HU218048B

HU218048B - A habitusban és hozamban megváltoztatott transzgenikus növények előállítása plazmidok segítségével

Info

Publication number: HU218048B
Application number: HU68/91A
Authority: HU
Inventors: Antje Schaeven; Uwe Sonnewald; Lothar Willmitzer
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date: 1990-02-13
Filing date: 1991-02-12
Publication date: 2000-05-28
Also published as: US5436394A; DE4004800C2; JPH0549482A; CA2036103A1; DE4004800A1; AU7089891A; JP3288395B2; IL97157A0; EP0442592A2; EP0442592A3; AU650639B2; IE910480A1; HUT58810A; HU910468D0

Abstract

A találmány tárgyát transzgenikus növények előállításához alkalmazottplazmidok képezik, amelyek előnye, hogy egy invertáz gén olyan DNS-szekvenciáját tartalmazzák, amely szekvencia által kódolt termék egynövényi genomba való bevezetése a növényben lévő fotoasszimilátumokeloszlását és/vagy képződését megváltoztatja, és ezáltal a növényihabitus és/vagy hozam megváltozásához vezet, valamint ezen plazmidoktranszgenikus növények előállításánál történő alkalmazása képezi. Atalálmány tárgyát képezi továbbá egy, a fenti DNS-szekvenciáttartalmazó növényi sejt és növény valamint eljárás ezek előállítására. ŕ

Description

A találmány transzgenikus növények előállítására szolgáló, új plazmidokat, illetve olyan növényeket és eljárást mutat be, amelyek a plazmidokon lokalizált és a növényben lejátszódó cukormetabolizmushoz vagy cukorelosztáshoz kapcsolódó gének beépítése és expressziója révén megváltoztak.

A haszonnövény vagy dísznövény növekedése, fejlődése és hozama attól az energiától függ, amelyet az illető növény a szén-dioxidnak szénhidrátokká történő fixálása által, a fotoszintézis során nyer. A fotoszintézis elsődleges helye a levél és kisebb mértékben a szár szövete is, de más növényi szervek, mint a gyökér, mag vagy gumó a fotoasszimilátumok képzéséhez nem járulnak hozzá lényegesen, hanem ellenkezőleg, növekedésük a fotoszintetikusán aktív szervek által biztosított ellátásától függ. Ez azt jelenti, hogy a fotoszintézissel nyert energiának egy, a fotoszintetikusán aktív szervektől a fotoszintetikusán inaktív növényi részek felé haladó áramlása létezik.

A fotoszintetikusán aktív szerveket forrásnak, illetve „source”-nak nevezik. A fixált szén-dioxid nettó exportőrének is definiálják őket. A növény fotoszintetikusán inaktív részeit elnyelőnek, illetve „sink”-nek nevezik. A fixált szén-dioxid nettó importőrének is definiálják.

Feltételezhető, hogy mind a fotoszintézis termékeinek hatékony hasznosítása, mind a növényen belüli elosztásuk a növényt több vonatkozásban befolyásolják. Példaként a növény habitusát említjük meg. Az újonnan kifejlődő szervek, mint a nagyon fiatal levelek vagy más részek, mint a gyökér és mag a „sources” fotoszintetikus teljesítményétől teljesen függnek. Ez azt jelenti, hogy olyan szervek fejlődése a „sources”-ban képződött fotoasszimilátumok növényben történő elosztásától függ. A fiatal levelek kialakulási lehetősége vagy a gyökér kialakulása drasztikus következménnyel járhat a növény habitusára, mint például a növény magasságára, az intemódiumok távolságára, a levél nagyságára és alakjára, a levél kinézetére és a képződő gyökerek mennyiségére és alakjára. Továbbá a fotoasszimilátumok elosztása is döntő jelentőségű kell hogy legyen a növény hozamára nézve.

így a búza fotoszintézisének összteljesítménye az utolsó évszázadokban nem változott jelentősen, miközben a búzanövénynek az ember számára értékes, aratható hozama megemelkedett. Ez főleg arra vezethető vissza, hogy a hozam szempontjából fontos „sinks”, mint a magvak jelentősen több fotoasszimilátumot vettek fel, mint más, a hozam szempontjából jelentéktelen növényi részek, mint például a szár. Ebben az esetben a fellépő szárrövidülés miatt az ember számára egy sokkal előnyösebb „sink”-„source” arány vált elérhetővé. Ez a tény az elsődleges „sources”-ban képezett fotoasszimilátumok eloszlásának a fontosságát hangsúlyozza a magasabb rendű növényekben, mind a növény habitusát, mind hozamát illetően.

Nem ismeretes, hogy a „sínk” és „source” arányát milyen biokémiai mechanizmusok regulálják.

A kétszikű és egyszikű növények genetikai megváltoztatására szolgáló új biotechnológiai módszerek ismeretesek Gasser és Fraley, 1989, Science 244, 1293 1299 dolgozata nyomán.

A legtöbb növényben a fotoasszimilátumok növényen belüli eloszlása cukor formájában és főleg szacharóz formájában történik. A szacharóz elosztása a „source” és „sínk” szövetek között a floemen keresztüli szacharózszállítással zajlik. Az egyik leglényegesebb deteiminánst a „sinks” erősségének kifejezésére a „sinks”be történő floem kiürítése képezheti. A floemből a „sinks”-be történő szacharóz erőteljesebb kiürítése úgy valósítható meg, hogy a szacharóz a floem elhagyása után hamarosan egy másik kémiai komponenssé alakul át amely a szacharózzal nem áll kémiai egyensúlyban.

A növényi habitus megváltozása lényeges javulást je ént az ismert növényekhez képest. így például a szár rövidítését kevésbé szélérzékeny fajták kialakítása céljából végezték el. A fotoasszimilátumoknak az aratható szervekbe mint magvakba, levelekbe (például dohány), szárba (például cukomád), gumóba (például burgonyagumó), répába (például cukorrépa, takarmányrépa), termésbe (pl, paradicsom, árpa, búza, szója vagy kukorica) történő irányított elosztását a növényi hozam növelése érdekében hajtották végre. Végeredményben ilyen változások a dísz- és kerti növényekben is előidézhetek, ami teljesen új habitussal rendelkező növények kialakulásához vezet.

A találmány célja, hogy plazmidok előállítására nyújtson lehetőséget, amelyek segítségével olyan növények hozhatók létre, amelyeknek habitusa, mint például a magasságuk, levélalakjuk, intemódiumtávolságuk és gyökérfejlődésük, illetve terméshozamuk megváltozott. A találmány további feladata, hogy ezen a plazmidokat tartalmazó növények előállítására nyújtson lehetőséget.

Észrevették, hogy plazmidok, amelyeken a cukormetabolizmushoz vagy cukorelosztáshoz kapcsolódó gének találhatók, a növénybe történő irányított beépítés után úgy expresszálódnak ezekben a transzgenikus növényekben, hogy a kódolt termékek a fotoasszimilátumok megváltozott elosztásához. Ezáltal váratlanul kim itatható volt, hogy egyes gének beépítése a habitus és hozam erőteljes megváltozásához vezet.

A növényi habitus és hozam különlegesen erőteljes megváltozása például a burgonya és dohány esetében olyan plazmidokkal volt elérhető, amelyek egy, szacharózt modifikáló enzimet kódoló gén DNS-szekvenciáját tartalmazzák. Ez a gén lehet egy invertáz gén, mint például az élesztő sucl invertáz génje, és a plazmidokban ez a gén szekvenciája más gének (amelyek az invertáz gének expresszióját lehetővé teszik növényi sejtekben és növényekben) regulációs régióihoz kapcsolt, illetve adott esetben olyan DNS-szekvenciákhoz fuzionálódott, amelyek biztosítják az invertáz protein irányítását növény i vakuólumokban és növényi sejtekben.

Az invertáz gén szekvenciája elé adott esetben még egy további DNS-szekvencia építhető, amely a növényi sejt és növény endoplazmatikus retikulumába való felvételhez szükséges szignálpeptidhez fuzionálódott. Ebben az esetben a regulációs régiók a növényi szövetek promoterei és terminációs jelei. Promoterként olyan

HU 218 048 Β promoterek használhatók, amelyek egy megközelítőleg konstitutív expressziót biztosítanak mint például a karfiol-mozaikvírus 35S RNS-ének promotere, vagy amelyek csak meghatározott szövetekben tesznek lehetővé expressziót, mint a fotoszintetikusán aktív sejtekben működő ST-LS1 gén promotere, illetve a raktározó ,sinks”-ben, mint gumókban, répákban vagy termésekben aktív patatin-gén B33-osztály I promotere és például magspecifikusan expresszálódó promoterek.

Szignálpeptidként például a Solanum tuberosum-bó\ származó proteináz inhibitor II-gén használható, amely szignálpeptid adott esetben más génszakaszokkal, mint például az octopin szintetáz génnel fuzionálódhat.

A DNS-szekvencia, amely idegen proteinek irányítását, mint például az invertáz protein irányítását végzi a növényi vakuólumokban és növényi sejtekben, lehet például egy, a Solanum tuberosum-bói származó patatingén pgT5 DNS-szekvencia. A DNS-szekvencia, amely az idegen protein irányítását a vakuólumokba biztosítja, általában az idegen proteinnel képezett fúziós protein kialakulásához vezet.

Magasabb rendű növényekbe való idegen gének beépítésének előkészítésére nagyszámú klónozóvektor áll rendelkezésre, amelyek tartalmaznak egy E. coú'-ban működő replikációs rendszert és egy markergént, amely lehetővé teszi a transzformált sejtek szelektálását. A vektorok például pBR332-t, pUC-sorozatokat, M13-mpsorozatokat, pACYC184-et stb. tartalmazhatnak. Annak megfelelően a szekvencia egy megfelelő restrikciós helyen a vektorba beépíthető. A kapott plazmidot az E. coli-ba történő transzformálásához használják. Az E. coli sejteket egy megfelelő táptalajban tenyésztik, utána összegyűjtik és lizálják. A plazmidot visszanyerik.

Analízismódszerekként általában szekvenciameghatározást, restrikciós enzimekkel történő analízist, elektroforéziseket és további biokémiai és/vagy molekuláris biológiai módszereket használnak. Minden egyes manipuláció után az alkalmazott DNS-szekvencia szétvágható és a következő DNS-szekvenciával összekapcsolható. Minden plazmidszekvencia ugyanebben a plazmidban vagy más plazmidban klónozható. A kívánt gén növénybe való beépítési módszerétől függően további DNS-szekvenciák válhatnak szükségessé. Ha a növényi sejt transzformálásához például a Ti- vagy Ri-plazmidot használják, akkor legalább a Ti- és Ri-plazmid T-DNSének jobb oldali határrégióját, de gyakran a jobb és bal határrégióit is, mint a beépítendő gének oldalrégióit is be kell építeni.

A T-DNS alkalmazását a növényi sejtek transzformálásához intenzíven megvizsgálták és megfelelően leírták az EP 120516 lajstromszámú szabadalmi leírásban, valamint Hoekema 1985-ben a The Binary Plánt Vector System című kiadvány V. fejezetében (Offsetdrukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam,), Fraley és munkatársai a Crit. Rév. Plánt Sci., 4. 1-46 közleményükben és An és munkatársai az EMBO J. (1985) 4. 277-287 publikációjukban.

Ha a bevitt DNS már a genomban integrálódott, akkor ott viszonylag stabilan megmarad és általában nem ugrik ki. A DNS-szekvencia normális körülmények között egy szelekciós markert is tartalmaz, amely a transzformáit növényi sejteknek egy biociddal vagy egy antibiotikummal - mint a kanamicin, G-418, bleomicin, higromicin vagy klóramfenikol - szemben rezisztenciát biztosít. Ezek alapján az alkalmazott marker lehetővé teszi a transzformált sejtek szelektálását olyan sejtekkel szemben, amelyekből hiányzik a beépítendő DNS.

A növényi gazdasejtbe történő DNS bevitelére sok módszer áll rendelkezésre. A T-DNS-sel történő transzformációt Agrobacterium tumefaciens vagy Agrobacteriam rhizogenes alkalmazásával végzik, a fúzió, a mikro injektálás vagy elektroporáció további lehetőségeket jelentenek. Ha a transzformációhoz Agrobacterium-okat használnak, akkor a beépítendő DNS-t speciális plazmi dókba kell klónozni, mégpedig egy intermedier vektorba vagy egy bináris vektorba. Az intermedier vektoro< olyan szekvenciák segítségével, amelyek a T-DNSben levő egyes szekvenciaszakaszaival homológok, a Ti- vagy Ri-plazmidba homológ rekombinációval integrálódhatnak. Ezenkívül tartalmazzák a T-DNS átviteléhez szükséges vzr-régiót. Az intermedier vektorok Agrobacterium-okban nem replikálódnak. Egy helper plazmid segítségével az intermedier plazmid az Agrrobacterium tumefaciens-be bevihető (konjugáció). A bináris vektorok mind E. coli-ban, mind az Agrobacteriumokban replikálódnak. Tartalmaznak egy szelekciós markergént és egy linkért, illetve polilinkert, amelyet a T-DNS bal és jobb határrégiói fognak közre. Az Agrobacterium-ókba a bináris vektorok közvetlenül transzformálhatok, amint azt Holsters és munkatársai a Mól. Gén. Génét. 1978,163. 181-187 számában leírták. A gaz- dasejtként szolgáló Agrobacterium kell hogy tartalmazzon egy plazmidot, amely a vzr-régiót hordozza. A vir-régió a növényi sejtbe történő T-DNS bevitelhez szükséges. Járulékos T-DNS-t tartalmazhat. Az így transzformált baktériumot növényi sejtek transzformálásához használják. A növényi sejtbe való DNS beviteléhez a növényi explantátumot célszerűen Agrobacteriitm tumefaciens-szel vagy Agrobacterium rhizoqenesszel fertőzik. Utána a megfertőzött növényi anyagból (például levéldarabok, szárszegmentumok, gyökerek és protoplasztok vagy szuszpenziós tenyészet sejtjei) megfelelő táptalajban, amely antibiotikumokat vagy biocidokat szelekció céljából tartalmazhat, újra teljes növények regenerálhatok. Az így kapott növények a beépített DNS jelenlétére tesztelhetők. Az injektálás és elektroporáció esetében a plazmiddal szemben különleges követelmények nincsenek. Egyszerű plazmidok, mint például pUC-származékok használhatók.

A transzformált sejtek a növényben a megszokott módon növekednek. Ezek a növények normálisan felnevelhetek, és olyan növényekkel, amelyek ugyanazt a transzformált örökítőanyagot vagy más örökítőanyagokíit tartalmaznak, keresztezhetőek. Az így keletkező hibrid egyedek a megfelelő fenotipikus tulajdonságokkal rendelkeznek.

Fogalmak és rövidítések

Rövidítések bp, kb - bázispár, kilobázis

D, kD - dalton, kilodalton

HU 218 048 Β

DNS	- dezoxiribonukleinsav, genetikai információ hordozója	sejtben (esetleg eukariótákban is),
amely a baktérium kromoszómájától
SDS	- nátrium-dodecil-szulfát		függetlenül replikálódik. A plazmid
Tris	- Tris (2-aminoetil)-amin		egy másik gazda-DNS-ébe integrá-
EDTA	- etilén-diamin-triecetsav	5	lódhat
Fogalmak elektroforézis	- biokémiai elválasztási módszer		promoter - a DNS-expresszió szabályozó szekvenciája, amely homológ vagy
endoplazmati-	proteinek és nukleinsavak elválasztására nagyság és töltés alapján - intracelluláris membránszerű csa-	10	heterológ DNS-gén-szekvenciák transzkripcióját teszi lehetővé replikáció - a DNS-szekvencia megkétszere-
kus retikulum	tornák, amelyek kémiai és bioké-		ződése
expresszió	miai anyagok szállítására szolgálnak - egy gén aktivitása		restrikciós - restrikciós endonukleázok, ame- enzimek lyek az endodezoxiribonukleázok al- csoportját képezik (például EcoRI
gén	- öröklődési faktor; az öröklődést	15	(GAATTC szekvenciaspecifitás) és
genom	anyagnak egy egysége, egy meghatározott jelleg részinformációjának a hordozója. Gének nukleinsavakból állnak (például DNS) - a sejt kromoszómáin lokálizált	20	EcoRII (CC(A vagy T)GG-szekvenciaspecifitás), és nagyfokú szubsztrátspecifitást mutatnak (-hasítási hely) restrikciós -hasítási helyek, amelyeket restrik-
intemódiumok	gének összessége - csomók (nódium) által egymástól		helyek ciós enzimek specifikusan hoznak létre
	elválasztott hajtásszakaszok (például fűszár, szár stb.). A nódiumokon a levelek állnak	25	termináció - a proteinszintézis utolsó lépése, amelyben a polipeptidlánc kiegészül transzformáció - egy baktériumtörzs exogén DNS-
intemódium-	- a különböző hajtásszakaszoknak		ének a bevitele egy recipiens sejtbe
távolság	a nódiumoktól való távolsága		vektorok - gazdaspecifikus replikációra ké-
Klenow-	- DNS-polimeráz I 76 000 D-os		pes struktúrák, amelyek géneket fel-
fragmentum	ffagmense, amely szubsztilizinnel		vesznek és ezeket más sejtekbe be-
	történő emésztéssel keletkezett 5-	30	viszik. Plazmidok vektorként hasz-
klón	3-polimeráz- és 3-5-exonukleáz-aktivitással rendelkezik, de holoenzim 5-3-exonukleáz-aktivitással nem rendelkezik. - sejtpopuláció, amely egyetlen	35	nálhatók A következő plazmidokat a Német Mikroorganizmus Gyűjteményben, Braunschweigben letétbe helyeztük (elhelyezési szám): 1990. 02. 12-én
ligálás	anyától származik. Az utódok genotípusai megegyeznek. A klónozással a sejtvonalak egységessége még fokozható - a DNS 5’-foszfátcsoportja és 3’-	40	plazmid p35S-Cy-INV (DSM 5785) plazmid p35S-CW-INV (DSM 5788) plazmid p33-CW-INV (DSM 5787) plazmid pl700-CW-INV (DSM 5789) plazmid p33-Cy-INV (DSM 5786)
linker,	hidroxilcsoportja közötti foszfodiészterkötés enzimatikus képzése - szintetikus DNS-szekvencia,		7990. 08. 20-án plazmid p35S-V-INV (DSM 6142) Az ábrák leírása
polilinker	amely egymás szomszédságában		1. ábra: az 5,1 kb nagyságú p35S-Cy-INV plazmid
	egy vagy több (polilinker) restrik-	45	struktúráját mutatja be.
Northern biot,	ciós vágási helyet tartalmaz - elektroforetikusan elválasztott		A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza :
Southern biot	DNS vagy RNS egy nitrocellulóz-		A=A fragmentum (529 bp):a karfiol-mozaikvírus
	vagy nejlonmembránra történő átvitele és fixálása	50	(CaMV) 35S promoterét tartalmazza. Egy olyan fragmentumot tartalmaz, amely a CaMV 6909-tól 7437-ig
fenotípus	- azon tulajdonságok összessége,		terjedő nukleotidszakaszát foglalja magában.
floem	amely egy organizmusban a génállományával (genotípus) ellentétben megnyilvánulnak - a növényi szállítóedények háncs-	55	B=B fragmentum (1726 bp): a burgonya proteináz inhibitor II génjéből származó 23 nukleotidot (923-945 nukleotid) tartalmazza, melyeket egy 7 bázispámyi linker segítségével az élesztő suc2 génjéhez
plazmid	szövete. A szállítóedények vizet, illetve vízben oldott anyagokat szállítanak - járulékos, extrakromoszomális		(amely a + 64-től + 1765-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza) kapcsoltunk. C=C fragmentum (192 bp): a Ti-plazmid pTiACH₅T-DNS-ének a 3-as gén poliadenilációs szignálját tartal-
	DNS-öröklődési anyag a baktériumi	60	mazza.

HU 218 048 Β

Valamint bemutatja az 1. példában leírt hasítási helyeket.

2. ábra: a 7,1 kb nagyságú p35S-CW-INV plazmid struktúráját mutatja be.

A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza :

A=A fragmentum (529 bp): a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét tartalmazza egy olyan fragmentumon, amely a CaMV 6909-től 7437-ig terjedő nukleotidszakaszát foglalja magában.

B = B fragmentum (1963 bp): a burgonya proteináz inhibitor II génjéből származó, a 923-tól 1159-ig terjedő nukleotidszakaszt tartalmazza, amelyet egy linker segítségével az élesztő suc2 génjéhez (amely a + 64-től + 1765-ig terjedő nukleotidokat foglalja magában) fuzionáltunk.

C=C fragmentum (192 bp): a Ti-plazmid pTiACH₅T-DNS-ének a 3-as gén poliadenilációs szignálját tartalmazza.

Valamint bemutatja a 2. példában leírt hasítási helyeket.

3. ábra: a 7,0 kb nagyságú p33-CW-INV plazmid struktúráját mutatja be.

A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza :

A = A fragmentum (1526 bp): a patatingén B33 promoterének a Dra\-Dral fragmentumát (pozíció: -151 2-től +14-ig) tartalmazza.

B és C=B fragmentum (1963 bp) és C fragmentum (192 bp): A p35S-CW-INV plazmid B és C fragmentumaival egyeznek meg (2. ábra).

Valamint bemutatja a 3. példában leírt hasítási helyeket.

4. ábra: a 8,4 kb nagyságú pl700-CW-INV plazmid struktúráját mutatja be.

A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza:

A=A fragmentum (1585 bp): a burgonya ST-LS1génjének az EcoRI-A/óoII fragmentumát tartalmazza.

Valamint bemutatja a 4. példában leírt hasítási helyeket.

5. ábra: a 6,8 kb nagyságú p33-Cy-INV plazmid struktúráját mutatja be.

A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza :

A=A fragmentum (1526 bp): apatatingén B33 promoter régiójának a Drai-Dral fragmentumát (pozíció :-1512-től + 14-ig) tartalmazza.

B és C=B fragmentum (1726 bp) és C fragmentum (192 bp): A p35S-Cy-INV plazmid B és C fragmentumaival egyeznek meg (1. ábra).

Valamint bemutatja az 5. példában leírt hasítási helyeket.

6. ábra: a 6,3 kb nagyságú p35S-V-INV plazmid struktúráját mutatja be.

A plazmid a következő fragmentumokat tartalmazza :

A=A fragmentum (529 bp): A karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35 S promoterét tartalmazza.

B=B fragmentum (2898 bp): A genomiális patatin klón pgT5 +707-től + 1895-ig terjedő nukleotidszekvenciáját, az AGCTTTC szekvenciájú linkért és az élesztő suc2 génjének + 64-től +1765-ig terjedő nukleotidszakaszát tartalmazza.

Valamint bemutatja a 6. példában leírt hasítási helyeket.

7. ábra: azt a gélt mutatja be, amellyel öt, egymástól független transzgenikus dohánynövény levélkivonatából az invertázaktivitás in situ kimutatható (1-5 oszlop), valamint nem transzgenikus növényekben (W38 oszlop) az aktivitás hiánya látható.

A=a redukálócukrok gélszakasza. Az 1-5 oszlopban levő fekete foltok mutatják a redukálócukrok (invertázaktivitás) jelenlétét a kontrollal szemben (W38 oszlop).

B=a proteinfrakció gélszakasza.

8. ábra: két, a p33-CW-INV plazmiddal transzformáit burgonyanövény gumóinak a mennyiségét, nagyságeloszlásukat (friss súly) és az össz-ffiss-súlyukat (a kép bal oldalán, B33-Cw-IN-4 és B33-Cw-1 jelzésű növények), valamint két, azonos körülmények között felnevelt és nem transzformált kontrollnövényt mutat be (a kép jobb oldalán, control-1 és control-2 jelzésű növények). Minden vertikális vonal egy gumót jelent, amelynek súlyát a vonal fölött g-ban megadtuk. Ezenkívül gban az összsúlyt (totál) is megadtuk.

9. ábra: az in situ kimutatásra szolgáló gélt mutatja, amelynek mintái a vakuólumokban megnyilvánuló invertázaktivitást kódoló p35S-V-INV plazmiddal transzformáit dohánynövények.

1. oszlop: nem transzformált dohánynövények protoplasztjai

2. oszlop: nem transzformált dohánynövények vakuólumai

3. oszlop: transzgenikus dohánynövények protoplasztjai

4. oszlop: transzgenikus dohánynövények vakuólumai.

Minden oszlopra összehasonlítható mennyiségű protoplasztot, illetve vakuólumot vittünk fel, amelyeket az α-mannózidázaktivitás segítségével állapítottunk meg. A 3. és 4. oszlopban levő fekete foltok a redukálócukrok képzésekor megnyilvánuló invertáz aktivitását mutatják. A két oszlop intenzitása egymással megegyezik, amely bizonyítja az invertáz kizárólagos lokalizációját a vakuólumokba. Az invertázaktivitás a nem transzformáit dohánynövények protoplasztjaiban és vakuólumaiban (1. és 2. oszlop) nem tapasztalható.

A találmány bemutatását szolgáló megvalósítási példák jobb megértése végett mindenekelőtt a kísérletekben szükséges és egyébként ismert eljárások felsorolását adjuk meg:

1. Klónozási eljárások

A klónozáshoz a pUC18/19-t és pUCl 18-t (YanischPerron és munkatársai, 1985, Gene, 33. 103-119) és pMPK 110-t (Eckes, 1984, disszertáció, Kölni Egyetem) vektorokat alkalmaztuk.

HU 218 048 Β

A növényi transzformációhoz a génkonstrukciókat a bináris vektor BIN19-be (Bevan, 1984, Nucl. Acids Rés., 12. 8711-8720) klónoztuk.

2. Baktériumtörzsek

A pUC-vektorok esetén az E. coli BMH71-18 törzsét (Messing és munkatársai, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24. 6342-6346) vagy TB1 törzsét alkalmaztuk.

A BIN19 vektor esetében kizárólag az E. coli TB1 törzsét használtuk. TB1 a JM101 törzs rekombináns-negatív, tetraciklinrezisztens származéka (Yanisch-Perron és munkatársai, Gene, 33. 103-119). A TB1 törzs genotípusa (Bárt Barrel személyes közlése): F”(íruD36, proAB, lac\, lacZ //M15), ll(lac, pro), SupE, thiS, recN, Sri: :TnlO(Tc^R).

A növényi transzformációt az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzs (Bevan, M., 1984, Nucl. Acids Rés. 12. 8711-8721; BIN19 származéka) segítségével végeztük el.

3. Agrobacterium tumefaciens transzformációja

BIN19 származékok esetén az Agrobacterium-okba történő DNS bevitele direkt transzformációval Holsters és munkatársainak a Mól. Gén. Genet.-ben (1978, 163, 181-187) leírt módszere alapján történik. A transzformáit Agrobacterium-ok plazmid DNS-ét Bimbóim és Doly, 1979, Nucl. Acids Rés., 7. 1513-1523 módszere alapján izoláltuk, és megfelelő restrikciós enzimekkel elvégzett emésztés után gélelekroforézissel elválasztottuk.

4. Növényi transzformáció

A) Dohány: Az Agrobacterium tumefaciens szelektív körülmények között növesztett kultúrájából 10 ml-t centrifugáltunk, a felülúszót elhagytuk, és a baktériumokat azonos térfogatú, antibiotikummentes táptalajban reszuszpendáltuk. Ebben a baktériumszuszpenzióban áztattuk a steril növényekről származó levéllemezeket (1 cm²), melyeknek a főerét előzőleg eltávolítottuk, steril Petri-csészében. Ezután a levéllemezeket sűrűn egymás mellé Petri-csészékbe tettük, amelyek MS-táptalajat (Murashige és Skoog, 1962, Physiologia Plantarum, 15. 473-497) és 2% szacharózt, valamint 0,8% bactoagart tartalmaztak. Kétnapos, 25 °C-on és sötétben történt inkubáció után új MS-táptalajra áthelyeztük, amely 100 mg/1 kanamicint, 500 mg/1 klarofánt, 1 mg/1 benzilaminopurint (BAP), 0,2 mg/1 naftil-ecetsavat (NAA) és 0,8% bactoagart tartalmazott. Növekvő hajtásokat hormonmentes, 250 mg/1 klaforánt tartalmazó MS-táptalajra tettük át.

B) Burgonya: Steril burgonyakultúrából származó 10, kicsi, szikével megsértett levelet tettünk 10 ml 2% szacharózt tartalmazó MS-táptalajba, amelybe szelektív körülmények között növekedett Agrobacterium tumefaciens over-night kultúra 30-50 μΐ-ét adagoltunk. 3-5 perces enyhe rázatás után 25 °C-on és sötétben inkubáltuk a Petri-csészéket. Két nap múlva a leveleket egy másik MS-táptalajba helyeztük át, amely 1,6% glükózt, 2 mg/1 zeatinribózt, 0,02 mg/1 naftil-ecetsavat, 0,02 mg/1 gibberellinsavat, 500 mg/1 klaforánt, 50 mg/1 kanamicint és 0,8% bactoagart tartalmazott. Egyhetes, 25 °C-on és 3000 lux alatt történt inkubálás után a táptalajban lévő klaforánkoncentrációt a felére csökkentettük. Egy további kultiváció az ismert módszerek alapján zajlott le (Rocha-Sosa és munkatársai, 1989, EMBO J., 8. 29.

5. Transzgenikus növények genomiális DNS-ének az analízise

A genomiális növényi DNS izolálását Rogers és Bendich, 1985, Plánt Mól. Bioi., 5. 69-76 módszere szerint végeztük.

A DNS-analízis céljából a megfelelő restrikciós enzimekkel történt emésztés után 10-20 pg DNS-t „Southern blot”-ok segítségével a keresett DNS-szekvencia integrálódására vizsgáltunk.

7. Transzgenikus növények totál-RNS-ének analízise

A növényi totál-RNS izolálását Logemann és munkatársai, 1987, Analytical Biochem., 163. 16-20 módszere szerint végeztük el.

Az analízishez 50-50 pg totál-RNS-t „Northern biot” segítségével a keresett transzkriptumok jelenlétére vizsgáltunk.

7. Proteinextrakció

A növényi szövetből származó összprotein extrakciójához szövetdarabokat homogenizáltunk proteinextrakciós pufferben [25 mM nátrium-foszfát (pH=7,0), 2 mM nátrium-biszulfit, 2 mM fenil-metil-szulfofluorid (PMSF)] 0,1% (m/v) nem oldódó polivinil-pirrolidon (PVP) hozzáadásával.

A gézen át történt szűrés után a sejttörmelékeket 20 perces, 10 000 rpm fordulatszámú centrifügálással eltávolítottuk, és a felülúszó proteinkoncentrációját Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72. 248-254 módszere alapján meghatároztuk.

8. Idegen proteinek kimutatása immunológiai eljárások segítségével (Western biot)

Proteinextraktumokat SDS-PAGE (nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid) gélben végzett gélelektroforézis segítségével molekulaméretük szerint elválasztottuk. Utána a proteingéleket 15-30 percen át transzferpufferben (grafitelektródok számára, 48 g/1 Tris, 39 g/1 glicin, 0,0375% SDS, 20% metanol) telítettük, és ezután hűtőkamrában egy nitrocellulózfilterre átvittük és 1.3 mA/cm²-rel 1-2 órán át elválasztottuk. A filtert 30 percig 3% zselatint tartalmazó TBS-pufferben 20 mM Tris/HCL pH 7,5, 500 mM NaCl) telítettük, ezt követően a filtert 2 órán át a megfelelő antiszérummal és alkalmas hígításban (1:1000-10 000) szobahőmérsékleten inkubáltuk. Utána a filtert 15-15 percen át TBS-, TTBS- (TBS-puffer 0,1% Tween 20-szal) és TBSpufferrel mostuk. A mosás után a filtert egy órán keresztül, szobahőmérsékleten goat-anti-rabbit (GAR)-antitestekkel konjugált alkalikus foszfatázzal (1:7500 TBSben) inkubáltuk. Ezután a filtert a fent említett módon mostuk, és AP-pufferben (100 mM Tris/HCl (pH=9,5), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) semlegesítettük. Az alkalikusfoszfatáz-reakciót 70 pl 4-nitrotetrazolium (NBT)oldat (50 mg/ml NBT 70%-os dimetil-formamidban) és 35 pl 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIP) (50 mg/ml BCIP dimetil-formamidban), szubsztrát hozzáadásával AP-pufferben indítottuk. Általában 5 perc múlva az első jelek megfigyelhetők voltak. A reakció a stop-oldatba [20 mM Tris/HCl (pH = 8,0), 5 mM

HU 218 048 Β

EDTA-val] való filter áthelyezésével leállítható. A reakciót sötétben végeztük.

9. Invertázaktivitás kimutatása

A savas invertáz enzim a szacharózt glükózzá és fruktózzá hasítja. A savas invertáz enzimaktivitása növényiprotein-extraktumokban SDS-poliakrilamidgélben történt elválasztás után kimutatható.

A növényi összfehérjét a 7-es pontban leírt módon kivontuk, és 2x natív SB-pufferrel (125 mM Tris/HCl pH 6,8, 10% 2-merkaptoetanol, 20% glikol, 0,004% brómfenolkék) kezeltük, és 0,2%-os SDS-gélre helyeztük. A mintákat SDS-poliakrilamidgélben történő elválasztásuk előtt melegítéssel nem denaturáltuk. Az elektroforetikus elválasztás után a géleket vízben öblítettük, és egy órán át 30 °C-on szacharózoldatban [0,1 M szacharóz, 0,1 M nátrium-acetát (pH=5,0)] inkubáltuk. Ezt követően a felesleges szacharózt többszörös mosással (3x5 perc, vízzel) távolítottuk el. A redukálócukrok kimutatását a gél főzésével TPTC-reakciós oldatban (0,1% 2,3,5-trifenil-tetrazolium-klorid 0,5 N nátrium-hidroxidban), amely 5-10 percen át mikrohullámú sütőben történt, végeztük. A reakciót 10%-os ecetsavval állítottuk le. A géleket az áztatás után szárítottuk. A redukálócukrok jelenlétét (lásd 7. ábra, A alatt fekete foltokként látható) a gélben levő intenzív vörös elszíneződés mutatja.

10. Vakuólum izolálása transzgenikus és nem transzgenikus dohánynövényekből

Három-négy hetes, sterilen felnevelt dohánynövényekből ismert módszerekkel (Damm és Willmitzer, 1988, Mól. Gén, Génét., 217. 15-20) protoplasztokat állítottunk elő. Ezután körülbelül 10 millió protoplasztból az ismert módszer szerint (Boller és Kende, 1979, Plánt Physiology 63. 1123-1132) a vakuólumokat szabaddá tettük. A vakuólumok tisztaságát mikroszkóppal és az α-mannozidázaktivitás meghatározásával (Van dér Wilden és munkatársai, 1980, Plánt Physiology 66. 390-394) ellenőriztük. Az invertázaktivitás kimutatását gélelektroforetikusan az a-mannozidázkiegyensúlyozás után elvégeztük.

A 9. ábrán bemutatjuk, hogy a vakuólumfrakció összehasonlítható invertázaktivitást tartalmaz, csakúgy, mint a vakuólum izolálásához alkalmazott protoplasztok. Az eredmény mutatja, hogy az invertáz szubcelluláris eloszlása a vakuólum markerenzim a-mannozidázeloszlásával megegyezik.

1. példa

A p35S-Cy-INVplazmid előállítása és beépítése a dohány- és burgonyanövények genomjába

Az invertáz enzim a szacharózt két hexózzá - glükózzá és fruktózzá - hasítja. Egyik hexóz sem áll a szacharózzal kémiai egyensúlyban, azért nem vezetnek a szacharóz visszatartásához a floem kiürítését illetően. Egy élesztő DNS-szekvenciát, amely a suc2 gént kódolja, kiegészítettünk a karfiol-mozaikvírus RNS-ének konstitutív expresszióját biztosító 35S promoterével, valamint egy növényi terminációs jellel. A növényi terminációs szignál az octopinszintetáz gén poli-A oldalának a 3’-végét tartalmazza. A p35S-Cy-INV plazmid három fragmentumból (A, B, C) áll, melyeket a pUC 18 polilinker restrikciós hasítási helyeibe klónoztunk (lásd

1. ábra).

Az A fragmentum a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét tartalmazza. Egy fragmentumot tartalmaz, amely a CaMV 6909-től 7437-ig terjedő nukleotidszakaszát (Frank és munkatársai, 1980, Cell, 21. 285-294) foglalja magában, a pDH51 plazmid (Pietrzak és munkatársai, 1986 Nucleic Acids Research,

14. 5857-5868) EcoBA-Kpni fragmentumából izoláltuk, és a pUC18 plazmid EcoBA-Kpnl hasítási helyei közé klónoztuk.

A B fragmentum a burgonya (Solanum tuberosum) proteináz inhibitor II génjéből származó 23 nukleotidot tartalmazza (nukleotidok: 932-945, Keil és munkatársai, 1986, Nucleic Acid Rés. 14. 5641-5650), amelyet egy 7 bázispárból álló, AGCTTTC szekvenciájú linker segítségével az élesztő suc2 génjéhez [+64-től +1765ig terjedő nukleotidszakaszt magában foglaló DNS-darab (Taussig és Carlson 1983, Nucleic Acids Rés. 11. 1943-1954)] fuzionáltunk.

A B fragmentumot egy Sca/Xmnl fragmentumként a pUC18 polilinker SmaVPstl restrikciós hasítási helyei közé tettük úgy, hogy a Fsd-hasító hely 3’-túlnyúló véget T4-DNS polimeráz segítségével tompa véggé alakítottuk.

A C fragmentum a Ti-plazmid pTiACH5 T-DNSének a 3-as gén poliadenilizációs szignálját (Gielen és munkatársai 1984, EMBO J. 3. 835-846), a 11749-11939 nukleotidok közötti régióban tartalmazza, amely régiót a pAGV40 plazmid (Herrera-Estrella és munkatársai, 1983, Natúré 303. 209-213) Pvull-Hindlll fragmentumaként izoláltunk, és a Pvull hasítási helyhez való ópAI-linker hozzákapcsolása után a pUC18 polilinkerének Sphl-Hindlll hasítási helyei közé klónoztunk. A p35S-Cy-INV plazmid 5,1 kb nagyságú.

A p35S-Cy-INV plazmid A, B és C fragmentumokat tartalmazó részét bináris vektorokba beépítettük, és az Agrobacterium-rendszer segítségével dohány- és burgonyanövényekbe transzformáltuk. A transzformált sejtekből intakt és fertilis növényeket regeneráltunk. A regenerált növények analízise minden megvizsgált szövetben (levél, szár) invertázaktivitást mutatott, amely a nem transzformált növényekből hiányzott. Immunológiai eljárások segítségével bizonyítható volt, hogy ez az invertáz egy élesztőinvertáz. Az invertáz a citoszolban, illetve citoplazmában lokalizálódott. Ezek alapján transzgenikus dohány- és burgonyanövényeket állítottunk elő, amelyek minden szervükben és sejtjükben egy új invertázt tartalmaztak, amely ezekbe a növényekbe beépített élesztőinvertáz génről származik. A regenerált dohány- és burgonyanövények a nem transzformált növényekkel szemben határozott különbséget mutattak. így a levelek zöldes elszíneződés variációit mutatták. A továbbiakban egyes transzformált növények különbözően erős törpenövekedést mutatnak, amely főleg az intemódiumtávolság megrövidülésére vezethető vissza azonos levélszám mellett. Ezenkívül megfigyeltük, hogy a fiatal levelek gyengén befelé sodrodnak.

HU 218 048 Β

2. példa

A p35S-ClV-lNVplazmid előállítása és beépítése a dohány- és burgonyanövények genomjába

Az 1-es példában leírt módszerrel előállítottuk a p35S-CW-INV plazmidot, amely tartalmaz egy módosítást, miszerint az invertáz gént kódoló szekvencia elé beépítettünk az endoplazmatikus retikulumba való felvételhez szükséges szignálpeptidet, amely a burgonya (Solanum tuberosum) proteináz inhibitor II génje (Keil és munkatársai, 1986). A p35S-CW-INV plazmid 7,1 kb nagyságú és három fragmentumból (A, B, C) áll, amelyeket a pMPKl10 polilinker megadott restrikciós hasítási helyei közé klónoztunk (lásd

2. ábra).

Az A fragmentum a karfíol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét tartalmazza. Egy olyan fragmentumot tartalmaz, amely a CaMV 6909-től 7437-ig terjedő nukleotidjait (Franck és munkatársai, 1980, Cell 21. 285-294) foglalja magában, és amelyet a pDH51 plazmid (Pietrzak és munkatársai, 1986, Nucleic Acids Rés. 14. 5857-5868) EcoRl-Kpnl fragmentumából izoláltunk és a pMPKl 10 plazmid EcoRA-Kpnl hasítási helyei közé klónoztunk.

A B fragmentum a burgonya (Solanum tuberosum) proteináz inhibitor II génjéből a 923-tól 1159-ig levő nukleotidokat tartalmazza (Keil és munkatársai, 1986, Nucleic Acids Rés. 14. 5641-5650), amiket egy ACC GAA TTG GGG ATC CCA GCT TTC szekvenciájú linker segítségével az élesztő suc2 génjéhez, amely a +64-től + 1765-ig terjedő nukleotidokat foglalja magában (Taussig és Carlson, 1983, Nucleic Acids Rés. 11. 1943-1954), fuzionáltunk. Ezáltal egy növényi protein szignálpeptidjét, amely az endoplazmatikus retikulumba való felvételhez szükséges, az invertázszekvencia N-terminális végéhez kapcsoltuk. A B fragmentumot Sca.'Xmnl fragmentumként a pMPKllO polilinker Smal/Pstl helyei közé tettük úgy, hogy a ligálás előtt a Pr/I-hasítási hely 3’-túlnyúló végeit T4 DNS-polimeráz inkubációval tompa véggé alakítottuk.

A C fragmentum a Ti-plazmid pTiACH5 T-DNSének a 3-as gén poliadenilizációs szignálját (Gielen és munkatársai, 1984, EMBO J., 3. 835-846, nukleotidok: 11748-11939) tartalmazza, melyet a pAGV40 plazmid Pvull-Hindlll fragmentumaként (Herrera-Estrella és munkatársai, 1983, Natúré, 303. 209-213) izoláltunk, és a PvMlI-hasítási helyhez való 5p/il-linker hozzáadása után a pMPKl 10 polilinker Sphl-Hindlll hasítási helyei közé klónoztunk (lásd 2. ábra).

A p35S-CW-INV plazmid A, B és C fragmentumot tartalmazó részét az 1-es példában leírt módszerrel építettük be a növénybe. A transzgenikus növények analízise Western biot és aktivitásteszt alkalmazásával mutatta, hogy a suc2 gén által kódolt invertáz most az extracelluláris térben lokalizálódott. Transzgenikus dohány- és burgonyanövények, amelyek ezt a kiméragént tartalmazzák, a növények törpülése mellett a lerövidült intemódiumtávolság miatt egy új levélfenotípust mutatnak, amely zöld és klorotikus mezőkből álló mozaikminta kialakulásától a nekrotikus mezők kialakulásáig változhat. Továbbá egy erősen redukált gyökémövekedést mutatnak.

3. példa

A p33-CAV-IN'V plazmid előállítása és beépítése a burgonya genomjába

A p33-CW-INV plazmidot a 2-es példában leírt módon állítottuk elő, a 35S promotert pedig a patatingén B33 osztály I promoterére (Rocha-Sosa és munkatársai, 1989, EMBO J., 8. 23-29) cseréltük. A p33CW-INV plazmid 7,0 kb nagyságú és három fragmentumból (A, B és C) áll, amelyeket a pUC 118 polilinker restrikciós hasítási helyeibe klónoztunk (lásd 3. ábra).

Az A fragmentum a patatingén-833 promoterrégiójának a Dral-Dral fragmentumát (pozíció: -1512-től + 14-ig) (Rocha-Sosa és munkatársai, 1989, EMBO J. 8, 23-29) tartalmazza, amelyet a pUC118 polilinker •Szzial-helyére klónoztunk.

A B és C fragmentumok a p35S-CW-INV plazmid B és C fragmentumaival megegyezőek (lásd 2. ábra). A B és C fragmentumok klónozásához a p35S-CWINV plazmidot risp718-cal (részlegesen) és Hindlllmal emésztettük, a 7/zní/III-hasítási hely kinyúló végeit DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) feltöltöttük, és a B és C fragmentumot tartalmazó intakt fragmentet más fragmentumoktól gélelektroforézis segítségével elválasztottuk. Ezt a fragmentumot ezután a fent említett orientációban a DNS-polimerázzal (Klenow-fragment) G+A-val részlegesen feltöltött EcoR.1 hasítási hely és Aspl 18 hasítási hely közé klónoztuk. A részleges feltöltéssel a 7/z«r/III-hasítási helyet kaptuk meg.

A p33-CW-INV plazmidot az 1-es példában leírt módon építettük be a növénybe. A burgonya esetén a kiméragén az invertáz gumóspecifikus expressziójához vezetett.

A Desiree burgonyafaj két transzgenikus növényét, amelyeket a p33-CW-INV plazmiddal transzformáltunk, üvegházi feltételek mellett habitus és hozam szempontjából alaposan összehasonlítottuk a kontrolinövényekkel, amelyeket nem transzformáltunk. A legszignifikánsabb különbség meglepő módon a gumóhozamban lépett fel. így a két, p33-CW-INV-val transzformáit növény üvegházi feltételek mellett egy 283 g-os, illetve 223 g-os hozamot produkált, miközben a két kontrollnövény gumóhozama csupán 155, illetve 132 g friss súlyt mutatott fel. A gumók szárazsúlya, valamint összkeményítőtartalma azonos mértékű relatív gyarapodást mutatott a p33-CW-INV plazmiddal transzformált növények és a kontrollnövények esetén. Ez azt jelenti, hogy a p33-CW-INV plazmid beépítése és gumóspec.fikus expressziója transzgenikus növényekben a növények hozamát 50- 100%-kal emelte meg (lásd 8. ábra). A gumók nagyságeloszlását illetően, a p33-CW-INV plazmiddal transzformált növényekben a nagyobb gumók sokkal magasabbak (lásd 8. ábra). Ez azt jelenti, hogy a p33-CW-INV plazmid beépítésével és expreszsziójával nemcsak a burgonyanövények összgumóhozama növelhető szignifikánsan, hanem az egyes burgonyagumók nagysága is.

HU 218 048 Β

4. példa

A pllOO-ClV-lNTplazmid előállítása és beépítése a dohány és burgonya genomjába

A pl700-CW-INV plazmidot a 2-es példában leírt módszerrel állítottuk elő, a 35S promotert pedig az STLS1 gén levélspecifikus promoterére (Stockhaus és munkatársai, 1987, Proc. Natl. Sci U.S.A. 84. 7943-7947) cseréltük ki.

A pl700-CW-INV plazmid 8,4 kb nagyságú és három fragmentumból (A, B és C) áll, amelyeket a pMPK.110 polilinker restrikciós hasítási helyeire klónoztunk (lásd 4. ábra).

Az A fragmentum a burgonya ST-LS1 gén £coRIMboll fragmentumát tartalmazza. Az Λ/όοΙΙ-hely pozíciója, az Eckes és munkatársai, 1986, Mól. Gén. Génét. 205. 14-22 által publikált szekvenciára vonatkozva, az 1585-ös pozíciónál (+1 pozíciótól +1585 pozícióig) van. Ezt a fragmentumot a pUC18 polilinker £coRISmal hasítási helyei közé klónoztuk, oly módon, hogy az Mboll túlnyúló 3’-végét előzőleg T4 DNS-polimerázzal feltöltöttük.

A B és C fragmentumok a p35S-CW-INV plazmid B és C fragmentumaival egyeznek meg (lásd 2. ábra). A B és C fragmentumok klónozásához a p35S-CWINV plazmidot ^sp718-cal részlegesen emésztettük, a 3’-túlnyúló végeket DNS-polimerázzal (Klenow-fragmentum feltöltöttük és a plazmidot ///«ó/III-mal hasítottuk. A B és C fragmentumokat tartalmazó intakt fragmentumot más fragmentumoktól gélelektroforézis segítségével elválasztottuk, tisztítottuk, és a pMPKllO polilinker BamHl-Hindlll hasítási helyei közé klónoztuk. A őűffiHI-hasítási helyet előzőleg DNS-polimeráz Igyel feltöltöttük.

A pl700-CW-INV plazmid A, B és C fragmentumokat tartalmazó részét az 1-es példában leírt módon a növénybe beépítettük.

5. példa

A p33-Cy-INVplazmid előállítása és beépítése a dohány és burgonya genomjába

Az 1-es példában leírt módszerrel állítottuk elő a p33-Cy-INV plazmidot, a 35S promotert pedig a Rocha-Sosa és munkatársai, 1989. EMBO J. 8.23-29 által leírt patatingén B33 osztály I promoterére cseréltük ki.

A p33-Cy-INV plazmid 6,8 kb nagyságú és három fragmentumból (A, B és C) áll, amelyeket a pUCl 18 polilinker restrikciós hasítási helyei közé klónoztunk (lásd

5. ábra).

Az A fragmentum a patatin-gén B33 promoterrégiójának a Dral-Dral fragmentumát (-1512 pozíciótól + 14 pozícióig) (Rocha-Sosa és munkatársai, 1989. EMBO J. 8. 23-29) tartalmazza, melyet a pUCl 18 polilinker Smal-helyére klónoztunk.

A B és C fragmentumok a p35S-Cy-INV plazmid B és C fragmentumaival egyeznek meg. A B és C fragmentumok klónozásához a p35S-Cy-INV plazmidot 7/í'«í/lII-mal emésztettük meg, a túlnyúló 3’-véget DNS-polimerázzal (Klenow fragment) feltöltöttük, a plazmidot Aspl 18-cal részlegesen emésztettük, majd a

B és C intakt fragmentumokat tartalmazó fragmentumot más fragmentumoktól gélelektroforézissel elválasztottuk. Utána ezt a fragmentumot a pUCl 18 polilinker Αψ718 és a G+A-val DNS-polimerázzal részlegesen feltöltött EcoRI-hasítási helyei közé klónoztuk. A részleges feltöltés segítségével egy /YzWIII-hasítási helyet kaptunk.

A p33-Cy-INV plazmidot az 1-es példában leírt módszerrel növénybe beépítettük.

6. példa

A p35S-V-INVplazmid előállítása és beépítése a dohány genomjába

Az 1-es példában leírt módszerrel előállítottuk a p35-V-INV plazmidot azzal a módosítással, hogy az invertáz gén szekvenciája elé egy növényi gén (burgonva-patatingén pgT5, Rosahl és munkatársai, Mól. Gén. Génét. 203. 214-220) peptidjét fuzionáltuk, amely az invertáz protein vakuólumba történő irányításához szükséges. A p35S-V-INV plazmid 6,3 kb nagyságú és három fragmentumból (A, B és C) áll, melyeket a pUC18 polilinker megadott hasítási helyeire klónoztunk (lásd 6. ábra). Az A fragmentum (529 bp) a karfiol-mozaikvírus (CaVM) 35S promoterét tartalmazza. A fragmentum a CaMV 6909-től 7437-ig terjedő nukleotidszakaszát foglalja magában (Franck és munkatársai, Cell, 21. 285-294), és a pDH51 plazmidból (Pietrzak és munkatársai, Nuc. Ac. Research, 14. 5857-5868) EcoRX-Kpnl fragmentumként izoláltuk és a pUC 18 plazmid polilinkerének £coRI-£pz?I hasítási helyei közé klónoztuk (lásd 6. ábra).

A B fragmentum a genomiális patatinklón pgT5 szekvenciájából (Rosahl és munkatársai, 1986) a 707től az 1895-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza, melyeket egy AGCTTTC szekvenciájú linker segítségével kapcsoltunk az élesztő suc2 génjéhez, amely a + 64-től + 1765-ig terjedő nukleotidokat (Taussig és Carlson, 1983, Nucleic Acids Rés. 11. 1943-1954) foglalja magában. Ily módon az invertáz szekvenciájához egy, a magasabb rendű növények vakuólumaiban a proteinek irányításáért felelős, megfelelő vakuólumtargeting szignállal rendelkező fehérjét N-terminálisan fuzionáltunk. A B fragmentumot EcolEV-Xmnl fragmentumként a pUC 18 polilinker Smal/Pstl hasítási helyei közé tettük (lásd 6. ábra) úgy, hogy a ligálás előtt a Pstl 3’-túlnyúló végét T4 DNS-polimerázzal feltöltöttük.

A C fragmentum (192 bp) a Ti-plazmid pTiACH5 T-DNS-ének a 3-as gén poliadenilációs szignáljának (Gielen és munkatársai, EMBO J. 3. 835-846) a 11 749től 11 939-ig levő nukleotidjait tartalmazza, amelyet a pAGV40 plazmidból (Herrera-Estrella és munkatársai, 1983, Natúré 303.209-213) PvuII-HindlU fragmentumként izoláltunk, és Sphl linkemek a PvuII-hasítási helyhez történő illesztése után a pUC18 polilinker SphlHindlll hasítási helyei közé klónoztuk.

A kapott transzgenikus dohánynövények analízise invertázaktivitás-teszt segítségével mutatta, hogy a suc2 gén által kódolt invertáz most a vakuólumokban lokalizálódott (lásd 9. ábra). A transzgenikus do9

HU 218 048 Β hány a növények törpülésén kívül egy új levéltípust mutat. Ez abban nyilvánul meg, hogy az idősebb leveleken a levélcsúcstól kezdődően klorotikus mezők alakulnak ki.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő vektorba az invertáz gén olyan DNS-szekvenciáját illesztjük be, amely szekvencia által kódolt termék egy növényi genomba való bevezetése a növényben lévő fotoasszimilátumok eloszlását és/vagy képződését megváltoztatja, és ezáltal a növényi habitus és/vagy hozam megváltozásához vezet.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szekvenciaként az élesztő suc2 invertáz génjét alkalmazzuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz gén szekvenciáját más gének regulációs régiójához fuzionáljuk, amelyek biztosítják az invertáz gén expresszióját növényi sejtekben és növényekben.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan invertáz gén DNS-szekvenciáját alkalmazzuk, amely egy olyan DNS-szekvenciához kapcsolódik, amely biztosítja az invertáz irányítását a protein növény vakuólumaiban és növényi sejtekben.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi génekből származó regulációs régiókat - promotereket és terminációs szignálokat - alkalmazunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoterként a karfiol-mozaikvírus 35S RNS promoterét alkalmazzuk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoterként a patatingén B33 I osztály promoterét alkalmazzuk.
8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz protein irányítását vakuólumokban és növényi sejtekben biztosító DNS-szekvenciájaként a Solanum tuberosumból származó patatingén pgT5 DNSszekvenciáját (nukleotidpozíció: +707-től + 1895-ig) alkalmazzuk.
9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz gén suc2 DNS-szekvenciáját más gének regulációs régióihoz fuzionáljuk, amelyek biztosítják az invertáz gén expresszióját növényi sejtekben és növényekben, valamint az invertáz gén elé épített, növények és növényi sejtek endoplazmatikus retikulumába való felvételhez szükséges szignálpeptidhez kapcsoljuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulációs régiókként növényi gének promotereit és terminációs szignáljait alkalmazzuk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoterként az ST-LS1 gén promoterét alkalmazzuk.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoterként a patatingén B33 I osztály promoterét alkalmazzuk.
13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoterként a karfiol-mozaikvírus 35S RNS-promoterét alkalmazzuk.
14. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szignálpeptid DNS-szekvenciájaként Solanum tuberosum proteináz inhibitor II génjéből származó DNS-szekvenciát alkalmazunk.
15. Az 5. vagy 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az octopinszintetáz gén poli-A oldalának a 3’-végét tartalmazó terminális szignált alkalmazunk.
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P35S-Cy-INV (DSM 5785) plazmidot állítunk elő.
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy P35S-CW-INV (DSM 5788) plazmidot állítunk elő.
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy p33-CW-INV (DSM 5787) plazmidot állítunk elő.
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy pl700-CW-INV (DSM 5789) plazmidot állítunk elő.
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy p33-Cy-INV (DSM 5786) plazmidot állítunk elő.
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy p35S-V-INV (DSM 6142) plazmidot állítunk elő.
22. Eljárás habitus és/vagy hozam tekintetében módosított transzgenikus növények előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő növénybe az 1-21. igénypontok valamelyike, vagy ezek közül több, szerinti plazmidot illesztünk be.
23. Eljárás növényi sejt és növény előállítására, azzal jellemezve, hogy a sejtbe vagy a növénybe egy invertáz gén DNS-szekvenciáját illesztjük be, amely egy olyan invertázt kódol, amely a növényi genomba való beültetése után a fotoasszimilátumok elosztását és/vagy képződését megváltoztatja, és ezáltal a habitusban és/vagy a hozamban megjelenő változásokat okoz.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy DNS-szekvenciaként az élesztő suc2 invertáz génjét alkalmazzuk.
25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz gén DNS-szekvenciáját más gének regulációs régióihoz fuzionáljuk, amelyek biztosítják az invertáz gén expresszióját növényi sejtekben és növényekben.
26. A 23. vagy 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz gén DNS-szekvenciáját egy olyan DNS-szekvenciához kapcsoljuk, amely az invertáz fehérje irányítását biztosítja a növény vakuólumaiban és növényi sejtekben.
27. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulációs régiókként növényi gének promotereit és terminációs szignáljait alkalmazzuk.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a karfiol-mozaikvírus 35S RNS promoterét alkalmazzuk.

HU 218 048 Β
29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a patatin B33 osztály I promoterét alkalmazzuk.
30. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az invertáz protein irányítását a vakuólumokban és növényi sejtekben biztosító DNS-szekvenciaként Solanum tuberosumból származó patatingén pgT5 DNS-szekvenciát (nukleotidpozíció: + 707-től +1895-ig) alkalmazunk.
31. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a suc2 invertáz gén szekvenciáját más gének regulációs régióihoz fuzionáljuk, amelyek biztosítják az invertáz gén expresszióját növényi sejtekben és növényekben, valamint az invertáz gén elé épített, a növények és növényi sejtek endoplazmatikus retikulumába való felvételhez szükséges szignálpeptid DNS-szekvenciáját kapcsoljuk hozzá.
32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy regulációs régiókként növényi gének promotereit és terminációs szignáljait alkalmazzuk.
33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként az ST-LS1 gén promoterét alkalmazzuk.
34. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a patatingén B33 I osztály promoterét alkalmazzuk.
35. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy promoterként a karfiol-mozaikvírus 35S RNS promoterét alkalmazzuk.
36. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a szignálpeptid DNS-szekvenciájaként Solanum tuberosum proteináz inhibitor II génjéből származó DNS-szekvenciát alkalmasaink.
37. A 27. vagy 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az octopinszintetáz poli-A oldalának a 3’-végét tartalmazó terminációs szignált alkalmazunk.
38. A 23-37. igénypontok valamelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy haszonnövényt állítunk elő.
39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előállított haszonnövény dohány, burgonya, paradicsom, cukorrépa, szója, árpa, búza, kukorica vagy cukornád.
40. A 22. igénypont szerinti eljárás a magvak, termések, répák és gumók nagyobb száraztömegével rendelkező növények előállítására.
41. A 22. igénypont szerinti eljárás a nagyobb gumójú és nagyobb gumó-száraztömegű burgonyanövények előállítására.
42. Eljárás az aratási hozam növelésére, azzal jellemezve, hogy a 39. igénypont szerinti haszonnövényekkel és növényi termékekkel vetjük be a művelni kívánt területet.