HU214985B - Eljárás proteináz-inhibitorok előállítására - Google Patents
Eljárás proteináz-inhibitorok előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU214985B HU214985B HU903010A HU301090A HU214985B HU 214985 B HU214985 B HU 214985B HU 903010 A HU903010 A HU 903010A HU 301090 A HU301090 A HU 301090A HU 214985 B HU214985 B HU 214985B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- leu
- bikunin
- sequence
- int
- inhibitor
- Prior art date
Links
- 0 *CC(*)C(C1)CC(*2)C1C*C2C=C Chemical compound *CC(*)C(C1)CC(*2)C1C*C2C=C 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/55—Protease inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
Description
KIVONAT
A találmány tárgya eljárás proteináz-inhibitor előállítására, amely a humán bikunin 21-147 aminosav szekvenciáját tartalmazza, és amely a pozícióban Met helyett Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Tyr, Trp, Lys maradékot, pozícióban Met helyett Leu, Arg, Ile, Val, Lys maradékot, pozícióban Arg helyett Leu, Ile, Val, Phe, Lys maradékot, pozícióban Phe helyett Leu, Arg, Lys, Ile, Val maradékot tartalmaz tetszőleges kombinációban, oly módon, hogy az inhibitort kódoló nukleinsawal módosított gazdasejtet tenyésztenek, és az inhibitort a tenyészközegből izolálják.
A leírás terjedelme 26 oldal (ezen belül 15 lap ábra)
HU 214 985 B
HU 214 985 Β
A találmány tárgya eljárás proteináz-inhibitorok előállítására.
A találmány tárgya közelebbről géntechnológiai eljárás az emberi bikunin inhibitoraktivitású doménjein alapuló peptid-származékok (így az inter-a-tripszin-inhibitor, illetve a savstabil szérum-tripszin-inhibitorok, illetve a vizelet-tripszin-inhibitorok inhibitoraktivitású komponenseinek) mikroorganizmusok (baktériumok, alacsonyrendű eukarióták) segítségével történő előállítására. A találmány szerint előállított peptid-származékokra jellemző, hogy gátolják a szerin-proteázokat, például a pankreázt és granulocita elasztázt, a katepszin G-t vagy a plazma-kallikreint.
Az extracelluláris térbe kerülő proteázokat a potenciális endogén proteináz inhibitorok, így az cti-proteinázinhibitor általában gyorsan elfogja (Travis és Salvesen: Ann. Rév. Biochem. 52,655,1983). Bizonyos esetekben azonban ez a védekező mechanizmus nem, vagy legalábbis nem kielégítően működik, és ennek következménye súlyos betegség lehet, így emfízéma képződés, szeptikus sokk, sokkos tüdő, ARDS, reumás artritisz, koagulációs zavarok, veseelégtelenség és májelégtelenség. Ebben az összefüggésben potenciális gyógyszerként különleges szerepük van a specifikusan ható proteináz-inhibitoroknak. Emberi alkalmazásra elsősorban azok a proteináz-inhibitorok jöhetnek szóba, amelyek aminosavszekvenciáj a természetes humán inhibitorok szekvenciájához hasonló. Ez különösen fontos hosszúidejű terápia, például az a,-proteináz-inhibitorhiány (emfizéma-képződés) toxikus vagy allergiás mellékhatások elkerülése érdekében végzett kezelésénél.
Bár az a]-proteináz-inhibitor természetes ellenpáqa a neutrofil elasztázoknak, amelyeket gyulladási folyamatoknál extracellulárisan gátolni kell, terápiás alkalmazása azonban több okból nem optimális. Viszonylag magas 53 000 d értékű móltömege miatt az inhibitort a fiziológiás szintet meghaladó nagy tömegben kell adagolni. A szükséges mennyiség géntechnológiai úton könnyen előállítható, azonban a fiziológiás úton glikozilált rekombináns protein biológiai felezési ideje viszonylag alacsony (Matheson és munkatársai: J. Bioi. Chem., 261, 10404, 1986), ami miatt az inhibitort nagyobb mennyiségben kell adagolni. Az inhibitorra jellemző továbbá, hogy proteolizálható és oxidálható.
Mindkét tulajdonság tovább csökkenti az aktív származék koncentrációját, bár az oxidálhatóság géntechnológiai úton az inhibitor reaktív centrumában található metionin-származék (P)-pozíció) leucinra történő kicserélésével kiküszöbölhető (McCourtney és munkatársai: Natúré, 313, 149, 1985).
A találmány feladata, hogy emberi betegségek kezelésére alkalmas kis móltömegű proteináz-inhibitorokat fejlesszünk ki, például humán leukocita elasztáz, katepszin G vagy plazma-kallikrein ellen. Ennek során azt kellett megvizsgálni, hogy az ismert emberi inhibitorok módosításával nyerhető-e kívánt hatásspektrummal rendelkező proteináz-inhibitor. Ebből a célból alapmolekulaként használható lenne az emberi inter-a-tripszin-inhibitor ITI (Schreitmüller és munkatársai: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler, 368, 963, 1987, Gebhard és munkatársai:
Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 369S, 19, 1988, Gebhard és munkatársai: FEBS Fett. 229, 63,1988, Gebhard és munkatársai: Euro. J. Biochem., nyomás alatt) inhibitorhatású alegysége, amelyet a következőkben bikuninnak nevezünk (1. ábra), valamint a szerkezetileg azonos szérum Kunitz-típusú tripszin inhibitor (STI), és vizelet Kunitztípusú tripszin inhibitor (ÚTI), ha sikerülne, hogy néhány aminosav-maradék kicserélésével az inhibitor természetes hatásspektrumát a kívánt irányban megváltoztassuk (1. ábra). Ezek az anyagok egy egyetlen gén primer transzlációs terméke proteolitikus érésének eredményei (Kaumyer és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 14, 7839, 1986) és egy tripszinnel lehasítható N-terminális peptidből (1-21 aminosav-maradék) és két egymást követő szerkezetileg rokon doménből (1. számú dómén az N-terminális dómén, ami a definíció szerint a 22-77 aminosav-maradéknak felel meg, míg a 2. számú dómén a fehérje C-terminális részét képezi, definíció szerint a 78-147 aminosav-maradék) áll, amelyet tripszines kezelés után egyenként előállíthatunk. Mindkét dómén proteináz-inhibitor aktivitással rendelkezik, de a gátlás iránya eltérő (Gebhard és Hochstrasser: Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen, Eds. Elsevier, 1986, p. 375).
Az adott fiziológiai helyzettől függően az akut fázisú bikunin fehéije előfordulhat komplex formájában (ITIvel vagy immunglobulinnal képzett komplex formájában), vagy komplextől mentes formában, amely STIként kimutatható. Az ÚTI a vese által megszűrt STI. Az egyes inhibitorok ezért csak annyiban térnek el egymástól, hogy képesek-e más fehéij ékkel asszociálódni, illetve különböző testfolyadékokban mutathatók ki.
A specifikus és potenciális inhibitorok, például a bikunin dómén bázisú neutrofil elasztáz, a katepszin G vagy plazma kallikrein előállítható az 1. vagy 2. dómén reaktív centrumának P,-helyzetében lévő aminosav-maradékok kicserélésével.
Azt találtuk továbbá, hogy a doménban további olyan kicserélőhelyek fordulnak elő, például a P2’-helyzetben, amelyek tovább javítják a gátló tulajdonságokat.
A találmány tárgya tehát eljárás proteináz inhibitor előállítására, amely a humán bikunin 21-147 aminosav szekvenciáját tartalmazza, és amely a pozícióban Met helyett Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Tyr, Trp, Lys maradékot, pozícióban Met helyett Leu, Arg, Ile, Val, Lys maradékot, pozícióban Arg helyett Leu, Ile, Val, Phe, Lys maradékot, pozícióban Phe helyett Leu, Arg, Lys, Ile, Val maradékot tartalmaz tetszőleges kombinációban, oly módon, hogy az inhibitort kódoló nukleinsavval módosított gazdasejtet tenyésztünk, és az inhibitort a tenyészközegből izoláljuk.
A találmány szerint előállított proteináz-inhibitor Kunitz-típusú inhibitor-származék, amelynek hatásspektrumát a természetes aminosav-maradékok a reaktív centrum P, és P2- helyzetében más, természetes aminosav-maradékokra történő kicserélésével megváltoztattuk, ezen belül elsősorban az emberi bikunin egyik
HU 214 985 Β vagy mindkét, egymással összekapcsolt doménjén alapuló inhibitorok előállítására, amelyek gátló hatását a természetes inhibitorhoz, illetve az egyes doménekhez képest az egyik vagy mindkét dómén reaktív centrumának Pj- és/vagy P2-helyzetében lévő természetes aminosav-maradék más természetes aminosav-maradékra, például Alá, Gly, Ile, Leu, Arg, Phe, Val, Tyr, Trp vagy Lys maradékra történő kicserélésével megváltoztatjuk és/vagy javítjuk. A találmány szerinti eljárás érinti az inhibitor-származék alapjául szolgáló génszerkezetet, függetlenül az adott kodonválasztéktól, és a természetes cDNS és a szintetikus DNS kapcsolódásától.
A találmány szerint előállított bikunin-származékban az egyik vagy másik Pj-helyzetben, valamint az egyik vagy másik P2-helyzetben végzett kicserélés mellett további cserék is lehetségesek más helyzetekben. Ezek a további cserék a kívánt gátló tulajdonságot tovább javíthatják, előnyösebb farmakokinetikai viselkedést eredményezhetnek, az in vivő felezési időt meghosszabbíthatják, vagy előnyösebb technikai előállítási eljárást biztosíthatnak.
A találmány szerint előállított bikunin-származékok szekvenciájában és terjedelmében eltérő N-terminális és C-terminális peptid-részeket tartalmazhatnak az alapszerkezet kialakításához szükséges 26 és 76 helyzetben (1. inhibitor-domén), valamint 82 és 132 helyzetben (2. inhibitordomén) elhelyezkedő cisztein-maradékokon kívül. Az eredetileg megadott doménhatárokat (az 1. inhibitordoménben Lys22 és Arg77, valamint a 2. inhibitordoménben Thr78 és Asn147) a tripszinnel végzett feltárás alapján határoztuk meg, és nem esnek pontosan egybe a később meghatározott Exon határokkal (Vetr és munkatársai: FEBS Lett., 1989, nyomás alatt). Ez utóbbi szerint a két inhibitordomént az Asp24 és Val79, illetve Alá80 és Asp137 aminosv-maradékok határolják (1. ábra). Az alkalmazott kifejező rendszertől függően az egyes génszerkezetek N-terminális, illetve C-terminális peptidmeghosszabbítást kódolhatnak, függetlenül attól, hogy ez részben vagy egészben megmarad-e a végleges inhibitor-származékban, vagy csak átmenetileg épül be az ideiglenes fehérjébe, valamint attól, hogy ez a meghosszabbítás egy természetes bikuninhoz vagy más idegen fehérjéhez rendelhető-e.
így például a Met18-Thr19-Val20-Lys21 N-terminális szekvencia, amely a metionin maradék kivételével azonos a bikunin természetes aminosav-szekvenciájával, előnyösen alkalmazható abból a célból, hogy tripszinnel végzett hasítás után egységes terméket kapjunk, amelynek összetétele megfelel az eredetileg definiált 1. doménnek. Ily módon N-terminálisan idegen fehéqerészeket tartalmazó szerkezetből is simán leválaszthatók a bikunin domének. Közvetlen (vagyis N-terminális idegen fehéqerész nélküli) kifejeződésnél is az N-terminális metionin részleges, illetve bizonyos körülmények között teljes lehasadására lehet számítani. Az 1. doménben lévő C-terminális argininnek a terápiás alkalmazás közbeni eltávolítása előnyösen megakadályozható C-terminális meghosszabbítások alkalmazásával.
A bikunin-származékok vagy ffagmensei kifejezése eredményesen megvalósítható bakteriális vagy eukarióta rendszerekben. így például a bakteriális rendszerek közül előnyösen alkalmazhatók az Escherichia coli K 12 törzsek, amelyekben a kifejeződés nem fuzionált formában a citoplazmában intracellulárisan képzett, és megfelelő fúziós partnerrel, például az MS2-replikáz N-terminális részével kialakított fúziós fehérjét vagy gátló hatással rendelkező és a periplazma-térben kiválasztódó terméket eredményez. Ez utóbbi esetben megfelelő szignálpeptid, éldául OmpA szignálszekvencia felhasználásával dolgozunk.
Eukarióta rendszerként elnyösen alkalmazhatók például az élesztő szekréciós rendszerek, amelyekben a kifejezett termék megfelelő vezérszekvencia, például afaktor-prepro-szekvencia segítségével a szekréciós utakon keresztül felszabadul, és gátló hatású anyagként a tenyészközegbe kerül. Alkalmazhatók továbbá élesztő kifejező rendszerek is, amelyek intracelluláris szintézist biztosítanak.
Az említettek mellett felhasználhatók más prokarióta és eukarióta kifejező rendszerek is, például Bacillus, Staphylococcus, Hansenula és Aspergillus törzsek.
Ha szükség van az emlős állatokban lejátszódóhoz hasonló glikozilálásra, akkor glikoziláló rendszereket választunk. Glikozilálatlan bikunin-származékok prokarióta kifejező rendszerekben állíthatók elő. Az élesztő kifejező rendszerek általában az emlős állatokra jellemző glikozilálási mintától eltérő glikoziláláshoz vezetnek. Az élesztő kifejező rendszerekben nyert glikozilálatlan bikunin-származékok deglikoziláló enzim vagy glikozilálhatatlan származék kifejezésével állíthatók elő.
A találmány szerint előállított proteináz-inhibitorok gyógyszerkészítménnyé alakíthatók, melynek során gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóanyaggal, és/vagy egyéb gyógyszer segédanyaggal keveijük, és a keveréket adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.
A gyógyszerkészítmények különböző formák, például tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák, szuppozitóriumok, ampullák formájában fordulhatnak elő, amelyek hatóanyagmennyisége megfelel az egyes dózis tört részének, vagy annak sokszorosának. Dózisegységek tartalmazhatnak például 1, 2, 3 vagy 4 egyes dózist, vagy 1/2,1/3 vagy 1/4 egyes dózist. Az egyes dózis előnyösen olyan hatóanyagmennyiséget jelent, amelyet egyszeri adagolással alkalmazunk, és amely általában a napi dózis teljes mennyiségének, illetve annak fele, harmada, vagy negyede mennyiségének felel meg.
Nemtoxikus, gyógyászatilag alkalmazható inért hordozóanyagok alatt szilárd, félszilárd vagy folyékony hígítószereket, töltőanyagokat és formulázási segédanyagokat értünk.
Előnyös készítmények a tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák, granulátumok, szuppozitóriumok, oldatok, szuszpenziók és emulziók, paszták, kenőcsök, gélek, krémek, púderek és aeroszolos készítmények.
A tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák és granulátumok a hatóanyagok mellett szokásos hordozóanyagokat tartalmazzák, így
a) töltőanyagokat, például keményítőt, tejcukrot, nádcukrot, glukózt, mannitot vagy kovasavat,
HU 214 985 Β
b) kötőanyagokat, például karboxi-metil-cellulózt, alginátokat, zselatint vagy poli(vinil-pirrolidon)-t,
c) nedvesítőszereket, például glicerint,
d) szétesést elősegítő szereket, például agar-agart, kalcium-karbonátot vagy nátrium-karbonátot,
e) oldáslassító szereket, például paraffint,
f) reszorpciógyorsító szereket, például kvatemer ammónium-vegyületeket,
g) nedvesítőszereket, például cetil-alkoholt vagy glicerin-monosztearátot,
h) adszorpciós szereket, például kaolint vagy bentonitot,
i) csúsztatószereket, például talkumot, kalcium- vagy magnézium-sztearátot vagy szilárd poli(etilén-glikol)-t,
Alkalmazhatók a fenti a)-i) anyagok keverékei is.
A tabletták, drazsék, kapszulák, pirulák és granulátumok a szokásos, adott esetben áttetsző bevonatokkal láthatók el, és kialakíthatók úgy, hogy a hatóanyagot az emésztőtraktus meghatározott szakaszában késleltetve adják le, amelynek során beágyazó masszaként például polimerek és viaszok alkalmazhatók.
A hatóanyagok adott esetben egy vagy több hordozóanyaggal mikrokapszulázott formában is előfordulhatnak.
A szuppozitóriumok a hatóanyagok mellett a szokásos vízoldható vagy vízben oldhatatlan hordozóanyagokat tartalmazzák, például poli(etilén-glikol), zsír, például kakaózsír és hosszabb szénláncú észterek, például 14 szénatomos alkohol 16 szénatomos zsírsavval képzett észtere, vagy ezek keverékei.
Kenőcsök, paszták, krémek és gélek a hatóanyagok mellett a szokásos hordozóanyagokat tartalmazzák, például állati és növényi zsírok, viaszok, paraffinok, keményítők, tragant, cellulóz-származék, poli(etilén-glikol), szilikon, bentonit, kovasav, talkum, cink-oxid, illetve ezek keverékei.
A púder és az aeroszolos készítmény a hatóanyag mellett a szokásos hordozóanyagokat tartalmazza, például tejcukrot, talkumot, kovasavat, alumínium-hidroxidot, kalcium-szilikátot és poliamid port, illetve ezek keverékeit. Az aeroszolkészítmény tartalmazza továbbá a szokásos hajtóanyagokat, például klór-, fluor-szénhidrogéneket is.
Az oldatok és emulziók a hatóanyagok mellett a szokásos hordozóanyagokat tartalmazzák, így oldószereket, oldásközvetítőket, emulgeátorokat, ilyen például a víz, etil-alkohol, izopropil-alkohol, etil-karbonát, etil-acetát, benzil-alkohol, benzil-benzoát, propilén-glikol, 1,3-butilén-glikol, dimetil-formamid, olajok, elsősorban gyapotmagolaj, mogyoróolaj, kukoricacsíra-olaj, olívaolaj, ricinusolaj, szezámolaj, továbbá glicerin, glicerin-formál, tetrahidro-furfuril-alkohol, poli(etilén-glikol) és szorbitán-zsírsav-észter, illetve ezen anyagok keverékei.
Parenterális adagoláshoz az oldatokat és emulziókat steril, vérrel izotóniás formában alkalmazzuk.
A szuszpenziók a hatóanyagok mellett a szokásos hordozóanyagokat tartalmazzák, ilyenek például folyékony hígítószerek, így víz, etil-alkohol, propilén-glikol, valamint szuszpendálószerek, például etoxilezett izosztearil-alkoholok, poli(oxi-etilén)-szorbit és szorbitán észtere, mikrokristályos cellulóz, alumínium-metahidroxid, bentonit, agar-agar és tragant, illetve ezek keverékei.
A gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak még színezőanyagokat, konzerválószereket, valamint szag- és ízjavító adalékanyagokat, például borsmentaolajat és eukaliptuszolajat, valamint édesítőszereket, például szacharint.
A terápiás hatóanyagot a gyógyszerkészítmények előnyösen 0,1-99,5 tömeg%, elsősorban
0,5-95 tömeg% mennyiségben tartalmazzák.
A gyógyszerkészítmények az új hatóanyagok mellett tartalmazhatnak további gyógyászati hatóanyagokat is.
Az új gyógyszerkészítmények előállítása során a szokásos módon járunk el, amelynek során a hatóanyagot és a hordozóanyagokat összekeverjük.
Az új hatóanyagok embernek és állatnak adagolhatok lokálisan, orálisan, parenterálisan, peritoneálisan és/vagy rektálisan, előnyösen orálisan vagy parenterálisan, így intravénásán vagy intramuszkulárisan.
Az új hatóanyagok napi dózisa mind a humán, mind az állatgyógyászat területén 0,5-500 mg/kg testtömeg, előnyösen 4-100 mg/kg testtömeg. Ezt a mennyiséget több adagban adagoljuk. Az egyes adagok a találmány szerinti hatóanyagot előnyösen 1-250 mg/kg testtömeg, előnyösen 3-60 mg/kg testtömeg mennyiségben tartalmazzák. Bizonyos esetekben mégis szükséges lehet az előírttól eltérő mennyiségek alkalmazása, a kezelt beteg fajtájától és testtömegétől, a betegség fajtájától és súlyosságától, az adagolás módjától és időpontjától, valamint időtartamától függően. így bizonyos esetekben elegendő lehet kisebb mennyiségek adagolása is, míg más esetekben nagyobb mennyiségek adagolása szükséges. Az optimális dózis és az alkalmazás módjának meghatározása szakember számára rutin feladat.
Munkamódszerek
A DNS restrikciós enzimekkel végzett hasítását, az 5’ tullógó vég dNTP-vel DNS polimeráz I (Klenow fragmens) jelenlétében történő felíöltését, mungóbabnukleázzal végzett emésztést, a DNS gélelektroforézisét, a DNS fragmensek izolálását, ligálását, az E. coli transzformálását, és a telep hibridizálást az előállítási cégek (restrikciós enzimek: Boehringer Mannheim, Mannheim; Biolabs, Schwalbach; Pharmacia, Freiburg; mungóbab-nukleáz: Pharmacia és kompetens E. coli sejtek: BRL, Eggenstein) előírásainak figyelembevételével a szokásos eljárásokkal (például Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982) végezzük.
Az oligonukleotidok kémiai szintézisét Pharmacia Gene Assembler-n végezzük etablirozott foszfor-amidit-származék (p-ciano-etil-N,N-diizopropil-foszforamidit) segítségével, és denaturált poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítjuk.
Az egyes génszerkezetek DNS szekvenciájának megállapításához a kettősszálú DNS mindkét szálát Chen és Seeburg módszerével (DNA, 4, 165, 1985) közvetlenül szekvenáljuk.
HU 214 985 Β
Az élesztőtranszformáláshoz az SC106 törzs (MATalfa, hom3, gall2, his6, ura3, S2207A törzs, Yeast Genetics Stock Center, University of Califomia, Berkeley, Califomia, USA) 2x107 sejt/ml koncentrációjú élesztősejt szuszpenziójából 100 ml-t lecentrifugálunk, a sejtüledéket 1x5 ml TE pufferrel (10 mmol/1 Tris x HCI, pH = 7,5, 1 mmol/1 EDTA), majd 5 ml LiA-pufferrel (0,1 mol/1 lítium-acetát TE pufferben) mossuk. A sejteket 1 ml LiA pufferben szuszpendáljuk, és egy órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az így kapott kompetens sejteket egy napon keresztül 4 °C hőmérsékleten tárolhatjuk. A transzformálást az alábbiak szerint végezzük.
0,1 ml sejtszuszpenzióhoz 10 μΐ plazmid oldatot (1-5 μg DNS) és 15 μΐ hordozó DNS-t (heringspermából denaturált DNS, 3 mg/ml) adunk. 30 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 0,7 ml polipropilén-glikolt (40 tömeg% polipropilén-glikol 3350 LiA pufferben) adunk hozzá, és további 60 percen keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket ezután 5 percen keresztül 42 °C hőmérsékleten kezeljük, majd 4 másodpercen keresztül Eppendorf mikrocentrifugában centrifugáljuk. A sejt-pelletet kétszer 0,5 ml TE-pufferben mossuk, majd 0,1 ml TE-pufferben szuszpendáljuk, és szelektív tápközegre visszük. A transzformánsokat 3 nap elteltével kapjuk.
A transzformánsokat 20 mg/1 treoninnal, metioninnal és hisztidinnel kiegészített SD-közegben (0,67 tömeg0/» élesztő nitrogén bázis aminosav nélkül, 2 tömeg% D-glukóz) 30 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Megfelelő sejtsűrűség elérése után a sejteket lecentrifugáljuk, és a tripszin- és elasztáz-gátló aktivitást a tenyészet felülúszójában mérjük.
A fehérjéket a szokásos módon SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (Laemmli: Natúré, 277, 680,1970), és Coomassie Brilliant Blau festékkel végzett színezéssel mutatjuk ki.
Az aminosav analízishez mintegy 1 nmol fehérjét 200 μΐ 6 mol/1 sósav és 0,050% β-merkapto-etanol jelenlétében vákuumban 110 °C hőmérsékleten 22 órán keresztül inkubálunk. A hidrolizátumot szárítjuk, 150 μΐ 0,2 mol/1 nátrium-citrát pufferben (pH = 2,2) oldjuk, és szűrjük. Az aminosav analízist Biotronic LC 5000 aminosav-analizátoron fluoreszcensz detektorral Shimadzu C-R2AX integrátorral végezzük. Az aminosavak mennyiségét o-ftálaldehiddel reagáltatva az irodalom szerint határozzuk meg (Bensőn és Hare: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 619, 1975).
Az aminosav szekvenáláshoz 1-2 nmol fehérjét 30 μΐ trifluor-ecetsavban oldva polibrénnel kezelt üvegszűrőre visszük, és gázfázisú szekvenátorban (Applied Biosystems) Hewick és munkatársai módszerével (J. Bioi. Chem. 256, 7990, 1981) szekvenáljuk. A fenil-tiohidantoin-származékot ciano-HPLC-oszlop (DuPont) segítségével Beyreuther és munkatársai segítségével (Modem Methods in Protein Chemistry, 303-325, Walter de Gruyter, Berlin, 1983) segítségével Water-féle HPLC rendszeren szeparáljuk és analizáljuk.
A tripszin aktivitást Geiger és Fritz módszerével (Methods of Enzymatic Analysis, V. kötet, 3. kiadás,
Bergmeyer ed, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, p.
121) szubsztrátként benzoil-L-arginin-p-nitroanilidet alkalmazva határozzuk meg. A felszabadult pnitroanilint spektrofotometriásán 405 nm hullám5 hosszon mérjük. Az enzimet és az inhibitort a szubsztráthoz történő adagolás előtt 15 percen keresztül inkubáljuk.
Az elasztáz gátlás vizsgálatához humán leukocita elasztázt (Elastin Products Company, Inc., Pacific,
Miss., USA) és szubsztrátként MeO-Suc-Ala-Ala-ProVal-pNS-t (Bachem, Bubendorf, Schweiz) alkalmazunk. A vizsgálati körülményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az inhibitormintát általában teszt pufferral hígítva enzim hozzáadása után előinkubáljuk. A reakciót szubsztrát (0,1 mol/1 koncentrációban DMSO-ban oldva és pufferrel a törzsoldat koncentrációjára kiegészítve) indítjuk, és a p-nitroanilin szubsztrátból történő felszabadulását 405 nm hullámhosszon folyamatosan ellenőrizzük. A 100%-os értéket inhibitor nélkül végzett kísérlettel határozzuk meg. A százalékos gátlást az alábbi egyenlettel számoljuk:
gátlás (%) = 100 x (1 deltaOD inhibitor jelenlétében deltaOD inhibitor nélkül )
1. táblázat
Elasztázgátló teszt körülményei (Nakaima és munkatársai: J. Bioi. Chem. 254,4027, 1979)
Puffer | 0,2 mol/1 Tris/HCl, pH = 8,0 + 0,1 tömeg% Tween 80 |
Szubsztrát hozzáadása utáni ossz térfogat | 0,65 ml |
Enzimmennyiség/teszt | 50 ng |
Szobahőmérsékleten végzett előinkubálás | 30 perc |
Szubsztrát | MeO-Suc-Ala-Ala-Pro- Val-pNS |
Törzsoldat koncentrációja | 0,065 mol/1 |
Mennyiség/teszt | 0,1 ml |
T eszthőmérséklet | 30 °C. |
1. példa
Bikunin-génváltozatok előállítása és kifejezése E. coliban
Az egyes bikunin-génváltozatok egyrészt természe50 tes mRNS-ből, másrészt az egyes doméneknek, vagy annak részeinek megfelelő szintetikus génekből állnak. A cDNS kiónokat megfelelő cDNS tárakból állítjuk elő oligonukleotid próbával végzett hibridizálással (Kaumeyer és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 14,
7839-7849, 1986) vagy humán inter-a-tripszin-inhibitor elleni antitesttel végzett kiválogatással nyerjük (Schreitmüller és munkatársai: Bioi. Chem. HoppeSeyler, 368, 963-970, 1987). A szintetikus gént (1. dómén), illetve génszakaszt (2. dómén) az alábbiak sze60 rint állítjuk elő:
HU 214 985 Β
A des[,-,778-I47]-MetI8-Xaa36-Xaa38-bikunin gén és ennek például Xaa = Ile, Leu, Met, Val származékának előállítása
Az 1. számú dómén (des[1-17.?8-i47]_]y[eti8. bikunin) és variánsai (desj1 Xaa3 8-bikunin, például Xaa = Ile, Leu, Met, Val származékkal) génjeit két szintetikusan előállított modulból állítjuk össze, amelyeket az Ncol, Asp718 és Sál restrikciós nukleázok megfelelő kombinációjával végzett hasítással ezekből a génekből egyenként vagy együttesen eltávolíthatunk. Ez a konstrukció megkönnyíti a gének különböző vektor-rendszerekben történő alkalmazását, és a belső Asp718-restrikciós hasítóhely segítségével lehetővé teszi a modul eltávolítását, és így az egyes változatok előállítását (2. ábra).
Az 1. modul magában foglalja az 1-6 oligonukleotidot, míg a 2. modul a 7-12 oligonukleotidot. Az Xaa36-Xaa38 változatok előállításához csak az 1. modult kell kicserélni. Az 1. modul változatainak előállításához, amennyiben ez szükséges, a 2, 3, 5 vagy 6 oligonukleotidot más oligonukleotidra cseréljük, amelyben a metionin kódja (ATG) helyett izoleucin kód (ATC), leucinkód (CTG) vagy valinkód (GTT), illetve a szemben lévő szálban ezek komplementer szekvenciái helyettesítik. Az N-terminális V-T-K szekvencia a természetes N-terminális peptid részét képezi. Az egyetlen idegen aminosav a Start-metionin, amelynek lehasítását a gén E. coliban végzett in vivő közvetlen kifejezésével érhetjük el.
A klónozási folyamatot a 3. ábra mutatja. A pTZ18NCO plazmid előállításához a pTZ18R plazmidot (Pharmacia) EcoRI segítségével hasítjuk, mungóbab-nukleázzal kezeljük, 5’-ACCATGGT-3’ palindrom szekvenciával ligáljuk, és E. coli DH5 törzsbe transzformáljuk. A kapott plazmidot szekvencia analízissel ellenőrizzük.
A pTZMODl és pTZMODIXX (XX = IL, LM, MM, LL, VL) plazmidokat a pTZ18NCO plazmid Ncol és Asp718 segítségével végzett hasítás, a linearizált plazmid polinukleotid-kinázzal foszforilezett 1-6 oligonukleotiddal (1. modul, 2. ábra), illetve a megfelelő oligonukleotid változatokkal végzett ligálása, E. coli DH5 törzsbe történő transzformálás, radioaktív jelölésű oligonukleotid 4-gyel végzett telep hibridizálás, és a plazmid DNS izolálása után szekvenálással jellemezzük.
A pTZKUNl plazmid előállításához a pTZMODl plazmidot Asp718 és Sáli segítségével hasítjuk, a linearizált plazmidot polinukleotid-kinázzal foszforilezett oligonukleotid 7-12-vel (2. modul, 2. ábra) ligáljuk, E. coli DH5 törzsbe transzformáljuk, és radioaktív jelölésű oligonukleotid 11-gyei végzett telep hibridizálással izoláljuk, majd a plazmid DNS-t szekvenálással jellemezzük.
A pTZKUNIXX plazmid (XX = IL, LM, MM, LL, VL) előállításához a 2. modulhoz tartozó oligonukleotid 7-12 helyett a pTZKUNl plazmidból Asp718 és Sáli segítségével lehasított fragmenst használjuk, és egyéb szempontból a fent leírt módon járunk el.
A des[l !7]-MetI8-Xaa36-Xaa38-bikunin gél előállítása
A des[1“17]-Met18-Xaa36-Xaa38-bikunin génje olyan kettősfejű változat, amelyben aminosavcserét csak az 1. doménben hajtottunk végre. Előállításához az 1. dómén, illetve ennek változatai szintetikus génjét a 2. dómén természetes génfragmensével kondenzáljuk. A klónozási folyamatot a 4. ábra mutatja.
A pTZBIK plazmid előállításához a pTZ18R plazmidba klónozott és a1-mikroglobulin-bikunin klónból (pTZ18MBl) származó cDNS-t Sau3A restrikciós nukleázzal hasítjuk. Ennek során A fragmenst (4. ábra) kapunk, és ezt gélelektroforetikusan izoláljuk. A fragmens az oq-mikroglobulint kódoló szakasztól eltekintve a bikunin gén szinte teljes szekvenciáját tartalmazza a bikunin N-terminális peptidjének kis génszakasza mellett. A fragmens végeit Klenow enzim jelenlétében dATP-vel és dGTP-vel szelektíven feltöltjük, mungóbab-nukleázzal kisimítjuk, és HindlII-mal linearizált és végein mungóbab-nukleázzal kisimított pTZ19R plazmidba (Pharmacia) klónozzuk. A plazmidot E. coli DH5 törzsbe klónozzuk. A kapott klón plazmid DNS-ét szekvenciaanalízissel azonosítjuk.
A pTZBIKl és pTZBIRIXX (XX = IL, LM, MM, LL, VL) plazmidok előállításához a bikunin-gén 1. doménjének természetes génszakaszát a megfelelő szintetikus génszakasszal vagy annak származékával helyettesítjük. A pTZBIK-DNS-ből Sphl és PstI enzimekkel végzett hasítás után izolált C fragmenst, amely a szinte teljes 1. doménre vonatkozó génszakasz kivételével a bikunin teljes cDNS szekvenciáját tartalmazza, a megfelelően hasított pZKUNl, illetve pTZKUNIXX (XX = IL, LM, LL, VL) (lásd 3. ábra) plazmidba ligáljuk, és E. coli DH5 törzsbe klónozzuk. A kapott klón plazmid DNS-ét szekvencia analízissel jellemezzük.
A des[‘ 79]-Xaa92-Xaa94-bikunin gén, Xaa = Ile,
Leu, Met, Val, Phe előállítása
A 2. dómén génjét (des[U79]-bikunin) a bikunin gén megrövidítésével állítjuk elő (5. ábra). A génváltozatokat (des[1”79]-Xaa92-Xaa94-bikunin) a 2. dómén Apal/XmnI restrikciós fragmensének (3. modul) a megfelelő oligonukleotid A-D, illetve ezek változatai (6. ábra) segítségével végzett kicserélésével a 7. ábra szerint nyerjük.
A pTZKUN2 plazmid (5. ábra) előállításához a pTZBIKl-DNS HindlII és BspMI restrikciós nukleázzal végzett kezelésével kapott, és mungóbab-nukleázzal kisimított A fragmens, és az Xcy-I enzimmel hasított és mungóbab-nukleázzal kezelt pTZ19R vektor (Pharmacia) ligálásával kapjuk, majd E. coli DH5 sejtekbe transzformáljuk. Az egyes kiónok plazmid DNS-ét szekvencia analízissel j ellemezzük.
A pTZKUN2XX (XX = IL, LL, VL és LF) plazmid előállításához a pTZKUN2 plazmid Apal/XmnI fragmensét a 3. modul megfelelő oligonukleotidjével (lásd a 6. ábrát) helyettesítjük. A vektorfragmenst a megfelelő restrikciós nukleázzal végzett hasítással, és az 5’ vég borjúbélből származó lúgos foszfatázzal végzett defosz6
HU 214 985 Β forilezésével izoláljuk. A 3. modul polinukleotid-kinázzal foszforilezett oligonukleotidjével végzett ligálás és E. coli DH5 törzsbe történő transzformálás után az egyes kiónok plazmid DNS-ét a hasítási térkép felvételével és szekvencia analízissel jellemezzük (7, ábra).
A desfi-^j-Met^-Xaa^-Xaa^-Xaa^-Xaa^. bikunin gén előállítása
A bikunin mindkét doménben módosított génváltozatai előállításához a különböző 1. domént tartalmazó bikunin gén származékokban (pTZBIKlXX, 4. ábra) a természetes 2. dómén szakaszait a gén változatoknak megfelelő 2. dómén (7. ábra) megfelelő szakaszaival cseréljük ki a 8. ábrán megadott módon.
A pTZBIXX plazmidot EcoRI és Apai restrikciós nukleázzal hasítjuk, a DNS fragmens 5’ végét botjúbélből származó lúgos foszfatázzal defoszforilezzük, és a vektor fragmenst izoláljuk, majd a pTZKUN2XX plazmid ugyancsak izolált EcoRI/Apal fragmensével ligáljuk, és E. coli DH5 törzsbe klónozzuk. Az egyes ki ón ok plazmidját szekvencia analízissel jellemezzük.
A des fi-17.82-I47]-Met,8-Xaa36-Xaa3S-bikunin gén előállítása
Az 1. dómén C-terminális végén T-V-A-A aminosav szekvenciával meghosszabbított génje (des[1-17-82-147]-Met18-Xaa36-Xaa38-bikunin) előállításához a megfelelő bikunin változat pTZBIKlXX plazmidjában a 2. domént a oligonukleotiddal (5’CTGTGGCGGCCTGAG-3’) és b oligonukleotiddal (5’-AATTCTCAGGCCGCC-3’) cseréljük (9. ábra). Ehhez a pTZBIKlXX plazmidot BspMI és EcoRI enzimmel hasítjuk, a DNS fragmens 5’ végét borjúbélből származó lúgos foszfatázzal defoszforilezzük, a vektor fragmenst izoláljuk, és oligonukleotid jelenlétében ligáljuk. E. coli DH5 törzsbe végzett transzformálás után az egyes kiónok pTZKUNIXXc plazmidját szekvencia analízissel jellemezzük.
A bikunin változatok kifejezése
A leírt bikunin génváltozatok részben klónozóvektorban is, vagy különböző kifejező vektorba, például pJLA502 vektorba (Schauder és munkatársai: Gene, 52, 279-283, 1987), pEX3 vektorba (Stanley és Luzio: EMBO J. 3, 1429-1434, 1984) és pEX3407 vektorba (Kocken és munkatársai: FEBS Lett. 236, 132-134, 1988) történő átklónozás után kifejezhetők. így például a pTZKUNIXX, illetve PTZBIK1XX2XX plazmidból (3. és 8. ábra) Ncol/Sall, illetve NcoI/EcoRI fragmensek izolálhatok, és közvetlenül a megfelelően hasított és borjúbélből származó lúgos foszfatázzal kezelt pJLA502 vektorba ligálhatók. Hasonló fragmensek izolálhatok a pTZBIKlXX plazmidból (EcoI/EcoRI fragmens, 4. ábra), a pTZBIKlXX2XX plazmidból (NcoI/EcoRI fragmens, 8. ábra) és a pTZKUNIXX plazmidból (NcoI/HindlII fragmens, 3. ábra), ezekmungóbab-nukleázzal kisimíthatók, és pEX3 vagy pEX3407 vektorba ligálhatók.
A pTZKUN2XX plazmidból (7. ábra) EcoRI-gyel végzett hasítással, mungóbab-nukleázzal végzett kezeléssel és BamHI-gyel végzett ismételt hasítással fragmensek állíthatók elő, amelyek pEX-vektorba ligálhatók. A pEX-vektor DNS-ét ehhez vagy Sáli segítségével hasítjuk, és mungóbab-nukleázzal kezeljük, vagy mint a legutóbbi szerkezetnél, PstI segítségével hasítjuk, mungóbab-nukleázzal kezeljük és BamHI segítségével ismét hasítjuk. Az E. coli pop2136 (VidalIngigliardi and Raibaud: Nucleic Acids Rés., 13, 1163, 1985) transzformánsai lehetővé teszik a gén kifejeződés hőmérsékletfüggő szabályozását. Minden esetben fúziós fehéqék keletkeznek, amelyek egy savval hasítható Asppro-peptidkötésen keresztül a kifejezendő fehérjéhez kapcsolódnak. A fúziós fehérjerész leválasztása, tisztítás és a bikunin rész renaturálása után des[>-17]-Pro18bikunin, des[11778“147]-Pro18-bikunin és des[’-78]-Pro79bikunin inhibitor változatokat kapunk. A bikunin résznek a fúziós partnerről történő leválasztása megvalósítható a proteolitikusan (tripszinesen) különösen labilis Pro20-Lys2,-Lys22-szekvencia alkalmazásával is. Az egyesfejű változatok különösen jól exprimálhatók a szekréciós kifejezőrendszerekben.
A kifejezett termék azonosítását gélelektroforézissel (például a fúziós fehérje meghatározásához) vagy standard enzimgátló teszttel (a fúziós partner lehasítása, tisztítás és a bikunin rész renaturálása után) végezzük.
A mérési eredmények szerint például az E. coliban végzett kifejezéssel a megadott módon kapott des[1-17]Met18-Leu36-Leu38-bikunin, des[1“17]-Met18-Leu36-Leu38bikunin és desf1 l7]-Mctl8-Leu92-Leu94-bikunin potenciális proteázgátló hatással rendelkezik.
2. példa
A Leu36-Leu3S-bikunin kifejezése
A gén klónozása:
A pCY17 egy pBR322 plazmidból levezethető vektor, amely MAT-alfa-l-strukturgént tartalmaz (Kínján és Herskowitz: Cell, 30, 933, 1982). A pMT15 egy élesztő-E. coli-Shuttle vektor (10. ábra). Ez utóbbi AmpR, bla és URA3 gén szegmenst tartalmaz, amely az E. coli és az élesztő vonatkozásában szelektálható markerként szolgál. A pMT15 ezenkívül pBR322-ből származó ColEl-eredetet hordoz, és a 2 u plazmid B formájának egy szegmensét tartalmazza, ezért a plazmid E. coliban is, és élesztőben is stabilan szaporítható. Ezenkívül Matl-alfa-promotert és a pCY17 plazmidból származó EcoRI-HindlII fragmens, az lf-faktor előfehéije N-terminális pre-pro-szekvenciáját tartalmazza. A plazmid 3’ végéhez egy 115 bp HindlII-BamHI-fragmens kapcsolódik, amely a pre-invertáz 34 N-terminális aminosavját kódolja (Das és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 218, 240, 1989). Emellett a pMT15 a BamHI hasítóhely 3’ végén egy 160 bp élesztő transzkripciós terminátor fragmenst tartalmaz, amely az élesztő URAT génből állítható elő (Yarger és munkatársai: Mól. Cell. Bioi., 8,1095,1986).
A pMT15235 bp Pstl-HindlII-fragmensét, amely az alfa-faktor pre-pro-vezérszekvencia kódoló szakaszát tartalmazza, M13mpl8 vektorba klónozzuk, és a mutagén
5’-GAA GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3 ’
HU 214 985 Β oligonukleotid felhasználásával célzott mutációt hajtunk végre. A mutáció eredményeként az alfa-faktor pre-pro-szekvencia 81. helyzetében található szerin-kódot TCT-ről AGC-re változtatjuk, miáltal HindlII hasítóhelyet kapunk. Az így előállított 213 bp PstlHindlII fragmenst (11. ábra) a pMT15 plazmádban a 235 bp Pstl-HindlII fragmens helyére építjük be. Az így módosított plazmid a pS600 jelet kapja, és a Lys-ArgGlu-Ala-Glu-Ala szekvencia helyett a Lys-Arg szekvenciakódját tartalmazza (12. ábra).
Leu36-Leu38-bikunin gén előállítása:
A PIM1 plazmidból egy 540 bp Sau3AI-ffagmenst (Das és Lehman: J. Cell. Biochem. 2B, 284, 1988), amely a bikunin kódoló szekvenciáját tartalmazza (13.
ábra), M13mpl9-be klónozzuk, és célzott mutációt hajtunk végre, amellyel Met36 helyett Leu36 és Met38 helyett Leu38 cserét kapunk. A mutációt Syers és munkatársai módszerével (Nucl. Acids. Rés. 16, 79, 1988) hajtjuk végre. Emellett egy kettősszálú DNS fragmenst állítunk elő az alábbi szekvenciával:
5’ ... AGC TTG GAT AAA AGA GCT GTG CTA CCC CAA 3 AC CTA TTT TCT CGA CAC GAT GGG GTT
GAA GAG GAA G.......3’
CTT CTC CTT CCT AG... 5’.
A DNS fragmenst a szokásos módon foszforilezzük, majd a mutált bikunin-szekvenciával együtt a HindlIImal és a BamHI-gyel hasított 8,2 bp pS600 plazmidba építjük. Az oligomer visszaállítja a pre-pro-alfa-faktor 20 szekvencia 3’ végét és a bikunin-szekvencia 5’ végét.
Az így kapott új pLLB3638 plazmid a pre-pro-alfa-faktor szekvencia Lys-Arg hasítási hellyel ellátott kódoló szakaszát tartalmazza, amelyhez Leu36-Leu38-bikunin szekvencia kapcsolódik. A pLLB3638 plazmidban ta- 25 lálható pre-pro-alfa-faktor Leu36-Leu38-bikunin fúziós helyének DNS-ét és a megfelelő aminosav-szekvenciát a 14. ábra mutatja.
Az inhibitor aktivitású Leu36-Leu38-bikunin kifejezése, kiválasztása és analízise: 30
A fent leírt módon az SCI06 élesztő sejtvonalak (MÁT, hom3, gal2, his6, ura3) pLLB3638 plazmiddal transzformáljuk, az URA3+-sejteket izoláljuk, és tenyésztjük, majd vizsgáljuk a felülúszó elasztáz-inhibitor aktivitását. A kontrollvizsgálatban bemutatjuk, hogy 35 a pS600-zal transzformált SCI06 sejtek elasztáz-inhibitor aktivitást nem termelnek.
A kapott eredmények igazolják, hogy a Saccharomyces cerevisiae-ben kifejezett Leu36-Leu38-bikunin gén a tény észközegben két fehéijét termel, amelynek 40 tulajdonságai:
a) tripszin inhibitor hatás,
b) SDS-oliakrilamid gélen végzett elektroforézis szerint 20 k és 17 k móltömeg,
c) mintegy 60% bikunin N-terminális szekvencia és mintegy 40% des(Ala-l)-bikunin szekvencia.
3. példa
Leu92-Leit9*-bikunin kifejezése
A gén klónozása:
A pIMl-DNS 540 bp Sau3Al-fragmensét (Das és Lehman: J. Cell. Biochem. 12 B, 284, 1988), amely tartalmazza a bikunin kódoló szakaszát (13. ábra), M13mpl9 plazmidba klónozzuk, és célzott mutációval az Arg92-t Leu92-re, és a Phe94-et Leu94-re változtatjuk.
Az így módosított fragmenst az 1. példában leírt módon pS600 plazmidba klónozzuk. A pLLB9294 kifejező vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor Leu92-Leu94-bikunin gén fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciáját a 15. ábra mutatja.
A Leu92-Leu94-bikunin kifejezése, kiválasztása és az inhibitor hatás igazolása:
A fent leírt módon az SC 106-ot pLLB9294-gyel transzformáljuk, az URA3+ sejteket izoláljuk, és tenyésztjük, a felülúszóban az elasztáz inhibitor hatást mérjük. A kontrollvizsgálatban kimutatjuk, hogy a pS600-zal transzformált SC106-sejtek elasztáz inhibitor aktivitást nem termelnek.
A kapott eredmények igazolják, hogy a Saccharomyces cerevisiae-ben kifejezett Leu92-Leu94-bikunin gén a tenyészközegben két fehérjét termel, amelynek tulajdonságai:
a) elasztáz inhibitor hatás,
b) SDS-poliakrilamid gél elektroforézis szerint 20 k és k móltömeg,
c) mintegy 60% bikunin N-terminális szekvencia és mintegy 40% des(Ala-l)-bikunin szekvencia.
4. példa
Leu26-Leu2S-Letd2-Leu9A-bikunin kifejezése
A gén klónozása:
A pIMl-DNS 540 bp Sau3AI fragmensét (Das és Lehmann: J. Cell. Biochem. 12 B, 284, 1988), amely tartalmazza a bikunin kódoló szekvenciát (13. ábra), pM13mpl9 plazmiddal klónozzuk, és célzott mutációt hajtunk végre, amelynek során a Met36-ot Leu36-ra, a Met38-at Leu38-ra, az Arg92-t Leu92-re és a Phe94-et Leu94-re cseréljük. Az így módosított fragmenst az 1. példában megadott módon a pS600 plazmidba klónozzuk. A p4LB kifejező vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor Leu36-Leu38-Leu92-Leu94-bikunin gén fúziós helyének DNS és aminosav-szekvenciáját a 16. ábra mutatja.
A Leu36-Leu38-Leu92-Leu94-bikunin kifejezése, ki50 választása és az inhibitor aktivitás igazolása:
A fent leírt módon az SC 106-ot p4LB-vel transzformáljuk, az URA3* sejteket izoláljuk, és tenyésztjük. A felülúszóban vizsgáljuk az elasztáz inhibitor aktivitást. A kontrolikísérletben a pS600 plazmiddal transz55 formált SCI06 sejtek elasztáz inhibitor aktivitást nem termelnek.
A kapott eredmények igazolják, hogy a Saccharomyces cerevisiae-ben kifejezett Leu36-Leu38-Leu92Leu94-bikunin gén két fehéijét termel, amelynek tulaj60 donságai:
HU 214 985 Β
a) elasztáz inhibitor hatás,
b) SDS-poliakrilamid gél elektroforézis szerint 20 k és 17 k móltömeg,
c) mintegy 60% bikunin N-terminális szekvencia és mintegy 40% des(Ala-l)-bikunin szekvencia.
5. példa
Desf -2ü-Leu^-Leu^-bikunin kifejezése A gén klónozása:
A pIMl-DNS 480 bp PvuII fragmensét (Das és Lehmann: J. Cell. Biochem. 12 B, 284, 1988), amely a des[*-21]- bikunin kódoló szakaszát tartalmazza (13. ábra), M23mpl9 plazmidba klónozzuk, és célzott mutáci5 ót hajtunk végre, amellyel a Met36-ot Leu36-ra, és a Met38-at Leu38-ra változtatjuk. A mutációt Sayers és munkatársai (Nucl. Acids. Rés. 16, 791, 1988) végezzük. Ezenkívül egy kettősszálú DNS fragmenst állítunk elő, amelynek szekvenciája:
5-AGC TTG GAT AAA AGA AAA GAA GAT TCC TGC CAG-3’ AC CTA TTT TCT TTT CTT CT A AGG ACG GTC -5 ’
A DNS fragmenst a szokásos módon foszforilezzük. Ezután a mutált bikunin-szekvenciával együtt HindlIImal és BamHI-gyel emésztett 8,2 bp PS600 plazmidba építjük be. Az oligomer visszaállítja a pre-pro-alfa-faktor szekvencia 3 ’ végét és a bikunin-szekvencia 5 ’ végét. Az így kapott új pDLLB-121 plazmid a pre-pro-alfa-faktor szekvencia Lys-Arg hasítóhellyel ellátott kódoló szakaszát tartalmazza, amelyhez des[l2l]-Leu36Leu38-bikunin szekvencia kapcsolódik. A pDLLB121 plazmidban található pre-pro-alfa-faktor-Leu36Leu38-bikunin fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciáját a 17. ábra mutatja.
A des[l“21]-Leu36-Leu38-bikunin kifejezése, kiválasztása és az inhibitorhatás igazolása:
A fent leírt módon az SC106-ot pDLLB-121 plazmiddal transzformáljuk, az URA3+ sejteket izoláljuk, és tenyésztjük. A tenyészközegben vizsgáljuk az elasztáz inhibitor aktivitást. A kontrolikísérlet igazolja, hogy a pS600 plazmiddal transzformált SCI06 sejtek elasztáz inhibitor aktivitást nem termelnek.
A mérési eredmények szerint a Saccharomyces cerevisiae-ben kifejezett des[* 2l]-Lcu36-Leu38-bikunin gén a tenyészközegben egy fehérjét termel, amelynek tulajdonságai:
a) tripszin inhibitor hatás,
b) SDS-poliakrilamid gél elektroforézis szerint 17 k és k móltömeg,
c) a fehérje a des[1-21]-bikunin N-terminális Lys-GluAsp-Ser-Cys-szekvenciáját mutatja.
Az ábrák értelmezése:
Az 1. ábra a humán bikunin primer szerkezetét mutatja. Az N-terminális peptid (1-21 pozíció), valamint az
1. dómén (22-77 pozíció) és a 2. dómén (78-147 pozíció) tripszines hasítással nyerhető. A nyilak a különböző exonok által kódolt szekvenciákat, a csillagok a reaktív centrumok megváltoztatott Pj és P2> maradékát mutatják. A bikuninban lévő két inhibitor dómén azonos aminosav-maradékot függőleges vonalak emelik ki.
A 2. ábra a dest'-^^s-'^j-Met^-bikunin gén a (pTZKUNl) és a des['-iV8-i47]_Meti8-Xaa36-Xaa38bikunin változat szerkezetét és alapgén oligonukleotid szekvenciáját mutatja. A változatban kicserélt maradékokat kettős aláhúzás jelöli. A gén 5’ terminális részén a CCATGG Ncol felismerő szekvencia első kódoló része, míg a gén 3 ’ terminális részén egy GTCGAC Sáli felismerő szekvenció három, egymást követő stop kód részének harmadik kódjának utolsó nukleotidja található. Az egyes modulokat határoló Ncol, Asp718 és Sáli felismerő helyeket egyszeres aláhúzással jelöljük. A génszerkezethez alkalmazott oligonukleotidokat nyilak jelölik, és meg vannak számozva.
A 3. ábra a des[l l7.78-|47]-Metl8-bikunin gén (pTZKUNl) és a des[1-17.78-i47]-Mefi8-Xaa36-Xaa38bikunin változat (pTZKUNlXX) klónozását mutatja.
A 4. ábra a des[117]-bikunin gén (pTZBIK), illetve a des[ul7]-Met18-bikunin (pTZBIKl) és a des^-'J-Mct18Xaa36-Xaa38-bikunin gén (pTZBIK 1XX) klónozását mutatja. M jelentése aj-mikroglobulin, Dl és D2 jelentése 1. és 2. dómén, N jelentése N-terminális peptid, C jelentése C-terminális szekvencia, KUNI jelentése Módi és Mod2 modulból álló szintetikus 1. dómén. A klónozási folyamat során kieső hasítási helyeket a kapott plazmidba bevisszük, de nem jellemezzük. A B és D fragmenseket - ha önmagukban nincsenek előállítva - a jobb tájékoztatás érdekében megjelöljük.
Az 5. ábra a desf'-^j-bikunin gén (pTZKUN2) klónozását mutatja. D2 jelentése 2. dómén, D jelentése C-terminális szekvencia, KUNI jelentése Módi és Mod2 modulból álló szintetikus 1. dómén. A klónozási folyamat során kieső hasítási helyeket a kapott plazmidba jellemzés nélkül bevisszük. Az egyes fragmenseket - ha önmagukban nincsenek előállítva, ilyen például a B és C fragmens - a jobb tájékoztatás érdekében megadjuk.
A 6. ábra a 2. dómén génváltozatainak előállítását mutatja: des[' 79]-Xaa92-Xaa94-bikunin változatok és des [1 -17 ] -Met18-Leu36-Leu38-Leu92-Leu94-bikunin, Xaa92-Xaa94 = Ile, Leu, Met, Val, Phe. Látható a természetes bikunin szekvencia a 2. doméntől (78 pozíció) és a szintetikus oligonukleotid A-D (nyilak), amelyekben a bikunin 92 és 94 pozíciója kódját (kettős aláhúzás) az A és B oligonukleotidban az egyes változatoknak megfelelően helyettesítjük (Ile:ATC, Leu:CTG, Val:GTT, illetve az ellenkező szálban ezek komplementer szekvenciái). Az Apai restrikciós nukleáz-felismerő helyét (GGGCCC) és az Xmnl restrikciós nukleáz-felismerő helyét (GAANNNTTC) egyszeres aláhúzás jelöli.
A 7. ábra a des[1-79]-Xaa92-Xaa94-bikunin gén változatok, Xaa = Ile, Leu, Met és Val, klónozását mutatja.
D2 jelentése 2. dómén, KUN2 jelentése a természetes Xmnl/Apai fragmens helyett szintetikus 3. modult tartalmazó 2. dómén, C jelentése C-terminális szekvencia.
A 8. ábra a des[117]-Met18-Xaa36-Xaa38-Xaa92Xaa94-bikunin gén változatok, Xaa = Ile, Leu, Met, Val,
HU 214 985 Β
Phe, klónozását mutatja. KUNI jelentése 1. és 2. modulból álló szintetikus 1. dómén, KUN2 jelentése a természetes XmnI/Apal fragmens helyett szintetikus 3. modult tartalmazó 2. dómén, C jelentése C-terminális szekvencia. A 9. ábra des^-17· 82“147]-Met18-Xaa36Xaa38-bikunin gén klónozását mutatja (az 1. dómén Cterminálisan T-V-A-A aminosav meghosszabbítást tartalmaz). KUNI jelentése 1. és 2. modulból álló szintetikus 1. dómén, D2 jelentése 2. dómén, C jelentése C-terminális szekvencia, a és b jelentése oligonukleotid linker (lásd a leírás megfelelő részét).
A 10. ábra a pMT15 E. coli-élesztő Shuttle vektort mutatja.
A 11. ábra az alfa-faktor-vezérszekvencia célzott mutációjának vázlata. A TCT AGC-re történő kicserélése megkönnyíti a 213 bp Pstl-HindlII fragmens izolálását, amelyet I jelöl.
A 12. ábra módosított élesztő-E. coli-Shuttle vektor előállítását mutatja, amely lehetővé teszi a bikunin kifejezését és kiválasztását alfa-faktor-promotor és módosított alfa-faktor-vezérszekvencia alkalmazásával. A módosított alfa-faktor-vezérszekvenciát (all. ábrán I-gyel jelölve) Pstl-HindlII gén fragmensként a pMT15 vektorba építjük be, és ott az eredeti alfa-faktor-vezér-szekvencia helyett alkalmazzuk.
A 13. ábraapMT15 E. coli-élesztő-Shuttle vektorba klónozott természetes bikunin gént mutatja, amely alfafaktor pre-pro-szekvenciát tartalmaz.
A 14. ábra a pLLB3638 kifejező vektort mutatja. Ez pS600 vektorba klónozott pre-pro-alfa-faktor-Leu36Leu38-bikunin gén fúzió. Az ábrán látható a pLLB3638 kifejező vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor-Leu36Leu38-bikunin fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciája. A Lys-Arg a pre-pro-alfa-faktor szekvencia KEX-2 helye (Julius és munkatársai: Cell, 37, 1075, 1984). Az 1-38 aminosav számozás megfelel a bikunin szekvenciának.
A 15. ábra a pLLB9294 kifejező vektor, amely pS600 vektorba klónozott pre-pro-alfa-faktor-Leu92Leu94-bikunin gén fúzió. A pLLB3638 vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor-Leu92-Leu94-bikunin fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciáját mutatja. A Lys-Arg a pre-pro-alfa-faktor-szekvencia KEX2 helye (Julius és munkatársai: Cell, 37, 1075, 1984). Az 1-94 aminosav számozás megfelel a bikunin szekvenciának.
A 16. ábra p4LB kifejező vektor, amely pS600 vektorba klónozott pre-pro-alfa-faktor Leu36-Leu38-Leu92Leu94-bikunin gén fúzió. Az ábra a p4LB vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor- Leu36-Leu38-Leu92-Leu94-bikunin fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciáját mutatja. A Lys-Arg a pre-pro-alfa-faktor szekvencia KEX2 helye (Julius és munkatársai: Cell 37, 1075, 1984). Az 1-94 aminosav-számozás megfelel a bikunin szekvenciának.
A 17. ábra pDLLB-121 kifejező vektor, amely pS600 vektorba klónozott pre-pro-alfa-faktor-des[1_21]Leu35-Leu38-bikunin gén fúzió. Az ábra a pDLLB121 vektorban lévő pre-pro-alfa-faktor-des['-21]-Leu36Leu38-bikunin fúziós helyének DNS és aminosav szekvenciáját mutatja. A Lys-Arg a pre-pro-alfa-faktor szekvencia KEX2 helye (Julius és munkatársai: Cell, 37,1075, 1984). Az 1-38 aminosav-számozás megfelel a bikunin szekvenciáinak.
Claims (6)
1. Eljárás proteináz-inhibitor előállítására, amely a humán bikunin 21-147 aminosav szekvenciáját tartalmazza, és amely a
36 pozícióban Met helyett Leu, Ile, Val, Arg, Phe, Tyr, Trp, Lys maradékot,
38 pozícióban Met helyett Leu, Arg, Ile, Val, Lys maradékot,
92 pozícióban Arg helyett Leu, Ile, Val, Phe, Lys maradékot,
94 pozícióban Phe helyett Leu, Arg, Lys, Ile, Val maradékot tartalmaz tetszőleges kombinációban, azzal jellemezve, hogy az inhibitort kódoló nukleinsawal módosított gazdasejtet tenyésztünk, és az inhibitort a tenyészközegből izoláljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a 36 és 38 pozícióban Met helyett nem oxidálható aminosav maradékot tartalmazó proteináz-inhibitor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő nukleinsawal megváltoztatott sejtet tenyésztjük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás N-terminálisan a bikunin természetes 1-21 szekvenciájából levezethető aminosav-szekvenciával meghosszabbított proteináz-inhibitor előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő nukleinsawal megváltoztatott sejtet tenyésztjük.
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 Ν 15/15
10 20 fi V l P C Ε £ í E S £ E £ fi l V ΐ Ε V I K
22 JO I I 40 50 00 70 77
Ϊ £ I S C Β l Β Y S í B F £ Β Ε B 1 S Β Y F Y Β Β T S « » C £ I F Β ϊ E S C Β Ε Β E H K F V 1 E fi E £ l Β 1 C 1
I I III II UH lill I Ilii I *B eo ÍO I I 100 11· 120 133
TVÍBCBLFÍVBEFCBBF1 BIBBF BBBBIIEBLFFYSBEBEBEBKFYSEFEEBEYES
Λ
140 »7
VFEBEtEELlBFSI
1. ábra
Kcol 22 30 36
MVTKXEDSCQLGYSAGPCg
CCATGGTAACTAAAAAAGAAGACTCTTGCCAGCTGGGCTACTCTGCTGGTCCGTGCATGG 60 CAT7GATTTTTTCTTCTGAGAACGGTCGACCCGATGAGACGACCAGGCACGTACC <---------4-------X-----—5----Modulé 1 < > Modulé 2
36 40 Aap716 50
GJJTSRYFYNGTSMACETFQY
-2-X---3--x---7------GT^TGXCTrCTCGTTACTTCTACAACGGTACCTCTATGGCTTGCGAAAC'TrrCCAGTACG 120 CATACTGAAGAGCAATGAAGATGTTGCCATGGAGATACCGAACGCTTTGAAAGG7CATGC _ x-6---X-------j o60 70
GGCMGNGNNFVTEKECLQTC — X-----6---------X------9--GTGGTTGCATGGGTAACGGTAACAACTTCGTTACTGAAAAAGAATGCCTGCAGACTTGCC 160 CACCAACGTACCCATTGCCAITGTTGAAGCAATGACTTTTTCTTACGGACGTCTGAACGG ----X----u------x---íj-R endendend Sáli --->
GTTAATGATAG CAATTACTAT£iGCIg —->
2. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 N 15/15
Η.η-.'’IScJ Αβ'.β EeoRI
I-’-i-^T7prsm
Hindin Soll Mp7«8 NecI ’-*-*-V7p.-o^ |—
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12N 15/15
GariHI
Hir.eZE EcoRJ Sou3A EcoRI 1-1-^1?2ΐ5ϋ^ΗΖΐΐΖΖ.£ίΕ>,
1. Sou3A
2. Klenow enzyme + dATP + dGTP
3. Mung bean nuclease
6 Lipcse *D-F
1, Sphl/Pstl
2. Fragment C isolated
4. Lipcse
HndUI Sphl Kcol
4. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 N 15/15
I—a-1 Fed-c--
FBd-A-1- C-OnBT RnmUr «rviTIT
5. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 N 15/15
70 80 90 92 94 97
TVAACNLPIVRGPCgAglQL <-----λ--------------AC7G7GGCGGCC7GCAA7C7CCCCA7AG7CCGGGGCCCC7GC££AGCCTI£A7CCAGC7C
7GACACCGCCGGACG77AGAGGGG7A7CAGGCCCCGGGGACGGACCGGAAG7AGG7CGAG
100 110 WAFDAVKGKCVLFPYGGCQG
7GGGCA7T7GA7GC7G7CAAGGGGAAG7GCGTCC7CT7CCCC7ACGGGGGCTGCCAGGGC
ACCCG7AAAC7ACGACAGTTCCCC77CACGCAGGAGAAGGGGA7GCCCCCGACGG7CCCG
120 130
NGNKFYSEKECREYCGVPGD
AACGGGAACAAGT7C7AC7CAGAGAAGGAG7GCAGAGAG7AC7GCGG7G7CCC7GG76AT
T7GCCC77GT7CAAGATGAG7CTCT7CC7CACGTC7C7CA7GACGCCACAGGGACCAC7A
140 147
GDEELLRFSN
GG7GA7GAGGAGCTGCTGCGC7TC7CCAACTGACAAC7GGCCGG7CTGCAAG7CAGAGGA
CCAC7AC7CCTCGACGACGCGAAGAGGT7GAC7GTTGACCGGCCAGACGTTCAGTC7CCT
7GGCCAG7G7C7GTCCCGGGGTCC7G7GGCAGGCAGCGCCAAGCAACC7GGG7CCAAA7A
ACCGG7CACAGACAGGGCCCCAGGACACCG7CCG7CGCGGTTCG77GGACCCAGG777AT
AAAAC7AAA7TG7AAAC7CC7GAAAAAAAAAAAAAAAAA
77T7GA7TTAACA7T7GAGGACi'ri Iliül Iliiül I
6. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 Ν 15/15
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 Ν 15/15
ΗιηέΟ h-A-1
EceRI ApcI
-1—(cJkut? |-krr7 om
Hindi EcoRI Apsl Htel l-L-jcI 03 |κ^ϊ1τ7ρΓοη> >
1 EcoRI) Ápol
2 Isolation of the vector fragnent
3 EceKI/Apol
4 Isolátjön of fragnant A
5 UgoM
Hindi EcoRI Ápol Hcol
I L
U jC^2lKuolll7prom > .
pTZfliKtXX2XX
8. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 N 15/15
9. ábra
HU 214 985 Β
Int. Cl.6: C 12 N 15/15
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3915689 | 1989-05-13 | ||
DE4001244 | 1990-01-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU903010D0 HU903010D0 (en) | 1990-09-28 |
HU214985B true HU214985B (hu) | 1998-08-28 |
Family
ID=25880860
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU903010A HU214985B (hu) | 1989-05-13 | 1990-05-11 | Eljárás proteináz-inhibitorok előállítására |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5407915A (hu) |
EP (1) | EP0401508B1 (hu) |
JP (2) | JP3126975B2 (hu) |
KR (1) | KR0156246B1 (hu) |
AT (1) | ATE114332T1 (hu) |
AU (1) | AU623769B2 (hu) |
CA (1) | CA2016627C (hu) |
DE (1) | DE59007737D1 (hu) |
DK (1) | DK0401508T3 (hu) |
ES (1) | ES2066033T3 (hu) |
GR (1) | GR3015124T3 (hu) |
HU (1) | HU214985B (hu) |
IE (1) | IE65710B1 (hu) |
IL (1) | IL94349A (hu) |
NZ (1) | NZ233635A (hu) |
PH (1) | PH27530A (hu) |
PT (1) | PT94016B (hu) |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060134087A1 (en) * | 1988-09-02 | 2006-06-22 | Dyax Corp. | ITI-D1 Kunitz domain mutants as hNE inhibitors |
US5663143A (en) * | 1988-09-02 | 1997-09-02 | Dyax Corp. | Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase |
US7078383B2 (en) * | 1988-09-02 | 2006-07-18 | Dyax Corp. | ITI-D1 Kunitz domain mutants as HNE inhibitors |
CA2055425A1 (en) * | 1990-11-13 | 1992-05-14 | Hideaki Morishita | Polypeptide, dna fragment encoding the same and process for producing the same, and enzyme inhibition process, drug composition and methods of treating using the same |
ES2124203T3 (es) * | 1991-03-01 | 2004-04-16 | Dyax Corp. | Inhibidores de la elastasa neutrofila humana y la catepsina g humana. |
CA2082226A1 (en) * | 1991-11-08 | 1993-05-09 | Hideaki Morishita | Polypeptide, dna fragment encoding the same, drug composition containing the same and process for producing the same |
IL104327A0 (en) * | 1992-01-07 | 1993-05-13 | Novo Nordisk As | Variant of human kunitz-type protease inhibitor |
JP2769083B2 (ja) * | 1993-02-22 | 1998-06-25 | 日清食品株式会社 | エラスターゼ阻害活性を有する新規ペプチドおよびその製造方法 |
JP3570558B2 (ja) * | 1993-05-01 | 2004-09-29 | 持田製薬株式会社 | Dna断片およびそれを含むベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体、該ベクターを用いる蛋白質の産生方法 |
US5650394A (en) * | 1993-11-04 | 1997-07-22 | Adeza Biomedical | Use of urinastatin-like compounds to prevent premature delivery |
ATE529444T1 (de) | 1994-01-11 | 2011-11-15 | Dyax Corp | Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten |
US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
AU4868096A (en) * | 1995-02-23 | 1996-09-11 | Adeza Biomedical Corporation | Polypeptides derived from urinastatin having calcium channel blocking activity and their use to delay premature delivery |
BR9708021A (pt) * | 1996-03-11 | 1999-07-27 | Bayer Ag | Proteína substancialmente purificada composição farmacêutica sequência de ácido nucleico isolada vetor de express o de protéina auto-replicante e processos para inibir a atividade de protéinas de serina tratar uma condição e preparar um medicamento de uma proteína |
ES2209542T3 (es) * | 1998-12-22 | 2004-06-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Metodo para acelerar la velocidad de eliminacion mucociliar usando un inhibidor de serinproteasa de tipo kunitz. |
US20070140979A1 (en) * | 1998-12-22 | 2007-06-21 | Bayer Aktiengesellschaft | Method for accelerating the rate of mucociliary clearance |
US6660482B1 (en) * | 2000-02-28 | 2003-12-09 | Rhode Island Hospital | Inter-alpha-trypsin inhibitor as a marker for sepsis |
EP1374469A1 (en) * | 2001-03-27 | 2004-01-02 | Aware, Inc. | Receiver transparent q-mode |
CA2488558C (en) | 2002-06-07 | 2013-08-20 | Dyax Corp. | Prevention and reduction of blood loss |
US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
DK2386310T3 (en) | 2002-08-28 | 2019-02-25 | Dyax Corp | Methods of preserving organs and tissues |
DE602004031589D1 (de) * | 2003-01-07 | 2011-04-14 | Dyax Corp | Kunitz-domäne-bibliothek |
US6989369B2 (en) * | 2003-02-07 | 2006-01-24 | Dyax Corp. | Kunitz domain peptides |
US7235530B2 (en) | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
WO2010080833A1 (en) * | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
SI2521568T1 (sl) | 2010-01-06 | 2019-01-31 | Dyax Corp. | Proteini, ki vežejo plazemski kalikrein |
IL269565B2 (en) | 2011-01-06 | 2024-06-01 | Dyax Corp | KALLIKREIN PLASMA BINDING PROTEINS |
EP3110434B1 (en) | 2014-02-24 | 2018-09-19 | Takeda GmbH | Uti fusion proteins |
BR112016022318A2 (pt) | 2014-03-27 | 2017-10-31 | Dyax Corp | método, composição farmacêutica para uso no tratamento de doenças de retina e uso de um anticorpo |
JP7003354B2 (ja) | 2015-12-11 | 2022-03-04 | 武田薬品工業株式会社 | 遺伝性血管性浮腫の発作を治療するための血漿カリクレイン阻害薬およびその用途 |
US11725043B2 (en) | 2020-03-05 | 2023-08-15 | DiaMedica USA Inc. | Ulinastatin polypeptides |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU560584B2 (en) * | 1983-07-28 | 1987-04-09 | Bayer Aktiengesellschaft | Homologues of aprotinin |
US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
FR2599752B1 (fr) * | 1986-06-10 | 1989-11-03 | Transgene Sa | Variants de l'alpha1- antitrypsine utiles notamment comme inhibiteurs de la kallikreine |
FR2601033B1 (fr) * | 1986-07-02 | 1990-01-19 | Transgene Sa | Variants de l'alpha-antitryspine humaine glycosylee et procede pour la preparation |
EP0255011A3 (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-23 | Miles Inc. | Human inter-alpha-trypsin inhibitor gene |
-
1990
- 1990-05-01 DK DK90108284.2T patent/DK0401508T3/da active
- 1990-05-01 AT AT90108284T patent/ATE114332T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-01 DE DE59007737T patent/DE59007737D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-01 ES ES90108284T patent/ES2066033T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-01 EP EP90108284A patent/EP0401508B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-02 PH PH40464A patent/PH27530A/en unknown
- 1990-05-10 NZ NZ233635A patent/NZ233635A/en unknown
- 1990-05-10 IL IL94349A patent/IL94349A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-05-11 PT PT94016A patent/PT94016B/pt active IP Right Grant
- 1990-05-11 HU HU903010A patent/HU214985B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-05-11 JP JP02120186A patent/JP3126975B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-11 IE IE171390A patent/IE65710B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-05-11 AU AU54970/90A patent/AU623769B2/en not_active Ceased
- 1990-05-11 CA CA002016627A patent/CA2016627C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-05-12 KR KR1019900006865A patent/KR0156246B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-03-05 US US08/027,602 patent/US5407915A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-02-22 GR GR940403586T patent/GR3015124T3/el unknown
-
2000
- 2000-09-13 JP JP2000278172A patent/JP2001112492A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2016627A1 (en) | 1990-11-13 |
IE65710B1 (en) | 1995-11-15 |
GR3015124T3 (en) | 1995-05-31 |
PT94016B (pt) | 1997-05-28 |
ATE114332T1 (de) | 1994-12-15 |
EP0401508A3 (de) | 1991-03-27 |
IE901713L (en) | 1990-11-13 |
US5407915A (en) | 1995-04-18 |
PT94016A (pt) | 1991-01-08 |
IL94349A (en) | 1998-01-04 |
CA2016627C (en) | 2000-08-22 |
JPH03255099A (ja) | 1991-11-13 |
PH27530A (en) | 1993-08-18 |
JP2001112492A (ja) | 2001-04-24 |
DE59007737D1 (de) | 1995-01-05 |
AU623769B2 (en) | 1992-05-21 |
AU5497090A (en) | 1990-11-15 |
KR900017607A (ko) | 1990-12-19 |
HU903010D0 (en) | 1990-09-28 |
JP3126975B2 (ja) | 2001-01-22 |
EP0401508B1 (de) | 1994-11-23 |
EP0401508A2 (de) | 1990-12-12 |
IL94349A0 (en) | 1991-03-10 |
KR0156246B1 (ko) | 1998-11-16 |
NZ233635A (en) | 1991-12-23 |
DK0401508T3 (da) | 1995-05-15 |
ES2066033T3 (es) | 1995-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU214985B (hu) | Eljárás proteináz-inhibitorok előállítására | |
JP2537507B2 (ja) | 組換え宿主から生産されたアプロチニン相同体、それらのための方法、発現ベクタ−および組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 | |
JP2894354B2 (ja) | 組換えdna技術によつて産生されたウシ膵臓トリプシン阻害剤の変異型、それらの方法、発現ベクターおよび組換え宿主、およびそれらの製薬学的使用 | |
Skriver et al. | CpG mutations in the reactive site of human C 1 inhibitor | |
CA1341211C (en) | Mini-proinsulin, its preparation and use | |
FI106471B (fi) | Menetelmä polypeptidien valmistamiseksi, polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi, ilmentämisvektori ja isäntäsolu | |
JPS63169994A (ja) | 組換え宿主によつて生成された膵臓分泌トリプシン阻害剤およびその変異型、方法、発現ベクターおよびそのための組換え宿主およびその製薬学的使用 | |
HU204563B (en) | Process for producing recombinant serine-protease inhibitors and dns sequencyes for them | |
US6875589B1 (en) | Mini-proinsulin, its preparation and use | |
AU632361B2 (en) | Recombinant aprotinin variants - genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
HU219302B (en) | Aprotinin analogues | |
Chen et al. | Chemical synthesis, molecular cloning, and expression of the gene coding for the Trichosanthes trypsin inhibitor—a squash family inhibitor | |
AUERSWALD et al. | Synthesis, cloning and expression of recombinant aprotinin | |
KR940003690B1 (ko) | 단백질 또는 당단백질의 제조방법 | |
AU611676B2 (en) | Hybrid serpins and dna coding for them | |
US5231010A (en) | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof | |
WO1991009947A1 (en) | Polypeptides having serine protease inhibitor activity and dna coding therefor | |
IL81879A (en) | Purification of minactivin for homogeneity, production of minactivin as recombinant techniques, and uses of homogeneous or recombinant minactivin | |
Black et al. | Identification of an RNA‐Binding‐Loop in the N‐Terminal Region of Signal‐Recognition‐Particle Protein SRP19 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |