HU217792B - Method for preparing intercellular adhesion molecule (icam-1) and pharmaceutical compositions containing them - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás intercelluláris adhéziós molekula (ICAM–1)olyan oldható fragmentumainak előállítására, amelyek LFA–1-hezkötődnek, tartalmazzák az 1. domént, de hiányzik belőlük atranszmembrán do- mén. A találmány tárgyát képezi az ilyenfragmentumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására szolgálóeljárás is. Az intercelluláris adhéziós molekulák részt vesznek abbana folyamatban, amelyben a limfociták felismerik a gyulladásoshelyeket, odavándorolnak, és rákapcsolódnak a sejtszubsztrátumokra agyulladás folyamán. A találmány tárgyát képezi az ilyen molekulákazonosítására szolgáló in vitro diagnosztikai eljárás is. ŕThe present invention relates to a process for the preparation of soluble fragments of an intercellular adhesion molecule (ICAM-1) which bind to LFA-1, contain domain 1 but lack an atrial membrane domain. The invention also relates to a process for the preparation of pharmaceutical compositions containing such fragments. Intercellular adhesion molecules are involved in the process by which lymphocytes recognize sites of inflammation, migrate there, and attach to cell substrates during encephalitis. The invention also provides an in vitro diagnostic method for such molecular identification. ŕ

Description

A találmány olyan intercelluláris adhéziós molekulákra vonatkozik, mint amilyen az ICÁM -1. Ezek a molekulák egy olyan folyamatban vesznek részt, amelyben a limfocitapopulációk sejtszubsztrátumokat ismernek fel és hozzájuk tapadnak. Ez úgy történik, hogy az említett limfociták a gyulladásos helyekhez vándorolnak, és a gyulladásos reakciók során a sejtszubsztrátumokkal kölcsönhatásba lépnek. Vonatkozik a találmány ezenkívül még olyan ligandummolekulákra is, amelyek képesek az ilyen adhéziós molekulákhoz kapcsolódni, továbbá e ligandumok szűrővizsgálatára és az intercelluláris adhéziós molekulák, a ligandummolekulák és a szűrővizsgálatok alkalmazására.The present invention relates to intercellular adhesion molecules such as ICAM -1. These molecules are involved in a process in which lymphocyte populations recognize and attach to cellular substrates. This is done by migrating said lymphocytes to sites of inflammation and interacting with cellular substrates during inflammatory reactions. The invention also relates to ligand molecules capable of binding to such adhesion molecules, and to screening these ligands and using intercellular adhesion molecules, ligand molecules and screening assays.

A leukocitáknak hozzá kell kapcsolódniuk a sejtszubsztrátumokhoz, hogy megfelelően meg tudják védeni a gazdaszervezetet az idegen behatolókkal szemben, például a baktériumokkal vagy vírusokkal szemben. A védekezőrendszerről kitűnő ismertetést ad H. W. Eisen munkája [Microbiology, 3. kiadás, Harper és Row, Philadelphia (1980), 290-295. és 381-418. oldal]. A leukocitáknak úgy kell hozzákapcsolódniuk az endoteliális sejtekhez, hogy ezek el tudjanak vándorolni a keringésből a folyamatban lévő gyulladások helyére. Ezenkívül hozzá kell kapcsolódniuk az antigénbemutató sejtekhez, hogy végbemehessen a normál specifikus immunválasz, és végül hozzá kell kapcsolódniuk a megfelelő célsejtekhez, hogy a vírussal fertőzött vagy tumorsejtek lízise megtörténhessék.Leukocytes must attach to cellular substrates to adequately protect the host against foreign invaders such as bacteria or viruses. The defense system is excellently described by H. W. Eisen, Microbiology, 3rd edition, Harper and Row, Philadelphia (1980), 290-295. 381-418. side]. Leukocytes must attach to endothelial cells so that they can migrate from the circulation to the site of ongoing inflammation. In addition, they must bind to antigen-presenting cells in order for the normal specific immune response to occur and finally to bind to the appropriate target cells for lysis of virus-infected or tumor cells.

Az utóbbi időben hibridómatechnológiával azonosítottak olyan leukocita felületi molekulákat, amelyek részt vesznek e kapcsolódások közvetítésében. Röviden: humán T-sejtekkel szemben [D. Davignon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78,4535-4539 (1981)] és egérlépsejtekkel szemben [T. Springer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 9, 301-306 (1979)] termelt olyan monoklonális antitesteket azonosítottak, amelyek a leukociták felületére kötődnek, és meggátolják a fent leírt kapcsolódással összefüggő reakciókat [T. Springer és munkatársai, Fed. Proc., 44, 2660-2663 (1985)]. Az ezekkel az antitestekkel azonosított molekulákat Mac-1-nek és Lymphocyte Function-associated Antigén- 1-nek (LFA-1; limfocitafunkcióhoz kapcsolt antigén-1) nevezték el. A Mac-1 egy olyan heterodimer molekula, amely makrofágokon, granulocitákon és nagy, granuális limfocitákon fordul elő. Az LFA-1 szintén heterodimer, amely a legtöbb limfocitán megtalálható [T. A. Springer és munkatársai, Immunoi. Rév., 68, 111-135 (1982)]. Ez a két molekula plusz egy harmadik molekula, a p 150,95 (amelynek a szöveti megoszlása hasonlít a Mac- 1-éhez) játszik szerepet a celluláris adhézióban [G. Keizer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 15, 1142-1147 (1985)].Recently, hybridoma technology has been used to identify leukocyte surface molecules involved in mediating these attachments. Briefly, against human T cells [D. Davignon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, 78, 4535-4539] and mouse spleen cells [T. Springer et al., Eur. J. Immunol., 9, 301-306 (1979), identified monoclonal antibodies that bind to the surface of leukocytes and inhibit the coupling reactions described above [T. Springer et al., Fed. Proc., 44, 2660-2663 (1985)]. The molecules identified by these antibodies were named Mac-1 and Lymphocyte Function-associated Antigen-1 (LFA-1; Lymphocyte Function-Associated Antigen-1). Mac-1 is a heterodimeric molecule that occurs on macrophages, granulocytes, and large granular lymphocytes. LFA-1 is also a heterodimer found on most lymphocytes [T. A. Springer et al., Immunol. Rev., 68, 111-135 (1982)]. These two molecules plus a third molecule, p150.95 (whose tissue distribution is similar to Mac-1), play a role in cellular adhesion [G. Keizer et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985).

A fent leírt leukocitamolekulákról megállapították, hogy egy glükoproteinekkel rokon család tagjai [F. Sanchez-Madrid és munkatársai, J. Exper. Med., 158, 1785-1803 (1983); G. D. Keizer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 15, 1142-1147 (1985)]. E glükoproteincsaládot olyan heterodimerek alkotják, amelyek egy aláncot és egy β-láncot tartalmaznak. Megállapították, hogy míg mindegyik antigén α-lánca különbözik egymástól, a β-lánc nagymértékben állandó [F. SanchezMadrid és munkatársai, J. Exper. Med., 158,1785-1803 (1983)]. Megállapították, hogy a glükoproteincsalád βláncának (néha CD 18 elnevezéssel szerepel) a molekulatömege 95 kD (kilodalton), ugyanakkor az α-lánc molekulatömege 150-180 kD között változik [T. Springer, Fed. Proc., 44,2660-2663 (1985)]. Bár a membránproteinek α-alegységei közt nincs olyan nagyfokú homológia, mint a β-alegységeknél, e glükoproteinek a-alegységeinek pontos analízise kimutatta, hogy alapvető hasonlóságok vannak közöttük. Az LFA - 1-gyel rokon glükoproteinek a- és β-alegységei közt meglévő hasonlóságokat foglalják össze F. Sanchez-Madrid és munkatársai a következő közleményekben: J. Exper. Med., 158, 586-602 (1983) és J. Exper Med., 158, 1785-1803 (1983).The leukocyte molecules described above were found to be members of a family related to glycoproteins [F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983); Keizer, G.D., et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985). This family of glycoproteins is made up of heterodimers comprising a subunit and a β-chain. It has been found that while the α-chains of each antigen are different from each other, the β-chain is highly constant [F. SanchezMadrid et al., J. Exper. Med., 158, 1785-1803 (1983)]. The β chain of the glycoprotein family (sometimes referred to as CD 18) has been found to have a molecular weight of 95 kD (kilodalton), while the molecular weight of the α chain ranges from 150 to 180 kD [T. Springer, Fed. Proc., 44, 2660-2663 (1985). Although the α-subunits of membrane proteins do not have the same degree of homology as the β-subunits, a precise analysis of the α-subunits of these glycoproteins has shown that there are fundamental similarities between them. Similarities between the α and β subunits of the LFA-1-related glycoproteins are summarized by F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med. 158: 586-602 (1983) and J. Exper Med. 158: 1785-1803 (1983).

Több olyan egyént azonosítottak, akik ezen adhéziós proteincsalád egyetlen tagját sem képesek normál mennyiségben kifejezni leukocitasejtjeik felületén [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44,2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668-689 (1985)]. Ezeknek a betegeknek a limfocitái hasonló hiányosságokat mutattak in vitro, mint azok a normál limfociták, amelyeknél az LFA-1-molekulacsaládot antitestekkel gátolták. Ezenkívül ezek az egyének képtelenek voltak normál immunválaszt adni, mivel sejtjeik képtelenek voltak sejtszubsztrátumokhoz hozzátapadni [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44,2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668-689 (1985)]. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az immunreakciók enyhülnek, ha a limfociták nem tudnak normál módon megtapadni annak következtében, hogy hiányoznak az LFA-1-családhoz tartozó funkcionális adhéziós molekulái.Several individuals have been identified who are unable to express normal levels of any member of this adhesion protein family on the surface of their leukocyte cells [D. C. Anderson et al., Fed. Proc., 44,2671-2677 (1985); D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985). The lymphocytes of these patients showed similar deficiencies in vitro as the normal lymphocytes in which the LFA-1 family was inhibited by antibodies. In addition, these individuals were unable to elicit a normal immune response because their cells were unable to adhere to cellular substrates [D. C. Anderson et al., Fed. Proc., 44,2671-2677 (1985); D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985). These data indicate that immune responses are reduced when lymphocytes are unable to attach normally due to a lack of functional adhesion molecules of the LFA-1 family.

Összefoglalva tehát egy állat egészségének és életképességének a fenntartásához az szükséges, hogy limfocitái képesek legyenek más sejtekhez (például endoteliális sejtekhez) hozzátapadni. Megállapították, hogy ehhez az adherenciához sejt-sejt kontaktusok szükségesek, melyben a limfociták sejtfelületén jelen lévő specifikus receptormolekulák vesznek részt. Ezek a receptorok segítik elő, hogy egy limfocita más limfocitákhoz, endoteliális sejtekhez és más, nem vaszkuláris sejtekhez tudjon tapadni. Megállapították, hogy a sejtfelületi receptormolekulák szoros rokonságban vannak egymással. Azoknál az embereknél, akiknél ezek a sejtfelületi receptormolekulák hiányoznak a limfocitákról, krónikus és visszatérő fertőzések fordulnak elő, valamint más klinikai tüneteik is vannak, beleértve a hiányos antitestválaszokat.In conclusion, maintaining the health and viability of an animal requires that its lymphocytes be able to attach to other cells (e.g., endothelial cells). It has been established that this adherence requires cell-to-cell contacts involving specific receptor molecules present on the cell surface of lymphocytes. These receptors help a lymphocyte to attach to other lymphocytes, endothelial cells and other non-vascular cells. Cell surface receptor molecules have been found to be closely related. People who lack these cell surface receptor molecules on lymphocytes have chronic and recurrent infections and have other clinical symptoms, including defective antibody responses.

Minthogy a limfocitaadhézió abban a folyamatban is részt vesz, amelyben egy idegen szövet azonosítása és kilökődése megtörténik, ennek a folyamatnak a megértése nagy jelentőségű a szervátültetés, szövetátültetés, allergia és onkológia területén.Because lymphocyte adhesion also participates in the process of identifying and rejecting a foreign tissue, understanding this process is of great importance in the field of organ transplantation, tissue transplantation, allergy, and oncology.

Rothlein, R. és munkatársai leírnak egy új leukocita sejtfelületi molekulát, a természetes ICÁM-l-et [Journal of Immunology, 137(2), 1270-1274 (1986)], amely mind redukáló, mind nem redukáló körülmények közöttRothlein, R., et al., Describe a novel leukocyte cell surface molecule, natural ICAM-1 (Journal of Immunology, 137 (2), 1270-1274 (1986)), which under both reducing and non-reducing conditions.

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

000 molekulatömegűnek mutatkozik SDS-PAGEmeghatározásban. Kísérletekkel demonstrálják az ICÁM-1-nek számos leukocita-sejtvonal és T-sejt limfoblasztok forbol-észterrel stimulált homotípiás aggregációjában játszott szerepének fontosságát. Továbbá fejtegetik, hogy az ICÁM-1 fontos szerepet játszhat a gyulladások során fellépő adhéziós folyamatok szabályozásában.It has a molecular weight of 000 in SDS-PAGE. Experiments demonstrate the importance of ICAM-1 in the phorbol ester-stimulated homotypic aggregation of several leukocyte cell lines and T-cell lymphoblasts. Furthermore, they explain that ICAM-1 can play an important role in the regulation of adhesion processes during inflammation.

Mariin, S. D. leírja a természetes ICÁM-1-molekula tisztítását [Cell, 57(5), 813-819 (1987)], és kimutatja, hogy ez a molekula egy ligandum az LFA-1ffiggő adhéziós rendszer részére. Kísérletekkel azt is bemutatja, hogy a teljes természetes ICÁM-1-molekula egyedül is elegendő közvetlenül a limfocitaadhézió közvetítésére.Mariin, S.D. describes the purification of the natural ICAM-1 molecule (Cell, 57 (5), 813-819 (1987)) and shows that this molecule is a ligand for the LFA-1 adhesive adhesion system. It also demonstrates experimentally that the entire natural ICAM-1 molecule alone is sufficient to directly mediate lymphocyte adhesion.

Dustin, L. M. és munkatársai további jellemzőket közölnek az ICAM-l-ről [Journal of Immunology, 737(1), 245-254 (1986)]. Leírják a természetes, érett ICAM-1 glükoprotein jellemzőit, intracelluláris prekurzorát és a polipeptidvázat. Szintén megemlítik, hogy az ICÁM -1 szerepet játszhat a gyulladásos folyamatokban és az immunválaszban.Dustin, L.M., et al. (1986) disclose further features of ICAM-1 (Journal of Immunology, 737 (1), 245-254). The characteristics of the native, mature ICAM-1 glycoprotein, intracellular precursor and polypeptide backbone are described. It is also mentioned that ICAM -1 may play a role in the inflammatory process and the immune response.

A jelen találmány tárgyát az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-l=Intercellular Adhesion Molecule-1) szolubilis, funkcionális származékai képezik. Vonatkozik ezenkívül a találmány olyan antitestekre és antitestffagmentumokra, amelyek az ICÁM-1 funkcióját gátolni képesek, valamint az ICÁM -1 funkciós más inhibitoraira, továbbá azokra a vizsgálatokra, amelyekkel ezen inhibitorokat meg lehet határozni. Foglalkozik ezenkívül a találmány minden fent leírt molekula diagnosztikai és terápiás alkalmazásával.The present invention relates to soluble functional derivatives of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1 = Intercellular Adhesion Molecule-1). The invention further relates to antibodies and antibody fragments that are capable of inhibiting ICAM-1 function, and other inhibitors of ICAM-1 function, and assays for determining these inhibitors. The invention further relates to the diagnostic and therapeutic use of each of the above described molecules.

Részletezve: a találmány magában foglalja az ICAM-1 intercelluláris adhéziós molekula szolubilis, funkcionális származékait, amelyek lényegében nem tartalmaznak természetes eredetű szennyeződéseket. A találmányhoz tartoznak az olyan molekulák is, amelyek ezenfelül képesek egy, a limfociták felületén jelen lévő molekulához kötődni.More particularly, the invention includes soluble functional derivatives of the ICAM-1 intercellular adhesion molecule which are substantially free of naturally occurring impurities. The invention also includes molecules which are capable of binding to a molecule present on the surface of lymphocytes.

Foglalkozik továbbá a találmány az ICAM-1 intercelluláris adhéziós molekulával és detektálható jelzéssel ellátott származékaival.The invention further relates to derivatives of ICAM-1 with an intercellular adhesion molecule and detectable labeling.

A találmány egy olyan rekombináns DNS-molekulára is vonatkozik, amely az ICAM-1 vagy funkcionális származéka kifejezésére képes.The invention also relates to a recombinant DNA molecule capable of expressing ICAM-1 or a functional derivative thereof.

A találmány ezenkívül magában foglal egy eljárást az ICAM-1 lényegében tiszta formában való előállítására, amely a következő lépésekből áll:The invention further includes a process for preparing ICAM-1 in substantially pure form, comprising the steps of:

a) szolubilizált ICAM-1-készítmény előállítása céljából az ICÁM-1-et kifejező sejtek membránjából származó ICÁM - 1-et oldhatóvá tesszük,a) solubilizing ICAM-1 from the membrane of cells expressing ICAM-1 for the preparation of a solubilized ICAM-1 formulation,

b) a szolubilizált ICÁM-1-készítményt affinitásmátrixra visszük fel, ez a mátrix olyan antitestet tartalmaz, amely megköti az ICÁM - 1-et,b) applying the solubilized ICAM-1 preparation to an affinity matrix, which matrix contains an antibody that binds ICAM-1,

c) hagyjuk, hogy az affínitásmátrixon lévő antitest megkösse az ICÁM - 1-et,c) allowing the antibody on the affinity matrix to bind ICAM-1,

d) a mátrixról eltávolítunk minden olyan vegyületet, amely nem kötődött az antitesthez, ésd) removing any compound that is not bound to the antibody from the matrix; and

e) az ICÁM- 1-et lényegében tiszta formában izoláljuk úgy, hogy az ICÁM - 1-et a mátrixról eluáljuk.e) isolating ICAM-1 in substantially pure form by eluting ICAM-1 from the matrix.

A találmány foglalkozik ezenkívül egy olyan antitesttel, amely vagy az ICAM-1-molekulához, vagy az ICAM-1 egy funkcionális származékához kötődik. A találmány az ilyen antitestet termelő hibridómasejtre is vonatkozik.The invention further relates to an antibody that binds to either the ICAM-1 molecule or a functional derivative of ICAM-1. The invention also relates to a hybridoma cell producing such an antibody.

A találmány tárgyát képezi az a hibridómasejt is, amely az R6-5-D6 monoklonális antitest termelésére képes.The invention also relates to a hybridoma cell capable of producing monoclonal antibody R6-5-D6.

A találmány magában foglal továbbá egy eljárást a kívánt hibridómasejt előállítására, amely egy olyan antitestet termel, amely az ICÁM-1-hez képes kötődni, s ez az eljárás a következő lépésekből áll:The invention further provides a method for producing a desired hybridoma cell which produces an antibody capable of binding to ICAM-1, comprising the steps of:

a) ICÁM-1-et kifejező sejttel állatot immunizálunk,a) immunizing the animal with a cell expressing ICAM-1,

b) az állat lépsejtjeit egy mielóma-sejtvonallal fuzionáljuk,b) fusing the animal's spleen cells with a myeloma cell line,

c) a fuzionált lép- és mielómasejtekből antitestszekretáló hibridómasejtek képződnek, és(c) fused spleen and myeloma cells form antibody-secreting hybridoma cells; and

d) a hibridómasejteket a kívánt ICÁM-1-hez kötődő antitestet termelő hibridómasejtre szüljük.d) the hybridoma cells are grafted onto the hybridoma cell which produces the antibody which binds to the desired ICAM-1.

A találmány a fenti eljárás szerint kapott hibridómasejtre is és a hibridómasejt által termelt antitestre is vonatkozik.The invention also relates to a hybridoma cell obtained by the above method and to an antibody produced by the hybridoma cell.

A találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás is, amellyel az intercelluláris adhézió nem immunglobulin antangonistáját azonosíthatjuk, mely eljárás a következő lépésekből áll:The present invention also provides a method for identifying a non-immunoglobulin antangonist of intercellular adhesion, comprising the steps of:

a) egy olyan nem immunglobulin hatóanyagot, amely intercellulárisadhézió-ellenes hatást fejt ki, limfocitakészítménnyel inkubálunk, mely limfocitakészítményben a sejtek többsége aggregálödni képes,a) incubating a non-immunoglobulin drug having anti-intercellular adhesion activity with a lymphocyte preparation in which the majority of cells are capable of aggregating,

b) vizsgáljuk a limfocitakészítményt, hogy meghatározzuk, vajon a hatóanyag jelenléte gátolja-e a limfocitakészítmény sejtjeinek aggregálódását; ha aggregációgátlás jön létre, akkor a hatóanyag az intercelluláris adhézió antagonistájának bizonyult.b) testing the lymphocyte composition to determine if the presence of the active agent inhibits cell aggregation of the lymphocyte composition; when inhibition of aggregation occurs, the drug has been shown to be an antagonist of intercellular adhesion.

A találmány foglalkozik még olyan gyulladások kezelésének módszerével, amelyek emlősökön a specifikus védekezőrendszer válaszaként lépnek fel. E módszer szerint az ilyen kezelést igénylő egyénnek egy gyulladásgátló szer olyan mennyiségét adjuk, amely elégséges a gyulladás megszüntetéséhez; a módszer szerint a gyulladásgátló szer vagy ICÁM - 1-hez kötődő antitest, vagy olyan antitestfragmentum, amely képes az ICÁM-1-hez kötődni, vagy ICAM-1 vagy az ICAM-1 funkcionális származéka, vagy az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistája lehet.The invention further relates to a method of treating inflammation that occurs in response to a specific defense system in a mammal. In this method, the subject in need of such treatment is administered an amount of an anti-inflammatory agent sufficient to eliminate the inflammation; according to the method, the anti-inflammatory agent may be either an antibody that binds to ICAM-1, or an antibody fragment that is capable of binding to ICAM-1, or a functional derivative of ICAM-1 or ICAM-1, or a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1. .

A találmány magában foglalja továbbá a gyulladás kezelésének fent leírt módszerét, amelyben az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistája nem azonos az LFA-l-gyel.The invention further encompasses a method of treating inflammation as described above wherein the non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1 is not the same as LFA-1.

A találmány további tárgyát képezi egy olyan eljárás, amellyel a hematopoetikus tumorsejt - e sejt migrációjához szükség van az LFA-1-család egy funkcionális tagjára - metasztázisa meggátolható. Az eljárás szerint egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, a metasztázis gátlásához elegendő mennyiséget adunk a gyulladásgátló anyagból. A gyulladásgátló anyag vagy egy olyan antitest lehet, amely kötődik az ICAM-1hez, vagy olyan antitestfragmentum, amely kötődik az ICÁM-1-hez, vagy ICAM-1 vagy az ICAM-1 egyIt is a further object of the present invention to provide a method of inhibiting the metastasis of a hematopoietic tumor cell, which requires a functional member of the LFA-1 family for its migration. The method involves administering to a patient in need of such treatment an amount of antiinflammatory agent sufficient to inhibit metastasis. The anti-inflammatory agent may be either an antibody that binds to ICAM-1, or an antibody fragment that binds to ICAM-1, or an ICAM-1 or ICAM-1 antibody.

HU 217 792 Β funkcionális származéka, vagy az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistája lehet.EN 217 792 IC or may be a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1.

Vonatkozik a találmány a hematopoetikus tumorsejt metasztázisa gátlásának fent leírt eljárására, amelyben azonban az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistája egy nem LFA-1 típusú ICAM-1 nem immunglobulin antagonista.The invention relates to a method of inhibiting hematopoietic tumor cell metastasis as described above, wherein, however, the non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1 is a non-immunoglobulin antagonist of non-LFA-1 type.

A találmány egy olyan eljárást is tartalmaz, amellyel egy ICAM-l-et kifejező tumorsejt növekedését gátoljuk meg. Az eljárás szerint egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, egy toxinból a növekedés gátlásához elégséges mennyiséget adunk, s ez a toxin egy toxinnal módosított ICÁM-1-hez kötődni képes antitest vagy toxinnal módosított olyan antitest-fragmentum lehet, amely az ICÁM-1-hez kötődni képes, vagy az LFA-1-molekulacsalád toxinnal módosított egy tagja vagy az LFA-1-molekulacsalád egy toxinnal módosított funkcionális származéka lehet.The invention also provides a method of inhibiting the growth of a tumor cell expressing ICAM-1. The method comprises administering to a patient in need of such treatment an amount sufficient to inhibit growth of a toxin, which may be an antibody capable of binding to a toxin-modified ICAM-1 or a toxin-modified antibody fragment that is an inhibitor of ICAM-1. can be either a toxin-modified member of the LFA-1 family, or a toxin-modified functional derivative of the LFA-1 family.

Foglalkozik még a találmány egy olyan eljárással is, amellyel az LFA-l-et kifejező tumorsejt növekedését gátoljuk meg. Az eljárás szerint egy betegnek, aki ilyen kezelést igényel, a tumorsejt növekedésének gátlásához elegendő mennyiségű toxint adunk, s ez a toxin vagy toxinnal módosított ICAM-1, vagy az ICAM-1 egy toxinnal módosított funkcionális származéka lehet.The invention further provides a method of inhibiting the growth of a tumor cell expressing LFA-1. The method comprises administering to a patient in need of such treatment an amount of a toxin sufficient to inhibit tumor cell growth, which may be either a toxin-modified ICAM-1 or a toxin-modified functional derivative of ICAM-1.

A találmány tárgyát képezi még egy olyan módszer, amellyel olyan emlősökben, amelyeknél gyulladás gyanúja áll fenn, egy olyan gyulladás jelenlétét és helyét diagnosztizáljuk, amely a specifikus védekezőrendszer válaszának következményeként alakult ki, s e módszer abból áll, hogyThe present invention further provides a method for diagnosing the presence and location of an inflammation in a mammal suspected of having an inflammation that results from the response of a specific defense system, which comprises:

a) a betegnek detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum ICAM-l-et kifejező sejtet tud azonosítani, ésa) administering to the patient a composition comprising a detectable labeled ligand capable of identifying a cell expressing ICAM-1, and

b) a kötődő ligandumot észleljük.b) detecting the binding ligand.

A találmány ezenfelül megad egy diagnosztikai módszert, amellyel emlősökben, akiknél gyulladás gyanúja áll fenn, egy olyan gyulladás jelenlétét és helyét diagnosztizáljuk, amely a specifikus védekezőrendszer válaszának eredménye, s e módszer a következőket tartalmazza:The invention further provides a diagnostic method for diagnosing the presence and location of an inflammation in a mammal suspected of having an inflammation that results from a specific defense system response, comprising:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan készítménnyel inkubáljuk, amely egy detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmaz, mely ligandum ICAM-l-et kifejző sejt azonosítására képes, ésa) incubating a patient tissue sample with a composition comprising a detectable labeled ligand capable of identifying a cell expressing ICAM-1, and

b) a kötődő ligandumot észleljük.b) detecting the binding ligand.

A találmány egy további olyan módszert is tartalmaz, amellyel ICÁM-1 -et kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk emlősökben, ha ilyen sejt jelenlétének gyanúja merül fel, s a módszer a következőket tartalmazza:The present invention further provides a method of diagnosing the presence and location of a tumor cell expressing ICAM-1 in a mammal when the presence of such a cell is suspected, comprising:

a) a betegnek egy detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum ICÁM- 1-hez képes kötődni, s ez a ligandum vagy egy antitest, vagy egy olyan antitestfragmentum lehet, amely ICÁM- 1-hez képes kötődni, ésa) administering to the patient a composition comprising a detectably labeled ligand capable of binding to ICAM-1, which ligand can be either an antibody or an antibody fragment capable of binding to ICAM-1, and

b) a kötődő ligandumot észleljük.b) detecting the binding ligand.

A találmány tartalmaz ezenkívül egy olyan módszert, amellyel ICAM-l-et kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk emlősökben, ha ilyen sejt jelenlétének gyanúja merül fel, s a módszer a következőket tartalmazza:The invention further provides a method of diagnosing the presence and location of a tumor cell expressing ICAM-1 in a mammal when the presence of such a cell is suspected, comprising:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan készítménnyel inkubáljuk, amely detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmaz, mely ligandum ICAM-1hez képes kötődni, és a ligandum vagy egy antitest, vagy egy olyan antitestfragmentum lehet, amely ICÁM- 1-hez képes kötődni, ésa) incubating the tissue sample from the patient with a composition comprising a detectable labeled ligand capable of binding to ICAM-1, which ligand can be either an antibody or an antibody fragment capable of binding to ICAMM-1, and

b) a kötődő ligandumot észleljük.b) detecting the binding ligand.

A találmány egy további olyan módszert tartalmaz, amellyel az LFA-1-molekulacsalád egy tagját kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk egy betegben, akinél ilyen sejt jelenlétét feltételezzük, s a módszer a következőket tartalmazza:The present invention further provides a method of diagnosing the presence and location of a tumor cell expressing a member of the LFA-1 family of molecules in a patient suspected of having such a cell, comprising:

a) a betegnek egy olyan detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum az LFA-1-molekulacsalád egy tagjához képes kötődni, és ez a ligandum vagy ICAM-1 vagy ICAM-1 egy funkcionális származéka lehet, ésa) administering to the patient a composition comprising a detectable labeled ligand which is capable of binding to a member of the LFA-1 family of molecules and which may be a functional derivative of either the ligand or ICAM-1 or ICAM-1, and

b) a kötődő ligandumot észleljük.b) detecting the binding ligand.

A találmány egy további olyan módszerre is vonatkozik, amellyel az LFA-1-molekulacsalád valamely tagját kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk egy betegben, akinél ilyen sejt jelenlétét feltételezzük, a módszer a következőket tartalmazza:The present invention also provides a method for diagnosing the presence and location of a tumor cell expressing a member of the LFA-1 family in a patient suspected of having such a cell, the method comprising:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan detektálható jelzéssel ellátott ligandum jelenlétében inkubáljuk, amely az LFA-1-molekulacsalád egy tagjához képes kötődni, s ez a ligandum vagy ICAM-1, vagy az ICAM-1 egy funkcionális származéka lehet, ésa) incubating a patient tissue sample in the presence of a detectable labeled ligand capable of binding to a member of the LFA-1 family of molecules, which may be a functional derivative of either ICAM-1 or ICAM-1, and

b) észleljük a kötődő ligandumot, amely a szövetmintában lévő LFA-1-molekulacsalád egy tagjához van kötve.b) detecting the binding ligand bound to a member of the LFA-1 family of molecules in the tissue sample.

A találmány magában foglal még egy olyan gyógyszerkészítményt, amelyThe invention further provides a pharmaceutical composition which

a) olyan gyulladásgátló hatóanyagot tartalmaz, amely vagy az ICÁM - 1-hez kötődő antitest, vagy egy antitestfragmentum lehet, mely fragmentum az ICÁM-1-hez kötődik, vagy az ICAM-1 egy funkcionális származéka vagy az ICÁM -1 egy nem immunglobulin antagonistája lehet, és amely(a) it contains an anti-inflammatory agent which may be either an antibody that binds to ICAM-1 or an antibody fragment that binds to ICAM-1 or a functional derivative of ICAM-1 or an antagonist of non-immunoglobulin ICAM-1 can and which

b) legalább egy olyan immunszupresszív hatóanyagot tartalmaz, amely vagy dexametazon, vagy azatiopirin vagy ciklosporin A lehet.b) contains at least one immunosuppressive agent which may be either dexamethasone or azathiopyrine or cyclosporin A.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.The following is a brief description of the figures.

Az 1. ábra egy normál és egy LFA-1-hiányos sejt közötti adhéziót ábrázol.Figure 1 shows the adhesion between a normal and an LFA-1 deficient cell.

A 2. ábra két normál sejt közötti adhézió folyamatát ábrázolja.Figure 2 illustrates the process of adhesion between two normal cells.

A 3. ábrán a celluláris aggregáció kinetikáját mutatjuk be 50 ng/ml PMA jelenlétében (o) és távollétében ^(χ).Figure 3 shows the kinetics of cellular aggregation in the presence (o) and in the absence ^{(χ) of} 50 ng / ml PMA.

A 4. ábra az LFA -1 és az LFA-1 + sejtek közötti aggregációt mutatja be. Karboxi-fluoreszcein-diacetáttal jelzett EBV-transzformált sejteket (10⁴) összekevertünk PMA jelenlétében 10⁵ nem jelzett autológ sejttel (tele oszlopok) vagy JY-sejtekkel (üres oszlopok). Másfél óra után a 2. példa szerinti kvalitatív vizsgálatot használva megszámoltuk a jelzett sejteket az aggregátumban vagy a szabadon lévő jelzett sejteket. Az aggre4Figure 4 shows aggregation between LFA -1 and LFA-1 + cells. Carboxyfluorescein diacetate-labeled EBV-transformed cells (10 ⁴ ) were mixed with 10 ⁵ unlabeled autologous cells (full columns) or JY cells (empty columns) in the presence of PMA. After 1.5 hours, using the qualitative assay of Example 2, labeled cells in the aggregate or free labeled cells were counted. The aggre4

HU 217 792 Β gátumban lévő jelzett sejtek számát százalékban adjuk meg. Két kísérletből az egyik reprezentatív eredményét adjuk meg.The percentage of labeled cells per day is given. Representative results from one of two experiments are given.

Az 5. ábrán az ICAM-1 és a JY eredetű LFA-1 immunprecipitációja látható. A JY-sejtek Triton X-100 lizátumait (1. és 2. nyomsáv) vagy a kontroll lizálópuffert (3. és 4. nyomsáv) az ICÁM-1-hez kötődni képes antitesttel (1. és 3. nyomsáv) vagy az LFA - 1-et kötni képes antitesttel (2. és 4. nyomsáv) immunprecipitáltuk. Az A mező a redukáló körülmények között kapott eredményeket, a B mező pedig a nem redukáló körülmények között kapott eredményeket mutatja. A molekulatömegstandardokat az S nyomsávban futtattuk.Figure 5 shows immunoprecipitation of ICAM-1 and JY-derived LFA-1. Triton X-100 lysates (lanes 1 and 2) or control lysis buffer (lanes 3 and 4) of JY cells with antibody capable of binding to ICAM-1 (lanes 1 and 3) or LFA - 1-binding antibody (lanes 2 and 4) was immunoprecipitated. Field A shows the results under reducing conditions and Field B shows the results obtained under non-reducing conditions. Molecular weight standards were run in the S band.

A 6. ábra az IL-l-nek és a gamma-interferonnak humán dermális fibroblasztokon az ICAM-1 expressziójára gyakorolt hatása kinetikáját ábrázolja. Humán dermális fíbroblasztokat szaporítottunk 8-10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig, IL-l-et (10 egység/ml, betöltött körök), vagy rekombináns gamma-interferont (10 egység/ml, üres négyzetek) adtunk a sejtekhez, és a jelzett időkben vett mintákat 4 °C-ra hűtöttük, és elvégeztük az indirekt kötési vizsgálatot. A standard deviáció nem haladta meg a 10%-ot.Figure 6 shows the kinetics of the effect of IL-1 and interferon gamma on the expression of ICAM-1 in human dermal fibroblasts. Human dermal fibroblasts were grown to a density of 8-10 ⁴ cells / well (0.32 cm ² ), IL-1 (10 units / ml, filled circles) or recombinant gamma interferon (10 units / ml, blank squares) were added. cells and samples taken at the indicated times were cooled to 4 ° C and subjected to indirect binding assay. The standard deviation did not exceed 10%.

A 7. ábra az IL-1 és a gamma-interferon ICÁM-1re gyakorolt hatásának koncentrációfüggését mutatja be. Humán dermális fíbroblasztokat szaporítottunk 8· 10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. Az IL-2-t (üres körök), a rekombináns humán IL-l-et (üres négyzetek), a rekombináns egér IL-l-et (betöltött négyzetek), a rekombináns humán gamma-interferont (betöltött körök) és a rekombináns β-interferont (üres háromszögek) a jelzett hígításban adagoltuk, és 4 órán át (IL-1) vagy 16 órán át (β- és gamma-interferon) inkubáltuk. A kapott eredmények négy meghatározás átlagértékei, a standard deviáció nem haladta meg a 10%-ot.Figure 7 shows the concentration dependence of the effect of IL-1 and interferon gamma on ICAM-1. Human dermal fibroblasts were grown to a density of 8 x 10 ⁴ cells / well (0.32 cm ² ). IL-2 (empty circles), recombinant human IL-1 (empty squares), recombinant mouse IL-1 (filled squares), recombinant human gamma interferon (filled circles), and recombinant human Interferon-β (empty triangles) was added at the indicated dilution and incubated for 4 hours (IL-1) or 16 hours (interferon-β and gamma). The results obtained are the average of four determinations, the standard deviation not exceeding 10%.

A 8. ábrán az ICAM-1 cDNS nukleotid- és aminosavszekvenciája látható. Az első ATG az 58. pozícióban van. Az ICÁM -1 tripszines peptideknek megfelelő transzlatált szekvenciákat aláhúztuk. A feltételezett hidrofób szignálpeptidet, valamint a transzmembrán szekvenciákat vastagon aláhúztuk. Az N-glükozilációs helyeket bekereteztük. A 2976-os pozícióban lévő poliadenilációs AAT AAA szignált foléhúzott vonallal jelöltük meg. Az ábrázolt szekvencia a HL-60 cDNS-klón szekvenciája. Az endoteliális sejt cDNS-t majdnem teljes hosszában szekvenáltuk, és ez csak csekély különbségeket mutatott.Figure 8 shows the nucleotide and amino acid sequences of ICAM-1 cDNA. The first ATG is in position 58. Translated sequences corresponding to ICAM-1 trypsin peptides are underlined. The putative hydrophobic signal peptide as well as the transmembrane sequences were bold underlined. N-glycosylation sites are boxed. The polyadenylation AAT AAA signal at position 2976 is indicated by a foliage line. The sequence shown is that of the HL-60 cDNA clone. Almost the entire length of the endothelial cell cDNA was sequenced and showed only slight differences.

A 9. ábra az ICÁM-1 homológ doménjeit és rokonságát ábrázolja az immunglobulin szupergéncsaláddal.Figure 9 depicts homologous domains and affinity of ICAM-1 with the immunoglobulin supergene family.

A 9A. ábra 5 homológ domént (D 1-5) ábrázol. A két vagy több azonos csoport esetén az egybeeső részt bekereteztük. A NCAM-doménekben a kétszer vagy többször előforduló állandó csoportokat, valamint a C2 és Cl készletek doménjeiben lévő állandó csoportokat összehasonlítottuk az ICAM-1 belső ismétlődő szekvenciáival. Az ICAM-1 dómén várható β-szálainak helyzetét keretekkel és az összehasonlító sorok fölött lévő kisbetűkkel jeleztük, az immunglobulin C doménekben lévő β-szálak ismert helyét keretekkel és az összehasonlító sorok alatti nagybetűkkel jelöltük.9A. Figure 5 depicts 5 homologous domains (D 1-5). For two or more identical groups, the overlapping section is framed. The double or multiple constant groups in the NCAM domains and the constant groups in the C2 and Cl repertoire domains were compared with the ICAM-1 internal repeats. The position of the expected β-strands of the ICAM-1 domain is indicated by frames and lower case letters above the reference lines, the known positions of the β-strands in the immunoglobulin C domains are indicated by frames and upper case letters below the reference lines.

Az ICÁM -1 doméneken belül feltételezett diszulfidhidak helyét S-S jelzi.The position of disulfide bridges within ICAM -1 domains is indicated by S-S.

A 9B.-D. ábrák az ICAM-l-doménekkel analóg protein domének összehasonlítását mutatják; a proteinek kezdeti összehasonlítása úgy történt, hogy átkutattuk az NBRF-adatbázist a FASTP-program segítségével. A kapott szekvenciák a következők: MAG, NCAM T-sejtreceptor, α-alegység, V-domén, IgMp-lánc és α-1 βglükoprotein.9B.-D. Figures 3 to 5 are comparisons of protein domains analogous to ICAM-1 domains; Protein comparisons were initially made by scanning the NBRF database using the FASTP program. The resulting sequences are MAG, NCAM T cell receptor, α-subunit, V-domain, IgMp chain and α-1 β-glycoprotein.

A 10. ábrán az ICÁM -1 és a MAG szekunder szerkezetének az összehasonlítása látható.Figure 10 shows a comparison of the secondary structure of ICAM -1 and MAG.

All. ábra az LFA-1 pozitív EBV-transzformált Blimfoblasztoid sejtek kötődését ábrázolja ICÁM- 1-hez planáris membránokon.All. Figure 3B shows the binding of LFA-1 positive EBV-transformed Blimphoblastoid cells to ICAM-1 on planar membranes.

A 12. ábra az LFA-1 pozitív T-limfoblasztok és Tlimfómasejtek kötődését ábrázolja ICÁM-1-hez műanyaghoz kötött vezikulumokban.Figure 12 shows the binding of LFA-1 positive T-lymphoblasts and Thymphoma cells to ICAM-1 in plastic-bound vesicles.

A 13. ábra az JY B-limfoblasztoid sejtek ICAM-1hez való kötődésének gátlását mutatja be műanyaghoz kötött vezikulumokban. A sejteket vagy a vezikulumokat előzőleg monoklonális antitestekkel kezeltük.Figure 13 shows the inhibition of binding of JY B lymphoblastoid cells to ICAM-1 in plastic-bound vesicles. The cells or vesicles were previously treated with monoclonal antibodies.

A 14. ábra a hőmérséklet hatását mutatja be a Tlimfoblasztoknak ICÁM-1-hez való kötődésére műanyaghoz kötött vezikulumokban.Figure 14 shows the effect of temperature on the binding of Tymphoblasts to ICAM-1 in plastic-bound vesicles.

A 15. ábra a T-limfoblasztok ICÁM - 1-hez való kötődésének divalens kationszükségletét ábrázolja műanyaghoz kötött vezikulumokban.Figure 15 depicts the divalent cationic requirement for the binding of T-lymphoblasts to ICAM-1 in plastic-bound vesicles.

A 16. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a Tsej ttel összefüggő OKT3 antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. Az „OKT3” jel az antigén hozzáadását jelenti.Figure 16 illustrates the effect of anti-adhesion antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to recognition of T cell-associated OKT3 antigen. "OKT3" signifies addition of antigen.

A 17. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a nem specifikus T-sejt mitogén, a Concanavalin A felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. A „CONA” jel a Concanavalin A hozzáadását jelenti.Figure 17 illustrates the effect of anti-adhesion antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to the recognition of a non-specific T cell mitogen, Concanavalin A. The "CONA" sign indicates the addition of Concanavalin A.

A 18. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a kagylóhemocianin (keyhole limpet hemocyanin) antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. A „KLH” jel a kagylóhemocianinnak a sejtekhez való hozzáadását jelenti.Figure 18 illustrates the effect of anti-adhesion antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to the recognition of a mussel hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) antigen. The "KLH" mark refers to the addition of mussel hemocyanin to the cells.

A 19. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a tetanusz toxoid antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. Az „AGN” jel a tetanusz toxoidnak a sejtekhez való hozzáadását jelenti.Figure 19 illustrates the effect of anti-adhesion antibodies on the ability of peripheral blood mononuclear cells to proliferate in response to tetanus toxoid antigen recognition. The "AGN" sign refers to the addition of the tetanus toxoid to the cells.

A 20. ábra az RR1/1, R6.5, LB2 és CL203 monoklonális antitestekben az ICAM-1 deléciós mutánsokhoz való kötődését ábrázolja.Figure 20 shows the binding of the ICAM-1 deletion mutants to the monoclonal antibodies RR1 / 1, R6.5, LB2 and CL203.

A 21. ábra az ICAM-1 deléciós mutánsoknak az LFA- 1-hez való kötődését ábrázolja.Figure 21 shows the binding of ICAM-1 deletion mutants to LFA-1.

A 22. ábra az RR1/1, R6.5, LB2 és CL203 antiICAM-1 mononukleáris antitestek által felismert epitopokat mutatja be.Figure 22 depicts epitopes recognized by the anti1CAM-1 mononuclear antibodies RR1 / 1, R6.5, LB2 and CL203.

A 23. ábra az ICAM-1 dómén-2 mutánsainak LFA-1 -kötő kapacitását mutatja be.Figure 23 shows the LFA-1 binding capacity of the domain-2 mutants of ICAM-1.

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

A 24. ábra az ICAM-1 domén-3 mutánsainak LFA-1-kötő kapacitását mutatja be.Figure 24 shows the LFA-1 binding capacity of ICAM-1 domain-3 mutants.

A 25. ábra az ICAM-1 dómén-1 mutánsainak LFA-1-kötő kapacitását mutatja be.Figure 25 shows the LFA-1 binding capacity of the domain-1 mutants of ICAM-1.

A 26. ábra ICÁM aminoterminális domének összehasonlítását ábrázolja.Figure 26 shows a comparison of the amino terminal domains of ICAM.

A jelen találmány - egyik szempontja szerint - egy LFA-l-hez kötődő természetes ligandumra vonatkozik. Azokat a molekulákat - ilyenek az LFA-l-család molekulái -, amelyek a sejtek adhéziójának folyamatában részt vesznek, „adhéziós molekulák”-nak nevezzük.In one aspect, the present invention relates to a natural ligand that binds to LFA-1. Molecules, such as those of the LFA-1 family, that are involved in cell adhesion are called "adhesion molecules."

A találmány szerinti természetes ligandum „intercelluláris adhéziós molekula-1” vagy „ICAM-1” elnevezést kapott. Az ICAM-1 egy 76-97 kD-os glükoprotein. Az ICÁM -1 nem heterodimer. A találmány az ICÁM-1-re és „funkcionális származékai”-ra vonatkozik. Az ICAM-1 „funkcionális származéka” egy olyan vegyület, amelynek a biológiai aktivitása (akár funkcionálisan, akár strukturálisan) lényegében hasonló az ICÁM-1 biológiai aktivitásához. A „funkcionális származékok” kifejezés magában foglalja egy molekula „fragmentumait”, „variánsait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait”. Egy molekula, például az ICÁM -1 „fragmentuma” alatt a molekula bármely polipeptidrészét értjük. Főként azokat az ICAM-l-fragmentumokat helyezzük előnybe, amelyek 1CAM-1aktivitást fejtenek ki és szolubilisek (nincsenek membránhoz kötve). Egy molekula, például az ICAM-1 „variánsa” alatt egy olyan molekulát értünk, amely strukturális és funkcionális szempontból lényegében vagy a teljes molekulához, vagy ennek egy fragmentumához hasonló. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha mindkét molekulának lényegében hasonló a szerkezete vagy mindkét molekulának hasonló a biológiai aktivitása. Tehát feltéve, hogy két molekula hasonló aktivitású, akkor variánsoknak tekinthetők, minthogy itt ezt a kifejezést használjuk abban az esetben is, ha az egyik molekula szerkezete eltér a másikétól, vagy ha aminosavszekvenciájuk nem azonos. Egy molekula, például az ICÁM -1 „analóg”-] a egy olyan molekulának felel meg, amely funkció szempontjából lényegében vagy a teljes molekulához, vagy ennek a fragmentumához hasonlít. Ha egy molekuláról azt mondjuk, hogy egy másik molekula „kémiai származéka”, itt azt jelenti, hogy olyan kiegészítő kémiai csoportokat tartalmaz, amelyek normál körülmények között nem részei a molekulának. Az ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, abszorpcióját, biológiai féléletidejét stb. Az ilyen hatások közvetítésére alkalmas csoportokat ismertet a Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) című kiadvány. A „toxinnal módosított” molekula egy olyan molekula (mint az ICAM-1 vagy egy antitest), amely egy toxinrészt tartalmaz. Ha egy ilyen molekula egy sejthez kötődik, akkor a toxinmolekula szoros közelségbe kerül a sejttel, és ezáltal elősegítheti a sejt pusztulását. Bármilyen alkalmas toxinrész alkalmazható, azonban előnyös, ha olyan toxint használunk, mint például a ricintoxin, a diftériatoxin, a radioizotóp toxinok, a membráncsatomaképző toxinok stb. Az ilyen csoportoknak egy molekulához való kapcsolására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen.The natural ligand of the invention is designated "intercellular adhesion molecule-1" or "ICAM-1". ICAM-1 is a 76-97 kD glycoprotein. ICAM -1 is not a heterodimer. The invention relates to ICAM-1 and its "functional derivatives". The "functional derivative" of ICAM-1 is a compound whose biological activity (either functionally or structurally) is substantially similar to that of ICAMM-1. The term "functional derivatives" includes "fragments", "variants", "analogs" or "chemical derivatives" of a molecule. A "fragment" of an molecule, such as ICAM-1, is understood to mean any polypeptide portion of the molecule. Especially those ICAM-1 fragments that express 1CAM-1 activity and are soluble (not membrane bound) are preferred. A "variant" of an molecule, such as ICAM-1, is a molecule that is structurally and functionally substantially similar to the entire molecule or a fragment thereof. One molecule is said to be "substantially similar" to another molecule if both molecules have substantially the same structure or have the same biological activity. Thus, provided that two molecules have similar activity, they may be considered variants, since the term is used here even if the structure of one molecule is different from the other or if the amino acid sequence is not the same. A molecule, such as ICAM -1, "analog" -] corresponds to a molecule that is functionally similar to either the entire molecule or a fragment thereof. When one molecule is said to be a "chemical derivative" of another molecule, it means that it contains additional chemical groups that are not normally part of the molecule. Such groups may improve the solubility, absorption, biological half-life, etc. of the molecule. Groups capable of mediating such effects are described in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). A "toxin modified" molecule is a molecule (such as ICAM-1 or an antibody) that contains a portion of a toxin. When such a molecule binds to a cell, the toxin molecule is placed in close proximity to the cell, thereby promoting cell death. Any suitable toxin moiety may be used, but it is preferred to use a toxin such as ricin toxin, diphtheria toxin, radioisotope toxins, membrane channel-forming toxins, and the like. Methods for linking such groups to a molecule are well known in the art.

Egy antigénmolekula, mint az ICAM-1 vagy az LFA-1-molekulacsalád tagjai természetes körülmények között a limfociták felszínén fejeződnek ki. Tehát, ha egy ilyen sejtet megfelelő állatba juttatunk be, például intraperitoneális injekcióban stb., olyan antitestek termelését fogja kiváltani, amely képes lesz az ICÁM-1-hez vagy az LFA-1-molekulacsalád tagjaihoz kötődni. Ha kívánt, egy ilyen állat szérumát le lehet venni, és fel lehet használni az ezen molekulákhoz kötődő poliklonális antitestek forrásaként. Előnyösebb azonban, ha az ilyen állatból levesszük a lépsejteket, és e lépsejteket mielóma-sejtvonallal fuzionáljuk, majd a fúziós sejteket olyan hibridómasejtek képzésére késztetjük, amelyek ICÁM- 1-et vagy az LFA-1-molekulacsalád tagjait kötő monoklonális antitestet szekretálnak.Members of an antigenic molecule, such as the ICAM-1 or LFA-1 family, are naturally expressed on the surface of lymphocytes. Thus, when such a cell is introduced into a suitable animal, for example, by intraperitoneal injection, etc., it will produce an antibody capable of binding to ICAM-1 or members of the LFA-1 family of molecules. If desired, the serum of such an animal can be harvested and used as a source of polyclonal antibodies that bind to these molecules. More preferably, however, spleen cells from such an animal are harvested and fused with a myeloma cell line, and the fusion cells are induced to form hybridoma cells that secrete a monoclonal antibody that binds ICAM-1 or members of the LFA-1 family of molecules.

A fentiekben leírt módon kapott hibridómasejteket különböző módszerekkel szűrhetjük abból a célból, hogy azokat a kívánt hibridómasejteket azonosítsuk, amelyek vagy az ICÁM-1-hez, vagy az LFA-1-molekulacsalád tagjaihoz képesek kötődni. Egy előnyös szűrővizsgálat szerint az ilyen molekulákat az Epstein-Barr-vírussal transzformált sejtek aggregációját gátló képességük alapján azonosítjuk. Azokat az antitesteket, amelyek ezt az aggregációt gátolják, tovább szüljük, hogy meghatározzuk, vajon ez az aggregációgátlás az ICÁM-1-hez való kötődésük révén jött-e létre. Bármilyen olyan módszer használható egy ilyen szűrővizsgálatban, ami az ICÁM- 1-et az LFA-1-molekulacsaládtól megkülönbözteti. Tehát például az antitest által megkötött antigént immunprecipitációval vagy poliakrilamidgél-elektroforézissel analizálhatjuk. Ha a megkötött antigén az LFA-1molekulcsalád tagja, akkor az immunprecipitált antigén dimerként viselkedik, míg ha a megkötött antigén az ICAM-1, akkor egyetlen molekulatömeg-féleséget immunprecipitáltunk. Egy más módon úgy lehetséges megkülönböztetni a két antitestet, azaz, hogy melyik kötődik az LFA-1-molekulacsalád tagjaihoz és melyik kötődik az ICÁM- 1-hez, hogy a granulocitákhoz való kötődésre szűrünk, ugyanis a granulociták LFA-l-et fejeznek ki, de ICÁM-1-et nem. Az antitestnek (amelyről tudjuk, hogy meggátolja a sejt aggregációját) az a képessége, hogy kötődik a granulocitákhoz, azt jelenti, hogy az antitest megköti az LFA-l-et. A kötődés elmaradása arra utal, hogy az antitest az ICAM-1 felismerésére képes. A sejtnek azon tulajdonságát, hogy kötődik-e egy sejthez - például granulocitához -, általában használt eszközökkel határozhatják meg az általános jártassággal rendelkező szakemberek. Az ilyen eszközök közé tartoznak az immunassay-k, a sejtagglutinációk, a szűrőlemezekhez való kötés vizsgálata, antitestprecipitáció stb.The hybridoma cells obtained as described above may be screened by various methods to identify the desired hybridoma cells that are capable of binding to either ICAM-1 or members of the LFA-1 family of molecules. In a preferred screening assay, such molecules are identified by their ability to inhibit aggregation of cells transformed with Epstein-Barr virus. Antibodies that inhibit this aggregation are further elicited to determine whether this inhibition of aggregation is due to their binding to ICAM-1. Any method that differentiates ICAM-1 from the LFA-1 family of molecules can be used in such a screening assay. Thus, for example, the antibody-bound antigen may be analyzed by immunoprecipitation or polyacrylamide gel electrophoresis. If the bound antigen is a member of the LFA-1 family of molecules, the immunoprecipitated antigen behaves as a dimer, whereas if the bound antigen is ICAM-1, a single molecular weight species is immunoprecipitated. Alternatively, it is possible to distinguish between the two antibodies, which binds to members of the LFA-1 family of molecules and binds to ICAM-1 by screening for binding to granulocytes, since granulocytes express LFA-1, but not ICAM-1. The ability of the antibody (known to inhibit cell aggregation) to bind to granulocytes means that the antibody binds LFA-1. The lack of binding indicates that the antibody is capable of recognizing ICAM-1. The ability of a cell to bind to a cell, such as granulocytes, can be determined by commonly used tools by those of ordinary skill in the art. Such devices include immunoassays, cellular agglutination, binding to filter plates, antibody precipitation, and the like.

A találmány szerinti aggregációellenes antitesteket egy másik módszer szerint is azonosíthatjuk; éspedig úgy, hogy mérjük, hogy ezen antitestek különbözőképpen képesek-e kötődni az ICÁM-1-et kifejező sejtekhez (ilyenek az aktivált endoteliális sejtek) és azokhoz a sejtekhez, amelyek nem fejeznek ki ICÁM-1-et,The anti-aggregation antibodies of the invention may also be identified by another method; namely, measuring the ability of these antibodies to bind differently to cells expressing ICAM-1 (such as activated endothelial cells) and to cells that do not express ICAM-1,

HU 217 792 Β azaz ezekhez nem képesek kötődni. Az általános jártassággal rendelkező szakemberek megfelelően fogják értékelni azt a lehetőséget, hogy a fenti vizsgálat módosítható, és más sorrendben is elvégezhető, miáltal számos lehetséges szűrővizsgálati módszer keletkezhet, azonban ezek mindegyike alkalmas a meghatározásra és arra, hogy megkülönböztesse az ICÁM-1-et megkötő antitesteket az LFA-1-molekulacsalád tagjait kötő antitestektől.They cannot bind to these. It will be appreciated by those of ordinary skill in the art that the above assay may be modified and performed in a different order, resulting in a number of possible screening methods, but all of which are capable of assaying and discriminating between antibodies that bind ICAM-1. antibodies binding members of the LFA-1 family of molecules.

A találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagok előállíthatok természetes eljárásokkal (például úgy, hogy egy állatot, növényt, gombát, baktériumot stb. arra késztetünk, hogy egy ICAM-1 nem immunglobulin antagonistát termeljen, vagy úgy, hogy egy állatot olyan poliklonális ellenanyag termelésére késztetünk, amely megköti az ICÁM- 1-et); szintetikus módszerekkel [például úgy, hogy Merrifielt módszerével polipeptideket szintetizálunk az ICÁM-1 vagy az ICÁM-1 funkcionális származékai, vagy az ICAM-1 proteinantagonistái (melyek vagy immunglobulinok, vagy nem immunglobulinok lehetnek) előállításához]; hibridómatechnológiával (például úgy, hogy monoklonális antitestet termelünk, amely kötődik az ICÁM-1-hez) vagy rekombináns technológiával [például úgy, hogy a találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagot különböző gazdasejtekbe (ilyenek az élesztő, baktériumok, gombák, tenyésztett emlőssejtek stb.) termeljük vagy rekombináns plazmidok vagy vírusvektorok segítségével]. Hogy melyik eljárást választjuk, az bizonyos faktoroktól függ, ilyen az alkalmasság, a kívánt kitermelés stb. Nem szükséges, hogy a fent leírt módszerek, eljárások, technológiák közül csak egyet válasszunk ki az adott gyulladásgátló hatóanyag termelésére; a fent leírt eljárások, módszerek és technológiák kombinálhatok abból a célból, hogy megkapjuk az adott gyulladásgátló hatóanyagokat.The anti-inflammatory agents of the invention may be prepared by natural methods (e.g., by inducing an animal, plant, fungus, bacterium, etc., to produce an ICAM-1 non-immunoglobulin antagonist, or by inducing an animal to produce a polyclonal antibody). ICAM-1); synthetic methods (e.g., by synthesizing polypeptides by Merriffelt's method to produce functional derivatives of ICAM-1 or ICAM-1, or protein antagonists of ICAM-1 (which may be either immunoglobulins or non-immunoglobulins)); hybridoma technology (e.g., by producing a monoclonal antibody that binds to ICAM-1) or recombinant technology (e.g., by producing the anti-inflammatory agent of the invention into various host cells (such as yeast, bacteria, fungi, cultured mammalian cells, etc.). recombinant plasmids or viral vectors]. Which process is chosen depends on certain factors such as suitability, desired yield, etc. It is not necessary to select only one of the methods, processes, technologies described above for the production of a given anti-inflammatory drug; the methods, methods, and techniques described above may be combined to provide the particular anti-inflammatory agents.

A) Az LFA-1-hez kötődő partner (ICAM-1) azonosításaA) Identification of the LFA-1 Binding Partner (ICAM-1)

1. Az LFA -1-függő aggregációvizsgáló módszer1. The LFA -1-dependent aggregation assay

Számos Epstein-Barr-vírussal transzformált sejt aggregációra hajlamos. Az aggregációt forbol-észterek jelenléte fokozza. Megállapították, hogy ezt a homotípusos aggregációt (ez olyan aggregáció, amelyben csak egyfajta sejt vesz részt) anti-LFA-1-antitestek blokkolják [R. Rothlein és munkatársai, J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986), adataik a következőkben referenciaként szerepelnek]. Az LFA- 1-függő kötés mértékét úgy határozhatjuk meg, hogy megállapítjuk a spontán és a forbol-észtertől függő aggregátumképződés mértékét.Many cells transformed with Epstein-Barr virus tend to aggregate. Aggregation is enhanced by the presence of phorbol esters. This homotypic aggregation (an aggregation involving only one type of cell) has been found to be blocked by anti-LFA-1 antibodies [R. Rothlein et al., J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986), the data of which are hereby incorporated by reference. The extent of LFA-1-dependent binding can be determined by measuring the extent of spontaneous and phorbol ester-dependent aggregate formation.

Egy LFA-1-függő aggregációt befolyásoló hatóanyagot olyan vizsgálattal lehet azonosítani, amellyel megállapítható, hogy az Epstein-Barr-vírussal transzformáit sejteknél a hatóanyag a spontán vagy a forbolésztertől függő aggregációt befolyásolja-e. A legtöbb Epstein-Barr-vírussal transzformált sejtet fel lehet használni egy ilyen vizsgálatban, amíg ezek a sejtek az LFA-1-receptormolekula kifejezésére képesek. Ezeket a sejteket T. A. Springer és munkatársai [J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984); ezt a munkát a következőkben referenciaként használjuk fel] módszere szerint állíthatjuk elő. Noha bármilyen ilyen sejt felhasználható a találmány szerinti LFA- 1-függő kötési vizsgálatban, mégis előnyösebb a JY-sejtvonal sejtjeit alkalmazni [C. T. Terhost és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 73,910 (1976)]. A sejteket bármilyen alkalmas táptalajban tenyészthetjük; azonban sokkal előnyösebb, ha a sejteket 10% fetális borjúszérummal és 50 pg/ml gentamicinnel (Gibro Laboratories) kiegészített RPMI 1640 táptalajban tenyésztjük. A sejteket olyan körülmények mellett kell tenyészteni, amelyek megfelelőek az emlőssejtek proliferációja szempontjából (azaz rendszerint 37 °C hőmérséklet mellett, 5% CO₂- és 95% relatívnedvesség-tartalmú atmoszférában stb.).An LFA-1-dependent aggregation-influencing agent can be identified by assaying whether the agent affects spontaneous or phorbol ester-dependent aggregation in cells transformed with Epstein-Barr virus. Most cells transformed with Epstein-Barr virus can be used in such an assay as long as these cells are capable of expressing the LFA-1 receptor molecule. These cells are described by TA Springer et al., J. Med. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984); this work will now be used as a reference]. Although any such cell may be used in the LFA-1-dependent binding assay of the invention, it is preferred to use cells of the JY cell line [CT Terhost et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 73,910 (1976)]. The cells may be cultured in any suitable medium; however, it is much more preferred that the cells be cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum and 50 pg / ml gentamicin (Gibro Laboratories). Cells should be cultured under conditions suitable for the proliferation of mammalian cells (i.e., usually at 37 ° C, 5% CO _{2 to} 95% relative humidity, etc.).

2. Az LFA -1 kötődik az ICÁM— 1 -hez2. LFA -1 binds to ICAM-1

Olyan egyéneket azonosítottak, akiknek a limfocitái nem tartalmaztak LFA-1-családhoz tartozó receptormolekulákat [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44, 2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668-689 (1985)]. Ezek az egyének leukocitaadhézió-hiánybetegségben (LAD=Leukocyte Adhesion Deficiency) szenvednek. Az ilyen betegek EBV-transzformált sejtjei nem képesek sem spontán, sem forbol-észter jelenlétében aggregálódni a fent leírt aggregációs vizsgálatban. Ha ezeket a sejteket LFA-1-kifejező sejtekkel keverjük, megfigyelhető az aggregáció [R. Rothlein és munkatársai, J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986)] (1. ábra). Fontos tény, hogy nem jön létre aggregáció, ha ezeket a sejteket anti-LFA-l-antitestek jelenlétében inkubáljuk. Tehát, bár az aggregációhoz LFA-1 szükséges, az LFA-1-hiányos sejtek LFA-1-tartalmú sejtekkel létrejött aggregációja azt mutatja, hogy az LFA-1-et kötő partner nem LFA-1 volt, hanem egy előzőleg még fel nem fedezett celluláris adhéziós molekula. Az 1. ábra a celluláris adhézió mechanizmusát mutatja be.Individuals whose lymphocytes did not contain LFA-1 receptor molecules were identified [D. C. Anderson et al., Fed. Proc., 44, 2671-2677 (1985); D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985). These individuals suffer from Leukocyte Adhesion Deficiency (LAD). EBV-transformed cells of such patients are unable to aggregate either spontaneously or in the presence of phorbol ester in the aggregation assay described above. When these cells are mixed with LFA-1-expressing cells, aggregation can be observed [R. Rothlein et al., J. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)] (Figure 1). Importantly, aggregation does not occur when these cells are incubated in the presence of anti-LFA-1 antibodies. Thus, although LFA-1 is required for aggregation, aggregation of LFA-1-deficient cells with LFA-1-containing cells indicates that the LFA-1 binding partner was not LFA-1 but a previously unidentified partner. cellular adhesion molecule. Figure 1 illustrates the mechanism of cellular adhesion.

B) Intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1)B) Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)

Az új intercelluláris adhéziós molekulát, az ICÁM-1-et először R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986); a közleményt a következőkben referenciaként használjuk fel] eljárása szerint azonosítottuk és részlegesen jellemeztük. Az ICAM-1-molekula észlelésére monoklonális antitesteket állítottunk elő LFA-1-expresszió szempontjából genetikailag deficiens egyének sejtjeivel immunizált egérlépsejtekből. A kapott antitesteket az LFA-1-et kifejező sejtek aggregációját gátló tulajdonságára szűrtük (2. ábra). Részletesebben: egereket immunizáltunk LAD-betegekből származó EBV-transzformált olyan B-sejtekkel, amelyek nem fejeznek ki LFA-1-antigént. Az állatok lépsejtjeit eltávolítjuk, mielómasejtekkel fuzionáljuk, és hagyjuk, hogy kialakuljanak a monoklonális antitesttermelő hibridómasejtek. Ezután normál egyénekből származó EBV-transzformált, LFA- 1-et kifejező sejteket inkubálunk a hibridómasejt monoklonális antitestjének jelenlétében abból a célból, hogy minden olyan monoklonális antitestet azonosíthassunk, amelyek az EBV-transzformált B-sejtek forbol-észter közvetítette, LFA- 1-dependens, spontán aggregációját gátolni képesek. Minthogy a hibridómasejtek olyan sejtektől származtak, amelyek soha nem találkoztakThe novel intercellular adhesion molecule, ICAM-1, was first described by R. Rothlein et al. Immunol., 137, 1270-1274 (1986); the disclosure is hereafter used as reference] and has been partially characterized. To detect the ICAM-1 molecule, monoclonal antibodies were generated from mouse spleen cells immunized with cells of genetically deficient individuals for LFA-1 expression. The resulting antibodies were screened for their ability to inhibit the aggregation of cells expressing LFA-1 (Figure 2). More specifically, mice were immunized with EBV-transformed B cells from LAD patients that do not express LFA-1 antigen. The spleen cells of the animals are removed, fused with myeloma cells, and allowed to form monoclonal antibody-producing hybridoma cells. EBV-transformed LFA-1-expressing cells from normal individuals are then incubated in the presence of the hybridoma cell monoclonal antibody to identify any monoclonal antibody mediated by the EBV-transformed B-cell phorbol ester, LFA-1-dependent. , inhibit spontaneous aggregation. Because hybridoma cells were derived from cells that had never met

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

LFA-1-antigénnel, így LFA-1 ellen nem termeltek monoklonális antitestet. Tehát bármelyik olyan antitestnek, amelyikről kiderül, hogy gátolja az aggregációt, kötődnie kell egy olyan antigénhez, amely bár nem LFA-1, mégis részt vesz az LFA-1 adhéziós folyamatban. Jóllehet bármilyen módszert használhatunk az ilyen monoklonális antitestek előállítására, előnyösebb, ha az ICÁM-1-kötő monoklonális antitesteket Balb/c egerek immunizálásával állítjuk elő, R. Rothlein és munkatársai módszere [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)] és sémája szerint, LFA- l-deficiens betegekből származó, Epstein-Barr-vírussal transzformált, perifériás vér eredetű mononukleáris sejtek alkalmazásával. Ezeket a sejteket T. A. Springer és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984)].No monoclonal antibody was produced with LFA-1 antigen, such as LFA-1. Thus, any antibody that is found to inhibit aggregation must bind to an antigen that, although not LFA-1, is still involved in the LFA-1 adhesion process. Although any method may be used to generate such monoclonal antibodies, it is preferred that the ICAM-1 binding monoclonal antibodies be prepared by immunizing Balb / c mice, according to the method of R. Rothlein et al. Immunol., 137, 1270-1274 (1986)] and the scheme using peripheral blood mononuclear cells transformed from LFA-1-deficient patients transformed with Epstein-Barr virus. These cells are described by T. A. Springer et al., J. Med. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984)].

Az ICÁM-1-hez kötődő antitestek előállítására és észlelésére szolgáló előnyös eljárás szerint egereket immunizálunk EBV-transzformált B-sejtekkel, melyek mind ICÁM-1-et, mind LFA-1-et fejeznek ki, vagy még előnyösebb TNF-aktivált endoteliális sejtekkel, amelyek ICÁM- 1-et kifejeznek, de LFA- 1-et nem. Az anti-ICAM-1-antitesteket termelő hibridómasejtek előállítására szolgáló egy legelőnyösebb eljárásban Balb/c egereket immunizálunk egymás után JY-sejtekkel és differenciált U937-sejtekkel (ATCC CRL-1593). Az állatokból lépsejteket veszünk le, mielómasejtekkel fuzionáljuk, és hagyjuk, hogy antitesttermelő hibridómasejtekké alakuljanak. Az antitesteket arra nézve szüljük, hogy képesek-e meggátolni egy EBV-transzformált sejtvonal - ilyenek a JY-sejtek, amelyek LFA-1-receptort és ICÁM-1-et is kifejeznek - LFA-l-függő, forbolészterrel indukált aggregációját. R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1987)] kimutatták ezeket az aggregációt gátló antitesteket, majd megvizsgálták, hogy meg tudják-e gátolni az SKW3sejtvonalnál [M. Dustin és munkatársai, J. Exper. Med., 165, 672-692 (1987)] a forbol-észterrel indukált aggregációt. Ennek a sejtvonalnak forbol-észter jelenlétében való spontán aggregációját gátolják az LFA-1-et kötni képes antitestek és nem gátolják az antiICAM-1-antitestek. Azok az antitestek, amelyek a JYsejtek forbol-észterrel indukált aggregációját meg tudják gátolni, de nem képesek gátolni az SKW3-sejtek forbol-észterrel indukált aggregációját, azok feltehetően anti-ICAM- 1-antitestek. Az ICÁM- 1-et kötő antitesteket más módszerrel úgy azonosítjuk, hogy olyan antitestekre szűrünk, amelyek az LFA-kifejező sejtek (ilyenek a JY-sejtek) LFA-l-függő aggregációját gátolják, ugyanakkor nem tudnak kötődni olyan sejtekhez, amelyek LFA- 1-et fejeznek ki, de ICÁM- 1-et nem fejeznek ki vagy csak csekély mértékben (ilyenek a normál granulociták), vagy képesek olyan sejtekhez kötődni, amelyek ICÁM-1-et kifejeznek, de LFA-1-et nem (ilyenek a TNF-fel aktíváit endoteliális sejtek). Még egy másik módszer szerint úgy járunk el, hogy ICÁM- 1-et, LFA- 1-et vagy mindkettőt kifejező sejtekből immunprecipitátumot készítünk olyan antitestek használatával, amelyek gátolják a sejtek, például a JYsejtek LFA-l-függő aggregációját, és SDS-PAGE vagy egy ezzel egyenértékű módszerrel meghatározzuk az antitesttel precipitált molekula bizonyos molekuláris jellemzőit. Ha a jellemzők azonosak az ICAM-1 jellemzőivel, úgy feltételezhető, hogy az antitest antiICAM-1-antitest.In a preferred method for producing and detecting antibodies to ICAM-1, mice are immunized with EBV-transformed B cells expressing both ICAM-1 and LFA-1, or more preferably TNF-activated endothelial cells, which express ICAM-1 but not LFA-1. In a most preferred method of producing hybridoma cells producing anti-ICAM-1 antibodies, Balb / c mice are immunized sequentially with JY cells and differentiated U937 cells (ATCC CRL-1593). The animals are harvested from spleen cells, fused with myeloma cells and allowed to develop into antibody-producing hybridoma cells. Antibodies are raised for their ability to inhibit LFA-1-dependent phorbol ester-induced aggregation of an EBV-transformed cell line, such as JY cells, which express both LFA-1 receptor and ICAM-1. R. Rothlein et al., J. Med. Immunol., 137, 1270-1274 (1987)] detected these aggregation inhibiting antibodies and tested whether they could inhibit the SKW3 cell line [M. Dustin et al., J. Exper. Med. 165: 672-692 (1987)]. Spontaneous aggregation of this cell line in the presence of phorbol ester is inhibited by LFA-1 binding antibodies and not inhibited by antiICAM-1 antibodies. Antibodies that can inhibit phorbol ester-induced aggregation of JY cells but are unable to inhibit phorbol ester-induced aggregation of SKW3 cells are presumably anti-ICAM-1 antibodies. ICAM-1 binding antibodies are otherwise identified by screening for antibodies that inhibit LFA-1-dependent aggregation of LFA-expressing cells (such as JY cells), but are unable to bind to cells that express LFA-1. express, but not to a small extent (such as normal granulocytes), or to bind to cells expressing ICAM-1 but not LFA-1 (such as TNF -activated endothelial cells). In another method, cells expressing ICAM-1, LFA-1, or both are immunoprecipitated using antibodies that inhibit LFA-1-dependent aggregation of cells, such as JY cells, and SDS-PAGE or an equivalent method is used to determine certain molecular characteristics of the antibody precipitated molecule. If the characteristics are the same as those of ICAM-1, then the antibody is presumed to be an antiICAM-1 antibody.

Az ICÁM-1 sejtfelületi molekulát a fent leírtak szerint előállított monoklonális antitesteket alkalmazva tisztítottuk és jellemeztük. Az ICÁM-1-et humán sejtekből vagy szövetekből tisztítottuk, monoklonális antitestaffínitás-kromatográfia segítségével. E módszer szerint az ICÁM-1-gyel reagáló monoklonális antitestet inért oszlopmátrixhoz kapcsoljuk, melyhez bármilyen módszert felhasználhatunk, de előnybe helyezzük H. C. Oettgen és munkatársai [J. Bioi. Chem., 259, 12 034 (1984)] módszerét. Ha a sejtlizátumot átengedjük a mátrixon, a jelen lévő ICAM-1-molekulákat a mátrix adszorbeálja és visszatartja. Az oszlop pH-jának vagy ionkoncentrációjának a változtatásával a megkötött ICAM-1-molekulákat az oszlopról le lehet oldani. Jóllehet bármilyen alkalmas mátrix használható, előnyös, ha a mátrix anyaga Sepharose (Pharmacia). Az oszlopmátrixok készítése és alkalmazása proteinek tisztításához jól ismert módszer e szakterületen.The ICAM-1 cell surface molecule was purified and characterized using the monoclonal antibodies prepared as described above. ICAM-1 was purified from human cells or tissues by monoclonal antibody test affinity chromatography. In this method, the ICAM-1-reacting monoclonal antibody is coupled to an inert column matrix for which any method may be used, but is preferred by H. C. Oettgen et al. Biol. Chem., 259, 12 034 (1984)]. When the cell lysate is passed through the matrix, the ICAM-1 molecules present are adsorbed and retained by the matrix. By altering the column pH or ion concentration, the bound ICAM-1 molecules can be liberated from the column. Although any suitable matrix may be used, it is preferred that the matrix material be Sepharose (Pharmacia). The preparation and use of column matrices for protein purification is well known in the art.

Az általános jártassággal rendelkező szakemberek értelemszerűen használhatják fel a fent leírt vizsgálati módszereket olyan vegyületek azonosítására, amelyek képesek a celluláris adhézió fokát és mértékét gyengíteni vagy gátolni.It will be appreciated by those skilled in the art that the assay methods described above be used to identify compounds which are capable of attenuating or inhibiting the degree and extent of cellular adhesion.

Az ICAM-1 egy olyan sejtfelületi glükoprotein, amely egyrészt nem hematopoetikus sejteken fejeződik ki, ilyenek a vaszkuláris endoteliális sejtek, timusz epitéliális sejtek, bizonyos más epitéliális sejtek és fibroblasztok, másrészt hematopoetikus sejteken fejeződik ki, ilyenek a szöveti makrofágok, mitogénnel stimulált limfocitablasztok és a germinatív centrumú B-sejtek, továbbá a dendritikus sejtek a mandulákban, nyirokcsomókban és a Peyer-plakkokban. Az ICÁM-1 nagymértékben fejeződik ki vaszkuláris endoteliális sejteken a reaktív hiperpláziát mutató T-sejtterületeken, nyirokcsomókban és mandulákban. Az ICAM-1 kis mennyiségben fejeződik ki a perifériás vérlimfocitákon. Bizonyos mielomonocitás sejtvonalak forbol-észterrel stimulált differenciálódása nagyban növeli az ICÁM-1 expresszióját. Tehát az ICAM-1 elsősorban gyulladásos helyeken fejeződik ki, és általában nem nyilvánul meg nyugvó sejteken. Bőr fibroblasztokon az ICÁM -1-expressziét három-ötszörösére növeli az interleukin-1, illetve 10 egység/ml gamma-interferon 4, illetve 10 óra időtartamon át. Az indukáció a protein- és mRNS-szintézistől függ és reverzibilis.ICAM-1 is a cell surface glycoprotein expressed on non-hematopoietic cells, such as vascular endothelial cells, thymus epithelial cells, certain other epithelial cells and fibroblasts, and on hematopoietic cells such as lymphocytic germinative center B cells; and dendritic cells in tonsils, lymph nodes, and Peyer's plaques. ICAM-1 is highly expressed on vascular endothelial cells in T-cell areas showing reactive hyperplasia, in lymph nodes and in tonsils. ICAM-1 is expressed in small amounts in peripheral blood lymphocytes. Phorbol ester-stimulated differentiation of certain myelomonocytic cell lines greatly increases the expression of ICAM-1. Thus, ICAM-1 is predominantly expressed at sites of inflammation and is generally not expressed on dormant cells. In skin fibroblasts, ICAM-1 expression is increased three to five fold by interleukin-1 and 10 units / ml interferon gamma, respectively over a period of 4 and 10 hours, respectively. Induction depends on protein and mRNA synthesis and is reversible.

Az ICAM-1 molekulatömege különböző sejttípusoknál különböző, fibroblasztokon 97 kD a molekulatömeg, az U937 mielomonocita-sejtvonalnál 114 kD és a JY B-limfoblasztoid sejteknél 90 kD. Az ICÁM-1 bioszintézisekor egy körülbelül 73 kD intracelluláris prekurzort mutattunk ki. A nem N-glükozilált forma - ami a tunikamicinkezelés következménye (a tunikáiméin gátolja a glükozilációt) - molekulatömege 55 kD.ICAM-1 has a molecular weight for different cell types, 97 kD for fibroblasts, 114 kD for the U937 myelomonocyte cell line and 90 kD for JY B lymphoblastoid cells. An approximately 73 kD intracellular precursor was detected during ICAM-1 biosynthesis. The non-N-glycosylated form, which is the result of treatment with tunicamycin (inhibits glycosylation on tunicamins), has a molecular weight of 55 kD.

A forbol-észterrel stimulált U937-sejtekből vagy a fibroblasztsejtekből izolált ICAM-1 azonos főtermé8The same major product of ICAM-1 isolated from phorbol ester-stimulated U937 cells or fibroblast cells8

HU 217 792 Β két eredményez, melynek a molekulatömege - kémiai deglükozilálás után - 60 kD. Az ICAM-1 monoklonális antitestek befolyásolják a fitohemagglutinin-blasztok adhézióját az LFA-1-hiányos sejtvonalakhoz. Ha az ICÁM-1-et kötő monoklonális antitestekkel előkezeljük a fibroblasztokat, de a limfocitákat nem, ezzel az előkezeléssel meggátoljuk a limfocita-fibroblaszt adhéziót. Ha a limfociták kapnak előkezelést LFA-1 elleni antitestekkel és a fibroblasztok nem, ugyancsak azt találjuk, hogy ezzel meggátoljuk a limfocita-fibroblaszt adhéziót.This results in two molecules having a molecular weight of 60 kD after chemical deglycosylation. ICAM-1 monoclonal antibodies influence the adhesion of phytohemagglutinin blasts to LFA-1-deficient cell lines. By pretreating fibroblasts with lymphocytes but not lymphocytes that bind ICAM-1, this pretreatment prevents lymphocyte-fibroblast adhesion. If the lymphocytes are pretreated with antibodies against LFA-1 and the fibroblasts are not, it is also found to inhibit lymphocyte-fibroblast adhesion.

Tehát az ICÁM -1 a leukocitákon lévő CD 18 komplex liganduma. Fibroblasztokon és endoteliális sejteken az ICÁM -1 in vitro ugyanannyi időn belül indukálható gyulladáskeltő mediátorokkal - ilyenek például az IL—1, gamma-interferon és a tumomekrózis-faktor (TNF) -, mint amennyi időt vesz igénybe in vivő a limfociták infiltrációja a gyulladásos léziókba [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986); J. S. Prober és munkatársai, J. Immunoi., 137, 1893-1896 (1986)]. Az ICAM-1 kifejeződik nem hematopoetikus sejteken, mint a vaszkuláris endoteliális sejtek, a timusz epitéliális sejtek és más epitéliális sejtek és fibroblasztok, valamint hematopoetikus sejteken, mint a szöveti makrofágok, mitogénnel stimulált T-limfocitablasztok és a germinatív centrumú B-sejtek, továbbá dendritikus sejteken a mandulákban, nyirokcsomókban és Peyer-plakkokban [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. Az ICÁM-1 kifejeződik keratinocitákon jóindulatú gyulladásos léziókban, ilyenek az allergiás ekcéma, lichen planus, exanthema, urticaria és a bullózus (hólyagos) betegségek. Az allergiás bőrreakciók, amelyeket egy olyan hapténnek a bőrön való alkalmazásával idéznek elő, amelyre a beteg allergiás, a keratinocitákon szintén erős ICAM-1-expressziót eredményeznek. Másrészt a bőrön lévő toxikus plakkok nem okoznak ICAM-1expressziót a keratinocitákon. A különböző dermatológiai rendellenességekből eredő bőrléziók biopsziáiból származó keratinocitákon kimutatható az ICAM-1, továbbá ICÁM-1-expressziót indukálnak az allergiás patch-tesztekből eredő léziók is, míg a toxikus patchtesztekből származó léziók nem váltanak ki ICAM-1expressziót.Thus, ICAM -1 is a ligand for the CD18 complex on leukocytes. In fibroblasts and endothelial cells, ICAM-1 can be induced in vitro with inflammatory mediators, such as IL-1, interferon gamma and tumor necrosis factor (TNF), in the same time as in vivo lymphocyte infiltration into inflammation [M. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254; J.S. Prober et al., 1986, J. Immunol. 137, 1893-1896. ICAM-1 is expressed on non-hematopoietic cells such as vascular endothelial cells, thymic epithelial cells and other epithelial cells and fibroblasts, and on hematopoietic cells such as tissue macrophages, mitogen-stimulated T-lymphocytelasts, and germinal cells, cells in tonsils, lymph nodes and Peyer's plaques [M. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254. ICAM-1 is expressed on keratinocytes in benign inflammatory lesions such as allergic eczema, lichen planes, exanthema, urticaria and bullous diseases. Allergic skin reactions caused by the application of a hapten to which the patient is allergic also result in strong expression of ICAM-1 on keratinocytes. On the other hand, toxic plaques on the skin do not induce ICAM-1 expression on keratinocytes. In keratinocytes from biopsies of skin lesions from various dermatological disorders, ICAM-1 can be detected, and lesions from allergic patch tests induce ICAM-1 expression, whereas lesions from toxic patch tests do not induce ICAM-1 expression.

Az ICAM-1 tehát egy olyan sejtszubsztrátum, amelyhez a limfociták képesek kötődni, s így a limfociták a gyulladásos helyekre tudnak vándorolni és/vagy különböző effektorfunkciókat tudnak kifejteni a gyulladás helyén. Ezek a funkciók magukban foglalják az antitesttermelést, a vírussal fertőzött célsejtek lízisét stb. A „gyulladás” („inflammation”) kifejezés itt a védekezőrendszer specifikus vagy nem specifikus reakcióit jelenti. A „specifikus védekezőrendszer” kifejezéssel az immunrendszernek azt a komponensét fejezzük ki, amely specifikus antigén jelenlétére reagál. Gyulladásnak mondjuk a specifikus védekezőrendszernek a válaszát, ha a gyulladást a specifikus védekezőrendszer reakciója okozza, közvetíti vagy vele összefügg. Specifikus védekezőrendszer válasza által okozott gyulladás például az antigénekre - ilyen például a rubeolavírus-, autoimmun betegségekre, T-sejtek közvetítette késői típusú túlérzékenységre (ez látható például olyan egyéneknél, akiknél a Mantoux-teszt pozitív), sporiasisra stb. adott válasz.Thus, ICAM-1 is a cellular substrate to which lymphocytes are capable of binding, so that lymphocytes can migrate to inflammatory sites and / or exert various effector functions at the site of inflammation. These functions include antibody production, lysis of target cells infected with the virus, and the like. The term "inflammation" as used herein refers to specific or non-specific responses of the defense system. The term "specific defense system" refers to a component of the immune system that responds to the presence of a specific antigen. Inflammation is defined as the response of a specific defense system when inflammation is caused, mediated, or associated with the reaction of a specific defense system. Inflammation caused by a specific defense system response, for example, to antigens such as rubella virus, autoimmune diseases, T-cell-mediated late-type hypersensitivity (as seen, for example, in individuals with a Mantoux test positive), sporiasis, and the like. answer.

A „nem specifikus védekezőrendszer reakciója” egy olyan válasz, amelyet az immunológiai memóriára képtelen leukociták közvetítenek. Ezek közé a sejtek közé tartoznak a granulociták és makrofágok. Amikor itt azt mondjuk, hogy a gyulladás a nem specifikus védekezőrendszer válaszának a következménye, akkor a gyulladást a nem specifikus védekezőrendszer okozza, közvetíti vagy egy reakciójával függ össze. Nem specifikus védekezőrendszer által okozott gyulladás - legalábbis részben - például az a gyulladás, amely a következő állapotokkal jár együtt: asztma, felnőttkori respirációs distress szindróma (ARDS=aduit respiratory distress syndrome) vagy szeptikémia vagy trauma okozta másodlagos többszörös szervkárosodás, a miokardiális vagy más szövetek reperfuziója által okozott károsodás, akut glomerulonephritis, reaktív arthritis, akut gyulladásos komponenseket tartalmazó dermatózisok, akut purulent meningitis vagy a központi idegrendszer más gyulladásos zavarai, hemodialízis, leukaferezis, fekélyes vastagbélgyulladás (colitis ulcerosa), Crohm-betegség, nekrotizáló enterocolitis, granulocitatranszfüzióval társult tünetek és citokin indukálta toxicitás.A "non-specific defense system response" is a response mediated by leukocytes that are not capable of immunological memory. These cells include granulocytes and macrophages. When we say that inflammation is the result of a response by a non-specific defense system, inflammation is caused, mediated, or linked to a reaction by a non-specific defense system. Non-specific defense system-mediated inflammation is, at least in part, inflammation associated with conditions such as asthma, adult respiratory distress syndrome (ARDS) or secondary multiple organ damage due to septicemia or trauma, myocardial or other reperfusion injury, acute glomerulonephritis, reactive arthritis, dermatoses containing acute inflammatory components, acute purulent meningitis or other inflammatory disorders of the central nervous system, hemodialysis; cytokine-induced toxicity.

A jelen találmány értelmében az ICAM-1 funkcionális származékai és főként azok a származékai, amelyek közé az ICÁM -1 olyan fragmentumai vagy mutációs variánsai tartoznak, amelyek az 1, 2 és 3-as domént tartalmazzák, a nem specifikus védekezőrendszer ezen reakcióinak a kezelésében vagy gyógyításában használhatók fel. Az ilyen kezelésnél vagy gyógyításban előnyösebbek az olyan ICAM-1-fragmentumok vagy mutációs variánsok, amelyek az ICAM-1 2-es doménjét tartalmazzák, de az ilyen kezelésre vagy gyógyításban a legelőnyösebbek az ICAM-1 azon fragmentumai vagy mutációs variánsai, amelyek az ICÁM -1 1-es doménjét tartalmazzák.According to the present invention, functional derivatives of ICAM-1, and in particular those derivatives comprising fragments or mutation variants of ICAM-1 containing domains 1, 2 and 3, for the treatment of these reactions of the non-specific defense system, or can be used in healing. ICAM-1 fragments or mutation variants containing the ICAM-1 domain 2 are preferred for such treatment or cure, but ICAM-1 fragments or mutation variants that have ICAM-1 are most preferred for such treatment or cure. 1 domain.

C) Az ICAM-1-gén klónozásaC) Cloning of the ICAM-1 gene

A számtalan eljárás közül bármelyiket fel lehet használni az ICAM-1-gén klónozására. Egy ilyen módszer szerint egy, az ICAM-1-kifejező sejtekből származó cDNS-inszertumokat tartalmazó ingázó vektorgyűjteményt analizálunk olyan inszertum jelenlétére, amely ICAM-1-gént tartalmaz. Egy ilyen analízist úgy végzünk, hogy a sejteket a vektorral transzficiáljuk, majd ICAM-1-expresszióra vizsgáljuk. E gén klónozásának egy előnyös módszere magában foglalja az ICAM-1molekula aminosavszekvenciájának a meghatározását. A feladat végrehajtásához az ICAM-1-proteint tisztítjuk és automata szekvenátorral analizáljuk. Egy másik módszer szerint a molekulát fragmentáljuk akár brómciánnal, akár proteázokkal, például papainnal, kimotripszinnel vagy tripszinnel [Y. Oike és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 9751-9758 (1982); C. Liu és munkatársai, Int. J. Pept. Protein Rés., 21, 209-215 (1983)]. Jóllehet az ICAM-1 teljes aminosavszekvenciája meghatározható, mégis előnyösebb a molekulaAny of a number of methods can be used to clone the ICAM-1 gene. In such a method, a commuting vector library containing cDNA inserts from ICAM-1 expressing cells is analyzed for the presence of an insert containing the ICAM-1 gene. Such an assay is performed by transfecting cells with the vector and assaying for ICAM-1 expression. A preferred method of cloning this gene involves determining the amino acid sequence of the ICAM-1 molecule. To accomplish this task, the ICAM-1 protein was purified and analyzed by an automated sequencer. Alternatively, the molecule is fragmented with either bromocyanine or proteases such as papain, chymotrypsin or trypsin [Y. Oike et al., J. Bioi. Chem., 257, 9751-9758 (1982); C. Liu et al., Int. J. Pept. Protein Res., 21, 209-215 (1983)]. Although the complete amino acid sequence of ICAM-1 can be determined, the molecule is more preferred

HU 217 792 Β peptidfragmentumainak a meghatározása. Ha a peptidek 10 aminosavnál hosszabbak, a szekvenciákra kapott információ általában elégséges ahhoz, hogy egy gént - így az ICÁM-1-gént - klónozzuk.Determination of peptide fragments of HU 217 792 Β. When the peptides are longer than 10 amino acids, the information obtained for the sequences is generally sufficient to clone a gene, such as the ICAM-1 gene.

Egy peptid aminosavcsoportjainak a szekvenciáját vagy az általánosan használt 3 betűs jelzéssel írjuk fel, vagy 1 betűs jelzéssel. A 3 betűs és 1 betűs jelölések felsorolása megtalálható szakkönyvekben, például: A. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, NY (1970). Ha a szekvenciát függőlegesen írjuk fel, az aminoterminális csoport a sor felső részén és a peptid karboxiterminális csoportja a sor alján van. Hasonlóképpen, ha a felsorolás vízszintes, az aminoterminusz a bal oldalon, míg a karboxiterminusz a jobb oldalon van. A peptid aminocsoportjait kötőjel választhatja el. Ezek a kötőjelek kizárólag arra szolgálnak, hogy megkönnyítsék a szekvencia bemutatását. Tisztán magyarázatként, aThe sequence of the amino acid residues of a peptide is either written using the commonly used 3 letter designation or the 1 letter designation. A list of 3-letter and 1-letter notations can be found in professional books, e.g., A. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, NY (1970). When the sequence is written vertically, the amino terminal group is at the top of the row and the carboxy terminal group of the peptide is at the bottom of the row. Similarly, if the list is horizontal, the amino terminus is on the left and the carboxy terminus is on the right. The amino groups of the peptide may be separated by a hyphen. These dashes are provided for ease of reference only. For the sake of clarity, a

-Gly-Alá-Ser-Phejelölésű aminosavszekvencia azt jelenti, hogy egy Alá csoport a Gly karboxilcsoportjához kapcsolódik, a Ser csoport az Alá karboxilcsoportjához és a Phe aminocsoportjához kapcsolódik. A jelölés azt is jelenti, hogy az aminosavszekvencia a Gly-Ala-Ser-Phe tetrapeptidből áll. Ez a jelölés nem korlátozza az aminosavszekvenciát erre a tetrapeptidre, hanem azt jelenti, hogy 1. a tetrapeptidhez egy vagy több aminosavcsoport kapcsolódhat, akár aminoterminális, akár karboxi-terminális végén, 2. a tetrapeptid amino- és karboxi-terminális végéhez egy vagy több aminosavcsoport kapcsolódhat, 3. a tetrapeptidhez nem kapcsolódik más aminosav.The -Gly-Ala-Ser-amino acid sequence means that an Ala group is attached to the carboxyl group of Gly, the Ser group is attached to the carboxyl group of Ala and the amino group of Phe. The designation also means that the amino acid sequence consists of the Gly-Ala-Ser-Phe tetrapeptide. This designation does not limit the amino acid sequence to this tetrapeptide, but means that 1. one or more amino acid residues may be attached to the tetrapeptide, either at the amino terminus or at the carboxy terminus, 2. one or more amino acid residues at the amino and carboxy terminus of the tetrapeptide. 3. no other amino acid is attached to the tetrapeptide.

Amint egy vagy több megfelelő fragmentumot szekvenáltunk, megvizsgáljuk az ezeket kódoló DNS-szekvenciákat. Minthogy a genetikai kód degenerált, egynél több kodon használható egy adott aminosav kódolásához [J. D. Watson közlése a következő kiadványokban: Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA (1977), 356-357. oldal]. A peptidfragmentumok analízise révén meghatározzuk azokat az aminosavszekvenciákat, amelyeket a legkevésbé degenerált oligonukleotidok kódolnak. Ezt előnyösen úgy végezzük el, hogy azonosítjuk azokat a szekvenciákat, amelyek olyan aminosavakat tartalmaznak, amelyeket egyetlen kodon kódol. Ilyen aminosavszekvenciákat azonban ritkán kódolhat egyetlen oligonukleotid, az aminosavszekvenciát gyakran a hasonló oligonukleotidok tetszés szerinti készlete kódolhatja. Fontos tudni, hogy amíg a készlet minden tagja egy olyan oligonukleotid, amely tudja kódolni a peptidfragmentumot, és ennélfogva potenciálisan ugyanazon nukleotidszekvenciát tartalmazza, amint az a gén, amely a peptidfragmentumot kódolja, mégis a készletnek csak egy tagja tartalmaz olyan nukleotidszekvenciát, amely a gén nukleotidszekvenciájával identikus. Minthogy ez a tag jelen van a készletben, és képes a DNS-sel hibridizálni a készlet többi tagjának a jelenlétében is, a nem frakcionált oligonukleotidkészletet is fel lehet használni ugyanúgy, mintha egyetlen oligonukleotidot alkalmaznánk a peptídet kódoló gén klónozásához.Once one or more suitable fragments have been sequenced, the DNA sequences encoding them are examined. Because the genetic code is degenerate, more than one codon can be used to encode a particular amino acid [J. Publication of D. Watson in Molecular Biology of the Gene, 3rd edition; W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA (1977), 356-357. side]. By analyzing peptide fragments, the amino acid sequences encoded by the least degenerate oligonucleotides are determined. Preferably, this is done by identifying sequences containing amino acids encoded by a single codon. However, such amino acid sequences can rarely be encoded by a single oligonucleotide, often the amino acid sequence may be encoded by any set of similar oligonucleotides. It is important to know that while each member of the kit is an oligonucleotide that can encode the peptide fragment and therefore potentially contains the same nucleotide sequence as the gene encoding the peptide fragment, only one member of the kit contains a nucleotide sequence that contains the nucleotide sequence of the gene. identical. Because this tag is present in the kit and is capable of hybridizing with DNA in the presence of other members of the kit, the unfractionated oligonucleotide set can be used in the same way as using a single oligonucleotide to clone the peptide encoding gene.

A fent leírtakkal pontosan analóg módon alkalmazhatunk egy olyan nukleotidot (vagy oligonukleotidkészletet), amelynek a nukleotidszekvenciája komplementer a peptidfragmentumot kódoló oligonukleotidszekvenciával vagy a szekvenciakészlettel.In a manner analogous to that described above, a nucleotide (or set of oligonucleotides) having a nucleotide sequence complementary to the oligonucleotide sequence or set of sequences encoding the peptide fragment may be used.

Az ICÁM-1-gén egy fragmentumát kódoló, alkalmas oligonukleotidot vagy oligonukleotidkészletet, vagy amely egy ilyen oligonukleotiddal vagy nukleotidkészlettel komplementer, azonosítunk (a fent leírt eljárást használva), szintetizálunk és - a szakterületen jól ismert módon - ICÁM-1-génszekvenciákat kifejező humán sejtekből származó DNS-sel vagy előnyösebben egy cDNS-készítménnyel hibridizáljuk. A nukleinsav hibridizációs technikákat T. Maniatis és munkatársai [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982)], valamint B. D. Haymes és munkatársai [Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)] munkái tartalmazzák, melyeket itt referenciaként használunk fel. A felhasznált DNS- vagy cDNS-forrást ICAM-1szekvenciákra feldúsítjuk. A dúsítást legkönnyebben cDNS felhasználásával érhetjük el úgy, hogy RNS-t vonunk ki olyan sejtekből, amelyeket ICÁM- 1-szintézist indukáló körülmények között tenyésztünk [például U937-sejteket (ATCC 1593) tenyésztünk forbol-észterek jelenlétében stb.].A suitable oligonucleotide or set of oligonucleotides encoding a fragment of the ICAM-1 gene or which is complementary to such an oligonucleotide or set of nucleotides is identified (using the procedure described above), synthesized and expressed in a manner well known in the art to express human DNA, or more preferably, a cDNA composition. Nucleic acid hybridization techniques are described by T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982), and BD Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, ARL App., Washington, DC (1985). which are used here for reference. The DNA or cDNA source used is enriched for ICAM-1 sequences. Enrichment is most easily achieved by using cDNA to remove RNA from cells cultured under conditions that induce ICAM-1 synthesis (e.g., U937 cells (ATCC 1593) in the presence of phorbol esters, etc.).

A fent leírt vagy ezekhez hasonló technikákat eredményesen alkalmazták a következő gének klónozásánál: humán aldehid-dehidrogenázok [L. C. Hsu és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 3771-3775 (1985)], fibronektin [S. Suzuki és munkatársai, Eur. Mól. Bioi. Organ. J., 4, 2519-2524 (1985)], humán ösztrogénreceptor-gén [P, Walter és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 7889-7893 (1985)], szöveti plazminogénaktivátor [D. Pennica és munkatársai, Natúré, 301, 214-221 (1983)] és humán érett placentáris alkalikus foszfatáz-komplementer DNS [W. Kam és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 8715-8719 (1985)].Techniques described above or similar have been successfully used to clone the following genes: human aldehyde dehydrogenases [L. C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 3771-3775 (1985)], fibronectin [S. Suzuki et al., Eur. Biol. Organ. J., 4, 2519-2524 (1985)], the human estrogen receptor gene (P, Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 7889-7893 (1985)], tissue plasminogen activator [D. Pennica et al., Natura, 301: 214-221 (1983)] and human mature placental alkaline phosphatase complementary DNA [W. Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 8715-8719 (1985).

Az ICÁM-1-gén expressziós vektorba való klónozásának egy előnyös kiviteli változata szerint ICÁM -1et kifejező sejtből származó DNS vagy előnyösebben cDNS klónozásával expressziósvektor-gyűjteményt készítünk. A gyűjteményből ezután kiszűrjük azokat az egyedeket, amelyek anti-ICAM-1, antitesthez kötődő proteint fejeznek ki és nukleotidszekvenciáik olyan polipeptideket kódolnak, amelyeknek az aminosavszekvenciája ugyanolyan, mint az ICÁM-1-nek vagy az ICAM-1 fragmentumainak.In a preferred embodiment of cloning the ICAM-1 gene into an expression vector, a collection of expression vectors is prepared by cloning DNA from the cell expressing ICAM-1, or more preferably cDNA. Individuals expressing an anti-ICAM-1 antibody-binding protein and encoding polypeptides having the same amino acid sequence as ICAM-1 or fragments of ICAM-1 are then screened from the collection.

A fent leírt módszerek szerint klónozott ICAM-1gént hozzá lehet kötni mesterségesen egy expressziós vektorhoz, és be lehet vezetni baktérium- vagy eukariótasejtekbe ICÁM-1-protein termelése céljából. Ezek a manipulációs technikák megtalálhatók T. Maniatis és munkatársai munkájában (lásd fentebb), és egyébként jól ismertek a szakterületen.The ICAM-1 gene cloned according to the methods described above can be artificially linked to an expression vector and introduced into bacterial or eukaryotic cells to produce ICAM-1 protein. These manipulation techniques are found in T. Maniatis et al., Supra, and are otherwise well known in the art.

D) Az LFA-1 -függő aggregációs vizsgálatok felhasználási területeD) Field of application of LFA-1-dependent aggregation assays

Az LFA-1-függő aggregáció mérésére szolgáló, fent leírt módszer olyan hatóanyagok azonosítására alkalmazható, amelyek antagonistákként az LFA-110The method described above for measuring LFA-1-dependent aggregation can be used to identify agents that antagonize LFA-110 as an antagonist.

HU 217 792 Β függő aggregáció mértékét gátolják. Ezek az antagonisták úgy hatnak, hogy csökkentik az LFA-1 vagy az ICAM-1 aggregációt közvetítő képességét. Ilyen hatóanyagok közé tartoznak az immunglobulinok, például egy olyan antitest, amely vagy az LFA- 1-hez, vagy az ICÁM-1-hez kötődik. A fent leírt módszer ezenkívül nem immunglobulin (vagyis kémiai) hatóanyagok vizsgálatára is alkalmas, azaz annak meghatározására, hogy ezek antagonistái-e az LFA- 1-aggregációnak.EN 217 792 Β dependent aggregation. These antagonists act by reducing the ability of LFA-1 or ICAM-1 to mediate aggregation. Such agents include immunoglobulins, such as an antibody that binds to either LFA-1 or ICAM-1. In addition, the method described above is also suitable for testing non-immunoglobulin (i.e., chemical) agents, i.e., for determining whether they are antagonists of LFA-1 aggregation.

E) ICÁM-1-receptorproteineket kötő antitestek felhasználási területeE) Areas of use of antibodies that bind to ICAM-1 receptor proteins

1. Gyulladásgátló hatóanyagok1. Anti-inflammatory agents

A CD 18 komplex tagjaival szembeni monoklonális antitestek gátolják a leukociták számos adhéziótól függő funkcióját, így az endotheliumhoz való kötődést [D. Haskard és munkatársai, J. Immunoi., 137, 2901-2906 (1986)], a homotípusú adhéziókat [R. Rothlein és munkatársai, J. Exp. Med., 163, 1132-1149 (1986)], a limfociták antigénnel és mitogénnel indukált proliferációját [Davignon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 4535-4539 (1981)], az antitestképződést [A. Fischer és munkatársai, J. Immunoi., 136, 3198-3203 (1986)] és minden leukocitánál az effektoríunkciókat, így a citotoxikus T-sejtek [A. M. Krensky és munkatársai, J. Immunoi., 132, 2180-2182 (1984)], a makrofágok [G. Strassman és munkatársai, J. Immunoi., 136, 4328-4333 (1986)] és minden olyan sejt litikus hatását, amelyek az antitestfüggő celluláris citotoxicitási reakciókban részt vesznek [S. Kohl és munkatársai, J. Immunoi., 133, 2972-2978 (1984)]. Mindegyik fenti funkcióban az antitestek gátolják a leukocitáknak a megfelelő sejtszubsztrátumhoz való tapadását, ez pedig gátolja a végeredményt.Monoclonal antibodies to members of the CD18 complex inhibit many adhesion-dependent functions of leukocytes, including endothelial binding [D. Haskard et al., J. Immunol. 137: 2901-2906 (1986)], homotype adhesions [R. Rothlein et al., J. Exp. Med., 163, 1132-1149 (1986)], antigen and mitogen-induced proliferation of lymphocytes (Davignon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 4535-4539 (1981)], antibody formation [A. Fischer et al., 1986, J. Immunol. 136: 3198-3203] and all leukocytes have effector functions such as cytotoxic T cells [A. M. Krensky et al., J. Immunol., 132: 2180-2182 (1984)], macrophages [G. Strassman et al., J. Immunol., 136, 4328-4333 (1986)] and all cells involved in antibody-dependent cellular cytotoxicity reactions [S. Kohl et al., J. Immunol. 133: 2972-2978 (1984). In each of these functions, the antibodies inhibit the adhesion of leukocytes to the appropriate cellular substrate, which inhibits the final result.

Mint ahogy fent tárgyaltuk, az ICÁM -1 molekuláknak az LFA-1-molekulacsalád tagjaihoz való kötődése a sejtadhézióban központi fontosságú. Az adhéziós folyamat alatt a limfociták folyamatosan ellenőrizhetik, hogy egy állatban jelen vannak-e idegen antigének. Bár az ilyen folyamatok normál körülmények között kívánatosak, ezek okozzák az átültetett szerv kilökődését, az átültetett szövet kilökődését és több autoimmun betegséget is. Tehát bármilyen olyan eszköz, amellyel gyengíteni vagy gátolni lehetne a sejtadhéziót, igen kívánatos lenne az átültetett szervek és átültetett szövetek recipiensei számára vagy az autoimmun betegek számára.As discussed above, the binding of ICAM-1 molecules to members of the LFA-1 family of molecules is central to cell adhesion. During the adhesion process, lymphocytes can continuously check for the presence of foreign antigens in an animal. Although such processes are desirable under normal circumstances, they cause graft rejection, graft rejection, and several autoimmune diseases. Thus, any means of attenuating or inhibiting cell adhesion would be highly desirable to recipients of transplanted organs and transplanted tissue, or to autoimmune patients.

Az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitestek mint gyulladásgátló hatóanyagok emlősbetegeknél igen jól alkalmazhatók. Lényeges, hogy ezek a hatóanyagok az általános gyulladásgátló hatóanyagoktól abban különböznek, hogy szelektíven gátolják az adhéziót, és nincs olyan mellékhatásuk - ilyen például a neffotoxicitás -, mint amilyenek a hagyományos hatóanyagoknál felléphetnek. Tehát az ICÁM -1-kötő monoklonális antitesteket emlősbetegekben a szerv- és szövetkilökődés megelőzésére használhatjuk vagy autoimmun válaszok módosítására, mellékhatásoktól való félelem nélkül.ICAM-1 binding monoclonal antibodies are very useful as anti-inflammatory agents in mammals. Importantly, these agents differ from the general anti-inflammatory agents in that they selectively inhibit adhesion and do not have side effects such as nefotoxicity that can occur with conventional agents. Thus, ICAM-1-binding monoclonal antibodies can be used in mammalian patients to prevent organ and tissue rejection or to modify autoimmune responses without fear of side effects.

Fontos szempont, hogy az ICÁM-1-et felismerő monoklonális antitestek használata mellett, még aAn important consideration is that with the use of monoclonal antibodies recognizing ICAM-1, a

HLA-szempontból eltérő egyéneknél is, végrehajthatók szervátültetések.Organisms that are not HLA-specific can be used for organ transplants.

2. A kései típusú túlérzékenységi reakciók szupresszorai2. Suppressors of late-type hypersensitivity reactions

Minthogy az ICÁM -1-molekulák főként a gyulladások helyén, például a kései típusú túlérzékenységi reakciók (delayed type hypersensitivity reaction) helyén fejeződnek ki, az ICÁM-1-molekulákhoz kötődő antitestek (különösen a monoklonális antitestek) terápiás potenciálját felhasználhatjuk az ilyen reakciók gyengítésére vagy kiküszöbölésére. A terápiás felhasználás lehetőségét kétféleképpen lehet kiaknázni. Először: ICAM-1 elleni monoklonális antitestet tartalmazó készítményt adhatunk be olyan betegnek, akinél kései típusú túlérzékenységi reakció lépett fel. Ilyen készítményeket adhatunk például olyan egyéneknek, akik olyan antigénekkel, mint például a mérges szömörce (poison ivy, posion oak) stb. érintkeztek. Egy másik alkalmazási lehetőség szerint a betegnek az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitestet egy antigénnel együtt adjuk be, hogy megelőzzük az ezt követő gyulladásos reakciót. Tehát, ha ICÁM-1-kötő monoklonális antitest mellett kiegészítésül egy antigént adagolunk, ez átmenetileg toleránssá teheti az egyént ugyanezen antigénnek egy következő megjelenésével szemben.Because ICAM-1 molecules are expressed mainly at sites of inflammation, such as delayed-type hypersensitivity reactions, the therapeutic potential of antibodies that bind to ICAM-1 molecules (especially monoclonal antibodies) can be used to attenuate or inhibit such reactions. eliminate. There are two ways to exploit the therapeutic potential. First, a composition comprising a monoclonal antibody to ICAM-1 can be administered to a patient who has a late-type hypersensitivity reaction. Such formulations may be administered, for example, to individuals who are exposed to antigens such as poison ivy, posion oak, and the like. in contact with. In another embodiment, the patient is co-administered the ICAM-1 binding monoclonal antibody with an antigen to prevent a subsequent inflammatory reaction. Thus, the addition of an antigen in addition to an ICAM-1 binding monoclonal antibody may render the subject temporarily tolerant of a subsequent appearance of the same antigen.

3. A krónikus gyulladással járó betegségek terápiája3. Therapy for diseases with chronic inflammation

Minthogy az LFA-1-hiányban szenvedő LAD-betegeknél nem lép fel gyulladásos válasz, azt gondoljuk, hogy az LFA—1 természetes ligandumának, az ICÁM-1-nek az antagonistája szintén gátolja majd a gyulladásos választ. Az ICAM-1-ellenes antitestek gyulladásgátló képessége képezi az alapját terápiás felhasználásuknak krónikus gyulladásos betegségek és autoimmun betegségek - ilyen a lupus erythematosus, az autoimmun thyroiditis, az experimentális allergiás encephalomyelitis (EAE), a sclerosis multiplex, a diabeteses Reynaud-szindróma bizonyos formái, a rheumatoid arthritis stb. - kezelésében. Ezek az antitestek a psoriasis terápiás kezelésében is felhasználhatók. Általánosságban az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitesteket azoknak a betegségeknek a kezelésében lehet alkalmazni, amelyek folyamatosan kezelhetők szteroidterápiával.Since LAD patients with LFA-1 deficiency do not show an inflammatory response, it is believed that an antagonist of the natural LFA-1 ligand, ICAM-1, will also inhibit the inflammatory response. The anti-inflammatory ability of anti-ICAM-1 antibodies forms the basis of their therapeutic use in chronic inflammatory diseases and autoimmune diseases such as lupus erythematosus, autoimmune thyroiditis, experimental allergic encephalomyelitis (EAE), multiple sclerosis, diabetic Reyndrome, rheumatoid arthritis, etc. - treatment. These antibodies can also be used in the therapeutic treatment of psoriasis. In general, monoclonal antibodies that bind to ICAM-1 can be used to treat diseases that can be treated continuously with steroid therapy.

4. Diagnosztikai és prognosztikai alkalmazások4. Diagnostic and prognostic applications

Minthogy az ICÁM-1 főként a gyulladásos helyeken fejeződik ki, az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitesteket eszközként lehet felhasználni arra, hogy egy betegben képet alkothassunk a fertőzés és gyulladás helyéről, és hogy azt láthatóvá tegyük. Ilyen célú használat esetén a monoklonális antitesteket detektálható jelzéssel látjuk el, például radioizotópokkal való jelzéssel, affinitásjelzéssel (ilyen a biotin, avidin stb.), fluoreszcens jelzéssel, paramágneses atomokkal való jelzéssel stb. A jelölések kivitelére szolgáló eljárások jól ismertek e szakterületen.Because ICAM-1 is predominantly expressed at sites of inflammation, monoclonal antibodies that bind to ICAM-1 can be used as a tool to visualize and visualize the site of infection and inflammation in a patient. For such use, monoclonal antibodies are labeled with detectable labels, such as radiolabelling, affinity labeling (such as biotin, avidin, etc.), fluorescent labeling, paramagnetic labeling, and the like. Methods for implementing markings are well known in the art.

Az antitesteknek a diagnosztikai gyakorlatban való klinikai felhasználásával a következő összefoglaló közlemények foglalkoznak: Η. B. Grossman, Urol. Clin. Norh. Amer., 13, 465-474 (1986); E. C. Unger és mun11The clinical use of antibodies in diagnostic practice is addressed in the following summary publications:. B. Grossman, Urol. Clin. North Amer. Amer., 13, 465-474 (1986); E. C. Unger et al

HU 217 792 Β katársai, Invest. Rádiói., 20, 693-700 (1985) és B. A. Khaw és munkatársai, Science, 209, 295-297 (1980).HU 217 792 Β et al., Invest. Radiol., 20, 693-700 (1985) and B.A. Khaw et al., Science, 209, 295-297 (1980).

A gyulladások fennállását ligandumok segítségével is észlelhetjük, azaz olyan mRNS, cDNS vagy DNS révén, amelyek az ICÁM -1-kifejező sejtek ICÁM -1-génszekvenciáihoz vagy ICAM-l-mRNS-szekvenciáihoz kötődnek. Ezeknek a hibridizációs vizsgálatoknak a technikáját T. Maniatis írta le (lásd fentebb).Inflammation can also be detected using ligands, i.e., mRNA, cDNA or DNA that bind to ICAM-1 gene sequences or ICAM-1-mRNA sequences of ICAM-1-expressing cells. The technique of these hybridization assays is described by T. Maniatis (see above).

A detektálhatóan jelzett antitestek helyzetének az észlelése alapján egy gyulladásnak vagy egy tumor fejlődésének a helyére lehet következtetni. A gyulladás vizsgálatának egyik módja szerint úgy járunk el, hogy szövet- vagy vérmintákat veszünk, és a mintákat a detektálható jelzéssel ellátott antitestek jelenlétében inkubáljuk. Egy előnyös megvalósítási változatban a technikát nem invazív módon alkalmazzuk, azaz mágneses leképzést, fluorográfiát stb. használunk. Ezt a diagnosztikai tesztet arra lehet használni, hogy a szervátültetett betegnél a potenciális szövetkilökődés korai jeleit megfigyeljük. Az ilyen vizsgálatok lefolytatásánál megkísérelhetjük meghatározni egy betegnél a rheumatoid arthritisre vagy más gyulladásos megbetegedésekre való hajlamot.Observation of the position of detectably labeled antibodies suggests the site of inflammation or tumor development. One way to test for inflammation is by taking tissue or blood samples and incubating the samples in the presence of detectable labeled antibodies. In a preferred embodiment, the technique is applied in a non-invasive manner, i.e., magnetic imaging, fluorography, and the like. used. This diagnostic test can be used to detect early signs of potential tissue rejection in an organ transplant patient. Such studies may attempt to determine the susceptibility of a patient to rheumatoid arthritis or other inflammatory diseases.

5. Néhány kiegészítés a terápiás és diagnosztikai célokra alkalmazott antigén természetű anyagok beadásával kapcsolatban5. Some additions to the administration of antigenic substances used for therapeutic and diagnostic purposes

A terápiás vagy diagnosztikai hatóanyagokra - így például a bovininzulinra, interferonra, szöveti plazminogénaktivátorra vagy az egér monoklonális antitestekre - adott immunválaszok lényegében csökkentik ezen hatóanyagok terápiás vagy diagnosztikai értékét, és valójában betegségeket is okozhatnak, például szérumbetegséget. Az ilyen esetek a találmány szerinti antitestek használatával orvosolhatók. Ebben az eljárásban az antitesteket a terápiás vagy diagnosztikus hatóanyaggal kombinálva alkalmazhatjuk. Az antitest hozzáadása megakadályozza, hogy a recipiens felismerje a hatóanyagot, és ennélfogva megvédi a beteget attól, hogy ez ellen immunválasz induljon meg. Az immunválasz elmaradása a beteg számára azt eredményezi, hogy a terápiás vagy diagnosztikus hatóanyagokból további adagokat lehet a betegnek beadni.Immune responses to therapeutic or diagnostic agents, such as bovinulin, interferon, tissue plasminogen activator, or murine monoclonal antibodies, substantially reduce the therapeutic or diagnostic value of these agents, and may actually cause diseases such as serum disease. Such cases can be corrected using the antibodies of the invention. In this method, the antibodies can be used in combination with a therapeutic or diagnostic agent. Addition of the antibody prevents the recipient from recognizing the active ingredient and therefore protects the patient from triggering an immune response. The absence of an immune response in the patient results in additional doses of the therapeutic or diagnostic agents being administered to the patient.

F) Az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1) felhasználási területeF) Application of Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1)

Az ICAM-1 az LFA-1 kötőpartnere. Tehát betegségek kezelésében az ICAM-l-et vagy funkcionális származékait az LFA-1-hez kötődő antitestekkel felváltva lehet alkalmazni, azaz ezeket a molekulákat - szolubilizált formában - fel lehet használni gyulladás, szervkilökődés, graftrejekció stb. gátlására. Az ICAM-l-et vagy funkcionális származékait ugyanúgy lehet használni, mint az anti-ICAM-1-antitesteket a terápiás és diagnosztikai hatóanyagok immunogenitásának a csökkentésére.ICAM-1 is the binding partner of LFA-1. Thus, in the treatment of diseases, ICAM-1 or functional derivatives thereof may be used interchangeably with antibodies binding to LFA-1, i.e., these molecules may be used in solubilized form for inflammation, organ rejection, graft rejection, etc. inhibition. ICAM-1 or functional derivatives thereof can be used in the same way as anti-ICAM-1 antibodies to reduce the immunogenicity of therapeutic and diagnostic agents.

Az ICAM-l-et, funkcionális származékait és antagonistáit fel lehet használni olyan tumorsejtek metasztázisának és proliferációjának a blokkolására, amelyek felületükön vagy ICAM-l-et, vagy LFA-1-et fejeznek ki. Különböző módszereket használhatunk e cél elérésére. Például a hematopoetikus sejtek migrációjához szükség van LFA-1 -ICÁM-1 kötődésre. Tehát e kötődés antagonistái akadályozzák e migrációt, és blokkolják a leukocitavonal tumorsejtjeinek a metasztázisát. Vagy másként: vagy az ICAM-l-et, vagy az LFA-1molekulacsalád egy tagját megkötni képes, toxinnal módosított molekulákat adhatunk be betegeknek. Ha az ilyen toxinnal módosított molekulák hozzákötődnek olyan tumorsejtekhez, amelyek az ICAM-l-et vagy az LFA-1-molekulacsalád egy tagját kifejezik, a toxin jelenléte elöli a tumorsejtet és ezáltal megakadályozza a tumor proliferációját.ICAM-1, its functional derivatives and antagonists can be used to block metastasis and proliferation of tumor cells expressing either ICAM-1 or LFA-1 on their surface. There are different ways to achieve this goal. For example, migration of hematopoietic cells requires LFA-1-ICAM-1 binding. Thus, antagonists of this binding inhibit this migration and block the metastasis of leukocyte lineage tumor cells. Alternatively, toxin-modified molecules capable of binding either ICAM-1 or a member of the LFA-1 family of molecules may be administered to patients. When such toxin-modified molecules bind to tumor cells expressing ICAM-1 or a member of the LFA-1 family of molecules, the presence of the toxin kills the tumor cell and thereby prevents tumor proliferation.

G) Az ICÁM-1-függő adhézió nem immunglobulin antagonistáinak felhasználási területeG) Areas of use of non-immunoglobulin antagonists of ICAM-1-dependent adhesion

Az ICAM-l-fúggő adhézió meggátolható olyan nem immunglobulin antagonistákkal, amelyek vagy az ICÁM-1-hez, vagy az LFA-1-hez kötődnek. Az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistája például az LFA-1. Egy nem immunglobulin antagonista, amely kötődik az LFA-l-hez, például az ICAM-1. A fent leírt vizsgálatok révén további nem immunglobulin antagonisták azonosíthatók és tisztíthatók. Az ICÁM -1-függő adhézió nem immunglobulin antagonistái ugyanarra a célra használhatók, mint az LFA-1 elleni antitestek vagy az ICÁM-1 elleni antitestek.ICAM-1-dependent adhesion can be inhibited by non-immunoglobulin antagonists that bind to either ICAM-1 or LFA-1. An example of a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1 is LFA-1. A non-immunoglobulin antagonist that binds to LFA-1, such as ICAM-1. Additional non-immunoglobulin antagonists can be identified and purified by the assays described above. Non-immunoglobulin antagonists of ICAM-1-dependent adhesion can be used for the same purposes as antibodies to LFA-1 or antibodies to ICAM-1.

H) A találmány szerinti készítmények alkalmazásaH) Use of the compositions of the invention

Az ICAM-1-gyei terápiás hatást úgy érhetünk el, ha a betegnek a teljes ICAM-l-molekulát adjuk be vagy ennek bármilyen terápiásán hatásos peptidfragmentumát.The therapeutic effect of ICAM-1 can be achieved by administering to the patient the entire ICAM-1 molecule or any therapeutically effective peptide fragment thereof.

Az ICAM-l-et és funkcionális származékait vagy szintetikus úton, vagy rekombináns DNS-technológiával, vagy proteolízis révén kaphatjuk meg. Az ICÁM-1 terápiás előnyeit azzal növelhetjük meg, ha további aminosavcsoportokat kapcsolunk a molekulához, amelyek erősítik a vivőanyaghoz való kapcsolódást vagy erősítik az ICÁM-1 aktivitását. A jelen találmány oltalmi köréhez tartoznak az ICAM-1 azon további funkcionális származékai is, amelyekből hiányoznak bizonyos aminosavcsoportok vagy amelyek más aminocsoportokat tartalmaznak, feltéve, ha ezek a származékok a sejtes adhéziót befolyásoló tulajdonságokkal rendelkeznek.ICAM-1 and its functional derivatives may be obtained either synthetically or by recombinant DNA technology or by proteolysis. The therapeutic benefits of ICAM-1 can be enhanced by attaching additional amino acid residues to the molecule that enhance binding to the vehicle or enhance ICAM-1 activity. Other functional derivatives of ICAM-1 which lack certain amino acid residues or which contain other amino groups are also included within the scope of the present invention, provided that these derivatives have cell adhesion promoting properties.

A találmány szerinti antitestekről és az ICAM-1molekuláról azt állítjuk, hogy „lényegében nem tartalmaznak természetes szennyezéseket”, ha ezek a készítmények lényegében mentesek azoktól az anyagoktól, amelyek ezekben a termékekben rendszerint a természetben együtt vannak.The antibodies of the invention and the ICAM-1 molecule are said to be "substantially free of natural impurities" when these formulations are substantially free of the substances normally present in nature in these products.

A jelen találmány azokra az antitestekre és biológiailag aktív fragmentumaira (akár poliklonális, akár monoklonális) is kiterjed, amelyek képesek az ICÁM-1-hez kötődni. Ezek az antitestek állatban vagy szövettenyészetben, vagy rekombináns DNS-technológiával állíthatók elő.The present invention also encompasses antibodies and biologically active fragments thereof (either polyclonal or monoclonal) that are capable of binding to ICAM-1. These antibodies can be produced in animal or tissue culture or by recombinant DNA technology.

Ha egy betegnek ICAM-l-et kötő antitesteket adunk be vagy ennek fragmentumait, vagy ha egy recipiens betegnek ICAM-l-et (vagy egy fragmentumát, variánsát vagy származékát) adunk, az alkalmazott hatóanyag adagolása olyan faktorok függvényében változik, mint a beteg kora, súlya, magassága, neme, általános állapota orvosi szempontból, kortörténete stb. ÁltalábanWhen a patient is given ICAM-1 binding antibodies or fragments thereof, or when a recipient patient is given ICAM-1 (or a fragment, variant, or derivative thereof), the dosage of the active ingredient used will vary according to factors such as the age of the patient. , weight, height, gender, medical condition, medical history, etc. usually

HU 217 792 Β célszerű a beteget 1 pg/kg-tól 10 mg/kg-ig (kg a beteg testtömege) terjedő antitestadaggal kezelni, de kisebb vagy nagyobb adagok is alkalmazhatók. Ha a betegnek ICAM-1-molekulákat vagy funkcionális származékait adjuk be, előnyös, ha ezekből a molekulákból szintén 1 pg/kg-tól 10 mg/kg-ig (kg a beteg testtömege) teijedő adagokat adunk, bár kisebb vagy nagyobb adagok is alkalmazhatók. Mint alább tárgyaljuk, a terápiásán hatásos dózist csökkenthetjük, ha az anti-ICAM-1-antitestet anti-LFA-1-antitesttel együtt alkalmazzuk. Egy komponensnek egy második komponenssel való együttes alkalmazása itt azt jelenti, hogy a két komponenst olyan időközökben adagoljuk, hogy mindkét komponens ugyanazon időben legyen észlelhető a beteg szérumában.It is expedient to treat the patient with an antibody dose ranging from 1 pg / kg to 10 mg / kg (kg patient body weight), but lower or higher doses may be used. When ICAM-1 molecules or functional derivatives thereof are administered to a patient, it is preferable that doses ranging from 1 pg / kg to 10 mg / kg (kg body weight) of these molecules are also administered, although lower or higher doses may be used. . As discussed below, the therapeutically effective dose may be reduced when the anti-ICAM-1 antibody is used in combination with the anti-LFA-1 antibody. The use of a component with a second component herein means that the two components are administered at intervals such that both components are detectable in the patient's serum at the same time.

Mind az ICÁM-1-et kötő antitest, mind maga az ICÁM -1 beadható a betegnek intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, enterálisan vagy parenterálisan. Ha az antitestet vagy az ICÁM- 1-et injekcióban adjuk, az adagolás történhet folyamatos infúzióval, vagy egyszeri vagy többszöri implantációs kapszula adásával.Both ICAM-1 binding antibody and ICAM-1 itself can be administered to a patient intravenously, intramuscularly, subcutaneously, enterally or parenterally. When the antibody or ICAM-1 is administered by injection, the administration may be by continuous infusion or by the administration of a single or multiple implant capsule.

A találmány szerinti gyulladásellenes hatóanyagokat olyan mennyiségben adjuk a recipiens betegnek, hogy az elégséges legyen a gyulladás leküzdéséhez. Egy mennyiségre akkor mondjuk, hogy elégséges a leküzdéshez, ha a hatóanyag dózisa, adagolásának módja stb. elégséges a gyulladás gyengítéséhez vagy megelőzéséhez.The anti-inflammatory agents of the invention are administered to the recipient in an amount sufficient to control the inflammation. For one amount, it is said to be sufficient to overcome the dose, mode of administration, etc. of the active ingredient. sufficient to attenuate or prevent inflammation.

Az anti-ICAM-1-antitestet vagy ennek egy fragmentumát vagy egyedül, vagy egy vagy több kiegészítő immunszupresszív hatóanyaggal kombinálva adagolhatjuk (főként olyan betegnek, akinél szerv- vagy szövetátültetés történt). Az ilyen vegyület(ek) alkalmazása vagy „profilaktikus”, vagy terápiás célt szolgál. Ha profilaktikus célból adjuk, akkor az immunszupresszív vegyülete(ke)t bármilyen gyulladásos válasz vagy szimptóma előtt alkalmazzuk (például a szervvagy szövettranszplantáció ideje előtt vagy ezzel egy időben vagy röviddel ez után, de a szervkilökődés bármilyen szimptómája előtt). A vegyület(ek) profilaktikus adása arra szolgál, hogy megelőzzön vagy gyengítsen bármely bekövetkező gyulladásos választ (például egy átültetett szerv vagy szövet kilökődését). Ha az immunszupresszív vegyület(ek) terápiás célt szolgának, úgy ez(eke)t az aktuális gyulladás tüneteinek a kezdetekor (vagy röviddel ez után) kell beadni. A vegyület(ek) terápiás alkalmazása bármilyén aktuális gyulladás (ilyen például egy átültetett szerv vagy szövet kilökődése) gyengítésére szolgál.The anti-ICAM-1 antibody, or fragment thereof, may be administered alone or in combination with one or more additional immunosuppressive agents (particularly in a patient who has undergone organ or tissue transplantation). The use of such compound (s) is either "prophylactic" or therapeutic. When administered for prophylactic purposes, the immunosuppressive compound (s) is administered prior to any inflammatory response or symptom (e.g., prior to, or shortly after, organ or tissue transplantation, but prior to any symptom of organ rejection). Prophylactic administration of the compound (s) is intended to prevent or attenuate any inflammatory response that may occur (e.g., rejection of a transplanted organ or tissue). If the immunosuppressive compound (s) serves a therapeutic purpose, it (s) should be administered at the beginning (or shortly after) of the symptoms of current inflammation. Any therapeutic use of the compound (s) is intended to attenuate actual inflammation (such as rejection of a transplanted organ or tissue).

A jelen találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagokat tehát vagy a gyulladás megindulása előtt (egy előre látott gyulladás elfojtására) alkalmazzuk, vagy a gyulladás megindulása után.Thus, the anti-inflammatory agents of the present invention are applied either before the onset of inflammation (to suppress a foreseeable inflammation) or after the onset of inflammation.

Egy készítményről akkor mondhatjuk, hogy „farmakológiailag megfelelő”, ha beadását a recipiens beteg tűri. Egy ilyen hatóanyagnál akkor mondjuk, hogy adagolása „terápiásán hatásos mennyiségben” történik, ha a beadott mennyiség hatása fiziológiai szempontból szignifikáns. Egy hatóanyagról akkor mondjuk, hogy fiziológiailag szignifikáns hatású, ha beadása a recipiens betegben kimutatható fiziológiai változást okoz.A preparation can be said to be "pharmacologically acceptable" if its administration is tolerated by the recipient patient. Such an active ingredient is said to be administered in a "therapeutically effective amount" when the effect of the administered amount is physiologically significant. An active ingredient is said to be physiologically significant if its administration causes a detectable physiological change in the recipient patient.

A találmány szerinti antitestet és ICAM-1-molekulákat ismert eljárások szerint formulázhatjuk gyógyszerészeti szempontból használható készítményekké, azaz ezeket az anyagokat vagy funkcionális származékaikat gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozó vivőanyagokkal kombinálva elegyítjük. Az alkalmas vivőanyagok és formulázásuk - ideértendők más humán proteinek, mint például a humán szérumalbumin - leírása megtalálható például a Remington’s Pharmaceutical Sciences [16. kiadás, A. Osol (szerkesztő), Mack, Easton PA, USA (1980)] című kiadványban. Annak érdekében, hogy megfelelő hatékonysággal alkalmazható, gyógyszerészeti szempontból megfelelő készítményt állítsunk elő, ezeknek a készítményeknek az antiICAM-1-antitestből vagy az ICÁM-1-molekulából vagy funkcionális származékaikból hatásos mennyiséget kell tartalmazniuk, a hordozó vivőanyag alkalmas mennyiségével együtt.The antibody and ICAM-1 molecules of the invention may be formulated into pharmaceutically acceptable compositions according to known methods, i.e., by combining these substances or functional derivatives with pharmaceutically acceptable carriers. Suitable carriers and their formulation, including other human proteins such as human serum albumin, are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences [16]. A. Osol (editor), Mack, Easton PA, USA (1980). In order to formulate a pharmaceutically acceptable formulation which is effective in efficacy, these formulations must contain an effective amount of the antiICAM-1 antibody or ICAM-1 molecule or functional derivatives thereof, together with an appropriate amount of carrier vehicle.

A hatás időtartamának a szabályozására ezenkívül farmakológiai módszereket is alkalmazhatunk. Szabályozottan felszabaduló készítményeket az antiICAM-1-antitesttel vagy az ICAM-1-gyei, vagy ezek funkcionális származékaival komplexet képező, vagy ezeket adszorbeáló polimerek segítségével állítunk elő. A szabályozott felszabaduláshoz megfelelő makromolekulákat (például poliészterek, poliaminosavak, poli(vinil-pirrolidon), etilén-vinil-acetát, metil-cellulóz, karboxi-metil-cellulóz vagy protamin-szulfát) választunk ki, továbbá megállapítjuk a makromolekulák koncentrációját és az inkorporáció módszereit a szabályozott felszabadulás érdekében. Egy másik lehetséges módszer szerint a szabályozottan felszabaduló készítményekkel úgy szabályozzuk a hatás időtartamát, hogy az antiICAM-l-antitestet vagy az ICÁM-1-molekulákat, vagy funkcionális származékaikat beépítjük egy polimer anyag - mint amilyenek a poliészterek, poliaminosavak, hidrogélek, politejsav vagy az etilén-vinil-acetát-kopolimerek - partikuláiba. Vagy pedig a hatóanyagoknak polimer partikulákba való beépítése helyett ezeket az anyagokat például koacervációs technikával vagy interfaciális polimerizációval készített mikrokapszulákba vihetjük be, például hidroxi-metil-cellulózvagy zselatinmikrokapszulákba, vagy például kolidális gyógyszer-felszabadító rendszereket - ilyenek például a liposzómák, albuminmikrogömbök, mikroemulziók, nanopartikulák és nanokapszulák - vagy makroemulziókat alkalmazhatunk. Ezek a technikák megtalálhatók a Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) című kiadványban.In addition, pharmacological methods may be used to control the duration of action. Controlled release formulations are prepared using polymers which complex or adsorb with the antiICAM-1 antibody or ICAM-1 or functional derivatives thereof. Suitable macromolecules (e.g., polyesters, polyamino acids, polyvinylpyrrolidone), ethylene vinyl acetate, methylcellulose, carboxymethylcellulose or protamine sulfate) are selected for controlled release, and the concentration of macromolecules and methods of incorporation are determined. for controlled release. Alternatively, controlled release formulations can be controlled by incorporating the anti-ICAM-1 antibody or ICAM-1 molecules or functional derivatives into a polymeric material such as polyesters, polyamino acids, hydrogels, polylactic acid, or ethylene-vinyl acetate copolymers. Alternatively, instead of incorporating the active compounds into polymeric particles, these materials may be incorporated into microcapsules prepared, for example, by coacervation or interfacial polymerization, such as hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules, or e.g. nanocapsules - or macroemulsions. These techniques can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980).

A találmány általános leírása után a találmány könnyebben megérthető a következő példákon keresztül. amelyeket magyarázatképpen ismertetünk, anélkül azonban, hogy e példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.Following the general description of the invention, the invention will be better understood by the following examples. without limiting the scope of the invention to these examples.

1. példaExample 1

Emlőssejtek tenyésztéseCulturing mammalian cells

A találmány szerinti EBV-transzformált és hibridómasejteket általában 20 mM L-glutaminnal, 50 pg/ml gentamicinnel és 10% fetális bovin- (vagy fetális borjú-)The EBV-transformed and hybridoma cells of the invention are generally treated with 20 mM L-glutamine, 50 pg / ml gentamycin and 10% fetal bovine (or fetal calf).

HU 217 792 Β szérummal kiegészített RPMI 1640 táptalajban tartjuk fenn. A sejteket 37 °C-on 50% CO₂- és 95% nedvességtartalmú levegőatmoszférában tenyésztjük.HU 217 792 Β serum supplemented with RPMI 1640 medium. The cells were cultured at 37 ° C in an atmosphere of 50% CO _{2 to} 95% humidity.

Epstein-Barr-vírussal (EBV) transzformált sejtekhez úgy jutunk, hogy ml-enként 10⁶ T-sejtre kimerített perifériás vér mononukleáris sejtet tartalmazó, 20% fetális borjúszérummal (FCS 2 fetal calf serum) és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI 1640 táptalajt 16 órán át inkubálunk B95-8 sejtek (ATCC CRL 1612) [D. A. Thorley-Lawson és munkatársai, J. Exper. Med., 146,495 (1977)] EBV-tartalmú felülúszójával. A sejtekből 0,2 ml részleteket mértünk be 10 mikrotitráló lemeztartályba. Amíg a sejtnövekedés észlelhető, a táptalajt RPMI 1640 táptalajjal (kiegészítve 20% FCS-sel és 50 pg/ml gentamicinnel) cseréltük. A legtöbb tartályban növekedést észleltünk, és ezeket a sejteket ugyanezen táptalajban szaporítottuk el. Fitohemagglutinin- (PHA) blasztokat készítettünk 10⁶ sejt/ml sűrűséggel, RPMI 1640 táptalajban (kiegészítve 20% FCSsel), mely 1:800 hígításban tartalmazott PHA-P-t (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA). A PHAsejtvonalakat interleukin-2-vel (IL-2-vel) kondicionált táptalajban szaporítottuk, és hetenként PHA-val kezeltük [D. A. Cantrell és munkatársai, J. Exper. Med., 158, 1895 (1983)]. A fenti eljárást T. Springer és munkatársai [J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984)] közölték, adatait itt referenciaként használjuk fel. A fenti eljárás folyamán kapott sejteket ezután anti-LFA-1 antitestekkel szűrtük, hogy meghatározzuk, vajon kifejeznek-e LFA-1 antigént. Ezeket az antitesteket F. Sanchez-Madrid és munkatársai ismertették [J. Exper. Med., 158, 1785 (1983)].Cells transformed with Epstein-Barr virus (EBV) are obtained by RPMI 1640 medium supplemented with 10 ⁶ T cell depleted peripheral blood mononuclear cells supplemented with 20% fetal calf serum (FCS 2 fetal calf serum) and 50 pg / ml gentamicin. Incubate for 16 hours with B95-8 cells (ATCC CRL 1612) [DA Thorley-Lawson et al., J. Exper. Med., 146, 495 (1977)] with an EBV-containing supernatant. 0.2 ml aliquots of cells were added to 10 microtiter plate wells. Until cell growth was observed, the medium was replaced with RPMI 1640 medium (supplemented with 20% FCS and 50 pg / ml gentamycin). Growth was observed in most wells and these cells were grown in the same medium. Phytohemagglutinin (PHA) blasts were prepared at 10 ⁶ cells / ml in RPMI 1640 medium (supplemented with 20% FCS) containing PHA-P (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) at a 1: 800 dilution. PHA cell lines were grown in interleukin-2 (IL-2) conditioned medium and treated weekly with PHA [DA Cantrell et al., J. Exper. Med., 158, 1895 (1983)]. The above procedure was described by T. Springer et al., J. Med. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984)], the data of which are incorporated herein by reference. The cells obtained in the above procedure were then screened with anti-LFA-1 antibodies to determine whether they express LFA-1 antigen. These antibodies are described by F. Sanchez-Madrid et al. Exper. Med., 158, 1785 (1983)].

2. példaExample 2

A sejtes aggregáció és adhézió vizsgálómódszereiTesting methods for cellular aggregation and adhesion

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a celluláris adhézió mértékét, aggregációs vizsgálatokat végeztünk. Az ilyen vizsgálatokban használt sejtvonalakat kétszer mossuk 5 mM HEPES-puffert (Sigma Chemical Co., St. Louis) tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal, és a sejteket 2 -10⁶ sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk. Lapos fenekű, 96 tartályos mikrotitrálólemezek (No. 3596; Costar, Cambridge, MA, USA) tartályaiba bemérünk 50 pl megfelelő monoklonális antitest-felülúszót vagy 50 pg teljes táptalajt tisztított monoklonális antitesttel vagy nélküle, 50 pl teljes táptalajt, mely 200 ng/ml forbol-észtert, azaz forbol-mirisztátacetátot (PMA) tartalmaz és 100 pl teljes táptalajt, mely a sejteket 2-10⁶ sejt/ml koncentrációban tartalmazza. A végső koncentráció tehát 50 ng/ml PMA és 2· 10⁵ sejt tartályonként. Hagyjuk, hogy a sejtek spontán leülepedjenek, és az aggregáció mértékét különböző időpontokban feljegyezzük. A titerérték O-tól 5+-ig változhat, ahol a 0 azt jelenti, hogy a sejtek lényegében nincsenek összecsapódva; 1 + azt jelenti, hogy a sejtek kevesebb mint 10%-a aggregálódott; a 2+ azt jelenti, hogy a sejtek kevesebb mint 50%-a aggregálódott; a 3+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a kis, laza csomókat képez; a 4+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a aggregálódott nagy csomókban; az 5+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a nagy, kompakt aggregátumokban van. Annak érdekében, hogy a sejtes adhézióról ennél kvantitatívabb értékelést kapjunk, a reagenseket és a sejteket 5 ml-es polisztirolcsövekbe mérjük be ugyanolyan sorrendben, mint fent. A csöveket 37 °C-on egy forgó rázógép rácsos állványába helyezzük. A csöveket körülbelül 200 fordulat/perc mellett 1 órán át rázzuk, és ezután a sejtszuszpenzióból 10 pl-t hemocitométerbe helyezünk, és a szabad sejtek számát megmérjük. Az aggregáció százalékát az alábbi egyenlettel határozzuk meg:Aggregation assays were performed to determine the extent of cellular adhesion. Cell lines used in such assays were washed twice with RPMI 1640 medium containing 5 mM HEPES buffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) and resuspended at 2 to 10 ⁶ cells / ml. Wells of flat bottom 96-well microtiter plates (No. 3596; Costar, Cambridge, MA, USA) are weighed with 50 µl of appropriate monoclonal antibody supernatant or 50 µg of complete medium with or without purified monoclonal antibody, 50 µl of complete medium at 200 ng / ml ester, i.e. phorbol myristate acetate (PMA), and 100 µl of complete medium containing cells at a concentration of 2-10 ⁶ cells / ml. Thus the final concentration of 50 ng / ml PMA and 2 × 10 ⁵ cells per well. The cells are allowed to settle spontaneously and the degree of aggregation is recorded at different times. The titer may vary from 0 to 5 +, where 0 means that the cells are essentially non-confluent; 1 + means that less than 10% of the cells are aggregated; 2+ means that less than 50% of the cells are aggregated; 3+ means that 100% of the cells form small, loose lumps; 4+ means that 100% of the cells are aggregated in large nodules; 5+ means that 100% of the cells are in large, compact aggregates. In order to obtain a more quantitative evaluation of cell adhesion, reagents and cells are weighed into 5 ml polystyrene tubes in the same order as above. The tubes were placed at 37 ° C in a lattice rack of a rotary shaker. The tubes are shaken at about 200 rpm for 1 hour, and 10 µl of the cell suspension is then placed in a hemocytometer and the number of free cells is measured. The percentage of aggregation is determined by the following equation:

szabad sejtek száma aggregáció % = 100 χ (1--) bevitt sejtek számanumber of free cells% aggregation = 100 χ (1-) number of cells introduced

A fenti képletben a bevitt sejtek száma egyenlő a kontrollcsőben lévő sejtek ml-enkénti számával. A kontrollcső csak sejteket és teljes táptalajt tartalmaz, és nincs inkubálva. Az egyenletben a szabad sejtek száma egyenlő a kísérleti csőben lévő, nem aggregált sejtek ml-enkénti számával. A fenti eljárást R. Rothlein és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986)].In the above formula, the number of cells introduced is equal to the number of cells per ml in the control tube. The control tube contains only cells and whole medium and is not incubated. The number of free cells in the equation is equal to the number of non-aggregated cells per ml in the test tube. The above procedure is described by R. Rothlein et al., J. Med. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)].

3. példaExample 3

LFA-1-függő sejtes aggregációLFA-1-dependent cellular aggregation

A 2. példában leírt kvalitatív vizsgálatot EpsteinBarr-vírussal transzformált JY-sejtvonallal végeztük. Megfigyeltük, hogy a mikrotitrálólemezeken lévő táptalajhoz adott PMA hatására a sejtek aggregálódnak. Gyorsított videofelvételek (timelapse videó recordings) azt mutatták, hogy a mikrotitrálólemez tartályai fenekén a JY-sejtek mozgékonyak, és aktív membrángyűrődéseket és állábas (pseudopodiás) mozgásokat mutattak. A szomszédos sejtek állábai közti érintkezés gyakran sejt-sejt adherenciát eredményezett. Ha az adherencia fennmarad, a sejt kontaktusterülete az uropodia felé mozdul el. Az érintkezés az élénk sejtmozgás és a sejtek ellenkező irányba való elhúzódása ellenére is fennmaradhat. Úgy tűnik, hogy a PMA-val kezelt és a nem kezelt sejtek közti primer különbség a már kialakult kontaktusok stabilitásában van. PMA-val a kialakult sejtcsomók mérete növekszik, ahogyan további sejtek tapadnak a csomók felszínére.The qualitative assay described in Example 2 was performed with the Jstein cell line transformed with EpsteinBarr virus. It was observed that the addition of PMA to the medium on the microtiter plates allowed the cells to aggregate. Timelapse video recordings showed that JY cells were motile at the bottom of the wells of the microtiter plate and showed active membrane folds and pseudopodial movements. Contact between the jaws of adjacent cells often resulted in cell-cell adherence. If adherence persists, the cell's contact area shifts toward uropodia. Contact may persist despite vigorous cell movement and cell retraction. The primary difference between PMA-treated and untreated cells appears to be the stability of established contacts. With PMA, the size of the formed cell nodules increases as additional cells adhere to the surface of the nodules.

Az adhézió mérésének másik módszere a 2. példában leírt kvantitatív vizsgálat. A sejtszuszpenziót 200 fordulat/perc mellett 2 órán át rázzuk, majd átvisszük hemocitométerbe, és megszámoljuk az aggregátumon kívül lévő sejteket. PMA távollétében 2 óra múlva a JY-sejtek 42%-a (SD=20%, N=6) volt aggregátumokban, míg ha a sejteket azonos körülmények között 50 pg/ml PMA-val inkubáltuk, a sejtek 87%-a (SD=8%, N=6) volt az aggregátumokban. Az aggregáció kinetikus vizsgálata azt mutatta, hogy a PMA minden vizsgált időpontban (3. ábra) erősítette az aggregáció sebességét és mértékét.Another method for measuring adhesion is the quantitative assay described in Example 2. The cell suspension was shaken at 200 rpm for 2 hours, then transferred to a hemocytometer and counted cells outside the aggregate. In the absence of PMA, 42% (SD = 20%, N = 6) of JY cells were in aggregates after 2 hours, whereas when cells were incubated with 50 pg / ml PMA under the same conditions, 87% (SD) = 8%, N = 6) in the aggregates. Kinetic analysis of aggregation showed that PMA enhanced the rate and extent of aggregation at each time point examined (Figure 3).

4. példaExample 4

A sejtek aggregációjának gátlása anti-LFA-1 monoklonális antitestekkelInhibition of cell aggregation by anti-LFA-1 monoclonal antibodies

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az antiLFA-1 monoklonális antitestek hatását a PMA-val indukált sejtes aggregációra, a 2. példában leírt kvalitatív aggregációs vizsgálat szerint inkubált sejtekhez az említett monoklonális antitesteket adtuk hozzá. Azt tapasztaltuk, hogy e monoklonális antitestek gátolták a sejtaggregátumok kialakulását, akár jelen volt PMA, akár nem. Az LFA-1 α-láncával szembeni monoklonális antitesteknek mind az F(ab’)₂’, mind az Fab’ fragmentumai képesek voltak a sejtes aggregációt meggátolni. Míg lényegében a sejtek 100%-a képezett aggregátumokat anti-LFA-1-antitest távollétében, addig ha antitestet adtunk hozzájuk, a sejtek kevesebb mint 20%-a volt az aggregátumokban. Ennek a kísérletnek az eredményeit R. Rothlein és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 163, 1132-1149(1986)].In order to test the effect of antiLFA-1 monoclonal antibodies on PMA-induced cellular aggregation, said monoclonal antibodies were added to cells incubated according to the qualitative aggregation assay described in Example 2. These monoclonal antibodies were found to inhibit the formation of cell aggregates, whether or not PMA was present. Both F (ab ') ₂ ' and Fab 'fragments of the monoclonal antibodies to the α-chain of LFA-1 were able to inhibit cellular aggregation. While essentially 100% of the cells formed aggregates in the absence of anti-LFA-1 antibody, less than 20% of the cells were present in the aggregates when antibody was added. The results of this experiment are described by R. Rothlein et al. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)].

5. példaExample 5

A sejtes aggregáció LFA-1-receptorigényeCellular aggregation requires LFA-1 receptor

Betegekből származó EBV-transzformált limfoblasztoid sejteket készítettünk az 1. példában leírt módon. A sejteket LFA-l-et felismerő monoklonális antitestekkel szűrtük, és azt találtuk, hogy a sejtek LFA-1deficiensek.EBV-transformed lymphoblastoid cells from patients were prepared as described in Example 1. The cells were screened with monoclonal antibodies recognizing LFA-1 and found to be LFA-1 deficient.

A 2. példában leírt kvalitatív aggregációs vizsgálatot végeztük el a fent leírt LFA-l-deficiens sejteket használva. Ezek a sejtek spontán nem aggregálódtak még PMA jelenlétében sem.The qualitative aggregation assay described in Example 2 was performed using the LFA-1 deficient cells described above. These cells did not spontaneously aggregate even in the presence of PMA.

6. példaExample 6

Az ICÁM-1 felfedezéseDiscovering ICAM-1

Az 5. példa szerinti LFA-l-deficiens sejteket karboxi-fluoreszcein-diacetáttal jeleztük [M. Patarroyo és munkatársai, Cell. Immunoi., 63, 237-248 (1981)]. A jelzett sejteket 1:10 arányban autológ vagy JY-sejtekkel kevertük, és meghatároztuk az aggregátumban a fluoreszceinnel jelzett sejtek százalékát R. Rothlein és munkatársai eljárása szerint [J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986)]. Megállapítottuk, hogy az LFA-ldeficiens sejtek az LFA-1-kifejező sejtekkel koaggregálódni képesek (4. ábra).The LFA-1 deficient cells of Example 5 were labeled with carboxyfluorescein diacetate [M. Patarroyo et al., Cell. Immunol., 63, 237-248 (1981)]. The labeled cells were 1:10 mixed with autologous or JY cells and the percentage of fluorescein-labeled cells in the aggregate was determined according to the method of R. Rothlein et al. Exper. Med. 163: 1132-1149 (1986)]. LFA-1 deficient cells were found to be able to co-aggregate with LFA-1-expressing cells (Figure 4).

Hogy meghatározzuk, vajon kizárólag az LFA-1 volt-e lényeges az aggregátumok képződése vagy fennmaradása szempontjából, LFA-l-et kötő antitesteket adtunk a fent leírt kész aggregátumokhoz. Azt tapasztaltuk, hogy az antitest hozzáadása erőteljesen széttördelte a kialakult aggregátumokat. Gyorsított videofelvétellel megerősítettük, hogy a kialakult aggregátumokhoz hozzáadott monoklonális antitestek 2 órán belül megkezdték az aggregátumok széttördelését (I. táblázat). LFA-l-gyel szembeni monoklonális antitestek hozzáadása után az aggregátumokon belül lévő egyes sejteknél az állábas mozgások és alakváltozások változatlanok maradtak. Az egyes sejtek fokozatosan leváltak az aggregátum felületéről; 8 óra múlva a sejtek nagy része diszpergálódott. Gyorsított videóval azt láttuk, hogy a kialakult aggregátumok szétesése LFA-1 monoklonális antitestek hatására időben visszafelé futtatva azonos az LFA-1 monoklonális antitestek távollétében történő aggregációs folyamattal.To determine whether LFA-1 alone was relevant for the formation or maintenance of aggregates, LFA-1 binding antibodies were added to the prepared aggregates described above. It was found that the addition of antibody severely disrupted the aggregates formed. Accelerated video recording confirmed that the monoclonal antibodies added to the formed aggregates began to disintegrate the aggregates within 2 hours (Table I). After the addition of monoclonal antibodies to LFA-1, the motions and deformations of the individual cells within the aggregates remained unchanged. The individual cells gradually detached from the aggregate surface; After 8 hours, most of the cells dispersed. Accelerated video showed that the disintegration of the formed aggregates by LFA-1 monoclonal antibodies when run back in time is the same as the aggregation process in the absence of LFA-1 monoclonal antibodies.

I. táblázatTable I

Az anti-LFA-1 monoklonális antitestek hatása a PMA-val indukált JY-sejtaggregátumok széteséséreEffect of anti-LFA-1 monoclonal antibodies on disruption of PMA-induced JY cell aggregates

Kísérlet Experiment 2 óra^a 2 hours ^a Aggrcgációleolvasás, 18 óra Aggregation reading, 18 hours -MAt -Matt + MAt + MAt 1. First 4 + 4+ 4+ 4+ l + ^b l + ^b 2. Second 3 + 3+ 4+ 4+ 1+^c 1+ ^c 3. Third 5 + 5+ 5 + 5+ l+^d l + ^d

Mikrotitrálólemezen végzett kvalitatív vizsgálatban az aggregáció leolvasása vizuálisan történt. Haanti-LFA-1 volt jelen a vizsgálat időtartama alatt, az aggregáció kisebb volt 1 +-nál.In a qualitative study on a microtiter plate, aggregation was read visually. Haanti-LFA-1 was present during the study period and aggregation was less than 1+.

^a Az aggregáció mértéke közvetlenül a monoklonális antitest (MAt) hozzáadása előtt, a 2. órában. ^b TS1/18+TS1/22 ^c TS1/18 ^dTSl/22 ^a The extent of aggregation just before the addition of the monoclonal antibody (MAt) at hour 2. ^b TS1 / 18 + TS1 / 22 ^c TS1 / 18 ^d TSl / 22

7. példaExample 7

Az LFA-1 függő aggregáció divalension-igényeDivalence requirement of LFA-1 dependent aggregation

A citotoxikus T-sejtek és a célsejtek közötti LFA-l-fuggő adhézióhoz magnéziumionok jelenléte szükséges [E. Martz, J. Cell. Biok, 84, 584-598 (1980)]. A PMA-val indukált JY-sejtek aggregációját divalens kationoktól való függőségre teszteltük. A JYsejtek nem aggregálódnak kalcium- és magnéziumionokat nem tartalmazó táptalajban (a 2. példa szerinti vizsgálatban). A divalens magnéziumion hozzáadása elősegítette az aggregációt 0,3 mmolos kis koncentráció mellett. Ha egyedül kalciumionokat adagoltunk, annak csekély haszna volt. Azonban azt tapasztaltuk, hogy a kalciumionok megnövelik a magnéziumionoknak azt a képességét, amellyel elősegítik a PMA-val indukált aggregációt. Ha 1,25 mM kalciumiont adtunk a táptalajhoz, 0,02 mM magnéziumion-koncentráció elősegítette az aggregációt. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a sejtek LFA-l-fuggő aggregációjához magnéziumionok szükségesek, és hogy a kalciumionok, bár önmagukban elégtelenek, szinergistái a magnéziumionoknak az aggregációt illetően.LFA-1-dependent adhesion between cytotoxic T cells and target cells requires the presence of magnesium ions [E. Martz, J. Cell. Biok., 84, 584-598 (1980)]. The aggregation of PMA-induced JY cells was tested for dependence on divalent cations. JY cells do not aggregate in medium containing no calcium and magnesium ions (assay of Example 2). Addition of divalent magnesium ion facilitated aggregation at a low concentration of 0.3 mmol. Adding calcium ions alone had little benefit. However, it has been found that calcium ions increase the ability of magnesium ions to promote PMA-induced aggregation. When 1.25 mM calcium ion was added to the medium, 0.02 mM magnesium ion concentration promoted aggregation. These data indicated that LFA-1-dependent aggregation of cells requires magnesium ions, and that calcium ions, although insufficient in themselves, are synergistic with magnesium ions in aggregation.

8. példaExample 8

Anti-ICAM-1 monoklonális antitesteket kifejező hibridómasejtek izolálásaIsolation of hybridoma cells expressing anti-ICAM-1 monoclonal antibodies

Az ICAM-1-kötő monoklonális antitesteket R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi, 137, 1270-1724 (1986)] módszere szerint izoláltuk. E közleményt itt referenciaként használjuk fel, azaz 3 Balb/c egeret intraperitoneálisan oltva immunizáltunk egy LFA-l-deficiens egyén perifériás véréből származó EBV-transzformált mononukleáris sejtjeivel [T. A. Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. Minden immunizáló oltáshoz körülbelül 10⁷ sejtet tartalmazó 1 ml RPMI 1640 táptalajt használtunk. Az oltásokat az egérlépsejtek eltávolítása előtt 45, 29 és 4 nappal végeztük a kívánt hibridómasejtek termelése végett. A lépsejtekICAM-1 binding monoclonal antibodies are described by R. Rothlein et al., J. Med. Immunol. 137: 1270-1724 (1986)]. This publication is used herein as a reference, i.e., 3 Balb / c mice were immunized intraperitoneally with EBV-transformed mononuclear cells from the peripheral blood of an LFA-1-deficient individual [TA Springer et al., J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. One ml of RPMI 1640 medium containing approximately 10 ⁷ cells was used for each immunization vaccine. Inoculations were performed 45, 29 and 4 days prior to removal of mouse spleen cells to produce the desired hybridoma cells. The spleen cells

HU 217 792 Β eltávolítása előtt 3 nappal az egereknek további 10⁷ sejtet adtunk intravénásán, 0,15 ml táptalajban.3 days prior to removal of EN 217 792 Β the mice were given an additional 10 ⁷ cells intravenously, 0.15 ml of medium.

A fent említett állatokból izolált lépsejteket P3X73Ag8.653 mielómasejtekkel (ATCC CRL 1580) fuzionáltuk, 4:1 arányban, G. Galffe és munkatársai [Natúré, 266, 550 (1977)] előirata szerint. A kapott hibridómasejtek részleteit 96 tartályos mikrotitrálólemezekre mértük be. A hibridóma-felülúszókat aggregációgátlásra szűrtük, és egy táló hibridómát (600 vizsgált tartályból) határhígitásos módszerrel klónoztuk és szubklónoztuk. Ezt a szubklónt RR1/1.1.1 jelzéssel láttuk el (a továbbiakban az „RR1/1” jelzést használjuk).Spleen cells isolated from the above-mentioned animals were fused with P3X73Ag8.653 myeloma cells (ATCC CRL 1580) at a ratio of 4: 1 according to G. Galffe et al., Natur. 266, 550 (1977). Details of the resulting hybridoma cells were plated on 96-well microtiter plates. The hybridoma supernatants were screened for inhibition of aggregation and a mesh hybridoma (out of 600 wells tested) was cloned and subcloned by the limiting dilution method. This subclone is designated RR1 / 1.1.1 (hereinafter referred to as "RR1 / 1").

Megállapítottuk, hogy az RR1/1 monoklonális antitest következetesen gátolja az LFA-l-et kifejező JYsejtvonal PMA-val stimulált aggregációját. Az RR1/1 monoklonális antitest által gátolt aggregáció azonos vagy valamivel kisebb, mint az LFA-1 a- vagy βalegységével szembeni egyes monoklonális antitestek gátlása. Ezzel szemben a kontroll HLA-ellenes monoklonális antitestek - a HLA-antitesteket bőségesen fejezik ki a JY-sejtek - nem gátolják az aggregációt. Azt az antigént, amelyet az RR1/1 monoklonális antitest megköt, intercelluláris adhéziós molekula-1-nek (ICÁM - 1-nek) neveztük el.We found that RR1 / 1 monoclonal antibody consistently inhibited PMA-stimulated aggregation of the JY cell line expressing LFA-1. The aggregation inhibited by the RR1 / 1 monoclonal antibody is equal to or slightly less than the inhibition of some monoclonal antibodies to the LFA-1 α- or β-subunit. In contrast, control anti-HLA monoclonal antibodies, which are abundantly expressed by JY cells, do not inhibit aggregation. The antigen bound by RR1 / 1 monoclonal antibody was called intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1).

9. példaExample 9

Anti-ICAM-1 monoklonális antitestek felhasználása az ICÁM-1-molekula jellemzéséreUse of anti-ICAM-1 monoclonal antibodies to characterize ICAM-1

Annak érdekében, hogy meghatározzuk az ICAM-1 természetét, és főként hogy meghatározzuk, vajon az ICAM-1 különbözik-e az LFA-1-től, sejtproteineket immunprecipitáltunk az RR1/1 monoklonális antitesttel. Az immunprecipitációt R. Rothlein és munkatársai szerint végeztük [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)]. A JY-sejteket 5 · 10⁷ sejt/ml mellett 1% Triton X-100-, 0,14 M NaCl-, 10 mM trisz- (pH=8,0), frissen hozzáadott 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid- és 0,2 egység/ml tripszininhibitor aprotonintartalmú oldatban (lizáló puffer) lizáltuk 20 percig 4 °C-on. A lizátumokat lecentrifugáltuk (10 000 g; 10 perc) és ciánbromiddal aktivált, glicinnel kezelt Sepharose CL-4B (Pharmacia) 50%-os szuszpenziójának 50 μΐ-ével előderítettük 1 órán át 4 °C-on. A lizátum 1 ml-ét a Sepharose CL-4B-hez kötött (1 mg/ml) RR1/1 monoklonális antitest 50%-os szuszpenziójának 20 μΐ-ével immunprecipitáltuk egy éjszakán át 4 °C-on [T. A. Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. A Sepharose-monoklonális antitest kötést úgy végeztük, hogy a Sepharose CL-4B-t bróm-ciánnal aktiváltuk karbonátpufferben S. March és munkatársai módszere szerint [Anal. Biochem., 60, 149 (1974)]. A mosott immunprecipitátumokat SDS-PAGE-módszerrel és ezüstfestéssel vizsgáltuk J. H. Morrissey eljárása szerint [Anal. Biochem., 117, 307(1981)].In order to determine the nature of ICAM-1, and in particular to determine whether ICAM-1 differs from LFA-1, cellular proteins were immunoprecipitated with the RR1 / 1 monoclonal antibody. Immunoprecipitation was performed according to R. Rothlein et al. Immunol., 137, 1270-1274 (1986)]. JY cells at 5 x 10 ⁷ cells / ml were supplemented with 1% Triton X-100, 0.14 M NaCl, 10 mM Tris pH 8.0, freshly added 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. and lysed in 0.2 units / ml trypsin inhibitor in aprotonin solution (lysis buffer) for 20 minutes at 4 ° C. The lysates were centrifuged (10,000 g; 10 min) and pre-digested with 50 μΐ of a 50% suspension of cyanogen bromide-activated glycine-treated Sepharose CL-4B (Pharmacia) for 1 hour at 4 ° C. One ml of lysate was immunoprecipitated with 20 μΐ of a 50% suspension of Sepharose CL-4B-bound (1 mg / ml) monoclonal antibody RR1 / 1 at 4 ° C overnight (TA Springer et al., J Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. Sepharose monoclonal antibody binding was performed by activating Sepharose CL-4B with bromocyanide in carbonate buffer according to the method of S. March et al., Anal. Biochem., 60, 149 (1974)]. Washed immunoprecipitates were assayed by SDS-PAGE and silver staining according to JH Morrissey [Anal. Biochem., 117, 307 (1981)].

A proteineket SDS-mintapufferrel [Μ. K. Ho és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 636 (1983)] oldottuk ki 100 °C-on, a mintákat kettéosztottuk és redukáló (5A. ábra) és nem redukáló (5B. ábra) körülmények között elektroforetizáltuk (SDS - 8% PAGE). Az 50 kD és 25 kD molekulatömegű sávok a Sepharose-monoklonális antitestből származó immunglobulinok nehéz és könnyű láncának felelnek meg (5A. ábra, 3. nyomsáv). Különböző mennyiségű más sávot is megfigyeltünk a 25-50 kD molekulatömeg-tartományban, ezeket azonban nem észleltük a hajas leukémiasejteken, amelyek csak egy 90 kD molekulattömegű sávot adtak. Az LFA-1 177 kD-os α-alegysége és 95 kD-os β-alegysége az ICÁM - 1-től eltérően vándorolt mind redukáló (5A. ábra, 2. nyomsáv), mind nem redukáló (5B. ábra, 2. nyomsáv) körülmények között.Proteins were washed with SDS sample buffer [[. K. Ho et al., J. Bioi. Chem. 258, 636 (1983)] at 100 ° C, and the samples were split and electrophoresed under reducing (Figure 5A) and non-reducing (Figure 5B) conditions (SDS - 8% PAGE). The 50 kD and 25 kD bands correspond to the heavy and light chains of immunoglobulins derived from the Sepharose monoclonal antibody (Figure 5A, lane 3). Different amounts of other bands were also observed in the 25-50 kD molecular weight range, but were not detected in hairy leukemia cells, which gave only a 90 kD molecular weight band. The 177 kD α-subunit and the 95 kD β-subunit of LFA-1 migrated differently from ICAM-1, both reducing (Figure 5A, lane 2) and non-reducing (Figure 5B, lane 2). ) conditions.

Az RR1/1 monoklonális antitest hatását a PHA-limfoblaszt aggregációjára a 2. példában leírt kvantitatív aggregációs vizsgálat alkalmazásával határoztuk meg. Ezért a T-sejt eredetű blasztsejteket stimuláltuk 4 napon át PHA-val, majd gondosan mostuk, és ezután 6 napon át IL-2-vel kondicionált táptalajban tenyésztettük. A 6 napos tenyésztés alatt a PHA intemalizálódott, és nem befolyásolta az aggregációs vizsgálatot. Különböző T-blasztsejtekkel végzett három különböző vizsgálatban az ICAM-1 monoklonális antitestek következetesen gátolták az aggregációt (II. táblázat).The effect of RR1 / 1 monoclonal antibody on PHA lymphoblast aggregation was determined using the quantitative aggregation assay described in Example 2. Therefore, T-cell derived blast cells were stimulated for 4 days with PHA, then carefully washed and then cultured in IL-2 conditioned medium for 6 days. During 6 days of culture, PHA became intimalized and did not affect the aggregation assay. In three different assays with different T-blast cells, ICAM-1 monoclonal antibodies consistently inhibited aggregation (Table II).

II. táblázatII. spreadsheet

PMA-val stimulált PHA-limfoblasztok aggregációjának gátlása RR1/1 monoklonális antitesttel³ Inhibition of PMA-Stimulated PHA Lymphoblast Aggregation by RR1 / 1 Monoclonal Antibody ³

Kísérlet Experiment PMA PMA MAt mab Aggre- gáció %-a Aggre- this volume %-the Gátlás^b %-a ^B % inhibition l^c l ^c - - Kontroll control 9 9 - - + + Kontroll control 51 51 0 0 + + HLA-A, B HLA-A, B 58 58 -14<* -14 <* + + LFA-1α LFA-1α 31 31 39 39 + + ICAM-1 ICAM-1 31 31 39 39 2^C 2 ^C - - Kontroll control 10 10 - - + + Kontroll control 78 78 0 0 + + LFA-1β LFA-1β 17 17 78 78 + + ICAM-1 ICAM-1 50 50 36 36 3^f 3 ^f - - - - 7 7 + + Kontroll control 70 70 + + HLA-A, B HLA-A, B 80 80 -14 -14 + + LFA-3 LFA-3 83 83 -19 -19 + + LFA-1α LFA-1α 2 2 97 97 + + LFA-1β LFA-1β 3 3 96 96 + + ICAM-1 ICAM-1 34 34 51 51

^a Az 50 ng/ml PMA-val stimulált, PHA-val indukált limfoblasztok aggregációját a 2. példában leírtak szerint indirekt módon határoztuk meg úgy, hogy a nem aggregálódott sejteket mikroszkóp segítségével számoltuk meg. ^of 50 ng / ml, stimulated with PMA, PHA-induced lymphoblasts was determined as described in Example 2. The aggregation indirectly by way of non-aggregated cells were counted using a microscope.

^b A gátlás százaléka a PMA-val és X63 monoklonális antitesttel kezelt sejtekhez viszonyítva. ^b Percent inhibition relative to cells treated with PMA and X63 monoclonal antibody.

^c Az aggregációt a monoklonális antitest cs PMA együttes hozzáadása után 1 óra múlva mértük. ^c Aggregation was measured 1 h after the addition of monoclonal antibody cs PMA.

^d A negatív szám az aggregáció százalékos erősödését jelzi. ^c Az aggregációt a monoklonális antitest és PMA együttes hozzáadása után 1 óra múlva mértük. A sejteket 200 g mellett 1 percig ülepítettük, ^d A negative number indicates a percentage increase in aggregation. ^c Aggregation was measured 1 hour after the addition of the monoclonal antibody and PMA. The cells were pelleted at 200 g for 1 minute,

HU 217 792 Β °C-on 15 percig inkubáltuk, óvatosan rcszuszpendáltuk, és 45 percig 100 fordulat/perc mellett ráztuk.Incubate at 15 ° C for 15 minutes, gently resuspend and shake for 45 minutes at 100 rpm.

^f A sejteket 4 órán át 37 °C-on PMA-val előkezeltük. Miután hozzáadtuk a monoklonális antitestet, a csöveket 37 °C-on inkubáltuk 20 percig nyugalmi helyzetben és 100 percig 75 fordulat/perc mellett. ^f Cells were pretreated with PMA for 4 hours at 37 ° C. After the addition of the monoclonal antibody, the tubes were incubated at 37 ° C for 20 minutes at rest and 100 minutes at 75 rpm.

Az LFA-1 monoklonális antitestek következetesen erősebben gátoltak, mint az ICAM-1 monoklonális antitestek, míg a HLA-1 és LFA-3 monoklonális antitestek hatástalanok voltak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált monoklonális antitestek közül csak azok kötődtek LFA-1-hez vagy ICÁM-1-hez, amelyek képesek voltak a sejtes adhéziót meggátolni.LFA-1 monoclonal antibodies were consistently more potent than ICAM-1 monoclonal antibodies, whereas HLA-1 and LFA-3 monoclonal antibodies were ineffective. These results showed that only those monoclonal antibodies tested were bound to LFA-1 or ICAM-1, which were capable of inhibiting cellular adhesion.

10. példaExample 10

ICAM-1 elleni monoklonális antitest előállítása ImmunizálásPreparation of a monoclonal antibody against ICAM-1 Immunization

Balb/c egereket intraperitoneálisan (ip.) oltunk 2 χ 0,5 ml-ben (RPMl-táptalajban) 2 -10⁷ JY-sejttel a fúzió előtt 103 és 24 nappal. A fúzió előtti 4. és 3. napon az egereket ip. oltjuk 0,5 ml RPMI-táptalajban 10⁷ PMA-val differenciált U937-sejttel.Balb / c mice were inoculated intraperitoneally (ip) in 2 x 0.5 ml (RPM1 medium) with 2 -10 ⁷ JY cells 103 and 24 days prior to fusion. On days 4 and 3 before fusion, mice were injected ip. inoculate 0.5 ml RPMI medium with 10 ⁷ PMA-differentiated U937 cells.

U937-sejtek differenciálásaDifferentiation of U937 cells

U937-sejteket (ATCC CRL-1593) differenciálunk úgy, hogy 5 · 10⁵/ml sejtet 10% fetális bovinszérummal, 1% glutaminnal és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI-táptalajban (teljes táptalaj), mely 2 ng/ml forbol12-mirisztát-acetátot (PMA) tartalmaz, inkubálunk steril polipropilén tartályban. Az inkubálás harmadik napján a táptalaj felét levesszük, és friss PMA-tartalmú teljes táptalajjal pótoljuk. A 4. napon a sejteket eltávolítjuk, mossuk és előkészítjük immunizáláshoz.U937 cells (ATCC CRL-1593) were differentiated so that 5 x 10 ⁵ cells / ml in RPMI medium (whole medium) supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% glutamine and 50 pg / ml gentamicin, containing 2 ng / ml forbol12- myristate acetate (PMA), incubated in sterile polypropylene container. On the third day of incubation, half of the medium was removed and replaced with fresh medium containing fresh PMA. On day 4, the cells are removed, washed and prepared for immunization.

Fúziómerger

Az immunizált egerekből származó lépsejteket P3X63Ag8.653 mielómasejtekkel -4:1 arányban - fuzionáljuk Galfre és munkatársai [Natúré, 266, 550 (1977)] szerint. A fúzió után a sejteket 96 tartályos, lapos fenekű mikrotitrálólemezekre visszük, tartályonként 10⁵ lépsejttel.Spleen cells from immunized mice were fused with P3X63Ag8.653 myeloma cells at a ratio of -4: 1 according to Galfre et al., Natura, 266, 550 (1977). Following fusion, cells are plated in 96-well flat-bottom microtiter plates at 10 ⁵ steps per well.

Anti-ICAM-1 -pozitív sejtek szelekciójaSelection of anti-ICAM-1 positive cells

Egy hét után 50 μΐ felülűszót szűrünk a 2. példa szerinti kvalitatív aggregációs vizsgálattal, JY- (ATCC CCL 87) és SK.W-3-sejteket (DSM ACC53) mint aggregálódó sejtvonalakat használva. Azokból a felülúszókból, amelyek a JY-sejtek aggregációját gátolják, de nem gátolják az SK.W-3 sejtekét, a sejteket szelektáljuk és kétszer klónozzuk határhígításos módszert alkalmazva.After one week, 50 μΐ of the supernatant was filtered by the qualitative aggregation assay of Example 2 using JY (ATCC CCL 87) and SK.W-3 cells (DSM ACC53) as aggregating cell lines. The supernatants which inhibit JY cell aggregation but do not inhibit SK.W-3 cells are selected and cloned twice by the limiting dilution method.

A kísérlet három külön olyan hibridómavonal azonosítását és klónozását eredményezte, amelyek antiICAM-1 monoklonális antitestet termeltek. A hibridóma-sejtvonalak által termelt antitestek IgG_2a, IgG_2b, illetve IgM típusúak voltak. Az IgG_2a anti-ICAM-1 antitestet termelő hibridóma-sejtvonal R6’5’D6’E9’B2 jelzést kapott. Az előnyös hibridóma-sejtvonal jele: R6’5’D6’E9’B2 (a továbbiakban: „R6-5-D6”).The experiment resulted in the identification and cloning of three separate hybridoma lines that produced antiICAM-1 monoclonal antibody. The antibodies produced by the hybridoma cell lines were IgG _2a , IgG _2b , and IgM, respectively. The hybridoma cell line producing IgG _2a anti-ICAM-1 antibody was designated R6'5'D6'E9'B2. The preferred hybridoma cell line is designated R6'5'D6'E9'B2 (hereinafter "R6-5-D6").

11. példaExample 11

Az ICÁM-1 expressziója és szabályozásaExpression and regulation of ICAM-1

Az ICAM-1 expressziójának mérésére egy radioimmunassay-t fejlesztettünk ki. A vizsgálatban tisztítottA radioimmunoassay was developed to measure the expression of ICAM-1. Purified in the test

RRl/l-et jóddal jelzünk egy jódvegyülettel úgy, hogy specifikus aktivitása 10 pCi/pg legyen. Endoteliális sejteket tenyésztünk 96 tartályos lemezeken, és ezeket a kísérleteknél leírt módon kezeljük. A lemezeket 4 °C-ra hűtjük oly módon, hogy fél-egy órára hideg szobába helyezzük a lemezeket és nem azonnal jégre. Az egysejt rétegeket háromszor mossuk hideg, teljes táptalajjal, majd 30 percig 4 °C-on inkubáljuk ¹²⁵J-RRl/l-gyel. A megkötött ^l25J-ot 0,1 mólos NaOH-val szabadítjuk fel és számlálunk. A ¹²⁵J-RR1/1 specifikus aktivitását jelzetlen RR1/1 használatával állítjuk be, hogy a vizsgálat során lineáris szignált kapjunk az antigénsűrűség értékére. A nem specifikus kötést a jelzetlen RR1/1 ezerszeres túlsúlyának jelenlétében határoztuk meg, ezt levontuk a teljes kötésből, és ez eredményezte a specifikus kötést.RR1 / l is labeled with iodine with an iodine compound so that its specific activity is 10 pCi / pg. Endothelial cells were cultured in 96 well plates and treated as described in the experiments. The plates were cooled to 4 ° C by placing the plates in a cold room for half an hour and not immediately on ice. The monolayers were washed three times with cold complete medium and incubated with ¹²⁵ J-RR1 / L for 30 minutes at 4 ° C. Bound ^{125 I} was liberated and counted with 0.1 M NaOH. The specific activity of ¹²⁵ J-RR1 / 1 is adjusted using unlabeled RR1 / 1 to obtain a linear signal for antigen density in the assay. Non-specific binding was determined in the presence of a thousand-fold excess of unlabeled RR1 / 1, subtracted from total binding and resulting in specific binding.

A fent leírt radioimmunassay-vel mért ICAM-1expresszió megnövekszik humán köldökvéna endoteliális sejteken (HUVEC; humán umbilical vein endothelial cells) és humán véna saphena endoteliális sejteken (HSVEC; humán saphenous vein endothelial cells) IL—1, TNF, BPS és IFN-gamma hatására (III. táblázat). Ebben a vizsgálatban véna saphena endoteliális sejteket használtunk, hogy megerősítsük azokat az eredményeket, amelyeket köldökvéna endoteliális sejtekből és felnőttek szövetéből származó, nagy, vénás endoteliális sejtek tenyészetéből kaptunk. Az ICAM-1 alapexpressziója kétszer nagyobb véna saphena endoteliális sejteken, mint köldökvéna endoteliális sejteken. Ha köldökvéna endoteliális sejteket rekombináns IL—1 a, IL-1 β és TNF-gamma hatásának tesszük ki, tíz-húszszorosára nő az ICÁM -1-expresszió. Az IL-1 a, TNF és LPS voltak a leghatásosabb indukálószerek, és az IL— 1 sem tömeg szerint, sem telítési koncentrációkban nem volt elég hatásos a válasz szempontjából (III. táblázat). Az IL-1 β 100 ng/ml koncentrációban 9-szeresére növelte az ICAM-1-expressziót HUVEC-en, és 7,3szorosra HSVEC-en és 15 ng/ml-nél a növekedés a maximum felét érte el. Az rTNF 50 ng/ml-nél 16-szorosra növelte az ICAM-1 expresszióját HUVEC-en és 11szeresre HSVEC-en és 0,5 ng/ml-nél a maximális hatás felével. Az interferon-gamma jelentősen növelte az ICAM-1-expressziót, azaz 10 000 egység/ml-nél 5,2szeres volt HUVEC-en és 3,5-szörös HSVEC-en. Az LPS hatása 10 pg/ml mellett hasonló nagyságú volt, mint az rTNF hatása. Ezen mediátorok páronkénti kombinációja vagy additív, vagy az additívnál valamivel kisebb hatást gyakorolt az ICAM-1 expressziójára (III. táblázat). Az rTNF kereszttitrálása rIL-1 β-val és rINF-gammával nem mutatott szinergizmust közöttük sem szuboptimális, sem optimális koncentrációkban.ICAM-1 expression by radioimmunoassay as described above is increased on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC; human umbilical vein endothelial cells) and human venous saphenous endothelial cells (HSVEC; human saphenous vein endothelial cells), IL-1, TNF, gamma. (Table III). In this study, venous saphenous endothelial cells were used to confirm the results obtained from the culture of umbilical vein endothelial cells and large venous endothelial cells from adult tissue. ICAM-1 expression is twice as high on venous saphenous endothelial cells than on umbilical vein endothelial cells. Exposure of umbilical vein endothelial cells to recombinant IL-1α, IL-1β, and TNF-gamma results in a ten-to twenty-fold increase in ICAM-1 expression. IL-1α, TNF, and LPS were the most potent inducers, and IL-1, at either weight or saturation concentrations, was not sufficiently effective in response (Table III). IL-1 β increased the expression of ICAM-1 9-fold in HUVEC at a concentration of 100 ng / ml and reached a maximum of 7.3-fold in HSVEC and 15 ng / ml in the maximum. RTNF increased ICAM-1 expression at 50 ng / ml by 16-fold in HUVEC and 11-fold in HSVEC and at 0.5 ng / ml with half the maximum effect. Interferon-gamma significantly increased ICAM-1 expression, that is, at 10,000 units / ml it was 5.2-fold on HUVEC and 3.5-fold on HSVEC. The effect of LPS at 10 pg / ml was similar to that of rTNF. The paired combination of these mediators had either additive or slightly less than additive effects on ICAM-1 expression (Table III). Cross-titration of rTNF with rIL-1 β and rINF-gamma showed no synergism at either suboptimal or optimal concentrations.

Minthogy az LPS növeli az ICAM-1 expresszióját az endoteliális sejteken olyan mennyiségekben is, mint amennyi néha a táptalajokban előfordul, megvizsgáltuk azt a lehetőséget, hogy vajon az alap ICÁM—1-expresszió az LPS-nek tulajdonítható-e. Több szérum sarzsvizsgálatánál azt tapasztaltuk, hogy az alacsony endotoxintartalmú szérum 25%-kal alacsonyabb ICAM-1 alapexpressziót eredményezett. Az itt ismertetett összes eredmény olyan endoteliális sejtekre vonatkozik, amelye17Because LPS increases the expression of ICAM-1 on endothelial cells at levels that sometimes occur in culture media, we investigated the possibility that basic ICAM-1 expression can be attributed to LPS. Multiple serum batch testing showed that low endotoxin serum resulted in a 25% lower basal expression of ICAM-1. All of the results reported herein relate to endothelial cells which: 17

HU 217 792 Β két alacsony endotoxintartalmú szérummal tenyésztettünk. Azonban 10 pg/ml LPS-neutralizáló polimixin B antibiotikum bevitele csak egy további 25%-kal csökkentette az ICAM-1-expressziót (III. táblázat). Az IL—1vagy TNF-kezelés hatására megnövekedett ICAM-1expressziót nem befolyásolta 10 pg/ml polimixin B jelenléte, ami egybevág ezen készítmény alacsony endotoxinszintjével (III. táblázat).HU 217 792 Β were cultured with two low endotoxin sera. However, administration of 10 pg / ml of LPS-neutralizing polymyxin B antibiotic only reduced ICAM-1 expression by an additional 25% (Table III). Increased ICAM-1 expression induced by IL-1 or TNF treatment was not affected by the presence of 10 pg / ml polymyxin B, which is consistent with the low endotoxin levels of this formulation (Table III).

III. táblázatIII. spreadsheet

Anti-ICAM-1 monoklonális antitestekAnti-ICAM-1 monoclonal antibodies

Kondicionálás (16 óra) Conditioning (16 hours) Specifikusan kötött ^12SI (cpm)Specially bound ^12S I (cpm) HUVEC HUVEC HSVEC HSVEC kontroll control 603+11 603 + 11 - - 1 132+31 1,132 + 31 100 ng/ml rIL-1 β 100 ng / ml rIL-1 β 5 680+633 5,680 + 633 9x 9x 8 320+766 8 320 + 766 7,3x 7,3x 50ng/ml rIL-Ι a 50ng / ml rIL-Ι a 9 910+538 9,910 + 538 16x 16x - - - - 50 ng/ml rTNF-a 50 ng / ml rTNF 9 650+1 500 9,650 + 1,500 16x 16x 12 690+657 12,690 + 657 11,2x 11,2x 10 pg/ml LPS 10 pg / ml LPS 9 530+512 9,530 + 512 16x 16x 10 459+388 10,459 + 388 9,2x 9,2x 10 ng/ml rlFN-gamma 10 ng / ml rlFN-gamma 3 120+308 3,120 + 308 5,2x 5,2x 4 002+664 4,002 + 664 3,5x 3.5x rIL-Ι a + rTNF rIL-Ι a + rTNF 1 469+1 410 1469 + 1410 24x 24x 16 269+660 16,269 + 660 14x 14x rIL-Ι β + LPS rIL-Ι β + LPS 13 986+761 13,986 + 761 23x 23x 10 870+805 10,870 + 805 lOx lOx rIL-Ι β + rlFN-gamma rIL-Ι β + rlFN-gamma 7 849+601 7,849 + 601 13x 13x 8 401+390 8 401 + 390 7,4x 7,4x rTNF + LPS rTNF + LPS 15 364+1 241 15,364 + 1,241 24x 24x 16 141 + 1 272 16,141 + 1,272 14x 14x rTNF + rlFN-gamma rTNF + rlFN-gamma 13 480+1 189 13,480 + 1,189 22x 22x 13 238+761 13,238 + 761 12x 12x LPS + IFN-gamma LPS + IFN-gamma 10 206+320 10,206 + 320 17x 17x 10 987+668 10,987 + 668 lOx lOx polimixin B (10 pg/ml) polymixin B (10 pg / ml) 480+23 480 + 23 - - - - - - polimixin B + rIL-1 polymyxin B + rIL-1 5 390+97 5,390 + 97 llx IIx - - - - polimixin B + rTNF polymyxin B + rTNF 9 785+389 9,785 + 389 20x 20x - - - - 1 pg/ml LPS 1 pg / ml LPS 7 598+432 7,598 + 432 13x 13x - - - - polimixin B + LPS polymyxin B + LPS 510+44 510 + 44 l,lx l lx

Az ICAM-1 expressziójának HUVEC-en és HSVEC-HUVEC-en vagy HSVEC-en való szabályozásához e sejteket 96 tartályos lemezekre oltottuk összefolyt egysejt rétegről 1:3 arányban, majd hagytuk növekedni összefolyásig. A sejteket ezután a felsorolt anyagokkal vagy közegekkel kezeltük 16 órán át, és a RIA-t a leírt módszerekkel végeztük el. Minden vizsgálatot négy párhuzamossal végeztünk.To control expression of ICAM-1 on HUVEC and HSVEC-HUVEC or HSVEC, these cells were inoculated into 96-well plates from a confluent monolayer at a ratio of 1: 3 and then allowed to grow to confluency. Cells were then treated with the substances or media listed for 16 hours and RIA was performed as described. Each study was performed in duplicate.

12. példaExample 12

Az interleukin-1 és a gamma-interferon indukációjának kinetikája ICÁM- 1-re vonatkozólagInduction kinetics of interleukin-1 and interferon-gamma with respect to ICAM-1

Az interleukin-1 és a gamma-interferon hatásának kinetikáját ICÁM-1-nek bőrfibroblasztokon való kifejeződésénél M. L. Dustin és munkatársai [J. Immunoi., 137, 245-254 (1986); mely közleményt referenciaként használjuk fel] szerint határoztuk meg, ¹²⁵I-dal jelzett kecske antiegér-IgG-kötési vizsgálat alkalmazásával. A kötési vizsgálat elvégzése érdekében humán bőrfibroblasztokat tenyésztettünk 96 tartályos mikrotitrálólemezeken 2-8· 10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. A sejteket kétszer mostuk az 1. példa szerint kiegészített RPMI 1640 tápoldattal. A sejteket még egyszer mostuk 10 mM HEPES, 0,05% NaN₃ és 10% hőinaktivált fetális bovinszérumot tartalmazó Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (Hanks’ Balanced Salt Solution=HBSS). A kötőpufferrel való mosást 4 °C-on végeztük. Minden tartályhoz hozzáadtunk 50 pl-t a fenti kötőpufferből és 50 pl-t a megfelelő X63 (ATCC TIBI7) és W6/32 (ATCC HB95) hibridóma-felülúszóból negatív, illetve pozitív kontrollként. Az inkubálást 30 percig 4 °C-on gyenge rázogatás mellett végeztük, a tartályokat kétszer mostuk a kötőpufferrel, majd hozzáadtuk 100 pl-ben a második antitestet, a ¹²⁵I kecske antiegér antitestet 50 nCi értékben. A ¹²⁵I kecske antiegér antitestet Iodogén (Pierce) felhasználásával készítettük P. J. Fraker és munkatársai módszere szerint [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 80, 849 (1978)]. Harminc perc (4 °C) múlva a tartályokat kétszer mostuk 200 pl kötőpufferrel, és a sejtréteget 100 pl 0,1 M NaOH hozzáadásával oldottuk fel. Ezt és egy 100 plnyi mosófolyadékot Beckman 5500 gamma-számlálóban vizsgáltuk. A specifikus kötés beütési számát a következőképpen számítottuk ki: (cpm a monoklonális antitesttel)-(cpm X63-mal). Minden lépést, a specifikus reagensekkel való indukciót beleértve, négy párhuzamos vizsgálatban végeztünk.Kinetics of the effects of interleukin-1 and interferon gamma on expression of ICAM-1 on cutaneous fibroblasts by ML Dustin et al., J. Med. Immunol., 137, 245-254 (1986); which is used as reference using ¹²⁵ I-labeled goat anti-mouse IgG binding assay. To perform the binding assay, human skin fibroblasts were cultured in 96-well microtiter plates to a density of 2-8 x 10 ⁴ cells / well (0.32 cm ² ). Cells were washed twice with RPMI 1640 supplemented with Example 1. The cells were washed once more with Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) containing 10 mM HEPES, 0.05% NaN ₃ and 10% heat-inactivated bovine serum. Washing with binding buffer was performed at 4 ° C. To each well was added 50 µl of the above binding buffer and 50 µl of the respective X63 (ATCC TIBI7) and W6 / 32 (ATCC HB95) hybridoma supernatant as negative and positive controls. The incubation was carried out for 30 minutes at 4 ° C with gentle shaking, the wells were washed twice with binding buffer and 100 µl of the second antibody, ¹²⁵ µl of goat anti-mouse antibody at 50 nCi. ¹²⁵ I goat anti-mouse antibody was prepared using Iodogen (Pierce) according to the method of PJ Fraker et al., Biochem. Biophys. Gap. Comm., 80, 849 (1978)]. After 30 minutes (4 ° C), the wells were washed twice with 200 µl of binding buffer and the cell layer was dissolved by adding 100 µl of 0.1 M NaOH. This and 100 pl of washings were assayed on a Beckman 5500 gamma counter. The specific binding score was calculated as (cpm with monoclonal antibody) - (cpm with X63). Each step, including induction with specific reagents, was performed in four replicates.

Az interleukin-1-nek az ICAM-1 indukciójára gyakorolt hatásának a féléletideje 2 óra, és ez gyorsabb, mint a gamma-interferoné, melynél 3,75 óra volt aThe half-life of interleukin-1 on induction of ICAM-1 is 2 hours and faster than that of interferon-gamma at 3.75 hours.

HU 217 792 Β féléletidő (6. ábra). Az ICAM-1 nyugalmi szintre való visszatérésének időtartama, úgy látszik, a sejtciklustól vagy a sejtnövekedés sebességétől függ. Nyugalmi állapotban lévő sejtekben az interleukin-1 és a gammainterferon hatása 2-3 napon át stabil, míg log-fázisban lévő tenyészetekhez az ICAM-1 expressziója 2 nappal az indukáló anyagok eltávolítása után közel van az alapszinthez.Half life (Figure 6). The length of time ICAM-1 returns to rest appears to depend on the cell cycle or the rate of cell growth. In resting cells, the effect of interleukin-1 and interferon-gamma is stable for 2 to 3 days, whereas in log phase cultures, ICAM-1 expression is close to baseline 2 days after removal of inducers.

Az ICAM-1 indukcióját illetően a rekombináns egér és humán interleukin -1 és a rekombináns gammainterferon dózis-válasz görbéi a 7. ábrán láthatók. A gamma-interferonnál és az interleukin-1-nél hasonlók a koncentrációfüggések és közel azonos hatásúak 1 pg/ml mellett. A humán és az egér rekombináns interleukin-1-görbéi szintén hasonlóak, de sokkal kisebb hatással vannak az ICAM-1 expressziójára, mint a humán interleukin-1-készítmények.The dose response curves for the induction of ICAM-1 are shown in Figure 7 for recombinant mouse and human interleukin -1 and for recombinant interferon gamma. Interferon gamma and interleukin-1 are similar in concentration dependence and are nearly equivalent at 1 pg / ml. Recombinant human and mouse interleukin-1 curves are also similar but have a much lesser effect on ICAM-1 expression than human interleukin-1 formulations.

A ciklohexamid, amely a proteinszintézis inhibitora, és az aktinomicin D, amely az mRNS-szintézis inhibitora, megszünteti mind az interleukin-1, mind a gamma-interferon hatását az ICAM-1 expressziójára fibroblasztokon (IV. táblázat). Ezenfelül a tunikáiméin, amely az N-glükozilációt gátolja, csak 43%-ban gátolja az interleukin-1 hatását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ICAM-1-expresszió interleukin-1gyel és gamma-interferonnal stimulált növekedéséhez protein- és mRNS-szintézisre van szükség, de N-glükozilációra nincs szükség.Cyclohexamide, which is an inhibitor of protein synthesis, and actinomycin D, which is an inhibitor of mRNA synthesis, abolishes both interleukin-1 and interferon-gamma on the expression of ICAM-1 on fibroblasts (Table IV). In addition, tunicimale, which inhibits N-glycosylation, inhibits interleukin-1 by only 43%. These results indicate that protein and mRNA synthesis is required for the stimulation of ICAM-1 expression with interleukin-1 and interferon-gamma, but no N-glycosylation is required.

IV. táblázatARC. spreadsheet

Cikloheximid, aktinomicid D és tunikamicin hatása az IL- 1-gyel és gamma-interferonnal indukált ICÁM -1-expresszióra humán bőrfibroblasztokon² Effect of cycloheximide, actinomicide D and tunicamycin on IL-1 and interferon-induced ICAM-1 expression in human dermal fibroblasts ²

Kezelés Treatment Specifikusan kötött ^,25I kecske anti-egér IgG (cpm)Specially bound ²⁵ I goat anti-mouse IgG (cpm) anti-ICAM-1 anti-ICAM-1 anti-HLAA,B,C anti-HLA A, B, C kontroll (4 óra) control (4 hours) 1 525 + 140 1,525 + 140 11 928+600 11,928 + 600 +cikloheximid + cycloheximide 1 513+210 1513 + 210 10 678+471 10,678 + 471 +actinomicin D + actinomycin D 1 590+46 1,590 + 46 12 276+608 12,276 + 608 +tunikamicin + tunicamycin 1461 + 176 1461 + 176 12 340+940 12,340 + 940 IL-1 (lOE/ml) (4 óra) IL-1 (10E / ml) (4 o'clock) 4 264±249 4,264 ± 249 12 155+510 12,155 + 510 +cikloheximid + cycloheximide 1 619+381 1619 + 381 12 676+446 12,676 + 446 +aktinomicin D + actinomycin D 1 613+88 1613 + 88 12 294+123 12,294 + 123 +tunikamicin + tunicamycin 3 048+113 3,048 + 113 13 434+661 13,434 + 661 IFN-gamma (10E/ml)(18óra) IFN-gamma (10 U / ml) (18óra) 4 569+109 4,569 + 109 23 675+500 23,675 + 500 +cikloheximid + cycloheximide 1 461+59 1 461 + 59 10 675+800 10,675 + 800 +aktinomicin D + actinomycin D 1 326+186 1326 + 186 12 089+550 12,089 + 550

“ Humán fibroblasztokat tenyésztünk 8 10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. A kezeléseket a felsorolt reagensekkel 50 μΐ-es végtérfogatban végeztük. A ciklohcximidből, aktinomicin D-ből és tunikamicinből 20 pg/ml, illetve 10 μΜ, illetve 2 μg/ml mennyiséget adagoltunk a citokinnel azonos időben. Minden adat négy párhuzamos vizsgálat eredménye ± SD."Human fibroblasts were cultured in 8 10 ⁴ cells / well (0.32 cm ²⁾ density. Treatments with the listed reagents were performed in a final volume of 50 μΐ. Cycloheximide, actinomycin D and tunicamycin were added at 20, 10 and 2 μg / ml at the same time as cytokine. Each data is the result of four replicates ± SD.

13. példaExample 13

Az ICÁM— 1 szöveti megoszlásaTissue distribution of ICAM-1

Humán szervek fagyasztott szöveteit hisztokémiai vizsgálatnak vetettük alá, hogy meghatározzuk az ICÁM -1 megoszlását a timuszban, nyirokcsomókban, bélben, bőrben, vesében és májban. A vizsgálatot úgy végeztük el, hogy normál humán szövetek fagyasztott metszeteit (4 pm vastag) acetonban fixáltuk 10 percig és RR1/1 monoklonális antitesttel, immunperoxidáz technikával festettük, az avidin-biotin komplex módszert használva (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) N. Cerf-Bensussan és munkatársai [J. Immunoi., 130, 2615 (1983)] leírása szerint. Az antitesttel való inkubálás után a metszeteket egymás után biotinilezett ló antiegér IgG-vel és avidin-biotinilezett peroxidáz komplexszel inkubáltuk. A metszeteket végül 3-amino9-etil-karbazol- (Aldrich Chemical Co., MilWaukee, WI, USA) tartalmú oldatba mártottuk a színreakció kifejlesztésére. A metszeteket ezután 4%-os formaldehidben 5 percig fixáltuk, majd hematoxilinnel átfestettük. A kontrollmetszeteket nem rokon monoklonális antitesttel inkubáltuk RR1/1 antitest helyett.Frozen tissues of human organs were subjected to histochemical analysis to determine the distribution of ICAM-1 in the thymus, lymph nodes, intestine, skin, kidney, and liver. The assay was performed by frozen sections of normal human tissues (4 pm thick) in acetone for 10 minutes and stained with RR1 / 1 monoclonal antibody by immunperoxidase technique using the avidin-biotin complex method (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Cerf-Bensussan et al., J. Med. Immunol., 130, 2615 (1983)]. After incubation with antibody, sections were incubated sequentially with biotinylated horse anti-mouse IgG and avidin-biotinylated peroxidase complex. The sections were finally immersed in a solution containing 3-amino9-ethylcarbazole (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) to develop the color reaction. The sections were then fixed in 4% formaldehyde for 5 minutes and then stained with hematoxylin. Control sections were incubated with unrelated monoclonal antibody instead of RR1 / 1 antibody.

Azt találtuk, hogy az ICAM-1 megoszlása igen hasonló a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) II. osztályú antigénjeinek a megoszlásához. Minden szövetben a legtöbb érpályában (kis és nagy érben) az endoteliális sejteknek ICAM-1-antitesttel való festődését ki lehetett mutatni. A vaszkuláris endoteliális festődés intenzívebb volt a nyirokcsomókban, mandulákban és Peyer-plakkokban lévő interfollikuláris (parakortikális) területeken, összehasonlítva a vesében, májban és normál bőrben lévő véredényekkel. A májban a festődés leginkább a szinuszoid béléssejtekre korlátozódott; a hepatociták és a legtöbb gyűjtő- és ütőér endoteliális béléssejtje nem festődött.We have found that the distribution of ICAM-1 is very similar to that of the major histocompatibility complex (MHC) II. class antigens. In all tissues, staining of endothelial cells with ICAM-1 antibody was detected in most vascular (small and large) vessels. Vascular endothelial staining was more intense in the interfollicular (paracortical) areas of the lymph nodes, tonsils, and Peyer's plaques as compared to blood vessels in the kidney, liver, and normal skin. In the liver, staining was mainly restricted to sinusoidal lining cells; endothelial lining cells of hepatocytes and most of the collecting and arteries were not stained.

A timusz velőállományában nagy sejtek diffúz festődése és egy dendritikus festődési kép volt megfigyelhető. A kéregállományban a festődési kép gócos volt és túlnyomóan dendritikus. A timociták nem festődtek. A perifériás nyirokszövetekben a másodlagos limfoid follikuluszok germinatív centrumú sejtjei intenzíven festődtek. Bizonyos limfoid follikulusokban a festődési kép főként dendritikus volt, a limfocitákra jellemző festődés nélkül. A külső zónában enyhén festődő sejteket figyeltünk meg. Ezenkívül a kiterjedt citoplazmával rendelkező dendritikus sejtek (interdigitating reticulum cells; interdigitáló retikulumsejtek) és egy kisszámú limfocita az interfollikuláris vagy parakortikális területeken festődött ICÁM- 1-hez kötődő antitestekkel.In the thymus, diffuse staining of large cells and a dendritic staining pattern were observed. In the cortex, the staining pattern was focal and predominantly dendritic. Thymocytes were not stained. In peripheral lymphoid tissues, cells of the secondary lymphoid follicle with germinative center were stained intensely. In some lymphoid follicles, the staining pattern was predominantly dendritic, without staining characteristic of lymphocytes. Slightly staining cells in the outer zone were observed. In addition, dendritic cells with extensive cytoplasm (interdigitating reticulum cells) and a small number of lymphocytes are stained with ICAM-1 binding antibodies stained in interollicular or paracortical areas.

A nyirokcsomókban és a vékonybél kötőszöveti rétegében (lamina propria) a makrofágokhoz hasonló sejtek megfestődtek. A fibroblasztszerű sejtek (orsó alakú sejtek) és a dendritikus sejtek, amelyek a legtöbb vizsgált sejt sztrómájában szétszórtan helyezkedtek el, megfestődtek ICÁM-1-hez kötődő antitesttel. Nem észleltünk festődést az epidermiszben a Langerhans/indetermináns sejtekben. Nem volt festődés a simaizom-szövetben.In the lymph nodes and in the connective tissue layer of the small intestine (lamina propria), cells similar to macrophages were stained. Fibroblast-like cells (spindle-shaped cells) and dendritic cells, which were scattered throughout the stroma of most cells examined, were stained with antibody binding to ICAM-1. No staining in the epidermis was observed in Langerhans / indeterminant cells. There was no staining in the smooth muscle tissue.

A mandulák nyálkahártyájában következetesen látható volt az epitéliális sejtek festődése. Jóllehet a hepa19Epithelial cell staining was consistently visible in the tonsil mucosa. Although hepa19

HU 217 792 Β tociták, az epevezeték epitéliuma, a bél epitéliális sejtjei és a vesetubulusok epitéliális sejtjei a legtöbb esetben nem festődtek, egy vesesejt-karcinóma esetében nefrektómiával kapott normál veseszövetmetszetekben számos proximális tubuláris sejt mutatott festődést ICÁM-1-re nézve. Ezek a tubuláris epitéliális sejtek anti-HLA-DR-kötő antitesttel is festődtek.In most cases, the TOCs, the bile duct epithelium, the intestinal epithelial cells, and the renal tubular epithelial cells were not stained, whereas in normal renal cell sections obtained by renal cell carcinoma, several proximal tubular cells showed staining for ICM. These tubular epithelial cells were also stained with anti-HLA-DR binding antibody.

Összefoglalva, az ICAM-1 kifejeződik olyan nem hematopoetikus sejteken, mint a vaszkuláris endoteliális sejtek és olyan hematopoetikus sejteken, mint a szöveti makrofágok és a mitogénnel stimulált T-Iimfocitablasztok. Azt találtuk, hogy kis mennyiségben ICAM-1 fejeződik ki perifériás vérlimfocitákon.In summary, ICAM-1 is expressed on non-hematopoietic cells, such as vascular endothelial cells, and on hematopoietic cells, such as tissue macrophages and mitogen-stimulated T-lymphocyte plaques. We have found that small amounts of ICAM-1 are expressed on peripheral blood lymphocytes.

14. példaExample 14

ICAM-1 tisztítása monoklonális antitest affinitáskromatográfiávalPurification of ICAM-1 by monoclonal antibody affinity chromatography

Általános tisztítási sémaGeneral cleaning scheme

Az ICÁM-1-et humán sejtekből vagy szövetekből tisztítottuk monoklonális antitest affinitáskromatográfiával. Először az ICAM-1-gyei reagáló PR1/1 monoklonális antitestet tisztítottuk, majd inért oszlopmátrixhoz kötöttük. Az antitestet R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)] és M. L. Dustin és munkatársai [J. Immunoi., 137, 245 (1986)] ismertették. Az ICÁM-1-et sejtmembránokból oldottuk ki úgy, hogy a sejteket nemionos detergenssel, Triton Χ-100-zal lizáltuk közel neutrális pH-η. A szolubilizált ICÁM-1-et tartalmazó sejtlizátumot ezután előtétoszlopokon vittük át, hogy eltávolítsuk azokat az anyagokat, amelyek nem specifikusan kötődnek az oszlopmátrix anyagához, majd a monoklonális antitest oszlopmátrixon visszük át, s hagyjuk, hogy az ICÁM-1-et megkösse az antitest. Az antitestoszlopot ezután egy sorozat növekvő pH-jú detergens mosópufferrel - pH=ll,0-ig - mossuk. A mosások alatt az ICÁM-1 kötve marad az antitestmátrixhoz, míg a nem kötött és gyengén kötött szennyezések leoldódnak. A megkötött ICÁM - 1-et ezután specifikusan oldjuk le az oszlopról, egy pH= 12,5 detergenspufferrel.ICAM-1 was purified from human cells or tissues by monoclonal antibody affinity chromatography. First, monoclonal antibody PR1 / 1 reactive with ICAM-1 was purified and then bound to an inert column matrix. The antibody is described by R. Rothlein et al., J. Med. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)] and M.L. Dustin et al., J. Med. Immunol., 137, 245 (1986)]. ICAM-1 was lysed from cell membranes by lysing the cells with a non-ionic detergent, Triton Χ-100, at a near neutral pH η. The cell lysate containing solubilized ICAM-1 was then passed through pre-columns to remove substances that did not specifically bind to the column matrix material, and then transferred to the monoclonal antibody column matrix and allowed to bind ICAM-1. The antibody column is then washed with a series of detergent wash buffer of increasing pH up to pH 1.0. During the washes, ICAM-1 remains bound to the antibody matrix, while unbound and weakly bound impurities are dissolved. Bound ICAM-1 is then specifically dissolved from the column with a pH 12.5 detergent buffer.

Az RR1/1 monoklonális antitest tisztítása és kovalens kötése Sepharose CL-4B-hezPurification and Covalent Binding of RR1 / 1 Monoclonal Antibody to Sepharose CL-4B

Az RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitestet hibridómahordozó egerek ascites folyadékából vagy hibridómatenyészet felülúszókból tisztítottuk standard technikákkal, ammónium-szulfátos kicsapással és protein A affinitáskromatográfiával [Ey és munkatársai, Immunochem., 15, 429 (1978)]. A tisztított IgG-t vagy patkány IgG-t (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) kovalens kötéssel kapcsoltuk Sepharose CL-4Bhez (Pharmacia, Uppsala, Svédország) March és munkatársai [Anal. Biochem., 60, 149 (1974)] módszerének egy módosított változatát alkalmazva. Röviden: A Sepharose CL-4B-t desztillált vízben mostuk, 40 mg/ml CNBr-dal - 5 M K₂HPO₄-ben (pH = körülbelül 12) - aktiváltuk, majd alaposan mostuk, 0,1 M HCldal 4 °C-on. A szűrt, aktíváit Sepharose-t azonos térfogatú tisztított antitesttel (2-10 mg/ml; 0,1 M NaHCO₃és 0,1 M NaCl-tartalmú oldatban) reszuszpendáltuk. A szuszpenziót 18 órán át 4 °C-on, óvatos le-fel forgatással inkubáltuk. A felülúszót ezután 280 nm-en mért abszorpciójával ellenőriztük, hogy tartalmaz-e kötetlen antitestet, majd az aktivált Sepharose-maradék relatív helyeit 0,05 mólos glicin hozzáadásával telítettük. A kötés hatékonysága rendszerint 90%-osnál nagyobb volt.RR1 / 1 anti-ICAM-1 monoclonal antibody was purified from ascites fluid of hybridoma-bearing mice or hybridoma culture supernatants by standard techniques, ammonium sulfate precipitation and protein A affinity chromatography [Ey et al., 15, 429 (1978)]. Purified IgG or rat IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) was covalently linked to Sepharose CL-4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden) by March et al., Anal. Biochem., 60, 149 (1974)]. Briefly, Sepharose CL-4B was washed with distilled water, activated with 40 mg / ml CNBr - 5 MK ₂ HPO ₄ (pH = 12) and then washed extensively with 0.1 M HCl at 4 ° C. you. The filtered, activated Sepharose was resuspended in an equal volume of purified antibody (2-10 mg / ml; in 0.1 M NaHCO ₃ and 0.1 M NaCl). The suspension was incubated for 18 hours at 4 ° C with gentle inversion. The supernatant was then checked for absorbance at 280 nm to check for unbound antibody, and the relative positions of the activated Sepharose residue were saturated with 0.05 M glycine. The bonding efficiency was usually greater than 90%.

Humán lépből készített membránok szolubilizálása detergensselSolubilization of human spleen membranes with detergent

Az egész eljárást 4 °C-on végeztük. Hajas sejtes leukémiás betegtől származó fagyasztott humán lépet (200 g; darabos) jégen megolvasztottunk 200 ml 1 mM fenil-metilszulfonil-fluoridot (PMSF), 0,2 egység/ml aprotonint és 5 mM jód-acetamidot tartalmazó trisz-konyhasó- (50 mM trisz, 0,14 M NaCl, pH = 7,4, 4 °C) oldatban. A szövetet kis darabkákra vágtuk és 4 °C-on Tekmar-porhomogenizátorban homogenizáltuk. A mennyiséget 300 ml-re töltöttük fel trisz-konyhasó oldattal és 100 ml 10% Tween 40-et (polioxietilén-szorbitán-monopalmitátot) tartalmazó triszkonyhasó oldatot adtunk hozzá, hogy a Tween 40 végső koncentrációja 2,5% legyen. Membránkészítés céljából a homogenizátumot egy Dounce- vagy előnyösebben egy Teflon Potter Elvejhem-homogenizátorban, három ütemben extraháltuk, ezután 1000 g mellett centrifugáltuk 15 percig. A felülúszót megőriztük, és az üledéket újra extraháltuk 200 ml 2,5%-os Tween 40-et tartalmazó trisz-konyhasó oldatban. Centriíúgálás után (1000 g; 15 perc) a két extrahálás felülúszóit egyesítettük és 150 000 g mellett 1 órán át centrifugáltuk, hogy a membránokat leülepítsük. A membránokat 200 ml trisz-konyhasó oldatban reszuszpendálva mostuk és 150 000 g mellett 1 órán át centrifugáltuk. A membránüledéket 200 ml trisz-konyhasó oldatban reszuszpendáltuk és egy motorizált homogenizátorral - teflon mozsártörővei - homogenizáltuk addig, amíg a szuszpenzió egyenletesen zavaros nem lett. A mennyiségét ekkor 900 ml-re egészítettük ki triszkonyhasó oldattal, 1% végkoncentrációig Na-laurilszarkozint adtunk hozzá, majd 4 °C-on 30 percig kevertük. A detergenslizátumban lévő oldhatatlan anyagokat centrifugálással (150 000 g; 1 óra) távolítottuk el. Ezután Triton Χ-100-at adtunk a felülúszóhoz 2% végkoncentrációig, és a lizátumot 4 °C-on 1 órán át kevertük.The whole procedure was carried out at 4 ° C. Frozen human spleen from a hairy cell leukemia patient (200 g; pieces) was thawed on ice with 200 ml of Tris-saline (50 mM) containing 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.2 U / ml aprotonin and 5 mM iodoacetamide. tris, 0.14 M NaCl, pH 7.4, 4 ° C). The tissue was cut into small pieces and homogenized at 4 ° C in a Tekmar powder homogenizer. The volume was made up to 300 ml with Tris-saline and 100 ml Tris-saline containing 10% Tween 40 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate) was added to bring the final concentration of Tween 40 to 2.5%. For membrane preparation, the homogenate was extracted in a Dounce or, more preferably, a Teflon Potter Elvejhem homogenizer, in three steps and then centrifuged at 1000 g for 15 minutes. The supernatant was preserved and the pellet was re-extracted with 200 ml of Tris-saline containing 2.5% Tween 40. After centrifugation (1000 g; 15 minutes), the supernatants from the two extractions were combined and centrifuged at 150,000 g for 1 hour to settle the membranes. The membranes were washed by resuspension in 200 ml of tris-saline and centrifuged at 150,000 g for 1 hour. The membrane pellet was resuspended in 200 ml of tris-saline and homogenized with a motorized homogenizer, Teflon pestle, until the suspension became uniformly cloudy. The volume was then made up to 900 ml with Tris-saline solution, Na-lauryl sarcosine was added to a final concentration of 1% and stirred at 4 ° C for 30 minutes. Insolubles in the detergent lysate were removed by centrifugation (150,000 g; 1 hour). Triton Χ-100 was then added to the supernatant to a final concentration of 2% and the lysate was stirred at 4 ° C for 1 hour.

A JY B-limfoblasztoid sejtek szolubilizálása detergensselSolubilization of JY B lymphoblastoid cells with detergent

A JY EBV-transzformált B-limfoblasztoid sejtvonalat 10% fetális borjúszérumot (FCS) és 10 mM HEPES-t tartalmazó RPMI 1640 táptalajban tenyésztettük. A tenyésztést közelítőleg 0,8-1,0-10⁶ sejt/ml sűrűségig folytattuk. Az ICAM-1 sejtfelszíni expressziójának a növelésére 25 ng/ml fórból-12-mirisztát-13acetátot (PMA) adtunk a tenyészethez a sejtek aratása előtt 8-12 órával. Ez alatt az idő alatt 50 μΜ nátriumvanadátot adtunk a tenyészethez. A sejteket 500 g mellett 10 percig tartó centrifugálással ülepítettük és kétszer mostuk Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) való felszuszpendálással és centrifugálással. A sejteket (körülbelül 5 g/5 liter tenyészet) 50 ml lizálópufferben (0,14 M NaCl, 50 mM trisz, pH = 8,0, 1%The JY EBV-transformed B-lymphoblastoid cell line was cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS) and 10 mM HEPES. The culture was continued to a density of approximately 0.8-1.0-10 ⁶ cells / ml. To increase the cell surface expression of ICAM-1, 25 ng / ml of phosphorus-12-myristate-13-acetate (PMA) was added to the culture 8-12 hours before harvesting the cells. During this time, 50 μΜ of sodium vanadate was added to the culture. Cells were pelleted by centrifugation at 500 g for 10 minutes and washed twice by resuspension in Hanks Balanced Saline (HBSS) and centrifugation. The cells (approximately 5 g / 5 L culture) were in 50 ml lysis buffer (0.14 M NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0, 1%).

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

Triton X-100, 0,2 E/ml aprotonin, 1 mM PMSF, 50 μΜ nátrium-vanadát) lizáltuk 4 °C-on, 30 percig keverés közben. A lizálatlan sejtmagokat és oldhatatlan törmelékeket 10 000 g mellett 1 órán át centrifugálva távolítottuk el, majd a felülúszót Whatman 3 mm szűrőpapíron szűrtük meg.Triton X-100, 0.2 U / ml aprotonin, 1 mM PMSF, 50 μΜ sodium vanadate) was lysed at 4 ° C for 30 min with stirring. Unlysed nuclei and insoluble debris were removed by centrifugation at 10,000 g for 1 hour and the supernatant was filtered through Whatman 3 mm filter paper.

Az ICAM-1 affinitáskromatográfiája szerkezetvizsgálatokhozAffinity chromatography of ICAM-1 for structural studies

A strukturális vizsgálatokhoz szánt ICÁM -1 nagybani tisztításához egy 10 ml-es RR 1/1-Sepharose CL-4B oszlopot (Pharmacia) (2,5 mg kötött antitest/ml gél) és két 10 ml-es CNBr-dal aktivált, glicinnel blokkolt Sepharose CL-4B előtétoszlopot és patkány IgG-vel konjugált Sepharose CL-4B (2 mg/ml) oszlopot használtunk. Az oszlopokat sorba kötöttük és előmostuk 10 oszloptérfogat lizálópufferrel, 10 oszloptérfogat 12,5 pH-jú pufferrel (50 mM trietil-amin, 0,1% Triton X-100, pH=12,5, 4 °C), majd 10 oszloptérfogat lizálópufferrel hoztuk egyensúlyba az oszlopokat. A humán lép detergenslizátumának 1 literét vittük fel az oszlopra 0,5-1,0 ml/perc átfolyási sebességgel. A két előtétoszlopot arra használtuk, hogy a nem specifikusan kötődő anyagokat eltávolítsuk a lizátumból, mielőtt az RR1/1-Sepharose oszlopra kerülne.For bulk purification of ICAM-1 for structural studies, a 10 mL RR 1/1-Sepharose CL-4B column (Pharmacia) (2.5 mg bound antibody / mL gel) and two 10 mL CNBr-activated glycine blocked Sepharose CL-4B precursor column and rat IgG-conjugated Sepharose CL-4B (2 mg / ml) column were used. The columns were serially rinsed and pre-washed with 10 column volumes of lysis buffer, 10 column volumes of pH 12.5 buffer (50 mM triethylamine, 0.1% Triton X-100, pH 12.5, 4 ° C) followed by 10 column volumes of lysis buffer. balancing the columns. One liter of human spleen detergent lysate was applied to the column at a flow rate of 0.5-1.0 ml / min. The two feeder columns were used to remove non-specific binding material from the lysate before being applied to the RR1 / 1-Sepharose column.

A felvitel után az RR1/1-Sepharose oszlopot és a megkötött ICAM-l-et 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett minimum 5 oszloptérfogattal mostuk egymás után a következő oldatokkal: 1. lizálópuffer; 2. 20 mM trisz (pH = 8,0)/0,14 M NaCl/0,1 Triton X-100;After loading, the RR1 / 1-Sepharose column and the bound ICAM-1 were washed successively with a minimum of 5 column volumes at a flow rate of 1 ml / min: 1. lysis buffer; 2. 20 mM Tris pH 8.0 / 0.14 M NaCl / 0.1 Triton X-100;

3. 20 mM glicin (pH = 10,0)/0,1% Triton X-100; és3. 20 mM glycine (pH 10.0) / 0.1% Triton X-100; and

4. 50 mM trietil-amin (pH= 11,0)/0,1 % Triton X-100. Mindegyik mosópuffer 1 mM PMSF-et és 0,2 E/ml aprotonint tartalmazott. Mosás után a kötve maradt ICAM-l-et 5 oszloptérfogat kioldópufferrel (50 mM trietil-amin/0,1% Triton X-100/pH= 12,5, 4 °C) eluáltuk 1 ml/3 perc átfolyási sebesség mellett. A leoldódó ICÁM-1-ből 1 ml-es frakciókat szedtünk, és azonnal semlegesítettük 0,1 ml 1 M trisz (pH = 6,7) hozzáadásával. Az ICAM-l-et tartalmazó frakciókat 10 μΐ alikvot mennyiségekből végzett SDS-PAGEmódszerrel [Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 60, 1901 (1984)] azonosítottuk, majd ezüstfestést végeztünk [J. H. Horrissey, Anal. Biochem., 117, 307 (1981)]. Ilyen körülmények mellett az ICAM-1 fő tömege körülbelül 1 oszloptérfogatban oldódott le, és tisztasága nagyobb volt 90%-osnál, amint azt az ezüsttel festett elektroferogrammból meg lehetett állapítani (egy kis mennyiségű IgG volt a főszennyeződés, ami az affinitásmátrixról származott). Az ICAM-1-tartalmú frakciókat egyesítettük, és körülbelül 20-szorosra bekoncentráltuk Centricon-30 mikrokoncentrátorokkal (Amicon, Danvers, MA, USA). A tisztított ICAM-l-pool etanollal kicsapott alikvot mennyiségéből Lowry módszerével meghatároztuk a proteintartalmat: körülbelül 500 pg tiszta ICAM-l-et állítottunk elő 200 g humán lépből.4. 50 mM triethylamine (pH 11.0) / 0.1% Triton X-100. Each wash buffer contained 1 mM PMSF and 0.2 U / ml aprotonin. After washing, the bound ICAM-1 was eluted with 5 column volumes of lysis buffer (50 mM triethylamine / 0.1% Triton X-100 / pH 12.5, 4 ° C) at a flow rate of 1 ml / 3 min. Fractions of 1 mL of soluble ICAM-1 were collected and immediately neutralized by the addition of 0.1 mL of 1 M tris (pH 6.7). Fractions containing ICAM-1 were aliquoted in 10 μΐ SDS-PAGE [Springer et al., J. Exper. Med., 60, 1901 (1984)] followed by silver staining [J. H. Horrissey, Anal. Biochem., 117, 307 (1981)]. Under these conditions, ICAM-1's main mass was dissolved in about 1 column volume and had a purity greater than 90% as determined from the silver-stained electropherogram (a small amount of IgG was the major impurity from the affinity matrix). ICAM-1 containing fractions were pooled and concentrated approximately 20-fold with Centricon-30 microconcentrators (Amicon, Danvers, MA, USA). An aliquot of ethanol precipitated from the purified ICAM-1 pool was determined by Lowry's method: About 500 pg of pure ICAM-1 was prepared from 200 g of human spleen.

A tisztított ICÁM-1 körülbelül 200 pg-ját egy második tisztítási lépésben preparatív SDS-poliakrilamidgélben elektroforetizáltuk. Az ICAM-l-et reprezentáló sávot úgy tettük láthatóvá, hogy a gélt 1 M KCl-ban áztattuk, majd az ICAM-l-et tartalmazó géldarabot kimetszettük és elektroeluáltuk Hunkapiller és munkatársai [Meth. Enzymol., 91, 227-236 (1983)] módszere szerint. A tisztított protein tisztasága nagyobb volt 98%nál, amint ezt SDS-PAGE-ezüstfestéssel megítéltük.About 200 pg of purified ICAM-1 was electrophoresed in a preparative SDS-polyacrylamide gel in a second purification step. The band representing ICAM-1 was visualized by soaking the gel in 1 M KCl, then the gel piece containing ICAM-1 was excised and electroeluted by Hunkapiller et al., Meth. Enzymol., 91, 227-236 (1983)]. The purity of the purified protein was greater than 98% as judged by SDS-PAGE silver staining.

Az ICAM-1 affinitástisztítása funkcionális vizsgálatokhozAffinity purification of ICAM-1 for functional assays

Funkcionális vizsgálatok céljára az ICÁM- 1-et JYsejtek detergenslizátumából tisztítottuk, mint fent leírtuk, de kisebb léptékben (1 ml-es RR1/1-Sepharose oszlop) és a következő módosításokkal. Minden oldat 50 μΜ nátrium-vanadátot tartalmazott. Miután az oszlopot 0,1% Triton Χ-100-tartalmú pufferrel (pH=ll,0) mostuk, újból mostuk az oszlopot 5 oszloptérfogat azonos pufferrel, amely 1% n-oktil-p-D-glükopiranozidot (oktil-glükozid) tartalmazott 0,1% Triton X-100 helyett. Az oktil-glükozid detergens kiszorította az ICÁM-1-hez kötött Triton Χ-100-at, és ellentétben a Triton X-100-zal, ezután dialízissel eltávolítható. Az ICAM-l-et ezután 0,1% oktil-glükozidot tartalmazó, pH = 12,5 pufferrel eluáltuk, majd mint fent leírtuk, analizáltuk és koncentráltuk.For functional assays, ICAM-1 was purified from JY cell detergent lysate as described above, but on a smaller scale (1 mL RR1 / 1-Sepharose column) and with the following modifications. Each solution contained 50 μΜ of sodium vanadate. After washing the column with 0.1% Triton Χ-100 buffer (pH = 1.0), the column was washed again with 5 column volumes of the same buffer containing 1% n-octyl-β-glucopyranoside (octyl glucoside). 1% instead of Triton X-100. The octyl glucoside detergent displaces Triton 100-100 bound to ICAM-1 and, unlike Triton X-100, can then be removed by dialysis. ICAM-1 was then eluted with 0.1% octyl glucoside in pH 12.5 buffer and analyzed and concentrated as described above.

75. példaExample 75

A tisztított ICÁM-1 jellemzőiCharacteristics of purified ICAM-1

A humán lépből tisztított ICAM-1 SDS-poliakrilamidgélben széles sávként vándorol, M_f = 72 000-91 000. A JY-sejtekből tisztított ICAM-1 szintén széles sáv gyanánt vándorol, M_r=76 500-97 000. Ezek az M_r-értékek a különböző sejtforrásokból immunprecipitált ICÁM-1-re ismert tartományban vannak: M_r=90 000 JY-sejteknél, 114 000 az U937 mielomonocita-sejtvonalnál és 97 000 fibroblasztoknál [Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245 (1986)]. Az M_r ezen széles tartományát a kiterjedt és változatos glükozilációs foknak tulajdonítjuk. A nem glükozilált prekurzomál M_r=55 000 (Dustin és munkatársai). A protein, akár JY-sejtekből, akár humán lépből tisztítjuk, megtartja antigén tulajdonságát, amit az bizonyít, hogy újból kötődni képes az eredeti affinitásoszlophoz. További bizonyítékot jelent az immunprecipitáció RR1/1-Sepharose-zal és az SDS-PAGE.Purified human splenic ICAM-1 migrates on SDS-polyacrylamide gels as a broad band _f M = 000. 72000-91 purified from JY cells are also ICAM-1 migrates as a broad band, M _r = 76,500 to 97 000. These M _r values for ICAM-1 immunoprecipitated from various cell sources are known: M _r = 90,000 for JY cells, 114,000 for the U937 myelomonocyte cell line, and 97,000 for fibroblasts (Dustin et al., J. Immunol. 137, 245 (1986)). )]. This broad range of M _{r is} attributed to the extensive and diverse degree of glycosylation. The non-glycosylated precursal M _r = 55,000 (Dustin et al.). The protein, whether purified from JY cells or human spleen, retains its antigenic properties, which is demonstrated by its ability to re-bind to the original affinity column. Further evidence is immunoprecipitation with RR1 / 1-Sepharose and SDS-PAGE.

Az ICAM-1 peptidfragmentumainak az előállításához körülbelül 200 pg proteint redukáltunk 2 mM ditiotreitol/2% SDS eleggyel, majd alkileztük 5 mM jód-ecetsavval. A proteint etanollal kicsaptuk, visszaoldottuk 0,1 M NH₄CO₃/0,l mM CaCl₂/0,l% Zwittergent 3-14 (Clabiochem) oldatban, ezután emésztés következett 1% (tömeg/tömeg) tripszinnel, 37 °C-on, 4 órán át, majd tovább emésztettük 1% tripszinnel, 12 órán át, 37 °C-on. A tripszines peptideket reverz fázisú HPLC-vel tisztítottuk, 0,4x15 cm-es C4 oszlop (Vydac) használatával. A peptideket 0-60% acetonitril (0,1%-os trifluor-ecetsavban) lineáris gradiensével eluáltuk. Szekvenciaanalízist végeztünk szelektált peptideken gázfázisú mikroszekvenátorral (Applied Biosystems). Ennek a vizsgálatnak a szekvenciaadatait az V. táblázatban foglaltuk össze.To prepare peptide fragments of ICAM-1, about 200 pg of protein were reduced with 2 mM dithiothreitol / 2% SDS and then alkylated with 5 mM iodoacetic acid. The protein was precipitated with ethanol and redissolved in 0.1 M NH ₄ CO ₃ / 0.1 mM CaCl ₂ / 0.1% Zwittergent 3-14 (Clabiochem), followed by digestion with 1% (w / w) trypsin, 37 ° C. for 4 hours and then further digested with 1% trypsin for 12 hours at 37 ° C. The trypsin peptides were purified by reverse phase HPLC using a 0.4 x 15 cm C4 column (Vydac). Peptides were eluted with a linear gradient of 0-60% acetonitrile (in 0.1% trifluoroacetic acid). Sequence analysis was performed on selected peptides using a gas-phase micros sequencer (Applied Biosystems). The sequence data for this assay are summarized in Table V.

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

V. táblázatTable V.

ICAM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciájaAmino acid sequence of ICAM-1 trypsin peptides

Amino- savcso- port amino savcso- powder 50a 50a 50b 50b 46a 46a 46b 46b X X 45 45 K K AA AA J J u u 0 0 Ml ml 1. First [T/V] [TV] A THE (V/A) (V / A) E E V V s s L L E E A THE L L V V L L 2. Second F F S S Q Q P P E E F F N N L L G G L L T T L/E JUICE 3. Third L L I I T T A THE L L P P P P D D S S G G L L P/(G) P / (G) 4. 4th T T s s F F A THE A THE T T L L V V I I P P 5. 5th V V L L P P P P P P V V R R L L E E G/Y G / Y 6. 6th Y Y G G L L L L N N T T P P V V T T N/L N / L 7. 7th P P W W P P P P V V Y Y Q Q T T P P (N) (N) 8. 8th T T P P I I I I T/I YOU G G G G C C P/V P / V (Q) (Q) 9. 9th s s F F G G (G) (G) L L - - L L s s K K (E) (E) 10. 10th E E E E (Q) (Q) - - D D E E T T (D) (D) 11. 11th A THE S S D/P D / P K K S S L L s s 12. 12th G/S G / S V V V V P P F F F F c c 13. 13th A THE T T D D Q Q S S E E D D 14. 14th G G V V W W V/L V / L A THE - - Q Q 15. 15th I I K K T T P P 16. 16th s s K K 17. 17th A THE 18. 18th P P 19. 19th X X 20. 20th Q Q 21. 21st L L

()=kevéssé megbízható szekvencia.() = unreliable sequence.

[ ]=nagyon kevéssé megbízható szekvencia.[] = very unreliable sequence.

/=kétértelműséget jelez a szekvenciában; a legvalószínűbb aminosavat az első betű jelenti, a=nagy peptid. b=kis peptid./ = indicates ambiguity in the sequence; the most likely amino acid is the first letter, a = large peptide. b = small peptide.

16. példaExample 16

Az ICÁM-1-gén klónozásaCloning of the ICAM-1 gene

Az ICÁM - 1-gén klónozására a különböző eljárások bármelyike felhasználható. Például az ICAM-1 tripszines fragmentumainak szekvenálása révén az aminosavszekvenciáról kapott információkat (V. táblázat) fel lehet használni egy olyan oligonukleotidszekvencia azonosítására, amely megfelelhet az ICAM-1-génnek. Vagy úgy is klónozhatjuk az ICAM-l-gént, hogy antiICAM-1-antitestet használunk az ICAM-1-termelő kiónok detektálására.Any of a variety of methods can be used to clone the ICAM-1 gene. For example, by sequencing trypsin fragments of ICAM-1, the information obtained from the amino acid sequence (Table V) can be used to identify an oligonucleotide sequence that may correspond to the ICAM-1 gene. Alternatively, the ICAM-1 gene may be cloned by using an antiICAM-1 antibody to detect ICAM-1-producing clones.

ICÁM- 1-gén klónozása oligonukleotidszondák segítségévelCloning of the ICAM-1 gene using oligonucleotide probes

A genetikai kódot használva [J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA (1977)] egy vagy több különböző olyan oligonukleotidot azonosíthatunk, amelyek az ICAM-1-peptideket kódolják. Annak valószínűségét, hogy egy bizonyos oligonukleotid a valóságban meg tudja alkotni az adott ICAM-1-kódoló szekvenciát, úgy lehet megítélni, ha figyelembe vesszük a szabálytalan bázispárosodási kapcsolatokat és azt, hogy az egyedi kodonok aktuális használatának milyen a gyakorisága egy bizonyos aminosav kódolásánál eukarióta sejtekben. Ilyen „kodonhasználati szabályok”-at ismertetnek R. Lathe és munkatársai [J. Molec. Bioi., 183, 1-12 (1985)]. A Lathe-féle „kodonhasználati szabályok” alkalmazásával egyetlen oligonukleotidot vagy oligonukleotidkészletet választunk, amely egy olyan „leginkább valószínű” nukleotidszekvenciát (azaz a legkevesebb felesleget tartalmazó nukleotidszekvenciát) tartalmaz, amely képes az ICÁM-1 tripszines peptidszekvenciákat kódolni.Using the genetic code [J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3rd edition; W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)] may identify one or more different oligonucleotides that encode ICAM-1 peptides. The likelihood that a particular oligonucleotide will actually form a given coding sequence for ICAM-1 can be judged by considering the irregular base pairing relationships and the frequency of actual codon usage in eukaryotic cells. . Such a "codon usage rule" is described by R. Lathe et al. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985). Using Lathe's "codon usage rules", a single oligonucleotide or set of oligonucleotides is selected that contains a "most likely" nucleotide sequence (i.e., the least excess nucleotide sequence) capable of encoding the tryptic peptide sequences of ICAM-1.

Az ICÁM-1-fragmentumokat kódoló, elméletileg „leginkább valószínű” szekvenciát tartalmazó oligonukleotid vagy oligonukleotidkészlet használatával egy olyan komplementer oligonukleotidnak vagy oligonukleotidkészletnek a szekvenciáját állapítjuk meg, amelyUsing an oligonucleotide or set of oligonucleotides that theoretically contains a "most likely" sequence encoding ICAM-1 fragments, the sequence of a complementary oligonucleotide or set of oligonucleotides is determined which

HU 217 792 Β a „legvalószínűbb” szekvenciával vagy szekvenciakészlettel képes hibridizálni. Egy ilyen komplementer szekvenciát tartalmazó oligonukleotid alkalmazható szondaként az ICAM-1-gén azonosítására és izolálására [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)].21 is capable of hybridizing with the “most likely” sequence or set of sequences. An oligonucleotide containing such a complementary sequence can be used as a probe to identify and isolate the ICAM-1 gene [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

Mint fentebb a C fejezetben leírtuk, ICAM-1 gént olyan eukarióta DNS-készítményekből klónozhatunk, amelyekről feltételezzük, hogy ezt a gént tartalmazzák. Az ICAM-1-proteint kódoló gén azonosítása és klónozása céljából egy DNS-gyűjteményt szűrünk arra vonatkozóan, hogy képes-e a fent leírt oligonukleotidszondákkal hibridizálni. Minthogy egy normál diploid sejtben az ICÁM -1-génnek valószínűleg csak két másolata van, és minthogy lehetséges, hogy az ICAM-1-génnek hosszú, nem átírt közbeeső szekvenciái (intronok) vannak, amelyeknek a klónozása nem kívánatos, előnyösebb az ICAM-1-kódoló szekvenciákat egy ICAM-1termelő sejt mRNS-éből készített cDNS-gyűjteményből izolálni, mint genomiális DNS-ből. Az alkalmas DNSvagy cDNS-készítményeket enzimatikusan hasítjuk vagy találomra feldaraboljuk és rekombináns vektorokba ligáljuk. Ezután e rekombináns vektoroknak a fent leírt oligonukleotidszondákkal való hibridizációs képességét méljük. A hibridizációs eljárásokat például T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)] című munkája vagy Β. T. Haymes és munkatársai, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach [IRL Press, Oxford (1985)] című munkája tartalmazza. A hibridizáló vektorokat ezután analizáljuk, hogy meghatározzuk a bennük lévő ICAM-1-szekvenciák nagyságát és természetét. Tisztán statisztikai megfontolásokra alapozva egy olyan gén, mint amely az ICÁM -1-molekulát kódolja, egyértelműen azonosítható (hibridizációs szűrés révén) egy csupán 18 nukleotidot tartalmazó oligonukleotidszonda alkalmazásával.As described above in Section C, the ICAM-1 gene can be cloned from eukaryotic DNA preparations that are presumed to contain this gene. To identify and clone the gene encoding ICAM-1, a DNA library is screened for its ability to hybridize with the oligonucleotide probes described above. Since a normal diploid cell has probably only two copies of the ICAM-1 gene, and since it is possible that the ICAM-1 gene has long, untranslated intervening sequences (introns) that are not desirable to be cloned, ICAM-1 is preferred. coding sequences were isolated from a cDNA library prepared from the mRNA of an ICAM-1 producing cell as genomic DNA. Suitable DNA or cDNA preparations are enzymatically cleaved or randomized and ligated into recombinant vectors. The ability of these recombinant vectors to hybridize with the oligonucleotide probes described above is then evaluated. Hybridization procedures are, for example, T. Maniatis, Molecular Cloning, Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982) or Β. T. Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach (IRL Press, Oxford (1985)). The hybridization vectors are then analyzed to determine the size and nature of the ICAM-1 sequences they contain. Based on purely statistical considerations, a gene such as that encoding the ICAM -1 molecule can be clearly identified (by hybridization screening) using an oligonucleotide probe of only 18 nucleotides.

Összefoglalva tehát, az ICÁM- 1-peptidszekvenciák aktuális azonosításával lehetővé válik egy ilyen peptidet kódoló, elméletileg „legvalószínűbb” DNS-szekvencia vagy -szekvenciakészlet azonosítása. Az elméleti szekvenciával komplementer oligonukleotid megszerkesztése révén (vagy a „legvalószínűbb” oligonukleotidokból álló készlettel komplementer oligonukleotidkészlet szerkesztése révén) egy olyan DNS-molekulát (vagy DNSmolekulakészletet) kapunk, amely mint szonda képes funkcionálni az ICAM-1-gén azonosításánál és izolálásánál.In summary, therefore, the current identification of ICAM-1 peptide sequences enables the identification of a theoretically "most likely" DNA sequence or set of sequences encoding such a peptide. By constructing an oligonucleotide complementary to the theoretical sequence (or by constructing a set of oligonucleotides complementary to a set of "most probable" oligonucleotides), a DNA molecule (or set of DNA molecules) is obtained that can function as a probe to identify and isolate the ICAM-1 gene.

Az V. táblázatbeli ICÁM-1-peptidszekvenciák felhasználásával meghatároztuk egy olyan oligonukleotid „legvalószínűbb” szekvenciáját, amely az AA és J peptidet kódolja (VI., illetve VII. táblázat). Oligonukleotidokat szintetizáltunk, amelyek ezekkel a szekvenciákkal komplementerek. A kapott szekvenciákat tisztítottuk az ICAM-1-génszekvenciák izolálásánál használandó szondák céljára. Alkalmas, nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjteményeket hoztunk létre PMA-val indukált HL-60 (ATCC CCL240) sejtekből és PS-sel (foszfáttal pufferolt NaCl-oldat) stimulált köldökvéna endoteliális sejtekből származó poli(A)⁺-RNS-ből. A PMA-val indukált HL-60 sejt eredetű poli(A)+-RNS használatával készített, nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjtemény előállítására U. Gubler és munkatársai [Gene, 25, 263-269 (1983)] és A. Corbi és munkatársai [EMBO J., 6, 4023-4028 (1987)] módszerét használtuk. Ezeket a közleményeket referenciaként alkalmazzuk.Using the ICAM-1 peptide sequences in Table V, the "most likely" sequence of an oligonucleotide encoding AA and J was determined (Tables VI and VII). Oligonucleotides were synthesized which were complementary to these sequences. The resulting sequences were purified for probes to be used for isolation of ICAM-1 gene sequences. Appropriate size-selected cDNA collections were generated from poly (A) ⁺ RNA from PMA-induced HL-60 (ATCC CCL240) cells and PS (phosphate buffered NaCl) stimulated umbilical vein endothelial cells. For the construction of a size-selected cDNA library using PMA-induced HL-60 cell-derived poly (A) + - RNA, U. Gubler et al., Gene, 25, 263-269 (1983) and A. Corbi et al. (EMBO J. 6: 4023-4028 (1987)). These publications are used as reference.

Egy nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjteményt készítettünk köldökvéna endoteliális sejtekből származó poli(A)⁺-RNS felhasználásával, amelyet 4 órán át 5 pg/ml PS-sel stimuláltunk. Az RNS extrakcióját úgy végeztük, hogy a sejteket 4 mólos guanidinium-izotiocianátban homogenizáltuk, majd a felülúszót CsCl-gradiensben ultracentrifugáltuk [J. M. Chirgwin és munkatársai, Biochem. J., 18, 5294-5299 (1979)]. A poli(A)⁺RNS-t az összes RNS-fajta keverékéből izoláltuk oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával (Type 3, Collaborative Research) [H. Aviv és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 1408-1412(1972)].A size-selected cDNA library was prepared using poly (A) ⁺ RNA from umbilical vein endothelial cells stimulated with 5 pg / ml PS for 4 hours. RNA extraction was performed by homogenizing cells in 4 M guanidinium isothiocyanate and ultracentrifuging the supernatant in a CsCl gradient (JM Chirgwin et al., Biochem. J., 18, 5294-5299 (1979)]. Poly (A) ⁺ RNA was isolated from a mixture of all RNA species by oligo (dT) cellulose chromatography (Type 3, Collaborative Research) [H. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 1408-1412 (1972)].

VI. táblázatVI. spreadsheet

Az ICAM-1 AA peptidet kódoló legvalószínűbb nukleotidszekvenciával komplementer oligonukleotidOligonucleotide complementary to the most likely nucleotide sequence encoding ICAM-1 AA peptide

Az ICAM-1 aminosavcsoportja Amino acid group of ICAM-1 ICAM-1 AA peptid ICAM-1 AA peptide Az AA peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia The most likely sequence encoding the AA peptide Komplementer szekvencia complementary sequence 5’ 5 ' 3’ 3 ' 162 162 Glu Glu G G C C A THE T T G G c c 163 163 Leu Leu C C G G T T A THE G G C C 164 164 Asp asp G G c c A THE T T C C G G 165 165 Leu Leu C C G G T T A THE G G C C 166 166 Arg Arg C C G G G G C C G G C C 167 167 Pro Pro c c G G c c G G c c G G 168 168 Gin Gin c c G G A THE T T G G C C 169 169 Gly Gly G G C C G G C C

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

VI. táblázat (folytatás)VI. Table (continued)

Az ICÁM-1 aminosavcsoportja Amino acid group of ICAM-1 ICAM-1 AA pcptid ICAM-1 AA pcptid Az AA peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia The most likely sequence encoding the AA peptide Komplementer szekvencia complementary sequence 5’ 5 ' 3’ 3 ' C C G G 170 170 Leu Leu C C G G T T A THE G G C C 171 171 Glu Glu G G C C A THE T T G G c c 172 172 Leu Leu C C G G T T A THE G G C C 173 173 Phe Phe T T A THE T T A THE T T A THE 174 174 Glu Glu G G C C A THE T T G G c c 3’ 3 ' 5’ 5 ' 175 175 Asn Asn A THE T T A THE T T C C G G 176 176 Thr Thr A THE T T C C G G C C G G 177 177 Ser Ser u u A THE c c G G A THE 3’ 3 ' 5’ 5 '

VII. táblázatVII. spreadsheet

Az ICÁM -1 J peptidkódoló legvalószínűbb nukleotidszekvenciával komplementer oligonukleotidOligonucleotide complementary to the most likely nucleotide sequence encoding the ICAM -1J peptide

Az ICAM-1 aminosav- csoportja ICAM-1 amino acid group ICAM-1 J peptid ICAM-1 J peptide A J peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia The most likely sequence encoding peptide J Komplementer szekvencia complementary sequence 3’ 3 ' 5’ 5 ' 19 19 Val With G G c c T T A THE G G C C 20 20 Thr Thr A THE T T

Az ICAM-1 aminosavcsoportja Amino acid group of ICAM-1 ICAM-1 J peptid ICAM-1 J peptide A J peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia The most likely sequence encoding peptide J Komplementer szekvencia complementary sequence 3’ 3 ' 5’ 5 ' C C G G c c G G 21 21 Cys Cys T T A THE G G C C C C G G 22 22 Ser Ser T T A THE c c G G c c G G 23 23 Thr Thr A THE T T c c G G c c G G 24 24 Ser Ser T T A THE c c G G c c G G 25 25 Cys Cys T T A THE G G C C T T A THE 26 26 Asp asp G G C C A THE T T C C G G 27 27 Gin Gin C C G G A THE T T G G C C 28 28 Pro Pro C C G G C C G G C C G G 29 29 Lys Lys A THE T T A THE T T 3’ 3 ' 5’ 5 '

A cDNS első szálának szintetizálásához 8 pg poli(A)⁺-RNS-t, avian jyeloblastosis vírus reverz transzkriptázt (Life Science) és egy oligo(dT) prímért használtunk. A DNS-RNS hibridet RNáz H-val (BRL) emésztettük, és a második szálat DNS-polimeráz I (New England Biolabs) segítségével szintetizáltuk. A terméket EcoRI metilázzal (New England Biolabs) metileztük, a tompa végeket EcoRI linkerekhez (New England Biolabs) ligáltuk, EcoRI-gyel emésztettük, és egy alacsony olvadásponté agarózban végeztük a nagyság szerinti szelekciót. Az 500 bp-nál nagyobb cDNS-eket előzőleg EcoRI-gyel emésztett és defoszforilált Ágt 10-be (Stratagene) ligáltuk. A ligálás termékét ezután pakoltuk (Stratagene gold).For the synthesis of the first strand of the cDNA, 8 pg of poly (A) ⁺ RNA, avian jyeloblastosis virus reverse transcriptase (Life Science) and an oligo (dT) primer were used. The DNA-RNA hybrid was digested with RNase H (BRL) and the second strand was synthesized using DNA polymerase I (New England Biolabs). The product was methylated with EcoRI methylase (New England Biolabs), the blunt ends ligated to EcoRI linkers (New England Biolabs), digested with EcoRI, and size-selected in a low melting point agarose. CDNAs greater than 500 bp were ligated with EcoRI-digested and dephosphorylated Aeg10 (Stratagene). The ligation product was then packaged (Stratagene gold).

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

A köldökvéna endoteliális sejteket és a HL-60 cDNS-gyűjteményt ezután lemezre vittük (20 000 pfu/150 mm-es lemez). A rekombináns DNS-t nitro-cellulóz szűrőkre vittük át - duplikátumban -, amelyeket 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl oldatban denaturáltunk, 1 M trisz (pH=7,5)/1,5 M NaCl oldatban neutralizáltunk és 80 °C-on hevítettünk 2 órán át [W. D. Benton és munkatársai, Science, 196, 180-182 (1977)]. A szűrőket előhibridizáltuk és 5x Denhardtoldatot, 50 mM Na₃PO₄-ot és 1 pg/ml lazacspermát tartalmazó 5x SSC-pufferben hibridizáltuk. Az előhibridizálás 45 °C-on 1 órán át tartott. A hibridizálást 32 bp (5’-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGT GAC) vagy a 47 bp (5’-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) antiszensz oligonukleotidokkal végeztük, amelyek a fent tárgyaltak szerint a J, illetve AA ICÁM-1 tripszines peptidekre (VI. és VII. táblázat) voltak alapozva [R. Lathe, J. Molec. Bioi., 183, 1-12 (1985)]. Az oligonukleotidokat gamma-³²-(P)ATP-vel végjeleztük T4 polinukleotid kinázt használva, a gyártó (New England Biolabs) által ajánlott körülmények mellett. Az egy éjszakán át tartó hibridizálást követően a szűrőket kétszer mostuk 2x SSC/0,1% SDS oldattal 30 percig, 45 °C-on. A hibridizációt mutató plakkokból izoláltuk a fágokat, melyeket ismételt lemezre öntéssel és újbóli szűréssel tisztítottunk.The umbilical vein endothelial cells and the HL-60 cDNA collection were then plated (20,000 pfu / 150 mm plate). The recombinant DNA was transferred to nitrocellulose filters, duplicated, denatured in 0.5 M NaOH / 1.5 M NaCl, neutralized in 1 M Tris pH 7.5 / 1.5 M NaCl, and Was heated at 2 ° C for 2 hours (WD Benton et al., Science, 196, 180-182 (1977)). The filters were pre-hybridized and hybridized in 5x SSC buffer containing 5x Denhard's solution, 50 mM Na ₃ PO ₄ and 1 pg / ml salmon sperm. The pre-hybridization was carried out at 45 ° C for 1 hour. Hybridization was performed with 32 bp (5'-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGT GAC) or 47 bp (5'-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) with antisense oligonucleotides 1A and 5A, respectively. [R. Lathe, J. Molec. Biol. 183: 1-12 (1985). Oligonucleotides were terminated with gamma ³² - (P) ATP using T4 polynucleotide kinase under the conditions recommended by the manufacturer (New England Biolabs). After overnight hybridization, the filters were washed twice with 2x SSC / 0.1% SDS for 30 minutes at 45 ° C. The phages were isolated from the plaques showing hybridization and purified by repeated plating and re-filtration.

Az ICÁM- 1-gén klónozása anti-ICAM-1-antitest alkalmazásávalCloning of the ICAM-1 gene using anti-ICAM-1 antibody

Az ICAM-l-gént - másképpen - anti-ICAM-1antitest alkalmazásával is klónozhatjuk. Egy sejtből, amely ICAM-1 kifejezésére képes, DNS-t vagy előnyösebben cDNS-t vonunk ki és tisztítjuk. A tisztított cDNS-t fragmentáljuk (hasítással, endonukleázzal való emésztéssel stb.), hogy DNS- vagy cDNS-poolt kapjunk. A poolból a DNS- vagy cDNS-ffagmentumokat ezután beklónozzuk egy expressziós vektorba, hogy így olyan expressziós vektorokból álló genomiális gyűjteményt kapjunk, amelynek minden tagja egyetlen klónozott DNS-t vagy cDNS-fragmentumot tartalmaz.Alternatively, the ICAM-1 gene may be cloned using an anti-ICAM-1 antibody. DNA or, more preferably, cDNA is extracted from a cell capable of expressing ICAM-1. The purified cDNA is fragmented (by cleavage, endonuclease digestion, etc.) to obtain a DNA or cDNA. The DNA or cDNA fragments from the pool are then cloned into an expression vector to obtain a genomic collection of expression vectors each member of which contains a single cloned DNA or cDNA fragment.

17. példaExample 17

A cDNS-klónok analíziseAnalysis of cDNA clones

A pozitív kiónokból származó fág DNS-t EcoRI-gyel emésztettük és Southern analízissel vizsgáltuk úgy, hogy az egyik klón cDNS-ét szondaként használtuk. Azokat a legnagyobb méretű cDSN-inszertumokat, amelyek kereszthibridizáltak, szubklónoztuk a pGEM 4Z (Promega) plazmidvektor EcoRI helyére. A HL-60 szubklónokat, amelyek mindkét orientációban tartalmazták a cDNS-t, exonukleáz III-mal való emésztéssel deletáltuk [S. Henikoff, Gene, 28, 351-359 (1984)] a gyártó ajánlásai szerint (Erase-a-Base, Promega). A progresszíven deletált cDNS-eket ezután klónoztuk és didezoxi-láncterminációs módszerrel [F. Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] szekvenáltuk az előállítók ajánlásai szerint (Sequenase, U.S. Biochemical). A HL-60 cDNS 5’- és kódoló szakaszainak mindkét szálát végigszekvenáltuk, és a 3’-szakasz mindkét szálát körülbelül 70%-ban szekvenáltuk. Egy reprezentatív endoteliális cDNS-t majdnem teljes hosszában szekvenáltunk a 4 bp-felismerő restrikciós enzimes fragmentumok shotgun klónozásával.Phage DNA from positive clones was digested with EcoRI and analyzed by Southern analysis using the cDNA of one clone as a probe. The largest cDSN inserts that cross-hybridized were subcloned into the EcoRI site of the plasmid vector pGEM 4Z (Promega). HL-60 subclones containing cDNA in both orientations were deleted by digestion with exonuclease III [S. Henikoff, Gene, 28, 351-359 (1984)] according to the manufacturer's recommendations (Erase-a-Base, Promega). The progressively deleted cDNAs were then cloned and dideoxy chain terminated [F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] according to the manufacturers' recommendations (Sequenase, U.S. Biochemical). Both strands of the 5 'and coding regions of the HL-60 cDNA were sequenced and both strands of the 3' region were sequenced at about 70%. A representative endothelial cDNA was sequenced almost by its full length by shotgun cloning of the 4 bp recognition restriction enzyme fragments.

Egy HL-60 és egy endoteliális sejt cDNS-ének megállapítottuk a cDNS-szekvenciáját (8. ábra). A 3023 bp szekvencia egy rövid 5’-, nem transzlatált szakaszt és egy 1,3 kb 3’-, nem transzlatált szakaszt tartalmaz és egy általánosan elfogadott poliadenilációs szignált a 2966. pozícióban. A leghosszabb nyitott leolvasási keret az első ATG-vel kezdődik az 58. pozícióban és egy TGA terminátor triplettel végződik az 1653. pozícióban. A transzlatált aminosavszekvencia és a 8 különböző tripszines peptidből meghatározott, összesen 91 aminosav (a VIII. táblázatban aláhúzva) között lévő azonosság megerősítette, hogy autentikus ICAM-1 cDNS-klónokat izoláltunk. Az ICAM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciáit a VIII. táblázat mutatja be.The cDNA sequence of an HL-60 and an endothelial cell was determined (Fig. 8). The 3023 bp sequence contains a short 5'-untranslated region and a 1.3 kb 3'-untranslated region and a generally accepted polyadenylation signal at position 2966. The longest open reading frame begins with the first ATG at position 58 and ends with a TGA terminator triplet at position 1653. The identity between the translated amino acid sequence and the total of 91 amino acids determined from the 8 different trypsin peptides (underlined in Table VIII) confirmed that authentic ICAM-1 cDNA clones were isolated. The amino acid sequences of ICAM-1 trypsin peptides are shown in Figure VIII. Table.

Vili. táblázatVili. spreadsheet

Az ICAM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciájaThe amino acid sequence of ICAM-1 trypsin peptides

Peptid peptide Csoportok Groups Szekvencia Sequence J J 14-29 14-29 XGSVLVTCSTSCDQPK XGSVLVTCSTSCDQPK u u 30-39 30-39 LLGIETPL(PK)(K) LLGIETPL (FF) (R) 50 50 78-85 78-85 (T)FLTVYXT (T) FLTVYXT X X 89-95 89-95 VELAPLP VELAPLP AA AA 161-182 161-182 XELDLRPQGLE— LFEXTSAPXQL XELDLRPQGLE- LFEXTSAPXQL K K 232-246 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK LNPTVTYGXDSFSAK 45 45 282-295 282-295 SFPAPNV(T/I)LXKPQ(V/L) SFPAPNV (T / I) LXKPQ (V / L)

— Azt jelenti, hogy a szekvencia a következő sorban folytatódik. Az aláhúzott szekvenciákat használtuk az oligonukleotidszondák előállításához.- It means that the sequence continues on the next line. The underlined sequences were used to generate the oligonucleotide probes.

A hidrofobicitás analízise [J. Kyte és munkatársai, J. Molec. Bioi., 157, 105-1332 (1982)] alapján egy 27 csoportból álló szignálszekvencia jelenlétére lehet következtetni. A +1 glutamin jelzése egybevág azzal, hogy képtelenek voltunk 3 különböző ICÁM -1-proteinkészítménynél N-terminális szekvenciát kapni; a glutamin piroglutaminsavvá ciklizálódhat, s ez blokkolt Nterminálist eredményezhet. A transzlatált szekvencia 1től 453-ig túlnyomóan hidrofil, ezt követi egy 24 csoportból álló hidrofób, feltehetően transzmembrán dómén. A transzmembrán domént közvetlenül követi számos, töltéssel ellátott csoport, amelyek egy 27 csoportból álló, feltehetően citoplazmatikus doménen belül helyezkednek el.Analysis of hydrophobicity [J. Kyte et al., J. Molec. Biol., 157, 105-1332 (1982)] suggests the presence of a 27 group signal sequence. +1 Glutamine labeling is consistent with the inability to obtain N-terminal sequences for 3 different ICAM-1 protein formulations; glutamine can be cyclized to pyroglutamic acid, resulting in a blocked Nterminal. The translated sequence is predominantly hydrophilic from 1 to 453, followed by a hydrophobic, probably transmembrane domain of 24 groups. The transmembrane domain is directly followed by a number of charged groups located within a putative cytoplasmic domain of 27 groups.

Az érett polipeptidlánc várható mérete 55 219 dalton, s ez kitűnően egyezik a megfigyelt mérettel, ami a deglükozilált ICAM-l-re nézve 55 000 [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. Nyolc N-glükozilációs hely várható. A tripszines szekvenciákban ezek közül két helyen hiányzik az aszparagin, ami bizonyítja ezek glükoziláltságát és extracel25The mature polypeptide chain is expected to have a size of 55,219 Daltons, which is in excellent agreement with the observed size, which is 55,000 for M. deglycosylated ICAM-1. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254. Eight N-glycosylation sites are expected. In these trypsin sequences, asparagine is absent at two of these sites, demonstrating their glycosylation and extracellularity.

HU 217 792 Β luláris orientációjúkat. Feltételezve 2500 daltont egy magas mannóztartalmú N-szénhidrátra számítva, 75 000 dalton várható az ICAM-1 prekurzorra, összehasonlítva a megfigyelt hat 73 000 daltonossal [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. A magas mannóztartalomnak komplex szénhidráttá való konverziója után az érett ICAM-1 glükoprotein 76-114 kD között van, a sejttípustól függően [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunok, 137, 245-254 (1986)]. Tehát az ICAM-1 egy erősen glükozilált, egyébként pedig egy tipikus membránintegrált protein.HU 217 792 Β lular orientation. Assuming 2,500 daltons per high-mannose N-carbohydrate, 75,000 daltons are expected for the ICAM-1 precursor, compared to the observed six 73,000 daltons [M. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254. After conversion of high mannose to complex carbohydrate, mature ICAM-1 glycoprotein is between 76-114 kD, depending on cell type [M. L. Dustin et al., J. Immunok. 137: 245-254 (1986). Thus, ICAM-1 is a highly glycosylated protein, otherwise it is a typical membrane integrated protein.

18. példaExample 18

Az ICAM-1 az immunglobulin szupergéncsalád egy integrinkötő tagjaICAM-1 is an integrin binding member of the immunoglobulin supergene family

Elvégeztük az ICAM-1 belső ismétlődő szekvenciáinak az összehasonlító vizsgálatát a Microgenie protein-összehasonlító program [C. Queen és munkatársai, Nucl. Acid. Rés., 12, 581-599 (1984)] alkalmazásával, majd ennek kiértékelése következett. Az ICÁM- 1-et a következő proteinekhez hasonlítottuk: IgM, N-CAM és MAG (N-CAM = idegsejtadhéziós molekula; MAG=mielinasszociált glükoprotein). A vizsgálat kiviteléhez a Microgenie- és ALIGN-programot használtuk [Μ. O. Dayhoff és munkatársai, Meth. Enzymol., 91, 524-545 (1983)]. Négy proteinszekvencia adatbázist - ezeket a National Biomedical Research Foundation (NBRF) tartja fenn - vizsgáltunk át hasonló proteinszekvenciák után kutatva a Williams és Pearson-féle FASTP-program segítségével [D. J. Lipman és munkatársai, Science, 227, 1435-1439 (1985)].A comparative assay of ICAM-1 internal repeats was performed using the Microgenie Protein Comparison Program [C. Queen et al., Nucl. Acid. Sl., 12, 581-599 (1984)] and subsequently evaluated. ICAM-1 was compared to the following proteins: IgM, N-CAM and MAG (N-CAM = nerve cell adhesion molecule; MAG = myelin-associated glycoprotein). Microgenie and ALIGN were used to perform the study [Μ. O. Dayhoff et al., Meth. Enzymol. 91: 524-545 (1983). Four protein sequence databases, maintained by the National Biomedical Research Foundation (NBRF), were reviewed for similar protein sequences using the Williams and Pearson FASTP program [D. J. Lipman et al., Science 227: 1435-1439 (1985).

Minthogy az ICAM-1 egy integrin liganduma, nem vártuk, hogy az immunglobulin szupergéncsalád egy tagja lenne. Azonban az ICÁM -1-szekvencia kiértékelése azt mutatta, hogy az kielégít minden olyan kritériumot, amelyeket az immunglobulin szupergéncsalád-tagsága megkövetel. Ezeket a kritériumokat az alábbiakban tárgyaljuk meg.Because ICAM-1 is an integrin ligand, we were not expected to be a member of the immunoglobulin supergene family. However, evaluation of the ICAM -1 sequence has shown that it meets all the criteria required for immunoglobulin super-family membership. These criteria are discussed below.

Az ICÁM-1 teljes extracelluláris doménje 5 homológ immunglobulinszerű doménből van felépítve, amelyeket a 9A. ábra aláhúzva mutat be. Az 1-4 domének 88, 97, 99, illetve 99 csoport hosszúságúak, és ezek típusosán Ig-doménméretek; az 5. dómén 68 csoportra csonkul. Az NBRF-adatbázis átvizsgálása során - a FASTP-programot használva - szignifikáns homológiákat találtunk az immunglobulin szupergéncsalád tagjaival, így a következőkkel: IgM, IgG C dómén, T-sejtreceptor α-alegységvariábilis dómén és α-Ι-β-glükoprotein [9B.-D. ábra].The entire extracellular domain of ICAM-1 is composed of 5 homologous immunoglobulin-like domains, which are shown in Figure 9A. Figure 4A is underlined. Domains 1-4 are 88, 97, 99, and 99 groups in length, and are typically Ig domain sizes; domain 5 truncates to 68 groups. Examination of the NBRF database using the FASTP program revealed significant homologies to members of the immunoglobulin supergene family, such as IgM, IgG C domain, T cell receptor α-subunit variable domain and α-Ι-β-glycoprotein [9B. D. figure].

Felhasználva a fenti információt, összehasonlítottuk az ICÁM-1 aminosavszekvenciáját az immunglobulin szupergéncsalád más tagjainak az aminosav-szekvenciájával.Using the above information, the amino acid sequence of ICAM-1 was compared with the amino acid sequence of other members of the immunoglobulin supergene family.

Három típusú lg szupercsaláddomént különböztetünk meg, úgymint V, Cl és C2. Mind a V, mind a C domének 2 β-lemezből vannak felépítve, amelyek intradomén diszulfidhidakkal kapcsolódnak egymáshoz; a V domének 9, míg a C domének 7 antiparalel β-szálat tartalmaznak. A konstans domének két készletre, a Cl ésThere are three types of Ig superfamily domain, such as V, Cl, and C2. Both V and C domains are composed of 2 β-sheets linked by intradomain disulfide bridges; the V domains contain 9 and the C domains contain 7 antiparallel β-strands. The constant domains are two sets, Cl and

C2 készletre vannak felosztva a 9A. ábrán bemutatott jellemző csoportok alapján. A Cl készlethez olyan proteinek tartoznak, amelyek részt vesznek az antigén felismerésében. A C2 készlethez számos Fc receptor és protein tartozik - ezek vesznek részt az adhézióban (cell adhesion) -, valamint a CD2, LFA-3, MAG és N-CAM. Azt találtuk, hogy az ICAM-1-domének a C2 készlet doménjeivel mutatják a legerősebb homológiát, s így az ICAM-1 ehhez a készlethez tartozik, amit az a tény is tükröz, hogy a C2-ben lévő állandó csoportokhoz nagyobb a hasonlósága, mint a Cl-ben lévőkhöz, mint ahogy ez a 9. ábrán a B-F β-szálak esetében látható. Továbbá az ICAM-1-domének sokkal jobban igazodnak a C2 domének A és G β-szálaihoz, mint a V és Cl domének ezen szálaihoz, s így sokkal inkább sorolható a teljes C2 dómén állománya mellé. A N-CAM, MAG és a- Ι-β-glükoprotein C2 doménjével való összehasonlítást a 9B. és 9C. ábra mutatja; az azonosság 28-33%-os. Egy T-sejtreceptorral való összehasonlítása Va 27%-os identitását és az IgM C dómén-3 34%-os identitást mutat [9B. és 9D. ábra].They are subdivided into a set C2 of FIG. Figure 5a. The Cl kit contains proteins that are involved in antigen recognition. The C2 set contains several Fc receptors and proteins involved in cell adhesion, as well as CD2, LFA-3, MAG and N-CAM. We have found that ICAM-1 domains exhibit the strongest homology with the domains of the C2 set, and thus ICAM-1 belongs to this set, which is also reflected by the fact that it has greater similarity to the constant groups in C2 than for those in Cl, as shown in Figure 9 for BF β-fibers. Furthermore, ICAM-1 domains are much more responsive to the A and G β strands of the C2 domains than to these strands of the V and Cl domains, and are thus much more closely related to the entire C2 domain. Comparison with the C2 domain of N-CAM, MAG, and α-β-β-glycoprotein is shown in Figure 9B. and 9C. FIG. the identity is 28-33%. A comparison with a T cell receptor shows 27% identity of Va and 34% identity of IgM C domain-3 [Fig. 9B. and 9D. figure].

Az immunglobulindomének legfontosabb jellemzői közé tartoznak a diszulfidkötésű tiszteinek, amelyek hidat képeznek a B és F szálak között, s ezek stabilizálják a β-lemezszendvicset; az ICÁM - 1-ben a tiszteinek minden esetben állandók, kivéve a domén-4 f szálában, ahol egy leucin található, amely befordulhat a szendvicsbe, és stabilizálhatja a kontaktust, mint ahogy ez néhány dómén V és C2 készleténél tapasztalható. A tiszteinek közti távolság (43, 50, 52 és 37 csoport) olyan, mint ami a C2 készletre jellemző.The most important features of the immunoglobulin domain include disulfide bonded bridges, which form a bridge between fibers B and F and stabilize the β-sheet sandwich; in ICAM - 1, officers are always constant except for domain 4f, where a leucine is present, which can turn into a sandwich and stabilize contact, as is the case with some domains V and C2. The distance between officers (Groups 43, 50, 52 and 37) is similar to that of Set C2.

Az ICÁM- 1-ben a láncok közti diszulfidkötések jelenlétének tesztelése érdekében ICAM-1 endoteliális sejteken SDS-PAGE-vizsgálatot végeztünk redukáló és nem redukáló körülmények mellett. Azért használtunk endoteliális sejt eredetű ICÁM-1-et, mivel ez kisebb glükozilációs heterogenitást mutat, mint a JYvagy a lép hajas sejt eredetű ICAM-1, és így nagyobb érzékenységgel kaphatjuk meg az M_r-ben való eltolódásokat. Ebből a célból 16 órán át LPS-sel (5 pg/ml) stimulált köldökvéna endoteliális sejttenyészetből tisztítottunk ICÁM-1-et immunaffinitás-kromatográfiával, mint fent leírtuk. Az acetonnal kicsapott ICÁM-1-et 0,25% 2 merkapto-etanolt vagy 25 mM jód-acetamidot tartalmazó mintapufferben [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)] reszuszpendáltuk és 5 percig 100 °C-on tartottuk. A mintáknál SDS-PAGE-t és ezüstfestést alkalmaztunk. Az endoteliális sejt ICÁM -1-molekulatömege (M_r) 100 kD redukáló körülmények között és 96 kD nem redukáló körülmények között, ami igen meggyőzően bizonyítja a láncközi diszulfidkötések jelenlétét a natív ICÁM- 1-ben.To test for the presence of inter-chain disulfide bonds in ICAM-1, SDS-PAGE was performed on ICAM-1 endothelial cells under reducing and non-reducing conditions. Endothelial cell-derived ICAM-1 was used because it exhibits less glycosylation heterogeneity than JY or spleen hair cell-derived ICAM-1, and thus obtains greater sensitivity to M _r offsets. For this purpose, ICAM-1 was purified from an umbilical vein endothelial cell culture stimulated with LPS (5 pg / ml) for 16 hours by immunoaffinity chromatography as described above. ICAM-1 precipitated with acetone was resuspended in sample buffer containing 0.25% 2 mercaptoethanol or 25 mM iodoacetamide (UK Laemmli, Natura, 227, 680-685 (1970)) and kept at 100 ° C for 5 minutes. Samples were subjected to SDS-PAGE and silver staining. The ICAM-1 molecular weight (M _r ) of the endothelial cell is 100 kD under reducing conditions and 96 kD under non-reducing conditions, which is very convincing evidence of the presence of inter-chain disulfide bonds in native ICAM-1.

A primer szekvencia használata a másodlagos szerkezet előrejelzésére [P. Y. Chou és munkatársai, Biochem., J. 13, 211-245 (1974)] 7 várható β-szálat - a-g-vel jelölve a 9A. ábrán, felül - jelzett minden ICÁM-1-doménben, ami pontosan beváltja egy immunglobulindoménnel szembeni várakozást, és megfelel az immunglobulinokban lévő A-H szálak helyzetének (9A. ábra, alul). A dómén 5-ben nincs A és CUse of the Primary Sequence to Predict Secondary Structure [P. Y. Chou et al., Biochem., J. 13, 211-245 (1974)] 7 expected β-fibers - designated a-g in Figure 9A. 9A, over-labeled in each ICAM-1 domain, which exactly reverses the wait for an immunoglobulin domain and corresponds to the position of the A-H strands in the immunoglobulins (Fig. 9A, bottom). Domain 5 has no A and C

HU 217 792 Β szál, de minthogy ezek képezik a lemezek peremét, a lemezek még mindig kialakulhatnak - talán a D szállal, amely elfoglalja a C szál helyét -, mint ahogy ez bizonyos más C2 doméneknél előfordul; és a jellemző diszulfidkötés a B és F szál között bántatlan marad. Tehát az a körülmény, hogy az ICAM-1-dómén méretre, szekvenciahomológiára, az állandó ciszteincsoportokra - amelyek a feltételezett intradomén diszulfidkötéseket alkotják -, diszulfidkötések jelenlétére és az előrelátható β-lemezszerkezetre vonatkozó kritériumoknak megfelel, alátámasztja, hogy az ICAM-1 az immunglobulin szupergéncsaládhoz tartozik.However, since these are the edges of the disks, the disks can still form - perhaps with the fiber D occupying the position of the C fiber - as is the case with certain other C2 domains; and the characteristic disulfide bond between fibers B and F remains intact. Thus, the fact that the ICAM-1 domain meets the criteria for size, sequence homology, constant cysteine residues constituting putative intradomain disulfide bonds, and the presence of disulfide bonds and predicted β-sheet structure is supported by 1 belongs to.

Megállapítottuk, hogy az ICAM-1 a C2 készlet N-CAM és MAG glükoproteinjeivel mutatja a legerősebb homológiát. Ez különlegesen azért lényeges, mivel mind a N-CAM, mind a MAG sejt-sejt adhéziót közvetít. A N-CAM-nak a neuron-neuron és neuromuszkuláris kölcsönhatásoknál van fontossága [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)], míg a MAG-nak a neuron-oligodendrocita és oligodendrocita-oligodendrocita kölcsönhatásokban van fontossága a mielinhüvely kialakulása folyamán [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell Biok, 105, 1893-1899 (1987)]. A N-CAM és MAG kifejeződése a sejt felületén a fejlődéssel kapcsolatos szabályozás alatt áll az idegrendszer kialakulása, illetve a mielinhüvely kialakulása folyamán ugyanúgy, mint az ICÁM-1 szabályozott indukciója gyulladás esetén [T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunok, 5, 223-252 (1987)]. Az ICAM-1, a N-CAM [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)] és MAG [J. L. Salzer és munkatársai, J. Cell. Biok, 104, 957-965 (1987)] teljes szerkezetükben hasonlóak és homológok, minthogy mindegyik membránhoz tartozó glükoprotein, amelyek 5 olyan C2 doménből vannak felépítve, amelyek az N-terminális extracelluláris szakaszt alkotják, bár a NCAM további nem Ig-szerű szekvenciát is tartalmaz az utolsó C2 dómén és a transzmembrán dómén között. Az ICAM-1 teljes hosszában - a transzmembrán és citoplazmatikus doménekkel együtt - a MAG mellé illeszthető 21%-os identitással; ugyanezt a százalékos identitást találjuk, ha az ICÁM-1 és NCAM-1 5 doménjét összehasonlítjuk. Az ICÁM-1 és MAG szekunder szerkezetének diagramos összehasonlítását a 10. ábra mutatja be. A domén-domén összehasonlítások szerint az ICAM-1- és NCAM-molekulákon belüli domének közti homológia szintje (x±s.d., 21 ±2,8%, illetve 18,6±3,8%) ugyanolyan, mint az ICAM-l-doméneknek a NCAM- és MAG-doménekkel való összehasonlításából látható homológiaszint (20,4±3,7, illetve 21,9±2,7). Jóllehet bizonyíték van a NCAM C-terminális szakaszaiban alternatív splicing jelenlétére [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987); D. Barthels és munkatársai, EMBO J., 6, 907-914 (1987)], ugyanígy a MAG-ban [C. Lai és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 4377-4341 (1987)] is, ugyanakkor erre nézve nem találtunk bizonyítékot az endoteliális vagy HL-60 eredetű ICÁM-1-kiónok szekvenálásakor, sem a különböző sejttípusok ICÁM-1-proteingerincének és prekurzorainak tanulmányozása folyamán [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)].We have found that ICAM-1 exhibits the strongest homology with the N-CAM and MAG glycoproteins of the C2 set. This is particularly important because both N-CAM and MAG mediate cell-cell adhesion. N-CAM is important in neuron-neuron and neuromuscular interactions [B. A. Cunningham et al., Science, 236: 799-806 (1987)], whereas MAG plays an important role in neuron-oligodendrocyte and oligodendrocyte-oligodendrocyte interactions during the formation of the myelin sheath [M. Poltorak et al., J. Cell Biok. 105: 1893-1899 (1987). The expression of N-CAM and MAG on the cell surface is under developmental regulation during development of the nervous system and myelin sheath, as well as the regulated induction of ICAM-1 in inflammation [T. A. Springer et al., Ann. Port. Immunok. 5: 223-252 (1987)]. ICAM-1, N-CAM [B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987)] and MAG [J. L. Salzer et al., J. Cell. Biok., 104, 957-965 (1987)] are similar in structure and homology to each membrane as they are composed of 5 C2 domains which form the N-terminal extracellular region, although NCAM also contains a further non-Ig-like sequence. contains between the last C2 domain and the transmembrane domain. ICAM-1, along its transmembrane and cytoplasmic domains, can be fitted alongside MAG with a 21% identity; the same percentage identity is found when comparing the 5 domains of ICAM-1 and NCAM-1. A graphical comparison of the secondary structure of ICAM-1 and MAG is shown in Figure 10. In domain-domain comparisons, the level of homology between the domains within the ICAM-1 and NCAM molecules (x ± sd, 21 ± 2.8% and 18.6 ± 3.8%) is the same as that of ICAM-1. Comparison of the domains with the NCAM and MAG domains showed 20.4 ± 3.7 and 21.9 ± 2.7, respectively. Although there is evidence for the presence of alternative splicing in the C-terminal sections of NCAM [B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987); D. Barthels et al., EMBO J., 6, 907-914 (1987)], as well as MAG [C. Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 4377-4341 (1987)], however, no evidence was found for sequencing of ICAM-1 clones from endothelial or HL-60 origin, nor for the study of ICAM-1 protein lineages and precursors of different cell types [M. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254.

A limfociták és számos különböző sejttípus kölcsönhatásaiban az ICAM-1 mint az LFA-1 ligandum működik. Szintetikus membrán kettős rétegeken a limfociták a beépült ICÁM-1-hez kötődnek, s a limfocitán ehhez LFA-1-re van szükség, s ez közvetlenül demonstrálja az LFA-1 kölcsönhatását az ICAM-l-gyel [S. D. Mariin és munkatársai, Cell, 51, 813-819 (1987)]. Az LFA-1 egy leukocita integrin, és nincsenek immunglobulinszerű jellemvonásai. A leukocita integrinek egy alcsaládot alkotnak. A másik két alcsalád sejtmátrix kölcsönhatásokat közvetít, és felismeri az RGD-szekvenciát ligandumain belül, amelyekhez a fibronektin, vitronektin, kollagén és a fibrinogén tartozik [R. O. Hynes, Cell, 48, 549-554 (1987); E. Ruoslahti és munkatársai, Science, 238, 491-497 (1987)]. A leukocita integrinek csak leukocitákon fejeződnek ki, sejt-sejt kölcsönhatásokban vesznek részt, és egyedül a következő ligandumaik ismertek: ICAM-1 és a C3 komplement komponens egy fragmentuma, az iC3b, amely nem mutat immunglobulinszerű jellemvonásokat és a Mac-1 ismeri fel [T. K. Kishimoto és munkatársai, Leukocyte Typing III, M. McMichael (szerkesztő), Springer-Verlag, New York (1987); T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi., 5, 223-252 (1987); D. C. Anderson és munkatársai, Ann. Rév. Med., 38, 175-194 (1987)]. A IX. táblázat mutatja be az ICAM-1-szekvencián belüli azon peptideket - szekvenciaanalízisre alapozva -, amelyeket az LFA-1 felismer.In interaction between lymphocytes and many different cell types, ICAM-1 acts as a ligand for LFA-1. On synthetic membrane bilayers, lymphocytes bind to integrated ICAM-1, which requires LFA-1, which directly demonstrates the interaction of LFA-1 with ICAM-1 [S. Mariin D. et al., Cell 51: 813-819 (1987). LFA-1 is a leukocyte integrin and has no immunoglobulin-like properties. Leukocyte integrins form a subfamily. The other two subfamilies mediate cellular matrix interactions and recognize the RGD sequence within its ligands to which fibronectin, vitronectin, collagen and fibrinogen belong [R. O. Hynes, Cell, 48, 549-554 (1987); E. Ruoslahti et al., Science 238: 491-497 (1987)]. Leukocyte integrins are expressed only on leukocytes, participate in cell-cell interactions, and their only ligands are known: ICAM-1 and a fragment of the complement component C3, iC3b, which does not exhibit immunoglobulin-like characteristics and recognizes Mac-1. . K. Kishimoto et al., Leukocyte Typing III, M. McMichael (editor), Springer-Verlag, New York (1987); T. A. Springer et al., Ann. Port. Immunol., 5, 223-252 (1987); D. C. Anderson et al., Ann. Port. Med. 38: 175-194 (1987). IX. Table IV shows peptides within the ICAM-1 sequence, based on sequence analysis, that are recognized by LFA-1.

IX. táblázatIX. spreadsheet

Az ICÁM -1-szekvencián belüli peptidek, amelyeket az LFA-1 valószínűleg felismerPeptides within the ICAM -1 sequence that are likely to be recognized by LFA-1

Az ICAM-1 az immunglobulin szupergéncsalád első olyan tagja, amely egy integrinhez kötődik. Bár mindkét család fontos szerepet játszik a sejtadhézióban, a köztük lévő kölcsönhatást eddig nem tartották valószínűnek. Ezzel szemben az immunglobulin génszupercsaládon belüli kölcsönhatások általánosan ismertek. Lehetséges, hogy az integrin és az immunglobulincsalád között további kölcsönhatásokat fognak felfedezni. Az LFA-1 felismer egy olyan ligandumot, mely eltér az ICAM-l-től [T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunoi., 5, 223-252 (1987)] és a leuko27ICAM-1 is the first member of the immunoglobulin supergene family to bind to an integrin. Although both families play an important role in cell adhesion, the interaction between them has so far been unlikely. In contrast, interactions within the immunoglobulin gene superfamily are generally known. Further interactions between the integrin and the immunoglobulin family may be discovered. LFA-1 recognizes a ligand different from ICAM-1 [T. A. Springer et al., Ann. Port. Immunol., 5: 223-252 (1987)] and leuko27

HU 217 792 Β cita integrin Mac-1 felismer egy C3bi-től különböző ligandumot a neutrofil-neutrofil adhézió során [D. C. Anderson és munkatársai, Ann. Rév. Med., 38, 175-194 (1987)]. Ezenkívül a tisztított MAG-ot tartalmazó vezikulumok kötődnek a neuritekhez, amelyek MAG-ok, így a MAG képes kell legyen egy eltérő receptorral való heterofil kölcsönhatásra [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell. Bioi., 105, 1893-1899 (1987)].Other integrin Mac-1 recognizes a ligand other than C3bi during neutrophil-neutrophil adhesion [D. C. Anderson et al., Ann. Port. Med. 38: 175-194 (1987). In addition, purified MAG-containing vesicles bind to neurons, which are MAGs, so that MAGs must be able to interact with a different receptor [M. Poltorak et al., J. Cell. Biol. 105: 1893-1899 (1987).

A NCAM-nak a neurális-neurális és neurális-muszkuláris sejtkölcsönhatásokban játszott szerepéről feltételezhető, hogy ez a homofil NCAM-NCAM kölcsönhatásának tudható be [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)]. A MAG-nak fontos szerepe van az axonokat körülvevő Schwann-sejtek szomszédos hurkainak a kölcsönhatásaiban a mielinhüvely kialakulásakor, ami vagy egy külön receptorral való kölcsönhatásnak, vagy a homofil MAG-MAG kölcsönhatásnak tulajdonítható. A NCAM-mal való homológia és a gyakori domén-domén kölcsönhatások fellépése az immunglobulin szupergéncsaládon belül felveti annak lehetőségét, hogy az ICÁM-1 részt vehet a homofil kölcsönhatásokban, valamint az ICAM-1-LFA-1 heterofil kölcsönhatásokban. Azonban a B-limfoblasztoid sejteknek - ezek egyszerre hasonló sűrűségben fejezik ki mind az LFA-l-et, mind az ICAM-l-et - a kötődése mesterséges vagy sejtes monorétegekben lévő ICÁM-1-hez teljesen gátolható, ha a B-limfoblasztokat LFA-1 monoklonális antitesttel (MAt) előkezeljük, míg nem befolyásolja az adherenciát, ha a B-limfoblasztokat ICAM-1 Mat-tel előkezeljük. Ha az egysejt réteget ICAM-1 MAt-tel előkezeljük, a kötődés teljesen megszűnik [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986); S. D. Mariin és munkatársai, Cell, 51, 813-819 (1987)]. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy ha egyáltalán fellépnek homofil kölcsönhatások, ezeknek sokkal gyengébbeknek kell lenniük, mint az LFA-1-gyei való heterofil kölcsönhatás.The role of NCAM in neural-neural and neural-muscular cell interactions is thought to be due to the homophilic NCAM-NCAM interaction [B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987). MAG plays an important role in the interaction of adjacent loops of Schwann cells surrounding axons in the formation of the myelin sheath, which can be attributed to either a separate receptor interaction or a homophilic MAG-MAG interaction. Homology with NCAM and the occurrence of frequent domain-domain interactions within the immunoglobulin supergene family raise the possibility that ICAM-1 may be involved in homophilic interactions as well as ICAM-1-LFA-1 heterophilic interactions. However, B-lymphoblastoid cells, which express both LFA-1 and ICAM-1 at similar densities, can be completely inhibited by binding to ICAM-1 in artificial or cellular monolayers when B-lymphoblasts are LFA -1 pre-treatment with monoclonal antibody (MAt), while not affecting adherence when B-lymphoblasts are pretreated with ICAM-1 Mat. If the monolayer is pretreated with ICAM-1 MAt, the binding is completely abolished [M. L. Dustin et al., 1986, J. Immunol. 137: 245-254; S. D. Mariin et al., Cell, 51: 813-819 (1987). These observations indicate that, if any homophilic interactions occur, they must be much weaker than heterophilic interactions with LFA-1.

Az a lehetőség, hogy a leukocita integrinek a ligandumokat alapvetően eltérő módon ismerik fel, megfelel egy 180 csoportból álló szekvencia jelenlétének az α-alegységekben, amelyek fontosak lehetnek a ligandumkötődésben, és ezek nincsenek meg az RGDfelismerő integrinekben [A. Corbi és munkatársai, EMBO J„ 6, 4023-4028 (1987)]. Bár a Mac-1-ről úgy tudjuk, hogy felismeri az iC3b-ben az RGD-szekvenciát, az ICÁM-1-ben azonban nincs RGD-szekvencia (8. ábra). Ez összhangban van azzal, hogy a GRGDSP fibronektin peptid és a kontroll GRGESP peptid nem képes az ICÁM-1 -LFA-1 adhéziót gátolni [S. D. Mariin és munkatársai, Cell., 57, 813-819 (1987)]. Habár rokon szekvenciák, mint a PRGGS és a RGEKE jelen vannak az ICAM-1 azon szakaszaiban, amelyekről feltételezhető, hogy hurkot alkotnak a dómén 2a és b, illetve a dómén 2c és d β-szálai között (9. ábra), és ez teszi lehetővé felismerésüket. Lényeges, hogy a homológ MAG-molekula egy RGD-szekvenciát tartalmaz a dómén 1 és 2 között [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell. Bioi., 705, 1893-1899 (1987); J. L. Salzer és munkatársai, J. Cell. Bioi., 104, 957-965 (1987)].The possibility that leukocyte integrins recognize ligands in fundamentally different ways corresponds to the presence of a 180-residue sequence in the α-subunits that may be important for ligand binding and are not present in RGD recognition integrins [A. Corbi et al., EMBO J 6, 4023-4028 (1987)]. Although Mac-1 is known to recognize the RGD sequence in iC3b, there is no RGD sequence in ICAM-1 (Figure 8). This is consistent with the fact that GRGDSP fibronectin peptide and control GRGESP peptide are unable to inhibit ICAM-1-LFA-1 adhesion [S. Mariin D. et al., Cell. 57: 813-819 (1987). Although related sequences such as PRGGS and RGEKE are present in sections of ICAM-1 that are thought to form a loop between domain 2a and b and domain 2c and d (Figure 9), allow them to be recognized. Importantly, the homologous MAG molecule contains an RGD sequence between domain 1 and domain 2 [M. Poltorak et al., J. Cell. Biol., 705, 1893-1899 (1987); J. L. Salzer et al., J. Cell. Biol., 104, 957-965 (1987)].

19. példaExample 19

Southern és Northern biotokSouthern and Northern biots

A Southern biot technikát 5 pg genomiális DNS felhasználásával végeztük. A DNS-eket három sejtvonalból vontuk ki: BL2, egy Burkitt-limfóma sejtvonal (dr. Gilbert Lenoir adománya), JY és Er-LCL [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 227-231 (1988)], egy EBVtranszformált B-limfoblasztoid sejtvonal.Southern biotech technique was performed using 5 pg genomic DNA. DNAs were extracted from three cell lines: BL2, a Burkitt lymphoma cell line (donated by Dr. Gilbert Lenoir), JY, and Er-LCL, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 227-231 (1988)], an EBV-transformed B-lymphoblastoid cell line.

A DNS-eket BamHI és EcoRI endonukleázokkal emésztettük az előállítók által javasolt mennyiség ötszörösével (New England Biolabs), majd 0,8%-os agarózgélben végzett elektroforézis után a DNS-eket nejlonmembránra (Zeta Probe, BioRad) vittük át. A szűrőt standard eljárásokkal prehibridizáltuk és hibridizáltuk, a-(³²P)dXTP-kkel (Boehringer Mannheim) véletlenszerűen jelzett (random priming) HL-60 eredetű ICÁM cDNS-t használva. A Northern biot technikához 20 pg össz-RNS-t vagy 6 pg poli(A)⁺-RNS-t használtunk. Az RNS-t denaturáltuk és 1%-os agaróz-formaldehid gélben elektroforetizáltuk, majd átvittük Zeta Probe-lemezekre. A szűrőlemezeket az előbb leírt módon prehibridizáltuk és hibridizáltuk [D. E. Staunton és munkatársai, EMBO I, 6, 3695-3701 (1987)] a ³²P-vel jelzett oligonukleotidpróbák (lásd fentebb) HL-60 eredetű cDNS-szondáját használva.The DNAs were digested with BamHI and EcoRI endonucleases at five times the manufacturer's recommended amount (New England Biolabs) and then transferred to a nylon membrane (Zeta Probe, BioRad) after electrophoresis on a 0.8% agarose gel. The filter was prehybridized and hybridized according to standard procedures, using a- ⁽³² P) ICAM cDNA derived ICAM cDNA from HL-60 HL-set (Boehringer Mannheim) were randomly labeled (random priming). For the Northern biotech technique, 20 pg total RNA or 6 pg poly (A) ⁺ RNA was used. RNA was denatured and electrophoresed on a 1% agarose formaldehyde gel and transferred to Zeta Probe plates. The filter plates were prehybridized and hybridized as described above (DE Staunton et al., 1987, EMBO I, 6, 3695-3701) using the HL-60 derived cDNA probe of ³² P-labeled oligonucleotide probes (see above).

A 3 kb cDNS-szondával és a BamHI-gyel és EcoRIgyel emésztett genomiális DNS-sel kapott Southern biotok 20, illetve 8 kb nagyságú fő fragmentumokat mutattak, ami egyetlen génre utal, és hogy a legtöbb kódoló információt a 8 kb tartalmazza. A három különböző sejtvonal blotjában nem volt bizonyíték a restrikciós fragmentumok polimorfizmusára.Southern biots obtained with the 3 kb cDNA probe and BamHI and EcoRI digested genomic DNA showed 20 and 8 kb major fragments, respectively, indicating a single gene and that most of the coding information is contained in the 8 kb. There was no evidence of restriction polymorphism in the blot of the three different cell lines.

20. példaExample 20

Az ICÁM-1-gén kifejeződéseExpression of the ICAM-1 gene

Az „expressziós vektor” egy olyan vektor, amely (megfelelő transzkripciós és/vagy transzlációs szabályozószekvenciák jelenlétének a következtében) egy vektorba beklónozott DNS- (vagy cDNS-) molekulát képes kifejezni, és ezáltal egy polipeptid vagy protein termelésére képes. A klónozott szekvenciák akkor fejeződnek ki, ha az expressziós vektort egy megfelelő gazdasejtbe vezettük be. Ha prokarióta expressziós vektort használunk, a megfelelő gazdasejt bármilyen olyan prokarióta sejt lehet, amely képes kifejezni a klónozott szekvenciát. Hasonlóképpen, ha eukarióta expressziós vektort használunk, a megfelelő gazdasejt bármilyen eukarióta sejt lehet, amely képes a klónozott szekvencia kifejezésére. Fontos megemlíteni, hogy mivel az eukarióta DNS köztes szekvenciákat tartalmazhat, és mivel az ilyen szekvenciákat a prokarióta sejtek nem tudják korrekt módon feldolgozni, előnyösebb, ha ICAM-l-et kifejező sejtből származó cDNS-t használunk egy prokarióta genomiális expressziós vektorgyűjtemény előállítása céljából. A cDNS-izolálás módszereit és egy genomiális gyűjtemény előállítási eljárásait T. Maniatis és munkatársai írták le [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)].An "expression vector" is a vector which (due to the presence of appropriate transcriptional and / or translational regulatory sequences) is capable of expressing a DNA (or cDNA) molecule which is cloned into a vector and thereby produces a polypeptide or protein. Cloned sequences are expressed when the expression vector is introduced into a suitable host cell. When a prokaryotic expression vector is used, the appropriate host cell may be any prokaryotic cell capable of expressing the cloned sequence. Similarly, when using a eukaryotic expression vector, the appropriate host cell may be any eukaryotic cell capable of expressing the cloned sequence. It is important to mention that since eukaryotic DNA may contain intermediate sequences and because such sequences cannot be processed correctly by prokaryotic cells, it is preferable to use cDNA from a cell expressing ICAM-1 to produce a collection of prokaryotic genomic expression vectors. Methods for cDNA isolation and methods for producing a genomic library are described by T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

A fent leírt expressziós vektor genomiális gyűjteményt gazdasejtbank létesítésére használjuk fel (min28The expression vector genomic collection described above was used to construct a host cell bank (min

HU 217 792 Β den gazdasejt a gyűjtemény egy tagját tartalmazza). Az expressziós vektort a gazdasejtbe bármilyen ismert módon bevihetjük, például transzformációval, transzfekcióval, protoplasztfűzióval, elektroporációval stb. Az expressziós vektorokat tartalmazó sejtbankot klónozás révén szaporítjuk, és tagjait egyenként vizsgáljuk (immunassay-ket használva) annak meghatározására, hogy képesek-e olyan proteint termelni, amely kötődik az anti-ICAM-1-antitesthez.HU 217 792 (contains one member of the collection). The expression vector may be introduced into the host cell by any known means, such as transformation, transfection, protoplast fusion, electroporation, and the like. The cell bank containing the expression vectors is propagated by cloning and its members examined individually (using immunoassays) to determine their ability to produce a protein that binds to the anti-ICAM-1 antibody.

Az anti-ICAM-1-antitesthez kötődő proteineket termelő sejtek expressziós vektorait továbbá vizsgáljuk annak megállapítására, hogy a teljes ICAM-l-gént fejezik-e ki (azaz tartalmazzák-e) vagy csak az ICAM-1gén egy fragmentumát fejezik ki (tehát ezt tartalmazzák) vagy egy olyan gént fejeznek ki (azaz tartalmaznak), amelynek a terméke bár immunológiailag rokon az ICÁM-1 -gyei, de mégsem maga az ICÁM-1. Bár ezt a vizsgálatot bármilyen alkalmas módszerrel el lehet végezni, előnyös meghatározni az expressziós vektorba klónozott DNS- vagy cDNS-fragmentum nukleotidszekvenciáját. Ezeket a nukleotidszekvenciákat azután megvizsgáljuk annak megállapítására, hogy tudnak-e kódolni olyan polipeptideket, amelyeknek az aminosavszekvenciája az ICÁM -1 tripszines emésztésével nyert fragmentumai aminosavszekvenciájával azonosak (V. táblázat).The expression vectors of the cells producing the proteins that bind to the anti-ICAM-1 antibody are further examined to determine whether they express (i.e. contain) the entire ICAM-1 gene or express a fragment of the ICAM-1 gene (i.e. ) or express (i.e. contain) a gene whose product, although immunologically related to ICAM-1, is not ICAM-1 itself. Although this assay can be performed by any suitable method, it is preferred to determine the nucleotide sequence of the DNA or cDNA fragment cloned into the expression vector. These nucleotide sequences are then screened to determine if they can encode polypeptides having the amino acid sequence identical to the amino acid sequence of its trypsin digestion of ICAM-1 (Table V).

Egy expressziós vektort, amely egy ICAM-l-gént meghatározó DNS- vagy cDNS-molekulát tartalmaz, a következők alapján lehet felismerni: (1) tudja-e irányítani egy olyan protein kifejeződését, amely az antiICAM-1-antitesthez képes kötődni; és (2) jelen van-e egy olyan nukleotidszekvencia, amely az ICAM-1 bármelyik tripszines fragmentumának a kódolására képes. Egy ilyen expressziós vektorba klónozott DNS-molekula eltávolítható az expressziós vektorból, és tiszta formában előállítható.An expression vector comprising a DNA or cDNA molecule that defines an ICAM-1 gene can be recognized by: (1) its ability to direct the expression of a protein that is capable of binding to the antiICAM-1 antibody; and (2) a nucleotide sequence capable of encoding any trypsin fragment of ICAM-1 is present. A DNA molecule cloned into such an expression vector can be removed from the expression vector and produced in pure form.

21. példaExample 21

A tisztított ICAM-1 funkcionális aktivitásaFunctional activity of purified ICAM-1

A sejtekben az ICÁM -1 normálisan a sejtmembránhoz kötött felületi proteinként funkcionál. Tehát megvizsgáltuk a tisztított ICAM-1 hatását mesterséges lipidmembránokba (liposzómákba vagy vezikulumokba) való beépítésük után oly módon, hogy a proteint detergenssel szolubilizált lipidekben feloldottuk, majd a detergenst dialízissel eltávolítottuk. JY-sejtekből tisztított és oktil-glükozid-detergensben a fent leírt módon oldott ICÁM-1-et vezikulumokba vittük be, és az ICÁM-1-et tartalmazó vezikulumokat üveg fedőlemezekhez vagy műanyag tenyésztőtartályokhoz fuzionáltuk abból a célból, hogy lehetővé váljék a sejtek proteinhez való kötődésének a detektálása.In cells, ICAM-1 normally functions as a surface protein bound to the cell membrane. Thus, the effect of purified ICAM-1 after its incorporation into artificial lipid membranes (liposomes or vesicles) was investigated by dissolving the protein in detergent solubilized lipids and then removing the detergent by dialysis. ICAM-1 purified from JY cells and dissolved in octyl glucoside detergent as described above was introduced into vesicles and vesicles containing ICAM-1 were fused to glass coverslips or plastic culture vessels to allow the cells to protein detection of its binding.

Planáris membránok és műanyaghoz kötött vezikulumok előállításaPreparation of planar membranes and plastic bound vesicles

A vezikulumokat Gay és munkatársai [J. Immunoi., 136, 2026 (1986)] módszerével állítottuk elő. Röviden: tojás foszfatidil-kolint és koleszterint oldottunk kloroformban, és ezeket 7:2 mólarányban kevertük össze. Ezután a lipidkeveréket nitrogéngázban, forgatás közben vékony filmréteggé szárítottuk, majd a kloroform nyomainak az eltávolítása érdekében 1 órán át liofilizáltuk. Ezután a lipidfilmet 1%-os oktil-glükozid/0,14 M NaCl/20 mM trisz (pH=7,2) oldatban oldottuk fel úgy, hogy a foszfatidil-kolin végkoncentrációja 0,1 mM legyen. A tisztított ICÁM-1-ből vagy a humán glükoforinból (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mint kontrollmembrán glükoproteinből mintegy 10 pg-ot adtunk az oldott lipid minden ml-éhez. A protein-lipiddetergens oldatot ezután 4 °C-on dializáltuk 200 térfogatnyi 20 mM trisz/0,14 M NaCl (pH=7,2) oldat háromszori váltásával és HBSS-oldat egyszeri váltásával.Vesicles were reported by Gay et al., J. Med. Immunol., 136, 2026 (1986)]. Briefly, egg phosphatidylcholine and cholesterol were dissolved in chloroform and mixed in a 7: 2 molar ratio. The lipid mixture was then dried under nitrogen with a thin film by rotation and lyophilized for 1 hour to remove traces of chloroform. The lipid film was then dissolved in 1% octyl glucoside / 0.14 M NaCl / 20 mM tris (pH 7.2) so that the final concentration of phosphatidylcholine was 0.1 mM. About 10 µg of purified ICAM-1 or human glycophorin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) as control membrane glycoprotein was added to each ml of dissolved lipid. The protein lipid-detergent solution was then dialyzed at 4 ° C with three volumes of 200 volumes of 20 mM Tris / 0.14 M NaCl, pH 7.2 and once with HBSS.

A planáris membránokat Brian és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6159 (1984)] módszerével állítottuk elő. Üveg fedőlemezeket (átmérő 11 mm) 15 percig forraltunk a 7X detergens (Linbro) 1:6 hígítású oldatában, egy éjszakán át mostuk desztillált vízzel, 70%-os etanolban áztattuk és levegőn szárítottuk. Az ICÁM-1-et vagy a glükoforint tartalmazó vezikulumszuszpenzió 80 μΐ-es csöppjeit a tartályok aljára cseppentettük egy 24 tartályos lemezen, majd az előkészített tárgylemezeket finoman ráúsztattuk. A lemezeket 20-30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd a tartályokat HBSS-oldattal töltöttük fel, és a fedőlemezeket megfordítottuk, hogy a planáris membránokat szembefordítsuk. Ezután a tartályokat intenzíven mostuk HBSS-sel, hogy a kötetlen vezikulumokat eltávolítsuk. A planáris membránfelület soha nem volt levegőnek kitéve.Planar membranes are described in Brian et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6159 (1984)]. Glass cover plates (11 mm diameter) were boiled for 15 minutes in a 1: 6 dilution of 7X detergent (Linbro), washed overnight with distilled water, soaked in 70% ethanol and air dried. 80 μΐ droplets of the ICAM-1 or glucophorin-containing vesicle suspension were dropped onto the bottom of the wells in a 24-well plate, and the prepared slides were gently floated. The plates were incubated for 20-30 minutes at room temperature, and the wells were filled with HBSS and the coverslips were inverted to face the planar membranes. The vessels were then washed extensively with HBSS to remove unbound vesicles. The planar membrane surface was never exposed to air.

Az üveg felületéhez fuzionált planáris membránokkal végzett kísérletek során az ICÁM-1-et tartalmazó vezikulumokról megállapítottuk, hogy azok a soktartályos szövettenyésztő lemezeken közvetlenül a műanyag felülethez kötődnek, és megtartják funkcionális aktivitásukat, amelyet a sejtekhez való specifikus kötődés bizonyít. A továbbiakban ezeket a vezikulumokat „műanyaghoz kötött vezikulumok”-nak („plasticbound vesicles”; PBV) nevezzük, minthogy a műanyaghoz kötött lipid vezikulumok természetét vizsgáltuk. A műanyaghoz kötött vezikulumokat úgy állítottuk elő, hogy 30 pl vezikulumszuszpenziót mértünk be a 96 tartályos szövettenyésztő tálca (Falcon) tartályainak az aljába, és a tálcákat a planáris membránoknál leírt módon inkubáltuk és mostuk.In experiments with planar membranes fused to the glass surface, vesicles containing ICAM-1 were found to bind directly to the plastic surface in multi-well tissue culture plates, as demonstrated by their specific cellular binding. Hereinafter, these vesicles are referred to as "plasticbound vesicles" (PBVs) as the nature of the plastic-bound lipid vesicles has been investigated. Plastic-bound vesicles were prepared by adding 30 µl of vesicle suspension to the bottom of the wells of a 96-well tissue culture plate (Falcon) and incubating and washing as described for the planar membranes.

Sejtadhéziós vizsgálatokCell adhesion assays

A sejtadhéziós vizsgálatokat mind a planáris membránokkal, mind a műanyaghoz kötött vezikulumokkal lényegében azonos módon végeztük, kivéve, hogy a planáris membránoknál használt sejtszámot és térfogatot a PBV esetében egyötödére csökkentettük.Cell adhesion assays were performed in substantially the same manner as both planar membranes and plastic-bound vesicles, except that the number and volume of cells used for planar membranes were reduced to one fifth for PBV.

Normál kontroliegyénekből és LAD- (Leukocyte Adhesion Deficiency) betegekből, akiknek a sejtjei LFA-l-et nem tudnak kifejezni [D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668 (1985)], származó T-limfocitákat készítettünk elő oly módon, hogy a perifériás vér mononukleáris sejtjeit 1 pg/ml Concanavalin A (ConA)-val tenyésztettük 3 napon át 20% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban, 5 · 10⁵ sejt/ml mellett. A sejteket ezután kétszer mostuk RPMI-vel és egyszer 5 mmólos metil-a-D-mannopiranoziddal, hogy eltávolítsuk a visszamaradó lektint aNormal control subjects and LAD (Leukocyte Adhesion Deficiency) patients whose cells cannot express LFA-1 [DC Anderson et al., J. Infect. Dis., 152, 668 (1985)] were prepared by culturing peripheral blood mononuclear cells with 1 pg / ml Concanavalin A (ConA) for 3 days in RPMI 1640 medium containing 20% fetal calf serum, At 5 x 10 ⁵ cells / ml. Cells were then washed twice with RPMI and once with 5 mM methyl αD-mannopyranoside to remove residual lectin

HU 217 792 Β sejtek felszínéről. A sejteket RPMI/20% FCS tápoldatban tenyésztettük, amely 1 ng/ml rekombináns IL-2-t tartalmazott, és a sejteket a tenyésztés megkezdése után a 10-22. nap között használtuk fel.HU 217 792 Β cell surface. Cells were cultured in RPMI / 20% FCS medium containing 1 ng / ml recombinant IL-2 and cells were cultured at 10-22 post-start. day.

Abból a célból, hogy a ConA-blasztoknak, a Tlimfóma SKW-3 sejteknek és a JY (LFA-1 pozitív) EBV-transzformált B-limfoblasztoid sejtvonalnak (BBN) [az 1-es betegből származik; T. A. Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1986)] a planáris membránokhoz vagy a PBV-hez való kötődését észlelhessük, az említett sejteket radioaktív izotóppal jeleztük úgy, hogy 1 -10⁷ sejtet 1 ml RPMI-1640/10% FCS tápoldatban 100 pCi Na^5lCrO4-gyel indukáltunk 1 órán át 37 °C-on, majd négyszer mostuk RPMI 1640nel a be nem épült jelzés eltávolítása céljából. Monoklonális antitestblokkoló vizsgálatokban a sejteket vagy a műanyaghoz kötött vezikulumokat RPMI-1640/10% FCS-ben oldott 20 pg/ml tisztított antitesttel előkezeltük, 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd négyszer mostuk a kötetlen antitestek eltávolítása céljából. A kétértékű kationoknak a sejtek kötődésére kifejtett hatásvizsgálata során a sejteket egyszer mostuk Ca²⁺-, Mg²⁺-mentes, 10% dializált FCS-tartalmú HBSS-oldattal, majd az oldathoz CaCl2-t és MgCl₂-t adtunk a megadott koncentrációkban. Minden kísérletben a sejteket és a planáris membránokat vagy PBV-t előzőleg kiegyensúlyoztuk a megfelelő hőmérsékleten (4 °C, 22 °C vagy 37 °C) a megfelelő vizsgálati pufferben.For the purpose of ConA blasts, Thymomaoma SKW-3 cells, and JY (LFA-1 positive) EBV-transformed B-lymphoblastoid cell line (BBN) [derived from patient 1; TA Springer et al., J. Exper. Realize the binding to planar membranes or PBV With Med. 160: 1901-1918 (1986)], those cells were labeled is radiolabeled to 1 -10 ⁷ cells 1 in RPMI-1640/10% ml FCS and 100 pCi Na ⁵ L CrO4 was induced for 1 hour at 37 ° C and then washed four times with RPMI 1640 to remove the unlabeled label. In monoclonal antibody blocking assays, cells or plastic-bound vesicles were pretreated with 20 pg / ml purified antibody in RPMI-1640/10% FCS, incubated at 4 ° C for 30 minutes, and washed four times to remove unbound antibodies. To test the effect of divalent cations on cell binding, cells were washed once with Ca ²⁺ , Mg ²⁺ -free, 10% dialyzed FCS-containing HBSS, and then CaCl ₂ and MgCl ₂ were added at the indicated concentrations. In each experiment, cells and planar membranes or PBV were pre-equilibrated at the appropriate temperature (4 ° C, 22 ° C or 37 ° C) in the appropriate assay buffer.

Hogy megmérjük a sejtek kötődését a tisztított ICÁM- 1-hez, az ⁵¹Cr-jelzett sejteket (5 -10⁵ EBV-transzformált sejt a planárismembrán-vizsgálatokban; 1-10⁵ EBV-transzformált sejt vagy SKW—3 sejt; 2-10⁵ ConA-blasztsejt a PBV-vizsgálatokban) a planáris membránokra vagy PBV-re centrifugáltuk 2 percig 25 mg mellett, majd inkubálás következett 4 °C-on, 22 °C-on vagy 37 °C-on. Az inkubálás után a nem kötődött sejteket úgy távolítottuk el, hogy a tartályokat nyolc ciklusban a megfelelő hőmérsékletű pufferrel feltöltöttük és leszívattuk. A megkötött sejtek mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a tartályok tartalmát 0,1 n NaOH/1% Triton X-100 oldattal szolubilizáltuk és gamma-számlálóval mértük. A sejtkötődés százalékát úgy állapítottuk meg, hogy a kötött sejtek cpm-értékét elosztottuk a bevitt sejtek cpm-értékével. A planárismembrán-vizsgálatokban a bevitt cpm-et a tenyésztőtartályok területének és a fedőlemez területének az összehasonlításából adódó arány szerint korrigáltuk.To measure cell binding to purified ICAM-to-1, the cells were Cr-labeled ⁵¹ (5 -10 ⁵ EBV-transformed cell of the planar membrane assays; 1 to 10 ⁵ EBV-transformants or SKW-3 cells; 2-10 ⁵ ConA blast cells in PBV assays) were centrifuged on planar membranes or PBV for 2 minutes at 25 mg, followed by incubation at 4 ° C, 22 ° C or 37 ° C. After incubation, unbound cells were removed by filling the wells with suction for eight cycles with the appropriate temperature buffer. The amount of bound cells was determined by solubilizing the contents of the wells with 0.1 N NaOH / 1% Triton X-100 and weighing with a gamma counter. Percentage of cell binding was determined by dividing the cpm value of the bound cells by the cpm value of the cells introduced. In planar membrane assays, the cpm introduced was corrected for the ratio of the area of the culture vessels to the area of the cover plate.

Ezekben a vizsgálatokban az EBV-transzformált Blimfoblasztoid sejtek, az SKW-3 T-limfómasejtek és a ConA T-limfoblasztok specifikusan kötődtek az ICÁM-1-hez mesterséges membránokban (11. és 12. ábra). A kötés specifikus volt, minthogy a sejtek nagyon gyengén kötődtek azokhoz a kontroll planáris membránokhoz vagy vezikulumokhoz, amelyek ekvivalens mennyiségű, más humán sejtfelszíni glükoproteint - glükoforint - tartalmaztak. Továbbá az LFA-1-pozitív EBV-transzformált sejtek és a ConA-blasztok kötődtek, míg ezek LFA-1-negatív párjai nem kötődtek szignifikáns mértékben, s ez azt mutatja, hogy a kötés attól függött, hogy volt-e a sejteken LFA-1.In these assays, EBV-transformed Blimphoblastoid cells, SKW-3 T-lymphoma cells and ConA T-lymphoblasts specifically bind to ICAM-1 in artificial membranes (Figures 11 and 12). The binding was specific because the cells were very weakly bound to control planar membranes or vesicles containing an equivalent amount of other human cell surface glycoprotein, glycophorin. Furthermore, LFA-1-positive EBV-transformed cells and ConA-blasts bound, whereas their LFA-1-negative pairs did not bind significantly, indicating that the binding was dependent on the presence of LFA-cells on the cells. first

A sejt kötődésének mind a specifitását, mind a celluláris LFA-1-től való függését monoklonális antitestblokkoló kísérletekben bizonyítottuk (13. ábra). A JYsejtek kötődése 97%-ban gátolható, ha az ICAM-1tartalmú PBV-t RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel előkezeljük. Ha a sejteket előkezeltük ugyanezen antitesttel, annak csekély hatása volt. Ezzel szemben a TS1/18 anti-LFA-1 monoklonális antitest a kötést 96%-ban gátolta, de csak akkor, ha a sejteket és nem a PBV-t kezeltük előzetesen. A kontroll TS2/9 antitest, amely az LFA-3-mal (mely egy más limfocita felületi antigén) reagál, nem fejtett ki szignifikáns gátló hatást, akár a sejteket, akár a PBV-t előkezeltük vele. Ez a kísérlet megmutatta, hogy maga az ICAM-1 és nem a csekély jelen lévő szennyezés - közvetíti a mesterséges membránokon megfigyelt celluláris adhéziót, és hogy az adhézió a kötődő sejten lévő LFA-1-től függ.Both the specificity of the cell binding and its dependence on cellular LFA-1 were demonstrated in monoclonal antibody-blocking experiments (Figure 13). Binding of JY cells is 97% inhibited by pretreating ICAM-1 containing PBV with RR1 / 1 anti-ICAM-1 monoclonal antibody. If the cells were pretreated with the same antibody, it had little effect. In contrast, the anti-LFA-1 monoclonal antibody TS1 / 18 inhibited the binding by 96%, but only when the cells and not the PBV were pretreated. The control TS2 / 9 antibody, which reacts with LFA-3 (another lymphocyte surface antigen), showed no significant inhibitory effect on either cells or PBV. This experiment showed that ICAM-1 itself, and not the slight presence of contamination, mediates the cellular adhesion observed on the artificial membranes and that the adhesion depends on LFA-1 on the binding cell.

A sejteknek a mesterséges membránokon lévő ICÁM- 1-hez való kötődése az LFA-l-függő adhéziós rendszer másik két jellegzetességét is bemutatja: a hőmérsékletfüggést és a kétértékű kationigényt. Amint az a 14. ábrán látható, a ConA-blasztok a PBV-n legjobban 37 °C-on kötődnek az ICAM-l-hez, kisebb mértékben 22 °C-on és igen gyengén 4 °C-on. A 15. ábrán az látható, hogy a kötés teljes mértékben a kétértékű kationok jelenlététől függ. Fiziológiás koncentráció esetében a Mg²⁺ egyedül elegendő a maximális sejtkötődéshez, míg a Ca²⁺ egyedül csak kismértékű kötődést tesz lehetővé. Azonban, ha a Mg²⁺-ot normál koncentrációja egytizedének megfelelő koncentrációban Ca²⁺-mal kombináljuk, a hatás szinergetikus és maximális kötés jön létre.The binding of cells to ICAM-1 on artificial membranes also demonstrates two other features of the LFA-1-dependent adhesion system: temperature dependence and divalent cation requirement. As shown in Fig. 14, ConA blasts bind to ICAM-1 at 37 ° C, to a lesser extent at 22 ° C and to a very low extent at 4 ° C, on PBV. Figure 15 shows that the bond is completely dependent on the presence of divalent cations. At physiological concentrations, Mg ²⁺ alone is sufficient for maximum cellular binding, whereas Ca ²⁺ alone allows only minor binding. However, when Mg ²⁺ is combined with Ca ^{2+ at a} concentration equal to one tenth of its normal concentration, the effect is synergistic and maximal bonding occurs.

Összefoglalva, a mesterséges membránokba beépített, tisztított ICAM-l-hez történő sejtkötődés specificitása, a monoklonális antitestekkel való specifikus gátlás, a hőmérséklet és a kétértékű kationok iránti igény azt mutatja, hogy az ICAM-1 az LFA-l-függő adhéziós rendszer egy specifikus liganduma.In summary, the specificity of cell binding to purified ICAM-1 incorporated in artificial membranes, specific inhibition by monoclonal antibodies, temperature, and the need for divalent cations indicate that ICAM-1 is a specific LFA-1-dependent adhesion system. ligand.

22. példaExample 22

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója allergiás és toxikus patch-teszt reakciókbanExpression of ICAM-1 and HLA-DR in allergic and toxic patch test reactions

Öt normál egyén bőrbiopsziás mintáját tanulmányoztuk annak megállapítására, hogy azok kifejeznek-e ICÁM- 1-et és HLA-DR-t. Azt tapasztaltuk, hogy míg néhány véredény endoteliális sejtjei rendszerint kifejeznek ICÁM-1-et, a normál bőr keratinocitáiban nem volt kimutatható ICÁM-1 -expresszió. Normál bőrbiopsziás minták keratinocitáiban nem volt megfigyelhető a HLA-DR festődése. Az ICÁM-1 és a II. osztályú antigének expressziójának a kinetikáját allergiás és toxikus bőrléziókból származó biopsziás sejteken tanulmányoztuk, és azt találtuk, hogy a hat vizsgált beteg felénél olyan keratinociták vannak jelen, amelyek ICÁM- 1-et fejeznek ki négy órával a haptén alkalmazása után (X. táblázat). Növelve a hapténnel való kezelés időtartamát, növekszik azoknak a betegeknek a százalékos aránya, akiknél a keratinociták ICÁM- 1-et fejeznek ki, és ugyancsak növekszik a festődés intenzitása, jelezvén,Skin biopsy samples from five normal subjects were examined to determine if they express ICAM-1 and HLA-DR. It has been found that while endothelial cells in some blood vessels normally express ICAM-1, no expression of ICAM-1 was detected in keratinocytes of normal skin. HLA-DR staining was not observed in keratinocytes of normal skin biopsy samples. ICAM-1 and II. The kinetics of the expression of class II antigens on biopsy cells from allergic and toxic skin lesions were found and found in half of the six patients tested to have keratinocytes expressing ICAM-1 four hours after hapten application (Table X). Increasing the duration of hapten treatment increases the percentage of patients whose keratinocytes express ICAM-1 and also increases the staining intensity,

HU 217 792 Β hogy 48 óra múlva keratinocitánként több ICAM-1 fejeződik ki. Tény, hogy ebben az időpontban minden biopsziában a keratinociták pozitívan festődtek ICÁM- 1-re. A 72. órában (24 órával a haptén eltávolítása után) a nyolc betegből hétnél még mindig volt ICÁM -1-kifejeződés a keratinocitákon, míg egy betegnél csökkent az ICAM-1 expressziója a 48. és 72. óra között.Β that ICAM-1 is expressed more per keratinocyte after 48 hours. In fact, at each time point in all biopsies, keratinocytes stained positively for ICAM-1. At 72 hours (24 hours after hapten removal), seven of the eight patients still had ICAM-1 expression on keratinocytes, while one patient had a decrease in ICAM-1 expression between 48 and 72 hours.

X. táblázatTable X.

Az ICAM-1- és a HLA-DR-indukció kinetikája allergiás patch-teszt biopsziás keratinocitákonKinetics of ICAM-1 and HLA-DR induction in allergic patch test on biopsy keratinocytes

A patch alkalmazása után eltelt idő (óra) Time (hours) after applying patch Biopsziák száma Number of biopsies Csak ICAM-1 ICAM-1 only Csak HLA-DR HLA-DR only ICAM-1 és HLA-DR ICAM-1 and HLA-DR Normál bőr Normal skin 5 5 0 0 0 0 0 0 Allergiás patch-teszt Allergic patch test 4 4 6 6 3^a 3 ^a 0 0 0 0 8 8 9 9 3 3 0 0 0 0 24 24 8 8 7 7 0 0 0 0 48^b 48 ^b 8 8 5 5 0 0 3 3 72 72 8 8 6 6 0 0 1 1

^a A mintákat pozitívnak tekintjük, ha a keratinocitáknak legalább egy kis csoportja megfestődik. ^b Ebben az időpontban minden patch-ot eltávolítottunk. ^a Samples are considered positive if at least a small group of keratinocytes are stained. ^b At this point, all patches have been removed.

A szövettani vizsgálatok szerint a haptén alkalmazása után négy órával vett biopsziás mintában a keratinociták ICAM-l-festődése kis csomókban jelent meg. A 48. órában a keratinociták nagy részénél az ICÁM-1 kifejeződött a sejt felületén, és nem volt látható különbség a lézió középpontja és széle között. A festődés erőssége csökkent, ahogy a keratinociták a stratum comeumhoz közeledtek. Ez volt tapasztalható mind a középpontból, mind a lézió széléről vett biopsziás mintákban. Ugyanebben az időpontban a patch-teszt pozitív volt (infiltráció, erythema és vezikulumok). Nem volt észlelhető különbség az ICAM-1 expressziójában abban az esetben, ha érzékeny egyéneknél különböző hapténeket alkalmaztunk. A lézió helyén a keratinocitákon kívül néhány mononukleáris sejten és endoteliális sejten is kifejeződött az ICAM-1.Histology revealed that ICAM-1 staining of keratinocytes in the biopsy sample taken four hours after the application of hapten appeared in small nodules. At 48 hours, most keratinocytes expressed ICAM-1 on the cell surface and there was no visible difference between the center and the edge of the lesion. The staining intensity decreased as keratinocytes approached the stratum comeum. This was observed in biopsy specimens from both the center and the lesion. At the same time, the patch test was positive (infiltration, erythema and vesicles). There was no detectable difference in the expression of ICAM-1 when different haptens were used in susceptible individuals. In addition to keratinocytes, ICAM-1 was also expressed on some mononuclear cells and endothelial cells at the lesion site.

Allergiás bőrléziókban a keratinocitákon a HLA-DR kifejeződése kevésbé gyakori, mint az ICAM-1 expressziója. A vizsgált egyének egyikénél sem volt pozitív a HLA-DR-festődés a keratinocitákon 24 órával a haptén alkalmazása után. Tény, hogy csak négy biopsziás mintában volt olyan keratinocita, amely HLA-DR-t fejezett ki, és egyetlen biopsziás mintában sem volt olyan keratinocita, amely HLA-DR-re pozitív lett volna, amikor ICÁM- 1-re nem (X. táblázat).In allergic skin lesions, expression of HLA-DR on keratinocytes is less frequent than that of ICAM-1. None of the subjects tested positive for HLA-DR staining on keratinocytes 24 hours after hapten administration. In fact, only four biopsy specimens had keratinocytes expressing HLA-DR and none of the biopsy specimens had keratinocytes that were positive for HLA-DR when not in ICAM-1 (Table X ).

Ellentétben az allergiás patch-teszt lézióval, a krotonolajjal vagy nátrium-lauril-szulfáttal indukált toxikus patch-teszt lézió olyan keratinocitákat tartalmaz, amelyeknek a felületén kevés ICAM-1 mutatható ki - ha egyáltalában valami kimutatható - minden vizsgált időpontban (XI. táblázat). Tény, hogy 48 órával a patch alkalmazása után - ugyanis allergiás patch-teszt esetében ez volt az optimális időpontja az ICAM-1expressziónak - 14 patch-tesztes egyén közül csak egynél fejeztek ki a keratinociták ICÁM-1-et a lézió helyén. Az allergiás patch-teszt biopsziával ellentétben a toxikus patch-teszt biopsziás mintában lévő keratinocitákon nem volt HLA-DR-kifejeződés.In contrast to allergic patch test lesion, crotone oil or sodium lauryl sulfate-induced toxic patch test lesion contains keratinocytes that have little, if any, ICAM-1 on each surface at each time point tested (Table XI). In fact, 48 hours after patch application, since this was the optimal time for ICAM-1 expression in the allergic patch test, only one of the 14 patch test subjects had keratinocytes expressing ICAM-1 at the lesion site. In contrast to allergic patch test biopsy, keratinocytes in the biopsy specimen had no HLA-DR expression in the toxic patch test.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ICÁM-1 az immunológiai eredetű gyulladások helyén fejeződik ki, és nem a toxikus eredetű gyulladásokban, így az ICAM-1-expressziót fel lehet használni az immunológiai eredetű és a toxikus eredetű gyulladások megkülönböztetésére, így például a veseátültetés után a betegnél fellépő akut veseelégtelenségben, ahol nehéz meghatározni, hogy az elégtelenség a kilökődésnek vagy az immunszupresszív terápiás hatóanyagnak tudható-e be. A vesebiopszia és az ICAM-1-expresszió fokozódásának a kimutatása lehetővé teszi az immunológiai eredetű kilökődés és a nem immunológiai eredetű toxikus reakció megkülönböztetését.These data show that ICAM-1 is expressed at the site of immunologic inflammation and not in toxic inflammation, so that ICAM-1 expression can be used to differentiate between immunologic and toxic inflammations such as kidney transplantation. after acute renal failure in a patient, where it is difficult to determine whether the failure is due to rejection or to an immunosuppressive therapeutic agent. Detection of renal biopsy and enhancement of ICAM-1 expression allows a distinction to be made between immunological rejection and non-immunological toxic reaction.

XI. táblázatXI. spreadsheet

Az ICAM-1- és a HLA-DR-indukció kinetikája toxikus patch-teszt biopsziás mintákból származó keratinocitákonKinetics of ICAM-1 and HLA-DR Induction on Toxic Patch Test on Keratinocytes from Biopsy Specimens

A patch alkalmazása után eltelt idő (óra) Time (hours) after applying patch Biopsziák száma Number of biopsies Csak ICAM-1 ICAM-1 only Csak HLA-DR HLA-DR only ICAM-1 és HLA-DR ICAM-1 and HLA-DR 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 8 8 3 3 l^a l ^a 0 0 0 0 24 24 3 3 1 1 0 0 0 0

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

XI. táblázat (folytatás)XI. Table (continued)

A patch alkalmazása után eltelt idő (óra) Time (hours) after applying patch Biopsziák száma Number of biopsies Csak ICÁM-1 ICAM-1 only Csak HLA-DR HLA-DR only ICAM-1 és HLA-DR ICAM-1 and HLA-DR 48^b 48 ^b 14 14 1 1 0 0 0 0 72 72 3 3 1 1 0 0 0 0

^a A mintát pozitívnak tekintjük, ha a keratinociták legalább egy kis csoportja megfestődik. ^b Ebben az időpontban minden patch-ot eltávolítottunk. ^a The sample is considered positive if at least a small group of keratinocytes are stained. ^b At this point, all patches have been removed.

23. példaExample 23

Az ICÁM-1 és a HLA-DR expressziója jóindulatú bőrbetegségekbenExpression of ICAM-1 and HLA-DR in benign skin diseases

Különböző típusú gyulladásos bőrbetegségben szenvedő betegek bőrbiopsziás sejtjeinek az ICAM-1- és HLA-DR-expresszióját tanulmányoztuk. Az allergiás kontakt ekcéma, a pemphigoid/pemphigus és a lichen planus biopsziás minták keratinocitáinak nagy része fejezett ki ICÁM-1-et. A lichen planus biopsziás minták mutatták a legerősebb festődést, amelynek a képe ha- 20 sonló, sőt erősebb volt, mint amilyen az allergiás patchteszt biopsziás mintákban volt látható 48 óra múlva (XII. táblázat). Az allergiás patch-tesztnél látott eredményekhez hasonlóan a legerősebb ICAM-l-festődés a súlyos mononukleáris sejtinfiltráció helyén volt látható. Továbbá a keratinociták HLA-DR-vizsgálataiban a vizsgált 11 lichen planus biopsziás mintákból 8 pozitív volt.ICAM-1 and HLA-DR expression of skin biopsy cells of patients with various types of inflammatory dermatology was studied. The majority of keratinocytes in biopsy specimens from allergic contact eczema, pemphigoid / pemphigus and lichen PLANI expressed ICAM-1. Lichen Planes biopsy specimens showed the strongest staining that was similar to, and even stronger than that seen in the Allergic Patch Test biopsy specimen at 48 hours (Table XII). Similar to the results seen in the allergic patch test, the strongest ICAM-1 staining was seen at the site of severe mononuclear cell infiltration. Furthermore, in the HLA-DR studies of keratinocytes, 8 of the 11 lichenplane biopsy specimens tested positive.

Az exanthemás és urticariás betegek bőrbiopsziás 15 mintáiban lévő keratinociták ICÁM -1 -expressziója kevésbé kifejezett. Az ebben a betegségben szenvedő hét beteg közül csak négynek a keratinocitái fejeztek ki ICÁM - 1-et a lézió helyén. Csak egy betegnél tapasztaltuk a HLA-DR expresszióját, és ez összefüggésben volt az ICÁM-1 -gyei.ICAM-1 expression of keratinocytes in skin biopsy samples of exanthemic and urticarial patients is less pronounced. Of the seven patients with this disease, only four had keratinocytes expressing ICAM-1 at the lesion site. Only one patient had HLA-DR expression and was associated with ICAM-1.

Minden vizsgált jóindulatú gyulladásos bőrbetegség esetében az endoteliális sejtek és az infiltrált mononukleáris sejtek egy része különböző mértékben fejezték ki az ICÁM-1-et.In all benign inflammatory skin conditions examined, some endothelial cells and infiltrated mononuclear cells expressed ICAM-1 to varying degrees.

XII. táblázatXII. spreadsheet

Az ICÁM-1 és a HLA-DR expressziója jóindulatú bőrbetegségek keratinocitáinExpression of ICAM-1 and HLA-DR on Keratinocytes of Benign Skin Diseases

Diagnózis Diagnosis Az esetek száma Number of cases Csak ICÁM-1 ICAM-1 only Csak HLA-DR HLA-DR only ICAM-1 és HLA-DR ICAM-1 and HLA-DR Allergiás kontakt ekcéma Allergic contact eczema 5 5 3^a 3 ^a 0 0 2 2 Lichen planus Lichen plans 11 11 3 3 0 0 8 8 Pemphigoid/pemphigus Pemphigoid / pemphigus 2 2 2 2 0 0 0 0 Exanthema exanthema 3 3 2 2 0 0 0 0 Urticaria urticaria 4 4 1 1 0 0 1 1

^a Pozitívnak tekintettük azokat a mintákat, amelyekben a keratinocitáknak legalább egy kis csoportja megfestődött.We ^were considered as positive samples with at least a small group of keratinocytes were stained.

24. példaExample 24

Az ICAM-1 expressziója pszoriázisos bőrléziók keratinocitáinExpression of ICAM-1 on keratinocytes of psoriatic skin lesions

Öt pszoriázisban szenvedő beteg bőrbiopsziás mintájában tanulmányoztuk az ICAM-1-expressziót a PUVA-kezelés megkezdése előtt és a kezelés alatt periodikusan (PUVA: a pszoriázis kombinált kezelése ultraibolya sugárzással és egy antracénszármazékkal). Szövettanilag bizonyított klasszikus pszoriázisban szenvedő öt betegből vettünk biopsziás mintát. A biopsziás mintákat egymást követően vettük a PUVA-kezelés előtt és a kezelés ideje alatt a megjelölt időpontokban. Az öt beteg esetében a biopsziás mintákat a pszoriázisos plakkok széléről vettük, és négy beteg esetén a klinikailag normális bőrből szintén vettünk biopsziás mintát.In a biopsy sample of five patients with psoriasis, ICAM-1 expression was studied periodically before and during treatment with PUVA (PUVA: combined treatment of psoriasis with ultraviolet radiation and an anthracene derivative). Biopsy samples were taken from five patients with histologically proven classical psoriasis. Biopsy specimens were collected sequentially before and during PUVA treatment at the indicated times. In five patients, biopsy specimens were taken from the edge of the psoriatic plaques, and in four patients biopsy specimens were also taken from clinically normal skin.

A friss biopsziás mintákat lefagyasztottuk és folyékony nitrogénben tároltuk. Hatmikronos kriosztátmetszeteket készítettünk, ezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten, levegőn szárítottuk, acetonnal 10 percig fixáltuk és vagy azonnal festettük, vagy alumíniumfóliába csomagolva -80 °C-on tartottuk a festésig.Fresh biopsy samples were frozen and stored in liquid nitrogen. Six micron cryostat sections were made, air-dried overnight at room temperature, fixed with acetone for 10 minutes, and either stained immediately or stored in aluminum foil at -80 ° C until staining.

A festést a következő módon végeztük: a metszeteket monoklonális antitestekkel inkubáltuk, és háromlépéses immunperoxidázos módszerrel festettük meg [H. Stein és munkatársai, Adv. Cancer Rés., 42, 67-147 (1984)], diamino-benzidin H₂O₂-szubsztrátumot alkalmazva. Az anti-ICAM-1- és a HLA-DR-festődés pozitív kontrolljaként tonzillát vagy nyirokcsomót használtunk. Negatív kontrollként a primer antitest távollétében megfestett szövetek szolgáltak.Staining was performed as follows: sections were incubated with monoclonal antibodies and stained by a three step immunperoxidase method [H. Stein et al., Adv. 42: 67-147 (1984)] using diaminobenzidine H ₂ O ₂ substrate. Tonsillas or lymph nodes were used as positive controls for anti-ICAM-1 and HLA-DR staining. Tissues stained in the absence of the primary antibody served as negative controls.

A HLA-DR elleni monoklonális antitestet a Becton-Dickinson cégtől (Mountainview, CA, USA) szereztük be. A monoklonális anti-ICAM-1 antitest az R6-5-D6 volt. A peroxidázzal konjugált nyúl antiegér lg és a peroxidázzal konjugált disznó antinyúl lg beszerzése a DAKAPATTS cégnél (Koppenhága, Dánia) történt. A diamino-benzidin-tetrahidrokloridot a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.The HLA-DR monoclonal antibody was obtained from Becton-Dickinson (Mountainview, CA, USA). The monoclonal anti-ICAM-1 antibody was R6-5-D6. Peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse Ig and peroxidase-conjugated porcine anti-rabbit Ig were purchased from DAKAPATTS (Copenhagen, Denmark). Diaminobenzidine tetrahydrochloride was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).

A vizsgálatok eredménye azt mutatta, hogy a beteg és a normál bőr néhány véredényének endoteliális sejtjei kifejeznek ICÁM-1-et, de az ICÁM-1-et kifejező véredények száma és a festődés intenzitása növekszik a pszoriázisos bőrléziókban. Ezenkívül öt nem kezelt beteg keratinocitáin az ICAM-1-expresszió képe a festődő sejtek kis csoportjától a sok megfestődött keratinocitáig változott. A PUVA-kezelés ideje alatt két betegThe results of the studies showed that endothelial cells of some blood vessels of the patient and normal skin express ICAM-1, but that the number of blood vessels expressing ICAM-1 and the intensity of staining increase in psoriatic skin lesions. In addition, the pattern of ICAM-1 expression on the keratinocytes of five untreated patients ranged from a small group of staining cells to many stained keratinocytes. Two patients were treated with PUVA

HU 217 792 Β esetében (2-es és 3-as beteg) az ICÁM-1-expresszió jelentős csökkenést mutatott, amely megelőzte vagy egybeesett a klinikai átmeneti javulással (remisszió) (XIII. táblázat). Az 1-es, 4-es és 5-ös betegnél csökkent, illetve növekedett az ICAM-1 kifejeződése a PUVA-kezelés alatt, összhangban a klinikai átmeneti javulással, illetve visszaeséssel. A PUVA-kezelés előtt vagy a kezelés után a normál bőr keratinocitáin nem volt ICAM-1-kifejeződés. Mindezek azt mutatják, hogy a PUVA nem indukált ICAM-1-expressziót a normál bőr keratinocitáinál.HU 217,792 Β (patients 2 and 3) showed a significant decrease in ICAM-1 expression, which preceded or coincided with the clinical improvement (remission) (Table XIII). Patients 1, 4, and 5 had decreased or increased ICAM-1 expression during PUVA treatment, consistent with a clinical improvement or relapse. Prior to or after PUVA treatment, normal skin keratinocytes did not have ICAM-1 expression. All of these indicate that PUVA did not induce ICAM-1 expression in normal skin keratinocytes.

Figyelemre méltó az a megfigyelés, hogy a mononukleáris sejtinfiltráció erőssége összefüggésben van a keratinocitákon megnyilvánuló ICAM-1 mennyiségével. Ez egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy a PUVAkezelés alatt a léziókban csökken a mononukleáris sejtek száma, ha az ICÁM-1 expressziója megszűnik, és megnövekszik a mononukleáris sejtek száma a PUVAkezelés alatt, ha a keratinocitákon az ICAM-1-expresszió emelkedettebb. Az endoteliális sejtek és a dermális mononukleáris sejtek szintén ICÁM -1-pozitívok. A klinikailag normál bőrben az ICÁM -1-kifejeződés az endoteliális sejtekre korlátozódik, és nincs kifejeződés a keratinocitákon.Remarkably, the strength of mononuclear cell infiltration is related to the amount of ICAM-1 expressed on keratinocytes. This is consistent with the observation that during PUVA treatment, the number of mononuclear cells in the lesions decreases when ICAM-1 expression is abolished and the number of mononuclear cells during PUVA treatment is increased when the expression of ICAM-1 on keratinocytes is increased. Endothelial cells and dermal mononuclear cells are also ICAM -1-positive. In clinically normal skin, ICAM-1 expression is restricted to endothelial cells and there is no expression on keratinocytes.

A HLA-DR expressziója a keratinocitákon különböző volt. Nem volt olyan HLA-DR-pozitív biopsziás minta, mely ne lett volna ICÁM- 1-pozitív.HLA-DR expression on keratinocytes was variable. There was no HLA-DR positive biopsy specimen that was not ICAM-1 positive.

Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kezelés előtt az ICAM-1-expresszió a keratinocitákon nyilvánul meg és összefügg a mononukleáris sejtbeszűrődés erősségével. A PUVA-kezelés alatt, a klinikai javulással párhuzamosan az ICÁM-1-festődés jelentős csökkenése észlelhető. A szövettani vizsgálatok szerint a dermális infiltrációk is csökkennek. Ha a kezelés alatt nyilvánvaló klinikai visszaesés tapasztalható, a keratinocitákon megnövekszik az ICÁM -1 expressziója, valamint a bőrinfiltráció erőssége is. Ha a kezelés alatt klinikai remisszió volt észlelhető, ezzel egyidejűleg csökkent a keratinocitákon az ICÁM-1-festődés, és ugyancsak csökkent a bőr beszűrődése. Tehát az ICÁM- 1-nek a keratinocitákon való kifejeződése megfelel a bőr mononukleáris sejtbeszűrődés-erősségének. Ezek az adatok a PUVA-kezelésre adott klinikai választ mutatják be, amely a keratinocitákon történő ICAM-1-expresszió csökkenésében és párhuzamosan a mononukleáris sejtek mérsékeltebb csökkenésében nyilvánul meg. Mindezek azt mutatják, hogy a keratinocitákon megnyilvánuló ICAM-1-expresszió felelős a bőrbeszűrődés beindulásáért és annak fenntartásáért, és hogy a PUVA-kezelés csökkenti az ICAM-1-expressziót, s ez pedig csökkenti a dermális infiltrációt és a gyulladásos reakciót.Taken together, these results indicate that ICAM-1 expression on keratinocytes prior to treatment is related to the potency of mononuclear cell infiltration. Significant reduction in ICAM-1 staining was observed during PUVA treatment, in parallel with clinical improvement. Histological studies also show that dermal infiltrations are reduced. If there is an obvious clinical relapse during treatment, the expression of ICAM-1 on the keratinocytes is increased as well as the intensity of skin infiltration. If clinical remission was observed during treatment, ICAM-1 staining on keratinocytes was simultaneously reduced and skin infiltration was also reduced. Thus, the expression of ICAM-1 on keratinocytes corresponds to the mononuclear cell infiltration strength of the skin. These data illustrate the clinical response to PUVA treatment, which is manifested by a decrease in the expression of ICAM-1 on keratinocytes and a parallel decrease in mononuclear cells. All of these indicate that the expression of ICAM-1 on keratinocytes is responsible for initiating and maintaining skin infiltration, and that PUVA treatment reduces ICAM-1 expression, which diminishes dermal infiltration and inflammatory response.

A pszoriázisos léziók keratinocitáin megnyilvánuló ICAM-1-expresszió összefüggésben van a lézió klinikai súlyosságával, valamint a bőrbeszűrődés nagyságával. Tehát az ICÁM-1 központi szerepet játszik a pszoriázisban, és kifejeződésének a gátlása és/vagy a CD 18 komplexszel való kölcsönhatásának a gátlása mononukleáris sejteken hatásos kezelési módja lesz ennek a betegségnek. Ezenkívül a keratinocitákon megnyilvánuló ICAM-1-expresszió ellenőrzése hatásos eszköze lesz a diagnózisnak és a prognózisnak, és eszköz lesz a pszoriázisterápia menetének a kiértékelésében.ICAM-1 expression on keratinocytes of psoriatic lesions is related to the clinical severity of the lesion and the extent of skin infiltration. Thus, ICAM-1 plays a central role in psoriasis, and inhibiting its expression and / or interactions with the CD18 complex on mononuclear cells will be an effective treatment for this disease. In addition, controlling the expression of ICAM-1 on keratinocytes will be an effective tool for diagnosis and prognosis and a tool for evaluating the course of psoriasis therapy.

XIII. táblázatXIII. spreadsheet

A keratinociták folyamatos ICAM-1-expressziója pszoriázisos bőrléziókban (PS) és klinikailag normál bőrben (N) PUVA-kezelés előtt és alattContinuous ICAM-1 expression of keratinocytes in psoriatic skin lesions (PS) and clinically normal skin (N) before and during PUVA treatment

A PUVAkezelés időtartama Duration of PUVA treatment A beteg száma Number of patient 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 PS PS PS PS N N PS PS N N PS PS N N PS PS N N 0 0 + + + + - - + + ++ - - + + ++ - - + + + +++ - - 1 nap One day + + 1 hét 1 week + + + + - - - - - - + + ++ - - + + - - 0 0 2 hét 2 weeks + + ++ + + - - + + - - + + - - 3 hét 3 weeks + + ++ X X 0 0 4 hét 4 weeks + + ++ + + - - - - - - + + ++ - - X X 5-6 hét 5-6 weeks - - X X - - - - - - X X - - 7 hét 7 weeks X X (++) (++) (+) (+) + + + +++ - - 10 hét 10 weeks (+) (+) - - - - X X - -

+ + + Sok pozitív kcratinocita + + Pozitív keratinociták + Gócos pozitív keratinociták (+) Igen kevés, elszórtan pozitív kcratinocita - Nincs pozitív festődés x Klinikai javulás (remisszió)+ + + Many positive squamous cells + + Positive keratinocytes + Concentrated positive squamous cells (+) Very few scattered positive squamous cells - No positive staining x Clinical improvement (remission)

O Klinikai visszaesésO Clinical relapse

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

25. példaExample 25

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója rosszindulatú bőrbetegségekbenExpression of ICAM-1 and HLA-DR in Malignant Skin Diseases

Eltérően a jóindulatú bőrbetegségektől, a rosszindulatú léziók keratinocitáin az ICAM-1 expressziója sokkal inkább változó (XIV. táblázat). A vizsgált 23 bőr Tsejtlimfóma (CTCL=cutaneous T-cell lymphoma) közül 14 esetben azonosítottunk ICAM-1-pozitív keratinocitát. A mycosis fungoides (MF) léziókból vett biopsziás minták keratinocitáin az ICAM-1-expresszió elvesztésének a tendenciája tapasztalható, ahogy a betegség az előrehaladottabb fázis felé halad. Azonban a legtöbb bőr T-sejtlimfómában a mononukleáris sejtinfiltrációval különböző mértékben arányos az ICAM-1 kifejeződése. A fennmaradó limfómákat vizsgálva nyolcból négyben találtunk olyan keratinocitákat, amelyek ICAM-l-et fejeznek ki. A vizsgált 29 rosszindulatú bőrbetegségben szenvedő beteg közül ötnek volt HLA-DR-kifejező keratinocitája, de ezek nem fejeztek ki ICÁM-1 -et (XIV. táblázat).Unlike benign skin diseases, expression of ICAM-1 is much more variable in keratinocytes of malignant lesions (Table XIV). ICAM-1-positive keratinocytes were identified in 14 of the 23 cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Keratinocytes from biopsy specimens from mycosis fungoides (MF) lesions show a tendency to lose ICAM-1 expression as the disease progresses to a more advanced phase. However, in most skin T-cell lymphomas, the expression of ICAM-1 is differentially proportional to mononuclear cell infiltration. Examining the remaining lymphomas, four out of eight found keratinocytes that express ICAM-1. Five of the 29 patients with malignant skin conditions examined had HLA-DR-expressing keratinocytes but did not express ICAM-1 (Table XIV).

XIV. táblázatXIV. spreadsheet

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója rosszindulatú bőrbetegségek keratinocitáinExpression of ICAM-1 and HLA-DR in Keratinocytes of Malignant Skin Diseases

Diagnózis Diagnosis Az esetek száma Number of cases Csak ICAM-1 ICAM-1 only Csak HLA-DR HLA-DR only ICAM-1 és HLA-DR ICAM-1 and HLA-DR CTCL, MFI CTCL, MFI 8 8 l^a l ^a 0 0 4 4 CTCL, MFII-III CTCL, MFII-III 10 10 1 1 2 2 4 4 CTCL, SS CTCL, SS 3 3 1 1 0 0 2 2 CTCL, nagy sejt CTCL, big cell 2 2 0 0 2 2 0 0 CBCL CBCL 2 2 0 0 0 0 1 1 Leukémia cutis Leukemia cutis 3 3 1 1 1 1 1 1 Histiocytosis X Histiocytosis X 1 1 0 0 0 0 0 0

^a Azokat a mintákat tekintettük pozitívnak, amelyekben legalább a keratinociták egy kis csoportja megfestődött. ^a Samples in which at least a small group of keratinocytes were stained were considered positive.

26. példaExample 26

Az anti-ICAM-1-antitestek hatása a humán perifériás vér mononukleáris sejtekproliferációjáraEffect of anti-ICAM-1 antibodies on human peripheral blood mononuclear cell proliferation

A humán perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a profilerációját antigének vagy mitogének jelenléte és 35 azok felismerése indukálja. Bizonyos molekulák, így a mitogén Concanavalin A vagy a T-sejtkötő OKT3 antitest a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek nem specifikus proliferációját okozzák.Profiling of human peripheral blood mononuclear cells is induced by the presence and recognition of antigens or mitogens. Certain molecules, such as the mitogenic Concanavalin A or the T-cell binding OKT3 antibody, cause non-specific proliferation of peripheral blood mononuclear cells.

A humán perifériás vér mononukleáris sejtjei hetero- 40 gének abból a szempontból, hogy olyan sejtek szubpopulációiból állnak, amelyek specifikus antigének felismerésére képesek. Ha egy perifériás mononukleáris sejt, amely képes egy sajátságos specifikus antigén felismerésére, találkozik az antigénnel, indukálódik a mono- 45 nukleáris sejtek szubpopulációinak profilerációja. Ilyen antigénekre példa a tetanusz toxoid és a kagylóhemocianin (keyhole limpet hemocyanin), ezeket a perifériás vér mononukleáris sejtek szubpopulációi felismerik, de szenzitizált egyénekben ezt nem minden perifériás mo- 50 nonukleáris sejt ismeri fel.Human peripheral blood mononuclear cells are heterogeneous in that they consist of subpopulations of cells capable of recognizing specific antigens. When a peripheral mononuclear cell capable of recognizing a specific antigen encounters the antigen, profiling of the subpopulations of mononuclear cells is induced. Examples of such antigens are tetanus toxoid and keyhole limpet hemocyanin, recognized by subpopulations of peripheral blood mononuclear cells, but not all peripheral mononuclear cells are recognized by sensitized individuals.

Vizsgáltuk az R6-5-D6 anti-ICAM-1 monoklonális antitestet, hogy gátolja-e a humán perifériás vér mononukleáris sejtek proliferációs válaszát olyan rendszerekben, amelyekről tudjuk, hogy sejt-sejt adhéziót 55 igényelnek.R6-5-D6 anti-ICAM-1 monoclonal antibody was tested to inhibit the proliferation response of human peripheral blood mononuclear cells in systems known to require cell-cell adhesion.

A perifériás vér mononukleáris sejteket Ficoll-Paque- (Pharmacia) gradiensben tisztítottuk az előállító cég előírásai szerint. A határfelület összegyűjtése után a sejteket háromszor mostuk RPMI 1640 ol- 60 dattal, majd lapos fenekű 96 tartályos mikrotitrálólemezeken tenyésztettük 10⁶ sejt/ml sűrűségig 10% fetális bovinszérummal, 2 mM glutaminnal és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI 1640 tápoldatban.Peripheral blood mononuclear cells were purified on a Ficoll-Paque (Pharmacia) gradient according to the manufacturer's protocol. After harvesting the interface, cells were washed three times with RPMI 1640, and cultured in flat bottom 96-well microtiter plates to a density of 10 ⁶ cells / ml in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 50 pg / ml gentamicin.

A fent leírt módon tenyésztett sejtekhez a következő antigéneket adtuk hozzá: T-sejt mitogén Concanavalin A (0,25 pg/ml); T-sejtkötő OK.T3 antitest (0,001 pg/ml); kagylóhemocianin (10 pg/ml); tetanusz toxoid (a kiindulási anyag 1:100 hígítása) R6-5-D6 anti-ICAM-1 antitest jelenlétében (5 μ g/ml végső koncentrációig) vagy enélkül. A sejteket 3,5 napig (ConAkísérlet), 2,5 napig (OKT3-kísérlet) vagy 5,5 napig (kagylóhemocianin- és tetanusztoxoid-kísérlet) tenyésztettük a kísérletek befejezése előtt.The following antigens were added to the cells cultured as described above: T-cell mitogen Concanavalin A (0.25 pg / ml); T-cell binding OK.T3 antibody (0.001 pg / ml); mussel hemocyanin (10 pg / ml); tetanus toxoid (1: 100 dilution of starting material) in the presence or absence of R6-5-D6 anti-ICAM-1 antibody (up to a final concentration of 5 μg / ml). Cells were cultured for 3.5 days (ConA experiment), 2.5 days (OKT3 experiment), or 5.5 days (mussel hemocyanin and tetanus toxoid experiment) before completion of the experiments.

A vizsgálat befejezése előtt 18 órával 2,5 pCi ³Htimidint adtunk a tenyészetekhez. A sejtek proliferációját a timidinnek a perifériás vér mononukleáris sejtek DNS-ébe való beépülése mérésével határoztuk meg. A beépült timidint folyadékszcintillációs számlálóval mértük [Merluzzi és munkatársai, J. Immunoi., 139, 166-168 (1987)]. A kísérletek eredményeit a 16. ábra (ConA-kísérlet), a 17. ábra (OK.T3-kísérlet), a 18. ábra (kagylóhemocianin-kísérlet) és a 19. ábra (tetanusztoxoid-kísérlet) mutatja be.Before completion of the study at 18 hours 2.5 uCi ³ Htimidint added to the cultures. Cell proliferation was determined by measuring the incorporation of thymidine into the DNA of peripheral blood mononuclear cells. Integrated thymidine was measured by liquid scintillation counting (Merluzzi et al., 1987, J. Immunol. 139, 166-168). The results of the experiments are shown in Fig. 16 (ConA experiment), Fig. 17 (OK.T3 experiment), Fig. 18 (mussel hemocyanin experiment) and Fig. 19 (tetanus toxoid experiment).

Azt találtuk, hogy mononukleáris sejtek esetében az anti-ICAM-1-antitest gátolja a ConA nem specifikus T-sejt mitogénre, az OK.T3 nem specifikus T-sejttel kapcsolatos antigénre és a specifikus antigénekre, így a kagylóhemocianinra és a tetanusz toxoidra adott proliferatív választ. Az anti-ICAM-1-antitest által kifej34We have found that in mononuclear cells, the anti-ICAM-1 antibody inhibits the proliferative effects of ConA on a non-specific T-cell mitogen, OK.T3 non-specific T-cell-associated antigen, and mammalian hemocyanin and tetanus toxoid. choose. Expressed by anti-ICAM-1 antibody34

HU 217 792 Β tett gátlás hasonlítható az anti-LFA-1 -antitest által kifejtett gátlással, melynek alapján feltételezhető, hogy az ICAM-1 funkcionális liganduma az LFA-1-nek és az ICÁM-1-nek ezen antagonista tulajdonsága gátolja a védekezőrendszer válaszait.Inhibition by the anti-LFA-1 antibody suggests that this antagonistic property of LFA-1 and ICAM-1 is inhibited by the protective ligand of ICAM-1 as a functional ligand of ICAM-1. .

27. példaExample 27

Az anti-ICAM-1 antitest hatása a kevert limfocitareakcióraEffect of anti-ICAM-1 antibody on mixed lymphocyte reaction

Amint azt a fentiekben tárgyaltuk, az ICÁM-1 az LFA-1-függő sejtadhéziók által közvetített immunválasz során a sejtek közötti hatékony kölcsönhatásához szükséges. Az immunválaszok vagy a gyulladásos betegségek során az ICAM-1 indukciója lehetővé teszi a leukocitáknak egymással és az endoteliális sejtekkel való kölcsönhatását.As discussed above, ICAM-1 is required for efficient cell-to-cell interaction in the immune response mediated by LFA-1-dependent cell adhesions. In immune responses or in inflammatory diseases, induction of ICAM-1 allows leukocytes to interact with each other and with endothelial cells.

Ha nem rokon egyének limfocitáit egymás jelenlétében tenyésztjük, blaszttranszformációt és a limfociták proliferációját figyelhetjük meg. Ez a válasz, vagyis egy limfocitapopuláció válasza egy másik populáció jelenlétére, kevert limfocitareakció (mixed lymphocyte reaction=MLR) néven ismert jelenség, és hasonló a limfocitáknak a mitogén hozzáadására fellépő reakciójához [Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, J. Klein, John Wiley and Sons, NY (1982), 453-458. oldal].When lymphocytes from unrelated individuals are cultured in the presence of each other, blast transformation and lymphocyte proliferation can be observed. This response, that is, the response of a lymphocyte population to the presence of another population, is known as mixed lymphocyte reaction (MLR) and is similar to the response of lymphocytes to the addition of mitogen (Immunology, J. Klein, John Wiley and Sons, NY (1982), 453-458. side].

Kísérleteket végeztünk, hogy meghatározzuk az anti-ICAM -1 monoklonális antitestek hatását a humán MLR-ra. A kísérleteket a következők szerint hajtottuk végre: normál, egészséges donoroktól vénapunkcióval perifériás vért vettünk le. A vért heparinos csövekbe vettük és szobahőmérsékleten 1:1 arányban hígítottuk Puck’s G (GIBCO) kiegyensúlyozott sóoldattal (BSS=balanced salt solution). A vérkeveréket (20 ml) 15 ml Ficoll/Hypaque sűrűséggradiensre (Pharmacia; sűrűség 1,078 szobahőmérsékleten) rétegeztük és 1000 g mellett 20 percig centrifugáltuk. A fázisok határfelületi részét összegyűjtöttük és háromszor mostuk Puck’s G-oldatban. A sejteket hemocitométerben számláltuk meg és ismét felszuszpendáltuk RPMI 1640 tápoldatban, amely 0,5% gentamicint, 1 mmol L-glutamint (Gibco) és 5% hővel inaktivált (56 °C, 30 perc) humán AB-szérumot (Flow Laboratories) tartalmazott. (Ezt az összetételt a következőkben RPMI-táptalajnak nevezzük.)Experiments were performed to determine the effect of anti-ICAM-1 monoclonal antibodies on human MLR. The experiments were performed as follows: peripheral blood was drawn from normal healthy donors by venipuncture. Blood was collected in heparin tubes and diluted 1: 1 at room temperature with Puck's G (GIBCO) balanced salt solution (BSS). The blood mixture (20 ml) was layered on a 15 ml Ficoll / Hypaque density gradient (Pharmacia; density 1.078 at room temperature) and centrifuged at 1000 g for 20 minutes. The interfacial portion of the phases was collected and washed three times in Puck's G solution. Cells were counted in a hemocytometer and resuspended in RPMI 1640 medium containing 0.5% gentamicin, 1 mmol L-glutamine (Gibco) and 5% heat inactivated (56 ° C, 30 min) human AB serum (Flow Laboratories). (This composition is hereinafter referred to as RPMI medium.)

Ezekben a kísérletekben egér anti-ICAM-1-et (R6-5-D6) használtunk. Minden monoklonális antitestet (ascites folyadékból állították elő a Jackson Immuno Research Laboratories cégnél, Boston, MA, USA) tisztított IgG-készítmény formájában használtunk.Mouse anti-ICAM-1 (R6-5-D6) was used in these experiments. All monoclonal antibodies (made from ascites fluid from Jackson Immuno Research Laboratories, Boston, MA, USA) were used in the form of a purified IgG preparation.

A perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC=peripheral blood mononuclear cell) Linbro-féle gömbölyű fenekű mikrotitrálólemezeken (76-013-05) tenyésztettük, 6,25 · 10⁵ sejt/ml sűrűségig. Egy másik donorból vett stimulátorsejteket 1000 R-nel sugároztuk be, és a válaszreakciót adó (responder) sejtekkel együtt tenyésztettük azonos sűrűségig. Az össztérfogat tenyészetenként 0,2 ml volt. A kontrollok csak respondersejteket, valamint csak stimulátorsejteket tartalmaztak. A tenyésztőlemezeket 37 °C-on 5% CO₂-tartalmú nedves levegőatmoszférában 5 napon át inkubáltuk. A tartályokat 0,5 pCi tríciumos timidinnel (³HT) (New England Nuclear) kezeltük a tenyésztés utolsó 18 órájában. Néhány esetben kétutas MLR-t végeztünk. Az eljárás azonos volt kivéve, hogy a második donor sejtjeit nem inaktiváltuk besugárzással.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC = peripheral blood mononuclear cell) (76-013-05) were cultured in Linbro round-bottomed microtiter 6.25 · 10 ⁵ cells / ml density. Stimulant cells from another donor were irradiated with 1000 R and co-cultured with the responder cells to the same density. The total volume per culture was 0.2 ml. Controls contained only responder cells and only stimulator cells. The culture plates were incubated at 37 ° C for 5 days in a humidified atmosphere of 5% CO ₂ . The wells were treated with 0.5 pCi of tritiated thymidine ( ³ HT) (New England Nuclear) for the last 18 hours of culture. In some cases, a two-way MLR was performed. The procedure was identical except that the cells of the second donor were not inactivated by irradiation.

A sejteket üvegszál szűrőkre gyűjtöttük egy többszörös automata mintagyűjtőt alkalmazva (Skatron, Norvégia), amelyet vízzel és metanollal öblítettünk. A szűrőket szárítószekrényben szárítottuk és Aquasolban, egy Beckman- (LS-3801) folyadékszcintillációs számlálóban mértük. Az eredményeket a 6 egyedi tenyészet átlaga cpm-értékében (± standard hiba) adjuk meg.Cells were harvested on glass fiber filters using a multiple automated sample collector (Skatron, Norway), which was rinsed with water and methanol. The filters were dried in an oven and measured in Aquasol on a Beckman (LS-3801) liquid scintillation counter. Results are expressed as the mean cpm (± standard error) of the 6 individual cultures.

A XV. táblázatból kitűnik, hogy a tisztított antiICAM-1 monoklonális antitestek gátolják az MLR-t dózistól függően, 20 ng/ml mellett már szignifikáns szupressziót okozva. Tisztított egér IgG-nek csekély az immunszupresszív hatása vagy nincs ilyen hatás. Az MLR szupressziója anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel akkor következik be, ha az antitestet a tenyészethez az első 24 órában adjuk (XVI. táblázat).In the XV. Table 1A shows that purified antiICAM-1 monoclonal antibodies inhibit MLR in a dose-dependent manner, causing significant suppression at 20 ng / ml. Purified mouse IgG has little or no immunosuppressive activity. Suppression of MLR by anti-ICAM-1 monoclonal antibody occurs when the antibody is added to the culture for the first 24 hours (Table XVI).

XV. táblázatXV. spreadsheet

Az anti-ICAM-1-antitest hatása az egyutas limfocitareakcióraEffect of anti-ICAM-1 antibody on one-way lymphocyte reaction

Válaszoló sejtek³ Responder cells ³ Stimulátorsejtek^b Stimulator cells ^b Antitest² Antibody ^{2 3}HT-bcépülés ³ HT-b building - - - - - - 445^d±143445 ^d ± 143 - - + + - - 148+17 148 + 17 + + - - - - 698+72 698 + 72 + + + + - - 42 626+1 579 42,626 + 1,579 + + + + mlgG (10,0 pg) mlgG (10.0 pg) 36 882+1 823 (14%) 36,882 + 1,823 (14%) + + + + mlgG (0,4 pg) mlgG (0.4 pg) 35 500+1 383 (17%) 35,500 + 1,383 (17%) + + + + mlgG (0,02 pg) mlgG (0.02 pg) 42 815+1 246 (0%) 42,815 + 1,246 (0%) + + + + R6-5-D6(10,0 pg) R6-5-D6 (10.0 pg) 8 250+520 (81%) 8250 + 520 (81%)

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

XV. táblázat (folytatás)XV. Table (continued)

Válaszoló sejtek³ Responder cells ³ Stimulátorsejtek^b Stimulator cells ^b Antitest⁰ Antibody ^{0 3}HT-beépülés ³ HT incorporation + + + + R6-5-D6 (0,4 pg) R6-5-D6 (0.4 pg) 16 142+858 (62%) 16,142 + 858 (62%) + + + + R6-5-D6 (0,03 pg) R6-5-D6 (0.03 pg) 28 844+1 780 (32%) 28,844 + 1,780 (32%)

³ Válaszoló sejtek (6,25 · 10⁵/ml). ^3. Responder cells (6.25 × 10 ⁵ / ml).

^b Stimulátorsejtek (6,25 10⁵/ml, 1000 R-al besugározva). ^b stimulator (6.25 10 ⁵ / ml and irradiated with 1000 R-sub).

^c ICAM-1 elleni tisztított monoklonális antitest (R6-5-D6) vagy tisztított egér IgG (mIgG=mouse IgG) végkoncentrációja (pg/ml) mellett. ^d 5-6 tenyésztés átlagértéke ± standard hiba, a zárójelben lévő számok az MLR gátlásának %-át jelentik. ^{c at a} final concentration (pg / ml) of purified monoclonal antibody to ICAM-1 (R6-5-D6) or purified mouse IgG (mIgG = mouse IgG). ^d Mean of 5-6 cultures ± standard error, numbers in parentheses represent% inhibition of MLR.

XVI. táblázatXVI. spreadsheet

Az anti-ICAM -1-adás idejeTime of anti-ICAM -1 transmission

R³ R ³ s^b s ^b Adagolás Dosage ³HT beépülés (cpm) ³ HT incorporation (cpm) 0. nap Day 0 1. nap One day 2. nap 2 days - - - - táptalaj broth 205^d±14205 ^d ± 14 476+132 476 + 132 247+75 247 + 75 - - + + táptalaj broth 189+16 189 + 16 na^e na ^e na So + + - - táptalaj broth 1 860+615 1860 + 615 na So na So + + + + táptalaj broth 41 063 +2 940 41,063 + 2,940 45 955+2 947 45,955 + 2,947 50 943+3 072 50,943 + 3,072 + + + + R6 5-D6 R6 5-D6 17781 + 1 293 17781 + 1293 38 409+1 681 38,409 + 1,681 47 308+2 089 47,308 + 2,089 (57%)^f (57%) ^f (16%) (16%) (7%) (7%)

³ Válaszoló sejtek (6,25 · 10⁵/ml). ^3. Responder cells (6.25 × 10 ⁵ / ml).

^b Stimulátorsejtek (6,25 10⁵/ml, 1000 R-al besugározva). ^b stimulator (6.25 10 ⁵ / ml and irradiated with 1000 R-sub).

^c Táptalaj vagy ICÁM -1 -gyei szembeni monoklonális antitest (R6- 5 - D6) 10 pg/ml, melyet a 0. napon és ezután 24 órás időközönként adagoltunk. ^d 4-6 tenyészet átlaga ± standard hiba. ^c na = nincs adagolás. ^c Monoclonal antibody to culture medium or ICAM-1 (R6-5-D6) at 10 pg / ml administered on day 0 and thereafter at 24 hour intervals. ^d Mean of 4-6 cultures ± standard error. ^c na = no dosing.

^f gátlás százaléka. ^f % inhibition.

Összefoglalva, az ICAM-1-gyei szembeni antitesteknek az MLR-re kifejtett gátló hatása azt mutatja, hogy az ICAM-1 monoklonális antitesteknek terápiás felhasználási lehetősége van az akut graftkilökődés megakadályozásában. Az ICAM-1 monoklonális antitesteknek egy másik terápiás felhasználása olyan immunológiai mediátorokkal összefüggő rendellenességekben van, amelyek az LFA-1/ICAM-1 által szabályozott sejt-sejt kölcsönhatásoktól függnek.In summary, the inhibitory effect of ICAM-1 antibodies on MLR indicates that ICAM-1 monoclonal antibodies have therapeutic potential for preventing acute graft rejection. Another therapeutic use of ICAM-1 monoclonal antibodies is in disorders involving immunological mediators that are dependent on LFA-1 / ICAM-1 regulated cell-cell interactions.

Az itt leírt kísérletek azt mutatják, hogy az ICÁM -1gyel szembeni monoklonális antitestek hozzáadása, ha a reakció első 24 órájában adagoljuk, gátolja a kevert limfocitareakciót (az MLR-t). Továbbá az ICAM-1 a humán perifériás vér monocitáin az in vitro tenyésztés során nagyobb mennyiségben képződik.The experiments described herein show that the addition of monoclonal antibodies to ICAM-1, when administered within the first 24 hours of the reaction, inhibits the mixed lymphocyte reaction (MLR). Furthermore, ICAM-1 is produced on human peripheral blood monocytes to a greater extent during in vitro culture.

Ezenkívül megállapítottuk, hogy az ICAM-1 nem fejeződik ki nyugvó humán perifériás vérlimfocitákon vagy -monocitákon. Az ICÁM-1 csak tenyésztett sejtek monocitáin vagy nem rokon donorsejtekkel együtt tenyésztett sejteken, egy kevert limfocitareakcióban képződik fokozott mértékben, amelyet hagyományos folyadékcitometriás analízissel állapítottunk meg. Az ICAM-1 ezen fokozott megjelenését a monocitákon fel lehet használni gyulladások indikátoraként, főként, ha az ICÁM -1 az akut vagy krónikus gyulladásos betegek friss monocitáin fejeződik ki.In addition, it was found that ICAM-1 is not expressed on resting human peripheral blood lymphocytes or monocytes. ICAM-1 is only enhanced on monocytes from cultured cells or cells co-cultured with unrelated donor cells in a mixed lymphocyte reaction as determined by conventional liquid cytometric analysis. This enhanced appearance of ICAM-1 on monocytes can be used as an indicator of inflammation, especially when ICAM-1 is expressed on fresh monocytes in patients with acute or chronic inflammation.

Az ICAM-1 specifitása és aktivált monocitákkal szembeni és az ICAM-1-gyei szembeni antitesteknek azon képessége, hogy az MLR-t gátolja, azt mutatja, hogy az ICÁM-1 monoklonális antitesteknek diagnosztikus és terápiás felhasználási lehetősége van a graftkilökődésben és olyan immunológiai mediátorokkal összefüggő zavarokban, amelyekben sejt-sejt kölcsönhatás lenne szükséges.The specificity of ICAM-1 and the ability of antibodies against activated monocytes and against ICAM-1 to inhibit MLR demonstrate the potential for diagnostic and therapeutic use of ICAM-1 monoclonal antibodies in graft rejection and in immunological mediators. related disorders in which cell-cell interaction would be required.

28. példaExample 28

Az anti-ICAM-1 - és anti-LFA-1-antitestek kombinált alkalmazásának szinergetikus hatásaSynergistic effect of combined use of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies

A 27. példában bemutattuk, hogy az antiICAM- 1-antitest gátolja az MLR-t. Az MLR-t az antiLFA-1-antitestek is képesek gátolni. Annak eldöntésére, hogy vajon az anti-ICAM-1- és anti-LFA-1-antitestek kombinált alkalmazása fokozott vagy szinergetikus hatást fejt-e ki, egy MLR-assay-t végeztünk (a 27. példában leírt módon) a két antitest különböző koncentrációinak a jelenlétében.Example 27 shows that the antiICAM-1 antibody inhibits MLR. MLR can also be inhibited by antiLFA-1 antibodies. To determine whether the combined use of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies exerted an enhanced or synergistic effect, an MLR assay (as described in Example 27) was performed on the different antibodies. concentrations.

Ezek az MLR-vizsgálatok azt mutatták, hogy az anti-ICAM-1- és anti-LFA-1-antitestek kombinációja olyan koncentrációkban, amelyekben egyik antitest sem gátolja jelentősen az MLR-t, szignifikánsan hatásosabb az MLR-válasz gátlásában (XVII. táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy azok a terápiás eljá36These MLR assays showed that the combination of anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 at concentrations where neither antibody significantly inhibits MLR is significantly more effective in inhibiting the MLR response (Table XVII). ). These results indicate that they are therapeutic

HU 217 792 Β rások, amelyekben kiegészítésül az anti-ICAM-1 -antitest - vagy egy fragmentuma - és az anti-LFA-1-antitest - vagy egy fragmentuma - együttes alkalmazása szerepel, olyan hatásúak, hogy előnyösebb gyulladás elleni terápiát tesznek lehetővé. Egy ilyen tökéletesített terápiában az antitesteket kisebb adagokban alkalmazhatjuk, mint amilyenek egyébként terápiásán hatásosak lennének, és olyan körülmények közt van ennek jelentősége, amikor az egyes antitestek magas koncentrációi antiidiotípusos választ indukálnának.The combination of anti-ICAM-1 antibody, or a fragment thereof, and an anti-LFA-1 antibody, or a fragment thereof, in combination, are such that they provide a more effective anti-inflammatory therapy. In such an advanced therapy, the antibodies may be administered at lower doses than would otherwise be therapeutically effective, and this is important in circumstances where high concentrations of each antibody induce an anti-idiotypic response.

XVII. táblázatXVII. spreadsheet

Az anti-ICAM-1 és az (R3.1) anti-LFA-1 különböző adagjainak a hatása a kevert limfocitareakcióraEffect of different doses of anti-ICAM-1 and (R3.1) anti-LFA-1 on mixed lymphocyte reaction

Koncentráció (pg/ml) Concentration (Pg / ml) Gátlás (%) Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) Inhibition (%) Anti-ICAM-1 (R6-5-D6) Anti-LFA-1 Anti-LFA-1 0 0 0,004 0,004 0,02 0.02 0,1 0.1 0,5 0.5 2,5 2.5 0,0 0.0 0 0 7 7 31 31 54 54 69 69 70 70 0,0008 0.0008 1 1 7 7 28 28 48 48 62 62 71 71 0,004 0,004 0 0 13 13 30 30 50 50 64 64 72 72 0,02 0.02 29 29 38 38 64 64 75 75 84 84 86 86 0,1 0.1 92,5 92.5 90 90 91 91 92 92 92 92 92 92 0,5 0.5 93 93 90 90 90 90 92 92 93 93 91 91

29. példaExample 29

Az anti-ICAM-1 szuboptimális dózisainak más immunszupresszív szerekkel kombinált alkalmazásával járó additív hatások MLR-benAdditive effects of sub-optimal doses of anti-ICAM-1 in combination with other immunosuppressive agents in MLR

A 28. példában bemutattuk, hogy az MLR-t az antiICAM-1- és anti-LFA-1-antitestek kombinációja gátolja. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, vajon az anti-ICAM-1 alkalmazása más immunszupresszív hatóanyagokkal (ilyen a dexametazon, azatioprin, ciklosporin A vagy a szteroidok, mint például a prednizon stb.) kombinálva ugyancsak hatásfokozódással jár-e. Ezért MLR-vizsgálatokat végeztünk az R6-5-D6-nak szuboptimális koncentrációival (azaz olyan koncentrációkkal, amelyek annál az optimális koncentrációnál kisebbek, mint amivel a beteg kizárólag a hatóanyagot kapná meg) és más immunszupresszív szereknek együttes alkalmazásával a 27. példa szerinti adatok alapján.Example 28 shows that MLR is inhibited by a combination of antiICAM-1 and anti-LFA-1 antibodies. In order to determine whether the use of anti-ICAM-1 in combination with other immunosuppressive agents (such as dexamethasone, azathioprine, cyclosporin A, or steroids such as prednisone, etc.) also results in an enhancement. Therefore, MLR assays were performed with suboptimal concentrations of R6-5-D6 (i.e., concentrations below the optimal concentration the patient would receive alone) and other immunosuppressive agents based on the data of Example 27. .

Az adatok azt mutatják, hogy az R6-5-D6 gátló hatása legalábbis additív a dexametazon (XVIII. táblázat), az azatioprin (XIX. táblázat) és ciklosporin A (XX. táblázat) szuboptimális dózisainak gátló hatásához. Ebből következik, hogy az anti-ICAM-1-antitestek hatékonyan csökkenthetik az ismert immunszupresszív szerek szükséges dózisait, és így ezek toxikus mellékhatásait csökkenthetik. Egy anti-ICAM-1-antitest (vagy fragmentuma) használatakor ahhoz, hogy elérjünk ilyen immunszupressziót, lehetőség nyílik az antitestet (vagy fragmentumát) akár egyetlen további immunszupresszív szerrel, akár egynél több további immunszupresszív szer kombinációjával együttesen alkalmazni.The data show that the inhibitory effect of R6-5-D6 is at least additive to the inhibitory effect of the suboptimal doses of dexamethasone (Table XVIII), azathioprine (Table XIX) and cyclosporin A (Table XX). It follows that anti-ICAM-1 antibodies can effectively reduce the required doses of known immunosuppressive agents and thus reduce their toxic side effects. When using an anti-ICAM-1 antibody (or fragment thereof) to achieve such immunosuppression, it is possible to use the antibody (or fragment thereof) in combination with one additional immunosuppressive agent or in combination with more than one additional immunosuppressive agent.

XVIII. táblázatXVIII. spreadsheet

Az anti-ICAM-1 és a dexametazon hatása humán MLR-benEffect of anti-ICAM-1 and dexamethasone in human MLR

Csoport Group Inhibitor (pg/ml) Inhibitor (pg / ml) ³HT-bccpülés (cptn) ³ HT bcc flight (cptn) Gátlás (%) Inhibition (%) Közeg Medium - - 156 156 - - Stimulátorok (S) Stimulators (S) - - 101 101 - - Responderek (R) Responders (R) - - 4 461 4,461 - - RxS RXS - - 34 199 34 199 - - RxS RXS R6-5-D6 (8) R6-5-D6 (8) 26 224 26,224 23 23 RxS RXS Dex (50) Dex (50) 14 158 14,158 59 59 RxS RXS R6-5-D6 (8) + Dex (50) R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7 759 7,759 77 77

Dex: dexametazonDex: dexamethasone

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

XIX. táblázatXIX. spreadsheet

Az anti-ICAM -1 és az azatioprin hatása humán MLR-benEffect of anti-ICAM-1 and azathioprine on human MLR

Csoport Group Inhibitor (pg/ml) Inhibitor (pg / ml) ³HT-beépülés (cpm) ³ HT incorporation (cpm) Gátlás (%) Inhibition (%) Közeg Medium - - 87 87 - - Stimulátor (S) Stimulator (S) - - 206 206 - - Responder (R) Responder (R) - - 987 987 - - RxS RXS - - 31 640 31,640 - - RxS RXS R6-5-D6 (8) R6-5-D6 (8) 26 282 26,282 17 17 RxS RXS CyA (10) CyA (10) 23 617 23,617 25 25 RxS RXS R6-5-D6 (8) + CyA (10) R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19 204 19,204 39 39

CyA: ciklosporin ACyA: Cyclosporin A

30. példaExample 30

Az anti-ICAM-1-antitest hatása a transzplantált allogén szervek kilökődésének szupresszálásábanEffect of anti-ICAM-1 antibody on suppressing rejection of transplanted allogeneic organs

Annak érdekében, hogy bemutassuk az antiICAM-1-antitest hatását egy allogén átültetett szerv kilökődésének a szupresszálásában, Cynomolgus majmokba allogén veséket ültettünk át Cosimi és munkatársai [Transplant. Proc., 73, 499-503 (1981)] módszere szerint azzal a módosítással, hogy az anesztéziához váliumot és ketamint használtunk.In order to demonstrate the effect of anti-ICAM-1 antibody on suppressing the rejection of an allogeneic transplant, allogeneic kidneys were transplanted into Cynomolgus monkeys by Cosimi et al., Transplant. Proc., 73, 499-503 (1981)], with the modification that palladium and ketamine were used for anesthesia.

Vagyis a veseátültetést lényegében a következőképpen végeztük. Heterotróp veseallograftokat ültettünk be 3-5 kg-os Cynomolgus majmokba, lényegében Marquet és munkatársai [Medical Primatology, II. rész, Karger, Basel, 125. oldal (1972)] leírása alapján az anesztéziát váliummal és ketaminnal végezve. A donor veseereket vég az oldalhoz anasztomózissal az aorta vagy véna cava oldalába száj áztattuk 7-0 Prolene-varrattal. A donor urétert elvágtuk, és a hólyagba extravizikális megoldással implantáltuk [Y. Taguchi és munkatársai, Advances in Transplantation, szerkesztő: Dausset és munkatársai, Williams & Wilkins, Baltimore, 393. oldal (1968)]. A vesefunkciót hetenként vagy kéthetenként értékeltük szérumkreatinin-meghatározásokkal. Ezenkívül rendszeresen vettünk allograft biopsziás mintákat hisztopatológiás vizsgálatok céljára, és minden nem túlélő egyed esetében teljes autopsziát végeztünk. A legtöbb recipiensben kétoldali nefrektómiát végeztünk a transzplantáció időpontjában, és az ezt követő urémiás halált tekintettük az allograft túlélése végpontjának. Néhány recipiens esetében unilaterális natív nefrektómiát és ellenkező oldali uréteres összeköttetést létesítettünk a transzplantációval egy időben. Ha az allograftkilökődés bekövetkezett, az autológ uréterkötést eltávolítottuk, ezzel a normál vesefunkciót helyreállítottuk, és megteremtettük annak lehetőségét, hogy a recipiens állat immunológiai megfigyelését folytathassuk.In other words, the kidney transplantation was done essentially as follows. Heterotropic kidney log grafts were implanted into 3-5 kg Cynomolgus monkeys, essentially Marquet et al., Medical Primatology, II. (Karger, Basel, page 125, 1972)] with anesthesia with pallium and ketamine. Donor kidneys were end-sided with anastomosis in the mouth of the aorta or vein cava with 7-0 Prolene suture. The donor ureter was dissected and implanted into the bladder by extravasation [Y. Taguchi et al., Advances in Transplantation, edited by Dausset et al., Williams & Wilkins, Baltimore, p. 393 (1968)]. Renal function was assessed weekly or biweekly by serum creatinine determinations. In addition, allograft biopsy specimens were routinely collected for histopathological examination and complete necropsy was performed on each non-surviving individual. Most recipients underwent bilateral nephrectomy at the time of transplantation and subsequent uremic death was considered the end point of allograft survival. In some recipients, unilateral native nephrectomy and anterior ureteral connection were established at the time of transplantation. When allograft rejection occurred, autologous ureter binding was removed, thereby restoring normal renal function and allowing the recipient animal to continue immunoassay.

Az R6-5-D6 monoklonális antitestet naponta adtuk 12 napon át a transzplantáció előtt két nappal elkezdvén 1-2 mg/kg/nap adagokban. A szérumkreatinin-szintet időszakonként mértük a kilökődés ellenőrzése céljából. Az anti-ICAM- 1-antitestnek az allogén vese immunrendszer okozta kilökődésére gyakorolt hatását a XXI. táblázat mutatja be.Monoclonal antibody R6-5-D6 was administered daily for 12 days prior to transplantation at doses of 1-2 mg / kg / day. Serum creatinine levels were periodically measured to control rejection. The effect of anti-ICAM-1 antibody on immune rejection by the allogeneic kidney is shown in Table XXI. Table.

XXI. táblázatXXI. spreadsheet

Az R6-5-D6 hatása a veseallograft-túlélés meghosszabbítására Cynomolgus majmokon végzett profilaktikus eljárásban³ Effect of R6-5-D6 on Prolongation of Kidney Logography Survival in Cynomolgus Monkey Prophylaxis ³

Majom Monkey R6-5-D6 dózis (mg/kg) Dose R6-5-D6 (mg / kg) Túlélési/utókezelési napok Survival / follow-up days Kontroll 1 Controls - - 8 8 Kontroll 2 Controls - - 11 11 Kontroll 3 Checks 3 - - 11 11 Kontroll 4 Checks 4 - - 10 10 Kontroll 5 Checks 5 - - 9 9 Kontroll 6 Controls - - 10 10 M15 M15 1,0 1.0 20 20 M19 M19 1,0 1.0 7» 7 » M17 M17 1,0 1.0 30 30 M25 M25 1,5 1.5 29 29 M23 M23 1,0 1.0 1E 1E M27 M27 2,0 2.0 34 34 M7 M7 0,5 0.5 22 22 MII MII 0,5 0.5 26 26 M10 M10 0,5 0.5 22 22 M8 M8 0,5 0.5 26^d 26 ^d

^a A majmoknak 12 egymást követő napon R6 - 5 - D6-ot adtunk. A dozírozást a transzplantáció előtti 2. napon kezdtük meg. ^b A halál oka ismeretlen. Latens maláriára utaló leletet kaptunk. ^a The monkeys were given R6 - 5 - D6 for 12 consecutive days. Dosing was started on day 2 before transplantation. ^b The cause of death is unknown. We found a finding of latent malaria.

^c A halál oka vescinfarktus. ^d 1988. augusztus 15-én meg él. ^c Causes of death from vesicular infarction. ^d She lives on August 15, 1988.

Az eredmények szerint az R6-5-D6 hatékonyan meghosszabbította azoknak a majmoknak az életben maradását, amelyek allogén transzplantált vesét kaptak.The results showed that R6-5-D6 effectively prolonged the survival of monkeys that received an allogeneic kidney transplant.

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

31. példaExample 31

Az anti-ICAM— 1 antitest hatása a transzplantált szervek akut kilökődésének szupresszálásábanEffect of anti-ICAM-1 antibody on suppressing acute rejection of transplanted organs

Annak bemutatása érdekében, hogy az antiICAM-1-antitest egy transzplantátumkilökődés akut modelljében mennyire hatékony, vizsgáltuk az R6-5-D6 hatását egy terápiás vagy egy akut kilökődési modellben. Ebben a modellkísérletben majomveséket transzplantáltunk (a 30. példában leírt eljárást alkalmazva), és az operáció körül 15 mg/kg ciklosporin A-t (CyA) adagoltunk imm., amíg helyre nem állt a stabil veseműködés. A CyA dózisát ezután kéthetenként 2,5 mg/kg adaggal csökkentettük, amíg meg nem történt a kilökődés, amelyet a vér kreatininszintjének a növekedése jelzett. Ettől az időponttól R6-5-D6-ot adagoltunk 10 napon át, és a túlélés időtartamát figyeltük. Fontos megjegyezni, hogy ebben az eljárásban a CyA dózisa szuboptimális maradt, mivel nem változtattuk meg, amikor az akut kilökődés eredménye megtörtént. Ebben a modellben az antitest segítsége nélküli kontrollok (n=5) 5-14 nappal élték túl a kilökődés beindulását. Az eljárásban a mai napig hat állatot teszteltünk R6-5-D6 használatával (XXII. táblázat). Az állatok közül kettő még él (az R6-5-D6 alkalmazását követően az M12 állat 31 napja és az M5 állat 47 napja él). Két állat 38, illetve 55 napig élt az R6-5-D6-terápia elkezdése után, és két állat pusztulását nem az akut kilökődés okozta, hanem más (az egyik halálát a CyA toxicitása okozta, a másik halála azért következett be, mivel az R6-5-D6-ot az anesztézia alatt kapta). Ez a modell inkább közelíti azt a klinikai szituációt, amelyben az R6-5-D6 használatát el lehetne kezdeni.To demonstrate the efficacy of the antiICAM-1 antibody in an acute model of transplant rejection, the effect of R6-5-D6 in a therapeutic or acute rejection model was investigated. In this model experiment, monkey kidneys were transplanted (using the procedure described in Example 30) and 15 mg / kg of cyclosporin A (CyA) was administered immuno-operatively until stable renal function was restored. The dose of CyA was then reduced by 2.5 mg / kg every two weeks until rejection was indicated by an increase in blood creatinine. From this time, R6-5-D6 was administered for 10 days and the survival time was monitored. It is important to note that in this procedure, the dose of CyA remained suboptimal because it was not changed when the acute rejection occurred. In this model, controls without antibody (n = 5) survived the onset of rejection by 5-14 days. To date, six animals have been tested using R6-5-D6 (Table XXII). Two of the animals are still alive (31 days for M12 and 47 days for M5 after R6-5-D6). Two animals survived for 38 and 55 days after initiation of R6-5-D6 therapy, and two animals died other than acute rejection (one death due to CyA toxicity and the other due to R6-5-D6 toxicity). -5-D6 during anesthesia). This model more closely approximates the clinical situation in which R6-5-D6 could be started.

XXII. táblázatXXII. spreadsheet

Az R6-5-D6 hatása a veseallograft-túlélés meghosszabbítására Cynomolgus majmokon végzett terápiás kísérletekben⁴ Effect of R6-5-D6 on Prolongation of Kidney Logography Survival in Therapeutic Experiments on Cynomolgus Monkeys ⁴

Majom Monkey A kilökődési esemény napja^b Day of Rejection Event ^b Túlélési/utókezelési napok Survival / follow-up days Kontrollok^c Controls ^c 14-98 14-98 5-14 5-14 M24 M24 41 41 38 38 M21 M21 34 34 ₄d _4th M3 M3 41 41 55 55 M9 M9 12 12 11' 11 ' M12 M12 37 37 >31^f > 31 ^f M5 M5 26 26 >47^f > 47 ^f

^a A majmok 1 - 2 mg/kg R6 5- D6-ot kaptak a kilökődés megindulását követően 10 napon át. ^a The monkeys received 1 to 2 mg / kg of R6 5-D6 for 10 days after the onset of rejection.

^b Az a nap, amikor a kreatininszintek megnőttek a CyA-adagok csökkentése következtében, és amikor az R6-5-D6-terápia elkezdődött. ^c Öt állatot teszteltünk a fent leírt terápiás eljárást használva kivéve, hogy nem kaptak segítő terápiát. A túlélési/utókezelésí napok a kreatininszint emelkedésének kezdete utáni túlélési napokat jelentik. ^b The day when creatinine levels increased due to lowering of CyA doses and when R6-5-D6 therapy started. ^c Five animals were tested using the therapeutic procedure described above, except for no assistive therapy. Survival / follow-up days refer to survival days after the onset of creatinine elevation.

⁴ Anesztézia alatt pusztult el. A kreatininszint alacsony volt. ^e CyA toxicitása miatt pusztult el. A keratininszint alacsony volt. ⁴ He died during anesthesia. Creatinine levels were low. ^e died due to the toxicity of CyA. Keratin levels were low.

¹ 1988. augusztus 15-cn még mindig élt. ¹ He was still alive on August 15, 1988.

32. példaExample 32

Az ICAM-1 csonkított származékainak genetikai szerkezete és kifejeződéseGenetic structure and expression of truncated derivatives of ICAM-1

Természetes állapotában az ICÁM-1 egy membránhoz kötött protein, amely egy 5 immunglobulinszerű doménből álló extracelluláris szakaszt, egy transzmembrán domént és egy citoplazmatikus domént tartalmaz. Kívánatos volt olyan ICAM-1 funkcionális származékokat szerkeszteni, amelyekben nincs transzmembrán dómén és/vagy a citoplazmatikus dómén, hogy az ICÁM-1-ből egy szolubilis, szekretált forma képződhessen. Ezeket a funkcionális származékokat az ICAM-1-gén oligonukleotidra irányuló mutagenezisével szerkesztettünk meg, majd ezt követte a mutáns génekkel transzficiált majomsejtekben való kifejeződés.In its natural state, ICAM-1 is a membrane-bound protein comprising an extracellular region of 5 immunoglobulin-like domains, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain. It was desirable to construct functional derivatives of ICAM-1 that do not have a transmembrane domain and / or a cytoplasmic domain to form a soluble, secreted form of ICAM-1. These functional derivatives were constructed by oligonucleotide mutagenesis of the ICAM-1 gene, followed by expression in the monkey cells transfected with the mutant genes.

Az ICÁM-1-génben aminosavszubsztitúciókat eredményező mutációkat és/vagy csonkított származékokat T. Kunkel [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] módszerével hoztunk létre. A fentiekben leírt módon előállított ICÁM -1 cDNS-t Sáli és KpnI restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és a kapott 1,8 kb DNS-fragmentumot a CDM8 plazmidvektorba [B. Seed és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)] szubklónoztuk. Az E. coli (BW313/P3) egy dut , ung’ törzsét [T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] ezzel a szerkezettel transzformáltuk, melyet pCD1.8C elnevezéssel láttunk el. Az R408 (Stratagene^R) helperfággal való fertőzés segítségével egy egyszálú uraciltartalmú templátot szabadítottunk fel a transzformált sejtekből. Az ICAM-1 cDNSmutánsokat ezután úgy állítottuk elő, hogy egy második szál szintézisét indítottuk be egy hibásan illeszkedő bázisokat tartalmazó oligonukleotiddal, majd ezután egy ung⁺ gazdasejtet (MC1061/P3) [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] a kapott heteroduplexszel transzformáltunk. A mutánsokat úgy izoláltuk, hogy a mutáns oligonukleotid révén bevitt, újonnan keletkezett endonukleáz restrikciós helyekre nézve végeztünk szűrővizsgálatot. A CDM8 eukarióta expressziós vektorban (Invitrogén, V308-20) lévő mutáns DNS-sel transzficiált COS-7 (ATCC CRL 1651) sejtek - standard DEAE-dextráneljárást alkalmaztunk - fejezték ki a mutáns ICAM-1-proteint [R. F. Selden és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, szerkesztő: F. M. Ausubel és munkatársai, 9.2.1-9.2.6. oldal (1987)].Mutations and / or truncated derivatives resulting in amino acid substitutions in the ICAM-1 gene are described by T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)]. The ICAM-1 cDNA prepared as described above was digested with SalI and KpnI restriction endonucleases and the resulting 1.8 kb DNA fragment was inserted into the plasmid vector CDM8 [B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)]. A dut, ung 'strain of E. coli (BW313 / P3) [T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] with this construct, designated pCD1.8C. A single-stranded uracil-containing template was released from transformed cells by infection with helper phage R408 (Stratagene ^R ). ICAM-1 cDNA mutants were then prepared by initiating the synthesis of a second strand with an oligonucleotide containing mismatched bases followed by an ung ⁺ host cell (MC1061 / P3) [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] were transformed with the resulting heteroduplex. Mutants were isolated by screening for newly generated endonuclease restriction sites introduced by the mutant oligonucleotide. COS-7 (ATCC CRL 1651) cells transfected with mutant DNA in the CDM8 eukaryotic expression vector (Invitrogen, V308-20) expressed the mutant ICAM-1 protein by standard DEAE dextran procedure [RF Selden et al., Current Protocols in Molecular Biology, edited by FM Ausubel et al., 9.2.1-9.2.6. (1987).

Előállítottuk az ICAM-1 egy olyan csonkított funkcionális származékát, amely nem tartalmazta a transzmembrán és citoplazmatikus doméneket, de tartalmazta az 5 immunglobulinszerű domént magában foglaló extracelluláris szakaszt. Egy 30 bp mutáns oligonukleotidot (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) használtunk arra, hogy a 452., illetve 453. pozícióban lévő tirozin- (Y) és glutaminsav- (E) kodonokat egy fenil-alanin- (F) kodonná és egy transzlációs stopkodonná (TAG) transzformáljuk. A mutáns, amelyet egyetlen Xbal restrikciós helye révén izoláltunk, Y⁴⁵²E/F,TAG elnevezést kapott.A truncated functional derivative of ICAM-1 was prepared that did not contain the transmembrane and cytoplasmic domains, but contained an extracellular region comprising 5 immunoglobulin-like domains. A 30 bp mutant oligonucleotide (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) was used to position the tyrosine (Y) and glutamic acid (E) codons at positions 452 and 453 with a phenylalanine (F) codon and a translation stop codon (TAG). The mutant isolated by a single Xba I restriction site was designated Y ⁴⁵² E / F, TAG.

A mutáns protein kifejezése céljából COS-sejteket transzficizáltunk 3 mutáns szubklónnal (#2, #7 és #8).To express the mutant protein, COS cells were transfected with 3 mutant subclones (# 2, # 7 and # 8).

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

A három mutáns szubklónnal való transzfekció után 3 nappal a tenyészet-felülúszókat és a sejtlizátumokat RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel való immunprecipitációval és SDS-PAGE-módszerrel analizáltuk. Az ICÁM- 1-et a #2 és #8 mutáns szubklónnal transzficiált sejtek tenyészeteinek felülúszójából precipitáltuk, de nem e sejtek detergens lizátumából. A tény észet-felülúszóban talált ICAM-1 molekulatömege körülbelül 6 kD-ra csökkent az ICAM-1 membrán formájához viszonyítva, amely egybevág a mutáns DNS előre látott méretével. Azaz az ICAM-1 ezen funkcionális származéka szolubilis proteinként szekretálódik. Ezzel szemben a natív ICAM-l-gyel transzficiált sejttenyészetek felülúszójából ICAM-1 nem volt immunprecipitálható, ami azt jelenti, hogy a COS-sejtek nem bocsátják ki az ICÁM -1 membrán formáját. Ezenfelül sem a negatív kontroll áltranszficiált sejtek tenyészetének felülúszóiból, sem a sejtlizátumaiból nem volt immunprecipitálható az ICÁM -1.Three days after transfection with the three mutant subclones, culture supernatants and cell lysates were analyzed by immunoprecipitation with RR1 / 1 anti-ICAM-1 monoclonal antibody and SDS-PAGE. ICAM-1 was precipitated from the supernatant of cultures of cells transfected with mutant subclones # 2 and # 8, but not from detergent lysates of these cells. In fact, the molecular weight of ICAM-1 found in the supernatant supernatant was reduced to about 6 kDa relative to the membrane form of ICAM-1, which is consistent with the predicted size of the mutant DNA. That is, this functional derivative of ICAM-1 is secreted as a soluble protein. In contrast, ICAM-1 was not immunoprecipitated from supernatant of cell cultures transfected with native ICAM-1, which means that COS cells do not release the ICAM-1 membrane form. In addition, neither the supernatants nor the cell lysates from the culture of the negative control mock-transfected cells were immunoprecipitated with ICAM-1.

A transzformált sejtek által szekretált csonka ICÁM-1-et immunaffinitás-kromatográfiával - egy specifikus antitestet (R6-5-D6) használva - tisztítottuk, és funkcionális aktivitását egy sejtkötő assay-ben teszteltük. Oktil-glükozid-detergens jelenlétében való tisztítás után a natív vagy a csonka, szekretált formájú ICÁM - 1-et tartalmazó készítményeket úgy hígítottuk, hogy az oktilglükozid végső koncentrációja 0,25% legyen (ez a koncentráció a detergens kritikus micellakoncentrációja alatt van). Hagytuk, hogy ezen ICAM-1-készítmények a 96 tartályos műanyag lemez (Nunc) felszínére kötődjenek, s így szilárd fázishoz kötött ICÁM-1 keletkezett. A kötetlen anyag kimosása után az SKW-3 sejteknek - felületükön LFA-l-et hordoznak - 75-80%-a kötődött az ICAM-1 natív, illetve 83-88%-a kötődött az ICAM-1 csonkított formájához specifikusan. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a szekretált, csonkított, szolubilis ICÁM-1 funkcionális származék megtartotta mind immunológiai reaktivitását, mind azon képességét, hogy közvetítse az ICÁM-1-függő adhéziót, amely a natív ICAM-1 jellemzője.The truncated ICAM-1 secreted by the transformed cells was purified by immunoaffinity chromatography using a specific antibody (R6-5-D6) and tested for functional activity in a cell binding assay. After purification in the presence of octyl glucoside detergent, formulations containing native or truncated secreted form ICAM-1 were diluted to give a final concentration of octyl glucoside of 0.25% (this concentration is below the critical micellar concentration of the detergent). These ICAM-1 preparations were allowed to bind to the surface of a 96-well plastic plate (Nunc) to form ICAM-1 bound to a solid phase. After washing the unbound material, 75-80% of the SKW-3 cells, carrying LFA-1 on their surface, bound to the native form of ICAM-1 and 83-88% bound specifically to the truncated form of ICAM-1. These data indicate that the secreted, truncated, soluble ICAM-1 functional derivative retained both its immunological reactivity and its ability to mediate ICAM-1-dependent adhesion, a feature of native ICAM-1.

Hasonló módon állítottuk elő az ICAM-1 egy olyan funkcionális származékát, amelyből csak a citoplazmatikus dómén hiányzott. Egy 25 bp oligonukleotidot (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) használtunk arra, hogy a 476-os aminosav (Y) kodonját egy TAG transzlációs stopkodonná változtassuk. A mutáns Y⁴⁷⁶/TAG elnevezést kapott. A mutánssal transzficiált COS-sejtek immunprecipitációs és SDS-PAGE-vizsgálatával az ICAM-1 egy olyan membránhoz kötött formáját mutattuk ki, amelynek a molekulatömege 3 kD-nal kevesebb, mint a natív ICAM-1 molekulatömege. A mutánstranszficiált COS-sejtek indirekt immunfluoreszcenciás vizsgálata pettyezett festődési képet adott, hasonlót, mint amikor a natív ICAM-1 LPS-sel stimulált endoteliális sejteken fejeződik ki. Végül a mutáns DNS-sel transzficiált sejtek hasonló módon specifikusan kötődnek a műanyag felületen lévő tisztított LFA- 1-hez, mint a natív ICAM-1 DNS-sel transzficiált COS-sejtek (XXIII. táblázat).Similarly, a functional derivative of ICAM-1 lacking only the cytoplasmic domain was prepared. A 25 bp oligonucleotide (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) was used to convert the 476 amino acid (Y) codon to a TAG translation stop codon. The mutant was designated Y ⁴⁷⁶ / TAG. Immunoprecipitation and SDS-PAGE of COS cells transfected with the mutant revealed a membrane-bound form of ICAM-1 with a molecular weight of 3 kD less than that of native ICAM-1. Indirect immunofluorescence of mutant transfected COS cells gave a blotched staining pattern similar to that expressed on native ICAM-1 LPS-stimulated endothelial cells. Finally, the cells transfected with the mutant DNA specifically bind to purified LFA-1 on the plastic surface in the same way as the COS cells transfected with the native ICAM-1 DNA (Table XXIII).

XX111. táblázatXX111. spreadsheet

ICÁM- 1-et vagy az ICÁM— 1 egy funkcionális származékát kifejező sejtek LFA-1-kötő képességeLFA-1 binding capacity of cells expressing ICAM-1 or a functional derivative of ICAM-1

Transzfekció transfection ICAM-l-ct kifejező LFA-l-et kötő sejtek százaléka Percentage of LFA-1 binding cells expressing ICAM-1-c Antitest nélkül Without antibody RR1/1 jelenlétében In the presence of RR1 / 1 Áltranszfekció Áltranszfekció 0 0 0 0 Natív ICAM-1 Native ICAM-1 20 20 0 0 Y⁴⁷⁶/TAGY ⁴⁷⁶ / TAG 20 20 0 0

33. példaExample 33

Az ICAM-1 funkcionális doménjeinek térképezéseMapping of functional domains of ICAM-1

Az ICÁM -1 vizsgálatai kimutatták, hogy a molekula 7 domént tartalmaz. Ezek közül öt dómén extracelluláris (a dómén 5 van legközelebb a sejt felületéhez és a dómén 1 van legtávolabb a sejt felületétől), egy dómén a transzmembrán dómén, és van egy citoplazmatikus dómén (azaz a citoplazmán belül helyezkedik el). Annak meghatározására, hogy mely domének járulnak hozzá az ICÁM-1 LFA-1-kötő képességéhez, epitóp térképezési vizsgálatok végezhetők. A vizsgálatok elvégzéséhez különböző deléciós mutánsokat állítottunk elő, és megvizsgáltuk, hogy képesek-e kötődni az LFA- 1-hez. A vizsgálatokat más módon is el lehet végezni, így olyan antiICAM-1 antitest használatával is, amelyről tudjuk, hogy befolyásolja az ICAM-1 LFA-l-kötő képességét. Erre a célra alkalmas antitest például az RR1/1 [R. Rothlein és munkatársai, J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)], az R6.5 (T. A. Springer és munkatársai, 07/250,446 lajstromszámú U. S. szabadalmi bejelentés; USP 5,284,931), az LB-2 [E. A. Clark és munkatársai, Leukocyte Typing I; szerk.: A. Bemard és munkatársai Springer Verlag, 339-346. oldal (1984)] vagy a CL203 [D. E. Staunton és munkatársai, Cell, 56, 849-853 (1989)].ICAM-1 assays have shown that the molecule contains 7 domains. Of these, five domains are extracellular (domain 5 is closest to the cell surface and domain 1 is farthest from the cell surface), one domain is the transmembrane domain, and there is a cytoplasmic domain (i.e., located within the cytoplasm). Epitope mapping studies can be performed to determine which domains contribute to ICAM-1's LFA-1 binding capacity. To carry out the assays, various deletion mutants were prepared and tested for their ability to bind to LFA-1. Other assays may be performed, including the use of an antiICAM-1 antibody known to affect the LFA-1 binding capacity of ICAM-1. A suitable antibody for this purpose is, for example, RR1 / 1 [R. Rothlein et al., J. Immunol., 137, 1270-1274 (1986)], R6.5 (T. A. Springer et al., U.S. Patent Application Serial No. 07 / 250,446; USP 5,284,931), LB-2 [E. A. Clark et al., Leukocyte Typing I; Ed. A. Bemard et al., Springer Verlag, 339-346. (1984)] or CL203 [D. E. Staunton et al., Cell, 56: 849-853 (1989).

ICAM-1-deléciós mutánsokat a különböző eljárások bármelyikével előállíthatunk. Azonban mégis előnyösebb, ha ezeket a mutánsokat helyre irányuló mutagenezissel állítjuk elő vagy más rekombináns technikával (például úgy, hogy ICAM-1-kifejező olyan génszekvenciákat szerkesztünk, amelyekből az egyes proteinszakaszokat kódoló szekvenciák hiányoznak). Az ilyen mutánsok előállításához adaptálható eljárások jól ismertek ezen a szakterületen. Ilyen eljárásokat használva három ICAM-1-deléciós mutánst készítettünk. Az első mutánsból hiányoznak az FI85-től P284-ig terjedő aminosavcsoportok (azaz a dómén 3 kiesett). A második mutánsból hiányoznak a P2 84-től az R451-ig terjedő aminosavcsoportok (azaz a dómén 4 és 5 kiesett). A harmadik mutánsból hiányoznak az Y476 utáni aminosavcsoportok (azaz a citoplazmatikus dómén kiesett). Ezeknek a vizsgálatoknak az eredménye arra utal, hogy a dómén 1, 2 és 3 kiemelkedő szerepet játszik az ICÁM - 1-nek az anti-ICAM-1-antitesttel és az LFA-1-gyei való kölcsönhatásában.ICAM-1 deletion mutants can be produced by any of a variety of methods. However, it is more preferred that these mutants be produced by site-directed mutagenesis or other recombinant techniques (e.g., by constructing ICAM-1-expressing gene sequences lacking the coding sequences for each protein sequence). Adaptive methods for producing such mutants are well known in the art. Using these methods, three ICAM-1 deletion mutants were prepared. The first mutant lacks amino acid residues from FI85 to P284 (i.e., domain 3 is deleted). The second mutant lacks the amino acid residues P2 to 84 to R451 (i.e. domain 4 and 5 are deleted). The third mutant lacks amino acid residues after Y476 (i.e., the cytoplasmic domain is deleted). The results of these studies indicate that domains 1, 2, and 3 play a prominent role in the interaction of ICAM-1 with anti-ICAM-1 antibody and LFA-1.

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

34. példaExample 34

Az ICÁM-1-ben létrejött mutációk hatása az LFA-1kötődésreEffect of mutations in ICAM-1 on LFA-1 binding

Az ICÁM-1-nek azon képességét, hogy kölcsönhatásba lép az LFA-l-gyel és hozzákötődik, olyan ICAM-l-aminosavcsoportok közvetítik, amelyek az ICAM-1-molekulában, a dómén 1-ben vannak jelen (8., 9. és 10. ábra). Ezeket a kölcsönhatásokat azonban az ICÁM-1-ben lévő dómén 2-ben és 3-ban jelen lévő aminosavak hatása is segíti. Tehát a jelen találmány szerinti előnyös funkcionális származékok közé tartoznak az ICAM-1-molekula szolubilis fragmentumai, s ezek tartalmazzák az ICAM-1 dómén 1-et, 2-t, és 3-at. Előnyösebbek az ICAM-1-molekula azon fragmentumai, amelyek az ICAM-1 dómén 1-et és 2-t tartalmazzák. A legelőnyösebbek az ICAM-1-molekulának azok a szolubilis fragmentumai, amelyek az ICAM-1 dómén 1-et tartalmazzák. Az első ICAM-1 doménben számos aminosavcsoport szerepel az ICAM-1-LFA-1 kölcsönhatásban. Ezeknek az aminosavaknak más aminosavakkal való szubsztitúciója megváltoztatja az ICAM-1nek azt a képességét, hogy kötődni tudjon az LFA-1hez. Ezeket az aminosavcsoportokat és a szubsztitúciókat mutatja be a 25. ábra. A 25. ábra bemutatja az ilyen mutációk hatását a kapott mutáns ICAM-1-molekula LFA- 1-kötő képességére. A 23-25. ábrákban a csoportokat az aminosavak egybetűs kódjával írtuk fel, és ezt követi az ICÁM-1-molekulában lévő csoport pozíciójának a jelzése. Tehát például az „E90” egy glutaminsavcsoportnak felel meg az ICAM-1 90-es pozíciójában. Hasonlóan, az „E90V” egy dipeptidet jelent, amely a 90-es pozíciójú glutaminsavcsoportból és a 91-es pozíciójú valincsoportból áll. A szubsztituált szekvenciát a törtvonaltól (,,?’) jobbra jelöljük. Az ICAM-1 V4, R13, Q27, Q58 és a D60S61 csoportjai vesznek részt az LFA-1-kötésben.The ability of ICAM-1 to interact with and bind to LFA-1 is mediated by ICAM-1 amino acid residues present in the ICAM-1 molecule, Domain 1 (Figures 8, 9). and Fig. 10). However, these interactions are also enhanced by the effect of the amino acids 2 and 3 of the domain in ICAM-1. Thus, preferred functional derivatives of the present invention include soluble fragments of the ICAM-1 molecule and include the ICAM-1 domain 1, 2, and 3. More preferred are fragments of the ICAM-1 molecule containing the ICAM-1 domain 1 and 2. Most preferred are soluble fragments of the ICAM-1 molecule containing ICAM-1 domain 1. The first ICAM-1 domain contains several amino acid residues in the ICAM-1-LFA-1 interaction. Substitution of these amino acids with other amino acids alters the ability of ICAM-1 to bind to LFA-1. These amino acid residues and substitutions are shown in Figure 25. Figure 25 illustrates the effect of such mutations on the LFA-1 binding capacity of the resulting mutant ICAM-1 molecule. 23-25. In Figures 1 to 4, the groups are represented by the one letter code of the amino acids followed by the position of the group in the ICAM-1 molecule. So, for example, "E90" corresponds to a group of glutamic acids at position 90 of ICAM-1. Similarly, "E90V" refers to a dipeptide consisting of the glutamic acid group at position 90 and the valine group at position 91. The substituted sequence is indicated to the right of the broken line ("?"). Groups V4, R13, Q27, Q58 and D60S61 of ICAM-1 are involved in LFA-1 binding.

Ezeknek az aminosavaknak a helyettesítése megváltoztatja az ICÁM-1-nek LFA-1-hez kötődő képességét. Például a V4 helyettesítése G-vel egy olyan mutáns ICÁM -1-molekula képződését eredményezi, amely kevésbé képes az LFA-1-hez kötődni (25. ábra). Az ICAM-1 R13 csoportjának E-vel való helyettesítése egy olyan mutáns molekula képződéséhez vezet, amely lényegesen kisebb kapacitással köti az LFA-l-et (25. ábra). Az ICAM-1 Q58 csoportjának helyettesítése H-val egy olyan mutáns molekula képződéséhez vezet, amely lényegében normál kapacitással köti az LFA-l-et (25. ábra). Az ICAM-1 D60S csoportjainak a helyettesítése KL-lel egy olyan mutáns molekulát eredményez, amely lényegesen kisebb kapacitással köti az LFA-l-et (25. ábra).Substitution of these amino acids alters the ability of ICAM-1 to bind to LFA-1. For example, the replacement of V4 with G results in the formation of a mutant ICAM -1 molecule that is less capable of binding to LFA-1 (Figure 25). Substitution of R13 of ICAM-1 with E leads to the formation of a mutant molecule that binds LFA-1 with significantly less capacity (Figure 25). Replacement of the Q58 group of ICAM-1 with H leads to the formation of a mutant molecule that binds LFA-1 at essentially normal capacity (Figure 25). Substitution of D60S residues of ICAM-1 with KL results in a mutant molecule that binds LFA-1 with significantly lower capacity (Figure 25).

A második dómén glükozilációs helyei szintén részt vesznek az LFA-1-kötésben (23. ábra). Az NI03 helyettesítése K-val vagy az A155N helyettesítése SV-vel egy olyan mutáns ICAM-1-molekula képződését eredményezi, amely lényegében képtelen az LFA- 1-hez kötődni. Ezzel szemben az NI75-ös glükozilációs helynek A-val való helyettesítése úgy tűnik, hogy lényegében nem befolyásolja a mutáns ICÁM-1-nek LFA-1kötő tulajdonságát.The glycosylation sites of the second domain are also involved in LFA-1 binding (Figure 23). Replacement of NIO3 with K or replacement of A155N with SV results in the formation of a mutant ICAM-1 molecule that is substantially unable to bind to LFA-1. In contrast, the replacement of the NI75 glycosylation site by A does not appear to substantially affect the LFA-1 binding property of the mutant ICAM-1.

A harmadik ICAM-1 doménben keletkező mutációk nem változtatják meg jelentősen az ICAM-1-LFA-1 kötődést (24. ábra).Mutations in the third ICAM-1 domain do not significantly alter ICAM-1-LFA-1 binding (Figure 24).

35. példaExample 35

Megnövekedett biológiai féléletidővel és kiürülést képességgel rendelkező ICAM-1 multimer formákICAM-1 multimeric forms with increased biological half-life and clearance

Kiméra molekulákat állítottunk elő, amelyekben az ICAM-1 dómén 1-et és 2-t hozzákapcsoltuk az immunglobulin nehéz lánc csuklószakaszához. Az előnyös szerkezetekben az ICAM-1-dómén 2 C terminusza az immunglobulin nehéz lánc gén egy szegmentumában lévő csuklószakasz N-terminuszához kapcsolódik, s ez lehetővé teszi a szegmentumok flexibilitását a csuklószakasznak köszönhetően. Az ICAM-1 dómén 1 és 2 ilyen módon egy antitest Fab-fragmentumát helyettesíti. Az IgG-osztályok nehéz láncaihoz való kapcsolás és állati sejtekben való termelés kiméra molekula termelését fogja eredményezni. IgA vagy IgM eredetű nehéz láncokat tartalmazó molekulák előállítása nagyobb mértékben multimer molekulák termelésében fog jelentkezni, s ez 2-12 ICAM-1-molekulát jelent. Az ICAM-1 nehéz lánc kiméra molekulákat termelő állati sejtekben a J lánc génkoexpressziója megfelelően összeszerelt IgA és IgM multimereket eredményez, amelyek főként 4-6 ICAM-1-molekulát tartalmazó IgA-molekulát és IgM esetében körülbelül 10 ICAM-1-molekulatartalmat jelentenek. Ezek a kiméra molekulák számos előnnyel rendelkeznek. Először: az Ig-molekulák - tulajdonságuk szerint - hosszú ideig fennmaradnak a keringésben, és ez javítja a biológiai féléletidőt.Chimeric molecules were constructed in which ICAM-1 domain 1 and 2 were linked to the hinge region of the immunoglobulin heavy chain. In preferred embodiments, the 2 C terminus of the ICAM-1 domain is linked to the N-terminus of a hinge region in a segment of the immunoglobulin heavy chain gene, allowing for flexibility of the segments due to the hinge region. ICAM-1 domain 1 and 2 thus substitute for the Fab fragment of an antibody. Linkage to the heavy chains of IgG classes and production in animal cells will result in the production of a chimeric molecule. Production of molecules containing heavy chains of IgA or IgM origin will be more involved in the production of multimeric molecules, meaning 2-12 ICAM-1 molecules. In animal cells producing ICAM-1 heavy chain chimeric molecules, gene expression of the J chain results in properly assembled IgA and IgM multimers, which in particular represent about 10 ICAM-1 molecules containing 4-6 ICAM-1 molecules and IgM. These chimeric molecules have many advantages. First, the Ig molecules, by their very nature, remain in circulation for a long time, which improves biological half-life.

Ezenkívül a manipulált molekulák multimer tulajdonsága azt eredményezi, hogy nagy aktivitással lépnek reakcióba mind a rhinovírussal, mind a sejtfelületi LFA-l-gyel - a terápia irányával összefüggésben -, és ez nagyban csökkenti a rekombináns proteinnek azt a mennyiségét, amelyet a hatásos dózis elérése érdekében lenne szükséges alkalmazni. A mukózus helyek, például az orr szekrétumaiban normálisan jelen lévő IgA és IgM erősen glükozilezett molekulák. Ezek erősen hidrofil jellege meggátolja a baktériumokat és a vírusokat - amelyekhez kötődnek - abban, hogy a sejtekhez kapcsolódjanak és hogy átjussanak az epitéliális sejtmembrán korláton. Tehát így nagyobb a terápiás hatékonyságuk. Az IgM és főként az IgA nyálkakömyezetben stabilak, és így növelhetik az ICÁM-1-szerkezetek stabilitását is. Ha egy ilyen ICÁM-1 funkcionális származékot a véráramba juttatunk, ez is növelheti a biológiai féléletidőt. Az IgA nem komplementkötő, s ez ideális az alkalmazás szempontjából, mivel ellenkező esetben káros hatása lenne. Abban az esetben, ha IgG H lánc kimérára lenne igény, lehetőség volna azokat a szakaszokat mutálni, amelyek a komplement kötésben, valamint az Fc-receptorral való kölcsönhatásban részt vesznek.In addition, the multimeric property of the manipulated molecules results in high activity reacting with both rhinovirus and cell surface LFA-1 in the direction of therapy, greatly reducing the amount of recombinant protein required to achieve an effective dose. would need to be applied. IgA and IgM are highly glycosylated molecules normally found in mucosal sites such as nasal secretions. Their highly hydrophilic nature prevents bacteria and viruses to which they bind from attaching to cells and crossing the epithelial cell membrane barrier. Thus, they have a greater therapeutic efficacy. IgM, and especially IgA, are stable in mucous membranes and can thus increase the stability of ICAM-1 structures. Introducing such a functional derivative of ICAM-1 into the bloodstream may also increase biological half-life. IgA is not complement binding and is ideal for application as it would otherwise have adverse effects. In the event that there is a demand for an IgG H chain chimera, it would be possible to mutate the sections involved in complement binding and interaction with the Fc receptor.

36. példaExample 36

ICÁM-1-mutánsok képzéseFormation of ICAM-1 mutants

Oligonukleotidra irányuló mutagenezisOligonucleotide-directed mutagenesis

Egy ICAM-1 cDNS-kódoló szakaszát egy 1,8 kb méretű Sall-KpnI-fragmentum formájában beklónoztukThe cDNA coding region of an ICAM-1 was cloned in the form of a 1.8 kb Sall-KpnI fragment

HU 217 792 Β a CDM8 expressziós vektorba (Invitrogen V308-20) [B. Seed és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)]. T. Kunkel módszere alapján [Proc. Natl. Acad. Sci., 82,488-492 (1985)], amelyet D. Staunton és munkatársai módosítottak [Cell, 52, 925-933 (1988)], ezt a szerkezetet (pDC1.8) használtuk egy egyszálú uraciltartalmú templát előállítására, az oligonukleotidra irányuló mutagenezisben való felhasználás céljára.HU 217,792 Β into the CDM8 expression vector (Invitrogen V308-20) [B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)]. By the method of T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82,488-492 (1985)] modified by D. Staunton et al. (Cell, 52: 925-933 (1988)), this construct (pDC1.8) was used to prepare a single-stranded uracil-containing template for oligonucleotide mutagenesis. for use.

Röviden: az XS 127 E. coli törzset pCDl.8-cal transzformáltuk. Egyedi telepeket tenyésztettünk 13 pg/ml ampicillint és 8 pg/ml tetraciklint tartalmazó 1 ml Luria-táplevesben (LB=Luria Borth; Difco) közel telítésig. A tenyészet 100 pl-ét R408 helperfággal (Stratagene) fertőztük 10-szeres fertőző adaggal (M0I=multiplicity of infection) és 10 ml ampicillin- és tetraciklintartalmú LB-tápoldatot adtunk hozzá további 16 órás tenyésztéshez 37 °C-on. A tenyészetet 10 000 fordulat/perc mellett 1 percig centrifugáltuk, és a felülúszót 0,22 pm-es szűrőn megszűrtük, ezután a fágszuszpenziót használtuk a BW313/P3 E. coli sejtek fertőzésére. A sejteket ampicillinnel és tetraciklinnel kiegészített LB-agar- (Difco) lemezekre öntöttük. Kiszúrtunk néhány telepet, ezeket ampicillin- és tetraciklintartalmú, ml LB-tápoldatban közel telítésig elszaporítottuk és 10 MOI helperfággal fertőztük. Ekkor a tenyészet térfogatát megnöveltük 250 ml-re, és a sejteket egy éjszakán át tenyésztettük. Egyszálú DNS-t izoláltunk standard fágextrakciós módszerrel.Briefly, strain XS 127 E. coli was transformed with pCD18.8. Individual colonies were cultured in 1 ml Luria broth (LB = Luria Borth; Difco) containing 13 pg / ml ampicillin and 8 pg / ml tetracycline until close to saturation. 100 µl of the culture was infected with helper phage R408 (Stratagene) at a 10-fold infectious dose (M0I = multiplicity of infection) and 10 ml of LB medium containing ampicillin and tetracycline was added for an additional 16 hours at 37 ° C. The culture was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute, and the supernatant was filtered through a 0.22 µm filter and the phage suspension was then used to infect BW313 / P3 E. coli cells. Cells were plated on LB agar (Difco) plates supplemented with ampicillin and tetracycline. Some colonies were spotted, grown to near saturation in ml of LB medium containing ampicillin and tetracycline, and infected with 10 MOI helper phage. At this time, the culture volume was increased to 250 ml and the cells were cultured overnight. Single-stranded DNA was isolated by standard phage extraction.

A mutáns oligonukleotidokat foszforiláltuk, és ezt használtuk a pCD1.8 templáthoz a második szál szintéziséhez [D. E. Staunton és munkatársai, Cell, 52, 925-933 (1988)].Mutant oligonucleotides were phosphorylated and used for pCD1.8 template for the synthesis of the second strand [D. E. Staunton et al., Cell 52: 925-933 (1988).

Transzfekciötransfection

COS-sejteket (ATCC CRL 1651) oltottunk 10 cm-es szövettenyésztő-lemezekre úgy, hogy 16-24 óra múlva 50%-a összefolyt legyen. A COS-sejteket ezután egyszer mostuk TBS-oldattal, majd 4 órán át inkubáltuk 10% Nu-szérumot (Collaborative), 5 pg/ml klorokvint (chloroquine), 3 pg mutáns plazmidot és 200 pg/ml DEAE-dextrán-szulfátot tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban. A sejteket ezután 10%-os DMSO/PBS-ben, majd PBS-ben mostuk, majd 16 órán át tenyésztettük a tápoldatban. A tápoldatot ekkor friss táptalajjal cseréltük ki, és a transzfekciö utáni 48. órában a COS-sejteket tripszin/EDTA (Gibco) kezeléssel szuszpendáltuk, majd elosztottuk két 10 cm-es lemezre, valamint 24 tartályos szövettenyésztő lemezekre a HRV-kötéshez. A 72 órás sejteket a 10 cm-es lemezekről 5 mmólos EDTA/HBSS oldattal arattuk le, és előkészítettük a műanyagra adszorbeált LFA-1-hez való adhéziós és immunfluoreszcenciához.COS cells (ATCC CRL 1651) were inoculated into 10 cm tissue culture plates so that 50% of the cells were confluent after 16-24 hours. COS cells were then washed once with TBS and incubated for 4 hours in RPMI containing 10% Nu serum (Collaborative), 5 pg / ml chloroquine (chloroquine), 3 pg mutant plasmid and 200 pg / ml DEAE dextran sulfate. 1640 medium. The cells were then washed in 10% DMSO / PBS, then in PBS, and cultured in culture medium for 16 hours. The medium was then replaced with fresh medium and, 48 hours after transfection, COS cells were resuspended in trypsin / EDTA (Gibco) treatment and then plated into two 10 cm plates and 24 well tissue culture plates for HRV binding. The 72 hour cells were harvested from the 10 cm plates with 5 mM EDTA / HBSS and prepared for adhesion and immunofluorescence to LFA-1 adsorbed to the plastic.

LFA -1- és HR V-kötésLFA -1 and HR V bond

LFA-l-et tisztítottunk SKW-3 lizátumokból immunaffinitás-kromatográfíával TS2/4 LFA-1 MAt Sepharose-on, és pH=ll,5 mellett, 2 mM MgCL₂ és 1% oktil-glükozid jelenlétében eluáltuk. Az LFA-l-et (10 pg/200 pl/6 cm-es lemez) bakteriológiai Petri-csészékhez kötöttük oly módon, hogy az oktil-glükozidot mM MgCl₂-t tartalmazó PBS-ben (foszfáttal pufferolt konyhasóoldat=phosphate buffered saline) 0,l%ra hígítottuk és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A csészéket 1%-os BSA-val (bovinszérum-albumin) blokkoltuk és 2 mM MgCl₂-, 0,2% BSA-, 0,025% azidés 50 pg/ml gentamicintartalmú PBS-ben tároltuk.LFA-1 was purified from SKW-3 lysates by immunoaffinity chromatography on TS2 / 4 LFA-1 MAt Sepharose and eluted at pH11.5 with ₂ mM MgCl2 and 1% octyl glucoside. LFA-1 (10 µg / 200 µl / 6 cm plate) was bound to bacteriological Petri dishes by placing octyl glucoside in PBS (phosphate buffered saline) containing mM MgCl ₂ . It was diluted to 0.1% and incubated overnight at 4 ° C. Plates were blocked with 1% BSA (bovine serum albumin) and stored in PBS containing 2 mM MgCl ₂ , 0.2% BSA, 0.025% azide and 50 pg / ml gentamicin.

Az⁵'Cr-ral jelzett COS-sejteket 5% FCS- (fetal calf serum), 2 mM MgCl₂-, 0,025% azidtartalmú PBS-pufferben inkubáltuk 5 pg/ml RRl/l-gyel és R6.5-tel ⁵ 'Cr-labeled COS cells were incubated in 5% FCS (fetal calf serum), 2 mM MgCl ₂ , 0.025% azide in PBS buffer with 5 pg / ml RRl / l and R6.5.

- vagy ezek nélkül - LFA-1 -gyei fedett mikrotitrálólemezeken 25 °C-on 1 órán át. A nem adherens sejteket 10 mmólos EDTA hozzáadásával oldottuk le, majd gamma-számlálás következett.with or without LFA-1 coated microtiter plates at 25 ° C for 1 hour. Non-adherent cells were lysed by addition of 10 mM EDTA followed by gamma counting.

EredményekResults

A következő anti-ICAM-1-antitesteket vizsgáltuk: RR1/1, R6.5, LB-2 és C1203. Ha ezek az antitestek képesek meggátolni az ICAM-1 funkcióját, akkor az ICAM-1-molekulának egy olyan különleges helyéhez kell kötődniük, ami az ICAM-1 funkciója szempontjából is fontos. Tehát az ICAM-1 fent leírt deléciós mutánsainak az előállításával és annak megállapításával, hogy az anti-ICAM-1-antitest milyen mértékben tud a deletált mutánshoz kötődni, lehetségessé válik annak meghatározása, hogy a deletált domének fontosak-e a funkció szempontjából.The following anti-ICAM-1 antibodies were tested: RR1 / 1, R6.5, LB-2 and C1203. If these antibodies are capable of inhibiting the function of ICAM-1, they must bind to a specific site of the ICAM-1 molecule that is also important for the function of ICAM-1. Thus, by generating the deletion mutants of ICAM-1 described above and determining the extent to which the anti-ICAM-1 antibody can bind to the deleted mutant, it becomes possible to determine whether the deleted domains are important for function.

Az ICAM-1 egy membránhoz kötött protein, amelynek az extracelluláris doménje valószínűleg öt Ig-szerű C doménből áll. Annak meghatározására, hogy mely domének vesznek részt az LFA-1 megkötésében, a dómén 3-at és a dómén 4-et és 5-öt (karboxiterminális szakasz) oligonukleotidra irányuló mutagenezis segítségével deletáltuk és COS-sejtekben való kifejeződésük után funkció szempontból teszteltük. Ezenkívül a teljes citoplazmatikus domént kiejtettük, hogy meggyőződjünk az ICÁM-1 kölcsönhatásokra gyakorolt potenciális befolyásáról. Mint vártuk, a citoplazmatikus dómén deléciója - Y476/*- azt mutatta, hogy nem volt veszteség az RR1/1-, R6.5-, LB-2- és CL203-reaktivitásban, ugyanakkor a dómén 3 deléciójaICAM-1 is a membrane-bound protein whose extracellular domain is likely to consist of five Ig-like C domains. To determine which domains are involved in LFA-1 binding, domain 3 and domain 4 and 5 (carboxy terminal region) were deleted by function-directed oligonucleotide mutation and after expression in COS cells. In addition, the entire cytoplasmic domain was pronounced to confirm the potential influence of ICAM-1 on interactions. As expected, the deletion of the cytoplasmic domain - Y476 / * - showed no loss in RR1 / 1, R6.5, LB-2 and CL203 reactivity, but the deletion of domain 3

- F185-R451 - csökkentette a CL203 reaktivitását, illetve ennek elvesztését okozta (20. ábra). Tehát úgy látszik, hogy a CL203 epitóp a dómén 4-ben helyezkedik el, míg az RR1/1, R6.5 és az LB-2 az aminoterminális doménben van.- F185-R451 - reduced or lost the reactivity of CL203 (Figure 20). Thus, it appears that the CL203 epitope is located in domain 4, while RR1 / 1, R6.5 and LB-2 are located in the amino-terminal domain.

Mind a három deléciós mutáns tehát az LFA- 1-hez való adherencia vad típusú szintjét mutatta (21. ábra). Aminosavszubsztitúciókat is végeztünk a dómén 1ben, 2-ben és 3-ban feltehetően jelen lévő β-hurkokban, és COS-sejtekben való kifejeződés után ezeket a funkciójuk szempontjából teszteltük. Az R6.5 epitóp eszerint a dómén 2 EE11 lGGA-szekvenciában lokalizálódik és feltehetően a dómén 1 E39-ben is, míg az RR1/1 és az LB-2 a dómén 1 R13 csoportjától függnek (22. ábra). Ezenkívül az RRl/l-kötődés csökken, ha a D71GQS-szekvenciában mutáció fordul elő. Azoknál a mutációknál, amelyekben N103-nál és N165-nél az N-glükozilációs helyek megszűnnek, csökken az RR1/1, R6.5 és az LB-2 LFA-1 HRV-kötése. Úgy látszik, hogy ezek a mutációk úgy hatnak a folyamatra, hogy ICÁM- 1-dimerek keletkeznek.Thus, all three deletion mutants showed wild-type levels of adherence to LFA-1 (Figure 21). Amino acid substitutions were also made in the β-loops presumed to be present in domains 1, 2 and 3 and tested for their function after expression in COS cells. According to this, the epitope R6.5 is localized in the EE11 IgGA sequence 2 and probably also in the domain 1 E39, whereas RR1 / 1 and LB-2 depend on the R13 group of domain 1 (Figure 22). In addition, RR1 / I binding is reduced when a mutation in the D71GQS sequence occurs. Mutations in which N103 and N165 abolish N-glycosylation sites reduce the HRV binding of RR1 / 1, R6.5 and LB-2 to LFA-1. These mutations appear to affect the process by forming ICAM-1 dimers.

Más mutációk a dómén 2-ben vagy 3-ban nem változtatják meg az LFA-1-adhéziót (23. és 24. ábra).Other mutations in domain 2 or 3 do not alter LFA-1 adhesion (Figures 23 and 24).

HU 217 792 ΒHU 217,792 Β

A dómén 1-ben az R13 és D60 aminosavak részt vesznek az LFA-1-kötésben (25. ábra).In domain 1, the amino acids R13 and D60 are involved in LFA-1 binding (Figure 25).

Tehát valószínűnek látszik, hogy az LFA-1- és HRV-kötés az ICAM-1 aminoterminális Ig-szerű doménjének a funkciója. A 26. ábra az ICAM-1 aminoterminális doménjének az összehasonlítását mutatja be.Thus, it seems likely that the LFA-1 and HRV bonds are a function of the amino-terminal Ig-like domain of ICAM-1. Figure 26 shows a comparison of the amino terminal domain of ICAM-1.

Bár a találmányt a speciális megvalósításokkal kapcsolatosan irtuk le, magától értetődik azonban, hogy a találmány tovább módosítható, azaz ez a bejelentés a találmány bármilyen olyan változtatását, használatát vagy adaptációját oltalmi körébe vonja, amely általánosságban a találmány alapelveit követi, ideértendők a jelen tartalomtól való olyan eltérések is, amelyek a találmánnyal kapcsolatos szakterületen a gyakorlati ismeretekből és a felhasználók gyakorlatából adódnak, továbbá amelyek az előbbiekben előadott és a csatolt igénypontokban megfogalmazott lényeges elveknek megfelelően alkalmazhatók.While the invention has been described in connection with the specific embodiments, it is understood that the invention may be modified further, that is, any change, use or adaptation of the invention which generally follows the principles of the invention is encompassed herein. discrepancies arising from the practical knowledge and the practice of users in the field of the invention, and which may be applied in accordance with the essential principles set forth above and in the appended claims.

Claims (12)

SZABADALMI IGÉNYPONTOKPATENT CLAIMS 1. Eljárás intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1) oldható fragmentumának előállítására, amely fragmentum kötődik az LFA- 1-hez, és tartalmazza az 1. domént, de hiányzik belőle az ICAM-1 transzmembrán doménje, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott fragmentumot kódoló, rekombináns vektorral transzformált mikroorganizmust az említett fragmentum kifejeződésére és a táptalajba való szekretálására alkalmas körülmények között tenyésztünk, és a táptalajból elkülönítjük az említett fragmentumot.A method for producing a soluble fragment of an intercellular adhesion molecule (ICAM-1) which binds to LFA-1 and contains domain 1 but lacks the transmembrane domain of ICAM-1, characterized in that a microorganism encoding a fragment transformed with a recombinant vector under conditions suitable for expression of the said fragment and secretion into the medium, and isolating said fragment from the medium. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán ICAM-1 1. és 2. doménjét, a humán ICAM-1 L, 2. és 3. doménjét, a humán ICAM-1 1., 2., 3. és 4. doménjét vagy a humán ICAM-1 1., 2., 3., 4. és 5. doménjét tartalmazó, oldható ICAM-1-fragmentumot állítunk elő.The method of claim 1, wherein the human ICAM-1 domains 1 and 2, human ICAM-1 domains L, 2 and 3, human ICAM-1 domains 1, 2, A soluble ICAM-1 fragment containing domains 3 and 4 or domains 1, 2, 3, 4 and 5 of human ICAM-1 is prepared. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a humán ICÁM-1 L, 2., 3., 4. és 5. doménjét tartalmazó, oldható ICAM-1-fragmentumot állítunk elő.The method of claim 1, wherein the soluble ICAM-1 fragment comprising the L, 2, 3, 4, and 5 domains of human ICAM-1 is produced. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy toxinderivatizált, oldható ICAM-1-fragmentumot állítunk elő.The method of claim 1, wherein the toxin-derivatized soluble ICAM-1 fragment is prepared. 5. Eljárás intercelluláris adhéziós molekula (ICÁM-1) olyan oldható fragmentumát kódoló, rekombináns DNS-molekula előállítására, amely fragmentum kötődik az LFA-1 -hez, és tartalmazza az 1. domént, de hiányzik belőle az ICAM-1 transzmembrán doménje, azzal jellemezve, hogy egy ICÁM- 1-et kódoló, rekombináns DNS-molekulába a 452. aminosavmaradékot kódoló kodon után egy stopkodont építünk be.5. A method of producing a recombinant DNA molecule encoding a soluble fragment of an intercellular adhesion molecule (ICAM-1) which binds to LFA-1 and contains domain 1 but lacks the transmembrane domain of ICAM-1. characterized in that a stop codon is inserted after a codon encoding amino acid residue 452 in a recombinant DNA molecule encoding ICAM-1. 6. Eljárás intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1) olyan oldható fragmentumát kódoló, rekombináns DNS-molekulát tartalmazó expressziós vektor előállítására, amely fragmentum kötődik az LFA-1hez, és tartalmazza az 1. domént, de hiányzik belőle az6. A method of producing an expression vector encoding a soluble fragment of an intercellular adhesion molecule (ICAM-1) which comprises a recombinant DNA molecule which binds to LFA-1 and contains domain 1 but lacks the domain 1. ICAM-1 transzmembrán doménje, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós vektorba egy 5. igénypont szerint előállított, rekombináns DNS-molekulát inszertálunk.The transmembrane domain of ICAM-1 is characterized by insertion of a recombinant DNA molecule according to claim 5 into a suitable expression vector. 7. Eljárás hatóanyagként az intercelluláris adhéziós molekula (ICAM-1) egy oldható fragmentumát tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított hatóanyagot önmagában vagy adott esetben egy vagy több más hatóanyaggal és/vagy a gyógyszerek készítésénél szokásosan használt hordozóval, hígítóval és/vagy egyéb segédanyaggal kombinálva gyógyszerkészítménnyé formázzuk.7. A process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising a soluble fragment of an intercellular adhesion molecule (ICAM-1) as claimed in any one of claims 1-3. The active ingredient as claimed in any one of claims 1 to 7, alone or optionally in combination with one or more other active ingredients and / or carriers, diluents and / or other excipients commonly used in the preparation of medicaments, is formulated into a pharmaceutical composition. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICÁM - 1-nek egy 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított, oldható fragmentumát a gyógyszerek készítésénél szokásosan használt hordozókkal, hígítókkal és/vagy egyéb segédanyagokkal kombinálva gyulladásellenes gyógyszerkészítménnyé formázzuk.8. The method of claim 7, wherein the ICAM-1 has a 1-3. The soluble fragment of any one of claims 1 to 6 is formulated in combination with carriers, diluents and / or other excipients commonly used in the preparation of medicaments to form an anti-inflammatory drug. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICÁM - 1-nek egy 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított, oldható fragmentumát a gyógyszerek készítésénél szokásosan használt hordozókkal, hígítókkal és/vagy egyéb segédanyagokkal kombinálva hematopoetikus tumorsejt metasztázisának elnyomására szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.9. The method of claim 7, wherein the ICAM-1 has a 1-3. The soluble fragment of any one of claims 1 to 6, in combination with carriers, diluents and / or other excipients commonly used in the preparation of drugs, is formulated into a pharmaceutical composition for suppressing metastasis of a hematopoietic tumor cell. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICÁM-1-nek egy 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított oldható fragmentumát és adott esetben egy másik gyulladásgátló szert egy immunszupresszív szerrel együtt a gyógyszerek készítésénél szokásosan használt hordozókkal, hígítókkal és/vagy egyéb segédanyagokkal kombinálva a specifikus vagy nem specifikus védekezőrendszer válaszából eredő gyulladás kezelésére szolgáló gyógyszerkészítménnyé formázzuk.10. The method of claim 7, wherein the ICAM-1 has a 1-3. A soluble fragment of any one of claims 1 to 7 and optionally another anti-inflammatory agent, in combination with an immunosuppressive agent, carriers, diluents and / or other excipients commonly used in the preparation of a medicament for treating inflammation resulting from a specific or non-specific defense system response. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásgátló szerként egy ICÁM- 1-hez kötődő antitestet vagy antitestfragmentumot, ICÁM-1-et, az ICÁM-1-nek egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított, oldható fragmentumát vagy az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistáját, egy LFA- 1-hez kötődő antitestet vagy ilyen antitest valamilyen funkcionális származékát, vagy az LFA-1 egy nem immunglobulin antagonistáját, immunszupresszív anyagként dexametazont, azatioprint vagy ciklosporin A-t használunk.11. The method of claim 10, wherein the anti-inflammatory agent is an antibody or antibody fragment that binds to ICAM-1, an ICAM-1, an ICAM-1 as defined in any one of claims 1-3. A soluble fragment prepared according to any one of claims 1 to 5 or a non-immunoglobulin antagonist of ICAM-1, an antibody binding to LFA-1 or a functional derivative of such antibody, or a non-immunoglobulin antagonist of LFA-1, dexamethasone, azathioprine or cyclosporin used. 12. Eljárás az LFA-1-molekulacsalád egy tagját kifejező tumorsejt jelenlétének és helyzetének diagnosztizálására olyan egyén szövetmintájában, akinél ilyen sejt jelenlétét feltételezzük, azzal jellemezve, hogy12. A method for diagnosing the presence and position of a tumor cell expressing a member of the LFA-1 family of molecules in a tissue sample of an individual suspected of having such a cell. i) az illető egyén szövetmintáját az ICÁM-1-nek egy 1-3. igénypontok bármelyike szerint előállított és detektálhatóan jelzett származéka jelenlétében inkubáljuk; és ii) detektáljuk az LFA-1-molekulacsaládnak a szövetmintában jelen lévő molekuláihoz kötött jelzett származékot.(i) a tissue sample of said individual is provided in accordance with sections 1-3 of ICAM-1; incubated in the presence of a detectably labeled derivative prepared according to any one of claims 1 to 5; and ii) detecting the labeled derivative bound to the LFA-1 family of molecules present in the tissue sample.