HU218822B

HU218822B - Eljárás idegen gént tartalmazó termőképes transzgén kukorica előállítására

Info

Publication number: HU218822B
Application number: HU083/91A
Authority: HU
Inventors: Günter Donn; Dénes Dudits; Sándor Morocz; János Németh
Original assignee: Hoechst Ag.
Priority date: 1990-06-23
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 2000-12-28
Also published as: JP3878678B2; JPH04271733A; DK0469273T3; IE912164A1; PT98071A; HUT58807A; EP0469273A1; ES2213740T3; ATE256192T1; PT98071B; DE59109256D1; EP0469273B1; HU912083D0; ZA914787B; TR26581A

Description

A találmány tárgya eljárás idegen gént tartalmazó termőképes transzgén kukorica előállítására.

A kétszikű növények lényegében Ti-plazmidvektor rendszeren keresztül agrobaktérium tumefaciens segítségével transzformálhatok. Ez a rendszer azonban egyszikű növényeknél közvetlenül nem alkalmazható. Potrykus és munkatársai [Mól. Gén. Génét. 199, 183 (1985)], valamint Lörz és munkatársai [Mól. Gén. Génét. 199, 178 (1985)] kimutatták, hogy egyszikű növények növényi protoplasztja a genomba idegen DNS-t stabilan fel tud venni. Az előrelépést akadályozta azonban, hogy a protoplasztot nem tudták termőképes növénnyé regenerálni.

Az utóbbi években ezért intenzív kutatások folytak abból a célból, hogy olyan genotípust és eljárást találjanak, amely lehetővé teszi a növény regenerálásának kézbentartását. A 292 435 számú európai közrebocsátási irat olyan eljárást ismertet, amelynek segítségével egy nyálkától mentes, lágy (omlós), granulált kukoricakalluszból kiindulva termőképes növényt lehet előállítani. Shillito és munkatársai [Bio/Technology, 7, 581 (1989)] ebben az összefüggésben megfigyelték, hogy termőképes növény regenerálásához szükséges az is, hogy olyan kalluszszuszpenziós kultúrából induljanak ki, amelyből osztódó és növénnyé regenerálható protoplasztkultúra állítható elő.

Egy 7-8 hónapos in vitro tenyésztési idő után Shillito és munkatársai olyan növényeket kaptak, amelyek életképes utódokkal rendelkeznek, ezek azonban a morfológia és a reproduktivitás vonatkozásában különböző rendellenességeket mutattak.

Prioli és Söndahl [Bio/Technology, 7, 589, (1989)] termőképes növény regenerálását és előállítását ismertetik Cat 100-1 jelű kukoricavonal protoplasztjából. A szerzők feltételezik, hogy a protoplaszt termőképes nővénnyé történő regenerálása különböző faktoroktól, például a genotípustól, a donorsejtek fiziológiai állapotától és a tenyésztési körülményektől függ.

A 465 875 számú európai szabadalmi irat (és ennek megfelelő 208 291 számú magyar szabadalmi irat) olyan új kukorica-genotípust ismertet, amelyből kiindulva reprodukálható módon és rövid időn belül olyan protoplaszt állítható elő, amely károsodás nélküli termőképes növénnyé regenerálható.

Az új kukorica-genotípus annyiban tér el az ismert regenerálható genotípusoktól, hogy éretlen embrióból kiindulva hormonmentes tápközegen a képződő csíranövényen a hajtásalapon egy auxin autrotróf embriogén kallusz képződik. Ez a kallusz hosszabb időn keresztül (legalább 12 hónap) hormonmentes közegen tenyészthető, amelynek során az embrióképzés képességét megőrzi. Ilyen tenyésztési körülmények között kifejlett embriók képződnek, amelyek adott esetben spontánul növénnyé fejlődnek. Emellett nagy számban képződnek járulékos embriók is, különösen megnövelt szacharóztartalmú (6-9 tömeg%) közegen. A tápközeg megváltoztatásával (a szacharóztartalmat 2-3 tömeg%-ra csökkentik, és 1-3 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat [2,4-D], illetve dikambát adnak hozzá) reprodukálható módon lágy, szemcsés kalluszképződés indukálható, amely embriogén sejtaggregációból (II. típusú kallusz) áll. Ez a II. típusú kallusz folyékony tápközegben szuszpenziós sejttenyészet formájában tovább tenyészthető, és totipotens protoplaszt izolálására alkalmas. A protoplaszt többek között genetikai transzformációhoz is felhasználható, és a találmány keretén belül ismertetett körülmények között termőképes transzgén kukoricanövénnyé regenerálható.

A találmány tárgya tehát eljárás transzgén kukoricanövény előállítására oly módon, hogy

- egy auxinautotróf kukorica-genotípus sejtszuszpenziójából enzimatikusan protoplasztot állítunk elő;

- a protoplasztot DNS-sel inkubáljuk, és a DNS-t inszertáljuk a protoplasztba;

- a DNS-t tartalmazó protoplasztból transzgén kukorica-sejtvonalat szelektálunk és regenerálunk; és

- a kukorica-sejtvonalból transzgén növényrészeket vagy növényt regenerálunk.

Mint ezt az idézett 465 875 száma európai szabadalmi leírás is ismerteti, az előnyös megvalósítási formán belül alkalmazott, erősen embriogén kukorica-sejtvonalat a Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH gyűjteményben 1990. január 6-án a Budapesti Szerződés előírásai szerint a DSM 6009 szám alatt deponáltuk. Mint ezt az idézett szabadalmi leírás ismerteti, a sejtvonalat egy kukoricanövény embriójából nyertük, amely a H 229 χ OK 281 genotípusok keresztezéséből származik. A találmány szerinti transzgén kukoricanövény előállításához a sejtvonal szuszpenziós kultúrájából protoplasztot állítunk elő, amelyet a beépítendő DNS-sel inkubálunk.

A protoplaszt előállítását a DSM 6009 számon deponált sejtvonalból roncsoló enzim, például cellulóz vagy pektináz vagy ezek keveréke segítségével végezzük. Az enzim koncentrációja széles határok között változtatható, előnyösen 0,05-4 vegyes% koncentrációban alkalmazzuk, ahol az enzim tömegét az enzimoldat térfogatához viszonyítjuk. A vizes ozmotikus oldat optimális összetételét, valamint az enzimkoncentrációt az alkalmazott szövettípus függvényében egyszerű kísérlettel megállapíthatjuk.

A protoplaszt stabilizálása érdekében a vizes oldat ozmotikusán aktív anyagokat, így mannitot, szorbitot, glükózt, szacharózt, fruktózt, kálium-nitrátot vagy a növényi tápközegek más tipikus sóit tartalmazza. Az enzimoldat ozmolaritása előnyösen 500-750 mOsm, különösen előnyösen 600-700 mOsm. A pH-érték 4,5 és 6,0 között változtatható. Az enzimoldatot előnyösen pH=5,5-6 értékre állítjuk, és 1-5 mmol/1 foszfátoldattal és 1-10 mmol/1 morfolin-etán-szulfonsawal (MES) stabilizáljuk.

A roncsoló enzim koncentrációjától függően a protoplaszt 3-20 óra alatt felszabadítható. Az enzimes inkubálás alatt az elegyet előnyösen óvatosan rázzuk. A rázást előnyösen 10-50 fordulat/perc sebességgel működő forgó rázóberendezésen végezzük.

A sejtekbe tetszőleges DNS bevihető. Előnyösen szelektálható markergénekkel dolgozunk. Ilyenekre pél2

HU 218 822 Β daként említhető a foszfino-tricin-acetil-transzferáz, az acetil-coA-karboxiláz, a glutation-S-transzferáz, a higromicin-foszfo-transzferáz, az acetolaktát-szintetáz, az

5-enol-piruvil-sikimát-foszfát-szintetáz (EPSP-szintetáz), a glutamin-szintetáz vagy a transzamináz génje. Természetesen olyan gének is bevihetők, amelyek kifejeződése a növény fejlődésével nem szelektálható. Ilyenekre példaként említhető a Bacillus thuringiensis Űendotoxinját kódoló gén vagy vírusrezisztenciát kódoló gén, például a vírus burokfehérjét (coat protein) kódoló gén. Alkalmazható továbbá a kitináz gén, valamint olyan gének, amelyek a növény fotoszintetikus teljesítőképességét javítják, például a foszfoenol-piruvát-karboxiláz génje, vagy a baktériumos aszparagin-szintetáz génje [Nakamura Μ. M. és munkatársai: Nucleic Acids Research 9, 4669 (1981)]. Előnyösen a Streptomyces viridochromogenesből származó foszfino-tricin-acetiltranszferáz génjét [Wohlleen W. és munkatársai: Gene 80,25-57 (1988)] alkalmazzuk, amely növényben történő kifejezéshez megfelelően módosítható. A fenti gén beépítésével a kukoricanövény és utódjai rezisztensek lesznek a foszfino-tricinnel (glufozinát) és a foszfinotricin-alanil-alaninnal (bialafosz) szemben.

Szintetizálás, illetve izolálás után a gén szokásos eljárásokkal, például E. coliba történő transzformálással, vagy úgynevezett „polymerase chain reaction” eljárással sokszorosítható. Az izolált funkcionális gén ezután közvetlenül vagy tetszőleges klónozó vektoron, előnyösen pBR 322, pUC 18 vagy pDH 51 klónozó vektoron [Pietrzak M. és munkatársai: Nucl. Acid Rs. 5858 (1986)] adott esetben növényben hatékony promoterrel a protoplasztba bevihető. Promoterként előnyösen alkalmazható a 35S promoter. A DNS például hisztonnal képzett komplex formájában is bevihető, mint ezt a 40 05 152 számú NSZK-beli közrebocsátási irat ismerteti.

A protoplasztinkubációhoz a DNS-t vizes oldatban szuszpendáljuk, amely puffer sókat is tartalmazhat, és egy ozmotikus hatású transzformációs pufferben lévő protoplaszthoz adjuk.

A transzformációs puffer különböző sók, előnyösen kétértékű kationokat tartalmazó sók, például magnézium-klorid vagy kalcium-klorid vagy ezek elegye, valamint cukrok, így szacharóz, glükóz vagy fruktóz, vagy cukoralkoholok, például mannit vagy szorbit vizes oldata. A só mennyisége általában 30-300 mval, a cukrok, illetve cukoralkoholok koncentrációja 50-500 mmol.

A DNS-oldat hozzáadása után mintegy 10-25 tömeg⁰/), előnyösen 6-10 tömeg% koncentrációig polietilénglikolt, előnyösen PEG 1500-8000-t adunk a keverékhez. A keveréket ezután pH=6,0-8,0, előnyösen pH=6,5-7 értéken 15-40 °C, előnyösen 20-25 °C hőmérsékleten 5 perc és 1 óra közötti, előnyösen 20-30 perc ideig inkubáljuk. Az inkubálás befejezése után a sejteket előnyösen növesztő tápközegre átoltjuk, amely szervetlen sókat, például ammónium, kálium, kalcium és magnézium sókat, valamint nitrátot, foszfátot, szulfátot, dihidrogén-foszfátot, citrátot, vitaminokat, aminosavakat, egy szintetikus auxint, például 2,4-D-t vagy dikambát, valamint cukrokat, előnyösen fruktóz, glükóz és szacharóz elegyét tartalmazza, miután a PEGet előzetesen egy vagy több mosással eltávolítottuk.

10-25 nap elteltével a túlélő és osztódásra alkalmas sejteket egy szelekciós közegen továbbtenyésztjük. A közeg a protoplaszt kallusz ozmotikus stabilizálásához előnyösen 6-10 tömeg% cukrot, előnyösen szacharózt tartalmaz. Minél idősebb a protoplaszttenyészet, annál alacsonyabb cukortartalom elegendő. Például egy 15-20 napos protoplaszttenyészetnél a közeg mintegy 9 tömeg% cukrot tartalmaz. A szelekciós közeg összetétele lényegében megegyezik a fent ismertetett növesztő közeg összetételével, és emellett egy szelekciós ágenst, például foszfino-tricint tartalmaz. A szelekciót például a 290 987 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett módon végezzük.

Az ismertetett tápközegen a transzformált protoplasztból kifejlődik a gént kifejező sejthalmaz, amely azután makroszkopikusan látható kallusszá fejlődik.

14-28 nappal a szelekció megkezdése után a kalluszt friss, előnyösen hormonmentes szelekciós közegre visszük át az embrió kifejlődésének megkönnyítése érdekében. A képződött transzgén embriót ezt követően adott esetben szelekciós ágenst tartalmazó közegen tovább tenyésztjük, amelynek során a levelek és a gyökérzet elkülönül.

Amint az in vitro növény eléri a 4-8 cm méretet, talajba kiültetjük, és klímakamrában vagy üvegházban virágzó növénnyé neveljük. A termőképes transzgén kukoricanövényt önbeporzással vagy idegen beporzással, vagyis nemes tenyészvonallal történő keresztezéssel szaporíthatjuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás egyszikű növények védelmére, amelynek során a gyomokat foszfinotricinnel vagy foszfino-tricin-alanil-alaninnal szelektive megsemmisítjük, amelynek lényege, hogy az adott területre a találmány szerinti eljárással előállítható és foszfino-tricin-acetil-transzferáz gént hordozó növényt vagy ennek utódjait ültetjük ki.

A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

Példák

Protoplasztizoláló közeg összetétele (100 ml)

Onozuka R S celluláz
(Maiji Seika, Japán)	800 mg
pektoliáz Y23
(Seishin Pharmaceutical, Japán)	40 mg
KNOj	200 mg
KH₂PO₄	136 mg
k₂hpo₄	47 mg
CaCl₂.2H₂O	147 mg
MgSO₄.7H₂O	250 mg
borjú-szérumalbumin (BSA)	20 mg
glukóz	4000 mg
fruktóz	4000 mg
szacharóz	1000 mg
PH	5,8
ozmolaritás	660 mO

HU 218 822 Β

1. számú protoplasztnövesztő oldat összetétele Azonos a protoplasztizoláló közeg összetételével, de nem tartalmaz cellulózt, pektoliázt és BSA-t. Transzformációs puffer összetétele

a)

b) glukóz

MES

MgCl₂.6H₂O pH ozmolaritás

PEG 6000 oldat glukóz

MgCl₂.6H₂O

Hepes pH

0,5 mol/1 0,1 tömeg% mmol/1 5,8

600 mOsm

0,5 mol/1 100 mmol/1 20 mmol/1

6,5

A PEG 6000-et közvetlenül felhasználás előtt adjuk az oldathoz (40 tömeg% PEG), a PEG oldatot 0,45 pm steril szűrőn szűrjük.

W 5 oldat összetétele

CaCl₂ 125 mmol/1

NaCl 150 mmol/1

KC1 5 mmol/1 glukóz 50 mmol/1

Protoplaszttenyésztő közeg összetétele (mg/l)

KN0₃ 3000 (NH₄)₂ SO₄ 500

MgSO₄.7H₂O 350

KH₂PO₄ 400

CaCl₂.2H₂O 300

Fe-EDTA és nyomelemek, például Murashige-Skoog-elegy [Physiol. Plánt. 15,473 (1962)].

m-mozit thiamin HC1 nikotinsavamid piridoxin HC1 glicin glukuronsav galakturonsav galaktóz maltóz glukóz ffuktóz szacharóz aszparagin glutamin prolin kazeinhidrolizátum

2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D)

PH ozmolaritás

100

1,0

0,5

2,0

750

500

000 36 000 30 000

500

100

300

500

0,5

5,8

600 mOsm

1. példa

A DSM 6009 sejtvonal protoplasztjának előállítása Protoplasztizolálás

A tápközeg utolsó kicserélését követő 2-4. napon, 55 előnyösen 3. napon a szuszpenziós tenyészetről leszívatjuk a folyékony közeget, és a visszamaradó sejteket 50 ml 1. számú protoplasztnövesztő oldattal öblítjük, és ismét szűrjük. A kapott sejtmassza minden 2 grammjához 10 ml protoplasztizoláló közeget adunk. A szuszpendált sejteket és sejtaggregátumot 27 ±2 °C hőmérsékleten enyhe rázás (30-40 fordulat/perc) mellett

4-6 órán keresztül sötétben inkubáljuk.

Protoplaszttisztítás

Miután a protoplasztfelszabadítással elérjük a legalább 1 000 000/ml értéket (mikroszkopikus megfigyelés), a szuszpenziót 200 pm, illetve 45 pm lyukbőségű rozsdamentes acél és nejlonszűrőn átszűrjük. Egy 100 pm-es és egy 60 pm-es szita kombinációjával a sejtaggregátum ugyanilyen jól elválasztható. A protoplaszttartalmú szűrletet mikroszkopikusan azonosítjuk. A szűrlet 98-99 tömeg% protoplasztot tartalmaz. A maradék emésztetlen egyedi sejtek. Az ilyen tisztaságú protoplasztkészítmény gradiens centrifugálás nélkül a transzformáláshoz felhasználható. Centrifugálással 1000 fordulat/perc értéken kilengő rotorban (100 g, 3 perc) a protoplasztot ülepítjük. A felülúszót eldobjuk, és a protoplasztot 1. számú mosóoldatban szuszpendáljuk. A centrifugálást megismételjük, és a protoplasztot a transzformációs pufferben szuszpendáljuk.

2. példa

Foszfino-tricin-acetil-transzferáz gén klónozása

A transzformáláshoz az alább megadott szintetikus foszfino-tricin-acetil-transzferáz gént alkalmazzuk a karfiol mozaikvírus 35S transzkriptjének promotere szabályozása alatt (a szekvenciákat lásd később, a foszfmotricin-acetil-transzferáz strukturgén a pDH51 plazmid [Pietrzak és munkatársai: N. A. R. 14, 5857-5868 (1986)] Sáli hasítóhelyére van klónozva], illetve a 275 957 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett szintetikus gént alkalmazzuk. A 35S promoter strukturgénből és a 35S terminátorból álló kimér gént a pUC18 polilinker EcoRI helyére visszük be. A kísérletek többségében hasítatlan pUC18-35S acetil-transzferáz plazmidot alkalmazunk. Egyes kísérletekben a plazmidot EcoRI enzimmel hasítjuk, és a linearizált pUC18 plazmid és az 1,3 Kb 35S acetil-transzferáz inzert keverékét alkalmazzuk a transzformáláshoz.

Az alkalmazott ligálási körülmények és klónozási módszerek az adott technikai területen közismert műveletek és megtalálhatók az általános kézikönyvekben (például Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989).

Az 1. számú szekvencia a pDH51 plazmid szekvenciája, amely tartalmazza a 35S promoter és terminátor szakaszokat, amiket Sáli helyet tartalmazó polilinkerből izoláltunk.

A 2. számú szekvencia a 275 957 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett foszfino-tricin-acetiltranszferáz gén szekvenciája.

HU 218 822 Β

1. számú szekvencia:

EcoRI

GAATTCCCATGGAGTCAAAGAATCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCOCCGTAAAGAGTGGCGAACAGTTCA

CTTAAGGGTACCTCAGTTTCTTAGTTTATCTCC'rGGATTaTCTTGAGCGGCATTTCTGACCGCTTGTCAAGT

24 36 48 60 72 tacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacgcttgtct

ATaTcrCACACAATCCTCACTTACTGTTr/rTr.TTTTAGAAGCAGTTGTACCACCTCGTGCTUTGCGAACAGA

96 103 120 132 144 actccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaauaaagggtaatat tgaggtttttatagtttctatgtcagagtcttctggtttcccgttaactctgaaaagttgtttcccattata

156 166 180 192 204 216 ccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtg scctttggaggagcctaaggtaacgggtcgatagacagtgaaataacacttctatcaccttttccttccac

-228 240 262 264 276 288

GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAüTCGTCCCA

CQAGGATOTTTACGGTAGTAACGCTATTTCCTTTCCGGTAGCAACTTCTAWíUAűACiSüCTGTCACCAGOGT

300 312 324 336 348 360 aagátggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtgg

TTCTACCTGGGűGTGGGTGCTCCTCGTAGCACCTTTTTCTTCTGCAAGGTTGGTGCAGAAGTTTCGTTCACC

372 3B4 39B 408 420 402 attgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctcta

TAACTACACTATAGAGGTQACTGCATTCCUrA12TüUtTl-UTTAŰGCTGATAaaAAacQT7CTClCC?iACJACAT 444 456 468 480 482 504

Sáli tataaggaagttcatttcatttgqagaggacagggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgc atattccttcaagtaaagtaaacctctcctgtcccatggücccctaogagatctcagctggacgtccgtacg

618 528 540 552 564 576 cgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctataataatgtgtgagtagttcccagataag gcgactttagtggtcagagagagatgtttagatagagagagatattattacacactcatcaagggictattc

688 600 612 624 636 646 ggaattagggttcttatagggtttcoctcatgtottűaűcatataagaaacccttagtatgtatttgtattt ccttaatcccaagaatatcccaaagcgagtacacaactcgtatattctttgggaatcatacataaacataaa

660 672 884 698 708 720

ZooRl gtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgggtaccgagctcgaattcaa cattttatgaagatagttattttaaagattaaggattttggttttaggtcacccatggctcgaocttaaütt

732 744 758 788 780 792

HU 218 822 Β

2. számú szekvencia:

Vei Aep Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Vei Glu lln Arg Pro Alá Thr-Ala iall

GTC GAC ATG TCT CCG GAG AGG AGA CCA GTT GAG ATT AGG CCA-GCT ACA CCA GAG CTG TAC AGA GGC CTC TCC TCT GGT CAA CTC TAA TCC GGT CGA TGT CQT

24 38 48

Al· Α·ρ Met GCT GAT ATG CGA CTA TAC

Alá Alá Val Cy· Asp 21· GCC GCG CTT TCT GAT ATC CGG CGC CAA ACA CTA TAG 83 75

Val Asn Hl· Tyr no oiu Ttot· β-ι GTT AAC CAT TAC ATT ΟΛΟ ACO TCT CAA TTG GTA ATG TAA CTC TGC AGA

BT 88

Thr Val Asn Phe Arí Tfar Glu Pro Gin ACA GTG AAC TTT AGG ACA GAG CCA CAA TGT CAC TTG AAA TCC TGT CTC GGT GTT

114 126

Thr Pro Gin Glu Trp 11· Asp Aop ACA CCA CAA GAG TGG ATT GAT GAT TGT GGT GTT CTC ACC TAA CTA CTA

138 180

Leu Glu .Arg Leu Gin Asp CTA GAG AGG TTG CAA GAT GAT CTC TCC AAC GTT CTA

168

Arg Tyr Pro Trp Uu Val Alá Glu Val Glu Gly

AGA TAC CCT TGG TTG GTT GCT GAG GTT GAG GGT

TCT ATG GGA ACC AAC CAA CGA CTC CAA CTC CCA

177 1B8 201

Val· Val Alá Gly lle·Alá Tyr Alá Gly Pro Trp Lys Alá Arg Asn Aló Tyr GTT GTG GCT GGT ATT GCT TAC GCT GGG CCC TGG AAG GCT AGG AAC GCT TAC CAA CAC CGA CCA TAA CGA ATG CGA CCC GGG ACC TTC CGA TCC TTG CGA ATG

216 228 240 292

Asp Trp Thr GAT TGG ACA

Val Glu Ser GTT GAG AGT

Thr Val Tyr Val Ser His Arg RJs Gin Arg Leu ACT GTT TAC GTG TCA CAT AGG CAT CAA AGG TTG TGA CAA ATG CAC AGT CTA TCC GTA GTT TCC AAC

CTA ACC

.TGT

CAA CTC 267 Ser Thr TCC ACA

ICA Leu TTG AAC

278 Tyr Thr TAC ACA

281 His Leu Lou Lys Sir Hét

303

Gly Leu

Gly GGA CCT

Glu Alá Gin

GGC CTA

CAT GTA

>-»

CTT-AAG GAA TTC 342

TCT ATG

GAG GCG CAA

CCG GAT

AGG 318

TGT

ATG

TGT 330

AGA

TAC

CTC CGC GTT

364

Gly Fhe

Lys

Ser

Val

Alá

Val

.11·

Gly

Leu Pro

Asn

Asp

Pro ser >ei

GGT TTT

AAG

TCT

GTG

GTT

GCT

GTT

ATA

GGC

CTT CCA

AAC

GAT

CCA TCT GTT

.CCA AAA

TTC.

AGA 369

CAC

CAA

CGA

CAA 381

TAT

CCG

GAA QGT 383

TTG

CTA

GGT AGA CAA 405

Arg Leu His Glu Alá Leu Gly Tyr Thr Alá Arg Gly Thr Leu Arg Alá Alá AGG .TTG CAT GAG GCT .TTG GGA TAC ACA GCC CGG GGT ACA TTG CGC GCA GCT TCC AAC GTA CTC CGA AAC CCT ATG TGT CGG GCC CCA TGT AAC GCG CCT CGA

420 432 444 458

Gly Tyr Lys His Gly Gly Trp Hle A»p Val Gly Phe Trp Gin Arg Aap The

GGA TAC AAG CAT GGT GGA TGG CAT GAT GTT GGT TTT TGG CAA AGG GAT TTT

CCT ATS TTC GTA CCA CCT ACC GTA CTA CAA CCA AAA ACC GTT TCC CTA AAA

471 483 486 5Ő7

Glu Leu Pro Alá Pro Pro Arg Pro Val Arg Pro Yal Thr Gin lle MG Val

Sáli

GAG TTG CCA GCT CCT CCA AGG CCA GTT AGG CCA GTT ACC CAG ATC TGA GTC

CTC AAC GGT CGA GGA GGT TCC GGT CAA TCC GGT CAA TGG GTC TAG ACT CAG

622 534 548 558

Asp

GAC

CTG

HU 218 822 Β

3. példa

Protoplaszttranszformálás

A transzformációs pufferben szuszpendált protoplasztot 0,5-1 xlO⁶ protoplaszt/ml titemél 10 ml-es részletekben 50 ml-es poliallomer csövecskékbe töltjük. A transzformáláshoz alkalmazott DNS-t triszEDTA (TE) pufferben oldjuk. A protoplasztszuszpenzió minden ml-éhez 20 pg plazmid DNS-t adunk. A DNS hozzáadása után a protoplasztszuszpenziót óvatosan rázzuk a DNS homogén eloszlatása érdekében. Rögtön ezután cseppenként 5 ml PEG oldatot csepegtetünk hozzá.

A csövecskék óvatos mozgatásával a PEG oldatot homogénen eloszlatjuk. Ezután további 5 ml PEG oldatot adunk hozzá, és a homogenizálást megismételjük. A protoplaszt 20 percen keresztül a PEG oldatban marad 25±2 °C hőmérsékleten. Ezután a protoplasztot 3 perces centrifugálással (100 g, 1000 fordulat/perc) ülepítjük. A felülúszót eldobjuk, a protoplasztot óvatos rázással 20 ml W₅-oldatban mossuk, és ismét centrifugáljuk. Ezután 20 ml protoplaszt tenyészközegben szuszpendáljuk, ismét centrifugáljuk, és ismét tenyészközegben szuszpendáljuk. Az oldat titerét 6-8xlO⁵protoplaszt/ml értékre állítjuk, és a protoplasztot 3 ml-es részletekben Petri-csészében (60 mm átmérő, 15 mm magasság) tenyésztjük. A parafilmmel lezárt Petri-csészéket 25±2 °C hőmérsékleten sötétbe állítjuk.

4. példa

Protoplaszttenyésztés

A protoplasztizolálást és transzformálást követő első 2-3 hétben a protoplasztot friss közeg hozzáadása nélkül tenyésztjük. Amint a protoplasztból regenerálódó sejtek vagy sejtaggregátumok több mint 20-50 sejtet tartalmaznak, 1 ml friss protoplaszttenyésztő közeget adunk hozzá, amely ozmotikumként 90 g/1 szacharózt tartalmaz.

5. példa

Transzformált kukoricasejtek kiválogatása és növényregen erálás

3-10 nappal a friss közeg hozzáadása után a protoplasztból képződő sejtaggregátumok 100 mg/1 Lfoszfino-tricint tartalmazó agarközegre vihetők fel. Tápközegként alkalmazható továbbá a protoplaszttenyésztő közeg vitaminjait, 90 g/1 szacharózt és 1,0 mg/1

2,4-D-t tartalmazó N6 közeg, valamint az ezzel analóg közegek, például a makro- és mikrotápsókkal kiegészített MS közeg (Murashige-Skoog, 1962).

A szelektív közegen akadályoztatás nélkül tovább fejlődik a stabil transzformált protoplasztból kialakuló kallusz. 3-5 hét, előnyösen 4 hét elteltével a transzgén kallusz friss szelekciós közegre átvihető, amely szintén 100 mg/1 L-foszfíno-tricint tartalmaz, de auxint már nem tartalmaz. Ezen a közegen L-foszfmo-tricm jelenlétében 3-5 hét elteltével mintegy 50% transzgén kukoricakallusz differenciálódik, amely az L-foszfino-tricin-acetil-transzferáz gént a genomjába felvette.

6. példa

Transzgén regenerált növények tenyésztése

Az embriogén transzformált kukoricaszövetet hormonmentes N6 közegen [Chu C. C. és munkatársai: Sci. Sin. 16, 659 (1975)] 5x 10~⁴ mol/1 L-foszfmo-tricin jelenlétében tenyésztjük. Ezen a közegen azok a kukoricaembriók fejlődnek, amelyek a foszfino-tricinacetil-transzferáz gént (PAT-gén) megfelelő mértékben kifejezik. A nem transzformált embriók, valamint azok, amelyek csak gyenge PAT aktivitást mutatnak, elpusztulnak. Amint az in vitro növények levelei elérik a 4-6 mm hosszúságot, a növényeket talajba kiültetjük. Az agarmaradékokat a gyökérről lemossuk, és a növényeket agyag, homok, vermikullit és egységföld 3:1:1:1 keverékébe ültetjük, és az elültetést követő első három napban 90-100% relatív páratartalmú közegben neveljük. Ezután klímakamrába helyezzük, és 14 órás, mintegy 25 000 lux értékű megvilágítási periódus mellett 23/17± 1 °C nappali/éjjeli hőmérsékleten neveljük. Az adaptált növényeket 65 ±5% nedvességtartalom mellett tartjuk.

7. példa

Az átvitt foszfino-tricin-acetil-transzferáz gén kifejezésének bizonyítása

3-4 héttel a talajba történő kiültetés után a transzgén regenerált növényeket és kontrollként a DNS-sel nem kezelt kalluszból regenerált növényeket kereskedelmi forgalomban lévő készítmény (Basta) formájában foszfíno-tricinnel permetezzük meg. A foszfinotricint 2,0 kg hatóanyag/ha mennyiségben alkalmazzuk. A herbicidet 50 ml/m² (500 1/ha) vízmennyiséggel visszük ki. Ez a foszfino-tricin mennyiség a PAT aktivitás nélküli növényeket 7-10 napon belül a gén kifejeződésének mértékétől függően vagy egyáltalán nem károsítja, vagy alacsony PAT aktivitás esetén lokális levélfoltok jelennek meg, ami azonban a kezelt növény fejlődését mérhető módon nem befolyásolja.

A kukoricakalluszból és a levélszövetből 100 mg-os mintákat 1,5 ml-es reakcióedényben folyékony nitrogénben megfagyasztunk, és az edény formájának megfelelő rozsdamentes acél mikromozsár törővei homogenizáljuk. Ehhez 100 μΐ Trisz-EDTA puffért (50 mmol/1 trisz, és 2 mmol/1 EDTA, pH=7,5) adagolunk a mintához. A homogenizált mintát 12 000 fordulat/perc értéken 1 percen keresztül Eppendorf centrifugában centrifugáljuk. A tiszta felülúszót pipettával eltávolítjuk, és a pelletet eldobjuk. A nyers extraktum fehéijetartalmát Bio-Rád protein assay segítségével meghatározzuk. A PAT vizsgálathoz a nyers extraktum alikvot részét alkalmazzuk, amely 20 pg fehérjét tartalmaz. Az extraktumhoz acetil-Co-A és 14C-L-foszfíno-tricin enzimet adunk. Az enzim végkoncentrációja az inkubációs elegyben 1 mmol/1 acetil-Co-A és 0,1 mmol/1 14C-Lfoszfino-tricin. A mintát rövid ideig keverjük, majd 37 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. Ezután az enzimreakciót 0,5 térfogatrész 12 tömeg%-os triklór-ecetsav hozzáadásával megállítjuk, jól elkeverjük, és 10 percen keresztül jégre állítjuk. Ezután 12 000 fordulat/perc értéken 10 percen keresztül centri7

HU 218 822 Β fugáljuk, és a felülúszót vékonyréteg-kromatográfiásan vizsgáljuk. Egy vékonyréteg-kromatográfiás lemezre (Cellulose F254, Merck) 6 μΐ inkubációs elegyet viszünk fel a referenciaanyagként alkalmazott 14C-foszfíno-tricin és 145C-acetil-foszfino-tricin mellett. Futtatószerként n-propanol/25 tömeg%-os NH₃ 3:2 vagy piridin/n-butanol/jégecet/víz 3:5:1:4 elegyét alkalmazzuk.

A megszárított vékonyréteg-kromatográfiás lemezt műanyag fóliába csomagoljuk, és röntgenfilm kazettában exponáljuk. Az előhívott röntgenfilmen a PAT aktivitás (a csak transzgén szövetekben előforduló) acetilfoszfino-tricin sávon ismerhető fel. A foszfino-tricin és az acetil-foszfino-tricin vékonyréteg-kromatográfiásan a megadott futtatószerekben jól nem választható el.

8. példa

Az átvitt gén átöröklése a regenerált növény utódjaira

A glufozinátot 2 kg/ha dózisban károsodás nélkül elviselő és a PAT enzim vizsgálatban egyértelmű PAT aktivitást mutató transzformánsok virágporával különböző tenyészvonalak, például B73, LH119, LH82, LH51, illetve Mól 7 vonalak bibéjét porozzuk meg. Mivel a pollenon keresztül csak a magban kódolt gének örökíthetők át, ily módon ellenőrizhető, hogy az átvitt gén a mag genomjába beépült-e. Csak ebben az esetben várható el, hogy a gén az utódokban kifejeződjön, és Mendel-féle törvényeknek megfelelő öröklődési folyamat játszódjon le.

a) Éretlen embriók vizsgálata

A beporzást követő 12-16 napon steril körülmények között éretlen embriót preparálunk ki a szemtermésből. Az izolált embriót hormonmentes MS, illetve N6 agar tápközegre visszük, amely 9 tömeg% szacharózt és 100 mg/1 L-foszfino-tricin-ammóniumsót (glufozinátammónium) tartalmaz. Az embriókat oly módon tenyésztjük a közegen, hogy a scutellum az agaron felfekszik. Ezután 2000-5000 lux erősségű 12 h/nap időtartamú megvilágítás mellett 75 ±2 °C hőmérsékleten tenyésztjük. A kifejezésre alkalmas PAT géntől mentes embriók ezen a közegen 14 napon belül csírásodás nélkül elpusztulnak. Az 1. táblázat három különböző transzformáns első hibrid filiális generációjának (t, hibrid) viselkedését mutatja.

1. táblázat

Transzgén apanövények és nem transzgén tenyészvonalak keresztezéséből származó éretlen embriók viselkedése

Pollcndonor	Izolált embriók száma	Elpusztult embriók száma	Fejlődő embriók száma
2. számú transzformáns	20	9	11
5. számú transzformáns	20	12	8
9. számú transzformáns	100	47	53

A kifejlődő embriók, amelyek 5 χ 10~⁴ mol/1 L-foszfino-tricin jelenlétében kicsíráznak, normál gyökérzetet, valamint zöld levélzetet növesztenek ezen közegen. A növények a szomatikus embriókból kifejlesztett in vitro növényekkel analóg módon a talajba kiültethetők. Ezek a növények a PAT gént átörökítik a t₂-generációba, ha a t! növény virágporát nem transzgén anyanövény bibéjére visszük.

b) Hajtásvizsgálat

A fent leírt keresztezésből származó érett magokat kiszárítjuk (legfeljebb 15 tömeg% víztartalom), és elültetjük (20 000 lux, 12 h, 22 °C nappali és 16 °C éjszakai hőmérséklet). A csíranövényeket 2-3 leveles állapotban a kereskedelmi forgalomban található Basta készítmény 1 tömeg%-os oldatával permetezzük meg a regenerált növények kezeléséhez hasonlóan (lásd a 6. példát). Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat

Pollendonor	Vizsgált hajtás	Károsodott hajtás	Elpusztult hajtás
9. számú transzformáns	29	15	14
13. számú transzformáns	20	11	9
14. számú transzformáns	39	17	22

A hasadási viselkedés összhangban van azzal a feltételezéssel, hogy egyes transzformánsok genomjukban csak egy funkcióképes PAT gént tartalmaznak.

A 14. számú transzformánsból 1990. 06. 12-én magokat deponáltunk a Budapesti Szerződés előírásai szerint a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, Nagy-Britannia gyűjteményben az NCIMB 40291 szám alatt.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás transzgén kukoricanövény előállítására, azzal jellemezve, hogy

- egy auxinautotróf kukorica-genotípus sejtszuszpenziójából enzimatikusan protoplasztot állítunk elő;

- a protoplasztot DNS-sel inkubáljuk, és a DNS-t inszertáljuk a protoplasztba;

- a DNS-t tartalmazó protoplasztból transzgén kukorica-sejtvonalat szelektálunk és regenerálunk; és

- a kukorica-sejtvonalból transzgén növényrészeket vagy növényt regenerálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t polietilénglikol jelenlétében végzett inkubálással inszertáljuk a protoplasztba.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DSM 6009 genotípus protoplasztját alkalmazzuk.

HU 218 822 Β
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a transzgén növényeket önbeporzással vagy idegen beporzással szaporítjuk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzgén kukoricanövénye- 5 két nemes tenyészvonallal végzett keresztezéssel szaporítjuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a protoplasztot

- foszfino-tricin-acetil-transzferázt kódoló DNS- 10 sel inkubáljuk;

- a DNS-t tartalmazó protoplasztból transzgén kukorica-sejtvonalat szelektálunk és regenerálunk; és

- a kukorica-sejtvonalból transzgén növényrészeket vagy növényt regenerálunk.
7. Eljárás kukoricanövények védelmére a gyomok foszfmo-tricinnel vagy foszfino-tricin-alanil-alaninnal a termesztés környezetében végzett szelektív irtásával, azzal jellemezve, hogy a termesztési területet a 6. igénypont szerinti eljárással előállítható növénnyel ültetjük be.