HU221603B

HU221603B - CD4-csapdareceptorokat és rokonszerkezetű molekulákat hordozó sejtek és alkalmazásuk

Info

Publication number: HU221603B
Application number: HU9700303A
Authority: HU
Inventors: Babak Banapour; Waldemar Kolanus; Charles Romeo; Brian Seed
Original assignee: The General Hospital Corporation
Priority date: 1994-08-02
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 2002-11-28
Also published as: EP0781095A4; CN1142941C; JPH10503932A; FI119868B; CN1158552A; DE69529910T2; HUT77253A; PL181085B1; ES2191058T3; DK0781095T3; PT781095E; AU697489B2; WO1996003883A1; NO970440L; CA2195653C; EP0781095A1; NO970440D0; CZ26497A3; HK1002545A1; JP3832856B2

Abstract

A találmány tárgyát képezi a CD4 – HIV-fertőzött sejt specifikusfelismerésére képes, de HIV-fertőzést nem közvetítő – fragmensétmagában foglaló extracelluláris részt tartalmazó, a HIV-fertőzött sejtmegsemmisítésére indító szignált a terápiás sejteknek nem továbbító,membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszáló terápiássejtek alkalmazása emlős HIV-fertőzésének kezelésére alkalmasgyógyászati készítmény előállítására. A találmány szerinti megoldásalkalmas emlősökben HIV-fertőzött sejt elleni celluláris immunreakciószabályozására, s ezáltal a HIV-fertőzés kezelésére. ŕ

Description

A találmány tárgyát képezi a CD4 - HlV-fertőzött sejt specifikus felismerésére képes, de HIV-fertőzést nem közvetítő - fragmensét magában foglaló extracelluláris részt tartalmazó, a HIV-fertőzött sejt megsemmisítésére indító szignált a terápiás sejteknek nem továbbító, membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszáló terápiás sejtek alkalmazása emlős HIV-fertőzésének kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható emlősökben HIV-fertőzött sejt elleni celluláris immunreakció szabályozására, s ezáltal a HIV-fertőzés kezelésére.

A T-sejtek - a T-sejt-receptorok révén megvalósuló

- antigénfelismerése számos immunológiai jelenség alapját képezi. A T-sejtek a sejt közvetítette immunitást irányítják, melynek során az immunrendszer sejtjei lebontják az idegen szöveteket vagy a fertőzött sejteket. Különböző T-sejtek léteznek, köztük a „helper” és „szupresszor” sejtek, amelyek módosítják az immunreakciót, valamint a citotoxikus (vagy ,Jciller”) sejtek, amelyek közvetlenül elpusztítják az abnormális sejteket.

A sejtek felületén jelen lévő egyedi antigént felismerő és ahhoz kötődő T-sejt aktiválódik, majd sokszorozódhat, és - amennyiben citotoxikus sejtről van szó elpusztíthatja a megkötött sejtet.

A HÍV és az immunpatogenezis

1984-ben kimutatták, hogy a HIV-vírus az AIDS kórokozója. Azóta az AIDS meghatározását többször megváltoztatták, a tekintetben, hogy a diagnózisban milyen kritériumokat kell figyelembe venni. A diagnosztikai paraméterek változása ellenére az AIDS általános azonosító ismérve a HIV-fertőzés és azt követően a perzisztens szervi tünetek, valamint az AIDS-re jellemző betegségek (mint például a másodlagos fertőzések, daganatok, neurológiai betegségek) kialakulása [Hairison’s Principles of Internál Medicine, 12. kiadás, McGraw Hill (1991)].

A HÍV a lentivíruscsoportba tartozó emberi retrovírus. A négy ismert emberi retrovírus két csoportba tartozik; ezek az emberi T-limfotróp retrovímsok (HTLV1 és HTLV-2), illetve emberi immundeficienciavírusok (HIV-1 és HIV-2). Az előbbiek transzformáló vírusok, míg az utóbbiak citopátiás vírusok.

Az AIDS világszerte leggyakoribb kórokozójaként az HIV-l-et azonosították. A HIV-2 és a HIV-1 közötti szekvenciahomológia körülbelül 40%-os; a HIV-2 közelebbi rokonságban áll a majom-immundeficienciavirusokkal [SIV; lásd Curran és munkatársai: Science 329, 1357 (1985); Weiss és munkatársai: Natúré 324, 572(1986)].

A HÍV a szokásos retrovírusgéneken (env, gag és pol) hat másik gént is tartalmaz, melyek a vírus replikációjában és egyéb biológiai aktivitásaiban játszanak szerepet. Ahogy fentebb említettük, az AIDS általános ismérve az a nagymértékű immunszuppresszió, amely elsősorban a sejt közvetítette immunitást érinti. Az ilyen immunszuppresszió különféle opportunista betegségeket - elsősorban bizonyos fertőzéseket és daganatokat

- eredményez.

Az AIDS esetében az immundefektus fő okaként a thymuseredetű (T-) limfociták alcsoportját képező T4populáció mennyiségi és minőségi hiányosságát azonosították. Fenotípus szinten e sejtcsoportra a CD4 felületi molekula jelenléte jellemző. A CD4-ről kimutatták, hogy a HÍV celluláris receptora [Dalgleish és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984)]. Bár a T4-sejt a legfőbb HTV-vel fertőzött sejttípus, bármely - felületén CD4-molekulát expresszáló - emberi sejt képes a HIV-hez kötődni és HIV-vel fertőződni.

A CD4⁺-T-sejteknek hagyományosan, Jielper”/, Jnducer” szerepet tulajdonítanak [jelezve ezáltal a B-sejtek aktiváló szignáljának biztosításában, illetve a reciprok CD8-markert hordozó T-limfociták citotoxikus/szupresszor sejtekké alakulásának indukálásában betöltött szerepüket; Reinherz és Schlossman: Cell 19, 821 (1980); Goldstein és munkatársai: Immunoi. Rév. 68, 5 (1982)].

A HÍV - a virális burok- („envelope”) proteinben (gpl20) lévő aminosavláncon keresztül - specifikusan és nagy affinitással kötődik a CD4-molekula (N-terminálisához közeli) Vl-régiójának egy részletéhez. A kötődés után a vírus fuzionál a célsejt membránjával és intemalizálódik. Ezután a vírus reverz transzkriptáz* segítségével genomi RNS-ét DNS-sé hja át, amely' beépül a celluláris DNS-be, ahol a sejt további életében „provirus”-ként marad fenn.

A provírus látens állapotban maradhat vagy aktiválódhat, melynek során transzkripcióval mRNS éss genomi RNS jön létre, majd proteinszintézis, összerendeződés, új virion képződése, és a vírusok sejtfelületből történő kisaijadzása („budding”) következik. Bár »pontos mechanizmus, amellyel a vírus sejtpusztulást indu- h kál, nem ismert, úgy véljük, hogy a fő mechanizmus a sejtfelületből történő erőteljes vírussaijadzás, ami a plazmamembrán felszakadásához vezet, és ezáltal? ozmotikus nyomáskülönbséget eredményez.

A fertőzés folyamata során a gazdaszervezet antitesteket fejleszt a vírusproteinek (köztük a gpl20 és gp41 fő burokproteinek) ellen. E humorális immunitás ellenére a betegség előrehalad, ami letális immunszuppressziót eredményez, melynek jellemzői az összetett opportunista fertőzések, a parazitémia, dementia és végül az elhalálozás. Az a tény, hogy a gazda vírusellenes antitestei a betegség előrehaladását nem képesek megállítani, a fertőzés legnyugtalanítóbb és legveszélyesebb vonatkozásainak egyikét reprezentálja, és a hagyományos eljárásokkal végzett vakcinálások esetében mérsékelt eredményességre enged következtetni.

Az immundeficienciavírusok elleni humorális reakció hatékonyságában két tényező játszhat szerepet. Az első, hogy az immundeficienciavírusok (a többi RNSvirushoz, és főleg a retrovirusokhoz hasonlóan) a gazda inununműködésének hatására nagy mutációs gyakoriságot mutatnak. A második, hogy a burok-glikoproteinek nagymértékben glikozilált molekulák, amelyeken kevés olyan epitóp található, amely alkalmas a nagy affinitású antitestkötődésre. A kevéssé antigénhatású virális burok-gtikoproteinek a gazda számára kevés lehetőséget adnak a vírusfertőzés - specifikus antitestek termelése útján történő - leküzdésére.

HU 221 603 Bl

A HIV-vírussal fertőzött sejtek felületükön gpl20glikoproteint expresszálnak. A gpl20 - a vírus nem fertőzött sejtekbe történő behatolásához hasonló reakció révén - a CD4+-sejtek között fúziós eseményeket közvetít, ami rövid életű sokmagvú óriássejtek kialakulását 5 eredményezi. A szincítiumképződés a gpl20-glikoprotein és a CD4-protein közvetlen kölcsönhatásának függvénye [Dalgleish és munkatársai., lásd fentebb; Klatzman és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984); McDougal és munkatársai: Science 231, 382 (1986); 10 Sodroski és munkatársai: Natúré 322, 470 (1986); Lifson és munkatársai: Natúré 323, 725 (1986); Sodroski és munkatársai: Natúré 321,412 (1986)].

A gpl20 és a CD4 közötti specifikus komplex képződése egyik bizonyítékát szolgáltatja annak, hogy a 15 CD4-antigént hordozó sejtek vírusfertőzéséért a CD4gpl20 kötődés a felelős [McDougal és munkatársai, lásd fentebb]. Más kutatók kimutatták, hogy a HlV-fertőzésre nem fogékony sejtvonalak az emberi CD4cDNS-sel végzett transzfekció és a cDNS expresszál- 20 tatása után fertőzhetőkké váltak [Maddon és munkatársai: Cell 46, 333 (1986)].

Több kutatócsoport is kidolgozott olyan terápiás programokat, amelyek a vírusadszorpció és a szincítium közvetítette celluláris átvitel gátlására szolgáló passzív 25 ágensként szolubilis CD4 alkalmazásán alapulnak; in vitro sikeresen bizonyították e programok hatékonyságát [Deen és munkatársai: Natúré 331, 82 (1988); Fisher és munkatársai: Natúré 331, 76 (1988); Hussey és munkatársai: Natúré 331, 78 (1988); Smith és munkatársai: 30 Science 238, 1704 (1987); Traunecker és munkatársai: Natúré 331, 84 (1988)]. Később megnövelt felezési idejű és mérsékelt biológiai aktivitású CD4-immunglobulin fúziós proteineket fejlesztettek ki [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989); Traunecker és munkatársai: Na- 35 tűre 339, 68 (1989); Bym és munkatársai: Natúré 344,

667 (1990); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi.

9, 347 (1990). Bár a CD4-immunotoxin-konjugátumok vagy fúziós proteinek a fertőzött sejtekkel szemben hatásos in vitro citotoxicitást mutatnak [Chaudhary és mun- 40 katársai: Natúré 335, 369 (1988); Till és munkatársai: Science 242, 1166 (1988)], az immundeficienciaszindróma lappangó sajátossága valószínűtlenné teszi, hogy egyféle kezelés alkalmazásával végzett terápia hatásos legyen a vírusfertőzés leküzdésére, és az idegen fúziós pro- 45 teinek antigénsajátsága valószínűleg korlátozza e proteinek alkalmazhatóságát az ismételt adagolást igénylő kezelésekben. SIV-virussal fertőzött majmokkal végzett kísérletek eredményeként kimutatták, hogy az oldható CD4 - jelentős CD4-citopénia nélküli állatoknak bead- 50 va - képes a SIV-titer csökkentésére és a myeloid potenciál in vitro eljárással mérhető fokozására [Watanabe és munkatársai: Natúré 337, 267 (1989)]. A kezelés megszakítása után a vírusok azonnali megjelenése arra utal, hogy az immunrendszer előrehaladó legyengülésének 55 megakadályozására céljából egész életen keresztül történő adagolás szükséges.

T-sejt- és Fc-receptorok

A T-sejt-antigénreceptor (TCR) leggyakoribb alakjának sejtfelületi expressziójához legalább hat különbö- 60 ző polipeptidlánc együttes expressziójára van szükség [Weiss és munkatársai: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984); Orloffhashi és munkatársai: Natúré 316, 606 (1985); Berkhout és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 8528 (1988); Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)]; ezek az α,/β-antigénkötőláncok, a CD3-komplex három polipeptidje, valamint a ζ-lánc. Ha ezek bármelyike hiányzik, a komplex többi tagjának stabil expressziója nem biztosított. A teljes komplex felületi expressziója szempontjából a korlátozó polipeptid a ζ [Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)], és úgy vélik, hogy a ligandum receptorfelismerése által kiváltott celluláris aktiválóprogramok legalább egy részét közvetíti [Weissmann és munkatársai: EMBO J. 8,

3651 (1989); Frank és munkatársai: Science 249, 174 (1990)]. A 32 kD-os I. típusú membránjhomodimer (ζ) } tartalmaz egy 9 aminosavas extracelluláris domént, amely N-kötött glikán kapcsolódásához nem tartalmaz helyet, és tartalmaz egy - egér esetében 112 aminosavas, ember esetében 113 aminosavas - intracelluláris domént [Weissman és munkatársai: Science 238, 1018 (1988); Weissman és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 85, 9709 (1988)]. Az antigénreceptort expresszáló sejtekben jelen van a ζ egy izoalakja (η; Baniyash és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 9874 (1988); Orloff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264,

14812 (1989)], amely egy alternatív mRNS-„splicing” reakcióútból származik. Úgy tartják, hogy a ζ-η hetero- i dimerek inozitol-foszfátok képződését, valamint receptor által beindított programozott sejtpusztulást (más néven apoptózist) közvetítik [Mercep és munkatársai: Science 242, 571 (1988); Mercep és munkatársai: Science 246, 1162(1989)].

Az Fc-receptorral asszociált gamma-lánc - a ζ- és η-lánchoz hasonlóan - egyéb polipeptidekkel együtt sejtfelületi komplexekben expresszálódik, mely polipeptidek közül néhány a ligandumfelismerést közvetíti, míg a többi funkciója ismeretlen. A gamma-lánc homodimer szerkezete és szerveződése nagyon hasonló a ζláncéhoz, és egyaránt részét képezi a hizósejtek/bazofil sejtek felé nagy affinitást mutató IgE-receptomak (FceRI), amely legalább három különböző polipeptidláncból áll [Blank és munkatársai: Natúré 337, 187 (1989); Ra és munkatársai: Natúré 241, 752 (1989], valamint az IgG egyik kis affinitású receptorából, melyet egerekben az FcyRIIa [Ra és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 15323 (1989)], emberben pedig a makrofágok és a természetes „killer’-sejtek CD16-altípusú expressziós terméke, a CD16_ix (transzmembrán CD16) képvisel [Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989); Andersen és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 87, 2274 (1990)] és egy meghatározatlan funkciójú polipeptidből [Anderson és munkatársai,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 (1990)]. Az utóbbi időben beszámoltak arról, hogy a γ-láncot egy egérT-sejtvonal, a CTL expresszálja, amelyben homodimereket, valamint γ-ζ- és γ-η-heterodimereket képez [Orloff és munkatársai: Natúré 347, 189 (1990)].

Az Fc-receptorok az immunkomplexek fagocitózisát, transzcitózist, valamint antitestfüggő celluláris cito3

HU 221 603 Bl toxicitást közvetítenek [Ravetch és Kinet: Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991); Unkeless és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 6, 251 (1988); Mellman: Curr. Opin. Immunoi. 1, 16 (1988)]. Az utóbbi időben kimutatták, hogy az alacsony affinitású egér-Fc-receptor izoalakok egyike, az FcRylIIBl, az Ig-bevonatú „target”ek „clarthrin” bevonatú üregekbe történő intemalizációját közvetíti, míg egy másik alacsony affinitású receptor, az FcRyinA - a „trigger-molekulák” kis családjának egy vagy több tagjával asszociálódva - ADCC-t közvetít [Miettinen és munkatársai: Cell 58, 317 (1989); Hunziker és Mellman: J. Cell Bioi. 109, 3291 (1989)]. Ezek a „trigger-molekulák” [a T-sejt-receptor (TCR) ζ-lánca, a TCR η-lánca és az Fc-receptor y-lánca] az immunrendszer különböző receptorainak ligandumfelismerő doménjeivel lépnek kölcsönhatásba, és önállóan celluláriseffektor-programokat képesek beindítani, ideértve az aggregációt követő citolízist [Samelson és munkatársai: Cell 43,223 (1985)]; Weissman és munkatársai: Science 239, 1018 (1988); Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990); Blank és munkatársai: Natúré 337, 187 (1989); Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989); Kurosaki és Ravetsh: Natúré 342, 805 (1989); Hibbs és munkatársai: Science 246, 1608 (1989); Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 (1990); és Irving és Weiss: Cell 64, 891 (1991)].

Az alacsony affinitású egér- és emberi Fc-receptorcsaládok közötti párhuzamok felvázolása során azonban nyilvánvalóvá vált, hogy az emberi FcRylIA és FcRylIC izoalakoknak egerekben nincsenek megfelelőik, s részben emiatt funkciójuk meghatározásra szorul.

Mivel a csak CD4-en alapuló humorális ágensek in vivő alkalmazhatósága korlátozott, egy korábbi munkákban a HÍV elleni celluláris immunitás fokozásának lehetőségét vizsgálták. Olyan kiméraprotein-készítményeket azonosítottak, amelyekben a CD4 extracelluláris doménje T-sejt-receptor, IgG-Fc-receptor vagy Bsejt-receptor szignáltranszdukáló elemek transzmembrán és/vagy intracelluláris doménjeihez vannak fuzionálva [U. S. S. N. 07/847,566 és 07/665,961; melyeket teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni]. Az extracelluláris CD4-domént tartalmazó kimérákat expresszáló citolitikus T-sejtek a HlV-burokproteineket expresszáló célsejtek hatékony, MHC-fuggetlen elpusztítását eredményezik. E megközelítési mód rendkívül lényeges és új eleme az Fc-receptor (T-sejt-receptor) és a B-sejt-receptor-láncok azonosítása, melyek aggregációja elegendő a celluláris reakció beindításához. E megoldás egyik különösen hasznos megvalósítása a CD4 és a ζ-, η- és γ-lánc alkotta kimérák alkalmazása, melyek a citolitikus T-limfocitákat úgy irányítják, hogy felismeijék és elpusztítsák a HIV-gpl20-at expresszáló sejteket [U. S. S. N. 07/847,566 és 07/665,961; melyeket teljes teijedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni].

A találmány tárgyát képezi egy eljárás HIV-vírussal fertőzött sejt elleni celluláris immunreakció szabályozására emlősben. Az eljárás során az emlősnek terápiás sejtek hatásos mennyiségét adjuk be; a terápiás sejtek membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszálnak, amely receptor tartalmaz (i) egy extracelluláris részt, amely a HIV-vírussal fertőzött sejtek specifikus felismerésére és megkötésére képes, de HlV-fertőzést nem közvetítő CD4-fragmenst tartalmaz; és (ii) egy intracelluláris részt, amely képes a terápiás sejtet a receptor által megkötött, HIV-vírussal fertőzött sejt elpusztítására indukálni.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan sejt, amely olyan proteinszerű, membránkötött kimérareceptort expresszál, amely tartalmaz (i) egy extracelluláris részt, amely a HIV-vírussal fertőzött sejtek specifikus felismerésére és megkötésére képes, de HIV-fertőzést nem közvetítő CD4-fragmenst tartalmaz; és (ii) egy intracelluláris részt, amely képes a terápiás sejtet a receptor által megkötött, HIV-vírussal fertőzött sejt elpusztítására indukálni.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás HlVfertőzés kezelésére emlősben, melynek során az emlősnek terápiás sejtek hatásos mennyiségét adjuk be, mely terápiás sejtek membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszálnak, amely receptor olyan extracelluláris részt tartalmaz, amely a HIV-vírussal fertőzött sejtek specifikus felismerésére és megkötésére képes, de HIV-fertözést nem közvetítő CD4-fragmenst foglal magában.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszáló sejt,* amely receptor olyan extracelluláris részt tartalmaz; amely a HIV-vírussal fertőzött sejtek specifikus felismérésére és megkötésére képes, de HIV-fertőzést nem· közvetítő CD4-fragmenst foglal magában.

A találmány előnyös megvalósítási módjaiban a CD4-fragmens a CD4 1-394. aminosavaiból vagy a CD4 1-200. aminosavaiból álló aminosavszekvenciát tartalmazza; a CD4-fragmenst a 26. ábrán bemutatott CD7-transzmembrándomén vagy az emberi IgGlmolekula 25. ábrán bemutatott „hinge”-(csukló-), CH2és CH3-doménjei választják el az intracelluláris résztől; míg a CD4-fragmenst a terápiás sejttől legalább 48 angström, előnyösen legalább 72 angström távolság választja el. A találmány előnyös megvalósítási módja értelmében a találmány szerinti kimérareceptor intracelluláris része egy T-sejt-receptorprotein (például ζ), egy B-sejt-receptorprotein vagy egy Fc-receptorprotein szignáltranszdukciós része; és a terápiás sejtek a következők lehetnek: (a) T-limfociták; (b) citotoxikus T-limfociták; (c) természetes ,4riller”-sejtek; (d) neutrociták; (e) granulociták; (f) makrofágok; (g) hízósejtek; (h) HeLa-sejtek; vagy (i) embrionális stem-sejtek (ES).

A találmány tárgyát képezi továbbá egy találmány szerinti kimérareceptort kódoló DNS, valamint egy ilyen DNS-t tartalmazó vektor.

Bár a találmány speciális megvalósítási módját a CD4 és a ζ-lánc alkotta kiméra képezi, a találmány szerinti megoldás céljaira az e molekulákéval (például granulocitákban vagy B-limfocitákban) hasonló funkciójú receptorláncok bármelyike alkalmazható. Az immunsejteket beindító, előnyös molekula megkülöntöztető jegyei közé tartozik, hogy önállóan (azaz különálló lánc4

HU 221 603 Bl ként) képes expresszálódni; az extracelluláris CD4doménnel történő fúzió képessége (miáltal olyan kiméra keletkezik, amely egy terápiás sejt felületén helyezkedik el); valamint - célligandummal történő találkozást követő aggregáció hatására - celluláris effek- 5 torprogramok beindításának képessége.

Jelenleg a kimérák immunsejtekbe történő bejuttatásának legelőnyösebb eljárását a génterápia valamelyik formája jelenti. Ha azonban az immunrendszer sejtjeit kimérareceptorokkal úgy állítjuk helyre, hogy a sejte- 10 két megfelelően szolubilizált, tisztított kiméraproteinnel elegyítjük, olyan manipulált sejtpopulációt kapunk, amely képes a HIV-vírussal fertőzött célsejtekre reagálni. Hasonló megoldásokat alkalmaztak például a CD4-molekula - terápiás célból - eritrocitákba történő bevitelére is. Ebben az esetben a manipulált sejtpopuláció nem lehet képes önmegújulásra.

A találmány tárgyát képezik a CD4-fragmensek Tsejt-receptor-, B-sejt-receptor- és Fc-receptor-alegységekkel képzett fúnkcionális és egyszerűsített kimérái, 20 amelyek képesek az immunsejtek vezérlésére, aminek eredményeként azok felismerik és elpusztítják a HIVvirussal fertőzött sejteket A celluláris reakció emlősben történő irányításának eljárása során az emlősnek HIV-vírussal fertőzött sejt felismerésére és elpusztításé- 25 ra képes - terápiás sejtek (például citotoxikus T-limfociták) hatásos mennyiségét adjuk be.

Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan kimérareceptor-proteinek, amelyek a citotoxikus T-limfocitákat úgy irányítják, hogy azok felismerjék és elpusztít- 30 sák a HIV-vírussal fertőzött sejteket, a kimérareceptorokat kódoló DNS-t tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek; valamint a kimérareceptorok elleni antitestek.

A találmány fentiekben felsorolt és egyéb - nem 35 korlátozó jellegű - megvalósítási módjai a következő részletes leírás alapján szakember számára érthetőek lesznek.

A találmány szerinti megoldás részletes leírásában különböző, szakember számára ismert eljárásokra hivat- 40 kozunk. Az ilyen ismert eljárásokat leíró publikációkat teljes terjedelmükben a kitanítás részének kell tekinteni.

A rekombináns DNS-technológiát ismertető alapvető munkák közé tartoznak a következők: Watson és munkatársai: „Molecular Biology of the Gene”, 1. és 2. 45 kötet, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell és munkatársai: „Molecular Cell Biology” Sientifíc American Books, Inc.,

New York, NY (1986); Lewin: „Genes II”, John Wiley and Sons, New York, NY (1985); Old és munkatársai: 50 „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetíc Engineermg”, 2. kiadás, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har- 55 bor, NY (1989); Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, Wiley Press, New York,

NY (1989).

A „klónozás” kifejezésen egy adott gén vagy más DNS-szekvencia vektormolekulába történő inszertálásá- 60 ra in vitro rekombinációs technikák alkalmazását értjük.

A „cDNS” kifejezés egy RNS-függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) működése révén RNS-templátról előállított komplementer DNS-t vagy DNS-másolatot jelent.

A „cDNS-könyvtár” kifejezésen cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjteményét égtük, amely cDNS-inszertek mRNS-ről készült DNSkópiákat tartalmaznak, melyeket a sejt a cDNS-könyvtár előállítása során expresszál. Az ilyen cDNS-könyvtárak ismert eljárások alkalmazásával állíthatók élő [lásd például Maniatis és munkatársai; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology ’,

Wüey Press, New York, NY (1989)]. A cDNS-könyvtár előállítása során először RNS-t izolálunk egy olyan organizmus sejtjeiből, amelynek genomjából egy adott gént kívánunk klónozni. A találmány szerinti megoldás céljaira előnyösen emlős állatból, elsősorban emberből származó limfocita-sejtvonalakat alkalmazunk. cDNSkönyvtár előállítására vektorként a vacciniavirus WRtörzse alkalmazható előnyösen.

A „vektor” kifejezésen például plazmádból, bakteriofágból, emlős- vagy rovarvírusból származó DNS-molekulát értünk, amelybe DNS-fragmensek inszertálhatók. A vektorok egy vagy több egyedi restrikciós helyet 1 tartalmaznak, és meghatározott gazdában vagy hordozó- i organizmusban önálló replikációra lehetnek képesek^mi- ( által a klónozott szekvencia reprodukálható. Ilyenfor- í mán a „DNS-expressziós vektor” kifejezésen olyan ön- I álló elemet értünk, amely képes egy rekombináns peptid f szintézisének vezérlésére. Az ilyen DNS-expressziós t vektorok közé bakteriális plazmidok, fágok, emlős- és | rovarplazmidok, valamint vírusok tartoznak. i

A „lényegében tiszta” kifejezésen olyan vegyületet *· (például proteint, polipeptidet vagy antitestet) értünk, amely lényegében mentes azoktól a komponensektől, amelyekkel természetes állapotban együtt fordul elő.

Általában egy vegyületre akkor mondjuk, hogy lényegében tiszta, ha a mintában lévő összes anyag legalább 60%-át, előnyösebben legalább 75%-át, és legelőnyösebben legalább 90%-át a kérdéses vegyület teszi ki.

A tisztaság bármilyen alkalmas eljárással mérhető, például oszlopkromatográfiával, poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy nagyteljesítményű folyadékkromatográfíával (HPLC). A nukleinsavak esetében a „lényegében tiszta” kifejezés olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmenst vagy -fragmenst jelent, amely nem közvetlenül határos (vagyis nem kapcsolódik kovalensen) azokkal a kódolószekvenciákkal, amelyekkel természetes állapotban (vagyis azon organizmus genomjában, amelyből a találmány szerinti DNS származik) közvetlenül szomszédos (5’- és 3’-végen egyaránt).

Egy molekula (például a találmány szerinti cDNSszekvenciák bármelyike) „fragmense” kifejezésen a mo- » lekula - egymással szomszédos nukleotidokból álló alegységét értjük. Egy molekula „analógja” olyan - térmészetes állapotban nem található - molekula, amely

HU 221 603 BI lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak egy fragmenséhez. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha a két molekula aminosavszekvenciája lényegében azonos. Közelebbről, egy „lényegében hasonló” aminosav- 5 szekvencia olyan szekvencia, amely legalább 50%-ban, előnyösen 85%-ban, legelőnyösebben 95%-ban azonos a természetes vagy vonatkoztatási aminosavszekvenciával és/vagy amely a természetes vagy vonatkoztatási aminosavszekvenciától csak konzervatív aminosav- 10 szubsztitúciókban tér el. A lényegében hasonló aminosavszekvenciákat tartalmazó molekulák hasonló biológiai aktivitásúak. Ahogy a leírásban használjuk, egy molekuláról akkor mondjuk, hogy egy másik molekula „kémiai származéka”, ha olyan molekularészeket tártál- 15 máz, amelyek normális esetben nem képezik a molekula részét. Az ilyen molekularészek növelhetik a molekula oldhatóságát, abszorpcióját, biológiai felezési idejét stb., illetve csökkenthetik a molekula toxieitását, megszüntethetik vagy mérsékelhetik a molekula nemkivána- 20 tos mellékhatásait stb. Az ilyen hatásokat eredményező molekularészek leírását lásd például „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

A találmány szerinti kimérareceptor-gén „funkció- 25 nális származéka” kifejezésen a gén olyan „fragmenseit” vagy „analógjait” értjük, amelyek nukleotidszekvenciájukat tekintve lényegében hasonlóak. A „lényegében hasonló” nukleinsavak lényegében hasonló aminosavszekvenciákat (meghatározásukat lásd fentebb) kó- 30 dóinak, s az ilyen nukleinsavak közé tartoznak azok a nukleinsavszekvenciák is, amelyek megfelelő hibridizációs feltételek mellett képesek a természetes vagy vonatkoztatási nukleinsavszekvenciával hibridizálódni [a megfelelő hibridizációs feltételeket illetően lásd pél- 35 dául Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, Wiley Press, New York, NY (1989)].

A „lényegében hasonló” kimérareceptor hasonló aktivitású, mint a „vad típusú” Τ-sejt-, B-sejt- vagy Fc-re- 40 ceptor-kiméra. A származék előnyösebben a vad típusú kimérareceptor aktivitásának 90%-át, még előnyösebben 70%-át, legelőnyösebben 40%-át fejti ki. A funkcionális kimérareceptor-származék aktivitása abban nyilvánul meg, hogy - extracelluláris CD4-részletével - spéci- 45 fikusan kötődik a HIV-vírussal fertőzött sejtekhez, és elpusztítja az ilyen sejteket. Ezen túlmenően, a kimérareceptor a receptort hordozó sejtet nem teszi érzékennyé a HlV-fertőzésre. A kimérareceptor aktivitása a leírásban ismertetett eljárások bármelyikével tesztelhető. 50

A találmány szerinti CD4-kimérareceptort kódoló DNS-szekvencia vagy funkcionális származékai - hagyományos eljárások alkalmazásával (a ligáláshoz szükséges tompa vagy ragadós végek kialakításával, restrikciós enzimes emésztéssel, a nemkívánatos összekapcso- 55 lódások elkerülése érdekében a ragadós végek alkalikus foszfatázos kezeléssel végzett feltöltésével és megfelelő ligázokkal végzett ligálással) - vektorDNS-sel rekombinálhatók. Az ilyen manipulációs technikák jól ismertek [lásd például Maniatis és munkatár- 60 sai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].

Egy nukleinsavmolekuláról (például DNS-ről) akkor mondjuk, hogy egy polipeptid „expresszálására képes”, ha a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákhoz .működőképesen kapcsolva” olyan nukleotidszekvenciákat tartalmaz, amelyek transzkripciós és transzlációs szabályozó információkat hordoznak. A .működőképes kapcsolódás” kifejezésen a szabályozó DNS-szekvenciák és az expresszálni kívánt DNS-szekvencia olyan kapcsolatát égtük, amely lehetővé teszi a génexpressziót. Az egyes organizmusokban a génexpresszióhoz szükséges szabályozórégiók pontos természete más és más lehet, azonban általános szabály, hogy tartalmazniuk kell egy olyan promoterrégióL amely - prokariótákban - magát a promotert (amely az RNS-transzkripció beindítását vezérli), valamint olyan DNS-szekvenciákat tartalmaz, amelyek RNS-sé átíródva jelzik a proteinszintézis kezdetét.

Az ilyen régiók normális esetben magukban foglalják azokat az 5’-oldali nemkódoló szekvenciákat, amelyek a transzkripció és a transzláció beindításában játszanak szerepet; ezek közé tartozik a „TATA-box”, a „capping”szekvencia, a CAAT-szekvencia és hasonlók.

Kívánt esetben a fentebb leírt eljárásokkal a proteint kódoló géntől 3 ’-irányban lévő nemkódoló régiót kaphatunk, amely fenntartható transzkripciós terminációs szekvenciái számára. Ennek megfelelően a proteint kó- j.

doló DNS-szekvenciával természetes állapotban közvet·⁵ 1 lenül szomszédos 3’-régió fenntartásával biztosíthatók » a transzkripciós terminációs szignálok Amennyibena: | transzkripciós terminációs szignálok működése a gazda- } sejtben nem kielégítő, olyan 3’-régió alkalmazható, i amely a gazdasejtben működőképes. t

Két DNS-szekvenciáról (például egy promoterré- | gióról és egy CD4-kimérareceptort kódoló szekvenciá- r ról) akkor mondjuk hogy működőképesen kapcsolód- r nak, ha a két DNS-szekvencia közötti kötés (1) nem eredményez kereteltolódási („frame-shift”) mutációt;

(2) nem gátolja a promoterrégió kimérareceptor-gén transzkripcióját irányító képességét; vagy (3) nem gátolja a kimérareceptor-gén azon képességét, hogy a promoterrégió irányítása alatt transzkriptálódjon. Egy promoterrégió akkor kapcsolódik működőképesen egy DNSszekvenciához, ha a promoter képes a DNS-szekvencia transzkripciójának beindítására. Ennek megfelelően a protein expresszálása érdekében olyan transzkripciós és transzlációs szignálokra van szükség, amelyeket egy megfelelő gazdasejt felismer.

A találmány szerinti megoldás értelmében a CD4kimérareceptor-proteint (vagy funkcionális származékát) prokarióta vagy eukarióta sejtekben expresszáltatjuk, bár előnyösebb az eukarióta sejtekben (és főleg az emberi limfocitákban) végzett expresszió.

A találmány szerinti antitestek számos eljárással előállíthatok. Például, a kimérát megkötni képes poliklonális antitesteket tartalmazó szérum termelődésének indu- t kálása céljából egy állatnak olyan sejteket adunk be, amelyek a CD4-receptor-kiméraproteint (vagy funkció- r nális származékát) expresszálják.

HU 221 603 Bl

Az egyik előnyös eljárással a találmány szerinti antitestekként monoklonális antitesteket állítunk elő. Az ilyen monoklonális antitestek hibridómatechnika [Kohler és munkatársai: Natúré 256, 495 (1975); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976); Kohler és mun- 5 katársai: Eur. J. Immunoi. 6, 292 (1976); Hammerling és munkatársai: „Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas”, Elsevier, NY, 563. olásd (1981)] alkalmazásával állíthatók elő. Általában az ilyen eljárásokban egy állatot a CD4-kimérareceptor-antigénnel immunizá- 10 lünk, az állatok lépsejtjeit kivonjuk, és alkalmas myeloma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. A találmány szerinti megoldás értelmében bármilyen alkalmas myeloma-sejtvonal alkalmazható. A fúzió után a kapott hibridómasejteket szelektív körülmények mellett HAT-tápkö- 15 zegben tartjuk, majd Wands és munkatársai leírása szerint [Gastroenterology 80,225 (1981)] határhigításos eljárással klónozzuk. Az ilyen szelektálással kapott hibridómasejteket a kimérához kötődni képes antitesteket szekretáló kiónok azonosítása céljából teszteljük. 20

A találmány szerinti antitestek lehetnek poliklonális vagy - előnyösen - régióspecifikus poliklonális antitestek is.

A találmány szerinti CD4-kimérareceptor elleni antitestek felhasználhatók a páciensben lévő kimérarecep- 25 tor (vagy kimérareceptort hordozó sejtek) mennyiségének ellenőrzésére. Az ilyen antitestek előnyösen alkalmazhatók a standard immundiagnosztikai vizsgálatokban, mint például az immunometriás vagy „szendvics” típusú vizsgálati eljárásokban (hagyományos szendvics 30 vizsgálati eljárás, fordított szendvics vizsgálati eljárás és szimultán szendvics vizsgálati eljárás). Az elfogadható specifitású, érzékenységű és pontosságú immunvizsgálatok megvalósítása érdekében az antitestek mennyisége és kombinációi elvárható mennyiségű kísérleti 35 munkával meghatározhatók.

Az immunológia alapelveit ismertető források közé tartoznak a következők: Roitt: „Essential Immunology”,

6. kiadás, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1988); Kimball: „Introduction to Immunology”, 2. ki- 40 adás, Macmillan Publishing Co., New York (1986); Roitt és munkatársai: „Immunology”, Gower Medical Publishing Ltd., London (1985); Campbell: ,Monoclonal Antibody Technology” in: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology” (szerk.: Burdon 45 és munkatársai), 13. kötet, Elsevier, Amsterdam (1984); Klein: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination”, John Wiley and Sons, New York (1982); és Kennett fe munkatársai (szeik.):,Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biolo- 50 gical Analyses”, Plenum Press, New Yoik (1980).

A „detektálás” vagy „kimutatás” kifejezésen egy anyag jelenlétének vagy hiányának, illetve mennyiségének meghatározását értjük. Ennek megfelelően ez a kifejezés egyaránt vonatkozik a találmány szerinti anya- 55 gok, készítmények és eljárások minőségi fe mennyiségi meghatározásokra történő alkalmazására.

A találmány szerinti antitestek és a találmány szerinti, lényegében tisztított antigén ideálisan alkalmazhatók reagenskészlet előállítására. Az ilyen reagenskész- 60 let tartalmaz egy rekeszekre osztott hordozóeszközt, amelyben egymáshoz közel egy vagy több edény, például fiolák, kémcsövek vagy hasonlók helyezkednek el, melyek a vizsgálat végrehajtásához szükséges elemeket elkülönítve tartalmazzák.

A reagenskészlet alkalmazásával számos vizsgálati típus elvégezhető, többek között kompetitív és nem kompetitív vizsgálatok. A találmány szerinti antitestek alkalmazásával végrehajtható vizsgálatok jellemző példái közé tartoznak a radioimmunvizsgálatok (RIA), az enzim-immunvizsgálatok (EIA), az enzimkötött immunadszorbens-vizsgálatok (ELISA), valamint az immunometriás (vagy szendvics) vizsgálatok.

Az „immunometriás” vagy „szendvics típusú” vizsgálati eljárás kifejezéseken a szimultán szendvics típusú, a hagyományos szendvics típusú és a fordított szendvics típusú immunvizsgálati eljárásokat értjük. E kifejezések jelentése szakember számára kézenfekvő. A találmány szerinti antitestek egyéb, jelenleg ismert vagy a jövőben kifejlesztésre kerülő vizsgálati eljárásokban is alkalmazhatók; ezek a megoldások szintén az igényelt oltalmi körbe tartoznak.

A „specifikusan felismeri és megköti” kifejezésen azt értjük, hogy az antitest felismeri fe megköti a kimérareceptor-polipeptidet, azonban egy mintában (például biológiai mintában) lévő egyéb, nem rokon molekulákat nem ismer fel és ezeket nem köti meg.

A „terápiás sejt” kifejezésen olyan sejtet értünk, amely a találmány szerinti CD4-kimérareceptort kódolók génnel van transzformálva, s ezáltal képes felismerni és elpusztítani a HIV-vírussal fertőzött sejteket; az ilyen tó* rápiás sejtek előnyösen a vérképző rendszer sejtjei.

Az „extracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a sejt felületén helyezkedik el. Az „intracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájával érintkezik. A „transzmembrán” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része átíveli a plazmamembránt. Ahogy a leírásban használjuk, az „extracelluláris rész”,„intracelluláris rész”, illetve „transzmembrán rész” olyan, egymással érintkező aminosavszekvenciákat jelent, amelyek egymással szomszédos sejtkompartmentekbe nyúlnak át.

Az „oligomerizálás” kifejezésen egy molekula más proteinekkel alkotott dimeijeinek, trimeijeinek, tetrameijeinek vagy magasabb rendű oligomerjeinek kialakítását értjük. Az ilyen oligomerek homooligomerek vagy heterooligomerek egyaránt lehetnek. Az „oligomerizáló rész” a molekula azon régiója, amely a komplex- (azaz oligomer-) képződést irányítja.

A „citolitikus” kifejezésen egy sejt (például HIVvírussal fertőzött sejt) vagy egy fertőző anyag (például HIV-vírus) elpusztításának képességét értjük.

Az „immundeficienciavirus” olyan retrovírus, amely vad típusú alakjában képes egy főemlős gazda T4-sejtjeinek megfertőzésére, fe a lentivírus alcsalád morfogenezises és morfológiai tulajdonságait mutatja. »_::

Ez a kifejezés magában foglalja a HÍV és SIV összes változatát (HIV-1, HIV-2, SlVmac, SIVagm, SlVmnd, ~

SlVsmm, SlVman, SlVmand és SIVcpz).

HU 221 603 Bl

Az „MHC-fuggetlen” kifejezésen azt értjük, hogy a celluláris citolitikus reakcióhoz a célsejt felületén nincs szükség MHC I. osztályú antigén jelenlétére.

A „funkcionális citolitikus szignáltranszdukáló származék” kifejezésen olyan (fentebb meghatározott) fűnk- 5 cionális származékot értünk, amely a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 40%-át, előnyösebben 70%-át, legelőnyösebben legalább 90%-át képes kifejteni. Ahogy a leírásban használjuk, a „funkcionális citolitikus szignáltranszdukáló származék” mű- 10 ködhet közvetlenül, a terápiás sejtet receptorkötött anyag vagy sejt elpusztítására indukálva (például intracelluláris kimérareceptor-rész esetében), illetve működhet közvetett módon, a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukáló proteinjei oligomerizációjának elősegi- 15 tésével (például transzmembrándomén esetében). Az ilyen származékok hatékonysága, például, az itt leírt in vitro vizsgálat alkalmazásával tesztelhető.

A „funkcionális HIV-envelope-kötő származék” kifejezésen olyan (fentebb meghatározott) funkcionális 20 származékot értünk, amely képes bármilyen HlV-burokprotein megkötésére. Az ilyen funkcionális származékok például az itt leírt in vitro vizsgálat alkalmazásával azonosíthatók.

Terápiás alkalmazás 25

A találmány szerinti transzformált sejteket immundeficienciavírus-fertőzés kezelésére alkalmazzuk. Az ilyen transzformált sejtek beadásának jelenlegi eljárásai közé tartozik az adoptív immunterápia és a sejtbeviteli terápia. Ezek az eljárások lehetővé teszik a transz- 30 formált immunrendszeri sejtek vérkeringésbe történő visszajuttatását [Rosenberg: Sci. Am. 62, (1990); Rosenberg és munkatársai: N. Engl. J. Med. 323, 570 (1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bár- 35 milyen állatnak beadhatók, amelyben várható a találmány szerinti vegyületek jótékony hatása. A találmány szerinti gyógyászati készítményeket elsősorban embereknek adjuk be, bár a találmány szerinti megoldást nem kívánjuk csupán ezen alkalmazási területre korlá- 40 tozni.

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az la. ábrán a CD4 (1-369. aminosavak) és különböző receptorláncok (38-41. azonosító számú szekvenciák) közötti fúzió helyén lévő aminosavszekvenciákat 45 mutatjuk be. Az aláhúzott szekvenciák a fúziós konstrukcióhoz alkalmazott BamHI-helyen belüli nukleotidszekvencia által kódolt aminosavakat jelölik. A transzmembrándomén kezdetét függőleges vonallal jelöljük.

A η-szekvencia N-terminálisa azonos a ζ-szekvenciá- 50 val, C-terminálisa azonban eltér attól [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)]. Az lb. ábrán a CD4, ϋϋ4:ζ, CD4:y és CD4:q CV1sejtekben mutatott felületi expressziójának áramlási citometriás vizsgálatának eredményét mutatjuk be. A sej- 55 teket CD4-kimérákat vagy CDlőppt expresszáló vírussal fertőztük, és fikoeritrinnel konjugált Leu3A antiCD4 monoklonális antitesttel festettük.

A 2. ábrán a CDI 6™ expresszióját mutatjuk be.

A sűrűn pontozott vonal a csak transzmembrán-CD16- 60 ot (CDIÓjm) expresszáló vírussal végzett fertőzés utáni expressziót, a szaggatott vonal a CD4:y-t expresszáló vírussal, a folytonos vonal pedig a CD4^-t expresszáló vírussal együttesen fertőzött sejtekben megfigyelt expressziót ábrázolja. A ritkán pontozott vond a csak CD4^-val fertőzött, 3G8 anti-CD16 monoklonális antitesttel [Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 79, 3275 (1982)] festett sejtekben megfigyelt expressziót mutatja.

A 3. ábrán a CDIŐjm - CDlójM-et, illetve a következő ζ-kimérákat expresszáló vírusokkal együttesen fertőzött sejtekben megfigyelt - felületi expresszióját mutatjuk be: Ο34:ζ (vastag folytonos vonal), Ο)4:ζ C11G (folytonos vonal); ϋ)4:ζ (szaggatott vonal);

Ο34:ζ C11G/D15G (sűrűn pontozott vonal). A ritkán pontozott vonal a csak CDlójM-et expresszáló vírussal fertőzött sejtekben megfigyelt felületi expressziót mutatja. A sejteket 3G8 anti-CD16 monoklonális antitesttel és egér-IgG elleni fikoeritrinnel konjugált Fab’₂ kecskeantitestekkel inkubáltuk. A ζ-kimérák expressziójának nagysága a vizsgált mutánsokban lényegében azonos volt, és a CDlöpM-et, illetve a ζ-kimérákat expresszáló vírusokkal végzett együttes fertőzés nem változtatta meg észrevehetően a kimérák felületi expresszióját.

A 4a-4d. ábrákon azt mutatjuk be, hogy egy TRsejtvonalban a mutáns ζ-kimérák keresztkötődése után? növekszik az intracelluláris szabad kalciumionok szint* l je. „Jurkat E6” sejteket [Weiss és munkatársai: J. lm* imunol. 133, 123 (1984)] rekombináns vacciniavírusok- < { kai fertőztünk és áramlási citometriával vizsgáltunk;. |

A bemutatott eredmények a kapuzott („gated”) CD4* j populációra vonatkoznak, igy csak a releváns kiméraproteint expresszáló sejteket vizsgáltuk. Az ibolya flua- | reszcencia kék színű Indo-1 fluoreszcenciához viszonyi- f tott átlagos aránya a populációban lévő intracelluláris f szabad kalciumkoncentrációt tükrözi, a reagáló sejtek ’ százalékos aránya pedig az előre meghatározott küszöbarányt (melyet úgy választottunk meg, hogy a nem kezelt sejtek 10%-a legyen pozitív) meghaladó sejtek arányát mutatja. A 4a. és 4b. ábrán a CD4^-t (folytonos vonal), illetve a CD16^-t (szaggatott vonal) expresszáló fikoeritrinnel konjugált Leu3a anti-CD4 monoklonális antitesttel inkubált, majd egér-IgG elleni kecskeantitesttel keresztkötött - ,Jurkat”-sejtek eredményei láthatók. A pontozott vonal a nem fertőzött sejtek 0KT3 anti-CD3 monoklonális antitestre adott reakcióját mutatja. A 4c. és 4d. ábrán a 034:ζ0150-1 (folytonos vonal), CD4^CllG/D15G-t (szaggatott vonal), illetve CD4: ζCl lG-t expresszáló, Jurkat”-sejtek eredményei láthatók (melyeket a 4a. és 4b. ábrával kapcsolatban leírtak szerint kezeltünk és vizsgáltunk).

Az 5a-5c. ábrákon azt mutatjuk be, hogy a CD4: ζ-,

CD4:y- és CD4:η-receptorok lehetővé teszik, hogy a citolitikus T-limfociták (CTL) elpusztítsák a HIV-1gpl20/41-proteint expresszáló célsejteket. Az 5a. ábrán a sötét körök a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”- t sejtekkel inkubált - Ο>4:ζ-ί expresszáló - citolitikus T-limfociták eredményeit; a világos körök a nem fertő- zött „HeLa”-sejtekkel inkubált - CD4^-t expresszáló

HU 221 603 Bl

- citolitikus T-limfociták eredményeit; a sötét négyzetek a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-sejtekkel inkubált, nem fertőzött citolitikus T-limfociták eredményeit; a világos négyzetek pedig a nem fertőzött „HeLa”-sejtekkel inkubált, nem fertőzött citolitikus T-limfociták 5 eredményeit mutatják. Az 5b. ábrán a sötét körök a gpl20/41-et expresszáló ,JHeLa”-sejtekkel inkubált CD4: η-t expresszáló - citolitikus T-limfociták eredményeit; a világos körök a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-sejtekkel inkubált - CD4:y-t expresszáló - 10 citolitikus T-limfociták eredményeit; a négyzetek pedig a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-sejtekkel inkubált Cl 1G/D15G kettős mutáns CD4: ζ-kimérát expresszáló citolitikus T-limfociták eredményeit; a világos négyzetek pedig a nem fertőzött „HeLa”-sejtekkel inkubált, 15 nem fertőzött citolitikus T-limfociták eredményeit mutatják. Az 5c. ábrán az 5b. ábrán bemutatott kísérletben alkalmazott citolitikus T-limfociták CD4-expressziójának áramlási citometriás vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. A célsejt: effektor arány korrigálása céljából a 20 CD4-kimérát expresszáló sejtek százalékos arányát úgy határoztuk meg, hogy a meghatározott nagyságú negatív (nem fertőzött) populációt - hisztogramráhelyezés alapján - levontuk. Az 5c. ábrán a nem fertőzött sejtek számára - összehasonlítási célból - önkényes küszöb- 25 értéket határoztunk meg, ami az egyéb sejtpopulációkra durván ugyanazt a pozitív frakciót adja, mint a hisztogramos kivonás.

A 6a. és 6b. ábrán a CD4 által irányított citolízis specifitását mutatjuk be. A 6a. ábrán a sötét körök a 30 CD16_PI-t expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4: ζ-t expresszáló CTL-ek eredményeit; a világos körök a gpl20-at expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4-et expresszáló CTL-ek eredményeit; a sötét négyzetek a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, 35 CD16^-t expresszáló CTL-ek eredményeit; a világos négyzetek pedig a gpl20p_rt expresszáló CTL-ek eredményeit mutatják A 6b. ábrán a sötét körök az MHC11+ osztályú Raji-sejtekkel inkubált, Ο34:ζ-ί expresszáló CTL-ek eredményeit; a világos körök az RJ2.25-sej- 40 tekkel (MHC Π- osztályú Raji-mutáns sejtek) inkubált, nem fertőzött CTL-ek eredményeit; a sötét négyzetek az MHC II⁺ osztályú Raji-sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek eredményeit, a világos négyzetek pedig az RJ2.25-sejtekkel (MHC Π osztályú Raji-mutáns sej- 45 tek) inkubált, CD4: ζ-t expresszáló CTL-ek eredményeit mutatják. Az ordináta skáláját negatív irányba kiterjesztettük.

A 7a. és 7b. ábrán a CDI 6: ζ-kimérareceptor karakterizálását mutatjuk be. A 7a. ábrán a CD16: ζ fúziós pro- 50 tein sematikus vázlata látható. A monomer CDI 6 foszfatidilinozitolhoz kötött alakjának extracelluláris részét dimer ζ-lánchoz kapcsoltuk (közvetlenül a transzmembrándoménen kívül). Az ábra alján a kapcsoló helyének aminosavszekvenciáját mutatjuk be (42. és 43. azonosí- 55 tó számú szekvencia). A 7b. ábrán a CD16: ζ-kiméra keresztkötődését követő kalciummobilizáció - TCRpozitív vagy TCR-negatív sejtvonalban - áramlási citometriával végzett vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. Az ábrán az antitestekkel 0. másodpercben kezelt 60 sejtpopulációkban az ibolya fluoreszcencia kékfluoreszcenciához viszonyított aránya (ami a relatív kalciumionkoncentráció mérőszáma) látható. A sötét négyzetek a Jurkat-sejtek OKT3 anti-CD3 monoklonális antitestre adott reakcióját; a sötét háromszögek a CD16^ REX33A TCR- mutánst keresztkötö - 3G8 antiCD16 monoklonális antitestre adott reakcióját; a világos négyzetek a JRT3.T3.5 Jurkat TCR- mutáns sejtvonalban a keresztkötést képző CD16: ζ-ra adott reakciót; a világos háromszögek Jurkat-sejtekben a keresztkötést képző CD16^-ra adott reakciót; a „+” jelek Jurkat-sejtekben a nem kiméra CD16-ra mutatott reakciót; a pontok pedig a nem kiméra CD16-ra a TCR- REX33Asejtvonalban mutatott reakciót mutatják.

A 8a. és 8b. ábrán a citolitikus potenciál deléciós vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. A 8a. ábrán a ζ deléciós végpontjainak elhelyezkedése látható. Az ábrán a ζ mutációit - az általánosan alkalmazott jelölésnek megfelelően - az eredeti aminosav/elhelyezkedés/mutáns aminosav rövidítéssel jelöljük, igy például a ,JD66*” a 66. aszparaginsav tenninációs kodonnal történő helyettesítését jelöli. A 8b. ábrán a deléciót nem tartalmazó CD16^ és a feltűnő ζ-deléciókat tartalmazó CD16 ^-kimérák citolízisvizsgálatban kapott eredményeit mutatjuk be. A CD16 elleni felületi antitestet exp? resszáló hibridómasejteket ⁵¹Cr-izotóppal jelöltük, és növekvő számú - CD16^-kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavirussal fertőzött - emberi citolitikus T-limfocitával inkubáltuk. A felszabadult ⁵¹Crizotóp százalékos arányát az effektor (CTL) célsejtek·* hez (hibridómasejtekhez) viszonyított aránya függvén nyében ábrázoltuk. A sötét körök a CD16^-et exp* resszáló sejtek által közvetített citolízist (mfi=18,7); a sötét négyzetek a €Ο16:ζΑ8ρ66*-1ώηέΓήΐ expresszáló · sejtek által közvetített citolízist (mfi=940,2); a világos négyzetek a CD16: ζΟ1υ60*-1αιηέΓέί expresszáló sejtek által közvetített citolízist (mfi=16,0); a világos körök a CD16: ζΤ)τ51 *-kimérát expresszáló sejtek által közvetített citolízist (mfi=17,4); a sötét háromszögek a CD16^he34*-kimérát expresszáló sejtek által közvetített citolízist (mfi=17,8); a világos háromszögek pedig a nem kiméra CD16-ot expresszáló sejtek által közvetített citolízist (mfi=591) mutatják. Bár ebben a kísérletben a CD16:ζAsp66* expressziója nem volt hozzáigazítva a többi fúziós protein expressziójához, az ugyanezen kísérletben azonos szinten CD16^-t expresszáló sejtek általi citolízis lényegében azonos eredményeket adott, mint a CD16^Asp66-kimérát expresszáló sejtek esetében.

A 9a-9d. ábrákon azt mutatjuk be, hogy a transzmembrán kölcsönhatások lehetőségének megszüntetése egy rövid ζ-szegmenst eredményez, amely képes a citolízis közvetítésére. A 9a. ábrán két- és háromrészes monomer kimérák sematikus rajzai láthatók. Az ábra tetején a 65. aminosavnál hasított CD16 ^-konstrukció látható, amelyből hiányzik a transzmembrán cisztein és aszparaginsav. Lentebb a CD16:CD5^- és a CD16: CD7: ζ-konstrukció, valamint a megfelelő kontrollok láthatók. Az intracelluláris domének aminosavszekvenciái az ábra alján láthatók (45., 46. és 47. azo9

HU 221 603 Bl nősítő számú szekvenciák). A 9b. ábrán a monomer kimérák deléciós mutánsainak citolitikus aktivitását mutatjuk be. Az ábrán a CD16^-t expresszáló sejtek citolitikus aktivitását (sötét körök; mfi=495) a CD16^Asp66*-konstrukciót expresszáló sejtek 5 citolitikus aktivitásával (sötét négyzetek; mfi=527);, illetve a mutáns CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*konstrukciót (üres négyzetek; mfi=338) és a mutáns CD16: ζϋνβΐ lGly/Aspl5Gly/Glu60*-konstrukciót expresszáló sejtek citolitikus aktivitásával (sötét három- 10 szögek; mfi=295) hasonlítjuk össze. A 9c. ábrán a három részből álló fúziós proteinek által közvetített citolitikus aktivitást mutatjuk be. A sötét háromszögek a ϋΟ16:ζΑ8ρ66*-1άιηέΓέΐ expresszáló sejtek; a világos négyzetek a CD16:5: ζ(48-65)-&)η8ίηύα:ίόί exp- 15 resszáló sejtek; a sötét négyzetek a ϋϋ16:7:ζ(48-65)-konstrukciót expresszáló sejtek; az üres háromszögek a CD16:7:4(48-59)-konstrukciót expresszáló sejtek; az üres körök a CD16:5-konstrukciót expresszáló sejtek; a sötét körök pedig a CD16:7- 20 konstrukciót expresszáló sejtek citolitikus aktivitását mutatják. A 9d. ábrán a mutáns és háromrészes kimérák által mutáns TCR~ Jurkat JRT3.T3.5-sejtvonalban kiváltott kalciummobilizációt mutatjuk be. A világos körök a dimer a εθ16:ζΑ8ρ66*Αοη8ΐη±οϊόΐ exp- 25 resszáló sejtek reakcióját; a sötét négyzetek a CD16: ζCysl lGly/Aspl 5/Gly/Asp66*-konstrukciót expresszáló sejtek reakcióját; a világos négyzetek a CD16: ζϋνβΐ lGly/Aspl5/Gly/Glu60*-konstrukciót expresszáló sejtek reakcióját; a sötét háromszögek a 30 CD16:7^(48-65)-konstrukciót expresszáló sejtek reakcióját; a világos háromszögek pedig a CD16^(48-59)-konstrukciót expresszáló sejtek reakcióit mutatják.

A lOa-lOf. ábrákon a 18 aminosavas szignál- 35 transzdukáló motívum egyes aminosavainak aktivitásban betöltött szerepét mutatjuk be. A 10a. és 10b., illetve a 10c. ábrán a C-terminális tirozin (Y62) közelében pontmutációkat hordozó kimérák által közvetített citolitikus aktivitást, illetve kalciumion-mobilizációt mutat- 40 juk be. A 10a. és 10b. ábrán a ϋϋ16:ζ fúziós proteineket nagy, illetve kis mennyiségben expresszáló sejtek esetében kapott eredmények láthatók. A kalciumionmobilizációs, illetve a citolízises vizsgálat eredményeinek ábrázolására azonos jelöléseket alkalmaztunk, me- 45 lyeket az ábrák jobb oldalán tüntettünk fel. A sötét körök a ϋϋ16:ζ-ί expresszáló sejtek (A: mfi=21; B: mfi=376); a sötét négyzetek a CD16:7: ζ(48-65^οη8ίrukciót expresszáló sejtek (A: mfi=31; B: mfi=82); a világos négyzetek a CD16:7: ζ(48-65χ31υ60Ο1η4κ>η8ί- 50 rukciót expresszáló sejtek (A: mfi=33; B: mfi=92); a „+” jelek a CD16:7^(48-65)Asp63Asn-konstrukciót expresszáló sejtek (A: mfi=30; B: mfi=74); a sötét háromszögek a CD16:7: ζ(48-65)Τ)τ62ΡΗβ-1ίοη8ΐη±ωόί expresszáló sejtek (A: mfi=24; B: mfi=88); a világos 55 körök a CD16:7^(48-65)Glu61Gln-konstrukciót expresszáló sejtek (A: mfi=20; B: mfi=62); a világos háromszögek pedig a CD16:7^(48-65)Tyr62Ser-konstrukciót expresszáló sejtek (B: mfi=64) eredményeit mutatják. A lOd. és lOe. ábrán, illetve a lOf. ábrán az N- 60 terminális tirozin (Y51) közelében pontmutációt hordozó kimérák által közvetített citolitikus aktivitást, illetve kalciumion-mobilizációt ábrázoljuk. A kalciumionmobilizációs, illetve a citolízises vizsgálat eredményeinek ábrázolására azonos jelöléseket alkalmaztunk, melyeket az ábrák jobb oldalán tüntettünk fel. A sötét körök a CD16^-t expresszáló sejtek (D: mfi=21,2; E:

mfi=672); a sötét négyzetek a CD16:7: ζ(48-65^οηβΙrukciót expresszáló sejtek (D: mfi=31,3; E: mfi=179);

a sötét háromszögek a CD16:7^(48-65)Asn48Serkonstrukciót expresszáló sejtek (D: mfi=22,4; E:

mfi=209; E: mfi=88); a világos négyzetek a

CD16:7^(48-65)Leu50Ser konstrukciót expresszáló sejtek (D: mfi=25,0; E: mii=142); a világos háromszögek pedig a CD16:7^(48-65)Tyr51Phe-konstrukciót expresszáló sejtek (D: mfí=32,3; E: mfi=294) citolitikus aktivitását mutatják.

A 1 la. és 1 lb. ábrán a ζ-lánc belső ismétlődéseinek egymás alá rendezését („alignment”) és citolízist elősegítő képességük összehasonlítását mutatjuk be. A 1 la. ábrán a ζ intracelluláris doménjének harmadolásával (és a CD16:7-kiméra transzmembrándoménjéhez kapcsolt) kapott kimérák sematikus ábrázolását, valamint az intracelluláris domének szekvenciáit (48., 49. és 50. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be (az azonos aminosavakat bekereteztük, a rokon aminosavakat pedig csillaggal jelöltük). A 1 lb. ábrán a három ζ-aldomén í citolitikus hatását mutatjuk be. A sötét körök a CD16: ζ- 1 kimérát expresszáló sejtek (mfi=476); a sötét négyzetek? I a CD16:7^(33-65)-konstrukciót expresszáló sejtek, j (mfí=68); a világos négyzetek a CD16:7^(71-104)fe J konstrukciót expresszáló sejtek (mfi=114); a sötét há? j romszögek pedig a CD16:7^(104-138)-konstrukciót | expresszáló sejtek (mfi=104) citolitikus aktivitását mu- j tátják. |

A 12. ábrán a CD16:FcRyII-kimérák sematikus áb- , rázolását mutatjuk be. ·

A 13a. és 13b. ábrán a CD4:FcRyII- és CD16:FcRyII-kiméra keresztkötése utáni kalciumionmobilizációt mutatjuk be. A 13 a. ábrán a kalciumérzékeny „Indo-1” fluorofórral jelölt sejtek által kibocsátott ibolyaszínű fluoreszcencia kék színű fluoreszcenciához viszonyított arányát a CD16 extracelluláris dómén antitestekkel megvalósult keresztkötése után eltelt idő függvényében ábrázoljuk. A 13b. ábrán a CD4:FcRyIIkimérákat hordozó sejtek által kibocsátott ibolyaszínű fluoreszcencia kék színű fluoreszcenciához viszonyított aránya - a kimérák antitestekkel létrehozott keresztkötése utáni - növekedésének előzőhöz hasonló vizsgálatát mutatjuk be.

A 14a. és 14b. ábrán a CD4:FcRyII- és CD16:FcRyII-kiméra citolízisvizsgálatának eredményeit mutatjuk be. A 14a. ábrán a CD16: FcRyH-kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfociták (effektorsejtek) növekvő mennyiségével kezelt anti-CD16 hibridómasejtek (célsejtek) által felszabadított ⁵¹Cr-izotóp százalékos arányát mutatjuk be. A 14b. ábrán a fc

CD4:FcRyII-kimérák által HlV-burok-glikoproteineket expresszáló célsejtekkel szemben közvetített citoto- r xicitás előzőhöz hasonló vizsgálatának eredményeit mu10

HU 221 603 Bl tatjuk be. A 15a-15e. ábrákon az FcRyII-A-farokban lévő - citolízis szempontjából lényeges - aminosavak azonosítását mutatjuk be. A 15a. ábrán a deléciós konstrukciók sematikus rajza látható. A 15b. és 15c. ábrán a CD16: FcRyII-A C-terminális deléciós változatai- 5 nak kalciumion-mobilizációra és citolízisre gyakorolt hatása vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. A 15d. és 15e. ábrán a CD16: FcRyII-Α intracelluláris farka Nterminálisán egyre kevesebb aminosavat tartalmazó háromrészes kimérák kalciumion-mobilizációra és cito- 10 lizisre gyakorolt hatása vizsgálatának eredményeit mutatjuk be.

A 16. ábrán a CD3-delta-receptorprotein aminosavszekvenciáját (24. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be; a bekeretezett szekvencia az előnyös cito- 15 litikus szignáltranszdukáló részt jelzi.

A 17. ábrán a T3-gamma-receptorprotein aminosavszekvenciáját (25. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be; a bekeretezett szekvencia az előnyös citolitikus szignáltranszdukáló részt jelzi. 20

A 18. ábrán az mbl-receptorprotein aminosavszekvenciáját (26. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be; a bekeretezett szekvencia az előnyös citolitikus szignáltranszdukáló részt jelzi.

A 19. ábrán a B29-receptorprotein aminosavszek- 25 venciáját (27. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be; a bekeretezett szekvencia az előnyös citolitikus szignáltranszdukáló részt jelzi.

A 20. ábrán a CD4-kimérák sematikus ábrázolását mutatjuk be. A 20a. ábrán a CD4(Dl-D4):Ig:CD7- 30 molekula; a 20b. ábrán a CD4(D1, D2):Ig:CD7-molekula; a 20c. ábrán a CD4(D1-D4):lg:CD7^-molekula; a 20d. ábrán a CD4(D1, D2): lg :CD7: ζ-molekula; a 20e. ábrán pedig a CD4; ζ-molekula látható. Az emberi CD4-molekula - prekurzor 1-394. aminosavainak 35 megfelelő - extracelluláris doménjét korábbi leírás szerint [Zettlemeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9,

347 (1990); azzal a különbséggel, hogy a rekombináns vacciniavirusokban az expresszió elősegítése érdekében az emberi Ig-iekombinánsok cDNS-változatát alkalmaz- 40 tűk] egy BamHI-helynél az emberi IgGl csukló(„hinge”), CH1- és CH2-doménjeihez kapcsoltuk.

A CD4-kimérák két domént tartalmazó változatát úgy állítottuk elő, hogy a CD4-prekurzor cDNS (200. aminosavnak megfelelő) egyedi Nhel-helyére egy BamHI- 45 adaptert inszertáltunk. A membránhoz kapcsolódó szekvenciák az emberi membránkötött IgGl első exonjából származó 22 aminosavból, valamint a CD7 146-203. aminosavaiból álltak. A ζ 55-163. aminosavai a négyrészes konstrukciók (20c. és 20d. ábra) „trigger”-motí- 50 vumaként szolgáltak. A ζ-láncot tartalmazó négyrészes konstrukciókban a ζ intracelluláris expresszióját kereskedelmi forgalomban beszerezhető intracelluláris dómén elleni antitesttel (Coulter) igazolták.

A 21. ábrán a HIV-l-burok-glikoproteint exp- 55 resszáló célsejtek - effektormolekulaként különböző CD4-eredetü kimérákat expresszáló - citotoxikus WH3-T-sejt-klón által közvetített citolízisét mutatjuk be. A citotoxicitási vizsgálatokhoz a CD8+ CD4- HLA B44-korlátozott WH3-T-sejtvonalat 10% emberi szé- 60 rummal kiegészített IMDM-tápközegben tartottuk, ahogy azt a leírásban korábban ismertettük. A sejteket gamma-sugárzással (3000 rád) kezelt, B44-et hordozó egymagvú sejtekkel és 1 pg/ml koncentrációjú fítohemagglutminnel (PHA) stimuláltuk. Egy napos stimulálás után a PHA-t friss tápközeg hozzáadásával

0,5 pg/ml koncentrációra hígítottuk, és három nap elteltével a tápközeget teljesen lecseréltük. A sejteket a citotoxicitási vizsgálatban való felhasználás előtt legalább napig szaporítottuk. A sejteket - a vPE16 esetében fentebb leírtak szerint - megfelelő rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük. A fertőzési folyamatot komplett tápközegben további 3-4 óra hosszat hagytuk folytatódni, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és lxl0⁷/ml sűrűségben újraszuszpendáltuk. U aljú mikrotitertálca - egyenként 100 pl komplett tápközeget tartalmazó - üregeibe a sejtszuszpenzió 100100 pl-ét adtuk, és kétszeres hígitású lépésekkel sorozathígítást készítettünk. A spontán krómizotóp-felszabadulás és az összes krómfelvétel mérése céljából mindegyik minta esetében két üregbe nem tettünk limfocitákat. A HeLa-S3-sejteket (HeLa-S3, ATCC) a fentebb leírtak szerint 10 cm-es csészékben vPElő-vacciniavektorral fertőztük. A csészékről - 1 mM EDTA-t tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) - leválasztott

10⁶ fertőzött sejtet lecentrifugáltuk és 37 °C-on egy órán át 100 pl ⁵¹Cr-nátrium-kromáttal (foszfátpufferelt sóoldatban 1 mCi/ml) újraszuszpendáltuk, majd PBS- 1 sel háromszor mostuk. Minden egyes üreghez a jelölt** 1 célsejtszuszpenzió 100 pl-ét adtuk, és a mikrotitertálcát* ) egy percig 750 χ g-vel centrifugáltuk. A felülúszóból 1

100 pl-es részleteket vettünk ki, és a radioaktivitást* i gamma-sugárszcintíllációs számlálóban mértük. Az e£ 1 fektor: célsejt arányt a sejtek - áramlási citometriával | megállapított - fertőzöttségi arányához korrigáltuk. I

A 22. ábrán a HIV-1 transzfektáns sejtvonalakban } bekövetkező replikációját mutatjuk be. A 293-as embe- ’ ri embrionális vesesejtvonal egy alvonalában olyan sejtvonalakat hoztunk létre, amelyek stabilan expresszálják a vad típusú CD-et és a különböző rekombináns kimérákat. A HIV-1 IIIB-izolátumából körülbelül lOtyml fertőzőképes részecske titerű vírusállományt hoztunk létre (a vírustitert indukátorként emberi C8166 T-sejtvonal alkalmazásával végzett végponthígítási vizsgálattal határoztuk meg). A sejteket 37 °C-on, hozzávetőleg

1-es fertőzési multiplicitással 8-12 óra hosszat fertőztük. A következő napon a sejteket foszfátpufferelt sóoldattal háromszor mostuk, tripszinnel kezeltük, új csészékre szélesztettük, és ezt 0. napnak tekintve a tényé- _s szeri felülúszóból a p24-titer meghatározása céljából 3-4 naponként mintákat vettünk. A sejteket 100 pg/ml hígromicin-B-t tartalmazó - friss táptalajjal láttuk el. A tenyészeti felülúszók analízisét hagyományos ELISA-alapú HIV-l-p24-antigénvizsgáló reagenskészlet (Coulter) alkalmazásával, a gyártó útmutatásai szerint végeztük. A bemutatott eredmények két azonos időtartamú független kísérlet eredményeit ábrá- » zolják.

A 23. ábrán a CD4 (CD4 Bam) Dl-D4-doménjei- ~ nek nukleotidszekvenciáját (28. azonosító számú szek11

HU 221 603 Bl vencia) és aminosavszekvenciáját (29. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

A 24. ábrán a CD4 (CD4 Nhe) Dl-D2-doménjeinek nukleotidszekvenciáját (30. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (31. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

A 25. ábrán az emberi IgGl (Igh23 Bam) csukló-, CH2-és CH3-doménjének nukleotidszekvenciáját (32. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (33. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

A 26. ábrán a CD7 (TM7 Bam Mlu) transzmembrándoménjének nukleotidszekvenciáját (34. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (35. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

A 27. ábrán a ζ-lánc (Zeta Mlu Nőt) intracelluláris doménjének nukleotidszekvenciáját (36. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (37. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

A 28. ábrán egy szintetikus α-hélix nukleotidszekvenciáját (51. azonosító számú szekvencia) és aminosavszekvenciáját (52. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be.

1. példa

Emberi IgGl: receptor-kimérák előállítása

A C_h3-dómén szekvenciáit az antitest-mRNS transzmembrán alakjának 3’-végéből származó cDNSfragmenshez kapcsolva az emberi IgGl nehéz láncának szekvenciáit állítottuk elő. A 3’-végi fragmenst szubsztrátként (emberi) mandula-cDNS-könyvtár alkalmazásával végzett polimeráz láncreakcióval kaptuk, melynek során a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (7. azonosító számú szekvencia);

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (8. azonosító számú szekvencia);

melyek a kívánt DNS-fragmensek 5’-végének, illetve 3’-végének felelnek meg. Az 5’-végi oligonukleotid az emberi IgGl C_Hl-doménjében lévő szakasszal komplementer, míg a 3’-végi oligonukleotid a transzmembrándomént kódoló szekvenciáktól közvetlenül 5’irányban elhelyezkedő szekvenciával komplementer. A polimeráz láncreakció termékét BstXI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és egy - variábilis és konstans régiókat tartalmazó - félszintetikus IgGlantitestet kódoló gén BstXI- és BamHI-helyei közé ligáltuk. A BstXI-BamHI-fragmens inszertálása után a konstrukció amplifikált részeit - restrikciós fragmenscserével - egészen a C_H3-domén Smal-helyéig kicseréltük, miáltal a konstrukcióban csak az Smal-hely és a 3’-végi oligonukleotid közötti szakasz származott a polimeráz láncreakcióból.

Emberi IgGl: ζ-kimérareceptor előállítása érdekében a nehéz lánc génjét (amely BamHI-hellyel végződik) hozzákapcsoltuk a (lentebb leírt) ζ-kiméra BamHIhelyéhez, úgy, hogy az antitestszekvenciák képezzék az extracelluláris részt. A kimérát kódoló plazmiddal transzfektált COS-sejtek áramlási citometriával végzett vizsgálata azt mutatta, hogy egy könnyű lánc cDNS-ét kódoló expressziós plazmiddal végzett kotranszfekció esetén az antitestdeterminánsok jelentős mértékű expressziója következett be, míg a könnyű lánc expressziós plazmidjának hiányában az antitestdeterminánsok mérsékelt expressziója volt megfigyelhető.

A fentebb leírtak szerint, hagyományos molekuláris líthatók elő [pl. η- vagy γ-lánchoz (lásd később) vagy egy T-sejt-receptor vagy Fc-receptor-protein bármilyen szignáltranszdukáló részéhez fuzionált emberi IgGl].

A nehéz és könnyű láncok közös promoter irányítása alatt történő expresszióját elősegítő transzkripciós egység előállítása érdekében nehéz és könnyű láncot kódoló szekvenciákból és a 78 kD-os glükóz által szabályozott proteint (grp78 vagy BiP) kódoló mRNS 5’végi nem transzlálódó részéből egy kétcisztronos mRNS-t kódoló plazmidot állítottunk elő. A grp78szekvenciákat emberi genomi DNS-ből, a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, polimeráz láncreakcióval állítottuk elő:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA

CAG CAC (9. azonosító számú szekvencia);

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG

CAG CAG (10. azonosító számú szekvencia).

A fenti oligonukleotidok az amplifikálni kivánt DNSfragmens 5’-, illetve 3’-végének felelnek meg. A polimeráz láncreakciókat 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében vé- l geztük. A polimeráz láncreakcióval kapott fragmenst ' I·

Notl-gyel és HincII-vel emésztettük, és az emberi f

IgGl kódolószekvenciájától 3’-irányban lévő NotI- és |

Hpal-helyek közé inszertáltuk. Ezután az emberi IgG í kappa könnyű láncának cDNS-ét - a HincII-hely és a vektor egy másik helyének felhasználásával - a grp78 vezetőszekvenciájától 3’-irányba inszertáltuk,

A kapott expressziós plazmid a következő komponenseket tartalmazta: a félszintetikus nehézlánc-gént, a grp78vezetószekvenciákat, a kappa könnyű lánc cDNS-szekvenciáit, valamint egy SV40-DNS-fragmensből származó poliadenilációs szignálokat. A COS-sejtek fenti expressziós plazmiddal végzett transzfektálása - a csak nehézlánc-determinánsokat kódoló plazmiddal végzett transzfekcióhoz viszonyítva - jelentős mértékben fokozta a nehézlánc-determinánsok expresszióját.

A nehézlánc/receptor kimérát és egy könnyű láncot tartalmazó kétcisztronos gén előállítása céljából az 5’oldali nehézlánc-szekvenciák bármilyen - találmány szerinti - nehézlánc/receptor kiméragénnel helyettesíthetők.

2. példa

CD4-receptor-kimérák előállítása

Emberi ζ-cDNS-t [Weissman és munkatársai:

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9709 (1988)] és γcDNS-t [Küster és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265,

6448 (1990)] HPB-ALL-tumorsejtvonalból [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987)] és emberi természetes „killer”-sejtekből készí- j= tett cDNS-könyvtárból, polimeráz láncreakcióval izoláltunk, míg a η-cDNS-t [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)] egér-timuszsejt12

HU 221 603 BI könyvtárból izoláltuk. A ζ-, η- és γ-cDNS-t a CD4 egy génsebészeti módszerekkel manipulált - a transzmembrándoméntől közvetlenül 5’-irányban BamHI-helyet tartalmazó - alakjának extracelluláris doménjéhez kapcsoltuk [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990)], amely a ζ- és η-cDNSben természetes állapotban - a transzmembrándoméntől 5’-irányban néhány nukleotid távolságra - hasonló helyen jelen lévő BamHI-helyhez volt kapcsolva (1., 3., 4. és 6. azonosító számú szekvenciák). A y-lánccal alkotott fúziós protein kialakítása céljából a szekvencia hozzávetőleg ugyanazon helyére egy BamHI-helyet inszertáltunk (1. ábra; 2. és 5. azonosító számú szekvencia). A génfúziókat - szelektálható markéiként E. coli gpt-gént tartalmazó - vacciniavírus expressziós plazmidba vittük be és homológ rekombináció alkalmazásával a vaccinia WR-törzs genomjába inszertáltuk, és mikofenolsawal szaporodásra szelektáltuk [Falkner és munkatársai: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és munkatársai: Gene 65, 123 (1988)]. Áramlási citometriás vizsgálattal kimutattuk, hogy a rekombináns vacciniavirusok a sejt felületén 0Ε)4:ζ és a CD4:y fúziós protein bőséges termelődését eredményezik, míg a CD4: η expressziója lényegesen kisebb mértékű (lb. ábra). Ez az utóbbi felismerés összhangban van azzal a cikkel, amelyben leírják, hogy egy η-cDNS expressziós plazmid egérbibridóma-sejtvonalba történő transzfektálása lényegesen kisebb expressziót eredményezett, mint egy hasonló ζ expressziós plazmiddal végzett transzfekció [Clayton és munkatársai: J. Exp. Med. 172, 1243 (1990)]. A rekombináns vacciniavírusokkal fertőzött sejtek immunprecipitációja azt mutatta, hogy a fúziós proteinek - a természetes CD4-antigéntől eltérően kovalens kötésű dimereket alkotnak. A monomer CD4.C, és CD4:y fúziós protein, valamint az eredeti CD4 molekulatömege 63, 55, illetve 53 kD volt. A fúziós proteinek nagyobb molekulatömege nagyjából összhangban van az intracelluláris rész nagyobb hosszúságával, ami a Ο34:ζ esetében 75 aminosawal, a CD4:y esetében pedig 5 aminosawal haladja meg az eredeti CD4 intracelluláris részének hosszát.

3. példa

A CD4-kimérák asszociálódhatnak más receptorláncokkal

Az emberi FcyRIII (CD 16τμ) makrofág/természetes, Jriller”-sejt alakjának transzfektánsokon bekövetkező sejtfelületi expresszióját az egér γ-lánccal [Kurosaki és munkatársai: Natúré 342, 805 (1989)] vagy emberi γ-lánccal [Hibbs és munkatársai: Science 246, 1608 (1989)], valamint emberi ζ-lánccal [Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989)] végzett kotranszfekcióval segítjük elő.

Áz említett hivatkozásokkal összhangban áll, hogy a kimérák expressziója lehetővé tette a CD16tm felületi expresszióját is, ha azt kotranszfekcióval vagy rekombináns vacciniavírusokkal végzett együttes fertőzéssel juttattuk be a célsejtbe (2. ábra). A vizsgált sejtvonalakban a ζ nagyobb mértékben segítette a CD16™ felületi expresszióját, mint a y (2. ábra), míg az eredeti CD4 nem növelte azt.

4. példa

Az Asp-Q-mutánsok nem asszociálódnak az Fc-receptorral

Létező antigén- vagy Fc-receptorokkal nem asszociálódó kimérák létrehozása érdekében olyan mutáns ζ fúziós proteineket állítottunk elő, amelyekből hiányzott a membránban lévő aszparaginsav (Asp) vagy a membránban lévő cisztein (Cys) (vagy mindkettő). Áramlási citometriás vizsgálattal kimutattuk, hogy a különböző mutáns kimérák által biztosított sejtfelületi expresszió intenzitása nem különbözött észrevehetően a nem mutáns kiméra által biztosított expresszió intenzitásától. Ezenfelül, az immunprecipitációs vizsgálatokkal megállapítottuk, hogy a kimérák által biztosított összes expresszió hasonló volt. A várakozásnak megfelelően a membránban lévő ciszteint nem tartalmazó mutáns kimérák nem képeztek diszulfidkötésű dimereket. Az aszparaginsavat nem tartalmazó két mutáns kiméra nem segítette elő a CDIÓjm felületi expresszióját, míg a ciszteint nem, de aszparaginsavat tartalmazó monomer kimérák lehetővé tették a CD16jm együttes expresszióját, de kisebb hatékonysággal, mind az eredeti dimer (3. ábra).

5. példa

A mutáns receptoroknak megmarad a kalciumreakciót beindító képességük

Annak meghatározása érdekében, hogy a fúziós pro-» teinek keresztkötődése - a T-sejt-antigénreceptor esetében megfigyelhetőhöz hasonló módon - lehetővé teszi-e a szabad intracelluláris kalcium felhalmozódását, a .Jurkat E6” emberi T-sejt leukémia-sejtvonal (ATCC ΤΠ3 152; American Type Culture Collection, Rockville, MD) sejtjeit a rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, és az extracelluláris dómén antitesttel bekövetkező keresztkötődése után mértük a citoplazma relatív kalciumkoncentrációját. Az „Indo-1” kalciumérzékeny festékkel [Grynzkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3340 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)] töltött sejtekkel áramlási citometriai vizsgálatot végeztünk. A 4a-4d. ábrákon a CD4^val és a ζ Asp- és Cys- mutánsaival fertőzött sejtekkel végzett kalciumáram-kísérletek eredményeit mutatjuk be. A kimérák keresztkötődése reprodukálhatóan fokozta az intracelluláris kalcium koncentrációját. A fertőzött sejtekben a CD4:q és a CD4:y szintén elősegítette az intracelluláris kalcium felhalmozódását. A ,Jurkat”sejtek felületükön kevés CD4-et expresszálnak, azonban az eredeti CD4 keresztkötődése - Ο16:ζ jelenlétében és hiányában egyaránt - nem változtatja meg az intracelluláris kalciumszintet (4a. és 4b. ábra).

6. példa

A CD4.fi-, CD4:x\- és CD4:y-kimérákaHIVgpl20/41-et expresszáló célsejtek citolízisét közvetítik

Annak meghatározása céljából, hogy a kimérareceptorok beindítják-e a citolitikus effektorprogramo13

HU 221 603 Bl kát, a HIV-gpl20/41-komplex CD4 által történő felismerésén alapuló „target:effektor” rendszer modellt hoztunk létre. „HeLa”-sejteket - gpl20/41-et expresszáló - rekombináns vacciniavirusokkal [Chakrabarti és munkatársai: Natúré 320, 535 (1986); Earl és munkatársai: J. Virol. 64, 2448 (1990)] fertőztünk, és a sejteket ^5,Cr-izotóppal jelöltük. A jelölt sejteket emberi allospecifikus (CD8+, CD4-) citotoxikus T-limfocita-sejtvonallal inkubáltuk, melyet - ϋΟ4:ζ-, CD4: η-vagy CD4:y-kimérát, vagy a kétszeresen mutáns CD4: ζϋγβΐ lGly: Aspl5Gly-kimérát expresszáló - rekombináns vacciniavirusokkal fertőztünk. Az 5a-5c. ábrákon azt mutatjuk be, hogy a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-sejteket a CD4-kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfociták (CTL) specifikusan lizálták. A nem fertőzött ,JHeLa”-sejteket a CD4^-kimérákkal ellátott citotoxikus T-limfociták nem támadták meg, és a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-sejteket a nem fertőzött CTL-ek nem ismerték fel. A különböző kimérák hatékonyságának összehasonlítása céljából a CD4-kimérákat expresszáló CTL-frakció, illetve a gpl20/41-et expresszáló „HeLa”-frakció esetében - áramlási citometriával kapott eredmények alapján - korrigáltuk az effektor: célsejt arányt. Az 5c. ábrán - az 5a. és 5b. ábrán bemutatott citolízises kísérletben alkalmazott - citotoxikus T-limfociták CD4-expressziójának citometriás vizsgálatának eredményeit mutatjuk be. Bár a felületi CD4: ζ átlagos sűrűsége jelentős mértékben meghaladta a CD4:p átlagos sűrűségét, az e kimérákat expresszáló sejtek citolitikus hatékonysága hasonló volt. A gpl20-at expresszáló célsejtek arányának megfelelő korrekcióval a CD4^- és CD4: η-protein által közvetített citolízis hatékonysága hasonló volt a specifikus T-sejt-receptor célsejt:effektor párok esetében leírt legjobb eredményekhez [a Ο34:ζ-ί expresszáló T-sejtek általi 50%-os felszabadítás esetében az átlagos effektor:célsejt arány l,9±0,99 volt (n=10)]. A CD4:y-fuzió kevésbé volt aktív, mint a transzmembrán aszparaginsavat és ciszteint nem tartalmazó CD4: ζ-fuzió, azonban mindkét esetben jelentős mértékű citolizist tapasztaltunk (5b. és 5c. ábra).

Annak ellenőrzése érdekében, hogy a vacciniafertőzés elősegítheti-e a citotoxikus T-limfociták által bekövetkező mesterséges felismerést, a CD16 foszfatidilinozitollal kapcsolt alakját (CD16_PI) expresszáló rekombináns vacciniavírussal fertőzött és ⁵¹Cr-izotóppal jelölt célsejtekkel, illetve CD16_prt vagy CD16^-t expresszáló kontroll rekombináns vírusokkal fertőzött citotoxikus T-limfocitákkal hasonló citolízises kísérleteket végeztünk. A 6a. ábrán látható, hogy a nem CD4kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel az eredeti HeLa-sejteket, illetve a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejteket, és hasonlóan, a CD4-kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a vacciniavirus által kódolt egyéb felületi proteineket expresszáló HeLasejteket. Ezenfelül, a nem kiméra CD4-et expresszáló citotoxikus T-limfociták nem lizálják jelentős mértékben a gpl20/41-et expresszáló HeLa-sejteket (6a. ábra).

7. példa

Az MHCII. osztályú antigéneket hordozó sejteket a kimérák nem támadják meg

Úgy véljük, hogy a CD4 egy MHC Π. osztályú antigén által expresszált, nem polimorf szekvenciával lép kölcsönhatásba [Gay és munkatársai: Natúré 328, 626 (1987); Sleckman és munkatársai: Natúré 328, 351 (1987)]. Annak ellenére, hogy tisztított proteinek esetében CD4 és MHC II. osztályú antigén közötti specifikus interakcióról nem számoltak be, a CD4-et expresszáló sejtek és az MHC II. osztályú molekulákat expresszáló sejtek között - bizonyos feltételek mellett adhézió mutatható ki [Doyle és munkatársai: Natúré

330, 256 (1987); Clayton és munkatársai: J. Exp. Med.

172, 1243 (1990); Lamarre és munkatársai: Science

245, 743 (1989)]. Következő kísérletünkkel azt vizsgáltuk, hogy az MHC II. osztályú antigéneket hordozó sejtek elpusztítása kimutatható-e. A 6b. ábrán látható, hogy a CD4: ζ a - nagy mennyiségű MHC II. osztályú antigént expresszáló - Raji-B-sejtvonal ellen nem indukál specifikus citolizist. Bár az MHC H~ Raji-sejtvonal [RJ2.2.5; Accola: J. Exp. Med. 157,1053 (1983)] esetében megfigyeltünk némi citolizist (5%-nál kisebb mértékben), ezek a sejtek hasonló érzékenységet mutatnak, mint a nem fertőzött T-sejtekkel inkubált Raji-sejtek.

8. példa

Szekvenciára vonatkozó követelmények a T-sejt-an- f tigén/Fc-receptor-zéta lánc általi citolízis indukció- í jóhoz 5

Bár a CD4 és a ζ-lánc alkotta kimérák képesek a ci- | totoxikus T-limfocitákat (CTL) HIV-gpl20-at exp·* | resszáló célsejtek elpusztítására indukálni, az emberi

T-sejtvonalakba bevitt ζ-kimérák tulajdonságainak egyértelmű összehasonlítása céljából a CD4 alternatíváját kerestük. Az emberi T-sejtvonalak képesek a CD4 expresszálására, ami megnehezíti a kalciummobilizáció típusa vagy mértéke, illetve a különböző kimérák citotoxikus potenciálja közötti kapcsolat specifikus meghatározását. Ennek kiküszöbölése érdekében ζ-láncból és

CDI 6-ból álló kimérákat állítottunk elő, amelyekben a

CD16 extracelluláris doménjét a ζ transzmembrán és intracelluláris szekvenciáihoz vannak kapcsolva (7a. ábra). A fuzionált géneket - szelektálható markerként E. coli gpt-gént hordozó - vacciniavirus expressziós plazmidba foglaltuk, és homológ rekombinációval a vaccinia WR-tÖrzs genomjába inszertáltuk, majd a rekombináns vírusokat mikofenolsav jelenlétében mutatott szaporodásra szelektáltuk [Falkner és

Moss: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és Coupar:

Gene 65,123 (1988)].

A rekombináns vacciniavirusokkal T-sejtvonalákat fertőztünk, és az extracelluláris domének antitestekkel létrejött keresztkötése után mértük a citoplazma relatív szabad kalciumion-koncentrációját. Az „Indo-1” festékkel töltött sejtekkel sejtpopuláció szinten spektrofotometriás, az egyes sejtek szintjén pedig áramlási citomet- í riás méréseket végeztünk [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985); Rabinovitch és <

munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A 7b. áb14

HU 221 603 Bl rán a CD16^ fúziós proteint expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőzött Jurkat-sejtvonal sejtjeiből összegyűjtött adatok analízisének eredményeit mutatjuk be. A kimérák keresztkötése reprodukálhatóan fokozta az intracelluláris kalciumion-koncentrációt, míg 5 a nem kiméra CD16-ot expresszáló sejtekkel végzett hasonló kezelés hatástalan (vagy csak kis hatású) volt. Ha a kimérát antigénreceptor nélküli mutáns sejtvonalakban expresszáltuk, mint például a REX33A [Breitmeyer és munkatársai: J. Immunoi. 138, 726 (1987); 10 Sancho és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 20760 (1989)] vagy a mutáns JRT3.T3.5 Jurkat-sejtvonal [Weiss és munkatársai: J. Immunoi. 135, 123 (1984)], a CD16-antitest keresztkötésére erőteljes reakciót figyeltünk meg. Hasonló adatokat kaptunk a REX20A mutáns sejtvonalra [Breitmeyer és munkatársai, lásd fentebb; Blumberg és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 14036 (1990)], valamint a laboratóriumunkban létrehozott CD3/TÍ negatív mutáns Jurkat-sejtvonalra.

A CD16^-t expresszáló rekombináns vírusokkal vég- 20 zett fertőzés nem állította helyre az anti-CD3-antitestre adott reakciót, ami azt mutatja, hogy a fúziós protein nem az intracelluláris CD3-komplex-láncok kiszabadításával fejti ki hatását.

A kimérák sejt közvetítette immunitást irányító ké- 25 pességének értékelése céljából citotoxikus T-limfocitákat CD16-kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, és a fertőzött T-sejteket membránkötött anti-CD16-antitesteket expresszáló hibridómasejtek specifikus lízisére alkalmaztuk. Ez a vizs- 30 gálát az eredetileg Fc-receptorokat hordozó sejtek effektormechanizmusának vizsgálatára kifejlesztett hibridóma-citotoxicitási vizsgálat [Graziano és Fanger: J. Immunoi. 138, 945 (1987); Graziano és Fanger: J. Immunoi. 139, 35 (1987); Shen és munkatársai: Mól. lm- 35 munol. 26, 959 (1989); Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989)] kiterjesztett változata.

A 8b. ábrán az látható, hogy a CD16^ citotoxikus Tlimfocitákban lezajló expressziója elősegíti, hogy a CTL-ek elpusztítsák a 3G8 hibridómasejteket (anti- 40 CD16; Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982)], miközben a CD16 foszfatidilinozitol-kötött alakját expresszáló citotoxikus T-limfociták inaktívak. A CD16^-ot hordozó CTL-ek a nem releváns antitestet expresszáló hibridómasejteket nem 45 pusztítják el.

A citolizishez szükséges minimális ζ-szekvenciák azonosítása céljából deléciós mutánsok sorozatát állítottuk elő, melyekben a C-terminálisról a ζ-lánc intracelluláris doménjének (44. azonosító számú szekvencia) egy- 50 re nagyobb részei vannak eltávolítva (8a. ábra). A ζlánc legnagyobb része eltávolítható anélkül, hogy a citolitikus hatást jelentősen károsítanánk; a teljes hosszúságú CD16 ^-kiméra hatékonysága lényegében azonos volt a 65. aminosavig deletált kiméra (CD16: ζΑδρόό*) 55 hatékonyságával (lásd 8b. ábra). A citotoxicitás hasonló csökkenését eredményezte a ζ-lánc 59. aminosaváig végrehajtott deléció (CD16^Glu60*), míg az 50. aminosavig történő deléció némileg kisebb aktivitást eredményezett. Mindazonáltal, az aktivitás teljes megszűnő- 60 sét akkor sem tapasztaltuk, ha az intracelluláris domént csupán három aminosavból álló transzmembránhorgonyra („anchor”) rövidítettük (8b. ábra).

Mivel a ζ egy diszulfidkötésű dimer, a citolitikus aktivitás fennmaradásának egyik magyarázatát az adja, hogy az endogén ζ a deléciós ζ-kimérával heterodimereket képez, helyreállítva ezáltal az aktivitást. Ezen elmélet igazolása céljából a ζ-lánc 11. aszparaginsavát és 15. ciszteinjét glicinnel helyettesítettük (CysllGly/Aspl5Gly), és a következők szerint immunprecipitációt végeztünk Szérummentes DME-tápközegben hozzávetőleg 2xl0⁶CVl-sejtet egy órán át - legalább 10-es fertőzési multiplicitással (, jnultiplicity of infection”; moi) rekombináns vacciniavirussal fertőztünk. A sejteket a fertőzés után 15 6-8 órával, 1 mM EDTA-t tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) leválasztottuk a tálcákról, és felületükön - laktoperoxidáz és hidrogén-peroxid alkalmazásával, Clark és Einfeld eljárásával [„Leukocyte Typing II”, 155. olásd, Springer-Verlag, NY (1986)] 2χ 10⁶ sejtre vonatkoztatva 0,2 mCi ¹²⁵I-izotóppal jelöltük A jelölt sejteket centrifügálással összegyűjtöttük és a következő összetételű oldatban lizáltuk: 1% NP-40;

0,1% SDS; 0,15 M NaCl; 0,05 M Tris-puffer (pH=8,0);

mM MgCl₂; 5 mM KC1; 0,2 M jód-acetamid és 1 mM PMSF. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk és a CD16-proteineket - 3G8-antitest [Fleit és munkatársai, lásd fentebb; Medarex] és anti-egér-IgG-agaróz (Cappel, Durham, NC) alkalmazásával - immunprecipitációnak vetettük alá. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS-gélen, nem redukáló feltételek mellett, vagy más módon, 10%-os gélen, redukáló feltételek mellétt é elektroforizáltuk. Az immunprecipitációs vizsgálat eredményei igazolták hogy a CD16^CysllGly/Aspl5Glykiméra nem diszulfidkötésű dimerként asszociálódik.

A mutáns receptorok citolitikus aktivitását is teszteltük. A 65. aminosavig deletált mutáns kiméra (CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*) a citolízisvizsgálatban - a vizsgálat körülményeitől függően - 2-8szor kisebb aktivitást mutatott, mint a hasonló deletált, de nem mutáns kiméra (CD16: ζΑβρ66·), ami aktivitásban nem különböztethető meg a CD16^-tól (9b. ábra).

A mutáns kimérák aktivitásában megfigyelhető csökkenés hasonlít a hasonló szerkezetű CD4-kimérák (lásd fentebb) aktivitásában tapasztalható csökkenéshez, és valószínű, hogy a ζ-monomerek dimerekhez viszonyított kisebb hatékonyságának tudható be. Ezzel szemben, az 59. aminosavig deletált, Asp-, Cys- mutáns kiméra nem mutat citolitikus aktivitást (lásd 9b. ábra), ami megerősíti azt a hipotézist, hogy az egyéb láncokkal létrejött - a transzmembrán Cys és/vagy Asp által közvetített - asszociáció volt felelős a 65. aminosav előtti aminosavakat is érintő deléciós kimérák citolitikus aktivitásának csekély mértékű fennmaradásáért.

Az áramlási citometriás vizsgálatok azt mutatták, hogy a transzmembrán aszparagint és ciszteint nem tartalmazó deléciós mutánsok TCR- mutáns Jurkat-sejtvonalban keresztkötést képző antitestre reagálva előse- g gíthetik a szabad kalciumion-koncentráció növekedését (9d. ábra). Az eredeti Jurkat-sejtvonalban expresszál- r tatott kimérák esetében is hasonló eredményeket kap15

HU 221 603 Β1 tünk. A CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* esetében a kapott adatok azt bizonyítják, hogy a kalciumérzékenység közvetítésének képessége mutációs szempontból elválasztható a citolízist elősegítő képességtől.

A ζ transzmembrán aminosavainak aktivitást elősegítő esetleges hatásának kiküszöbölése érdekében a ζ-lánc transzmembrán aminosavait és citoplazmikus részének első 17 aminosavát a CD5-, illetve a CD7-antigén transzmembrán aminosavaival, valamint citoplazmikus részének első 14 (CD5), illetve első 17 (CD7) aminosavával helyettesítettük. A három részből álló fúziós proteinek [CD16:5: ζ(48-65) és CD16:7: ζ(48-65)] - az egyszerűbb CD16^-kimérákkal ellentétben - nem képeznek diszulfidkötésű dimereket, mivel ζ-láncuk transzmembrándoménjéből hiányzik a cisztein. Jutkát- és TCR- sejtekben mindkét háromrészes kiméra képes volt mobilizálni a kalciumionokat (9d. ábra), valamint citotoxikus T-limfocitákban citolitikus reakciót indukálni (9c. ábra;, illetve az adatokat nem mutatjuk be), azonban a (ΖΧ)16:7:ζ(48-59) fúziós proteinben a ζ-lánc 59. aminosavig történő lerövidítése megszünteti a fúziós protein azon képességét, hogy TCR- és TCR⁺ Jurkat-sejtekben kalciumérzékenységet váltson ki, illetve, hogy érett citotoxikus T-limfocitákban citolízist indukáljon (9c. és 9d. ábra;, illetve az adatokat nem mutatjuk be).

A18 aminosavas motívumon belüli aminosavak aktivitásban betöltött szerepének vizsgálata céljából helyspecifikus mutációval számos mutánsváltozatot állítottunk elő, és ezeket - a kimérareceptor kis mennyiségben (10a. és lOd. ábra), illetve nagy mennyiségben (10b. és lOe. ábra) történő expressziója esetében - receptor közvetítette sejtpusztítást közvetítő képességükre vizsgáltuk. A 10a-lOf. ábrákon azt mutatjuk be, hogy - miközben az 59-63. aminosavakat érintő több konzervatív szubsztitúció (azaz a savas aminosavak rokon amidjaikkal, illetve a tirozin fenil-alaninnal történő helyettesítése) a citolitikus hatékonyság mérsékelt csökkentését eredményezte - a mutánsváltozatok általában megtartották kalciummobilizációs képességüket. Ezek az aminosavak együttesen egy lényeges almotivumot képeznek, mivel deléciójuk megszünteti a citolitikus aktivitást. A 62. tirozin fenil-alaninnal vagy szerinnel történő szubsztitúciója mind a citotoxikus, mind a kalciummobilizációs aktivitást megszüntette. A 18 aminosavas szegmens N-terminálisán az 51. tirozin fenilalaninnal végzett szubsztitúciója szintén megszüntette mindkét aktivitást, míg az 50. leucin szerinnel végzett helyettesítése megszüntette a kalciumreakciót, de csak részlegesen károsította a citotoxikus aktivitást. Feltételezzük, hogy a rövid idejű áramlási citometriás vizsgálatban a Leu50Ser-mutáns kalciummobilizációs aktivitásának hiánya nem tükrözi teljes mértékben azon képességét, hogy a hosszabb időtartamú citolízises vizsgálatban az intracelluláris kalciumszint jelentős mértékű növekedését eredményezi. Néhány citolitikus T-sejtvonal esetében azonban kalciumra nem érzékeny citolitikus aktivitásról számoltak be, és nincs kizárva annak lehetősége, hogy az általunk leírt eredmények alapját is hasonló jelenség képezi. A 48. aszparagin szerinnel történő helyettesítése néhány kísérletben részlegesen károsította a citotoxicitást, más kísérletekben azonban alig volt hatása.

A felesleges szekvenciaelemek potenciális szerepének vizsgálata céljából a ζ intracelluláris doménjét három szegmensre osztottuk, amelyek a 33-65., 71-104., illetve 104-138. aminosavakból álltak Mindhárom szegmenst (külön-külön) - a CD7 intracelluláris doménjének alapmembrán-kihorgonyzó szekvenciáitól közvetlenül disztálisan bevitt Mlul-hely segítségével - CD16 .CD7 kimérához kapcsoltuk (lásd később; 11a. ábra). A három elem citolitikus hatékonyságának összehasonlítása azt mutatta, hogy lényegében azonos hatásúak (11b. ábra). Az aminosavszekvenciák összehasonlítása alapján megállapítható, hogy a második szekvencia a tirozinok között 11 aminosavat tartalmaz, míg az első és harmadik szekvencia csak tizet.

Bár a T-sejt-aktiválás folyamatának pontos értékelése még nem történt meg, világos, hogy az antigénreceptor vagy a ζ-lánc intracelluláris szekvenciáit tartalmazó kimérák - aggregációja indítja be a kalciumion-mobilizációt, a citokin- és granulumfelszabadulást, valamint az aktiválás sejtfelületi markereinek megjelenését. A ζ-lánc aktív helye (amely lineáris peptidszakasz feltehetően túl rövid ahhoz, hogy saját enzimatikus aktivitása legyen) a celluláris aktiválás céljából valószínűleg egy - vagy legfeljebb néhány - proteinnel lép kölcsönhatásba. Nyilvánvaló az is, hogy a szabad kalciumionok mobilizációja önmagában nem elég a celluláris aktiváláshoz, mivel a citolízist közvetítő képesség mutációs szempontból elválasztható a kalciumfelhalmozódást közvetítő képességtől.

A ζ-lánc intracelluláris doménjéből származó. 18 aminosav két - nem rokon - protein transzmembrán és intracelluláris doménjéhez történő hozzáadása lehetővé teszi, hogy a kapott kimérák citolitikus aktivitást fejtsenek ki azon célsejtekkel szemben, amelyek hozzákötődnek a fúziós proteinek extracelluláris részéhez. Bár a 18 aminosavas fragmenst hordozó kimérák aktivitása hozzávetőleg nyolcszor kisebb, mint a teljes hosszúságú ζ-láncot tartalmazó kiméráké, a csökkent aktivitás a transzmembrán kölcsönhatások megszűnésének tulajdoníthatók, amelyek normális esetben lehetővé teszik a vad típusú ζ-láncok számára, hogy diszulfidkötésű dimereket képezzenek. A deléciós ζ-láncot tartalmazó konstrukciók, amelyek azonos C-terminálist tartalmaznak, mint a 18 aminosavas motívum, és nem tartalmaznak ciszteint és aszparaginsavat, jellemzően alig mutatnak kisebb aktivitást, mint azok a kimérák, amelyek csak a 18 aminosavas motívumot tartalmazzák.

A citolitikus aktivitásban szerepet játszó elem, amelyre figyelmünket összpontosítottuk, két tirozint tartalmaz, és nem tartalmaz szerint vagy treonint, ami korlátozza a foszforiláció aktivitáshoz való esetleges hozzájárulását. Bármelyik tirozin mutációja megszünteti az aktivitást, és annak ellenére, hogy az előzetes kísérletekben a 18 aminosavas motívumot tartalmazó felületi kiméraantigének keresztkötésképzése után jelentős mértékű tirozinfoszforilációt nem mutattunk ki, az ilyen foszforiláció aktivitásban játszott csekély szerepének le16

HU 221 603 Bl hetőségét nem zárhatjuk ki. A két tirozmnal kapcsolatos hatásokon kívül a 18 aminosavas szakasz N- és Cterminálisán végrehajtott több aminosavszubsztitúció csökkenti az aktivitást (kis receptordenzitásnál).

Több transzmembránprotein (köztük a CD3-delta és -gamma, a felületi IgM-mel asszociált mbl és B29, valamint a nagy affinitású IgE-receptor, az FceRI [Reth: Natúré 338, 383 (1989)] β- és γ-lánca) citoplazmikus doménjében a ζ-lánc aktív motívumához hasonló szekvenciák találhatók. Bár az ilyen szekvenciák funkciója bizonytalan, hatékony expresszió esetében mindegyik képes lehet az önálló T-sejt-aktiválásra, és az ilyen aktivitás magyarázatot adhat a ζ-negatív mutáns sejtvonalban megfigyelhető maradék TCR-érzékenységre [Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)].

A ζ-lánc önmaga három ilyen szekvenciát tartalmaz, melyek egymástól hozzávetőleg azonos távolságban helyezkednek el. Az intracelluláris dómén három részre történő hasítása azt mutatja, hogy mindhárom szekvencia képes citolitikus reakció beindítására. A ηláncból, amely a ζ-lánc egy összeillesztési („splicing”) izoalakja [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990); Clayton és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991)], hiányzik a harmadik motívum C-terminális fele. Mivel az első motívum C-terminális felének eltávolítása megszünteti az aktivitást, valószínűnek tűnik, hogy a η-lánc biológiai aktivitásának nagyobb hányada az első két motívumnak tulajdonítható. Bár a η-lánc az antigén közvetítette citokinfelszabadítás [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)] és a visszaállított citolízis (lásd fentebb) elősegítésében ugyanolyan aktivitású, mint a ζ-lánc, a η receptorstimuláció hatására nem foszforilálódik [Bauer és munkatársai, lásd fentebb]. Ilyenformán, vagy mindhárom motívum jelenléte szükséges a foszforilációhoz, vagy a harmadik motívum egy meghatározatlan tirozin kináz számára kedvező szubsztrátot képez.

9. példa

Az emberi Fc-receptor által kiváltott citolitikus szignáltranszdukció

A különböző emberi Fc-receptor-altípusok hatásának értékelése céljából olyan kiméramolekulákat állítottunk elő, amelyekben az emberi CD4-, CD5- vagy CD16-antigén extracelluláris doménjét az FcRIIyÁ, -Bl, -B2 vagy -C altípus [nevezéktant lásd: Ravetch és Kínét: Ann. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991)] intracelluláris doménjéhez kapcsoltuk Közelebbről, a fentebb leírt FcRILA-, FcRIIBl- és FcRIIB2-izoalakok transzmembrán és citoplazmikus doménjének megfelelő cDNSszekvenciákat a PC23-klőnból vagy - hagyományos eljárásokkal előállított - emberi mandula eredetű cDNSkönyvtárból, a következő szintetikus láncinditó oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (18. azonosító számú szekvencia; FcRII-A „forward” láncindító);

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (19. azonosító számú szekvencia; FcRII-A reverz láncinditó); GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (20. azonosító számú szekvencia; FcRII-Bl és FcRII-B2 „forward” láncinditó);

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (21. azonosító számú szekvencia; FcRIIB1 és FcRII-B2 reverz láncindító).

Ezek a láncindítók BamHl, illetve Notl felismerési helyeket tartalmaznak. Közvetlenül a Notl-hely után antiszensz stopkodon (CTA vagy TTA) található. Mindegyik láncinditó 18, a kívánt fragmensek 5’- vagy 3’végével komplementer nukleotidot tartalmaz. Az FcRIIA-izoalaktól csak a 268. aminosavban eltérő (P helyett L) FcRHyC citoplazmikus doménjének megfelelő cDNS-ffagmenst átfedéses polimeráz láncreakcióval végzett helyspecifikus mutagenezissel, a következő láncindítók alkalmazásával állítottuk elő:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (22. azonosító számú szekvencia); és TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (23. azonosító számú szekvencia).

A polimeráz láncreakcióval kapott fiagmenseket CD 16, illetve CD4 extracelluláris domént kódoló» DNS-t tartalmazó - vacciniavirus expressziós plazmidokba inszertáltuk, majd a timidin-kináz-lókusznál végzett rekombinációval vad típusú vacciniavirusba inszertáltuk, és a vírusokat a kívánt rekombinánsok azonosítása céljából E. coli gpt-gén kointegrációjára szelektál-* tűk. Az izoalakok azonosságát (lásd 12. ábra) didezoxiszekvenálással igazoltuk.

A kimérareceptor-proteinek termelődését immun-> precipitációs vizsgálatokkal is ellenőriztük. Szérum* mentes IMDM-tápközegben hozzávetőleg 10⁷JRT3.T3.5-sejtet egy órán át rekombináns vacciniavírussal, legalább tízes fertőzési multiplicitással (moi) fertőztünk. A fertőzés után 12 órával a sejteket összegyűjtöttük, és a laktoperoxidáz/glükóz oxidázos eljárással (Clark és Einfeld, lásd fentebb) felületükön - 10⁷ sejtre vonatkoztatva - 0,5 mCi ¹²⁵I-izotóppal jelöltük. A jelölt sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és 1% NP40-et, 0,1 mM MgCl₂-ot, 5 mM KCl-ot, 0,2 M jódacetamidot és 1 mM PMSF-et tartalmazó oldatban lizáltuk. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CDI 6 fúziós proteineket 4G8-antitest és anti-egér-IgGagaróz alkalmazásával immunprecipitáltuk. A mintákat redukáló feltételek mellett elektroforizáltuk. Valamennyi immunprecipitált kimérareceptor-molekula molekulatömege azonos volt a várt értékekkel.

A kimérareceptorok citoplazmikus szabad kalciumion-koncentrációt növelő képességének tesztelése céljából a rekombináns vírusokat a (leírásban ismertetett) JRT3.T3.5 TCR- Jurkat-sejtvonal fertőzésére alkalmaztuk, és a receptorok extracelluláris doménjeinek (a leírásban ismertetett) 3G8 vagy Leu-3A monoklonális antitesttel létrejött keresztkötése után a leírásban ismertetett módon mértük a citoplazma szabad kalciumion-koncentrációját. E vizsgálatokkal kimutattuk, hogy az FcRylIA és -C intracelluláris doménje az extracelluláris doménekkel létrejött keresztkötést követően képes volt a citoplazma szabad kalciumion-koncentrá17

HU 221 603 BI dójának növekedését kiváltani, míg az FcRylIBl és -B2 intracelluláris doménje hasonló feltételek mellett inaktív volt (13a. és 13b. ábra). Az FcRylIA CD4-gyel, CD5-tel és CD16-tal alkotott hibridjei a kalciumreakció elősegítését illetően lényegében azonos hatásúak 5 voltak (13a. és 13b. ábra). Az egyéb monocita- vagy limfocita-sejtvonalak szintén képesek voltak az extracelluláris domének keresztkötésképzése által kiváltott szignálra reagálni.

A különböző FcRylI intracelluláris domének citolizis- 10 ben betöltött szerepének vizsgálata céljából emberi citotoxikus T-limfocitákat (CTL-eket) CD16:FcRyIIA-,

-Bl, -B2 és -C-kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavirusokkal fertőztünk. A fertőzött sejteket ⁵¹Crizotóppal jelölt - CD16 elleni felületi antitestet exp- 15 resszáló - 3G8-10-2-hibridómasejtekkel együtt tenyésztettük. Amennyiben a kiméra CD16 extracelluláris doménje a limfocita-effektorprogram aktiválására képes intracelluláris szegmenshez kapcsolódik, a CD16-kimérát hordozó citotoxikus T-limfociták elpusztítják a hibri- 20 dóma-célsejteket (ezt a citolízisvizsgálatot az alábbiakban ismertetjük részletesen). A 14a. ábrán látható, hogy a CD16:FcRyIIA-t és CD16:FcRyIIC-t expresszáló vacciniavírussal fertőzött CTL-ek képesek a sejtfelületi anti-CD16-antitestet expresszáló célsejtek lizálására, a 25 CD16:FcRyIIBl-et, illetve a CD16:FcRyIIB2-t expresszáló vacciniavírussal fertőzött CTL-ek azonban nem.

Azon lehetőség kizárása érdekében, hogy a specifikus dtolizis valamilyen módon a CD16-résszel létrejött kölcsönhatásnak tulajdonítható, olyan citolízises kísér- 30 leteket végeztünk, amelyekben az FcRII intracelluláris doméneket CD4 extracelluláris doménekhez kapcsoltuk. Ezekben a kísérletekben célsejtként HIVgpl20/41-proteineket expresszáló HeLa-sejteket - pontosabban, a vPE16-vacciniavektorral („National Ins- 35 titute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository”, Bethesda, MD) fertőzött HeLa-sejteket alkalmaztunk. A CD16-rendszer esetében tapasztaltakhoz hasonlóan, a HIV-burokproteineket expresszáló célsejtek érzékenyek voltak a CD4:FcRyIIA-kimérát exp- 40 resszáló T-sejtek lizáló hatására, a CD4:FcRyQBl-et vagy CD4:FcRyIIB2-t expresszáló T-sejtekre azonban nem (lásd 14b. ábra).

Az FcRylIA és -C intracelluláris doménje semmilyen más proteinnel (beleértve a kibővített FcRy/TCTÍ^- 45 család tagjait) nem mutat közelebbi szekvenciahomológiát. A citolizis indukciójáért felelős szekvenciaelemek azonosítása érdekében az intracelluláris domént kódoló szekvenciák 5’- és 3’-oldalán deléciókat hoztunk létre (lásd később, illetve 15a. ábra), és az így kapott délé- 50 ciós mutánsokat a leírásban ismertetett kalciumionmobilizációs és citolízises vizsgálatokban értékeltük Azokban a kísérletekben, amelyekben az intracelluláris dómén N-terminábs részét távolítottak el, az FcRylI transzmembrándoménjét a nem rokon CD7-antigén 55 transzmembrándoménjével helyettesítettük, hogy kiküszöböljük a transzmembrándomén által közvetített kölcsönhatások esetleges aktivitást elősegítő hatását.

A 15b. és 15c. ábrán azt mutatjuk be, hogy a 14 Cterminális aminosav (köztük a 298. tirozin) eltávolítása 60 a citolitikus aktivitás teljes megszűnését, illetve a kalciumion-mobilizációs aktivitás jelentős mértékű csökkenését eredményezte. A 282. tirozinig húzódó további deléció azonos fenotípust eredményez (15b. és 15c. ábra). Az intracelluláris dómén N-terminálisától a 268. aminosavig húzódó deléció nem gyakorolt jelentős hatást sem a kalciumprofilra, sem a citolitikus aktivitásra, míg a 275. aminosavig húzódó deléció jelentősen csökkentette a szabad kalciumion-felszabadulás mértékét, a citolízisre azonban alig volt hatása (15d. és 15e. ábra). A 282. aminosavig tartó további deléció olyan FcRyQ-farkakat eredményezett, amelyek sem a kalciumion-mobilizációra, sem a citolizis kiváltására nem voltak képesek (15d. és 15e. ábra). Az e durva mérésekkel meghatározott „aktív elem” viszonylag nagy méretű (36 aminosav), és két - egymástól 16 aminosav távolságra lévő - tirozint tartalmaz.

10. példa

A fertőzést nem segítő CD4-tímérareceptorokat hordozó limfociták által kiváltott citolizis Ahogy azt fentebb leírtuk, génsebészeti módszerek alkalmazásával előállíthatok olyan effektormolekulák, amelyek a citotoxikus T-limfociták citolitikus aktivitását MHC-független módon irányítják. Például, a CD4 extracelluláris doménjéből és ζ-láncból álló kiméra a WH3 citotoxikus T-limfocita-klónban specifikusan? elpusztítja a HIV-1 felületi gpl20-glikoproteinjét hordozó célsejteket. Mivel a CD4-molekula extracelluláris doménje a sejteket érzékennyé teszi a HIV-fertőzésre, a? kimérával ellátott CTL-ek a vírus célsejtjeivé válhatnak, ami csökkenti hatékonyságukat [Dalgleish és munkatársai : Natúré 312, 767 (1984); Klatzmann és munkatársai: Natúré 312, 767 (1984)]. Ennek elkerülése érdekében olyan - CD4-en alapuló - kiméra effektormolekulákat terveztünk, amelyek a HIV-vel fertőzött sejteket specifikusan a citotoxikus T-limfociták célpontjaivá teszik, de a T-limfocitákat nem teszik érzékennyé a HIV-fertőzésre.

Genetikai manipulációval háromrészes fúziós proteint állítottunk elő, melyben a CD4 extracelluláris doménjét (23. ábra) az emberi IgGl nehéz láncának csuklódoménjához, valamint második és harmadik konstans doménjához kapcsoltuk [Zettlemeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990); 25. ábra], amelyeket ebben az esetben az emberi membránkötött IgGl első transzmembrán exonjának egy részéhez kapcsoltunk, amelyet az emberi CD7-antigén egy része követett, amely az egyedüli Ig-szerű dómén és a transzmembrándomént követő „stop-transzfer” szekvencia közötti szekvenciákból állt [Aruffo és Seed: EMBO J. 6, 3313 (1987); 26. ábra]. A CD7-szegmens extracelluláris részének aminosavszekvenciája prolinban gazdag régiót tartalmazott, ami egy nyélszerű struktúrára utal, amely az Ig-szerű domént kiemeli a sejtfelületből [Aruffo és Seed: EMBO J. 6,3313 (1987); 26. ábra], E kiméra és az itt leírt rokon kimérák expresszáltatása érdekében rekombináns vacciniavírusokat állítottunk elő. A rekombináns vacciniavírusokat CV-l-sejtekben homológ rekombinációval állítottuk elő. A CV-l-sejtekikjfl Illlll III ΙΙη»·Β

HU 221 603 Bl ben nagyobb titerű állományok előállítása előtt mindegyik állomány esetében legalább kétszer OKT4-gyel vagy Leu3a-val láthatóvá tettük a plakkokat és plakktisztítást végeztünk.

A három részből álló CD4(Dl-D4):Ig:CD7-ki- 5 méra (20a. ábra) hatékony sejtfelületi expressziót mutatott, ezt a kimérát vacciniaalapú szincítiumképzési vizsgálatban [Lifson és munkatársai: Natúré 323, 725 (1986); Ashom és munkatársai: J. Virol. 64, 2149 (1990)] HIV-receptorként való működési képességére 10 teszteltük. HIV-1 burok-glikoproteint kódoló rekombináns vacciniavírussal (vPE16; Earl és munkatársai: J. Virol. 64, 2448 (1990)] fertőzött HeLa-sejteket CD4gyel, CD4^-val vagy CD4(Dl-D4):Ig:CD7-tel fertőzött HeLa-sejtekkel tenyésztettünk együtt. A 6 cm-es csészékben 50%-os konfluens állapotot elért HeLasejteket (ATCC, Rockville, MD) szérummentes tápközegben egy órán át körülbelül 10-es fertőzési multiplicitással (moi) fertőztük. A sejteket komplett tápközegben 5-6 óra hosszat inkubáltuk, majd 1 mM EDTA-t tártál- 20 mazó foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) leválasztottuk.

A burokproteint és a CD4-kimérát expresszáló sejteket 1:1 arányban összekevertük, majd komplett tápközeget tartalmazó 6 cm-es csészékre szélesztettük. A szincítiumokat az együttes tenyésztés után 6-8 órával értékel- 25 tűk és lefényképeztük.

A CD4 és a vPE16 együttes tenyésztése könnyen kimutatható, sokmagvú óriássejtek kialakulását eredményezte. A TCR ζ-láncához fuzionált extracelluláris CD4-domént tartalmazó kiméra (27. ábra; CD4: ζ) szín- 30 tén képes volt a szincítiumok kialakulásának indukálására, míg a CD4(D1 -D4): lg: CD7-et expresszáló sejtek a sejtfúzió semmijeiét nem adták. Egy olyan konstrukciót is teszteltünk, amely a CD4 első és második doménjét (24. ábra) tartalmazta [CD4(D1, D2):Ig:CD7; 35 20b. ábra], mivel egy más összefüggésben a CD4 Nterminális két doménjéről kimutatták, hogy szükségesek a HIV-fertőzéshez [Landau és munkatársai: Natúré 334,

159 (1988)]. Ez a molekula sem volt fogékony a HÍV indukálta szincítiumképződésre. A ¹²⁵I-izotóppal jelölt 40 szolubilis gpl20-proteinnel végzett kötési vizsgálatok azt mutatták, hogy mind a CD(Dl-D4):Ig:CD7, mind a CD4(D1, D2): lg: CD7 változatlan affinitást mutatott a gpl20 iránt.

Ezt követően azt határoztuk meg, hogy a színei- 45 tiumképzésnek ellenálló kiméramolekulák képesek-e a sejtpusztítás indukálására akkor, ha az itt leírtak szerint „trigger’-molekularésszel látjuk el őket. A ζ intracelluláris doménjét (27. ábra) a CD4(Dl-D4):Ig:CD7 és a CD4(D1, D2):Ig:CD7 3’-végéhez kapcsoltuk, és elő- 50 állítottuk a megfelelő rekombináns vacciniavirusokat.

A kapott konstrukciókat, azaz a CD4(Dl-D4):Ig:CD7^-t (20c. ábra) és a CD4(D1,

D2): lg: CD7: ζ-t (20d. ábra) emberi WH3-CTLklónban expresszáltuk, és a találmányban leírt eljárá- 55 sok alkalmazásával a felületi HIV-burok-glikoproteint expresszáló HeLa-sejtek elpusztítására teszteltük.

A 21. ábrán látható, hogy a ζ-0)4(01-04):^:ΰ07hez vagy CD4(D1, D2):Ig:CD7-hez fuzionált intracelluláris doménje lehetővé teszi a sejtek elpusztítá- 60 sát, ugyanakkor, a ζ-láncot nem tartalmazó konstrukciók nem voltak képesek a citolitíkus aktivitás közvetítésére. A pozitív kontrollként alkalmazott Ο34:ζ valamivel hatékonyabb citotoxicitást közvetített, míg a CD4(D1, D2):Ig:CD7^ kevésbé volt hatásos, mint a CD4(Dl-D4):Ig:CD7:^ (21. ábra). Nyilvánvaló azonban, hogy mind a CD4(D1 -D4): lg :CD7: ζ-kiméra, mind a CD4(D1, D2): lg :CD7: ζ-kiméra képes a felületükön HIV-burokproteineket expresszáló sejtek specifikus elpusztításának közvetítésére. A vacciniavírusalapú vizsgálatban a négyrészes kimérik egyike sem volt képes a szincítiumképződés indukálására. Bebizonyítottuk azt is, hogy a 11a. ábrán bemutatott ζmotívumok közül egy is elég ahhoz, hogy egy

CD4(D1 -D4)-kiméra számára citolitíkus aktivitást biztosítson.

Radioimmunprecipitációs kísérletek alapján megállapítottuk, hogy a fúziós molekulák nagyrészt - ha nem teljesen - dimerek voltak. Ezekben a kísérletekben a CD4(Dl-D4):Ig:CD7^- vagy CD4(D1, D2): lg: CD7: ζ-kimérát expresszáló rekombináns vacciniavírussal fertőzött, metabolikusan jelölt HeLasejtek szolubilizált kivonatának immunprecipitálására protein-A-agarózgyöngyöket alkalmaztunk. Az immunprecipitált anyagot - redukáló és nem redukáló feltételekkel végzett - poliakrilamid-gélelektroforézissel frakcionáltuk. Hozzávetőleg 5xl0⁶ HeLa-S3-sejtet (ATCC CCL-2.2) - a vPE16 esetében leírtak szerint megfeleld vacciniavírus-törzzsel fertőztünk. A sejteket ‘ cisztein- és metioninhiányos tápközegben 200 pCi/ml „Tran³⁵S-Label” jelölőanyaggal (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) 6-8 órán át metabolikusan jelöltük, majd, mM EDTA-t tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal leválasztottuk. A sejteket ezután leülepítettük, és 150 mM NaCl-ot, 50 mM Tris-puffert (pH=7,5), 5 mM EDTA-t, 0,5% ΝΡ-40-et, 0,1% SDS-t és 1 mM PMSFet tartalmazó oldatban lizáltuk. A sejtmagvak centrifugálással végzett eltávolítása után minden egyes sejtkivonat egyötödét 4 °C-on két óra hosszat mosott proteinA-val konjugált agarózgyöngyökön adszorbeáltuk. A gyöngyöket 1 % ΝΡ-40-et tartalmazó foszfátpufferelt sóoldatban mostuk és - merkapto-etanol jelenlétében vagy hiányában - SDS-t tartalmazó mintapufferrel eluáltuk. A kísérletek eredményei azt mutatták, hogy nem redukáló feltételek alkalmazásakor az immunprecipitált CD4(Dl-D4):Ig:CD7^- és CD4(D1, D2): lg: CD7: ζ-kimérák többsége a várt molekulatömegű dimerként vándorolt.

A CD4 fúziós molekulákat expresszáló sejtek HIV-fertőzést segítő képességének közvetlen értékelése céljából a CD4(Dl-D4):Ig:CD7- és CD4(D1, D2): lg: CD7-kimérákat expresszáló transzfektánsokkal hosszú időtartamú fertőzési vizsgálatokat végeztünk. A CD4(Dl-D4):Ig:CD7-, CD4(D1, D2):Ig:CD7- és CD4-kimérák stabil transzfektánsait az emberi embrionális veséből származó, könnyen transzfektálható 293as sejtvonal egy alvonalában állítottuk elő. A kiméramolekulákat kétirányú vektorokban szubklónoztuk, amelyekben a higromicin-B gént a herpes simplex vírus timidin-kináz-promotere vezérelte. A 10 cm-es csészé19

HU 221 603 Bl ben 60-70%-os konfluens állapotig szaporított sejteket a kalcium-foszfát alkalmazásával végzett együttes kicsapási eljárás alkalmazásával a plazmid-DNS 10 pg-jával transzfektáltuk. A transzfektálás előtt a plazmidokat az egyetlen Sfil-helynél hasítva linearizáltuk, és a végeket T4-DNS-polimerázzal feltöltöttük. A transzfekció után 24 órával a sejteket négyfelé osztottuk, majd a transzfekció után 48 órával 400 pg/ml higromicin-B-vel (Sigma, St. Louis, MO) szelektáltuk. A sejteket 3-4 naponta higromicint tartalmazó friss tápközeggel láttuk el.

A rezisztens telepeket kivettük, szaporítottuk, és expressziójukat fluoreszceinnel konjugált anti-humánIgG Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) vagy az emberi CD4-gyel reaktív Q4120-antitest alkalmazásával végzett indirekt immunfluoreszcenciával, majd áramlási citometriával (Coulter, Hialeah, FL) értékeltük. A vizsgálathoz minden egyes konstrukcióból két független kiónt választottunk ki, melyekben a sejtfelületi CD4 szintje hasonló volt az egyéb sejtvonalakban megfígyelhetőhöz. A 22. ábrán látható, hogy a stabil CD4-transzfektánsokban a p24 a HIV-fertőzés utáni harmadik naptól kimutatható. Ezekben a tenyészetekben a sokmagvú óriássejtek jelenléte és a jellegzetes felfúvódás már a fertőzés utáni 5. napon látható volt. A nem transzfektált eredeti sejtvonalban, illetve a CD4(Dl-D4):Ig:CD7- és CD4(D1, D2):Ig:CD7transzfektánsok izolátumaiban 32 nap elteltével sem volt jelentős p24-szint, és nem voltak láthatók sokmagvú óriássejtek.

A fertőzési vizsgálatok befejezése után a sejteket felületi CD4-expressziójukra vizsgáltuk. A CD4-et expresszáló, fertőzött tenyészetekben a CD4 felületi epitópdenzitás jelentős mértékben csökkent, ami összhangban van a virális leszabályozással, a CD4(Dl-D4):Ig:CD7-et és CD4(D1, D2):Ig:CD7-et expresszáló tenyészetekben azonban a felületi denzitás változatlan maradt. E kísérletek eredményei azt mutatják, hogy előállithatók olyan - a CD4 két apikális doménjét tartalmazó - kiméramolekulák, amelyek a T-sejt-receptor ζ-láncához kapcsolódva képesek a HIV-fertőzött sejtek megcélzására és elpusztítására, azonban nem segítik elő a CD4 közvetítette HIV-fertózést.

További kísérletek eredményei arra utalnak, hogy a HIV-fertőzésnek ellenálló képességet a CD4-molekula extracelluláris doménje és a lipid kettősréteg közötti fizikai távolság biztosítja. Az egyik kísérletben olyan kiméramolekulát állítottunk elő, amely a CD7 „szár” és transzmembrándoménjében deléciót tartalmazott, ami a CD7 transzmembránrégiójából eltávolította a prolinban gazdag régiót. Ha ezt a domént a CD4 extracelluláris doménjéhez fuzionáljuk, megtartotta a CD4molekula extracelluláris doménjét kihorgonyzó képességét (amit a CEM-molekula sejtfelületi expressziója alapján állapítottunk meg). Ennek ellenére a HIVburok-glikoprotein által indukált szincítiumképződéssel szembeni ellenállási képesség megszűnt. Ilyenformán, a CD7-molekula - valószínűleg α-helikális szerkezetű - prolinban gazdag régiójának eltávolítása hatásosan csökkentette a CD4 extracelluláris doménje és a lipid kettősréteg közötti távolságot, és megszűntette a kiméra szincítiumképződéssel szembeni ellenálló képességét.

Egy másik kísérletben bebizonyítottuk, hogy a HÍV indukálta szincitiumképződéssel szembeni ellenállási képesség kialakulhat egy CD4/CD5-kiméra hatására, amelyről korábban leírták, hogy a CD4 extracelluláris doménje számára transzmembránhorgonyként szolgál, de önmagában nem képes a HÍV indukálta szincítiumképződés megakadályozására. Ebben a kísérlet10 ben az emberi IgGI nehéz láncának csukló-, CH2- és CH3-doménjét a CD4/CD5-molekulába inszertáltuk. A kapott kiméra megakadályozta a szincítiumképződést, ami ebben az esetben is arra utal, hogy az immunglobulin-domének által biztosított távolság elegen15 dő a HÍV indukálta szincitiumképződéssel szembeni rezisztencia biztosítására.

Egy harmadik kísérletben egy CD4-domént - változó hosszúságú szintetikus α-hélixek alkalmazásával a sejtmembrántól különböző távolságokban helyeztünk el. Olyan szintetikus oligonukleotidokat alakítottunk ki, amelyekben az egymást felváltva követő lizinek és glutaminsavak között alaninok helyezkednek el (a nukleotid- és aminosavszekvenciát lásd 28. ábra). Korábbi vizsgálatok eredményei azt tanúsítják, hogy az ilyen aminosavszekvenciák nagy gyakorisággal a-helikális szerkezetűek, ami arra utal, hogy az ilyen ismétlődő motívumok α-helikális konformációt vesznek fel, és ha a transzmembrándomén és a CD4 extracelluláris doménje közé ilyen α-hélixeket helyezünk, a CD4 távol' tartható a sejtmembrántól. Az α-helikális szegmenshosszúságának változtatásával - az α-hélix ismert csavarmenet-emelkedése alapján meghatároztuk a > CD4 azon kiemelési távolságát, amely a HIV-vírusok bejutásának megakadályozásához szükséges. Ezeket az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Konstrukció	Színei tiumképződés	Thy-1 expresszió
A)CD4+H+CH3+ CH3+CD7tm+stk	-	-
B) CD4(D1, D2)+H+CH2+ CH3+CD7tm+stk	+ /-<·>	+
C) CD4+CD7tm+stk	+	+
D) CD4+CD7tm (hosszú változat)	+	+
E) CD4+CD7tm (rövid változat)	+	+
F) CD4+CD5tm	+	+
G) CD4+CH2+CH3+ CD5tm	-	-
H) CD4+CH3+CD5tm	-	NM
I)CD4+CH34tm	+	+
J) CD4+szintetikus a-hélix (24 angström)+CD34tm	NM	+

ff

HU 221 603 Bl

1. táblázat (folytatás)

Konstrukció	Színei tiumképződés	Thy-1 expresszió
K) CD4+szintetikus a-hélix (48 angström)+CD34tm	NM	+ /-<»>
L) CD4+szintetikus a-hélix (72 angström)+CD34tm	NM	-

NM: nincs meghatározva * Jelentős mértékű csökkentés a szincítiumok vagy a thy-l-et expresszáló sejtek számában.

A táblázatban „CD4” jelentése - ha másképp nem jelezzük - CD4(D1-D4); „H”, „CH2”, illetve „CH3” jelentése az emberi IgGl nehéz láncának csukló-, CH2-, illetve CH3-régiója: „CD7tm+stk” jelentése a CD7 transzmembrán- és „szár” régiója; „CD7tm (hosszú változat)” jelentése a CD7 transzmembránrégiója; „CD7tm (rövid változat)” jelentése a CD7 - prolinban gazdag doménjében a fentebb leírtak szerint deletált - transzmembránrégiója; „CD5tm” jelentése a CD5 transzmembránrégiója; és „CD34tm” jelentése a CD34 transzmembránrégiója. A J)-L) konstrukciók esetében az α-hélixek hosszát angströmben adjuk meg; ezek az értékek azon a tényen alapulnak, hogy az a-hélixben egy csavarmenetet 3,6 aminosav alkot, és a csavarmenet magassága 5,4 angström (ebből egy aminosavra 1,5 angström jut). Ezek szerint, egy 16 aminosavas α-hélix a CD4 extracelluláris doménjét hozzávetőleg 24 angström távolságra emeli ki. A 48 és 72 angströmös α-hélixeket a BstYl-fragmens - a fragmens egyedi BamHI-helyére történő - egymás után konkatemerizációjával állítottuk elő (lásd 28. ábra), majd kiválasztottuk a megfelelő orientációjú kiónokat.

A szincítiumképzést - a vPE-16 vacciniavirus-konstrukcióból származó HIV-l-burok-glikoproteint expresszáló HeLa-sejtek végzett együttes tenyésztési vizsgálatban értékeltük.

A Thy-l-expressziót a következők szerint mértük. A HIV-1 hxb.2-klónja alapján élő retrovírusvektort állítottunk elő. Ebben a vektorban a nem kulcsfontosságú nef-gént a patkány-thy-1 (amely egy hatékonyan expresszált sejtfelületi molekula, amely foszfatidil-inozitol-kötéssel van a membránhoz horgonyozva) kódolószekvenciájával helyettesítettük. Az e molekuláris kiónból (hxb/thy-1) származó vírus fertőzőképes volt, amit citopatológiás hatásai és a fertőzött C8166-sejtek (amely egy emberi CD4+ leukémiás T-sejtvonal) tenyészeti felülúszójában kimutatott p24-termelődés bizonyított. A hxb/thy-l-klón hatására a CD4-gyel átmenetileg transzfektált HeLa-sejtek már a fertőzés után 18 órával thy-l-expresszió jeleit mutatták, ami nef-szerű módon szabályozott mRNS esetében előre várható. A nef-gén által kódolt mRNS-ek virális szabályozóproteineket kódoló mRNS-ek osztályába tartoznak, amelyek többszörös „splicing”-on mennek keresztül, és az általuk kódolt fehérjékből hiányzik a rev-re reagáló elem. Ezek az mRNS-ek korai virális géntermékekként zömmel a citoplazmában halmozódhatnak fel. A thy-l-mRNS-ek esetében azt vártuk, hogy szabályozásuk hasonló módon, azaz a vírus életciklusának korai szakaszában történik. Ez a rendszer - a vírusbehatolás helyett a thy-lexpresszió alkalmazásával - lehetővé teszi a HÍV behatolásának vizsgálatát. Különböző CD4-alapú kimérákat - standard DEAE-dextrán eljárások alkalmazásával átmenetileg HeLa-sejtekbe transzfektáltunk, és a transzfektált sejteket a transzfekció után 48 órán keresztül hxb/thy-1 -vírussal fertőztük, majd a fertőzés után 24-48 órával értékeltük a thy-l-expressziót. Az 1. táblázatban bemutatott eredményeket úgy kaptuk, hogy a fertőzés után 24 órával - kereskedelmi forgalomban beszerezhető Thy-1 monoklonális antitest (Accurate) alkalmazásával - mértük a thy-l-expressziót.

Az 1. táblázat eredményeiből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a HTV-l-fertőzés megakadályozása érdekében a CD4 extracelluláris doménjeinek legalább 48 angström távolságra, előnyösen legalább 72 angström távolságra ki kell nyúlniuk a sejtmembránból.

Az itt leírt általános eljáráshoz hasonlóan olyan HIV-burokproteinek elleni - antitesteken alapuló kimérák állíthatók elő, amelyek a HIV-vírussal fertőzött sejteket célozzák meg. Az ilyen antitestek példáinak leírását lásd Gomy és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, (1989); és Marasco és munkatársat: J. Clin. Invest. 90, 1467 (1992).

11. példa

A sejtmembránból kiálló CD4-molekulák alkalmazása HIV-csaliként

Ahogy azt az előzőekben bebizonyítottuk, a sejtfelületből kiálló CD4-doméneket hordozó sejtek ellenállóak a HIV-fertőzéssel szemben, igy az ilyen sejtek hatásos csapdaként szolgálnak a keringésben lévő HIVvírusok megkötésére, és a HIV-fertőzött páciensekben csökkentik a vírustitert. A CD4-domént előnyösen olyan sejten prezentáljuk, amely természetes állapotban áthalad a nyirokcsomókon; a hasznos gazdasejtek közé tartoznak az immunsejt-„clearance”-ben szerepet játszó sejtek, valamint az összes olyan sejt, amely természetes állapotban jelen van a nyirokcsomó-follikuluszokban. A gazdasejtek konkrét példái közé tartoznak - többek között - a makrofágok, T-sejtek (például ,belper”-T-sejtek), B-sejtek, neutrociták, dendritsejtek és a follikuláris dendritsejtek.

A találmány szerinti eljárásban bármilyen CD4domén (köztük a D1-D4- és Dl, D2-domén) alkalmazható, amely képes a HÍV megkötésére. Néhány (például a fentebb leírt) megvalósítási mód szerint a kiméra intracelluláris és/vagy transzmembrándomén része származhat bármilyen proteinből vagy aminosavszekvenciából.

12. példa

Egyéb T-sejt-receptor- és B-sejt-receptor„ trigger -molekulák

A találmány szerinti egyéb intracelluláris és transzmembrán szignáltranszdukáló domének T-sejt-receptorproteinekből (CD3-delta és T3-gamma), valamint Bsejt-receptorproteinekből (mbl és B29) származhatnak.

HU 221 603 BI

A CD3-delta aminosavszekvenciáját a 16. ábrán (24. azonosító számú szekvencia); a T3-gamma aminosavszekvenciáját a 17. ábrán (25. azonosító számú szekvencia); az mbl aminosavszekvenciáját a 18. ábrán (26. azonosító számú szekvencia); a B29 aminosavszekven- 5 ciáját pedig a 19. ábrán (27. azonosító számú szekvencia) mutatjuk be. Az ábrákon a szekvenciák citolitikus szignáltranszdukcióhoz szükséges (és ennélfogva a találmány szerinti kimérareceptorokban előnyösen alkalmazott) részét bekereteztük. Olyan kimérareceptorokat 10 állítottunk elő, amelyek a fenti proteindoméneket tartalmazzák, és a kapott konstrukciókat a találmány szerinti terápiás eljárásokban alkalmazzuk.

13. példa 15

Kísérleti eljárások

Vaecimafertőzés és radioimmunprecipitáció

Hozzávetőleg 5 χ 10⁶ CVl-sejtet [Friedrich és munkatársai, Oncogene 8, 1673 (1993)] szérummentes DME-tápközegben egy órán át legalább 10-es fertőzési 20 multiplicitással (moi) rekombináns vacciniavirussal fertőztünk. A sejteket a fertőzés után friss tápközegbe helyeztük, és metionin- és dszteinmentes DMEM-tápközegben (Gibco, Grand Island, NY) 200 pCi/ml ^3SS-metionin+cisztein jelölőanyaggal („Tran³⁵S-label”; ICN, 25 Costo Mesa, CA) metabolikusan hat óra hosszat jelöltük. Ajelölt sejteket 1 mM EDTA-t tartalmazó PBS-sel leválasztottuk, centrifúgálással összegyűjtöttük, és 1% ΝΡ-40-et, 0,1% SDS-t, 0,15 M NaCl-ot, 0,05 M Trispuffert (pH=8,0), 5 mM EDTA-t és 1 mM PMSF-et tar- 30 talmazó oldatban lizáltuk. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD4-proteineket OKT4-antitest és antiegér-IgG-agaróz (Cappel, Durham, NC) alkalmazásával immunprecipitáltuk. A mintákat 8%-os SDSpoliakrilamid-géleken, nem redukáló, illetve redukáló 35 feltételekkel elektroforizáltuk. A ³⁵S-izotóppal jelölt mintákat tartalmazó géleket az autoradiográfíás vizsgálat előtt „En³Hance” (New England Nuclear, Boston, MA) alkalmazásával impregnáltuk. A CD16 transzmembrán alakjának (CDIÓjm) elősegített expressziójá- 40 nak mérése céljából a csak CDlójM-domént kódoló vírusokkal fertőzött CVl-sejtekben megfigyelt expressziét a CD16tm^* vagy CDIÓjm :y-kimérát kódoló vírusokkal együttesen fertőzött sejtekben megfigyelt expresszióval hasonlítottuk össze. A fertőzés és hat 45 órás vagy hosszabb időtartamú inkubálás után a sejteket 1 mM EDTA-t tartalmazó PBS-sel leválasztottuk a tálcákról, és a CDló^, illetve a kimérák expresszióját indirekt immunfluoreszcencia-vizsgálattal vagy áramlási citometriával mértük. 50

Kalciumáram-vizsgálat

A Jurkat-E6-sejteket [Weiss és munkatársai: J. Immunoi. 133, 123 (1984)] szérummentes IMDM-tápközegben - 10-es fertőzési multiplicitással - egy órán át rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd 55 10% FBS-t tartalmazó IMDM-tápközegben 3-9 óra hosszat inkubáltuk. A sejteket centrifúgálással összegyűjtöttük, és 1 mM „Indo-1” aceto-metoxi-észtert [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260,

3340 (1985); Molecular Probes] tartalmazó komplett 60 tápközegben 3 x1ο⁶ sejt/ml mennyiségben újraszuszpendáltuk, és 37 °C-on 45 percig inkubáltuk. Az „Indol”-gyel jelölt sejteket leülepitettük és 1 χ 10 sejt/ml mennyiségben szérummentes IMDM-tápközegben újraszuszpendáltuk, majd szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk. A sejtek szabad kalciumion-tartalmát az ibolya és kék fluoreszcencia - áramlási citometria alkalmazásával történő - egyidejű mérésével határoztuk meg [Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A kalciumáram beindítása érdekében a sejtszuszpenzióhoz a 0. percben fíkoeritrinnel (PE) konjugált anti-CD4 Leu-3A-antitestet (1 pg/ml; Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), majd 10 pg/ml konjugálatlan kecske anti-egér-IgG-t; vagy szintén a 0. percben pg/ml koncentrációjú konjugálásán 3G8 (anti-CD16) monoklonális antitestet, majd fíkoeritrinnel konjugált

- egér-IgG-elleni - kecske Fab₂’-t adtunk. Az összes sejt jellemzően 40-80%-át kitevő PE-pozitív (fertőzött) sejtpopulációból ibolya/kék kibocsátási hisztogramokat készítettünk. A nem fertőzött sejtekben a Tsejt-antigén-receptor reakciót az OKT3-antitest váltotta ki (keresztkötésképzés nélkül). A CD16-kimérareceptorokkal végzett kísérletekben az alacsonyabb kalciumszint felé (antitest nélkül) alapvonal-eltolódást mutató mintákat kihagytuk a vizsgálatból. A hisztogram adatait a biner adatok - „Write Hand Mán” szoftver (Cooper City, FL) alkalmazásával - ASCD-höz történő konverziójával, majd „FORTRAN”-programkollekcióval í végzett, analízissel értékeltük. Az egységnyi értékre be-' I állított, normalizált kiindulási arány megállapítására,» valamint a nyugalmi köszöbarány (melyet úgy állítat- ( tünk be, hogy a nyugvó populáció 10%-a haladja meg a ;

küszöbszintet) meghatározására a második antitestreagens hozzáadása előtti ibolya/kék emissziós arányt.

használtuk.

Citolízisvizsgálat

A CD8- CD4- HLA-B44-korlátozott WH3-T- f sejtvonalat 10% emberi szérumot és 100 E/ml IL-2-t tartalmazó IMDM-tápközegben tartottuk, és szabályos időközönként perifériás vérből származó, sugáxkezelt (3000 rád) HLA-párosítatlan limfocitákkal és 1 pg/ml koncentrációjú fitohemagglutininnel nem specifikusan, vagy sugárkezelt, B44-et hordozó egymagvú sejtekkel specifikusan stimuláltuk. A nem specifikus stimulálás után egy nappal a fitohemagglutinint friss tápközeg hozzáadásával 0,5 pg/ml koncentrációra hígítottuk, és három nap múlva a tápközeget lecseréltük. Mielőtt a citotoxicitási vizsgálatot elkezdtük volna, a sejteket a fertőzés után legalább 10 napig szaporítottuk. A sejteket szé- = rummentes tápközegben legalább 10-es fertőzési multiplicitással egy óra hosszat rekombináns vacciniavirussal fertőztük, majd komplett tápközegben három óra hosszat inkubáltuk. A sejteket centrifúgálással összegyűjtöttük és 1 χ 10⁷ sejt/ml mennyiségben újraszuszpendáltuk. U aljú mikrotitertálca - egyenként 100 pl komplett tápközeget tartalmazó - üregeibe a kapott sejtszuszpenzió 100-100 pl-ét töltöttük. A sejtszuszpen- g ziókból kétszeres hígítási lépésekkel sorozathígítást készítettünk. A spontán krómizotóp-felszabadulás és az r összes krómfelvétel mérése céljából mindegyik minta

HU 221 603 Bl esetében két üregből kihagytuk a limfocitákat. A HeLaS3-sejtvonalból származó célsejteket 6,0 cm-es vagy 10,0 cm-es csészékben, szérummentes tápközegben hozzávetőleg 10-es fertőzési multiplicitással három órán át fertőztük, majd komplett tápközegben három óra hosszat inkubáltuk. A sejteket ezután 1 mM EDTAt tartalmazó foszfátpufferelt sóoldattal leválasztottuk a csészékről és megszámoltuk. 10⁶ célsejtet - a CD4kimérareceptorokkal végzett kísérletekben HeLa-, Raji vagy RJ2.2.5-sejteket, a CD16-kimérareceptorokkal végzett kísérletekben pedig „3G8 10-2”-sejteket [Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1989) - lecentrifúgáltunk és 50 μΐ steril ⁵¹Cr-nátrium-kromát-oldatban (1 mCi/ml; Dupont, Wilmington, DE) 37 °C-on egy órán át - időnként megkeverve - újraszuszpendáltunk. A sejteket foszfátpufferelt sóoldattal háromszor mostuk, majd a mikrotitertálca mindegyik üregébe a tápközegben 10⁵ sejt/ml mennyiségben újraszuszpendált jelölt sejtek 100 μΐ-ét adtuk. A Raji- és RJ2.2.5sejtek jelölését a HeLa-sejtek esetében leírttal azonos módon végeztük. A mikrotitertálcát 750 x g-vel egy percig centrifugáltuk, és 37 °C-on négy óra hosszat inkubáltuk. Az inkubálás után az egyes üregekben lévő sejteket óvatos pipettázással újraszuszpendáltuk. Az összes beütésszám meghatározása céljából a szuszpenzióból mintát vettünk, és a mikrotitertálcát 750 χ g-vel egy percig centrifugáltuk. A felülúszóból 100 μΐ-es részleteket vettünk, és a beütésszámot gamma-sugárszcintillációs számlálóval számláltuk. A százalékos sejtpusztítást a fertőzött célsejtek áramlási citometriával meghatározott arányának (rendszerint 50-90%) megfelelően korrigáltuk. A fertőzött effektorsejtek esetében az effektor: célsejt arányt a fertőzött sejtek százalékos arányához korrigáltuk (ez az arány a CD4-kimérareceptorokkal végzett kísérletek esetében rendszerint 20-50%, a CD16-kimérareceptorokkal végzett kísérletek esetében pedig 70% feletti).

A ζ-szekvencia in vitro mutagenezise

A ζ-szekvencia 11. és/vagy 15. aminosavába pontmutáció létrehozása céljából a ζ transzmembrándoménjétől 5’-irányban lévő BamHI-helytől kezdődő szintetikus oligonukleotidokat állítottunk elő, amelyek az eredeti ζ-szekvencia 11. ciszteinjét glicinre (C11G); 15. aszparaginsavát glicinre (D15G) vagy egyidejűleg a 11. ciszteint glicinre és a 15. aszparaginsavát glicinre (C11G/D15G) változtatják. Ezeket az oligonukleotidokat mutáns fragmensek előállítása érdekében polimeráz láncreakciókban alkalmaztuk, és a kapott fragmenseket a vad típusú CD4: ζ-konstrukciókba inszertáltuk vissza.

A ζ-láncban deléciók létrehozása érdekében - az 50., 59. vagy 65. aminosav után stopkodon beiktatására tervezett szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végzett polimeráz láncreakcióval ζ-cDNSszekvenciákat amplifikáltunk. A láncindítók az 5’végtől öt vagy hat nukleotid távolságra Notl-helyet tartalmaztak, rendszerint a CGC GGG CGG CCG CTA (11. azonosító számú) szekvencia formájában, ahol az utolsó három nukleotid a stop-antikodonnak felel meg. A NotI és stop-antikodon szekvenciáit 18 vagy több a fragmens kívánt 3’-végével komplementer nukleotid követi. A kapott kimérákat CD16^Y51*-nak, CD16^E60*-nak, illetve CD16^66*-nak neveztük el. A transzmembrándoméntől és a Notl-helytől 5’irányban lévő BamHI-helyet olyan fragmensek előállítására alkalmaztuk, amelyeket visszajuttattunk a vad típusú CD16 ^-konstrukcióba. A ζ-lánc transzmembrán és membránhoz közeli intracelluláris szekvenciáinak a fentebb leírt Asp^- és Cys^- CD4: ζ-konstrukció BamHI- és Sacl-emésztésével végzett - felszabadításával, és a kapott fragmens CD16^E60*-, illetve CD16:ζD66*-konstrukcióba történő inszertálásával monomer ζ-kimérákat állítottunk elő.

A háromrészes CD16:7:ζ(48-65)- és CD16:7:^(48-59)-kiméra előállítása

A 0ϋ16:ζΟ66*4οη8ΐη]1κ:ϊό előállítása céljából a ζlánc transzmembrándoménjének és a citoplazmikus dómén következő 17 aminosavának megfelelő ζ-cDNSszekvenciát a CD5 és a CD7 megfelelő transzmembrán és citoplazmikus doménjeit kódoló cDNS-szekvenciával helyettesítettük. A CD5- és CD7-cDNS-fragmenseket BamHI hasítási helyet tartalmazó és a CD5, illetve a CD7 transzmembrándoménjétől közvetlenül 5’-irányban lévő régiónak megfelelő - „forward” láncindító oligonukleotidok, valamint a következő - CD5-, illetve CD7szekvenciákkal és a ζ-szekvenciával átfedő, Sacl-helyet tartalmazó - reverz oligonukleotidok alkalmazásával' végzett polimeráz láncreakcióval állítottuk elő:

CD5:ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (12. azonosító számú, szekvencia);

CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (13. azonosító számú szekvencia).

A polimeráz láncreakcióval kapott CD5 és CD7 terméket BamHI-gyel és Sacl-gyel emésztettük, majd BamHI-gyel és Sacl-gyel emésztett CD16^E60* konstrukcióba ligáltuk, és a ζ-szekvencia BamHIhelytől Sacl-helyig terjedő szakaszát a CD7-fragmenssel helyettesítettük. A CD16:CD5- és CD16:CD7konstrukció előállítása érdekében a CD5- és CD7-fragmenst -Notl-helyet, valamint a CDS 416. glutaminja után, illetve a CD7 193. alaninja után stopkodont (UAA) kódoló - láncindító alkalmazásával végzett polimeráz láncreakcióval állítottuk elő. A CD5- és CD7PCR-fragmenst BamHI-gyel és Notl-gyel emésztettük, és a ΰ016:ζΑ8ρ66*^οηδΙη±οίό63 inszertáltuk.

A ζ citolitikus szignáltranszdukáló motívum N-terminális aminosavainak in vitro mutagenezise

A ζ-motívumon belüli Sacl-helytől kezdődő, és az eredeti aminosavszekvencia 48. aszparaginját szerűire (N48S), 50. leucinját szerűire (L50S) és 51. tirozinját fenil-alaninra (Y51F) változtató szintetikus láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk, melyek alkalmazásával polimeráz láncreakciót végeztünk, és a kapott fragmenseket visszajuttattuk a vad típusú CD16:7^(48-65)konstrukcióba.

A ζ citolitikus szignáltranszdukáló motívum C-terminális aminosavainak in vitro mutagenezise

A stopkodontól 3’-irányba lévő Notl-helytől kezdődő, és az eredeti aminosavszekvencia 60. glutaminsavát

HU 221 603 Bl glutaminra (E60Q), 61. glutaminsavát glutaminra (E61Q), 62. tirozinját fenil-alaninra vagy szerinre (Y62F vagy Y62S), 63. aszparaginsavát pedig aszparaginra (D63N) változtató szintetikus láncindító oligonukleotidokat szintetizáltunk, és ezek alkalmazásával poli- 5 meráz láncreakciót végeztünk, majd a kapott ffagmenseket - a BamHI-helytől a Notl-helyig - a vad típusú CD16: ζόό^οηδίηόωίόΐκι szubklónoztuk.

CD16:7:C,(33- 65)-, CD16.7 :^(71-104)- és

CD16:7 :^(104-137)-kimérakonstrukciók 10

A CGC GGG GCG GCC AGG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (14. azonosító számú) nukleotidszekvenciát tartalmazó láncinditó oligonukleotid alkalmazásával végzett polimeráz láncreakcióval olyan CD7 transzmembrándomént állítottunk elő, amely a 15 transzmembrán és az intracelluláris dómén közötti kapcsolódásnál Miül- és Notl-helyet tartalmazott. A kapott PCR-fragmenst BamHI-gyel és Notl-gyel emésztettük, majd visszainszertáltuk a CD16:7^(48-65)-konstrukcióba. A ζ-lánc 33-65., 71-104. és 104-137. ami- 20 nosavait kódoló ffagmenseket polimeráz láncreakcióval kaptuk, amihez a „forward” láncindítók 5’-végén lévő Mlul-helyet tartalmazó láncindítót és a reverz láncindítók 5’-végén lévő stopkodont és Notl-helyet tartalmazó láncinditót alkalmaztunk. A restrikciós helyek - 25 a restrikciós enzimes hasítás biztosítása érdekében - a láncinditó 5’-végétől hat nukleotidnyi távolságban helyezkedtek el.

ζ-33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (15. azonosító számú szekven- 30 cia);

ζ-71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (16. azonosító számú szekvencia); ζ-104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (17. azonosító számú szekvencia). 35 Deléciós FcRyllA-mutánsok előállítása

A teljes hosszúságú konstrukciók esetében alkalmazott eljárással azonos módon végzett polimeráz láncreakcióval -C-tenninális szekvenciájukban deléciót hordozó - FcRÜA-mutánsokat állítottunk elő, melyekben a 282. 40 és 298. tirozint kódoló nukleotidokat stopkodonná (TAA) változtattuk Az N-terminális deléciókat úgy hoztuk létre, hogy az intracelluláris dómén egyre kisebb részét kódoló ffagmenseket polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk, amihez olyan oligonukleotidokat alkalmaz- 45 tünk, melyek lehetővé tették, hogy a kapott fragmenseket - a CD16 extracelluláris doménjét, az ehhez fuzionált CD7-transzmembrándomént (amely Mlul-helyben végződik) és a transzmembrán és az intracelluláris dómén közötti kapcsolószakaszt kódoló expressziós 50 plazmid Miül- és Noű-helye közé inszertáljuk.

Egyéb megvalósítási módok

A fentebb leírt példákban bemutattuk, hogy a ζ-, τιvagy γ-kimérák aggregációja T-sejtekben elősegíti a citolitikus effektorsejt-reakciót. A ζ, η és γ exp- 55 ressziójának ismert előfordulása (T-limfociták, természetes „killer’-sejtek, bazofil granulociták, makrofágok és hízósejtek) arra utal, hogy konzervált szekvenciamotívumok a vérképzési sejtekre közösen jellemző érzékelő apparátussal lépnek kölcsönhatásba, és a recep- 60 toraggregációs események a gazda immunrendszere védekező mechanizmusának lényeges komponensét közvetítik.

A citolitikus reakció hatása és az MHC Π. osztályú receptorokat hordozó célsejtekre adott reakció hiánya azt bizonyítja, hogy a ζ-, η- vagy γ-láncon alapuló kimérák képezik az alapját az AIDS - adoptiv immunterápia segítségével történő - leküzdésében alkalmazott genetikai beavatkozásnak. Az endogén ζ- és γlánc széles körű elterjedtsége és az a tény, hogy a γlánccal asszociált Fc-receptorok különböző sejttípusokban közvetítenek citotoxicitást [Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989)], a kimérák expresszálására számos különböző sejttípust tesz alkalmassá. Például, a keringésben nagyon rövid (körülbelül 4 óra) élettartamú neutrofil granulociták a kimérák expresszálását illetően előnyös célsejtek. Nem valószínű, hogy a neutrofil granulociták HIV-vírussal történő fertőzése viruskiszabadulást eredményez, és e sejtek gyakorisága elősegíti a gazda védekezését. Az előnyösen alkalmazható gazdasejtek közé tartoznak az érett Tsejtek is, amelyek alkalmasak a retrovírusok genetikai manipulációjára [Rosengerg: Sci. Am. 262, 62 (1990)]. Rekombináns IL-2 segítségével a T-sejtek tenyészetben viszonylag könnyen szaporíthatok, s az így megnövelt populációk a keringésbe visszajuttatva rendszerint korlátozott élettartamúak [Rosenberg és ;

munkatársai: N. Engl. J. Med. 323, 570 (1990)]. I

Megfelelő feltételek mellett a CD4-kimérákat exp- t resszáló sejtek HIV-felismerése mitogén stimulusokat j kelthet, ami lehetővé teszi, hogy az ilyen sejtpopuláció } dinamikusan reagáljon a vírusfertőzésre. Bár találmá- j nyunkban a fúziós proteinek citolitikus T-limfociták- 1 bán mutatott viselkedésére összpontosítottunk, a kimé- | rák „helper’-limfocitákban történd expressziója a cito- I kinek olyan „HIV-mobilizált” forrását biztosíthatja, f ami megakadályozhatja a „helper’-sejtpopuláció AIDS f esetén megfigyelhető összeomlását. A vírusfertőzéssel szembeni rezisztencia - vírusbehatolási lépéstől eltérő stádiumban történő - kialakításának számos lehetőségének leírásai [Friedman és munkatársai: Natúré 335,

452 (1988); Green és munkatársai: Cell 58, 215 (1989); Malim és munkatársai: Cell 58, 205 (1989);

Trono és munkatársai: Cell 59, 113 (1989); Bionocore és munkatársai: Natúré 345, 625 (1990)] arra utalnak, hogy a vírustermelődés intracelluláris működési helyű, megfelelő anyagok expressziójával történő - megakadályozása céljából CD4-kimérákat hordozó sejtek alakíthatók ki. ;

Az önálló kimérák azon képessége, hogy a T-limfociták számára szignálokat továbbítanak, lehetővé teszi a retrovirusokkal genetikailag manipulált limfociták in vivő szabályozását. A komplementkötő domének eltávolítása érdekében génsebészeti módszerekkel manipulált specifikus IgM-antitestek által közvetített keresztkötési stimulusok elősegíthetik az ilyen limfociták számának in situ növekedését, míg a hasonló specifikus (pél- · dául a kiméraláncban létrehozott aminosawáltozásokat felismerő) IgG-antitestekkel végzett kezelés szelektí- r ven csökkentheti a manipulált populációt Ezen túlme24

HU 221 603 Bl nőén, a CD4 elleni IgM-antitestek a CD4^-kimérákat expresszáló Jurkat-sejtekben a kalciumion-mobilizációhoz a nem igényelnek további keresztkötésképzést.

A sejtpopulációk szabályozásának ismételt, testen kívüli szaporítás igénybevétele nélküli szabályozási képes- 5 sége jelentősen növelheti a génsebészeti módszerekkel manipulált T-sejtekhez ajánlott jelenlegi eljárások alkalmazhatóságát és hatékonyságát.

Bár a találmány szerinti készítményeket és eljárásokat a találmány előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás megvalósítási módjaiban különböző változtatások hajthatók végre, anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1728 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGC GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGCAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGCA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG AGGCGGAGAG GCAAGGCGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1389 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

100

150

200

250

300

350 j

400

450 l

500 1

550 i

600 5

650 |

700 j

750 Ϊ

800 j

850 f

900 I

950 ¹

1000

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

1400

1450

1500

1550 i1600

1650

1700

1728

HU 221 603 Bl

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTCCAATTC CTAGTCTTCC GATTGACTCC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TCGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200 TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1599 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50

GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100

GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150

TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGCCTC 200

CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250

GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300

ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350

GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400

TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450

CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500

GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550

GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600

GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650

ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700

GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750

TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800

CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850

TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900

CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950

CAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGCCGACCCA 1000 g

CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050

GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 r

GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150

HU 221 603 Bl

TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC 1250 CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300 AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG 1400 AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450 AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500 CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550 CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 575 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTÍPUS: fehérje

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val

Glu

Phe 195

Lyu

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin 205

Lys

Al a

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Lys

Glu 215

Gly

Glu

Gin

Val

Glu 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu 225

Al a

Phe

Thr

Val

Glu 230

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser 235

Gly

Glu

Leu

Trp

Trp 240

Gin

Al a

Glu

Arg

Al a 245

Ser

Lys

Ser 250

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp 255

Leu

Lys

Asn

Lys

Glu 260

Val

Ser

Val

Lys

Arg 265

Val

Thr

Gin

Asp

Pr o 270

Lys

Leu

Gin

Met

Gly 275

Lys

Leu

Pro

Leu 280

His

Leu

Thr

Leu

Pro 285

Gin

Ala

Leu

Pro

Gin 290

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly 295

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a 300

Leu

Glu

Al a

Lys

Thr 305

Gly

Lys

Leu

His

Gin 310

Glu

Val

Asn

Leu

Val 315

Val

Met

Arg

Al a

Thr 320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn 325

Leu

Thr

Cys

Glu

Val 330

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser 335

Pro

Lys

Leu

Me t

Leu 340

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu 345

Asn

Lys

Glu

Al a

Lys 350

Val

Ser

Lys

Arg

Glu 355

Lys

Pro

Val

Trp

Val 360

Leu

Asn

Pr o

Glu

Al a 365

Gly

Met

Trp

Gin

Cys 370

Leu

Ser

Asp

Ser 375

Gly

Gin

Val

Leu

Leu 380

Glu

Ser

Asn

Ile

Lys 385

Val

Leu

Pro

Thr

Trp 390

Ser

Thr

Pro

Val

Hi s 395

Al a

Asp

Pro

Lys

Leu 400

Cys

Tyr

Leu

Asp 405

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile 410

Tyr

Gly

Val

Ile

Ile 415

Thr

Al a

Leu

Tyr

Leu 420

Arg

Al a

Lys

Phe

Ser 425

Arg

Ser

Al a

Glu

Thr 430

Al a

Asn

Leu

Gin 435

Asp

Pro

Asn

Gin

Leu 440

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn 445

Leu

Gly

Arg

Glu 450

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu 455

Glu

Lys

Arg

Al a 460

Arg

Asp

Pro

Glu

Me t 465

Gly

Lys

Gin

Gin 470

Arg

Asn

Pro 475

Gin

Glu

Gly

Val

Tyr 480

Asn

Ala

Leu

Gin

Lys 485

Asp

Lys

Me t

Pro

Glu 490

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile 495

Gly

Thr

Lys

Gly

Glu 500

Arg

Gly

Lys 505

Gly

His

Asp

Gly

Leu 510

Tyr

Gin

Asp

Ser

His 515

Phe

Gin

Ala

Val

Gin 520

Phe

Gly

Asn

Arg

Arg 525

Glu

Arg

Glu

Gly

Se r 530

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr 535

Leu

Gly

Leu

Arg

Al a 540

Arg

Pro

Lys

Gly

HU 221 603 Bl

Glu

Ser

Thr

Gin

Ser

Gin

Ser

Cys

Al a

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

555

550

565

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Se r

Pro

Trp

Pro

Ser

Se r

Ser

Gin

Leu

565

570

575

Met

Asn

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Arg

His

Leu

Val

Leu

Gin

Leu

1

5

10

15

Al a

Leu

Pro

Al a

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Al a

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Al a

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180 185 190 τ

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: j

HOSSZA: 462 aminosav |

TÍPUSA: aminosav I

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro

Phe

Arg

His

Leu 10

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

Al a

Leu

Pro 20

Al a

Thr

Gin

Gly 25

Asn

Lys

Val

Leu 30

Gly

Lys

Gly

Asp 35

Thr

Val

Glu

Leu

Thr 40

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin 45

Lys

Ser

Ile

Gin 50

Phe

His

Trp

Lys

Asn 55

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys 60

Ile

Leu

Gly

Asn

Gin 65

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr 70

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys 75

Leu

Asn

Asp

Arg

Alá 80

Asp

Ser

Arg

Ser 85

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly 90

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile 95

Ile

Lys

Asn

Leu

Lys 100

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp 105

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu 110

Val

Glu

Asp

Gin

Lys 115

Glu

Val

Gin

Leu 120

Leu

Val

Phe

Gly

Leu 125

Thr

Al a

Asn

Ser

Asp 130

Thr

His

Leu

Gin 135

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr 140

Leu

Thr

Leu

Glu

Ser 145

Pro

Gly

Ser

Ser 150

Pro

Ser

Val

Gin

Cys 155

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly 160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly 165

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser 170

Val

Ser

Gin

Leu

Glu 175

Leu

Gin

Asp

Ser

Gly 180

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr 185

Val

Leu

Gin

Asn

Gin 190

Lys

Val

Glu

Phe 195

Lys

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin 205

Lys

Alá

Ser

HU 221 603 Β1

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Lys

Lys Glu 215

Gly

Glu

Gin

Val

G1 u 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu

Alá

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Al a

Glu

Arg

Al a

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Al a

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Al a

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a

Leu

Glu

Al a

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

Hi s

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Al a

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Me t

Leu

Se r

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Al a

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pr o

Val

His

Al a

Asp

Pro

Gin

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Ile

Leu

Asp

Al a

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ile

Val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cys

Arg

Leu

Lys

Ile

Gin

Val

Arg

Lys

Al a

Asp

I le

Al a

420

425

430

Ser

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Al a

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Asn

435

440

445

Gin

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Lys

His

Glu

Lys

Pro

Gin

450

455

460

462

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 532 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Asn Arg Gly Val

Pro

Phe

Arg His

Leu 10

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

1

5

Alá

Leu

Pro

Al a

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Alá

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Alá

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

Hi s

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

HU 221 603 Bl

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly 165

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser 170

Val

Ser

Gin

Leu

Glu 175

Leu

Gin

Asp

Ser

Gly 180

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr 185

Val

Leu

Gin

Asn

Gin 190

Lys

Val

Glu

Phe 195

Lys

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin 205

Lys

Alá

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Lys

Glu 215

Gly

Glu

Gin

Val

Glu 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu 225

Al a

Phe

Thr

Val

Glu 230

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser 235

Gly

Glu

Leu

Trp

Trp 240

Gin

Al a

Glu

Arg

Alá 245

Ser

Lys

Ser 250

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp 255

Leu

Lys

Asn

Lys

Glu 260

Val

Ser

Val

Lys

Arg 265

Val

Thr

Gin

Asp

Pr o 270

Lys

Leu

Gin

Met

Gly 275

Lys

Leu

Pro

Leu 280

His

Leu

Thr

Leu

Pro 285

Gin

Al a

Leu

Pro

Gin 290

Tyr

Al a

Gly

Ser

Gly 295

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a 300

Leu

Glu

Alá

Lys

Thr 305

Gly

Lys

Leu

His

Gin 310

Glu

Val

Asn

Leu

Val 315

Val

Me t

Arg

Al a

Thr 320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn 325

Leu

Thr

Cys

Glu

Val 330

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser 335

Pro

Lys

Leu

Met

Leu 340

Se r

Leu

Lys

Leu

Glu 345

Asn

Lys

Glu

Al a

Lys 350

Val

Ser

Lys

Arg

Glu 355

Lys

Pro

Val

Trp

Val 360

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a 365

Gly

Met

Trp

Gin

Cys 370

Leu

Ser

Asp

Ser 375

Gly

Gin

Val

Leu

Leu 380

Glu

Ser

Asn

Ile

Lys 385

Val

Leu

Pro

Thr

Trp 390

Ser

Thr

Pr o

Val

His 395

Al a

Asp

Pro

Lys

Leu 400

Cys

Tyr

Leu

Asp 405

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile 410

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu 415

Thr

Al a

Leu

Phe

Leu 420

Arg

Val

Lys

Phe

Ser 425

Arg

Ser

Al a

Glu

Pro 430

Pro

Al a

Tyr

Gin

Gin 435

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu 440

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn 445

Leu

Gly

Arg

Glu 450

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu 455

Asp

Lys

Arg

Gly 460

Arg

Asp

Pro

Glu

Met 465

Gly

Lys

Pro

Arg 470

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin 475

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn 480

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp 485

Lye

Me t

Al a

Glu

Al a 490

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly 495

Met

Lys

Gly

Glu

Arg 500

Arg

Gly

Lys

Gly 505

His

Asp

Gly

Leu

Tyr 510

Gin

Gly

Leu Leu

Ser Pro

Thr 515 Pro

Al a Arg

Thr

Lys

Asp

Thr 520

Tyr

Asp

Alá

Leu

His 525

Me t

Gin

Al a

530

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: +

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ]

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: Ϊ

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: h

HOSSZA: 50bázis

HU 221 603 Bl

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: CGCGGGCGGC CGCTA

A12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 48 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC GGCCGAATTC

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A.,14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC AGA

CTGGGCCTCA 50

TG 42

TTATCCCG 48 }b h

HU 221 603 BI

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 26 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 40 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG 40

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU 221 603 Β1

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 171 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly

Ser Gin Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro 20 25

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile 35 40

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg 50 55

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys 65 70

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gin Val His 85

Val Glu Leu Asp Pro Alá Thr Val Alá 100 105

Alá Ile Thr Leu Leu Leu Alá Leu Gly 115 120

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Alá Alá 130 135

Asn Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg

145 150

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Alá Arg

165

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 182 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Glu Gin Gly Lys Gly Leu Alá Val

Val	Leu	Alá	Thr	Leu 15	Leu
Glu	Glu	Leu	Glu 30	Asp	Arg
Trp	Val	Glu 45	Gly	Thr	Val
Asp	Leu 60	Gly	Lys	Arg	Ile
Gly 75	Thr	Asp	Ile	Tyr	Lys 80
Arg	Me t	Cys	Gin	Ser 95	Cys
Ile	Ile	Val	Thr 110	Asp	Val
Phe	Cys	Phe 125	Al a	Gly	Hi s
Thr	Gin 140	Al a	Leu	Leu	Arg
Arg 155 Lys	Asp	Asp	Al a	Gin	Tyr 160

Ile Leu Alá Ile Ile Leu 15

HU 221 603 Bl

Leu Gin Gly Thr Leu

Al a

Gin Ser

Ile 25

Lys Gly Asn Hi s

Leu 30

Val

Lys

20

Val

Tyr

Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Cys

Asp

Al a

35

40

45

Glu

Al a

Lys

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Lys

Asp

Gly

Lys

Me t

Ile

Gly

Phe

50

55

60

Leu

Thr

Glu

Asp

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Al a

Lys

Asp

65

70

75

80

Pro

Arg

Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys

Gly

Ser

Gin

Asn

Lys

Ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Asn

Cys

Ile

Glu

Leu

Asn

Al a

100

105

110

Al a

Thr

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Al a

Glu

Ile

Val

Ser

Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Al a

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile

Al a

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

Arg

Al a

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp

Gin

Tyr

Ser

Hi s

Leu

Gin

Gly

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Arg

Asn

180

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 220 aminosav TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA:	lineáris
MOLEKULATÍPUS: aminosav A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe
Leu Ser Tyr	5 10 15 Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gin Ala Leu Arg Val Glu
Gly Gly Pro	20 25 30 Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu
35 Thr Cys Glu	40 45 Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn Ile Thr Trp Trp Phe Ser
50 Leu Gin Ser	55 60 Asn Ile Thr Trp Pro Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gin
65 Gly Thr Thr	70 75 80 Gly Gin Leu Phe Phe Pro Glu Val Asn Lys Asn Thr Gly
Ala Cys Thr	85 90 95 Gly Cys Gin Val Ile Glu Asn Asn Ile Leu Lys Arg Ser
Cys Gly Thr	100 105 110 Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu
115 Asp Met Gly	120 125 Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
130 Ile Leu Leu	135 140 Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
145 Lys Arg Trp	150 155 160 Gin Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr
Glu Asp Glu	165 170 175 Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
Tyr Glu Asp	180 185 190 Ile Ser Arg Gly Leu Gin Gly Thr Tyr Gin Asp Val Gly
195 200 205 Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gin Leu Glu Lys Pro 210 215 220 A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: p

HOSSZA: 228 aminosav

HU 221 603 Bl

TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: aminosav

Met Alá Thr

Leu

Val 5

Leu Ser

Ser

Met

Pro 10

Cya

His

Trp

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Phe

Ser

Gly

Glu

Pro

Val

Pro

Al a

Met

Thr

Ser

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pr o

Cys

Ser

Gin

Ile

Trp

Gin

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Al a

Lys

Arg

Ser

Met

Val

Lys

Phe

His

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

His

Ser

Gly

Alá

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

Ile

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Gin

Asn

Ile

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

Ile

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Lys

Cys

Asp

Ser

Al a

Asn

115

120

125

His

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Se r

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

Ile

145

150

155

160

Ile

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Ile

Leu

Phe

Ile

Val

Pro

Ile

165

170

175

Phe

Leu

Asp

Lys

Asp

Gly

Lys

Al a

Gly

Met

Glu

Asp

180

185

190

Hi s

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Ile

Asp

Gin

Thr

Al a

Thr

Tyr

Glu

Asp

195

200

205

Ile

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

Glu

His

210 215 220

Pro Gly Gin Glu 225

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1304

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC 50 CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG 100 CAAGGCCACA ATCAACCGCC GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC 150 TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG 200 GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA 250 GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA 300 ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT 350 GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA 400 GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC 450 AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC 500 ACCCACCTGC TTCAGCGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC 550 TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC 600 AGCCCGCGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC 650 ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT 700 AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA 750 AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA 800 AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC 850 CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA 900 AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC 950

HU 221 603 Bl

CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TCCTOGTGAT CAGACCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCC

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 398

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

1000

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1304

Met	Asn	Arg	Gly	Val	Pro	Phe	Arg
Al a	Leu	Leu	Pro 20	j Al a	Al a	Thr	Gin
Lys	Gly	Asp 35	Thr	Val	Glu	Leu	Thr 40
lle	Gin 50	Phe	His	Trp	Lys	Asn 55	Ser
Gin 65	Gly	Ser	Phe	Leu	Thr 70	Lys	Gly
Asp	Ser	Arg	Arg	Ser 85	Leu	Trp	Asp
Lys	Asn	Leu	Lys 100	lle	Glu	Asp	Ser
Asp	Gin	Lys 115	Glu	Glu	Val	Gin	Leu 120
Ser	Asp 130	Thr	His	Leu	Leu	Gin 135	Gly
Ser 145	Pro	Pro	Gly	Ser	Ser 150	Pro	Ser
Lys	Asn	lle	Gin	Gly 165	Gly	Lys	Thr
Gin	Asp	Ser	Gly 180	Thr	Trp	Thr	Cys
Val	Glu	Phe 195	Lys	lle	Asp	lle	Val 200
Ser	lle 210	Val	Tyr	Lys	Lys	Glu 215	Gly
Leu 225	Alá	Phe	Thr	Val	Glu 230	Lys	Leu
Gin	Al a	Glu	Arg	Al a 245	Ser	Ser	Ser
Lys	Asn	Lys	Glu 260	Val	Ser	Val	Lys
Gin	Met	Gly 275	Lys	Lys	Leu	Pro	Leu 280
Pro	Gin 290	Tyr	Al a	Gly	Ser	Gly 295	Asn
Thr 305	Gly	Lys	Leu	Hi s	Gin 310	Glu	Val
Gin	Leu	Gin	Lye	Asn 325	Leu	Thr	Cys
Lys	Leu	Me t	Leu	Se r	Leu	Lys	Leu

340

His	Leu 10	Leu	Leu	Val	Leu	Gin 15	Leu
Gly 25	Asn	Lys	Val	Val	Leu 30	Gly	Lys
Cys	Thr	Al a	Ser	Gin 45	Lys	Lys	Ser
Asn	Gin	lle	Lys 60	lle	Leu	Gly	Asn
Pro	Ser	Lys 75	Leu	Asn	Asp	Arg	Alá 80
Gin	Gly 90	Asn	Phe	Pro	Leu	lle 95	lle
Asp 105	Thr	Tyr	lle	Cys	Glu 110	Val	Glu
Leu	Val	Phe	Gly	Leu 125	Thr	Alá	Asn
Gin	Ser	Leu	Thr 140	Leu	Thr	Leu	Glu
Val	Gin	Cys 155	Arg	Ser	Pro	Arg	Gly 160
Leu	Ser 170	Val	Ser	Gin	Leu	Glu 175	Leu
Thr 185	Val	Leu	Gin	Asn	Gin 190	Lys	Lys
Val	Leu	Al a	Phe	Gin 205	Lys	Al a	Ser
Glu	Gin	Val	Glu 220	Phe	Ser	Phe	Pro
Thr	Gly	Ser 235	Gly	Glu	Leu	Trp	Trp 240
Lys	Ser 250	Trp	lle	Thr	Phe	Asp 255	Leu
Arg 265	Val	Thr	Gin	Asp	Pro 270	Lys	Leu
His	Leu	Thr	Leu	Pro 285	Gin	Al a	Leu
Leu	Thr	Leu	Alá 300	Leu	Glu	Al a	Lys
Asn	Leu	Val 315	Val	Met	Arg	Al a	Thr 320
Glu	Val 330	Trp	Gly	Pro	Thr	Ser 335	Pro
Glu 345	Asn	Lys	Glu	Al a	Lys 350	Val	Ser

fa

HU 221 603 Bl

Lys Arg Glu Lys

Pro Val

Trp

Val 360

Leu

Asn

Pro

Glu Alá Gly 365

Me t

Trp

355

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

Hi s

Al a

Asp

Pro

385

390

395

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 719

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG GCGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG GTGCTAGCT

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 203

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS : aminosav

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met	Asn	Arg	Gly
Al a	Leu	Leu	Pro 20
Lys	Gly	Asp 35	Thr
Ile	Gin 50	Phe	His
Gin 65	Gly	Ser	Phe
Asp	Ser	Arg	Arg
Lys	Asn	Leu	Lys 100
Asp	Gin	Lys 115	Glu
Ser	Asp 130	Thr	His
Ser 145	Pro	Pro	Gly
Lys	Asn	Ile	Gin

Val 5	Pro	Phe	Arg
Al a	Alá	Thr	Gin
Val	Glu	Leu	Thr 40
Trp	Lys	Asn 55	Ser
Leu	Thr 70	Lys	Gly
Ser 85	Leu	Trp	Asp
Ile	Glu	Asp	Ser
Glu	Val	Gin	Leu 120
Leu	Leu	Gin 135	Gly
Se r	Ser 150	Pro	Ser
Gly 165	Gly	Lys	Thr

His	Leu 10	Leu	Leu
Gly 25	Asn	Lys	Val
Cys	Thr	Al a	Ser
Asn	Gin	Ile	Lys 60
Pro	Ser	Lys 75	Leu
Gin	Gly 90	Asn	Phe
Asp 105	Thr	Tyr	Ile
Leu	Val	Phe	Gly
Gin	Ser	Leu	Thr 140
Val	Gin	Cys 155	Arg
Leu	Ser 170	Val	Ser

Val	Leu	Gin 15	Leu
Val	Leu 30	Gly	Lys
Gin	Lys	Lys	Ser
45
Ile	Leu	Gly	Asn
Asn	Asp	Arg	Alá 80
Pro	Leu	Ile 95	Ile
Cys	Glu 110	Val	Glu
Leu	Thr	Al a	Asn
125
Leu	Thr	Leu	Glu
Ser	Pro	Arg	Gly 160
Gin	Leu	Glu 175	Leu

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550 í

600 I

650 i

700 ΐ

719 i

HU 221 603 BI

Gin Asp Ser Gly	Thr Trp Thr Cys	Thr 185	Val	Leu Gin	Asn Gin Lys Lys 190
	180
Val	Glu Phe Lys	Ile Asp Ile Val	Val	Leu	Alá
	195	200
A 32.	AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 768

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTAGCAGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC 50 CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 100 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT 150 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG 200 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC 250 AACAGCACGT ACCGGGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG 300 GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG 350 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 400 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCAGGT 450 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 500 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC 550 GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA 600 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG 650 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGG 700 CTGCAACTGG ACGAGACCTG TGCTGAGGCC CAGGACGGGG AGCTGGACGG 750 GCTCTGGACG ACGGATCC 768

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 254

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu 1

Pro

Lys

Ser

Cys Asp Lys 5

Thr

His

Thr 10

Cys

Pro

Cys

Pro 15

Al a

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

20

25

30

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

35

40

45

Val

Asp

Val

Ser

Hi s

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

50

55

60

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Alá

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

65

70

75

80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Alá

100

105

110

Leu

Pro

Alá

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Al a

Lys

Gly

Gin

Pro

115

120

125

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Alá

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

HU 221 603 Β1

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Se r

Arg

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Al a

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Leu

Gin

Leu

Asp

Glu

Thr

Cys

Al a

Glu

225

230

235

240

Al a

Gin

Asp

Gly

Glu

Leu

Asp

Gly

Leu

Trp

Thr

Asp

Pro

245

250

A 34.

AZONOSÍT

Ó SZÁMÚ SZEKVENCIA ADA

TAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 174

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCAAGGGCCT CTGCCCTCCC TGCCCCACCG ACAGGCTCCG CCCTCCCTGA 50 CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC GCCAGCAGCC TCTGCCCTCC 100 CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC TCGGGCTGGG CCTGGGGGTG 150 GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT 174

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 58 bázis

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Arg Alá Ser Alá Leu Pro Alá Pro Pro Thr Gly Ser Alá Leu Pro 15 10 15

Asp Pro Gin Thr Alá Ser Alá Leu Pro Asp Pro Pro Alá Alá Ser Alá

25 30

Leu Pro Alá Alá Leu Alá Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu

40 45

Gly Val Alá Cys Val Leu Alá Arg Thr Arg

55

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 345

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACGCGTTTCA GCAGGAGCGC AGAGCCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA 50 CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG TACGATGTTT 100 TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGAGAAGG 150 AAGAACCCTC AGGAAGGCCT GTACAATGAA CTGCAGAAAG ATAAGATGGC 200 GGAGGCCTAC AGTGAGATTG GGATGAAAGG CGAGCGCCGG AGGGGCAAGG 250 GGCACGATGG CCTTTACCAG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA GGACACCTAC 300 GACGCCCTTC ACATGCAGGC CCTGCCCCCT CGCTAAAGCG GCCGC 345

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 111

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Arg Phe Ser Arg Ser Alá Glu Pro Pro Alá Tyr Gin Gin Gly Gin 15 10 15

HU 221 603 Bl

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

Asp

20

25

30

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

35

40

45

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

50

55

60

Lys

Met

Al a

Glu

Alá

Tyr

Ser

Glu

lle

Gly

Me t

Lys

G1 y

Glu

Arg

65

70

75

80

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Thr

Al a

Thr

85

90

95

Lys

Asp

Thr

Tyr

Asp

Al a

Leu

Hi s

Me t

Gin

Al a

Leu

Pro

Arg

100

105

110

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly 1 5 10 15

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Alá Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu 15 10 15

Leu Asp Gly

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 12 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Gly Glu Pro Gin Leu Cys Tyr lle Leu Asp Alá 1 5 10

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Alá Asp Pro Gin Leu Cys Tyr lle 15 10 15

Leu Asp Alá

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ : nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU 221 603 Bl

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr 1 5 10

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Ser Pro Pro Gly Alá Asp Pro Lys Leu Cys Tyr 1 5 10

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 142 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Leu Asp Gly 15

Gin

Ser

Phe

Gly

Leu

Asp

Pr o

Lys

Leu

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

1

5

10

15

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

Alá

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

20

25

30

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Al a

Glu

Pro

Al a

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

35

40

45

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

50

55

60

Leu

Asp

Lys

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

65

70

75

80

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

85

90

95

Met

Alá

Glu

Alá

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Me t

Lye

Gly

Glu

Arg

100

105

110

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Thr

Al a

Thr

Lys

115

120

125

Asp

Thr

Tyr

Asp

Al a

Leu

Hi s

Met

Gin

Al a

Leu

Pro

Arg

130

135

140

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Alá

Glu

Pro

Al a

Tyr

Gin

Gly

1

5

10

15

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris

4— jg

HU 221 603 Bl

MOLEKULÁTÍPUS: fehéqe

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Ls Leu Val Lys Lys Phe Arg Gin Lys Ls Gin Arg Gin Asn Gin 15 10 15

Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 20 25 30

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehéqe

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg

Thr

Gin

lle

Lys

Leu

Cys

Ser

Trp

Arg

Asp

Lys

Asn

Ser

Al a

1

5

10

15

Alá

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁTÍPUS: fehéqe

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Thr 1

Arg

Phe

Ser 5

Arg

Ser

Alá Glu

Pro 10

Pr o

Alá

Tyr

Gin

Gin 15

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehéqe

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg

Thr

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

1

5

10

15

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Alá

Glu

Al a

20

25

30

Tyr

Ser

Glu

lle

AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehéqe

AZ 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Thr Arg lle Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 15 10 15

HU 221 603 Bl

Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Alá Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 20 25 30

Alá Leu His Met Gin Alá 35

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: DNS

AZ 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGATCCCAAG GCCAGGCTAA AGCCGAAGCC GCGAAGGCCG AGGCTAAGGC

CGAAGCAGAT 60

CTG 63

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 20aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehéije

AZ 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Pro Lys Alá Glu Alá Lys Alá Glu Alá Lys Alá Glu Alá Lys Alá

5

Glu Alá Asp Leu

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 30

1. A CD4 - HIV-fertőzött sejt specifikus felismerésére képes, de HIV-fertózést nem közvetítő - fragmensét magában foglaló extracelluláris részt tartalmazó, a HIV-fertőzött sejt megsemmisítésére indító szignált a 35 terápiás sejteknek nem továbbító, membránkötött, proteinszerű kimérareceptort expresszáló terápiás sejtek alkalmazása emlős HIV-fertőzésének kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a CD4- 40 fragmens a CD41-394. vagy 1-200. aminosavaiból áll.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kimérareceptorban a CD4-fragmenst a CD7 - 26. ábrán bemutatott - transzmembrándoménje vagy az emberi IgGl-molekula - 25. ábrán bemutatott - csukló- 45 („hinge”), CH2- és CH3-doménje választja el az intracelluláris résztől.
4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kimérareceptorban a CD4-fragmens legalább 48 angström vagy legalább 72 angström távolságra van a terápiás sejt membránjától.
5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kimérareceptor tartalmazza a CD7 transzmembrán részét, a CD5 transzmembrán részét vagy a CD34 transzmembrán részét.
6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kimérareceptorban a CD4-fragmenst egy vagy több a-hélix választja el a terápiás sejt membránjától.
7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a terápiás sejt T-sejt, B-sejt, neutrocita, dendritsejt vagy follikuláris dendritsejt.