és prisztánnal kezelt egereknek injektáljuk be ascites létrehozása céljából. Nagy mennyiségű IL—li fajlagos antitest termelhető az egérascites fluidumának szövettenyésztésével vagy masszív fejlesztésével és összegyűjtésével. Az antitestek tisztítása és oldhatatlan ágyhoz való kapcsolása révén a rekombináns IL—li fehérje tisztítására alkalmas affmitásadszorbenst nyerünk.The anti-IL-li activity of the supernatant from the wells coated with the pooled cells was assayed by ELISA, in which a partially purified IL-1 inhibitor was bound to the microtiter wells (IL-li is identical to the purified material in the mono Q column injected into mice). Normal mouse serum and hyperimmune antiserum were used as negative and positive controls. For positive supernatants, the ELISA is repeated on homogeneously purified IL-1 inhibitor coated plates and assayed for immunoprecipitation of purified, metabolically labeled IL-1i. Positive cells are cloned by limiting dilution and injected into pristane treated mice to produce ascites. Large amounts of IL-li specific antibody can be produced by tissue culture or massive development and collection of mouse ascites fluid. Purification of the antibodies and attachment to the insoluble bed yields an affinity adsorbent suitable for purification of the recombinant IL-li protein.

5. példaExample 5

Az IL—li cDNS klónozásaCloning of IL-li cDNA

Kimutattuk, hogy IgG-bevonatú Petri-csészén szélesztett és 24 órán át [³⁵S]-metionin jelenlétében tenyésztett monociták [³⁵S]—IL—li-t termelnek, amely Mono Q oszlopon mutatott kromatográfiás sajátságai alapján azonosítható.Monocytes plated on an IgG-coated petri dish and cultured for 24 hours in the presence of [ ³⁵ S] -methionine have been shown to produce [ ³⁵ S] -IL-li, which can be identified by its Mono Q column chromatographic properties.

Annak meghatározására, hogy az IL-1 i mikor termelődik maximális sebességgel (a 24 órás időszak alatt), a szélesztett monocitákat [³⁵S]-metionin hatásának tesszük ki impulzusszerű módon, rövid, 2 órás időtartamon át, amely idő elteltével nagy feleslegben lévő jelzetlen metionint adagolunk, és az inkubálást további 2 órán át folytatjuk. Ezután a tápközeget összegyűjtjük, és meghatározzuk az izotóppal jelzett IL-li-t. Ezt az eljárást alkalmazzuk monocitákon az IgG-bevonatú lemezen való szélesztést követő különböző időpontokban, azt találjuk, hogy a monociták [³⁵S]-metionin jelenlétének való kitevése a szélesztés után 15 órával hozza létre a maximális [³⁵S]—IL— li-t, jelezve ezzel azt, hogy a monocitákban az IL—li mRNS az IgG-bevonatú lemezen való szélesztést követően 15 óra múlva van a maximális szinten.To determine when IL-1i is produced at maximum rate (over a 24 hour period), plated monocytes are exposed to [ ³⁵ S] -methionine in a pulsed fashion over a short period of 2 hours, which is followed by a large excess of unlabeled methionine was added and incubation continued for a further 2 hours. The medium is then harvested and isotope labeled IL-li is assayed. This procedure is applied to monocytes at different times after plating on the IgG-coated plate, and it is found that exposing the monocytes to the presence of [ ³⁵ S] -methionine 15 hours after plating produces the maximum [ ³⁵ S] -IL-li , indicating that IL-li mRNA in monocytes is at its maximum level 15 hours after plating on an IgG-coated plate.

Az IB. példa szerint előállított friss monocitákat szélesztünk LPS-mentes IgG-η. RPMI tápközegben 15 órán át, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálást követően a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 4 mol/l-es guanidin-tiocianáttal, 25 mmol/l-es pH=7-es nátrium-citráttal, 0,5% szarkozillal és 0,1 mol/l-es 2-merkaptoetanollal lizáljuk. A lizátum össz-RNS-tartalmát P. Chomczynski és N. Sacchi AGPC eljárásával [Analytical Biochemistry, 162, 156-159. o. (1987)] elkülönítjük.IB. Fresh monocytes prepared according to Example 1c were plated in LPS-free IgG-η. After incubation in RPMI medium for 15 hours at 37 ° C, the cells were washed with phosphate buffered saline followed by 4 M guanidine thiocyanate, 25 mM pH 7 sodium citrate, 0.5% sarcosyl and 0.1 M 2-mercaptoethanol. The total RNA content of the lysate was determined by the AGPC method of P. Chomczynski and N. Sacchi, Analytical Biochemistry, 162, 156-159. She. (1987)].

A poli A+ RNS-t oligo dT cellulóz kromatográfiás eljárással {Aviv, H. és Leder, P. [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408-1412 (1972)]} elkülönítjük, etanollal kicsapjuk, majd 0,36 pg/μΐ koncentrációra oldjuk. A cDNS Gubler, U. és Hoffman, B. J. [Gene 25, 263-269 (1983)] eljárásával való előállításához 1 pg poli A⁺ RNS-t használunk fel.Poly A + RNA was determined by oligo dT cellulose chromatography (Aviv, H. and Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 1408-1412 (1972)]}, precipitated with ethanol and dissolved in 0.36 pg / μΐ. To generate cDNA by the method of Gubler, U. and Hoffman, BJ (Gene 25: 263-269 (1983)), 1 pg of poly A ⁺ RNA was used.

A cDNS-t lambda gtll expressziós könyvtárba visszük be EcoRI linkerek alkalmazásával, amelyek a Boehringer Mannheim 988 488 katalógusszámának vagy a New England Bio Láb 1070 katalógusszámának megfelelőek, az eljárás során a fenti gyártók utasításait követjük.The cDNA was introduced into the lambda gtll expression library using EcoRI linkers corresponding to the Boehringer Mannheim Catalog No. 988,488 or the New England Bio Foot 1070, following the instructions of the above manufacturers.

A kapott, 10⁶ független kiónt tartalmazó könyvtárat E. coli Y1090 rk~-on (Promega Biotec) szkríneljük, az IL-li-nek megfelelő poliklonális antitesttel, amint azt az előzőekben leírtuk, az R. A. Young és R. W. Davis [PNAS 80, 1194-1198 (1983)] által leírt szkrínelési körülményeket alkalmazzuk. A pozitív mintákat egy második, biotinilezett antitest (például kecske antiegér-IgG, Bethesda Research Labs), majd egy strepavidin-lúgos foszfatáz konjugát (Bethesda Research Labs) alkalmazásával azonosítjuk Bayer, E. A. és Wilchek, M.: [Methods in Biochemical Analysis (1979)] és Guesdon, J. L. Temynch, T. és Avrameas, S. [J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1138 (1979)] által leírt, és a gyártó utasításai szerinti módon.The resulting library of 10 ⁶ independent clones is screened on E. coli Y1090 rk ~ (Promega Biotec) with an IL-li polyclonal antibody as described previously by RA Young and RW Davis [PNAS 80, 1194 -1198 (1983)]. Positive samples were identified using a second biotinylated antibody (e.g., goat anti-mouse IgG, Bethesda Research Labs) followed by a strepavidin-alkaline phosphatase conjugate (Bethesda Research Labs) Bayer, EA and Wilchek, M., Methods in Biochemical Analysis (1979). )] and Guesdon, JL Temynch, T. and Avrameas, S. [J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1138 (1979) and according to the manufacturer's instructions.

6. példaExample 6

Az IL-1-inhibitort kódoló gén elkészítése és szekvenálásaConstruction and sequencing of the gene encoding the IL-1 inhibitor

Az 5. példában leírt módon előállított cDNS-t lambda GT10 klónozóvektorba építjük be. Ezt a cDNS-t először EcoRI metilázzal, S-adenozil-metionin szubsztrát alkalmazásával metilezzük, EcoRI linkereket kapcsolunk hozzá ligációs reakcióban, majd a linkerek feleslegét EcoRI endonukleázzal való emésztéssel és CL6B szpin oszlopon végzett kromatografálással eltávolítjuk. 0,124 pg kapcsolt, méret szerint szelektált cDNS-t ésThe cDNA prepared as described in Example 5 was inserted into the lambda GT10 cloning vector. This cDNA was first methylated with EcoRI methylase using S-adenosylmethionine substrate, ligated to EcoRI linkers, and excess of linkers removed by digestion with EcoRI endonuclease and chromatography on a CL6B sppin column. 0.124 pg of linked size-selected cDNA and

HU 222 810 Bl pg EcoRI-gyel hasított és foszfatázzal kezelt lambda GTlO-et tartalmazó reakcióelegyet készítünk, és a ligációs reakció termékeit GIGAPACK GOLD burkolóextraktum (Stratagene) alkalmazásával burkoljuk. így egy 1 χ 10⁷ tagból álló könyvtárat kapunk. í #ILlil—3 mintaA reaction mixture containing Lambda GT10O cleaved with EcoRI and phosphatase treated was prepared and the ligation reaction products were coated using GIGAPACK GOLD Coating Extract (Stratagene). Thus a library of 1 × 10 ⁷ members is obtained. í # ILlil — 3 patterns

TTATTA

TTCTACGTCCGNAAG5’TTCTACGTCCGNAAG5 '

Lys Met Gin Ala Phe #ILlil - 4 mintaLys Met Gin Ala Phe #ILlil - 4 samples

T A A A TT A A A T

TTCAAGATGAAGGTCGTTTCAAGATGAAGGTCGT

Lys Phe Tyr Phe Gin Glu #ILlil - 5 mintaLys Phe Tyr Phe Gin Glu #ILlil - 5 samples

T AT A

TACCANTGNTTCAAGATTACCANTGNTTCAAGAT

Me t Val Thr Lys Phe Tyr #ILlil - 6 mintaMe t Val Thr Lys Phe Tyr #ILlil - 6 samples

A ATTATT

CTGCANTTGGTCTTCTGCTGCANTTGGTCTTCTG

Asp Val Asn Gin Lys Thr #ILlil — 7 mintaAsp Val Asn Gin Lys Thr #ILlil - 7 samples

ATT AATT A

TTGGTCTTCTGNAAGATTTGGTCTTCTGNAAGAT

Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Megjegyzés: N=A, G, C és TAsn Gin Lys Thr Phe Tyr Note: N = A, G, C and T

Az #ILlil—3 mintát 5’ végén ³²P-foszforilezzük, és a könyvtár 3 χ 10⁵ plakkjának szkrínelésére használjuk.The # IL11i-3 sample was ³² P-phosphorylated at the 5 'end and used to screen the library for 3 x 10 ⁵ plaques.

A mintát reprodukálhatóan a három plakkhoz hibridizál- 35 juk, ezen plakkok egyike az #ILli-4 mintával is hibridizálódik. Ezt a plakkot, a GT10 ILli-2A-t tenyésztjük, és a DNS-t Lambdasorb (Promega) alkalmazásával izoláljuk a gyártó utasításainak követésével.The sample is reproducibly hybridized to the three plaques, one of which also hybridizes to the # ILli-4 sample. This plaque, GT10 ILli-2A, was cultured and DNA isolated using Lambdasorb (Promega) following the manufacturer's instructions.

A GT10-ILli-2A-t az ATCC 40488 letéti számon 40 letétbe helyeztük [American Type Culture Collection (ATCC)]. A DNS-t EcoRI-gyel emésztjük, öt egyforma aliquot részre osztjuk, és 1%-os agarózgélen elektroforetizáljuk.GT10-ILli-2A was deposited under ATCC Accession No. 40488 (American Type Culture Collection (ATCC)). The DNA was digested with EcoRI, divided into five aliquots and electrophoresed on a 1% agarose gel.

Az elektroforézist követően a géleket etidium-bro- 45 middal festjük. Ennek a gélnek egy fényképét mutatjuk be a 12A. ábrán. A 6., 8., 10., 12. és 14. sávok tartalmazzák az EcoRI-emésztés öt aliquotját. Az ötödik sáv HindlII-mal hasított vad típusú lambda DNS és HaelIImal (New England Biolabs) hasított φΧ174 RF DNS 50 elegyét tartalmazza, amelyek hasznos molekulatömegmarkerek. A 12A. ábrán azt mutatjuk be, hogy a GT10-IL1Í-2A olyan EcoRI-fragmenst tartalmaz, amely 1850 bázispár hosszúságú.Following electrophoresis, the gels were stained with ethidium bromide. A photograph of this gel is shown in Figure 12A. FIG. Lanes 6, 8, 10, 12, and 14 contain five aliquots of EcoRI digestion. The fifth lane contains 50 mixtures of Hindlll-cleaved wild-type lambda DNA and HaelII (New England Biolabs) cleaved φΧ174 RF DNA which are useful molecular weight markers. 12A. Fig. 2A shows that GT10-IL11I-2A contains an EcoRI fragment of 1850 bp.

Annak még meggyőzőbb bizonyítására, hogy ez az 55 1850 bázispárból álló fragmens az IL-l-inhibitort kódoló szekvenciát hordozza, a következők szerint Southem-blot-módszert alkalmazunk. A 12A. ábrán bemutatott gélen lévő DNS-fragmenst szokásos eljárással nitro-cellulózra visszük. A nitro-cellulózt ezután hosszá- 60To further prove that this 55 1850 bp fragment carries the IL-1 inhibitor coding sequence, the Southem blot method is used below. 12A. The DNA fragment on the gel of Fig. 1B is transferred to nitrocellulose by a conventional method. The nitrocellulose is then extended for 60 minutes

Ennek a GT10 könyvtárnak a szkrínelésére a 3. példában bemutatott protein- és peptidszekvencia alapján antiszensz oligonukleotidmintákat szintetizálunk. Ezeknek a mintáknak a szekvenciája és a nekik megfelelő peptidszekvenciák a következők:To screen this GT10 library, antisense oligonucleotide samples were synthesized based on the protein and peptide sequence shown in Example 3. The sequence of these samples and their corresponding peptide sequences are as follows:

TT

C C T 5 ’ As pC C T 5 'As p

ATHE

A A 5’ Phe bán 5 csíkra vágjuk, hogy az egyes csíkok tartalmazzák a 6., 8., 10., 12. és 14. sávok DNS-ét. A csíkokat ezután egyenként hibridizáljuk a fenti, az 5’ végükön ³²P-foszfáttal jelölt oligonukleotidmintákkal. Az oligonukleotidkoncentráció 1 pmol/ml, a hibridizálás hőmérséklete az alábbi:Cut into 5 bands on AA 5 'Phe, so that each band contains the DNA of lanes 6, 8, 10, 12 and 14. The bands were then hybridized individually with the above oligonucleotide probes labeled with ³² P-phosphate at their 5 'ends. The oligonucleotide concentration is 1 pmol / ml and the hybridization temperature is as follows:

Sáv Acid Minta Sample Hőmérséklet Temperature 6 6 #ILlil-3 ILlil # 3 35 °C 35 ° C 8 8 #ILlil—4 ILlil # 4 42 °C 42 ° C 10 10 #ILlil-5 ILlil # 5 42 °C 42 ° C 12 12 #ILlil-6 ILlil # 6 40 °C 40 ° C 14 14 #ILlil-7 ILlil # 7 35 °C 35 ° C

Mosást követően a sávokat sorba rendezzük és egymáshoz erősítjük, hogy az eredeti nitro-cellulóz-lemezt helyreállítsuk. Ezt a lemezt erősítőemyő jelenlétében -70 °C hőmérsékleten 14 órán át autoradiografáljuk. A kapott autoradiogram fényképét a 12B. ábrán mutatjuk be. Ez bizonyítja, hogy a minták mindegyike fajlagosan hibridizálódik az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenshez, igazolva ezzel azt, hogy ez a fragmens jelentős, az IL-1inhibitor szekvenciáját kódoló részt hordoz.After washing, the bands are aligned and stapled together to restore the original nitrocellulose plate. This plate was autoradiographed for 14 hours in the presence of an amplifier at -70 ° C. A photograph of the resulting autoradiogram is shown in Figure 12B. 4A. This proves that each of the samples specifically hybridizes to the 1850 bp fragment, thereby confirming that this fragment carries a significant portion of the coding sequence for the IL-1 inhibitor.

DNS-szekvenciájának meghatározására a GT10-IL1Í-2A DNS-t EcoRI-gyel emésztjük, 1%-os agarózgélen elektroforézist végzünk, és az 1850 bázispárt tartalmazó fragmenst elkülönítjük. Ezt a fragmenstTo determine its DNA sequence, GT10-IL1-1-2A DNA was digested with EcoRI, electrophoresed on a 1% agarose gel, and the 1850 bp fragment was isolated. This fragment

HU 222 810 BlHU 222 810 Bl

EcoRI-gyel emésztett M13 mpl9-cel Egáljuk, és E. coli JM109 törzsbe transzformáljuk. A transzformánsokat a béta-galaktozidáz-aktivitás hiánya szerint szkrineljük. Öt ilyen béta-galaktozidáz-hiányos transzformánst izoláltunk, ezekből egy szálú DNS-t készítünk, és Sanger és munkatársai eljárása szerint szekvenáljuk. A három transzformáns DNS-szekvenciája megfelel az mRNS 3’ végének, míg két transzformáns a proteint kódoló szekvenciát adja. A 13. ábrán azt a DNS-szekvenciát mutatjuk be, amelyet a cDNS proteint kódoló részére kaptunk.It is digested with EcoRI-digested M13 mpl9 and transformed into E. coli strain JM109. Transformants were screened for lack of beta-galactosidase activity. Five such beta-galactosidase deficient transformants were isolated, prepared from one stranded DNA and sequenced according to Sanger et al. The three transformants have the DNA sequence corresponding to the 3 'end of the mRNA, while two transformants give the protein coding sequence. Figure 13 shows the DNA sequence obtained for the coding region of the cDNA.

A 13. ábrán az előre jelzett aminosavszekvenciát is bemutatjuk. Az első aminosavtól, az alanintól a 29. aminosavig, a prolinig, valamint a 79. aminosavtól, az izoleucintól a lánc végéig az aminosavszekvencia feltételezett. A 30. aminosavtól, a prolintól, a 78. aminosavig, a prolinig terjedő előre jelzett aminosavszekvencia megegyezik a 3. példában leírt peptidszekvenciával.Figure 13 also shows the predicted amino acid sequence. From the first amino acid, alanine to amino acid 29, to proline, and from amino acid 79, isoleucine to the end of the chain, the amino acid sequence is assumed. The predicted amino acid sequence from amino acid 30, proline, amino acid 78 to proline is the same as the peptide sequence described in Example 3.

7. példaExample 7

A GT10-11-2A és azlL-li szekvenálásaSequencing of GT10-11-2A and azlL-li

A GT10-IL1Í-2A egy részét szekvenáltuk, ennek eredményét a 14. ábrán mutatjuk be. A DNS (99-557. nukleotidok) egy olyan fehérjét kódol, amely az IL-1inhibitorra jellemző aminosavszekvenciát tartalmazza. Úgy véljük azonban, hogy ezen a fehérjén néhány módosulásnak kell végbemennie, mielőtt a sejten kívüli környezetbe kiválasztódna. Ezek a módosulások a fehérje IL-li-akivitását tekintve lehetnek lényegesek vagy lényegtelenek.A portion of GT10-IL11I-2A was sequenced and the result is shown in Figure 14. DNA (nucleotides 99-557) encodes a protein that contains the amino acid sequence specific for the IL-1 inhibitor. However, it is believed that some modifications of this protein must take place before being secreted into the extracellular environment. These modifications may be significant or insignificant with respect to the IL-li activity of the protein.

A GT10-IL1Í-2A az X jelöléssel illetett IL-li amino terminusának legalább 32 aminosav N-terminálisát kódolja (3-98. nukleotidok). Úgy véljük, hogy ebben a 32 aminosavban szerepel egy kiválasztó vezetőszekvencia, amely a 24-26. nukleotidok által kódolt M-nél kezdődik, a naszcens IL-li-t a sejt közötti környezetbe irányítja, majd a vezetőpeptidáz és feltehetőleg egyéb peptidázok eltávolítják. Ennek a szekvenciának az eltávolítási mértéke az alfa- és béta-IL-l-inhibitorok esetén jelenleg még ismeretlen, de feltehető, hogy ezeknek a formáknak az N-terminálisa közel van az X forma N-terminálisához. Valószínű, hogy a kiválasztó leader (vezető)szekvencia eltávolítása szükséges ahhoz, hogy a fehérje hatékony IL- li-aktivitásúvá váljon.GT10-IL11I-2A encodes at least 32 amino acids (nucleotides 3-98) of the amino terminus of the X-labeled IL-li. It is believed that these 32 amino acids contain a selectable leader sequence as shown in Figures 24-26. starts at M encoded by nucleotides, directs nascent IL-li into the intercellular environment, and is then removed by the leader peptidase and possibly other peptidases. The degree of removal of this sequence for alpha and beta IL-1 inhibitors is currently unknown, but it is believed that the N-terminus of these forms is close to the N-terminus of Form X. It is likely that the deletion of the leader leader is necessary for the protein to become effective in IL-II activity.

A GT10-IL1Í-2A 349-351. nukleotidjai egy olyan N-egységet kódolnak, amely egy konszenzus Nglikozilezési hely része. N-glikanázzal való emésztésre való érzékenységük alapján feltételezzük, hogy az alfaés béta-IL- li glikozilezettek. Mivel az X forma nem érzékeny ezzel az enzimmel való emésztésre, feltehetőleg ez nem glikozilezett, bár ez a lehetőség is fennáll, ez a proteinszekvenálásban jártas szakember számára a leírásban adott információk birtokában könnyen kimutatható. Feltételezzük, hogy ennek az N-egységnek a glikozilezése nem szükséges ahhoz, hogy a protein hatásos IL-li-aktivitást mutasson.GT10-IL11-2A 349-351. nucleotides encode an N unit that is part of a consensus Nglycosylation site. Based on their sensitivity to digestion with N-glycanase, it is believed that alpha and beta-IL-II are glycosylated. Because Form X is insensitive to digestion with this enzyme, it is presumably not glycosylated, although this possibility exists, it can be readily detected by one skilled in the art of protein sequencing with the information provided herein. It is believed that glycosylation of this N-unit is not required for the protein to exhibit potent IL-li activity.

A GT10-IL1Í-2A 99-101. nukleotidjai egy P egységet kódolnak (lásd a 15. ábrán), de ez a P egység nem mutatható ki ebben a helyzetben (az N-terminálison) az IL-li X formájában. Lehetséges, hogy ez az egység az érett fehérjében módosul. Úgy véljük, hogy ennek az egységnek a módosulása nem lényeges az IL—liaktivitás hatékonysága szempontjából.GT10-IL11-2A 99-101. nucleotides encode a P unit (see Figure 15), but this P unit cannot be detected at this position (at the N-terminus) in the form of IL-li. It is possible that this unit is modified in the mature protein. It is believed that modification of this unit is not critical to the efficacy of IL-activity.

Az alfa- és béta-formák jelenleg ismeretlen N-terminális egységei az Edman-lebontással nem teljesen mutathatók ki, feltehetőleg a GT10-IL1Í-2A által kódolt fehérje bizonyos N-terminális egységeinek eltávolítását követően módosulnak. Feltételezzük, hogy ez a módosulás nem lényeges az IL-li-aktivitás hatékonysága szempontjából.The currently unknown N-terminal units of the alpha and beta forms are not fully detected by Edman degradation, presumably after the removal of certain N-terminal units of the GT10-IL11I-2A encoded protein. It is believed that this modification is not relevant to the efficacy of IL-1i activity.

8. példaExample 8

Az IL-li-t kódoló gének expressziója állati sejtekbenExpression of genes encoding IL-li in animal cells

Az IL-li állati sejtekben való expressziójához a következő lépések szükségesek:The expression of IL-li in animal cells requires the following steps:

a) Expressziós vektor létrehozásaa) Creating an expression vector

b) A gazdasejtvonal megválasztásab) Selection of host cell line

c) Az expressziós vektor bevitele a gazdasejtbec) Introduction of the expression vector into the host cell

d) A rekombináns gazdasejt manipulálása az IL-li expressziós szintjének növelésére.d) Manipulation of the recombinant host cell to increase expression levels of IL-li.

1. Az állati sejtekben való felhasználásra szánt IL-li expressziós vektorok különféle típusúak lehetnek, köztük erősen konstitutív expressziós szerkezetek, indukálható génszerkezetek, valamint olyanok, amelyek bizonyos sejttípusokban való expresszióra megfelelőek. Minden esetben promotereket és más génszabályozó szakaszokat, például indukálható vagy nem indukálható erősítőket (enhancer) és poliadenilációs jeleket helyezünk el a plazmidalapú vektorban lévő cDNSszekvenciához megfelelő helyzetben. A következőkben két ilyen szerkezetet ismertetünk:1. IL-li expression vectors for use in animal cells may be of various types, including highly constitutive expression constructs, inducible gene constructs, and those suitable for expression in certain cell types. In each case, promoters and other gene regulatory regions, such as inducible or non-inducible enhancers and polyadenylation signals, are positioned in a position appropriate to the cDNA sequence in the plasmid-based vector. Two such structures are described below:

(1) Egy erős konstitutív promoterszakaszt tartalmazó szerkezetet készítünk majomvírus 40 (SV40) gén kontrollszignálok olyan elrendezésben való alkalmazásával (pSV2CAT), ami plazmidra Gorman és munkatársai [Mól. Cél. Bioi.; 2, 1044-1051 (1982)] által leírtaknak (amit leírásunkba referenciaként építünk be) megfelel. Ezt a plazmidot úgy manipuláljuk, hogy az IL-li cDNS-t helyettesítjük be a kloramfenikol-acetil-transzferázt (CAT) kódoló szekvencia helyére a molekuláris biológiai technikában ismert módon (lásd Maniatis és munkatársai fentiekben hivatkozott munkája), amint azt a 6. ábrán bemutatjuk· (2) Indukálható génszerkezetet készítünk olyan PMK-plazmid alkalmazásával, amely egér-metallotionein (MT-1) promoterszakaszát [Brinster és munkatársai; Cell 27. 228-231 (1981)] tartalmazza. Ezt a plazmidot alkalmazhatjuk kiindulási anyagként, és manipulálhatjuk a 7. ábrán bemutatott módon egy fémmel indukálható génszerkezet előállítására.(1) A construct containing a strong constitutive promoter region was constructed using monkey virus 40 (SV40) gene control signals in an arrangement (pSV2CAT) as described for the plasmid in Gorman et al., Mol. Target. Biol .; 2, 1044-1051 (1982) (incorporated herein by reference). This plasmid was manipulated by replacing the IL-li cDNA with the sequence encoding chloramphenicol acetyltransferase (CAT) in a manner known in molecular biology (see Maniatis et al., Supra). (2) An inducible gene construct was constructed using the PMK plasmid which contains the promoter region of murine metallothionein (MT-1) [Brinster et al; Cell 27: 228-231 (1981)]. This plasmid can be used as a starting material and manipulated as shown in Figure 7 to generate a metal-inducible gene construct.

2. Számos különféle állati sejtvonal alkalmazható az IL-li kifejezésére az előzőekben leírt vektorok alkalmazásával, így aktív fehérjék állíthatók elő. Két olyan lehetséges sejtvonal, amelyeknek idegen gének expresszióját elősegítő képességét jól jellemezték, az egér-Ltk- és a kínaihörcsög-petefészek (CHO) dhfrsejtek, bár az IL-li expressziója nem korlátozódik ezekre a sejtvonalakra.2. A variety of animal cell lines can be used to express IL-li using the vectors described above to produce active proteins. Two possible cell lines, which have been well characterized for their ability to promote foreign gene expression, are murine Ltk and Chinese hamster ovary (CHO) dhfr cells, although IL-li expression is not restricted to these cell lines.

3. A DNS-vektor ezekbe a sejtvonalakba számos génátviteli eljárással vihető be. Az itt alkalmazott eljá193. The DNA vector can be introduced into these cell lines by a variety of gene transfer techniques. The procedure applied here19

HU 222 810 Bl rás a kalcium-foszfát-DNS precipitációs eljárás, amelyet S. L. Graham és A. S. van dér Eb [Virology 52, 456-467 (1973)] írnak le. Ebben az eljárásban az IL—li expressziós vektorát egy másik, egy kiválasztó markert kódoló expressziós vektorral együtt csapják ki. Ltk~-sejttranszfekció esetén a kiválasztó marker egy timidin-kináz-gén, és a kiválasztást (szelekció) Wigler és munkatársai [Cell 76;777-785 (1979)] eljárásával végezzük, CHO dhfr- sejtek esetén a kiválasztó marker dihidrofolát-reduktáz (DHFR), és a szelekciót Ringold és munkatársai; [J. Mól. Appl. Génét. 7, 165-175 (1981)] eljárásával végezzük.The calcium phosphate DNA precipitation method described by S. L. Graham and A. S. van Der Eb (Virology 52: 456-467 (1973)) is described. In this method, the expression vector of IL-li is co-precipitated with another expression vector encoding a selectable marker. In Ltk ~ cell transfection, the selectable marker is a thymidine kinase gene and selection (selection) is performed according to Wigler et al. DHFR), and selection by Ringold et al; [J. Mole. Appl. Gene. 7, 165-175 (1981)].

4. Ezt követően az IL— li génszerkezetet kifejező sejteket olyan körülmények között szaporítjuk, amelyek mellett az IL-li-termelés szintje nő. A metallotionein promoterszerkezetet hordozó sejteket már nehézfémek, például kadmium jelenlétében szaporíthatjuk, amely az MT-1 promoter hasznosítását ötszörösére növeli [Mayo és munkatársai, Cell 29 99-108] ez az IL—li fehéijeszint jelentékeny növekedéséhez vezet. Azokat a sejteket, amelyek IL— li expressziós vektorokat (SV40- vagy MT-1-alapú) DHFR expressziós vektorokkal együtt tartalmaznak, a Ringold és munkatársai [J. Mól. Appl. Génét. 1, 165-175 (1981)] által leírt génszaporítási eljárás szerint kezelhetjük methotrexate alkalmazásával, ami a DHFR-nek kompetitív antagonistája. Ez a sejtben a DHFR-gén több másolatának jelenlétéhez vezet, ennek folytán az IL— li gének megnövekedett kópiaszámához, ami több IL— li fehérje termelődéséhez vezet a sejtben.4. Cells expressing the IL-li gene construct are then propagated under conditions that increase IL-li production. Cells carrying the metallothionein promoter construct can already be propagated in the presence of heavy metals, such as cadmium, which increases the utilization of the MT-1 promoter up to 5-fold (Mayo et al., Cell 29 99-108), leading to a significant increase in IL-1i protein levels. Cells containing IL-li expression vectors (based on SV40 or MT-1) together with DHFR expression vectors are described in Ringold et al. Mole. Appl. Gene. 1, 165-175 (1981)] can be treated using methotrexate, a competitive antagonist of DHFR. This leads to the presence of multiple copies of the DHFR gene in the cell, resulting in an increased copy number of the IL-li genes leading to the production of more IL-li proteins in the cell.

9. példaExample 9

IL-li tisztítása rekombináns állati sejtekbőlPurification of IL-li from recombinant animal cells

Tekintettel arra, hogy az IL-li-t természetes anyagok sejtjeiből kívánjuk kiválasztani, feltételezzük, hogy az előzőekben a természetes fehérjék tisztítására leírt eljárások hasonló tisztítást és jellemzőket eredményeznek rekombináns fehéijék esetén.Given the desirability of selecting IL-li from cells of natural materials, it is believed that the methods described previously for purifying natural proteins result in similar purification and characteristics in recombinant proteins.

10. példaExample 10

Az IL-li szekvenciájaSequence of IL-li

Az IL-li aminoterminális egységét néhányszor közvetlen fehéijeszekvencia-meghatározással argininként (R) azonosítottuk. Az ilyen szekvenálás eredményét a 3. példában mutatjuk be. Ezzel ellentétben az IL-li cDNS-szekvenálás alapján előrelátható aminoterminális egysége egy prolin (P). Ez az aminoterminális egység felel meg a 13. ábrán látható 85-87. nukleotidoknak, és ez van körrel megjelölve a 14. és 15. ábrákon. Ez a látszólagos eltérés a cDNS-szekvencia és a közvetlen proteinszekvencia között feloldható azzal a feltételezéssel, hogy a cDNS-szekvenciába egy hiba épült be, miközben az mRNS-ből reverz transzkriptáz által katalizált módon szintetizálódott. Azaz, az mRNSen az aminoterminális egység kódolására alkalmas módon elhelyezkedő CGA (arginin) kodon változhatott a reverz transzkriptázreakció során CCA (prolin) kodonná a cDNS-ben. Ilyen típusú reverz transzkriptázproblémát ismertettek már korábban a szakirodalomban [B. D. Clark és munkatársai; Nucleic Acids Research 14, 7897 (1986)].The amino terminal unit of IL-li was identified several times by direct protein sequencing as arginine (R). The result of such sequencing is shown in Example 3. In contrast, the predicted amino terminal unit of IL-li by cDNA sequencing is proline (P). This amino terminal unit corresponds to Figures 85-87 in Figure 13. nucleotides, and is circled in Figures 14 and 15. This apparent discrepancy between the cDNA sequence and the direct protein sequence can be resolved by assuming an error in the cDNA sequence while synthesized from the mRNA by a catalyzed reverse transcriptase. That is, the CGA (arginine) codon located on the mRNA in a manner suitable for encoding the amino terminal unit may have been changed to a CCA (proline) codon in the cDNA during the reverse transcriptase reaction. This type of reverse transcriptase problem has been previously described in the literature [B. D. Clark et al .; Nucleic Acids Research 14, 7897 (1986)].

Feltételezzük, hogy a protein helyes aminosavszekvenciája a cDNS által előre láthatónak megfelelő, kivéve azt, hogy az aminoterminális aminosav prolin helyett arginin, amint az a 13-15. ábrákon jelölve van. Mind a DNS-szekvenciák, mind a nekik megfelelő peptidszekvenciák a találmány oltalmi körén belül esnek, azzal a megjegyzéssel, hogy előnyös az aminoterminálison az argininszekvencia.It is assumed that the correct amino acid sequence of the protein is predictable by the cDNA, except that the amino terminal amino acid is proline instead of proline, as shown in Figures 13-15. is marked on the figures. Both DNA sequences and their corresponding peptide sequences are within the scope of the invention, with the proviso that the arginine sequence at the amino terminus is preferred.

Claims (41)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. Legalább 90%-os tisztaságú interleukin-l-inhibitor (IL-li), amely az interleukin-1 alfa és interleukin-1 béta közül legalább az egyikkel szemben aktív.An interleukin-1 inhibitor (IL-li) having a purity of at least 90%, which is active against at least one of interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta. 2. Fiziológiásán funkcióképes interleukin-1-inhibitort (IL-li) kódoló izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi szekvenciarészletet:2. An isolated DNA sequence encoding a physiologically functional interleukin-1 inhibitor (IL-li), comprising the following sequence fragment: GCG GCG TCA TCA CAG CAG AAT AAT GGA GGA AAT AAT CTG CTG CAG CAG 27 AGG 27 AGG CCT CCT CCG CCG CAG CAG TCA TCA CCT CCT AAT AAT CAC CAC TCT TCT 54 CCT 54 CCT CCT CCT CTT CTT CTG CTG ATC ATC ATT ATT CAG CAG AGA AGA CCG CCG 81 ATC 81 ATC TGC TGC CCA CCA CCC CCC TCT TCT GGG GGG AGA AGA AAA AAA TCC TCC 108 AGC 108 AGC AAG AAG ATG ATG CAA CAA GCC GCC TTC TTC AGA AGA ATC ATC TGG TGG 135 GAT 135 DAM GTT GTT AAC AAC CAG CAG AAG AAG ACC ACC TTC TTC TAT TAT CTG CTG 162 AGG 162 AGG AAC AAC AAC AAC CAA CAA CTA CTA GTT GTT GCT GCT GGA GGA TAC TAC 189 TTG 189 TTG CAA CAA GGA GGA CCA CCA AAT AAT GTC GTC AAT AAT TTA TTA GAA GAA 216 GAA 216 GAA AAG AAG ATA OVER THE GAT DAM GTG GTG GTA GTA CCC CCC ATT ATT GAG GAG 243 CCT 243 CCT CAT CAT GCT GCT CTG CTG TCT TCT TGG TGG GAA GAA TCC TCC ATG ATG 270 GAG 270 GAG HU 222 810 Β1HU 222 810 Β1 3. A 2. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi DNS-szekvencia 99. és 554. közötti nukleotidjait:The isolated DNA sequence of claim 2, comprising the nucleotides 99 to 554 of the following DNA sequence: 70 80 90 100 110 12070 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCCACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET 1CPPSGRKSCTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCCACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET 1CPPSGRKS 130 140 150 160 170 180130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRNGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I DACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D 250 260 270 280 290 300250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLGIHGGKMCLTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLGIHGGKMCL 310 320 330 340 350 360310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TDCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD 370 380 390 400 410 420370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGPTGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP 430 440 450 460 470 480430,440,450,460,470,480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEACCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA 490 500 510 520 530 540490,500,510,520,530,540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFYACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY 550 4-560 570 580 590 600550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E *TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * 4. A 2. igénypont szerinti izolált DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az alábbi DNS-szekvencia 99. és 554. közötti nukleotidjait:The isolated DNA sequence of claim 2, comprising the nucleotides 99 to 554 of the following DNA sequence: 70 80 90 100 110 12070 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICRPSGRKSCTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCGACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICRPSGRKS 130 140 150 160 170 180130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRNGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKID 250 260 270 280 290 300250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCLTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCL HU 222 810 BlHU 222 810 Bl 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD 370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGP370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGP 430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA430 440 450 460 470 480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEA 490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY490 500 510 520 530 540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFY 550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E *550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * 5. Interleukin-l-et (IL-1) gátolni képes interleukin-l-inhibitor (IL—li) polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza: 25 (A)An interleukin-1 inhibitor (IL-li) polypeptide capable of inhibiting interleukin-1 (IL-1), characterized in that it comprises any of the following sequences: (A) 10 20 30 40 50 6010 20 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCAGAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA MEICRGLRSHLIMEICRGLRSHLI 70 80 90 100 110 12070 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKSCTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKS 130 140 150 160 170 180130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRNGCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I DACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D 250 260 270 280 290 300250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCLTGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCL 310 320 330 340 350 360310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TDCCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD 370 380 390 400 410 420370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGPTGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF ÍRSDSGP 430 440 450 460 470 480430,440,450,460,470,480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGCCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEATTSFESAACPGWFLCTAMEA HU 222 810 BlHU 222 810 Bl 490 500 510 520 530 540490,500,510,520,530,540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVSLTNMPDEGVMVTKFYDQPVSLTNMPDEGVMVTKFY 550 560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G és X aminosav jelentése R vagy P;550 560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * wherein S is C or G and X is R or P; (B) az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-szekvenciát tartalmazó részlete;(B) a fragment of sequence (A) comprising an IL-1I inhibitor IL-1; (C) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;(C) at least 70% sequence homology with sequence (A); (D) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. 10 pozíciói közötti szekvenciája által kódolt szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;(D) 99-554 of the coding region for sequence (A). At least 70% homologous to the sequence encoded by its 10 positions; (E) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:(E) the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S G R K S S G R K S S K S K M Q A M Q A F R F R I I W W D D V V N N Q K Q K. T T F F Y Y L L R R N N N Q N Q L L V A G Y L V A G Y L Q G Q G P N V P N V N L N L E E E E K K I I D D V V V V P P I I E E P P H H A THE L F L F L L G I H G G G I H G G K M K M C L S C L S C V C V K K S S G G D D E E T R T R L L Q Q L L E E A THE V V N I N I T T D L S E N D L S E N R K RK Q D K Q D K R F R F A THE F F I I R R S S D S D S G G P P T T T T S S F F E S E S A THE A C P G W A C P G W F L F L CTA CTA Μ E Μ E A THE D D Q Q P P V V S L S L T T N N M M P P D D E E G V G V M M V Τ K F Y V Τ K F Y F Q F Q EDE EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (F) az (E) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and (X) is R or P; or (F) a coding sequence for an amino acid sequence that is at least 70% homologous to amino acid sequence (E). 6. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.6. The polypeptide of claim 5, wherein the sequence comprises (C), (D) or (F) at least 80% homologous. 7. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalábbThe polypeptide of claim 5, wherein the sequence (C), (D) or (F) is at least 25 90%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.It contains 90% homologous sequences. 8. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy (C), (D) vagy (F) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.8. The polypeptide of claim 5, wherein said polypeptide comprises (C), (D) or (F) at least 95% homologous sequence. 9. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jelle30 mezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:The polypeptide of claim 5, wherein it comprises any of the following sequences: (a) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:(a) the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWDVNQKT FYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVP IEPHA LFLG IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAF IRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVS LTNMPDE GVMVTKFYFQEDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvencia.(U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWDVNQKT FYLRN NQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVP IEPHA LFLG IHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAV NITDLSENRKQDKRFAF IRSDSGPTTSF ESAACPGWFLCTAMEADQPVS LTNMPDE GVMVTKFYFQEDE wherein (U) is nothing, M, or a secretion signal sequence containing N-terminal of IL-II was administered and out of the cell processed form (X) is R or P; or (b) up to 5% of the amino acid sequence of (a). 10. A 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemez45 ve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:The polypeptide of claim 5, characterized in that it comprises any of the following sequences: (a) az alábbi aminosavszekvencia vagy annak egy IL-l-et gátló fragmense:(a) the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S G S G R K S R K S S S K K M Q A F R M Q A F R I I W W D D V N Q K V N Q K T T F F Y Y L L R R N N N Q N Q L L V A A A G Y L G Y L Q Q G G P N V N L P N V N L E E E E K K I D V V I D V V P P I I E E P P H H A THE L F L F L L G I G I H G G H G G K K M M C L S C V C L S C V K K S S G G D E T R D E T R L L Q Q L L E E A THE V V N I N I T T D L D L S E N S E N R R K K Q D K R F Q D K R F A THE F F I I R S D S R S D S G G P P T T T T S S F F E S E S A THE A C C P G W P G W F F L L C T A Μ E C T A Μ E A THE D D Q Q P V S L P V S L T T N N M M P P D D E E G V G V M M V T V T K F Y K F Y F F Q Q EDE EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és 60 (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvencia.wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and 60 (X) is R or P; or (b) an amino acid sequence that is at most 1% different from amino acid sequence (a). HU 222 810 Β1HU 222 810 Β1 11. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazza:The polypeptide of claim 5, wherein the polypeptide comprises the following amino acid sequence: M R N Q M R N Q P L P L S V S V G A G THE R K RK S L S L s Q s Q K G K G M P M P Q A F Q A F R L R L I E I E W E W E D V N Q D V N Q K T K T F Y F Y L P L P R N H A R N H A G G Y Y N N V N V N K K I I D V D V V V P P I I E E L F L F L L G G I I H H G G G G K K M M C C L L s c s c V V K K S S G G D D E T E T R R L L Q Q L L E E A V The V N I N I T T D D L L S S E E N N R R K K Q Q D D K R K R F F A THE F F I I R R S D S D S S G G P P T T T T S F S F E S E S A THE A THE C C P P G G W W F F L L c c T T A M M E E A THE D D Q Q P P V S V S L L T T N N M M P P D E D E G V G V M M V V T T K K F F Y Y F F Q Q E E D D E E 12. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó N-terminális szekréciós szignálpeptidet tartalmaz:The polypeptide of claim 5, wherein the polypeptide comprises an N-terminal secretory signal peptide comprising the following amino acid sequence or a portion thereof: MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICMEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC 13. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy glikozilációs mintázata a humán urináris IL— li-étől eltérő, vagy glikozilálatlan.13. The polypeptide of claim 5, wherein the glycosylation pattern is different or non-glycosylated from human urinary IL-IIi. 14. Az 5. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtben lett előállítva, 20 és legalább 90%-os tisztaságú.14. The polypeptide of claim 5, wherein the polypeptide is produced in a recombinant host cell having a purity of 20 and at least 90%. 15. A 14. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként prokarióta sejtben lett előállítva.15. The polypeptide of claim 14, wherein said polypeptide is produced as a recombinant host cell in a prokaryotic cell. 16. A 15. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként E. co/í-sejtben lett előállítva.16. The polypeptide of claim 15, wherein said polypeptide is produced in E. coli as a recombinant host cell. 17. A 14. igénypont szerinti polipeptid, azzal jelle15 mezve, hogy rekombináns gazdasejtként emlőssejtben lett előállítva.The polypeptide of claim 14, wherein said polypeptide is produced as a recombinant host cell in a mammalian cell. 18. A 17. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként CHO-sejtben lett előállítva.18. The polypeptide of claim 17, wherein said polypeptide is produced as a recombinant host cell in a CHO cell. 19. Interleukin-l-et (IL-l-et) gátolni képes IL-li-t kódoló rekombináns DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:19. A recombinant DNA molecule encoding IL-li capable of inhibiting interleukin-1 (IL-1), comprising any of the following sequences: (A)(THE) 10 20 30 40 50 6010 20 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCAGAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA MEICRGLRSHLIMEICRGLRSHLI 70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKS70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSET ICXPSGRKS 130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEK I D 250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCL250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG IHGGKMCL 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVN I TD310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVN I TD 370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP 430 440 450 460 470 480430,440,450,460,470,480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGCCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEATTSFESAACPGWFLCTAMEA HU 222 810 BlHU 222 810 Bl 490 500 510 520 530 540490,500,510,520,530,540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVS LTNMPDEGVMVTKFYDQPVS LTNMPDEGVMVTKFY 550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G, és az X aminosav jelentése R vagy P;550 4-560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * wherein S is C or G and X is R or P; (B) az (A) szekvenciában található kódolórégió vagy az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részlete;(B) the coding region in sequence (A) or the coding region of IL-1 which inhibits IL-1; (C) az (A) szekvenciában található kódolórégiónak vagy IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részletének degenerált szekvenciája;(C) a degenerate sequence of a coding region in the sequence of (A) or of an IL-1 inhibitor that inhibits IL-1; (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD(U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD NQLVAGYLQGPNVNLEEKNQLVAGYLQGPNVNLEEK LFLG IHGGKMCLSCVKSGLFLG IHGGKMCLSCVKSG NI TDLSENRKQDKRFAF INI TDLSENRKQDKRFAF I ESAACPGWFLCTAMEADQESAACPGWFLCTAMEADQ GVMVTKFYFQEDE ahol 25 (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely azGVMVTKFYFQEDE wherein 25 (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that is IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; 30 vagy (G) az (F) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.IL-li is processed into the extracellular compartment and (X) is R or P; Or (G) a coding sequence for an amino acid sequence that is at least 70% homologous to amino acid sequence (F). 20. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.20. The DNA molecule of claim 19, wherein the sequence (D), (E) or (G) comprises at least 80% homologous sequence. (D) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homo10 lóg szekvencia;(D) is at least 70% homologous to sequence (A); (E) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. pozíciói közötti szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;(E) 99-554 of the coding region for sequence (A); at least 70% homologous to the sequence between its positions; (F) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló szekvencia:(F) a coding sequence for a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: VNQKTFYLRN IDVVPIEPHA DETRLQLEAV RSDSGPTTSF PVSLTNMPDEVNQKTFYLRN IDVVPIEPHA DETRLQLEAV RSDSGPTTSF PVSLTNMPDE 21. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 90%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.21. The DNA molecule of claim 19, wherein the sequence (D), (E) or (G) comprises at least 90% homologous sequence. 22. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmaz.22. The DNA molecule of claim 19, wherein the sequence (D), (E) or (G) comprises at least 95% homologous sequence. 23. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza :23. A DNA molecule according to claim 19, characterized in that it comprises any of the following sequences: (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:(a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S S G G R K RK S S s s K M K M Q A Q A F F R R I W I W D V N Q D V N Q K K T T F F Y Y L L R R N N N Q N Q L L V V A THE G Y G Y L L Q Q G P G P N V N V N N L L E E EE K I D V K I D V V V P P I I E E P P H H A THE L F L F L L G G I I H G H G G G K K M C M C L S L S C C V V K S K S G D E T G D E T R R L L Q Q L L E E A THE V V N I N I T T D D L L S E NEITHER N N R R K Q K Q D K D K R R F F A F The F I R S D I R S D S S G G P P T T T T S S F F E S E S A THE A THE C C P G P G W W F F L C L C T A T A M M E E A D In D Q P V S Q P V S L L T T N N M M P P D D E E G V G V M M V V T T K F K F Y Y F F Q E Q E D E D E ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; 50 vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and (X) is R or P; Or (b) a sequence encoding up to 5% of an amino acid sequence other than (a). (U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD NQLVAGYLQGPNVNLEEK LFLG IHGGKMCLSCVKSG NITDLSENRKQDKRFAF I ESAACPGWFLCTAMEADQ GVMVTKFYFQEDE(U) (X) PSGRKS SKMQAFR IWD NQLVAGYLQGPNVNLEEK LFLG IHGGKMCLSCVKSG NITDLSENRKQDKRFAF I ESAACPGWFLCTAMEADQ GVMVTKFYFQEDE 24. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza :24. A DNA molecule according to claim 19, characterized in that it comprises any of the following sequences: (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:(a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: VNQKTFYLRNVNQKTFYLRN IDVVPIEPHAIDVVPIEPHA DETRLQLEAVDETRLQLEAV RSDSGPTTSFRSDSGPTTSF PVSLTNMPDEPVSLTNMPDE HU 222 810 Bl ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és 5 (X) jelentése R vagy P;Wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in a processed form to the outside of the cell and (X) is R or P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.or (b) a sequence encoding up to 1% of an amino acid sequence other than amino acid sequence (a). 25. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazza:25. The DNA molecule of claim 19, comprising the coding sequence for a polypeptide having the following amino acid sequence: M M R R P P S S G G R R K K S S S S K K M M Q Q A THE F F R R I I W W D D V V N N Q Q K K T T F F Y Y L L R R N N N N Q Q L L V V A THE G G Y Y L L Q Q G G P P N N V V N N L L E E E E K K I I D D V V V V P P I I E E P P H H A THE L L F F L L G G I I H H G G G G K K M M C C L L S S C C V V K K S S G G D D E E T T R R L L Q Q L L E E A THE V V N N I I T T D D L L S S E E N N R R K K Q Q D D K K R R F F A THE F F I I R R S S D D S S G G P P T T T T S S F F E E S S A THE A THE C C P P G G W W F F L L c c T T A THE M M E E A THE D D Q Q P P V V S S L L T T N N M M P P D D E E G G V V M M V V T T K K F F Y Y F F Q Q E E D D E E (Uniós elsőbbsége: 1988. 11. 03.; módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)(Priority of the Union: 03/11/1988; Priority of amendment: 01.07.1994) 26. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó N-terminális szekréciós szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz:26. The DNA molecule of claim 19, wherein said DNA molecule comprises a sequence encoding an N-terminal secretory signal peptide comprising the following amino acid sequence or a portion thereof: MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICMEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC 27. A 19. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a natív IL-l-inhibitorétól eltérő promotert tartalmaz, amely funkcionálisan hozzá van kapcsolva a kódolószekvenciához.27. The DNA molecule of claim 19, comprising a promoter other than its native IL-1 inhibitor which is functionally linked to the coding sequence. 28. Vektor, amely 17-27. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.28. A vector comprising 17-27. A DNA molecule according to any one of claims 1 to 6. 29. Rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy 20 interleukin-l-et (IL-l-et) gátló aktivitású IL—li polipeptidet kódoló DNS-molekulát tartalmaz, amely DNS-molekula az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazza:29. A recombinant host cell comprising 20 DNA molecules encoding an IL-1i polypeptide having interleukin-1 (IL-1) inhibitory activity, which DNA molecule comprises any of the following sequences: (A)(THE) 10 20 30 40 50 6010 20 30 40 50 60 GAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCAGAATTCCGGGCTGCAGTCACAGAATGGAAATCTGCAGAGGCCTCCGCAGTCACCTAATCA MEICRGLRSHLIMEICRGLRSHLI 70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS70 80 90 100 110 120 CTCTCCTCCTCTTCCTGTTCCATTCAGAGACGATCTGCCSACCCTCTGGGAGAAAATCCA TLLLFLFHSETICXPSGRKS 130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN130 140 150 160 170 180 GCAAGATGCAAGCCTTCAGAATCTGGGATGTTAACCAGAAGACCTTCTATCTGAGGAACA SKMQAFR IWDVNQKTFYLRN 190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKI D190 200 210 220 230 240 ACCAACTAGTTGCTGGATACTTGCAAGGACCAAATGTCAATTTAGAAGAAAAGATAGATG NQLVAGYLQGPNVNLEEKI D 250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCL250 260 270 280 290 300 TGGTACCCATTGAGCCTCATGCTCTGTTCTTGGGAATCCATGGAGGGAAGATGTGCCTGT VVP I EPHALFLG I HGGKMCL 310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD310 320 330 340 350 360 CCTGTGTCAAGTCTGGTGATGAGACCAGACTCCAGCTGGAGGCAGTTAACATCACTGACC SCVKSGDETRLQLEAVNI TD 370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP370 380 390 400 410 420 TGAGCGAGAACAGAAAGCAGGACAAGCGCTTCGCCTTCATCCGCTCAGACAGTGGCCCCA LSENRKQDKRFAF IRSDSGP 430 440 450 460 470 480430,440,450,460,470,480 CCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTGCCACCAGTTTTGAGTCTGCCGCCTGCCCCGGTTGGTTCCTCTGCACAGCGATGGAAGCTG TTSFESAACPGWFLCTAMEATTSFESAACPGWFLCTAMEA HU 222 810 BlHU 222 810 Bl 490 500 510 520 530 540490,500,510,520,530,540 ACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACTACCAGCCCGTCAGCCTCACCAATATGCCTGACGAAGGCGTCATGGTCACCAAATTCTACT DQPVSLTNMPDEGVMVTKFYDQPVSLTNMPDEGVMVTKFY 550 4560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * ahol S nukleotid jelentése C vagy G és X aminosav jelentése R vagy P;550 4560 570 580 590 600 TCCAGGAGGACGAGTAGTACTGCCCAGGCCTGCTGTTCCATTCTTGCATGGCAAGGACTG F Q E D E * wherein S is C or G and X is R or P; (B) az (A) szekvenciában található kódolórégió vagy az (A) szekvencia IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részlete;(B) the coding region in sequence (A) or the coding region of IL-1 which inhibits IL-1; (C) az (A) szekvenciában található kódolórégiónak vagy IL-l-et gátló IL-li-t kódoló részletének degenerált szekvenciája;(C) a degenerate sequence of a coding region in the sequence of (A) or of an IL-1 inhibitor that inhibits IL-1; (D) az (A) szekvenciával legalább 70%-ban homo10 lóg szekvencia;(D) is at least 70% homologous to sequence (A); (E) az (A) szekvencia kódolórégiójának 99-554. pozíciói közötti szekvenciával legalább 70%-ban homológ szekvencia;(E) 99-554 of the coding region for sequence (A); at least 70% homologous to the sequence between its positions; (F) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy 15 IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló szekvencia:(F) a coding sequence for a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S S G R K G R K S S s s K K M M Q A Q A F F R R I I W W D V N D V N Q Q K K T T F Y F Y L L R N R N N Q N Q L L V V AGY BRAIN L L Q Q G G P P N V N V N N L L E E E E K 1 D K 1 D V V V V P P I E I E P P H A H A L F L F L L G G I H G I H G G G K K M M c c L S L S C C V V K K S S G D E G D E T T R R L L Q L Q L E E A V The V N 1 N 1 T T D D LSE LSE N N R R K K Q Q D K D K R R F F A THE F F 1 R S 1 R S D D S S G G P T P T T T S F S F E S E S A THE A THE C P G C P G W W F F L L c c T A T A M M E E A THE D D Q P V Q P V S S L L T T N M N M P P D E D E G V G V M M V V T K F T K F Y Y F F Q Q E E D E D E ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (G) az (F) aminosavszekvenciával legalább 70%-ban homológ aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and (X) is R or P; or (G) a coding sequence for an amino acid sequence that is at least 70% homologous to amino acid sequence (F). 30. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 80%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.30. The recombinant host cell of claim 29, wherein the DNA molecule comprises or encodes at least 80% of the homologous sequence as (D), (E) or (G). 31. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 90%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.31. A recombinant host cell according to claim 29, characterized in that it comprises at least 90% of a DNA molecule having the sequence homologous to (D), (E) or (G). 32. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy (D), (E) vagy (G) szekvenciaként legalább 95%-ban homológ szekvenciát tartalmazó vagy kódoló DNS-molekulát tartalmaz.32. A recombinant host cell according to claim 29, characterized in that it comprises a DNA molecule comprising at least 95% of the homologous sequence as (D), (E) or (G). 33. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:33. The recombinant host cell of claim 29, wherein the DNA molecule comprises a DNA molecule comprising any of the following sequences: (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:(a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S S G G R K RK S S s s K. K. M Q A F R M Q A F R I W I W D V N Q K. T D V N Q K. T F F Y Y L L R R N N N Q N Q L L V V A THE G Y G Y L L Q Q G G P N V N L P N V N L E E EE K I D V V P K I D V V P I I E E P P H H A THE L F L F L L G G I I H G H G G G K K M M C L S C V C L S C V K S K S G D E T R L G D E T R L Q Q L L E E A THE V V N I N I T T D D L L S E NEITHER N N R R K K Q D K R F Q D K R F A F The F I R S D S G I R S D S G P P T T T T S S F F E S E S A THE A THE C C P G P G W W F F L L C T A Μ E C T A Μ E A D In D Q P V S L T Q P V S L T N N M M P P D D E E G V G V M M V V T T K F K F Y Y F F Q Q EDE EDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekréciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagy (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 5%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and (X) is R or P; or (b) a sequence encoding up to 5% of an amino acid sequence other than amino acid sequence (a). 34. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi szekvenciák bármelyikét tartalmazó DNS-molekulát34. The recombinant host cell of claim 29, wherein the DNA molecule comprises any of the following sequences as a DNA molecule. 50 tartalmaz:50 contains: (a) az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak egy IL-l-et gátló fragmensét tartalmazó polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia:(a) a nucleotide sequence encoding a polypeptide comprising the following amino acid sequence or an IL-1 inhibitory fragment thereof: (U) (X) (U) (X) P P S G R S G R K S K S S K M S K M Q Q A F R A F R I W I W D V N D V N Q κ Q κ T T F Y F Y L L R N R N N Q N Q L L VÁG CUT Y L Y L Q G P Q G P N N V N L V N L E E EE K I D K I D V V V V P P I E I E P P H A H A L F L F L L G I H G I H G G G G K M C K M C L L S C V S C V K S K S G D E G D E T R T R L L Q L Q L E E A V The V N I N I T T D L S D L S E N E N R K Q R K Q D D K R F K R F A F The F I R S I R S D S D S G G P T P T T T S F S F HU 222 810 BlHU 222 810 Bl ESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDE GVMVTKFYFQEDE ahol (U) jelentése semmi, M vagy N-terminális szekré- 5 ciós szignált tartalmazó szekvencia, amely az IL-li-t processzált formában a sejten kívülre juttatja és (X) jelentése R vagy P; vagyGVMVTKFYFQEDE wherein (U) is any sequence containing an M or N-terminal secretory signal that delivers IL-li in processed form to the extracellular space and (X) is R or P; obsession MRPSGRKSSKMQAFR IW NQLVAGYLQGPNVNLEE LFLG 1HGGKMCLSCVKS NI TDLSENRKQDKRFAF ESAACPGWFLCTAMEAD GVMVTKFYFQEDE (b) az (a) aminosavszekvenciától legfeljebb 1%-ban különböző aminosavszekvenciát kódoló szekvencia.MRPSGRKSSKMQAFR IW NQLVAGYLQGPNVNLEE LFLG 1HGGKMCLSCVKS NI TDLSENRKQDKRFAF ESAACPGWFLCTAMEAD GVMVTKFYFQEDE (b) at most 1% of the amino acid sequence coding for amino acid sequence (a). 35. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciájú polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:35. The recombinant host cell of claim 29, wherein said DNA comprises a DNA molecule comprising a sequence encoding a polypeptide having the following amino acid sequence: DVNQKTFYLRNDVNQKTFYLRN KIDVVPIEPHAKIDVVPIEPHA GDETRLQLEAVGDETRLQLEAV IRSDSGPTTSFIRSDSGPTTSF QPVSLTNMPDEQPVSLTNMPDE 36. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként az alábbi aminosavszekvenciát vagy annak részletét tartalmazó 20 N-terminális szekréciós szignálpeptidet kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz:36. The recombinant host cell of claim 29, wherein said DNA comprises a DNA molecule encoding a sequence comprising the following amino acid sequence, or a portion thereof, encoding a 20 N-terminal secretory signal peptide: MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICMEICRGLRSHLITLLLFLFHSETIC 37. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy prokarióta sejt.37. The recombinant host cell of claim 29, wherein said recombinant host cell is a prokaryotic cell. 38. A 37. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy E. coli-sejt.38. The recombinant host cell of claim 37, wherein said recombinant host cell is an E. coli cell. 39. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy emlőssejt.39. The recombinant host cell of claim 29, wherein said recombinant host cell is a mammalian cell. 40. A 39. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy CHO-sejt.40. The recombinant host cell of claim 39, wherein said recombinant host cell is a CHO cell. 41. A 29. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy DNS-molekulaként a natív IL-li-inhibitor promoterétől eltérő promotert funkcio25 nálisan a kódolószekvenciához kapcsoltan tartalmazó DNS-molekulát tartalmaz.41. The recombinant host cell of claim 29, wherein said promoter is a DNA molecule operably linked to a coding sequence other than a native IL-1I inhibitor promoter.