HU213566B - Process for producing equine interferon-gamma - Google Patents

Process for producing equine interferon-gamma Download PDF

Info

Publication number
HU213566B
HU213566B HU875549A HU554987A HU213566B HU 213566 B HU213566 B HU 213566B HU 875549 A HU875549 A HU 875549A HU 554987 A HU554987 A HU 554987A HU 213566 B HU213566 B HU 213566B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
aaa
ctg
aac
cag
ttc
Prior art date
Application number
HU875549A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46066A (en
Inventor
Rudolf Hauptmann
Adolf Himmler
Peter Swetly
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HUT46066A publication Critical patent/HUT46066A/hu
Publication of HU213566B publication Critical patent/HU213566B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás ló-gamma-interferon (EqlFNγ, equine interferon-gamma), e polipeptidet kódoló DNS-szekvencia, e DNS-szekvenciát tartalmazó megfelelő vektorok és gazda mikroorganizmusok előállítására.
A találmány további tárgyát képezi azon DNS-rész- 5 szekvenciák előállítása is, amelyek a természetes EqIFN-γ-polipeptidtől szerkezetileg eltérő polipeptideket kódolják. Leírjuk ezenkívül ezen fehérjék alkalmazását.
Az interferonok olyan fehérjék, amelyeket eukarióta sejtek választanak ki vírusfertőzés vagy más ingerek 10 hatására és amelyek képesek ezeket a sejteket a vírusfertőzésekkel szemben megvédeni. Az interferonok három osztálya ismeretes, melyek elnevezése a következő: alfa-interferon, béta-interferon és gamma-interferon (rövidítve: IFN-a, IFN-β és IFN-γ). Ezek felépítésükben és 15 hatásukban különböznek egymástól. Az interferonok szabályozhatják a sejtek immunrendszerét vagy befolyásolhatják a sejtek differenciálódását és a tumorok növekedését.
F. Wheelock 1965-ben felfedezett egy polipeptidet, 20 amely bizonyos sejteket megvédett a vírusfertőzéstől [Science, 149, 310 (1965)]. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező polipeptideket immun-interferonnak, III. típusú interferonnak, gamma-interferonnak vagy IFN-γnak nevezték, bár ezek a limfokin osztályba tartozó 25 polipeptideknek tekinthetők. A humán gamma-interferon mellett eddig ismertté váltak marha-, egér- és patkány-gamma-interferonok is. Az eddig megismert gamma-interferonok mindegyike glükozilált formában fordul elő, ámde a glükoziláció nem befolyásolja a biológiai aktivitást [Keller és mtsai: J. Bioi. Chem., 258, 8010, (1983)].
Hosszú ideig feltételezték, hogy az interferonok hatása fajspecifikus. Azonban az in vitro kísérletek azt mutatták, hogy a marhából származó interferonkészít- 35 mények a majmoknál és az embernél is képesek vírusellenes hatást kifejteni [M. G. Tovey és mtsai: J. Gén. Virol., 36, 341-344, (1977)]. Ez a fajok közötti kölcsönhatás valószínűleg a gének, illetve a fehérjék kisebb-nagyobb homológiájával van összefüggésben. A rendelkezésre álló állati interferonok csekély mennyisége miatt ezt a feltételezést nem lehetett még felülvizsgálni.
A fajok közt meglévő kölcsönhatás ellenére a fajidegen interferonok alkalmazásakor mellékhatásokat, így antigén hatást figyeltek meg, amely a terápiás alkalmazásnál nem engedhető meg.
Minthogy a haszon- és háziállattartás nagy gazdasági jelentőséggel bír, igény van a különböző fajok számára alkalmas interferonokra, amelyeket az állatorvos felhasználhat.
A különböző fajokból előállított nagytisztaságú interferonok jó lehetőséget teremthetnének az interferonok hatásmechanizmusának a vizsgálatára a célból, hogy emberekre is érvényes modell-elképzelések szülessenek.
Az állati interferonokkal történő első vizsgálatokat természetes sejt-anyagból származó készítményekkel végezték. Az ezzel az eljárással előállított interferonok hozama és tisztasága nem tette ezeket alkalmassá gyógyszerként való felhasználásra.
A rekombináns DNS-technológia fejlődése révén vált lehetővé, hogy a mikroorganizmusokat heterológ fehérjék termelésére bírják. Ilyen módon például előállítottak humán interferont (Hu-IFN) és legújabban különböző nem humán interferonokat is.
A jelen találmány feladata ló-gamma-interferon géntechnológiai úton való előállítása és az ehhez szükséges DNS-szekvencia előállítása.
A feladatot a találmány szerint az úgynevezett próba30 technikával oldottuk meg. Próbaként egy, a humán gamma-interferonból származtatott, az irodalomból ismert DNS-szekvenciát alkalmaztunk [Gray és Goeddel: Natúré, 298, 859-863 (1982)].
Próbaként ugyanígy alkalmazhatók más gamma-interferonokrész- vagy teljes szekvenciái is. A kiválasztásnál kiindulási anyagként a ló normál máj szövetéből származó DNS-gyűjtemény szolgált. így először sikerült az alábbi I. képletű EqIFN-γ-ΐ kódoló gént a határoló szakaszokkal izolálni:
GGATC 5 r: ACAAG*ATGtt< aCGGGTGGGGATAATGGGTCTCTCTCATCGTCAAAAGACCCAAGCAG b5
TWÖUtöGÁAA /AACTACAACACCAAAATGCCACAAAACCATAGTTATTAATACAAA , 2 5
TAACTAGCA l GTGCCTATCTGTCACCATCTCATCTGAAAAAACTTGTGAAAATACGT 18 5
AATCCTGATGAGACTTC AATTAGGTATAAAAACCAGCCCCAGKAGGCGAGGCAGTACACT 5
CTTCTOATCGCCtIGTAGGGCAGCTATTAGAAAAGAAAGATCAGCTGAGGCCTTGGGACC T ; Ο
GAT ·-1 * ICrrhGrh CAG A AGTGACWCTTTCAACT ACTTAeöCCTAACrCTCT CCG AAA CA 3 b 5
-is -ίο
Hét A«n Tyr Tht Ser Phe Ile Leu Alá Phe Gin Lee Cye Alá ile
ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TÖT GCG ATT 410 »5 -l l 5 10
Leu Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Cye Gin Alá Alá Phe Phe Lys Glu
TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 455 le Glu Mén Leu Lys Glu Tyr Phe
ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC 507
HU 213 566 Β
TTGTGGTTGKAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT
MCTCCACAOTCATCrFGAGAAGACTÖGOTGTTATTTTCTCTGTTTGTTOACTíMíATGAGT
TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTGTGCTCAATTTGCTATA
GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGí^CTTAACAGGTTTATAAAGCAT
AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG
ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGOTTACTATGATGGTGACAA
TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC
GCTGTCCTGAAACGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG
ATTrTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT tgctgagattttgtacgagttataagctggcttatatttaaaaaatttttttgtttttgt rTTATGAGHTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA
7TGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG
GCAGTATCTTATAGTGGGTWCCTTTGCmATCTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT
TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG
TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATMATCT
TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAMCTAAACAGAGGGT
TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTOTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT
56?
627
687
7«7
807
867
927
98”
1047 1107 1167 1 227 1287 134? 140? 146? 152? 1587
Asn Alá
TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA 1644
30 35
Arg Asn Pro Asp Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Phe Leu Asp He AGA AAC CCA GAT ÓTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC 1689 Λ. I N T R Ο N 2
!.»‘i Lys Trp Lys Glu
Tf, AAG AAC TGG AAA GAG GTAATCTAAGTSTTTCCATtTWTTGATTTTCCTGT 1741 Ti .CTT A TTTTCTGGTGGATGAA TTC ACACCAACCTCTí TTTTGTOCTCTTTTCTCC.Tr A<; »80/
Kap 3« Aep GAC 45 Ly· AAA Ly· AAA 50 Ser TCC 55 Phe TTC Tyr TAC 164'
i ie ATA 11» ATT Gin Ser CAG AGC Gitt He Val
OAT AGT CAA ATC. GTC
60 65 70
Phe ty· Leu Phe Glu Aah Leu Ly· *«P Ase Gin Val í le Gin Lya
TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG 1892
75 80 85
ser Met Asp Thr He Lys Glu Asp Leu Phe val Lys Phe Phe Asn
AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC 19 37
80 95 XÖO
Ser Ser Thr Ser Lya Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin ile
AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAO ATT 198 2
HU 213 566 Β
Μ T R Ο N ϊ
Pro
CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTr^íTTTCATrACAGAGGTTCTTGCAMAGTOCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCXGT^CCAAAACWTCCTTCC ^AATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAÁGTCAGTATGGGAATCAT'TTAAATTTG GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCA^TOAAGGGACAAATCCA gtgaggagggggcagtgaagaagtggaggggagtct^agaagcaggtctctccttgccc €TTCTT€öTGAGATGAAATCC!CCTGCFTTGGATGG<»3GÜTOCGTGTCTTGGT0GAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCIWÍAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT gggttcactaaaatttctatgatcttctttgctctataatcctacaattctgtggacaga AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTWüIGAGOTTCTTGGGCATTGCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGA^CAAGACCMTTTGTCTGTT TTTGeAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTrTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTrCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTCGGTTTG ICCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAG^SGAGGGTGTTOTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATrGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTCTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATIATTrTAGTCTTAACTGCTWtflGAAAGCAGCATTACfcTATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAeCAACTTTTTCAAlM^AATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCITGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTICTTTCCC io5 no ns val Asn Asp Lau Lys Val Gla Ar» Lys Alá 11· Ser Glu Leu
AATAG GTA .AAT GAT CTG AAG GTC CAG .CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC
2041 2101 2161 2221 2 2R1 2 341 2401 2461 25 21 2581 2641 női 2761 2R2I 3881
941
001 106 1 3121 3 181 3241 3301
3348
120 125 130
Ile Lys val ltot Asn Α·ρ Leu Sár Pro Lys Alá ?Α·η L«u Ar» Lys
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
135 140 145
Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Alá Leu Gin
CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
393
4 3 8 * · »
TAG tcxtcaiuctgcctgcaatatttgaatttttaaatctaaatctatttattaatktt TAATATTTTACATTATTTMTATGGC»AATATATTrTTAAAC^CATCAAAGTATTTATAAT agcaacttttatgtaatgaaaatgogtatctattaatatatatattatttataattcctg TATGGTGTGACTATTTCACTTGACCCmTTTTTCTGACCAACTAGGCAAGATTATGTGA ttacaaggctttaactcaggggccaactagggaötgggtagccgacctaccaagaccc^g TGA-3CTGTGTGTTTATTTCCCTCAATCmTACAATGAACACTTATAAAGGAA>GGAGGGCC *CCAGTCACTGCCTGTT^3AGAACATGTCTGCATTGTGA<XXACTeCTTAAT<^CATGTC AAACCACGCTTGAATGTGTCAGATGATAGGGCTTGTCCCamATAAAGCTTAGTMTCTCC TCTrATGCCTAGTGCTTCAGAATATTGTTGACAACTGTGACWCACCCAAATGGAAAGTft ATTTATTTGTTTAGTTTACCAATATTTAATAAATATGAATAAAGTATKATTTCATAACTA TTTATGCTGCGTCCGGCTTTrrCTAAGTGAGGACTGGGGTAAATGAACTACAAACTAATO AATCAGTAAGAGGGAACTCGTTTTTAGCGGTGGAAATCTTAGCTGGATTAAGCCCCATGA AACGTGGTATTTCrCTCCACTGGAGATTTGTTGGCTÁCTACTCCTCCATGTAGCAGCTCT TTATCTTTCCAAAATATAAATTTAATTATGTCACCATTTACTTCAGAGCTTCTGCGATGG AAAGTAGTTCAAATAGTTTAGCTTAGCACACAAAGCTTTGTTTCTCCCTCCTCCCTCAAC TCTGCACTGTGCTCTTCATCTTGGTGTCCCCACGTCCTCTGTCCACTTCGGGCAAACCAC cgggaatgtcatggtgagggtgagctctagggagagagggctggattagaatttcggccc oaccattaccagtagtatgacctttaatgaattacttgtattctctaagctccagtttcc tcatctgacacaagagaataattgtgcctaaaattgtggtgagagtttgttctttcactc AAGAAGTGTTTACTGGAGCATCCACTAGTTGCCTAGTGCTGTTCTAGGCACTTGAGATAC 4TTTCTOAACAAAATAGTCAAGGATCC
97 3557 36 n / ) X 7 3 7 179?
41 7 1977 90 37
4097
415? 41 n
277 4 3 17 4397 4457 4 517 4 57 7 4637 4664
HU 213 566 Β
Figyelemreméltó, hogy az EqIFN-y-t, mint minden eddig ismertté vált gamma-interferont, az adott szervezetben egy olyan gén kódolja, amelyben a strukturális gént megszakító hosszú szekvenciák találhatók: a gének exonokból és intronokból állnak, amelyek közül csak az exonok kódolják a fehérjéket. Az intronokat csak bizonyos rendszerek, például emlőssejt-rendszerek „értik” meg. Más rendszerekben, például az E. coliban, az intronokat tartalmazó DNS-szekvenciák nem alkalmazhatók.
A jelen találmány további feladatát képezte egy EqIFN-y-t kódoló, intronmentes DNS-szekvencia előállítása.
A feladat megoldása alapvetően két módon lehetséges:
1) A sejtmagokból, amelyekben a transzkripció végbemegy, a citoplazmába jutván az intronok kivágódnak és az exon-RNS-fragmentum darabok összeillesztéséből létrejön az eukarióta fehérje mRNS-e. Ezt a mRNS-t egy enzim, a reverz transzkriptáz egy olyan DNS-sé másolja át, amelyet „copy-DNS-nek [cDNS] nevezünk.
Ez az intronmentes DNS beépíthető a megfelelő plazmidokba, amelyek ezután a megfelelő gazdaszervezettel
- például E.coli-val együtt eukarióta fehéqék, így ajelen esetben EqIFN-γ termelésére alkalmazhatók. Ennél az eljárásmódnál hátrányos következménnyel járhat a genetikai kód degenerációja. Ez a degeneráció ahhoz vezet, hogy különböző szervezetek azonos aminosavakhoz eltérő kodo10 nokat alkalmaznak. Ha az alkalmazott DNS nem illeszkedik optimálisan, úgy ez az eukarióta fehéij éknek hibás expressziójához vezethet egy prókarióta rendszerben.
2) Egy eukarióta gén intronmentes DNS-szekvenciájának másik előállítási lehetősége az, hogy a kromo15 szomális DNS-szekvencia ismeretében kémiailag szintetizáljuk az intron-mentes DNS-szekvenciát.
A találmány célkitűzésének a megoldására igen alkalmasnak bizonyult a III. képlet szerinti DNS-szekvencia, amelyet önmagában ismert módon állítottunk elő.
- 1 ATS í TAC TA< TGC CA® 20 5 GCT GCT TTC ϊ τ » AAA 25 10 GAA ATC GAA AAC CTS n AAA
GAA TAC FTC AAC GCT CST MAC CCA GAC GTT GGT GAC SGT GGT CCG
35 *0 45
CTS ’K CTG GAC ATC CTG AAA AAC T6S AAA GAA GAC tct GAC AAA
50 $5 60
AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC ÍTC AAA CTS TTC
65 20 25
GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TC6 ATG GAC ACT
•0 «5 te
ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TC6 TCG ACT TCT
95 100 105
AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC
110 rfs 12©
CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG
in 130 US
AM GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTS CST AAA CGT AAA CGT TCT
140 145
CAG AAC CCA TTC cet GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA
Tizenhat különböző oligonukleotidot szintetizálunk két variánsban. Az első teljes variáns a 146 aminosavból és a start-metioninból álló érett EqIFN-y-t kódolja [III.
képlet], a második pedig az aminoterminálison 3 amino40 savval rövidebb és a start-metionint tartalmazó polipeptidet [Illa képlet] kódolja.
- 1 ATS I CAG GCT GCT TTC 5 11 y AAA GAA ATC GAA 10 AAC CTG AAA GAA TAC
AAC GCT CST AAC 20 CCA GAC STt GGT GAC 25 GGT UG T CCG CTG TT ; 30 CTG
GAC ATC CTG AAA 35 AAC TGG AAA GAA GAC 40 TCT GAC AAA AAG at : 4 5 ATC
C A6 TCT CAG A T € 50 GTT TCT TTC TAC TTC 55 AAA CTG UC GAA AA ' 60 c T®
AAA GAC AAC C AG 65 GTT ATC CAG AAA TCG 20 ATG GAC AC s ATC A A t >5 GAA
GAT CTG TTC GTT 00 AAA TTC ttc AAC TCG 05 TCG ACT TCT AAA CH» 90 S íM A.
GAC τ re CAG AAA 95 CTG ATC CAG ATC CCA 100 GTT AAC GAC CTG AA ·, 105 GT i
<*C CGT AAG 6CT 110 ATC TCT GAA CTG *TC 125 AAA SH ATC AAC b A . 2 20 CT 6
KI CCA AAA SC * 125 AAC r Tg CST AAA C6T ne AMA CG* ΐ| £Ag AA ‘ 1 35 CCA
: í f CGT SGT CGT ?4C CGT SC T CTT 143 CAG TAA
.· t»
HU 213 566 Β
Mindkét variánst könnyen módosíthatjuk oly módon, hogy a metionint kódoló ATG helyett egy hidrofób szig*T« AAT TAT ACA A6T TTT ATC
TT6 66» TCT TCT ACC nál-peptidet kódoló szekvenciát, például a IV. képlet szerinti szekvenciát kapcsolunk hozzá.
TT6 6CT TTT CMS CT6 T6T 6C6 ATT
Egy adott gazdaszervezetben az ilyen szignál-szekvencia révén megy végbe a kívánt polipeptid kiválasztódása a citoplazmából. Itt megy végbe a fehérj e képződése és a szignál-peptid lehasadása, azaz az érett fehérje keletkezése. Azon mikroorganizmusokat, például az E. coli- sejteket, amelyek nem képesek szignál-peptid szekvenciát tartalmazó polipeptideket képezni, fel kell tárni 15 az éretlen polipeptid izolálása céljából. A teljes vagy nem teljes szignál-peptid szekvenciát tartalmazó éretlen EqIFN-y-ák is a jelen találmány tárgyát képezik. A start-metionint önmagában ismert eljárással például brómciánnal [CNBr] vagy klórciánnal [CNC1] hasítjuk le, hogy 20 megkapjuk az érett EqIFN-y-t.
Ez a DNS-szekvencia kódolja az EqIFN-y-t, azonban kizárólag olyan kodonokat tartalmaz, amelyek sejtazonos - az E. coliban magas szinten kifejeződő - génekben
5
IV találhatók [Gouy és Gautier: Nucl. Acids. Rés., 10, 7055 (1982)].
A jelen találmány további célkitűzése, hogy elsőként adjon módszert az EqIFN-γ homogén, tiszta formában való előállítására.
Mint az előzőekben említettük, az EqIFN-γ izolálása és tisztítása természetes sejtekből kiindulva nem oldható meg kielégítő módon. A célkitűzést a találmány a II, III és a Illa képletekkel kifejezett megfelelő DNS-szekvenciák alkalmazásával oldjuk meg. Ezeket a megfelelő szabályzó szekvenciákkal ellátott szekvenciákat alkalmas vektorokba építjük be és az azokkal transzformált megfelelő gazdaszervezeteket vagy gazdasejt-tenyészeteket tenyésztjük. A képződött polipeptideket önmagában ismert eljárásokkal izoláljuk és tisztítjuk.
A kapott polipeptideket az V., Va képletek írják le.
Tyr Tyr Lys sí B Al A zo Ms Pne pne
Glu ly •Be Asn AT* 35 Arg Asn Prs
t f u τη» Λ «ν Asp 11 e 50 tfy t y* Asn
υ'> I i < Ili 61 h Ser 65 S τ» He
6 Ί t eu í, y« ASp ao íj' n M *
t.ys 0 i u Asp teu 65 í3 t ys
i. y 's 6tu A S p PBe 1 ιο bír· 1 ys Í.ÍU
ϊ I n Arg 115 t ¥5 Al a í 1 e
A $ fí. asp teu Ser Pro 1*0 L Alá Asn
A $ n Pro PB’Í *rg Arg Arg
Ly* 10 Glu Í5 ! i e G1 u
Asp Tel *0 6!y Asp S 1 $ CU y 5 *·
Trp Lys 55 Glu ÁSp Ser ÓP * t
Ser Phe ?a Tyr Fhe tys
He 61 n as lys Ser Hét ASp ~ í-L-r í
Phe Phe 100 A Jft Ser Ser t hf rt
i le 61 n 115 11« A in op
Ser 61 u no teu Lys Va I
l eu A ! á Arg !*S leu i ys 5» b Arg tys Arg Ser
ű 4 o Alá A 1 át pne Phe
4» > Ú ? yr A ín * 1« Ar § Asn Pro
Phe Lee ASP ne Leu t ys Asn
tys 11 e He Sir» Ser Gin Ile v*i
§ 1 v ÁSft L«u Lys ASp Asn Gin v*5
í 1 e Lys Glu ASp Leu PB· Val tys
lys Leu 61u ASp Phe Gin Lys Leu
leu L ys ve 1 óin Arg Lys Al A Ile
Asn ASP Leu Ser Pro Lys Alá Asn
SÍ n Asn Pro Phe Arg Gly Arg *rg
V képle t
Lys Glu i i e Glu Asn i eo t ys
ASp ΤΑ 1 Gly ASP 61 y SÍ y fre
Trp Lys 61 u ASP Ser Asp Lys
Ser pne Tyr Phe Lys teu Phe
He Gin Lys ser Met Asp ’hr
PB· ene A$B ser s«r T hr Ser
ne Gin Π* Prp vei Asn ASP
Ser Leu ! 1 e lys V«S Híl
teu Arg tys Arg Lys Arg Ser
A 1 A teu 61 Λ • * *
ve képlet
HU 213 566 Β
1 IMC '»SC CM 3 GC G T T T Π! MAA 10 fi*A Ml fi A A MAC CT A TS MÁS
G U TAT T » 1 A*í *AC CM SAT 75 GM Gbö GAT sor SS6 33 CCT
£ f T TTC CT 6 SAT 35 ATC tts *A6 MAC 186 ί ΤΑΜΑ B &G SAT ÁST s*c A5 ***
AM AT* ATT CMS 50 *G£ ro *TC SIC τ r r 55 TÁC t re A A Á r t <0 t T J
A A AA£ HS ÁA* 65 fi* T Of CM GR ATT - A A o$ A6€ ATS GAC J5 ACC
A T < Λ Afi >3 *>S s«e SÖ 3 fC - t r 51T **fi TR 4 c A >...·· ASC ACC 90 M€
AAÖ ere GA* 6»C 55 ’ te k A A Α*β CR AT f ; o ATT ecű S T M A A ' 105 -SAT
£ ! G **G GR CM 1 10 CSC A O SC * AT* AGT ύΐ; τ A Ti OÁ 6R l?0 AT fi
aP 3 3 ! £ £ R5 ί Λ * S, i AMC R 30 - VAS £ 5 fi OG ÁSS 135 AfiT
O s a T £ C A H5 CG* b G € CGG *6* GCG 4 * A&
II képlet
AII. képlet szerinti kromoszomális szekvencia alkalmazása esetében az emlősállat-sejtek transzformálása után az EqIFN-y-t a természetben előforduló, glükozilált formában kapjuk meg [autentikus EqIFN-γ].
A II, III, ill. Illa képleteknek megfelelő szekvenciák különösen alkalmasak az EqIFN-γ mikroorganizmusokban való előállítására, elsősorban az EqIFN-γ E.coliban való előállítására, amelyben a polipeptid nem-glükozilált formában fejeződik ki.
A jelen találmány további célkitűzése, hogy eljárást adjon a természetes EqIFN-y-ák módosítására.
A fehérjék módosítását elvégezhetjük például úgy, hogy vagy előállítjuk a fehérje származékát enzimes emésztéssel való fragmentálással, vagy úgy, hogy a fehérjét kódoló DNS-szekvenciát delécióval vagy fragmentálással módosítjuk és ezt a szekvenciát egy megfelelő gazdaszervezetben kifejeződésre késztetjük.
A találmány szerint az EqIFN-γ módosítása a kódoló DNS-szekvencia kémiai szintézisével történik. Abból a célból, hogy egyes szakaszok megváltoztatása lehetővé váljék a gének egyszerű manipulációja révén, a teljes DNS-szekvenciába több egyedi restrikciós enzim-hasítási helyet építünk be.
Az EqIFN-γ további módosított formáit a találmány szerint úgy kapjuk, hogy különböző oligonukleotidokat egyedül vagy különböző kombinációkban, a megfelelő szabályozó szekvenciákkal ellátva, megfelelő vektorokba építjük be, s az ezekkel transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük, majd a képződött fehérjéket izoláljuk és tisztítjuk.
A feladat megoldására lószövetből, előnyösen májból, Blin és Stafford módosított eljárása szerint [N. Blin és P. W. Stafford: Nucl. Acids Rés. 3. 2303-2308 (1976)] nagy molekulájú DNS-t izolálunk és speciális endonukleázok segítségével statisztikusan fragmentáljuk.
Az így nyert különböző fragmentumokat nagyságuk szerint úgy ffakcionáljuk, hogy előnyösen 10-23 kb [kilobázis] fragmentumokat kapjunk, amelyeket beklónozunk egy vektorba, például egy lambda-vektorba, például a lambda EMBL3A-ba. Végül ezeket a vektorokat a transzformáció után, egy gazdaszervezetben, például E. coli-ban szaporítjuk. Ezt a ló-DNS-tárat humán interferon próbaanyag segítségével nem szigorú hibridizációs feltételek között végigvizsgáljuk. A kevésbé szigorú feltételek lehetővé teszik azoknak a DNS-szekvenciáknak is a felismerését, amelyek a próbaanyagtól eltérnek.
A próba-anyag az irodalomból ismert plazmidok restrikciós enzimes emésztésével vagy ismert oligonukleotidok kémiai szintézisével állítható elő. Ez a próbaanyag HuIFN-y-át kódoló szekvenciával rendelkezik. Öt olyan lambda-klónt lehetett azonosítani, amelyek pozitív hibridizációs jelet adtak.
Ezekből a rekombináns fágokból a szokott módon tisztítjuk a DNS-t. A fág-DNS-eket különböző restrikciós enzimekkel való emésztés és az ezt követő Southemanalízis után [Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503-517, (1975)] HuIFN-γ próbaanyaggal való hibridizálással vizsgáljuk. A lamba Eq-γ 2 klón egyetlen 4,6 kb hosszú BamHI hibridizáló fragmentumát izoláljuk és a pUC9 plazmid [Vieirea és Messing; Gene 19,259-268, (1982)] BamHI-hasítási helyére klónozzuk.
Az E.coli - például a JM101 törzs - transzformálása után a kapott telepekből minipreparációs eljárással [Bimbóim és Doly: Nucl. Acids. Rés. 7, 1513-1523, (1979)] plazmid-DNS-t állítottuk elő, amelyet restrikciós enzimekkel emésztve vizsgáltunk. A kívánt BamHI inszertummal rendelkező plazmid a pAH 111 nevet kapta. A pAH 111 plazmid BamHI inszertumainak a végeit M13mp8, illetve M13mp9 vektorokba bevive, azokat diezoxi-módszerrel szekvenáltuk [Sanger és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, (1977)]. Humán gamma-interferon génnel összehasonlítva a szekvenciát [Gray és Goeddel: Natura 298, 859-863, (1982)] nagymértékű homológia mutatkozott a nem-kódoló 5’- és 3’-régiókban. Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a teljes EqIFN-γ gént izoláltuk.
A pAHl 11 plazmid 4,6 kb hosszú BamHI inszertumának egészét didezoxi-módszerrel szekvenáltuk. A BamHI fragmentum teljes szekvenciáját az M13-szubklónok részszekvenciáival való kombinációval állapítottuk meg. A részszekvenciákat a restrikciós fragmentumoknak [EcoRI, HindlII, PstI, Pstl-BglII,
HU 213 566 Β
HindlII-BamHI] a megfelelő hasított M13mp8 vagy M13mp9 vektorokba való irányított klónozásával kaptuk, További részszekvenciákat is előállítottunk, úgy, hogy a 2,0 kb hosszú BamHI-BglII fragmentumot, illetve a 2,0 kb hosszú Pstl fragmentumot „shotgun” módszerrel az M13mp8 vektorba klónoztuk be.
A kapott részszekvenciákat a 4.664 bp (bázispár) hosszú teljes szekvenciává komputerprogrammal egyesítettük [lásd az 1. ábrát].
A ló gamma-interferon gén fehérjét kódoló tartományát a nyitott leolvasási keret komputeres analízisével és más fajok gamma-interferon génjeivel való összehasonlítással [Gray és Goeddel; Natúré 298, 859-863; Gray és Goeddel: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5842-5846 (1983); Dijkemaés mtsai: EMBO J., 4,761-767, (1985); Ceretti és mtsai: J. Immunologi 136,4561-4564, (1986)] vizsgáltuk meg. A fehérjét kódoló régiót három intron szakítja meg, az első exonban a 20 aminosav hosszúságú, hidrofób szignálpeptidnek és az érett EqIFN-γ 18 aminosavának a kódolása történik meg [366-479 bázisok]. A második exon a 19—41 aminosavakat kódolja [1639-1707 bázisok], a harmadik exon a 42-102 aminosavakat kódolja [1803-1985 bázisok], a negyedik exon a 103-146 karboxiterminális aminosavakat [3307-3441 bázisok] kódolja. A 4010 és a 4020 pozíciókban két szignál-szekvencia [AATAAA] található, amelyek a mRNS poliadenilezését végzik. Az érett EqIFN-γ 86-88 pozíciójában található polipeptid az egyetlen potenciális N-glükozilációs hely [Asn-Ser-Ser], mely egybeesik a bovin gamma-interferon második N-glükozilációs helyével [Asn-Gly-Ser] (2. ábra). Az érett EqIFN-γ meglepő módon csak egyetlen cisztein-részt tartalmaz a 3-as helyzetben, ahol a természetes humán és egér-gamma-interferonnal analóg módon az első három amino-terminális aminosav (ebben az esetben Tyr-Tyr-Cys) a szervezetben valószínűleg proteolitikusan lehasad.
A rekombináns EqIFN-γ érett formájának Escherichia coliban való kifejezése céljából oligonukleotidokból egy szintetikus gént szerkesztettünk. Ez ugyanazt az aminosav szekvenciát kódolja, mint a természetes EqIFN-γ gén, azonban az egyes aminosavaknak kizárólag olyan kodonjait tartalmazza, amelyek az E.coliban magas szinten kifejeződő, sejtazonos génekben találhatók [Gouy és Gautier: Nucl. Acids. Rés. 10, 7055-7074, (1982)]. Kiegészítésként több egyedi restrikciós enzim-hasítóhelyet építettünk be, amelyek lehetővé teszik a gének egyszerű manipulációját az egyes szakaszok megváltoztatása céljából. Az EqIFN-γ szintetikus gént összesen 15 különböző oligonukleotidból, két változatban szerkesztettük meg. Az első változat az érett EqIFN-γ-ί kódolja 146 aminosavval és a start-metionint, a második forma az aminoterminálison 3 aminosawal (Tyr-Tyr-Cys) rövidebb polipeptidet kódol és a start-metionint, amely forma valószínűleg a természetes szervezetben is megtalálható.
A szintetikus EqIFN-γ gén szerkezetét a 3. ábra mutat) a be. Az alkalmazott oligonukleotidokat egy „Applied Biosystems Model 381 A” DNS-szintetizátor segítségével állítottuk elő, elektroforézissel tisztítottuk, majd sómentesítettük. A 3. ábrán bemutatott oligonukleotidok szerkezete a következő:
£6*1 5* TKTACTGCC A5GCT6CTTT CTTTAAASAA ATCSJUWACC TSAAAfiMTA
CTTCMCGCT €S 3 ? v -oagtatt chraggh trsahtc ^AAASMAG CAGCCTSSCA 3' t, 3 r · iaacccaüm gt'ggt&acs stscrcsct óttcctssac atcctcaw ACU3GAAA6A ASACTCTS-3*
R-4 «, — rtTRfAg rTTTTCMSA RTCCAGSAA CAGCGGAvCA CCGKACCAA
AC6A6CS V 'b-b UUMA6A’ C*TCC*tíRT CAGAKSTTI .UK'tfU CAAACRTTf
3AAAACC1GA AAGACAACC’3
H b T'fCMATTT UGAACAGTT TSAAGlA&AA AGAAACSATf
EG-7 5’ AGT-AKT* GAAAR'ŰATG SMAC’ARA AAGAAGARÍTCTTCAMT €8-3*
5* CSAACASA’ -τίΤ’Τ·ΛΑ' fUTTÍCTGGA 'M-íTfÁ/r GT,' λ
E8 3 5 * GKVÍU AAi’GgAAGA UKCA&AAA CTGA’CCA&A F<UA&PAA
C«CCT6A«.3·
HU 213 566 Β tfa-10 V GC’GAMHT CAGémC&’TA ACTGÓ&ART SuATCA£7TT CTSGMGTCT RCMTHAG MG’3*
Éfe 11 5 -.’rUtöCÜTA AGGCTATCR TGMCTGATC AAA6TTATGA ACSACC^K
KWWKT M-3‘ *’> V CGCAGGHAG '^rrej^f, fA&GRGRC RAGT’C^A
SATAMCn# C-3‘ £6 U 5 -CCTSC6TAM CGlAMCGTI CTCAGMCCC ATRCGTGŐT CGRGTGC’c πΧΑΒΪΜβ’,Γ
EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG MTGG6TTCT GAGMCGTTT
AC6TTTA-3’ ee-is s’-CAescwn tctttamo mtcsmmc ctsmagmt acttcmcsc tcs-i* í6«n s -rreM6WT σητΑβϊττ ttcotttct ttaaagaaas aeeete-j’
A szintetikus EqIFN-γ gén összeépítése két szakaszban történt. A gén első részét nyolc -EGI F.G8-oligonukleotid segítségével a Sáli hasítási helyig készítettük el, a gén második részét hat - EG-9 - EG-14 - oligonuk- 25 leotidból állítottuk elő a Sáli hasítási helytől a BamHI hasítási helyig. Az EqIFN-γ aminoterminális végén három aminosavval rövidebb formájának az előállításához az EG-1 és EG-2 oligonukleotidok helyett az EG-15 és EG-16 oligonukleotidokat alkalmaztuk.
A találmány tárgyát nemcsak azon gén-szekvenciák képezik, amelyek a találmány szerinti interferonokat kódolják, hanem olyan módosított származékok is, amelyek mutációval, lebontással, transzpozícióval vagy addícióval könnyen és rutinszerűen előállíthatók. Minden 35 olyan szekvencia, amely a találmány szerinti interferonokat kódolja [azaz azokat, amelyek az itt leírt aktivitás-spektrummal rendelkeznek] és amelyek ezekkel összehasonlítva degeneráltak, szintén a találmány tárgyát képezi. Ennek a szakterületnek a szakemberei a kódoló- 40 -régiók DNS-szekvenciáinak módosítását el tudják végezni. A találmány tárgyát képezi minden olyan szekvencia, amely a találmány szerinti interferonok aktivitás-spektrumával rendelkező polipeptideket kódolja, továbbá amelyek az itt bemutatott szekvenciával (vagy 45 ennek egy részével) szigorúan meghatározott körülmények között hibridizálnak (például olyan körülmények között, amelyek több, mint85 %-os, előnyösen több, mint 90%-os homológiával szelektálnak).
A hibridizálást 6><SSC (5><Dcnhardt-oldat) 0,1%
SDS (nátriumdodecilszulfát)-oldatban 65 °C-on végeztük. A szigorúság mértékét a mosási lépéssel határoztuk meg. így 85, vagy magasabb százalékos homológiájú DNS szekvencia szelektálásához a 0,2*SSC(0,01% SDS) 65 °C-al jellemzett körülmények, a DNS-szekvencia 90 vagy magasabb százalékos homológiájú szelekciójához 0,l*SSC (0,01% SDS,) 65 °C körülmények szükségesek.
A találmány szerinti interferon géneket minden szervezetbe be lehet vinni olyan körülmények között, ame- 60 lyek nagy hozamot biztosítanak. A megfelelő gazdák és vektorok a szakemberek előtt jól ismertek. Utalunk a 0 093 619 számú európai közzétett szabadalmi bejelentésre.
Különösen a prokarióták előnyösek az expresszió szempontjából, például az E.coli K12, 294 törzs (ATCC letéti szám: 31 446) vagy az E.coli XI776 törzs (ATCC letéti szám: 31 537). Az előzőekben említett törzsekhez 30 hasonlóan alkalmazhatók a következők: E.coli W 3110 [F, lambda, prototróf, ATCC letéti szám: 27 325], bacillusok, mint a Bacillus subtilis, az Enterobacteriaceae család tagjai, ilyen a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescans, valamint különböző Pseudomonas törzsek.
Általában olyan plazmidvektorok használhatók ezen gazdasejtekkel kapcsolatban, amelyek a gazdasejttel kompatibilis fajból származó szabályzó szekvenciákat tartalmaznak. A vektor általában a replikációs helyen kívül felismerő szekvenciákat is tartalmaz, melyek lehetővé teszik a transzformált sejtek fenotípus szerinti szelektálását. Az E.colit például túlnyomórészt a pBR322-vel transzformáljuk, azaz egy olyan plazmiddal, amely az E.coli fajból származik [Bolivár és mtsai: Gene, 2,95, (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklinrezisztencia-gént tartalmaz és az lehetővé teszi a transzformált sejtek azonosítását. A pBR322 plazmidnak és más plazmidoknak ezen kívül promotereket is kell tartalmaznia, vagy olyan promoterekkel kell őket ellátni, amelyek a mikro50 biális szervezetben a saját fehérjék expressziójára alkalmazhatók. A rekombináns DNS-ek előállítására leggyakrabban alkalmazott promoterek közé tartoznak a beta-laktamáz (penicillináz) és laktóz-promoterrendszerek (Chang és mtsai: Natúré 275, 615, (1978); Itakura és 55 mtsai: Science 198, 1056, (1977); Goeddel és mtasi: Natúré 281, 544, (1979)] és a tirptofán (trp) promoterrendszer [Goeddel és mtsai: Nucleic Acids Rés. 8 4057, (1980); a 0 036 776 számú európai közzétett szabadalmi bejelentés]. Ezek mellett a gyakran használatos promoterek mellett más mikrobiális promotereket is kifej lesz9
HU 213 566 Β tettek és használnak. A találmány szerinti interferonoknak megfelelő génszekvencia, például a lambda-bakteriofág leftward-promoterének [PL] az ellenőrzése alatt építhető be. Ez a promoter különösen hatékonyan szabályozható. A szabályozást a lambda-represszor teszi lehetővé, amelynek a szomszédos restrikciós enzim hasítási helyei ismertek. Ennek a represszor-génnek egy hőérzékeny alléljét be lehet vinni egy vektorba, amely egy EqIFN-γ-szekvenciát tartalmaz. A hőmérsékletet 42 °C-ra emelve a represszor inaktiválódik és a promoter aktiválódik. Ennek a rendszernek az alkalmazásával egy olyan klónbankot hozhatunk létre, amelyben a funkcionális IFN szekvencia a lambda-PL promotertől különböző távolságra elhelyezkedő riboszóma-kötőhely szomszédságában található. Ezeket a kiónokat átvizsgálhatjuk és azokat, amelyeknél a legnagyobb a kitermelés, szelektáljuk.
A találmány szerinti fehérjéket kódoló szekvenciáknak az expressziója és transzlációja más olyan szabályzórendszerek ellenőrzése alatt is végbemehet, amelyek „homológok” az organizmus nem transzformált formájával. így például egy laktóz-függő E.coli kromoszomális DNS-e laktóz- vagy lac-operont tartalmaz, amely beta-galaktozidáz enzim termelése révén lehetővé teszi a laktóz lebontását.
A lac-szabályzó elemeket az E. coli-t fertőzni képes lambda-plac5 bakteriofágból állíthatjuk elő. A fág lac-operonja ugyanezen baktérium-fajból származhat transzdukció révén.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott szabályzó rendszerek az organizmus saját plazmid DNS-éből származhatnak. A lac-promoter-operátorrendszert IPTG-val (izopropil-P-D-tiogalaktopiranozid, izopropil-tiogalaktozid) indukálhatjuk.
Más promoter-operátorrendszerek vagy ezek részei ugyanígy alkalmazhatók: például arabinóz, operátor, colicin El operátor, galaktóz operátor, alkalikus foszfatáz operátor, trp-operátor, xilóz-A operátor, tac-promoterstb.
A prokariotákon kívül eukariota mikroorganizmusok, mint például élesztőkultúrák is alkalmazhatók. Az eukariota mikroorganizmusok közül a Saccharomyces cerevisiae-t alkalmazzák a leggyakrabban, bár számos más faj is rendelkezésre áll. A Saccharomycesekben való kifejeződéshez például a YRp7 plazmid [Stinchcomb és mtsai: Natúré 282,39, (1979); Tschumperés mtsai: Gene 10, 157 (1980)] és az YEpl3 plazmid [Bwach és mtsai: Gene 8, 121-133 (1979)] alkalmazhatók. A TRPl-gént tartalmazó YRp7 plazmid egy triptofánmentes táptalajon növekedni nem képes élesztőmutánst képez, ilyen például az ATCC 44076 letéti számú mutáns.
Az élesztő-gazdasejt-genom TRP 1-károsodása, mint jellemző tulajdonság, hatékony segítség a transzformáció kimutatására, ha a sejtet triptofán nélkül tenyésztjük. Teljesen hasonló az eset az YEpl3 plazmidnál, amely az élesztő-LEU 2 gént tartalmazza és ez egy LEU 2-minusz mutánssal kiegészítve alkalmazható. Az élesztő-vektorok számára megfelelnek a következő promoterszekvenciák: az ADHI gén 5'-szegélyező szakasza [G. Ammerer: Methods of Enzymology 101, 192-201, (1983)], a 3-foszfoglicerát-kináz [Hitzeman és mtsai: J. Bioi.Chem.
255,2073 (1980)], vagy más glükolitikus enzimek [Kawasaki és Fraenkel: BBRC 108, 1107-1112, (1982)], mint az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, foszfo-glükóz-izomeráz és glükokináz 5'-szegélyező szakaszai. Megfelelő expressziós plazmidok szerkesztésénél az ezekkel a génekkel asszociált terminátorszekvenciákat ugyancsak bevezethetjük az expressziós vektorba a kifejezendő szekvencia 3'-végén, hogy a mRNS poliadenilezését és terminációját lehetővé tegyük.
Vannak promoterek, amelyeknek még az előnyük, hogy tenyésztési feltételek által szabályozott transzkripciót tesznek lehetővé, s ezek a következők: alkoholdehidrogenáz, izocitokróm-C, savanyú foszfatáz, a nitrogén-anyagcserével kapcsolatos lebontó eznimek, a fent említett gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és azok az enzimek, amelyek a maltóz és galaktóz felhasználásért felelősek.
Azok a promoterek, amelyeket az élesztő párosodási lokusza szabályoz, például a. BARI, MFal, STE2, STE3, STE5 gének promoterei, hőmérsékletfüggő sir-mutációval építhetők be [Rhine: Ph. D. Thesis: University of Oregon, Eugene, Oregon, (1979); Herskowitz és Oshima: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, I. rész, 181-209, (1981), Cold Spring Harbor Laboratory]. Ezek a mutációk befolyásolják az élesztő nyugalmi állapotban lévő párosodási típus-kazettáit és ezáltal indirekt módon a párosodási típustól függő promotereket is. Bár általában minden olyan plazmid vektor megfelelő, amely egy élesztővel kompatibilis promotert és eredeti replikációs és terminációs szekvenciákat tartalmaz.
A mikroorganizmusokon kívül a többsejtű organizmusok tenyészetei is megfelelő gazdaszervezetek. Elvileg minden ilyen tenyészet felhasználható, akár gerinces, akár gerinctelen állat sejttenyészetéről van szó. A legelőnyösebbek mégis a gerinces állatok sejttenyészetei, s így a gerincesek sejtjeinek szaporítása szövettenyészetben az utóbbi években rutinmódszerré vált [Kruse és Patterson: Tissue Culture, Academic Press (1973)]. Ilyen hasznos sejtvonalak a következők: VERŐ- és HeLa-sejtek, CHO-sejtek, valamint WI38, BHK, COS-7 és MDCK-sejtvonalak. Az ezekhez a sejtvonalakhoz használható expressziós vektorok rendszerint - ha szükséges - egy replikációs helyet egy, a kifejezendő gén előtt elhelyezkedő promotert az összes szükséges riboszómakötő hellyel együtt, RNS-eplicing helyet, poliadenilációs helyet és transzkripció terminátor szekvenciákat tartalmaznak.
Emlősállat-sejtek alkalmazása esetén az expressziós vektorokat szabályzó funkciók gyakran vírus-anyagokból származnak. Például a leggyakrabban használt promoterek polyoma adenovirus 2-ből származnak és különösen gyakran a Simian vírus 40-ből [SV40], Az SV40 korai és késői végpromoterei különösen hasznosak, mivel mindkettőt könnyen megkaphatjuk a vírusból olyan fragmentum formájában, amely még az SV40 virális replikációs helyét is tartalmazza [Fiers és mtsai: Natúré, 273,113 (1978)]. Ezenkívül az SV40 kisebb és nagyobb fragmentumai is felhasználhatók, ha ezek azt a megkö10
HU 213 566 Β zelítőleg 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely a HindlII hasítási helytől a virális replikációs helyen belül lévő BglI hasítási helyig terjed. Ezenkívül ugyancsak lehetséges és ajánlatos is olyan promoter- vagy szabályozó-szekvenciákat alkalmazni, amelyek rendszerint a kívánt génszekvenciákkal vannak kapcsolatban, feltéve, ha ezek a szabályzó szekvenciák a gazdasejt rendszerrel kompatibilisek.
A replikációs kezdőpontról vagy megfelelő vektorszerkesztés révén gondoskodhatunk - úgy, hogy egy exogén kezdőpontot beépítünk, például az SV40-ből vagy más vírusból [például: polyoma, adeno, VSV, PBV stb.] - vagy azt a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmus biztosítja. Ha a vektor a gazdasejt kromoszómájába van integrálva, akkor legtöbbször az utóbb említett eljárás is megfelel.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák előnyösen fejezhetnek ki a következő expressziós plazmidokban: pER103 [E. Restl-Dworkin és mtsai: Gene, 21,237-248, (1983); és 0115 613 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés, letétbe helyezve a DSM-nél 1983. december 20-án,DSM 2773 letéti szám alatt]; parp ER33 [0 115613 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés] vagy a pRHIOO, plazmid, minthogy ezek a vektorok mind tartalmaznak olyan szabályzó elemeket, amelyek a klónozott gének magas expressziós rátáját biztosítják. A találmány szerint a szintetikus EqlFN-g gén expressziós vektoraként a pRHIOO plazmidot alkalmazzuk, amely a Serratia marcescensből származó szabályozható triptofán promotert és egy mesterséges riboszóma-kötőhelyet tartalmaz. A pRHIOO expressziós plazmid előállítása céljából a pER103 plazmidot [E. Dworkin-Rastl és mtsai: Gene, 21, 237-248 (1983); 0 115 613 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés] HindlII restrikciós endonukleázzal linearizáljuk és eltávolítjuk az 5'-terminális foszfát részt.
Ezt a plazmid DNS-t foszforizált d(AGCTTAAAGATGAGCT) és d(CATCTTTA) oligonukleotidokkal keverjük össze és ligáljuk. A ligációs terméket SacI restrikciós endonukleázzal emésztjük és T4-PNK (polinukleotidkináz = PNK) hozzáadásával összekapcsoljuk. Az oligonukleotidokat a 0 115 613 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben leírt módszerhez hasonló módon állítjuk elő. A ligációs reakcióelegyet kompetens E.coli HB101 sejtekhez adjuk és inkubáljuk. A keletkező baktériumtelepekből önkényesen kiválasztottunk 12-t és azokból mikroméretben izoláltuk a plazmidokat [Bimbóim és Doly: Nucl. Acide Rés. 7. 1513-1523,(1979)]. A keletkező DNS-t SacI restrikciós endonukleázzal hasítjuk és a DNS-eket 1%-os agaróz gélben választjuk el (UTBE-puffer). Az a tény, hogy a DNS mintegy 4000 bp nagyságú lineáris molekulaként vándorol, azt bizonyította, hogy a plazmid Saclfelismerőhelyet tartalmaz. A plazmidok közül egyet önkényesen kiválasztottunk. A DNS-el minipreparációs módszerrel még egyszer E.coli HB101 sejteket transzformáltunk. A kapott transzformált baktériumokból kiválasztottunk egy telepet és nagyobb léptékben tenyésztettük. A tenyészetből izolált plazmidot EcoRI és BamHI restrikciós endonuklezáokkal hasítottuk, a DNS-eket
1%-os agaróz gélben elválasztottuk és a kisebb fragmentumokat a gélből elektroelucióval izoláltuk. Ezeket a körülbelül 460 bp hosszúságú EcoRI-BamHI DNSfragmentumokat Sanger módszerével szekvenáltuk [F. Sanger és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sci. (1977), 5463-5467]. Az ily módon analizált plazmidot pRH 100-nak neveztük el.
A plazmidot Sacl-el teljesen elhasítjuk és a túlnyomó DNS-végeket Klenow-ffagmentummal [Amersham] a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében tompa végűvé alakítjuk. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le és a DNS-t etanolos kicsapással koncentráljuk. A fenti kezeléssel a triptofán promoterrel való összekapcsoláskor egy tompa DNS-vég keletkezik, amely az „ATG” transzlációs startkodonnal végződik. A linearizált plazmid-DNS-t BamHI-el újból hasítjuk és a vektor részt izoláljuk.
Az így előkészített pRHIOO plazmid-vektort összekeverjük ligáit EG-1 - EG-8 és EG-9 - EG-14 oligonukleotidokkal és ligációs pufferben T4 DNS-ligázzal inkubáljuk. Ezzel a ligációs keverékkel kompetens E. coli sejteket, előnyösen JM101 sejteket transzformálunk és egy éjjelen át inkubálunk. Az így kapott transzformált sejtekből minipreparációs eljárással izoláljuk a plazmidDNS-t és restrikciós analízissel, valamint a HindlIIBamHI inszertumok szekvenálásával megállapítottuk a szerkezetét. Az érett EqIFN-γ kifejeződéséhez alkalmas szerkezetű plazmidnak a pEqG-YYCl nevet adtuk.
A három aminosavval rövidebb EqIFN-γ előállítása céljából teljesen hasonló módon klónoztuk az EG-15, -16, az EG-3 EG-8 és EG-9 - EG-14 oligonukleotidokat a pRH 100 vektorba. A kívánt szerkezetű plazmidot pEqG-QAA 1-nek neveztük el.
A sejtek vektorral való transzformálását számos eljárással meg lehet oldani. Például kalcium-ionok jelenlétében is el lehet végezni oly módon, hogy a sejteket magnézium tartalmú oldatban mossuk és a DNS-t kalcium tartalmú oldatban szuszpendált sejtekhez adjuk, vagy a sejteket a DNS és kalciumfoszfát koprecipitátumával kezeljük. Az ezt követő génexpresszió után a sejteket olyan közegbe visszük, amely szelektálja a transzformált sejteket.
A pEqG-YYCl vagy pEqG-QAAl plazmidot tartalmazó JM101 E.coli által kifejezett interferon-aktivitás kimutatása céljából a baktériumokat megfelelő táptalajon való tenyésztés után feltárjuk és steril szűrés után az interferon-aktivitást egy olyan módszerrel vizsgáljuk, amely a vesicularis stomatitis vírus [vesicular-stomatitisvirus = VSV vagy enkefalomiokarditisz vírus [encephalomyocarditis vírus = EMCV] citopatiás hatását [cytopathischen Effekt = CPE] méri. A vizsgálatokhoz vesicularis stomatitis vírussal [VSV] fertőzött NBL-6 sejteket, vagy enkefalomiokarditisz vírussal [EMCV] fertőzött A549 sejteket [ATCC CCL185 letéti számú humán tüdőkarcinoma-sejtvonal] alkalmaztunk.
A ló-interferonok kifejeződését jelzett fehérjék segítségével mutattuk ki maxi-sejtekben. Plazmidok által kódolt fehérjéket maxi-sejt-technikával lehet in vivő szelektíven jelezni [A. Sancar és mtsai: J. Bacteriol. 137, 692-693, (1979)]. A CSR603 E.coli törzs [CGSC 5830]
HU 213 566 Β nem rendelkezik olyan mechanizmusokkal, amelyekkel az ultraibolya (UV)-sugárzással károsított DNS-t ki tudnák javítani. Megfelelő UV sugárdózissal történő besugárzás hatására a bakteriális kromoszómák feldarabolódnak, azonban a jelentősen kisebb és a sejtekben több kópiában jelen lévő néhány plazmid-DNS megőrzi funkcióját. Az összes nem károsodott, szaporodó sejt D-cikloszerin antibiotikummal való elpusztítása és az endogén mRNS kimerítése után a maradék sejtekben már csak a plazmid által kódolt gének transzkripciója és transzlációja történhet meg. A keletkező fehérjéket radioaktív 35S-metionin beépítése révén mutatjuk ki. Az E.coli CSR603 sejteket a szokásos módon transzformáljuk az expressziós plazmiddal, majd ampicillin-tartalmú agarlemezeken szelektáljuk a transzformálódott baktériumokat. A maxi-sejtek előállítását és a fehérjék jelzését A. Sancar előírása szerint végezzük. Molekulasúlystandardként egy 14C-metilezett fehérjekeveréket [Amersham gyártmány] használunk. Kontrollként a pER103 plazmidot használjuk, amely csak a promotert tartalmazza az interferon gén nélkül és a pER21/l plazmidot, amely a humán IFN-alfa-2arg gén két kópiáját tartalmazza.
A találmány szerinti termék jellemzése céljára alkalmasak az ismert biológiai és immunológiai interferonvizsgálati módszerek. Minthogy az IFN-α, -β és γ - a PFU és CPE vizsgálatokban egyaránt antivirális tulajdonságokat mutatnak, a találmány szerinti EqlFN-y-nak az EqlFN-a-tól vagy -β-tól való megkülönböztetésére az interferonok különböző antigenitását használjuk ki.
A találmány szerinti polipeptideket az EqIFN-a és/vagy EqIFN-β elleni antiszérumok nem neutralizálják. A találmány szerinti polipeptidek megkülönböztetésére szolgál a savval szembeni labilitás, valamint az SDS-el szembeni érzékenység. Ha 0,2%-os SDS oldatban vagy pH=2 kémhatású oldatban inkubáljuk a polipeptidet 4 °C-on néhány órán át, az teljesen elveszíti antivirális aktivitását. Az EqIFN-α és EqIFN-β hasonló körülmények között stabil marad.
A ló-gamma mindazon szekvenciáinak a kimutatására, amelyek az interferon génnel nagymértékű homológiát mutatnak, nagymolekulasúlyú ló-DNS-t a megfelelő restrikciós enzimekkel teljesen elemésztünk és a kapott DNS-darabokat méretük szerint szétválasztjuk.
A DNS-t Southern módszerével átvisszük nitrocellulóz szűrőre, majd denaturáljuk és fixáljuk és nick-transzlatált próbaanyaggal hibridizáljuk. Az EqIFN-γ próbaanyagaként a pEqG-YYCl plazmid egy fragmentumát tartalmazza. A szűrőt ezután pontosan meghatározott körülmények között mossuk. Az autoradiográfiát DuPont Cronex röntgen filmen Kodak-Lanex-Regular erősítő fóliával hajtjuk végre 7 napon át -80 °C-on.
A gazdasejt transzformációja után a gén expressziója fermentáció, azaz sejttenyésztés segítségével történik olyan feltételek mellett, hogy végbemenjen a találmány szerinti fehérjék kifejeződése. A terméket rendszerint ismert kromatográfiás elválasztási módszerekkel izolálhatjuk, amikor is a kapott anyag a fehérjéket vezető és farokszekvenciával, vagy ezek nélkül tartalmazza. A találmány szerinti interferonok kifejeződhetnek úgy is, hogy N-terminálisan vezérszekvenciával vannak ellátva (pre-IFN), amelyet néhány gazdasejt esetében el lehet távolítani. Ha nem, akkor szükségessé válik a vezető szekvencia lehasítása (amennyiben jelen van), hogy érett IFN-t kaphassunk. Egyébként az IFN-klónt úgy is módosíthatjuk, hogy a mikroorganizmus közvetlenül az érett fehérjét állítsa elő a pre-IFN helyett. Ez esetben az élesztő- párosodási feromon MF-alfa-1 prekurzor szekvenciáját használhatjuk, hogy a fuzionált fehérje tökéletes érését, s a terméknek a táptalajba vagy a sejtek közti térbe történő kiválasztódását biztosítsuk. A funkcionális vagy érett IFN-t meghatározó DNS-szekvencia az MF-alfa-1 el egy feltételezett katepszinszerű hasítási helyen [a LysArg után] - az ATG iniciációs kodontól számított 256. pozícióban [Kurjan és Herskowitz: Cell 30,933-943, (1982)] - lehet összekapcsolva.
Az EqIFN-γ baktériumokból való tisztítási eljárására a következő általános sémát adjuk meg:
1. A sejteket nagy vezetőképességű lizáló-pufferrrel (körülbelül pH-8) nagy nyomással átpréseljük egy homogenizátoron és az átfolyt anyagot jégfurdőben lehűtjük.
2. A DNS-t polietilén-imin hozzáadásával keverés közben kicsapjuk 4 °C-on.
3. A bakteriális fehérjéket pH-állítással kicsapjuk, miközben az EqIFN-γ az oldatban marad.
4. A szilárd anyagokat 4 °C-on lecentrifúgáljuk.
5. A felülúszót a pH újbóli beállítása után, például ultracentrifugálással koncentráljuk.
6. A koncentrátumot alacsony vezetőképességű pufferrel szemben dialízáljuk.
7. A szilárd anyagokat lecentrifugáljuk, miközben az EqIFN-γ az oldatban marad.
8. Karboxi-metilcellulózon ioncserélő kromatografálást végzünk és növekvő ionerősségű gradienssel eluálunk.
9. Kalciumfoszfát-gélen kromatografálunk és növekvő ionerősségü gradienssel eluálunk.
10. Karboxi-metilcellulózon ioncserélő kromatográfiát végzünk enyhén denaturáló körülmények között és növekvő ionerősségű gradienssel eluálunk.
11. Gélszüréses kromatografálással elválasztunk.
A fenti eljárás 95%-os tisztaságú anyag előállítását teszi lehetővé.
Itt kell megjegyezni, hogy a találmány szerinti interferonok esetében nem csak leírt interferonokról van szó, hanem ennek a polipeptidnek minden olyan módosulatáról is, amelyeknek a Ιό-γ-IFN aktivitásanemváltozottmegjelentősen. Ez a módosítás jelentheti például a molekula megrövidülését - például az N- vagy C-terminálisan -, aminosavak kicserélődését más aminosavakkal, a molekula kémiai vagy biokémiai kötődését más molekulákhoz, amelyek inertek vagy aktívak. Ez utóbbi módosítás például egy vagy több találmány szerinti interferon és/vagy ismert a- vagy β-ίηterferon hibrid molekulát jelenthet.
Biológiai hatás-spektrumuk alapján a találmány szerinti interferonok minden olyan kezelésre alkalmazhatók, amelyeknél az ismert interferonokat alkalmazzák. Ilyenek például a herpesz, Rhinovirus, ló-abortusz-vírus,
HU 213 566 Β a rák különböző fajtái és hasonlók. Az új interferonok önállóan vagy más ismert interferonokkal vagy biológiailag aktív készítményekkel kombinálva alkalmazhatók, például IFN-alfával, IL-2-vel, más immun-modulátorokkal és hasonlókkal.
A találmány szerinti interferonok parenterálisan adhatók olyan esetekben, amikor tumor- vagy vírusellenes kezelésre van szükség és olyan esetekben is, amikor immunszuppresszív tulajdonságok mutatkoznak. Az adagolás és az adagolás mértéke azonos lehet azzal, ami a klinikai vizsga- 10 latok alapján jelenleg az IFN-készítményekre vonatkozik, például körülbelül (1-10), 106 egység naponta, de olyan készítményeknél, amelyeknél a tisztaság nagyobb, mint 1%, elérheti például a napi 51O7 egységet is. Például egy lényegében homogén, baktériumokban termelt, találmány 15 szerinti IFN célszerű adagolása parenterális alkalmazás esetén: 3 mg IFN-γ 25 ml 5%-os állati szérumalbuminban - előnyösen ló- vagy kutyaszérum-alburninban - feloldva.
Ezt az oldatot baktériumszűrőn megszüljük és a szűrt oldatot aszeptikus körülmények között 100 üvegbe szétosztjuk 20 úgy, hogy minden üveg 6· 106 egység tiszta, parenterálisan alkalmazható IFN-t tartalmazzon. Előnyös, ha az üvegeket felhasználásig hűtve (-20 °C) tároljuk. A találmány szerinti anyagokat ismert módon formulázhatjuk, amikor is a találmány szerinti polipeptideket egy - a gyógyszergyártásban elfogadott - hordozóval keveijük, hogy gyógyszerként alkalmazható szert kapunk. A használatos hor5 dozóanyagok és receptúráik leírását a Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin) kiadvány - kifejezetten erre hivatkozunk - tartalmazza. Betegek kezelésére alkalmas hatékony gyógyszerkészítmény előállítása céljából a találmány szerinti interferont összekeverjük a vivőanyag mért mennyiségével. Előnyös a parenterális alkalmazás.
A találmány tárgyát az alábbiak előállítására szolgáló elvárások képezik (részletezve):
Nagymértékben tiszta polipeptidek, amelyek - a ló-gamma-interferon (EqlFN-gamma) biológiai és immunológiai tulajdonságaival rendelkeznek;
- nem tartalmaznak jelentős mennyiségű állati eredetű más fehérjét;
- természetes formájukban nem glükoziláltak;
- az első N-terminális aminosav előtt metionint tartalmaznak;
- egy vezető pepiidet tartalmaznak és aminosav-szekvenciájuk a következő:
1 5 io 15
Tyr Tyr Cys 61 n Alá Alá Phe Phe tys Glu 11 e G 1 u Asn L eu tys
20 25 30
G 1 U Tyr Phe Asn Alá Arg Asn Pro ASP Val 61 y A se 61 y Gly Pro
35 «0 45
tev Phe Leu • Asp ne leu Lys Asn Trp Lys 61 u A sp Ser ASp Lys
50 55
lys ile 1 le Sin Ser fii rs ϊ 1 e *ai Ser Phe r P ne l ys t eu a η p
55 ÍÖ
ö 1 υ ÁS» L eu tys ASp fc s n 61 n »« 1 11 e 61 r í y 5 s € r h e t *SP . . r
30 85
; í- í L Sty ASP l eu Pne v a' t y s Phr p h e r '$ »»» - h Γ -
95 5ÖC
L v 5 leu Gtc Asp Pne ű3 n L y % l e « i i e 61 r t * a 3 A $ fi t · r
110 1 16
i. eu t ys va i 6 * fí Arg t. ys A 1 & í' e Ser Glu 8 £ V f i £ t. » Ti i
125 no 1 c,
ASP t eu Ser Pro 1 £ fi tys Ma ASP t eu Arg l y 5 A u g l yS Arg Ser
h 1 Π ísr* Pro Phe t * v Arg 5 ? y Arg A r g A i 8 * *· n L a n * * >
vagy
G1 n Alá Alá Phe Phe Lys Glu ne 61U Asn leu Lys
G1U Tyr pne Asn Alá Arg Asn Pro Asp Vei Gly ASp 61 y 6»y Pro
Leu Phe Leu Asp 1 le Leu Lys Asn Trp tys Glu Asp Ser ASP tys
Lys He 11 e Gin Ser Gin He val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe
G 5 U Asn L eu tys ASP Asn Gin val 11 e Gin LX’ Ser ASP Thr
11 e i ys Glu ASp Leu Phe val Lys Phe Phe Asn Ser Ser Tnr Ser
i ys teu 61u ASp Phe G1 n Lys Leu Pe 61 n 11 e Pro val Asn ASP
t eu Lys val Gin Arg Lys Alá ile Ser Glu Leu !1e Lys val «ex
Asn ASp L eu ser Pro Lys Alá Asn Leu Arg tys Arg l ys Arg Ser
G1 n Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg A! a l et G 1 n » * *
HU 213 566 Β
Továbbá DNS-molekulák, amelyek az alábbi poli- - érett EqlFN-gammát.
peptideket kódolják: Olyan DNS molekulák, amelyek a következőket tar
- az EqlFN-gamma biológiai és immunológiai tulaj- talmazzák:
donságaival rendelkező polipeptidet; - a teljes, természetes EqlFN-gamma gént;
- egy fent megadott polipeptidet; 5 - az alábbi nukleotidokat:
ft-, , A AT' Uí’T TTT CAG Π'. 1·,“ A'T ~ v - - ΓΑΠ τπ , ,fV —
- · - - ϊ N 1 F ' N AA·; ;AA '* Γ 77? GTAAC? A TG ATCTT Π A * A * Λ ''
- ven».-;?, • * ' v a - αγ ·’ ,α ^'+Α·τυΓ.;^^τΑττττ<;τυτυτττ<;ττ·'Αυττ7Λν^ ,A~- -J;A:A713rTr|lAvvr’„,-A vir. i< ;υ·· Π'.-ΑΟΛ * ,0.-7 Τυ.’.'ΜΑΑΑΟΑΤόΟ.^ΤΠ^Α 'AGGrF*ATA^A G A.
—a aa::-í-. : a x^agtgaat-gfgataatttaactagt*. · ,
A - , Í.AAA7CA. T* UTAT ?· -H »''-T*AC‘“T''T.-.*GGT7A-'TATG>TGGTGA. AA
-AU* Τ'? ΑΛΟΑΤΊΑ., » TAAAA G ZAATc: GAAA7AATT JA HAGTTAAAGAAGO ’
-. ?G · Y ' 1AA —7 · — 7<U-,A v.,'.* ?-A7f'AOT'ITC»'.A^0rT-TCCTCrAAAAAATo ·*' . > aAiA, . —afT --.-,-,-77-- -rA-,-,-r.~ AA._,-- AC1-,;G AAr TCAOTCAA ? - Πη-ΆΉΤ TTA. ΌΑ 'ΤΑΊ-ΑΑ :UT0GC^ta’A7“TAAAAAA--T':'TTTU;'?TTTí-77
A 7 -.ΛΑΑ , H A ‘ A í''f'ΓΓΑλΤ17 AAAA7B ,·*'ΤΤ7 Γ!ΉΒ?ΤΤΤΑ 7 'Λ'”- - ΆΌ. . ‘ίΑΑΛΤΤΙ 1 AT’TTAA’,7ATAGT7G-;AGCTCTGTTT7A-„AO
- A - .A'-A1'- ΛΊ AG<’ 7 ;a -.ΧΆ·*Α7Α TAGATGTGATGGAGCC-TTÖTACCAGACGGtH. · st ‘.TA rr’TTATAGTGGC,TTGC<Tr”GCTG>TCTTTTTACTAGACTTGKAATTATTTGCT ’ 7 ' ' T7rc7A^GTTAT'T^-;7UA.^ATTUAAGTA77ACCMSCCCTGTrSÁSTrCATCTG • -s *. -λ- ;,”ΆΑΓ ·ΑΑ,Ι·.<;'· “Α-Ά'-Τ·. 'íAAAATA A 3AA AGGTAAAACAGCACGATAATGT ' . :/»A- A -••CAAGACAATAO.··} TTT-NUTAATACT^ATTGTTAGAACTAAACACAGGOT ; UiA;,n '.AAT+A.-,Tt,AATA7T-,T-A7CATCTUAr-TCAATnAAACGT0AAGTACA7TT
TTA.,GU'AATTrATGUA. t’AATTGTAAACCAAGTTTl’CCTTCCTTTTTCMG AAC GCA
AGA AAC CCA GAT ÓTA GGG GAT ÖGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC — ff T 1 © W 2~
TTG AAG AAC TCG AAA GAG GTAAGCTOGTATTTCCATTTCKJTTGATTTTCCTGT
TGCTTATTTTCTOGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTrTCCCTAG
GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAO AGC CAA ATC GTC TCC TTC TBC
HU 213 566 Β '1/ AAA Tff GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAC GTC ATT CAA AAC
A·,? A'·.; >-AC ACC ATC AAG GAC GAC CTC, TTC GTT AAG PTC TT’
A-'N AGC AAG i’T, GAA TAC TTC CAA AAG 'TG ATT CA — — «~™»ϊ » T R O » 3« . , ; . ACTAGAT» T 1 AATT’TT'',*TTT‘“»7TTTCATTACAGAGGTTCTT » ΆΛ 7 7 ' -:
Τδ -;· ’AGAAAGTACAAATGAAr·· ATGAAATGAACCCGT'iGCCAAAACrCCi '*'% 7 1AATC ·ΑΤΤ^(Τ·:Τ Cf.ACVA TTTGCTAAGTCAGTATGC.CAAT-ATTTAAAT·; --T -A-'·: , ;CAAATTTCGCAC~ATGACTA’TCCAC>AAGGeA~:TGAAC,GCA. ΑΑΛΤ í A
- :¾ IGA ; T.T 1 TGAGG’a'AC-TCíGGA ,ΑαΓ-Τ>Τ -- CT - . : CG Γ +, ’T δ 77 , -'TTTGGATGf - > TGCTG G 7 TC TG TGGAAAG i ; A a 'C ., c .'..A .C · 1 , ·, G« G> CrCG’At-t 7 Λ »« ''T A-· G* AACTGT*, a \-r '?
, A A” A ·*.TG .
A , .
. ; - ·:, s
T ;·~” Τ>Τ Γ,-*,;Τ1 T' .T7ATG Γ7ΑΑ ΑΛ lAC'.'TiAC -X, T í-tgctct; t^aT’-cc α·-α*τ-* τ·τ<;', \ ' '· * G* IG-TCTC/ A -AGGTG.TTG.,G'-AT' ~δ·'.. 1- A δ - T ;”A'-CCCAAí AacacggaAGACc;. - ” . ’ 7 , --'/GT'. T5A· A.GTGÓ-'ArTATACC7eACCAAAGAACTGTTCTur''\ACT7G . '7 “δ -7cro'TAT -- T.-r>X;AGAAA''CCTTAGG<’TCCCAAACTTTCTCT'-ATGAAA 7T r \.T ; * a.í ?, TTA’GTCT^CTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAACCA: AAAGAG
AAA 7 , *“AT1T? ,CAKVATT ! CCTCTAATAGACAAAGACCTCCACATGCCT TGGGTTG ' ' G IGATCTAAATC-,GCTTGAATGAGAAGGWAGGGTGTTCTTATGACTATCTTTAi.AA ;aGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTcXXTGG-TCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA >·· V' AT GAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT ··. ,A> .aattctgtaccagtcaatttaaggatgtgtgatgttccccatcctattacagcaca A < G'A GC A A TTT AATTAT AATTTT AGTCTTAACTGCTG AAG AAAGC AGC ATT ACAT ATT AA GCT AACATATTCCTGGTG AAAGC AACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
A A TAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
TG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
HU 213 566 Β vagy
TAT TAf TCC CAG O’C CCG TTT TTT AAA -A Λ — I. 1 f 1 Ο H
1AA ΑΛ AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATA 21T \ 'TT.'.T-.xr’TUAATiA ~ rGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCl ' Γ A ;TTCACAGT^T<'TT‘AAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTtT,»ATG% ’ 7 — π utttittttactaaatgatctagatattgctttaaccctctgctcaatttgcta;a .ATAUTTAGAUAg^-.TT.-'ATgaaTCTT; 2'AAAACATGGGCTTAACftGGTTTATAAAGUAT
A<TGAAGTTGACAAT^TT ;~GG?7A,,AAG ’CATTGAA r^TGA^AAGTUAAGTAGTG ‘ Ί 7 A 'ATTGAAAAAATCa - ?A > TAT ΓΑ ' TTCTAACTTCTCAGCTTACTATGATGGTGArAA i A 3, T' - A AGA CT A. ICA T A A A A lUTAA^CTGAA *TAATTGATCAGTTAAAGAA •;-CT^TC«rr;V,AGGITTG^.'-;GAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG A ΓΤ ΓΤ » AAATr'r a -η . ·'< CGTTCTCTrAGCTGTGAAGTACTCTGGAAv,TCAGT‘?AAT ;'TUACA Cl T·.' A . -A IT^ATAACCT.lGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT , A-C-ACTT: '7” T ΛΛΑΑ GTÍATrrATGGTTAAT'rAAAATAGTTTTN-CATTTTAAa ~A* f ; A . ;'Α—Τ;ττ AAT1 TAGCTATT/,'TAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAnAC
5. \ \ * - , , .·Ά· ' .ATACATGP;A''GGACCCCTGTACCAGAC-,S ,C, í ' . ·υ > ; · ·,γ-τ; :rrr .ctgatctttttactagacttgaaattattt cc·
Γ ·: ·“?.- 'í. 7 rC’-CACT^TTGAAGTATrACCACCCCTGTTGAG'rTCAl.- 7'.
’ Λ * ’ A : -* ,c-A^7 . - U; ;cc Z'TACACTAT.V^AT.V.C.W.GCT.AAAACAGCACGATAArCT
- · . ,r·'*· »A Ά H.-~ÁG~TTTTGOGAATACTTA7TGTTAGAACTAAATAGAGG ΪΤ . •••ΑΑΑΑΤΑΛΑΑΤ^λο ΆΑ : ACTGI.'AGCATCTCATTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT — a ,,-.·*'·ΑΑ^ΓβΤΤ'·Α,“ΤΑΑ TTTAAAeCAAGTTTTCUTTCCTTTTTCAG AA ' ,T A
ΑΤΑ AA' < LA TAT 7TA TCG GAT GOT GGG CCT CTT TTC CTG TAT A. 7
W T 1 O i 2,
TTG m MAC TGG AAA GAG OTMAGCTÁÁOTMTTTCCATTTGGTTGATTWCÜTOT
TGCTTATrTTCTGGTGGATOAATTCACACCAACCTCTCTrrOTGCTCTrTTCTCCCTMG
GAT AGT GAC AAA AAA MTA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC
TTC AMA CTC TTT GAA MAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA MAO
AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC
HU 213 566 Β
A >·” A<>' ACC AGC MAC CTG CAA -AC TTT 'MA AAG CTG ATT CAG ATT
N T R Ο H 3----‘CG CTG AGG AGATC ΓΤ AMITCT1 TCTTTGvl TTT MTTACACAGGTTCTTűCAAAGT Tt*T
-fMTGT-^CMCAAAG ' M'IAAAC MMs'CMTGMACGAAC'XOTCGCCAAAACTCCTCCTT’ ·' -λ; ti - ^atttc-.^z-ttcacauact^^gctaagtc^tatgggaatcatttaaatt^^.t
IA TlCtXJGGAAATCCTCGCACTATGACTACTGCACAAAGCCAGGTGAAGGGACAAATCi A + r 4a : GACGCGCC MGTGA AGAAGTGGM GGCC ΑΤΤΓΤIC-MGAACC AGCTCTCTCCTTCCCC .; > AM?'* TTCC ,C7 ÍTTCTATf C7> ICCTCCCTGTCTTOCTGGAAAn ’ l ’V/to 7GAGG A-AGAAGAT? TGTGCTT CT.-C-^ATTCAUCCAeCAAOAAACTGTGA m ATGAAT'*· * C'G~TU<;CTGGGGCTTAT<7T-'TCATCTTAAAAOAGCCCTArT
- T7<’ATTAAAATTTTA7 IA?CTTCTTTCCTC7ATAATCCTACAATTCTCTGGACAGA ?. *. * “ '.AAATGft ·Α’.Ά7ΑΑΑ-;ΑΑΑΤΑ^^ΤΤΤΤ.7»Α·',Α0υΤΤ€τΤ<;00ΓΑΤΤ€υΑσΤυΓ ; ;,-,u “ 'TCCT^M. :?TA?AG?<MGrMGCCCMÁGA^AGGrAAGAUCATTTGTCTGTT ’ >, -.Λ*.*-’· .· · :AA7“TTTCTG-{«-AA,?m^G .:r,c~V ' G* ! CGAGAAAT TCTTA-TMAACTTtCTCTCATGAAAr7 ·-; .· : 4 , : τ·λτ··:Ί(’*:Τ7 <ΑΑ·“. * ‘-A ATATMA^TTTAAGCATAAAG^.'
5.·.’ ;-j '· ·: · ?' τν,ττ '.úja: rτ- •.'Aca?gctt?tggctt7g
G ' , . ·,· Í4-’ TTAV^VGUU TTGTTATGACTATGTTTAGAM . .·, Λ 5 5 , 3, , r; -7 · :GAGAGCTTAAGTGGC? 7-GTTTMAACTCAGACTTATTGCACA1 A ··>.- ,j:* ’TftA'*' A7.\TGTTTTGT'”rcT:CAT“T?A A/GTTCTTTTCGCTACATAATTT • A , \ A 7~CTG? A - A·? ’ MATT?AAGGATTTG-G MT -TTCCCC ATCCTATTACACCACA r. Λ ”, AATTTAA^TA ’AATTTTACTCTTAA^GC-7?-AGAKACCACCATTACATATTAA
-- ~·υ\Α, 7A?MTT<*CT,”~CMAACCMCTTTTTCMAA7?GMTATTTCTATTTTCAtGGMG'>''A
Τ -A A 7? MG 7A'GU,T -?CATGCCTTGTATCCCTGAAA.7TAATTTTGCTGTTTTCTTTrur
MATAÖ CTA AAT CAT CTG MAC CTC CMC COC *AA OCM ATM AQT OMA CTC
MTV AMA CTG ΑΤΟ AAT CAT CTG TCG CCC AAA GCT MAC CTG AGG AAG
CGO MAC AGG ACT CAG AAT CCM TTT CG A CCC COC AGA GCG TTG CAA
TAG
HU 213 566 Β vagy vagy vagy
1 5 W 15
is « A < *c WC CA6 GCC GCG TTT TTT MM A GAA ATA GM* MAC CTA AAS
2Ö 25 30
- U τ» : TTT AAC SC A *e* MAC cc* GAT GTA GGG GAT G«T 66 S CCT
>5 40 <5
t ’TC t ’ ·’,> * Vt 1 ' í) A A **c TGG AAA S*6 G*v AGT GAC AAA
5U 55 ín
τ ί AT* AT ' CAG AGC CAA AVf UTC TCC TTC T A C TTC AAA f Te i v-
65 tö ?c
**c 1 W *4 A b A s í«í UC *»v CAA MAS AGC ATS 6A C ACT
rtC 85 j· 0
ATC MAG b*s 3*1 C V S i re 6*1 AAG r r c r r ? AAC ASC ASC ACC AGC
»5 lűö 1Ö5
l AS C T S A A úa·: TTC CA* MAS ere ATT CAG ATT CCG STA AAT 6AT
1 - b ; is 1?5
MAG 6 VC ». A 1» e AAA St* * JA *&’ GAA . U ATC AAA &vü ATS
l 25 i 30 1 35
& Λ T G A : CVS r f . ' C f *f » & ' * * * . C W A Go • Λ c. a a-.; csb MAS *GS Mf- ;
• 5 > O ' CC * < . '•Λ i.CS rτ % 4 4 ’Ab
u 5 A*. TAC ' b < CMS 5 SC T SCI ne T 1 T AAA 10 GAA ATC SAA A A € v 1
- A & r *í T V i Ali 20 Se τ CG» A Á ( CC* GAC 25 STT esi tsÁC SS T 66 T j V öcs
c? FT , t I £» G a c; 35 ATC 06 4 Á « MAC TGG 4 0 MÁM SA* GAC tct GAC 45 Λ A A
i Á Q A 1 i' AT C c & G 50 TCT CMS > f c ST τ TC’ SS TT£ TAC TTC AAA € TG 5 0 T R
U Λ A * A i V I o-i Á A A « GAC MAC C M GTT ATC 10 CA6 AAA TCS A T 6 GAC ?8 *t r
A Γ £ AAA GAA 6*v 80 CTG TTC b T T AAA TTC 85 TTC AAC TCG TCG ACT 90 TCT
AMA ctg SA* GAC 95 TTC CMS AAA CTG ATC 100 CAS ATC CCA GTT AAC 105 GAí.
c w AAA GTT CAG 1 »0 CCT AAG GCT ATC TCT iis GAA CTG ATC AAA GTT UÖ ATG
MAC 6AC CTG TCT US CC* A- A A GCT AAC CTG 130 CGT AMA CGT AAA CGT 1 3S TCT
€ A& A A Cí- CCA TTC 140 CST GGT CST CST GCT IMS CTT CAG TAA
5 Λ ? í> tó □ ζ S G C * rn 2ő 5 TTT AAA 6AA ATC Ga a fe AAC CTG AAA r.AA T*c j!’
< v; » J r x T AAt C CA GAC GTT ter 6A-: &6T GU * te β CTS TTC 1 v
35 40 J! 5
> i . í' G A«M MAC f&G AAA «MA GAC TCT GAC AMA ÁA'G A’ . ATC
50 55 ¢-
* ’ - W «3 *: * S’ ’ ’U TTC TAC T T 0 AAM CTo TTC SAA A* '
55 t G t
t Λ A á A*1 GTT A · c € Ab K5 ATS ü*é ACT ATC AMI b A A
9 , 85 9-
Λ c τ 1 ’ i „ , - TTC AAC TCG * € <S KI AAA cw b
i ?Ö<‘ !U$
„ t G ii, a. * b 4 . - CAS ATC CC M G1 * t A ‘ GAC C TG Λ A ST f
1 1 Ö 1 IS 120
í A& -. · ti * T ’ f * GAA C TG ATC AAA 6?í ATG MAC s*c ·: tu
* * X, 110 1 15
c C “ » í »· b T AAA C 0 > A 4 CQ1 ’ 0 T CAS A « <
; í 143
t * . 3 CTT CAS T A Λ
HU 213 566 Β amelyek adott esetben a következő vezető szekvenciát,
A A? 7*1 AC* «ST TTI ATC tté sct m CAG ctő tst sce att
Π& SST TCT TCT ACC vagy ATG-t tartalmaznak;
- továbbá olyan szekvenciák, amelyek a fent említett DNS-molekulákkal hibridizálnak olyan körülmények között, amelyek 85 %-nál, előnyösen 90 %-nál nagyobb homológiát tesznek lehetővé, ahol is ezek a DNS-molekulák természetes, szintetikus vagy félszintetikus eredetűek lehetnek és ezekkel a DNS-molekulákkal mutáció, nukleotid szubsztituációk, nukleotid delációk, nukleotid inszerciók és nukleotid inverziók révén rokonságit) bán lehetnek és kódolják az EqIFN-γ biológiai és immunológiai aktivitásával rendelkező polipeptideket.
A találmány tárgyát képezik még az alábbi nukleotidokat tartalmazó DNS-molekulák:
f, AK&AAAACC TÁÁAASAATA t ’ AAC6Í* ; S t vagy < - ' · s ·· :.-*:··.· ’-aaai‘.ejr, * cvm vagy
Aí ,. . i. aV AKCTWUUW *, ’ A a ' vagy
- -TTcUTCtAe ÍH TTC AGG* TGTCCAGGAA CAGCGGMCA CCSTCACCAA
C&KTGGGÍ’ ACGA-KGU vagy
Í&C 5 :-ACAAAAA&AT CATCCAfíTCT CAGATCGTTT CTTTCTA^TT CAAACTGOC GAMACO&A AMACAMC-3· vagy * “ T rTCASSTTT TCSMCA6TT TSAMTAGAA AGAAACSATC TGAGACTGGA 1GA7CTT7TT STCMAGTC-3· vagy tb ? S’-ASSTTATCCÁ GAAATC6ATS 6ACACTATCA AASAAGATCT 6TTC6TTAAA HCTTCAACT CO-J* vagy íve 5'-tcgacgagtt gaagmttta acsaacagat crrcTTTSAT agtgtccatc GATTTfTGGA TAAfCTGGTT GTC-3* vagy íG c 5' TCöACTTCTA AACTS6AAGA CTTCCASAAA CTGATCCA6A TCCCA6TTAA
CGACCTGAAA-3’
HU 213 566 Β vagy
«6 W 5 -«CTGMCTTÍ CÁGGTCem TCCASTTTAS AAG~3‘ ACteeeAtCl G6ATCMTTT CTSSAMTCT
vagy
EG- n 5--6TTCAGCGTA AŐ6CTATCTC TCCAAAA6CT TGAAGTSATC AAAGTTATSA AOMCTSTC
vagy
EG- 1? 5CGCAÖGTTA6 GATMaCCTTA CTTTTMMA C-3 CA66TC6TTC atkactttga tcagttcmsa
vagy
t'fi. sr* uwc’u» τ,νίΛΜΝΗ t nAuAÁ'U u·'. ,t&' ; ,·.: ;;
vagy
c . 5 í t GS’Cf. USC’ ονιαγ Áy&u : A f> sCGACfACGb AftTGGGTU1 üAí’AACritn
vagy
U. € > AGGCFut I AA’GGAMAi JijÁAAGAÁI M’’../·.·,>
vagy * X • UAíU’A i ·*4Ι0 : i 7’CSA’TTCT HAAAGAAAG CAGCCU·2'
mely nukleotid szekvenciák az EqIFN-γ részeit kódolják és az ezen DNS-molekulák által meghatározott polipeptidek;
- továbbá olyan szekvenciák, amelyek a fent említett DNS molekulákkal hibridizálnak olyan körülmények között, amelyek 85%-nál, előnyösen 90%-nál nagyobb homológiát tesznek lehetővé, ahol is ezek a DNS-molekulák természetes, szintetikus vagy félszintetikus eredetűek lehetnek és ezekkel a DNS-molekulákkal mutáció, 45 nukleotid szubsztitúciók, nukleotid deléciók, nukleotid inszerciók és nukleotid inverziók révén rokonságban lehetnek és kódolják az EqIFN-γ részterületeit, valamint az ezen DNS-molekulák által kódolt polipeptidek.
A találmány további tárgyát képezi olyan rekombináns DNS-molekulák, például vektorok, előnyösen plazmidok előállítása, amelyek
- egy fent említett polipeptidet kódoló inszertumot;
- egy fent említett DNS-molekulát;
- és egy fent említett olyan DNS-molekulát tartalmaz- 55 nak, amely funkcionális kapcsolatban van egy expresszió-szabályozó szekvenciával és mikroorganizmusokban, mint például prokariótákban, így E. coliban, eukariótákban, például Saccharomyces cerevisiaeben és emlősállat-sejtekben, például lósejtekben replikálódik;
- és amelyek az EG-1 - EG-16 jelzésű DNS-molekulák közül legalább kettőt tartalmaznak, amelyek egymással tetszés szerinti kombinációban egy expresszió-szabá40 lyozó szekvenciával funkcionális kapcsolatban vannak, és amelyek mikroorganizmusokban, mint prokariótákban, például E.coliban, eukariótákban, például Saccharomyces cerevisiaeben és emlősállat-sejtekben, például lósejtekben replikálódnak.
A találmány még az olyan rekombináns DNS-molekulák előállítására is vonatkozik, mint amilyenek a pAHl 11, pRH281/5, pRH282/5, pGNl, pGN3, pGN20, pEqG-QAA2 vagy pEqG-QAA3 plazmidok.
A találmány olyan gazdaszervezetek előállítására is 50 vonatkozik, amelyeket a fent említett rekombináns DNS-molekulák egyikével transzformálunk, ilyen gazdasejtek például a prokarióták, előnyösen az E.coli sejtek, különösen a JM101 vagy HB101 E.coli sejtek, valamint az eukarióták, például a Saccharomyes cerevisiae vagy emlősállat-sejtvonalak, előnyösen ló-sejtvonalak.
A találmány további tárgya eljárás a találmány szerinti polipeptidek előállítására, olyan módon, hogy
a) megfelelő, például a fent említett gazdaszervezeteket transzformáljuk olyan genetikai információkkal, elő60 nyösen a fent említett rekombináns DNS molekulák20
HU 213 566 Β kai, amelyek a találmány szerinti polipeptideket kódolják;
b) az információk a találmány szerinti polipeptideket kódolják;
b) az információk a találmány szerinti polipeptidek termelése érdekében a gazdaszervezetben kifejeződjenek és
c) a találmány szerinti polipeptidet izoláljuk.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti polipeptidek legalább egyikét tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására szolgáló eljárás is.
Az ábrák magyarázata:
Az 1. ábrán a lambda Eq-y2 4664 bp hosszúságú BamHI-fragmentumának a DNS-szekvenciáját mutatjuk be.
Megadjuk a kódolt aminosav-szekvenciát és az intronok helyét. A negatív számozású aminosavak a hidrofób szignál-peptidet jelentik. Az érett EqIFN-γ egyetlen potenciális N-glükozilációs helyét a 86-88-as helyen aláhúzás jelzi. Az RNS-polimeráz kötéséhez szükséges CCATC és TATAAAA szekvenciákat aláhúztuk, ugyancsak az mRNS poliadenilezésének a szignál-szekvenciáját is [AATAAA],
A 2. ábra a különböző fajú gamma-interferonok aminosav szekvenciájának az összehasonlítását ábrázolja. Az „S” előjellel ellátott aminosavak alkotják a szignálpeptidet. A „consensus-szekvenciában nagybetűvel jelöljük azokat az aminosavakat, amelyek minden gammainterferonban azonosak, kisbetűvel pedig azokat, amelyek a gamma-interferonok több, mint 75 %-ában fordulnak elő.
A 3. ábrán a ló-gamma-interferon-gén totál-szintéziséhez alkalmazott oligonukleotidok sematikus képét mutatjuk be. Megadjuk az egyes oligonukleotidok hosszúságát, valamint származásukat. Azokat a restrikciós hasítási helyeket, amelyek a szintetikus génben csak egyszer fordulnak elő, megszámoztuk.
A 4. ábrán az érett EqIFN-γ-ί kódoló természetes gén [eq] szekvenciáját és az E.coliban való kifejeződésre optimalizált szintetikus [syn] szekvenciáját hasonlítjuk össze.
Az 5. ábrán az érett EqlFN-y-hoz használt kodonok táblázata látható. A baloldalon van a kodon első bázisa, a középen a második bázis és a jobb szélen a kodon harmadik bázisa. A táblázat megadja a mindenkori aminosavak számára a természetes génben lévő kodonokat, valamint zárójelben a szintetikus génben lévő kodonokat.
A 6. ábrán látható a pRHIOl expressziós plazmid szerkesztése.
A 7. ábrán látható a pGN20 szerkesztése és restrikciós térképe.
A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy a találmány oltalmi körét a példákra korlátoznánk.
Anyagok
A kiindulási anyagokat részben kereskedelemből szereztük be, részben az EMBL-től [Európai Molekuláris Biológiai Laboratórium, Heidelberg, NSZK] származnak. A JM101, pUC9 és M13mp8 E.coli törzsek a Bethesda Research Laboratories-ből, a sup F szupresszorfaktort tartalmazó E.coli törzsek, például az NM526, 538 és 539 E.coli, valamint a lambda-EMBL3 vagy 3A vektorok az EMBL-től származnak és a Stehelin cégtől [Basel, Svájc] is beszerezhetők.
1. A ló-DNS izolálása
A fagyasztott szövetet, például a ló-májat folyékony nitrogénben finom porrá őröljük, majd a 0,5 M EDTA, 10 mM trisz-HCl puffer (pH=8,0) 0,5 % SDS és 0,1 mg/ml proteináz K tartalmú oldatban (20 ml/g szövet) inkubáljuk 3 órán át 55 °C-on. A kapott viszkózus oldatot fenolos extrakcióval, majd háromszori fenol-kloroformizoamilalkohol (25:24:1 térf.) eleggyel extrahálva fehérjementesítjük, 50 mM trisz.HCl puffer (pH=8,0), 10 mM EDTA és 10 mM NaCl tartalmú oldattal szemben dializáljuk és a DNS-t kétszeres térfogat etanollal kicsapjuk. A csapadékot vákuumban teljesen megszárítjuk, majd TE pufferben [10 mM trisz.HCl (pH=8,0), 1 mM EDTA] 4 °C-on oldatba visszük és 1,273 g CsCl/ml oldatban 62 órán át 40 000 fordulat/perc mellett 20 °C-on centrifugáljuk [Sorvall 50Ti-Rotor]. A CsCl gradienst kicsepegtetjük, a DNS tartalmú frakciót TE-pufferrel szemben dializáljuk és végül a DNS-t kétszeres térfogat etanollal kicsapjuk, 70 %-os etanollal mossuk, megszárítjuk és újból oldjuk TE-pufferben (4 °C).
A kész DNS-preparátum nem tartalmaz RNS-t és hosszabb 50 kb-nél (0,45 %-os agaróz-gélben végzett elektroforézissel való meghatározás alapján).
2. A lö-DNS részleges emésztése endonukleázzal és nagyság szerinti frakcionálása
50-50 pg ló-DNS-t inkubálunk 1,6 egység Sau3 A-val 450 pl rekacióelegyben [10 mM trisz.Hcl (pH=7,5) puffer, amely 10 mM MgC12-t és 1 mM ditiotreitolt (DTT) tartalmaz] 37 °C-on. Az elegyből 15, 25 és 40 perc után 150 pl-es részleteket veszünk ki és 15 mM EDTA-t adunk hozzájuk.
A reakciót 10 perces 70 °C-ra való melegítéssel leállítjuk, majd 0,3 M Na-acetát (pH=6,0) hozzáadása után a DNS-t 2,5-szeres térfogat etanollal kicsapjuk. A DNS-t TE-pufferben újból feloldva 0,45 %-os agaróz gélben TBE-pufferben (10,8 g írisz, 5,5 g/1 bórsav, 0,93 g/1 Na2EDTA) körülbelül 1 V/cm-el egy éjjelen át elektroforetizálva molekula méret szerint frakcionáljuk. A molekulanagyság-markerek alapján (EcoRI-el és HindlII-al kétszeresen emésztett és HindlII-al emésztett lambdaDNS) a géldarabból kivágjuk a 10-23 kb hosszúságú DNS-t, a gélből származó DNS-t dializáló hüvelyben 3 órán át 300 V feszültséggel elektroeluáljuk (0,l*TBE puffer), Elutip-D-oszlopon [Schleicher-Schüll] az alkalmazási előírtak szerint tisztítjuk és végül etanollal kicsapjuk.
A ló-DNS-fragmentumok összekapcsolódásának (önligáció) megakadályozása céljából a méret szerint frakcionált ló-DNS-darabokat defoszforiláljuk. Az „önligáció” részben mesterséges ló-DNS-szekvencia hibrideknek, részben túlságosan nagy, s így a lambda fágba már be nem pakolható DNS-daraboknak a képződéséhez
HU 213 566 Β vezethet. Defoszforilálás céljából a DNS-t 140 μΐ reakcióelegyben [50 mM trisz.HCl (pH=9,5), 10 mM MgC12, 0,1 mM Zn-acetát, 1 mM spermidin] 5 egység marhabél-foszfatázzal [bovine intestinal phosphatase] 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd további 5 egység enzimet adunk az elegyhez és még 30 percig inkubáljuk. Ezután 25 mM végkoncentrációig EDTA-t adunk az elegyhez és a DNS-oldatot egyszer fenol-kloroformizoamilalkohol eleggyel (24:1) és háromszor dietiléterrel extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, megszárítjuk és 0,1 *TE pufferben oldjuk.
3. A ló-genom-DNS-tár létesítése
A defoszforilált, 10-23 kb hosszú ló-DNS-fragmentumokat egy lambda vektorba klónozzuk, például G-A-T-C ragadós végű lambda-EMBL3 vagy -3A vektorokba [Frischauf, A.M. és mtsai: J.Mol.Biol., 170,827-842 (1983)], amelyekhez úgy jutunk, hogy a fág-DNS belső BamHI-fragmentumát eltávolítjuk.
A vektort sup F szupresszorfaktorral rendelkező E.coli sejtekben, például NM526, 538 vagy 539 E.coli sejtben [Frischauf, A.M. és mtsai: J. Mól. Bioi. 170, 827-842, (1983)] 5 mM MgSO4 tartalmú LB-táptalaj oldatban tenyésztjük (Miller: Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Láb. Cold Spring Harbor, New York), polietilén-glikollal kicsapjuk és kétszeri CsCl-sűrüség gradiens centrifugálással [0,71 g CsCl/ml oldat; 40 óra; 45 000 fordulat/perc; 20 °C] tisztítjuk.
TE-pufferrel szembeni dialízis után a fág-DNS-t kétszeri fenol-kloroform-izoamilalkoholos [25:24:1] és kétszeri kloroform-izoamilalkoholos [24:1] extrakcióval fehérjementesítjük és etanolos kicsapással koncentráljuk.
Az MEBL3A vég-fragmentumok elkülönítése céljából 50 pg fág-DNS-t 2 órán át 37 °C-on 450 pl reakcióelegyben [10 mM trisz.HCl (pH=7,5); 10 mM MgCl,2, 1 mM ditiotreitol] BamHI-el teljesen megemésztünk, a reakciót 15 mM EDTA-val 10 percig 70 °C-on kezelve leállítjuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk.
A religáció elkerülése céljából a középső fragmentumot EcoRI-el újból hasítjuk és a lehasadó oligonukleotidot izopropanolos kicsapással eltávolítjuk.
A BamHI-el emésztett lambda-DNS-t 2 órán át 37 °C-on 450 μΐ 10 mM trisz.HCl [pH=7,5], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 tartalmú oldatban EcoRI-el teljesen megemésztjük és a reakciót 15 mM EDTA hozzáadásával és 10 percig 70 °C-ra való melegítéssel leállítjuk. Az elegyhez 0,3 M végkoncentrációig nátrium-acetátot adunk és a három nagy DNS fragmentumot 0,6 térfogat izopropanollal 0 °C-on 15 percig tartva kicsapjuk, kétszer 0,45 M Na-acetát- 0,6 térfogat izopropanol elegyével és egyszer 0,3 M Na-acetát - 2,5 térfogat etanol elegyével mossuk és 15 μΐ 0,1 χΤΕ-pufferben oldjuk. Ennél az eljárásnál a BamHI/EcoRI-linker oldatban marad. Az EMBL3 A fragmentumot (8 pg), körülbelül 5 pg 10-23 kb ló-DNS-t és 10 egység T4-DNS-ligázt (NEN) elegyítünk és egy éjjelen át 14 °C-on és egy napon át 4 °C-on 50 pl ligációs közegben [66 mM trisz.HCl (pH=7,2); 0,1 M NaCl; 10 mM MgCL; 1 mM EDTA; 5 mmól ditiotreitol; 0,5 mM ATP] inkubáljuk. A ligáit DNS-keveréket érett lambda-fág részecskékbe pakoljuk [in vitro packaging system] [Scalenghe, F. és mtsai: Chromosoma, 82, 205-216 (1981)].
Ennek a rendszernek az összetevőit, azaz az ultrahangos kivonatot (SE), a fagyasztással-felolvasztással készült lizátumot (FTL), az Ml és A puffereket Scalenghe szerint állítjuk elő [Schalenghe, F. és mtsai: Chromosoma, 82,205-216, (1981)]. A ligáit DNS keverék 10 ples részleteit szobahőmérsékleten 2 percig inkubáljuk olyan SF 25 pl-ével, amelyet 30 perccel előbb vettünk ki a jégből, majd ugyanilyen módon felolvasztott FTL 100 pl-ét adjuk az elegyhez és szobahőmérsékleten további 60 percig inkubáljuk azt. A bepakolandó elegyet 150 pl lambda-hígítóval [100 mM trisz.HCl (pH=7,5), 10 mM MgSO4 1 mM EDTA] hígítjuk és 4 °C-on tároljuk.
4. A ló-gamma-interferon [EqIFN-y] gén klónozása és szekvenálása
A. Egy teljes EqIFN-γ gén klón izolálása.
Az NM528 E.coli sejtek transzfekctójához a ló-DNSgyűjteményt használjuk. Egy éjjelen át 0,2 % maltózt tartalmazó LB tápoldatban [10 g/1 tripton, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 NaCl (pH=7,4) tenyésztjük a baktériumkultúrát, majd 10 mM MgSO4 oldatban 2,0 optikai sűrűségűre állítjuk be [600 nm hullámhosszon]. Ennek a szuszpenziónak a 0,5 ml-eit a DNS gyűjtemény lambda fágjainak 50.000 pfu [plaques forming unit = plakk-képző egység] mennyiségével fertőzzük és egy LB lágy agarréteggel 10 mM MgSO4-et tartalmazó LB agar lemezekre szélesztjük (13,5 cm átmérő). Összesen l,5xl06 rekombináns lambda-fág szűrővizsgálatát végeztük el. Egy éjszakán át 37 °C-on való inkubálás után minden lemez tágjairól nitrocellulóz-lemezre két másolatot készítünk [Benton és Davis, Science, 196, 180-182, (1977)]. A fág-DNS denaturálása [1 perc 0,5 M NaOH-t és 1,5 mM NaCl-t tartalmazó oldatban], semlegesítése [kétszer 3 perc 0,5 M trisz.HCl (pH=7,5), 1,5 M NaCl tartalmú oldattal] és öblítése [1-1 perc 2xSSC, 1XSSC, 0,15 M NaCl és 15 mM Na-citrát oldatokkal] után a szűrőket levegőn megszárítjuk és a DNS-t 2 órán át 80 °C-on tartva fixáljuk. A szűrőket éjjelen át 65 °C-on, 1,5 M NaCl és 10 mM trisz.HCl [pH=8] tartalmú oldatban mossuk és 4-6 órán át 65 °C-on előhibridizáljuk [hibridizáló oldat: 0,9 M NaCl, 50 mM NaH2PO4 (pH=7,4) 5 mM EDTA, 0,1 % Ficoll, 0,1 % polivinil-pirrolidon, 0,1 % marha szérumalbumin, 0,1 % SDS, 20 mg/ml ultrahanggal kezelt és denaturált lazac-sperma-DNS],
A hibridizálást szokásos módszerrel radioaktív jelzett HuIFN-γ próbaanyag friss oldatával végezzük, szűrőnként 106-cpm radioaktivitás alkalmazásával 20 órán át 65 °C-on. A szűrőt nem szigorúan meghatározott körülmények között 3xSSC-t és 0,1 % SDS-t tartalmazó oldattal mossuk 65 °C-on, megszárítjuk és autoradiográfiásan előhívjuk. Három plakk-tisztítás után 5 lambda-klónt tudtunk azonosítani, amelyek pozitív hibridizációs jelet mutattak.
Ezekből az izolált rekombináns fágokból a szokott módszerrel [Maniatis és mtsai, lásd fent] tisztítjuk a
HU 213 566 Β
DNS-t. A fág DNS-eket különböző restrikciós enzimekkel való emésztéssel és ezt követően Southem-analízissel [Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503-517, (1975)], azaz HuIFN-γ próbaanyaggal történő hibridizálással vizsgáljuk. A lambda Eq-γ 2 kiónnak egy egyedi hibridizáló, 4,6 kb hosszúságú BamHI fragmentumát izoláljuk és a pUC9 plazmid BamHI hasítási helyére klónozzuk. A JM101 E.coli sejtek transzformációja után a kapott kolóniákból egy minipreparációs módszerrel [Bimbóim és Doly: Nucl. Acids. Rés. 7, 1513-1523, (1979)] előállítjuk a plazmid DNS-t és azt restrikciós enzimekkel való emésztéssel vizsgáljuk. A kívánt BamHI inszertumot tartalmazó plazmidot pAHl 11-nek neveztük el. A pAH 111 plazmid BamHI inszertumának a végeit M13mp8, ill. M13mp9 vektorokba víve [Vieira, és Messing: Gene, 19, 259-268, (1982)] didezoxi-módszerrel [Sanger és mtsai Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, (1977)] szekvenáljuk. A humán gamma-interferon génnel való összehasonlítás [Gray és Goeddel: Natúré, 298, 859-863, (1982)] nagy homológiát mutatott a nem kódoló 5' és 3' régiókkal. Ebből megállapítottuk, hogy a teljes EqIFN-γ gént izoláltuk.
B. A lambda Eq-γ 2 kiónból nyert ló-gamma-interferon gén szekvenálása.
A p AH 111 plazmid 4,6 kb hosszúságú inszertumának egészét szekvenáljuk didezoxi-módszerrel. A BamHI fragmentum teljes szekvenciáját az M13-szubklónok részszekvenciáinak a kombinációjával állapítjuk meg, amelyeket a restrikciós fragmentumokat [EcoRI, HindlII, Petl-BglII, HindlII-BamHI] a megfelelően hasított Μ13mp8 vagy Μ13mp9 vektorokba való irányított klónozásával állítottunk elő. További részszekvenciákat állítunk elő, úgy hogy a 2,0 kb hosszúságú BamHI-BglII fragmentumot, illetve a 2,0 kg hosszúságú PstI fragmentumot „shotgun-módszerrel” M13mp8 vektorba klónozzuk. Mind a két DNS fragmentumot ultrahanggal kisebb darabokra hasítjuk, a DNS-végeket E.coli DNSpolimeráz I-el [Klenow-fragment] mind a négy dezoxinukleotid-trifoszfát 0,1 mM mennyiségeinek a jelenlétében inkubálva tompa végűvé alakítjuk [reakciópuffer: 50 mM trisz. HC1 (pH=7,5), 10 mM MgCE, 1 mM ditiotreitol, 0,5 mg/ml marha-szérumalbumin; inkubálás 1 órán át 25 °C-on], Agaróz-gélben végzett méret szerinti frakcionálás után izoláljuk a 0,4-1,0 kb hosszúságú DNS fragmentumokat és az M13mp8 vektor Smal hasítási helyére ligáljuk. A kapott részszekvenciákat komputer-program segítségével egyesítjük a 4664 bp hosszúságú teljes szekvenciává, amelyet az 1. ábra mutat be.
A nyitott leolvasási keret komputerrel alátámasztott analízise és más fajok gamma-interferon génjeivel való összehasonlítása segítségével [Gray és Goeddel: Natúré, 298, 859-863; Gray és Goeddel: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5842-5846 (1983); Dijkema és mtsai: EMBO J., 4,761-767, (1985); Cerretti és mtsai: J. Immunology, 136,4561-4564 (1986)] vizsgáltuk meg a ló gamma-interferon gén fehérjekódoló részét. A fehérjét kódoló régiót három intron szakítja meg, az első exon a 20 aminosav hosszúságú hidrofób szignálpeptidet és az érett EqIFN-γ polipeptid 18 aminosavát kódolja [366—479 bázisok]. A második exon a 19—41 aminosav szekvenciát kódolja [1639-1707 bázisok], a harmadik exon a 42-102 aminosavakat kódolja [1803-1985 bázisok] és a negyedik exon kódolja a C-terminális 103-146 aminosavakat [3307-3441 bázisok]. A 4010 és a 4020 pozícióban két szignál-szekvencia található [AATAAA] a mRNS poliadenilezésére. Az érett EqIFN-γ polipeptid 86-88 pozícióiban található az egyetlen potenciális Nglükozilálási hely [Asn-Ser-Ser], amely azonos helyen van a bovin gamma-interferon második N-glukozilálási helyével [2. ábra]. Az érett EqIFN-γ polipeptid meglepő módon csak egyetlen cisztein-részt tartalmaz a 3-as pozícióban, mivel a természetes humán és egér-gamma-interferonokkal analóg módon, az aminoterminális első három aminosav a szervezetben valószínűleg [ebben az esetben a Tyr-Tyr-Cys] proteitikusan lehasad.
5. Az érett EqlFN-y-t meghatározó szintetikus gén előállítása
A rekombináns EqIFN-γ érett formájának E.coliban való kifejezése céljából oligonukleotidokból szintetikus gént szerkesztünk, amely a természetes EqIFN-y-val azonos aminosav szekvenciát kódol, azonban az egyes aminosavaknak kizárólag olyan kodonjait tartalmazza, amelyek az E.coliban magas szinten kifejeződő, sejtazonos génekben találhatók [Gouy és Gautier: Nucl. Acids Rés., 10, 7055-7074 (1982)]. Ezenkívül több egyedi restrikciós enzim hasítási helyet építünk be, amelyek lehetővé teszik az egyes részek megváltoztatásával a gén egyszerű manipulációját. A szintetikus EqIFN-γ gént két variációban összesen 16 különböző oligonukleotidból szerkesztjük meg. Az első variáns a 146 aminosavat tartalmazó érett EqlFN-y-t és a startmetionint kódolja, a második forma az aminoterminálison három aminosavval [Tyr-Tyr-Gys] rövidebb polipeptidet és a start-metionint kódolja, amint az feltételezhetően a természetes szervezetben előfordulhat.
A szintetikus EqIFN-γ gén szerkezetét a 3. ábra mutatja be. Az előállításhoz alkalmazott oligonukleotidokat az Applied Biosystems [Model 381 A] DNS-szintetizátorával szintetizáljuk, denaturáló [7 mólos karbamid] 12 %-os poliakril-amid gélben elektroforetizálva tisztítjuk és Sephadex G-25 oszlopon [Pharmacia gyártmány] kizárásos kromatográfiával sómentesítjük.
Az oligonukleotidok összeépítése szintetikus
EqlFN-y- génné
A szintetikus EqIFN-γ gén felépítése két részletben történik, a gén első részét az EG-l-től az EG-8-ig terjedő nyolc oligonukleotid segítségével a Sáli hasítási helyig állítjuk elő, a gén második részét pedig az EG-9-től az EG-14-ig terjedő hat oligonukleotidból a Sáli hasítási helytől a BamHI hasítási helyig állítjuk elő. Az aminoterminálison három aminosavval rövidebb forma előállítása céljából az EG-1 és EG-2 oligonukleotidok helyett az EG-15 és EG-16 oligonukleotidokat alkalmazzuk. Az egymással komplementer oligonukleotidokat alkalmazzuk. Az egymással komplementer oligonukleotidokat mindig párosával foszforizáljuk az 5'-végeken. Mindkét
HU 213 566 Β oligonukleotidból [pl. EG3 és EG4, ill. EG-5 és EG-6 stb.] mindig 100 pmol mennyiséget inkubálunk 9 μΐ kináz-pufferben [70 mM trisz.HCl (pH=7,6), 10 mM MgCb, 5 mM ditioreitol], 2 pCí [Y‘32P] ATP (amersham) jelenlétében 10 egység T4-polinukleotid-kinázzal (New England Biolabs) 10 percig 37 °C-on, majd 1 μΐ 10 mM ATP oldatot adunk az elegyhez és további 50 percig inkubálunk 37 °C-on. A reakciót 10 percig 95 °C-onvaló melegítéssel állítjuk le. A DNS-végek későbbi összekapcsolódásának a megakadályozására az EG-1, EG-15, EG9 és az EG-14 oligonukleotidokat nem foszforiláljuk. Ezeket csak a polinukleotid-kináz inaktiválása után adjuk a komplementer oligonukleotidokhoz, majd az elegyet 5 percig 95 °C-on melegítjük, végül szobahőmérsékletre lehűtjük.
Az EG-1+2 (ill. a második esetben az EG-15+16), az EG-3+4, EG-5+6 és az EG-7+8 oligonukleotidokat egyesítjük, 1 μΐ 5 M NaCl-t adunk hozzá, 5 percig 70 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hütjük. Ehhez az oldathoz 5 μΐ 10 mM ATP-t, 2 μΐ ditiotreítolt, 1,5 ml lOxligációs-puffert [0,66 M trisz.HCl (pH=7,2), 1 M NaCl, 100 mM MgC12, 10 mM EDTA, 50 mM ditiotreitol] és 80 egység T4-DNS-ligázt (New England Biolabs) adunk és 48 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A ligázreakció lefolyását úgy követjük, hogy kis reakcióelegyrészleteket 5 %-os, nem denaturáló poliakrilamid gélben elektroforetizálunk és az elválasztott DNS fragmentumokat autoradiográfiával vizsgáljuk. Azonos módon kapcsoljuk össze egymással az EG-9-EG-14 oligonukleotidokat is. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le és a DNS-t etanolos kicsapással nyerjük ki.
6. A pRHIOO expressziós plazmid szerkesztése
Minden enzim-reakciót az enzimeket előállító cégek által megadott körülmények között végzünk.
pg pERIO3 plazmidot [Dworkin-Rastl és mtsai: Gene, 21, 237-248 (1983); EP-A-O. 115-613] 50 pl reakcióelegyben HindlII restrikciós endonukleázzal linearizálunk. Egy órán át 37 °C-on való inkubálás után 50 pl 2*CIP-puffert adunk hozzá [2xCIP puffer=20 mM trisz.HCl (pH=9,2) 0,2 mM EDTA],
Az 5'-terminális foszfátmaradékokat 2 egység borjúbélből előállított alkalikus foszfatázzal [calf intestine phosphatase=CIP] távolítjuk el 30 percig 45 °C-on inkubálva. A reakciót 4 pl 0,5 mM EDTA-oldat és 10 μΐ 1 M trisz.HCl (pH=8,0) pufferoldat hozzáadásával állítjuk le.
A fehérjéket kétszer fenollal, egyszer fenol-kloroform eleggyel extrahálva távolítjuk el. A DNS-t a vizes oldatból 0,1 térfogat 3 mM nátrium-acetát oldat (pH=5,5) és 250 pl etanol hozzáadásával kicsapjuk, a DNS-csapadékot centrifügálás után 70 %-os etanollal mossuk. A DNS-t megszárítjuk és végül a csapadékot 20 pl TE-pufferben [10 mM trisz.HCl (pH=8,0), 0,1 mM EDTA] oldjuk.
A szintetikusan előállított d[AGCTTAAAGATGAGCT] és d[CATCTTTA] oligonukleotidok 1-1 pg-ját 10 pl reakcióelegyben 10 egység T4-PNK [polinukleotidkináz] és 1 mM rATP jelenlétében foszforiláljuk. A reakció 37 °C-on 45 perc alatt megy végbe. A reakciót 10 percig 70 °C-on való melegítéssel állítjuk le.
A plazmid oldat 5-5 pl-ét elegyítjük a foszforilált obgonukleotidokkal és 5 percen át 70 °C-on tartjuk. Ezután az oldatot 0 °C-ra hűtjük, 2 pl lOxligáz puffért [500 mM trisz.HCl (pH=7,5), 100 mM MgCl?, 200 mM DTT, 1 mM rATP, 500 pg/ml BSA (marha-szérum-albumin, bovin serum albumin = BSA)], valamint 2 pl vizet és 10 egység T4-DNS-ligázt adunk hozzá. A reakciót 4 °C-on végezzük 40 órán át, majd 10 percig 70 °Con tartva leállítjuk.
A fenti ligáz-reakcióelegy 2 pl-ét összesen 30 pl oldatban 10 egység SacI restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs) 3 órán át 37 °C-on emésztjük. A reakciót 10 percig 70 °C-on tartva állítjuk le. A fenti reakcióelegy 5 pl-ét összesen 30 pl-ben 10 egység T4-PNK hozzáadásával 14 °C-on 16 órán át ligáljuk.
200 pl kompetens HB101 E.coli sejthez 10pl-t adunk ebből a ligáz-reakció-elegyből. A DNS felvétel elősegítésére a baktériumokat 45 percig jégen, majd végül 2 percig 42 °C-on tartjuk. Végül a baktérium suszpenziót ismét 0 °C-on inkubáljuk 10 percen át. A transzformált baktériumokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-agarra szétosztjuk.
A képződött baktériumtelepekből önkényesen kiválasztunk 12 telepet és mikroméretben izoláljuk belőlük a plazmidokat [Bimbóim és Doly: Nucl. Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)]. A kapott DNS-t SacI restrikciós endonukleázzal hasítjuk és a DNS-t agaróz-gélben választjuk el (1 %-os agaróz-gél, 1 xTBE-puffer). Az a körülmény, hogy a DNS mintegy 4400 bp hosszú lineáris molekulaként vándorol, bizonyítja, hogy egy Sacl-felismerőhely et vezettünk be a plazmidba. A plazmidok egyikét önkényesen kiválasztjuk. A minipreparatív módszerrel kapott DNS-el még egyszer transzformálunk HB 101 E. colisejteket. Az ennek eredményeként keletkezett transzformáit baktériumokból kiválasztunk egy telepet és nagyobb méretben tenyésztjük. Az innen izolált plazmidot az EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal elhasítjuk, a DNS-t 1 %-os agaróz gélben elválasztjuk, a kisebb fragmentumokat a gélből elektroelucióval izoláljuk. A körülbelül 460 bp hosszúságú EcoRI-BamHI DNS-fragmentumot Sanger módszerével szekvenáljuk [Sanger, F. és mtsai: Proc. Natl. Acad. Sci, 5463-5467 (1977)]. Az így analizált plazmidot pRH 100-nak neveztük el.
7. A szintetikus EqIFN-y gén bevitele a pRHIOO expressziós plazmidba pg pRHIOO plazmidot 100 pl reakció-pufferben Sacl-el teljesen elhasítunk, majd az enzimet 10 percig 70 °C-on való melegítéssel inaktiváljuk. A túlnyúló DNS-végeket Klenow-fragmentummal [Amersham] és a négy dezoxinukleotid-trifoszfát 10-10 pmólnyi mennyiségeivel tompa végűekké alakítjuk (30 perc, 25 °C). A reakciót fenol-kloroform eleggyel extrahálva állítjuk to és a DNS-t etanolos kicsapással koncentráljuk. Ennek a kezelésnek az eredményeképpen a triptofán promoterhez kapcsolódóan egy tompa DNS-vég jön létre, amely az „ATG” transzlációs startkodonnal fejeződik be. A linearizált plazmid-DNS-t BamHI-el újból hasítjuk és a vektor részt agaróz-gélben elektroforetizálva választjuk el.
HU 213 566 Β
A leírt módon előkészített pRHIOO plazmid-vektor 50 ng mennyiségét a ligáit EG-1 - EG-8 és az EG-9 -EG-14 oligonukleotidokkal elegyítjük és 10 μΐ ligációs pufferben [66mMtrisz.HCl(pH=7,2), lOOmMNaCl, lOmMMgCb, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, 1 mM ATP] egy egység T4 DNS-ligázzal [Boehringer, Mannheim] 24 órán át 14 °C-on inkubáljuk. A kalcium-kloridos kezeléssel alkalmassá tett JM101 E.coli-sejteket a ligációs eleggyel egy éjjelen át 37 °C-on inkubálva transzformáljuk. A kapott transzformált anyagból a plazmid-DNS-t minipreparatív eljárással izoláljuk és szerkezetét restrikciós analízissel és a HindlII-BamHI inszertumok szekvenálásával állapítjuk meg. Az érett EqlFN-g kifejezésére alkalmas szerkezetű plazmidot pEqG-YYClnek neveztük el.
8. Az interferon-aktivitás expresszióspEqG-QAAl plazmidot tartalmazó JMI01 E.coli-sejtekben
100 ml baktérium-tenyészetet erős rázatás közben a következő összetételű triptofánmentes táptalajban inkubálunk 37 °C-on (egy liter táptalajra vonatkozó adatok) 10 g [NH4]2PO4, 3,5 g KH2PO4 (PH=7,3 értékre állítjuk NaCH-val), 0,5 g NaCl, 21 g kazein-aminosav (savval hidrolizált), 11 g glükóz, 1 mmol MgSO4, 0,1 mmol CaCl2, 1 mg tiamin-HCl, 20 mg L-cisztein, 20 mg 3-b-indolakrilsav (IAA, a triptofánoperon induktora) és szükség szerint 50-100 mg ampicillin. Végül a baktériumokat 5 percig 4000 ford/perc mellett elválasztjuk, a táptalaj 1/10-ének megfelelő mennyiségű jéghideg 50 mM írisz.HC1 (pH=8,0) és 30 mM NaCl tartalmú oldatban szuszpendáljuk és jeges hűtés közben kétszer 30 percig ultrahangszondával (20 kHz, 100 Watt) feltárjuk. A sejttörmeléket 10 percig 10.000 ford/perc mellett 4 °C-on centrifugálva eltávolítjuk és a felülúszó interferon aktivitását steril szűrés után vesicularis stomatitis vírusra [Vesicular Stomatitis Vírus = VSV] vagy encephalomyocarditis vírusra [Encephalomyocarditis Vírus = EMVC] gyakorolt citopátiás hatás alapján teszteljük.
Teszt-rendszer: NBL-6 sejtek (ATCC CCL 57, lóbőrepidermisz-sejtek) / VSV
A549 (ATCC CCL 185 humán tüdő-karcinoma sejtvonal) /EMVC
A titert nemzetközi egységben adjuk meg az A549 sejteken humán interferon standarddal végzett párhuzamos vizsgálat eredménye alapján.
9. A kifejeződött ló-interferonok kimutatása fehérjék jelzésével maxisejtekben
A plazmid által kódolt fehérjéket maxisejt-technikával in vivő szelektíven jelezzük. E.coli CSR603 sejteket szokásos eljárással expressziós plazmidokkal transzformálunk és a transzformált baktériumokat ampicillin tartalmú agarlemezen szelektáljuk. A maxisejtek előállítása és a fehérjék jelzése A. Sancar előírása szerint történik (lásd fent). A sejteket 15 ml táptalajban (lásd a 8. példa) indolakrilsav nélkül 37 °C-on ODfl00nm±O,5 optikai sűrűségig szaporítjuk és 10 ml fenti tenyészetet Petri-csészében 5 másodpercig 50 cm távolságból UV-germicid lámpával (15 Watt) mozgatás közben besugárzunk és egy órán át 37 °C-on tovább inkubáljuk. A tenyészethez 100 pg/ml D-cikloszerint adunk, 14 órán át 37 °C-on inkubáljuk, végül a baktériumokat centrifugálással gyűjtjük össze. A sejteket kétszer mossuk 5 ml Hershey-sóoldattal, majd 5 ml 20 pg/ml indolakrilsavat tartalmazó Hershey-oldatban szuszpendáljuk és 2 órán át inkubáljuk 37 °C-on. Mindegyik tenyészethez 5 pCi/ml 35S-metionint adunk [lOOOCi/mmol] és egy órán át 37 °C-on rázatjuk. A sejteket összegyűjtjük, SDS és 2-merkaptoetanol-tartalmú elektroforézis próba-pufferben lizáljuk és a fehérjéket 15 %-os poliakrilamid gélben szétválasztjuk.
Hershey-sóoldat (a mennyiségek 1 liter oldatra vonatkoznak)
5,4 g NaCl
3,0 g KC1
1.1 gNH4Cl mg CaCl2.2H2O
0,2 g MgCl2.6H2O
0,2 mg FeCl3.6H2O mg KH2PO4
12.1 g trisz.HCl [pH 7,4]
Hershey-tápoldat (a mennyiségek 100 ml Hersheysóoldatra vonatkoznak) ml 20 %-os glükóz
0,5 ml 2 %-os treonin
1,0 ml 1 %-os leucin
1,0 ml 2 %-os prolin
1,0 ml 2 %-os arginin
0,1 ml 0,1 %-os tiamin
A megszárított gél autoradiogrammját 2 napig tartó exponálás után, DuPont Cronex rönttgenfilm és Kodak Lanex-Regular erősítő fólia felhasználásával -80 °C-on készítjük el. Molekulasúly-standardként egy 9 * * * * l4C-metilezett fehérjekeveréket [Amersham] alkalmazunk. Kontrollként egy olyan pER103 plazmid szolgál, amely csak az interferon gén nélküli promotert tartalmazza, valamint a pER21/l plazmid, amely a humán IFN-α 2arg gén két kópiáját tartalmazza.
10. Az EqlFN-'t-val hibridizáló szekvenciák kimutatása a genomiális ló-DNS-ben
Az EqIFN-γ interferon génnel nagyfokú homológiát mutató teljes szekvencia kimutatása a következőképpen történik: 30 pg nagymolekulasúlyú ló-DNS-t (1. példa) 100 egység megfelelő restrikciós enzimmel 300 pl reakcióelegyben teljesen megemésztünk, majd az elhasított DNS-nek 10 pl-eit 0,8 %-os agaróz gélbe visszük és nagyságuk szerint szétválasztjuk.
Ezután a DNS-t Southern szerint nitrocellulóz szűrőre visszük, denaturáljuk és fixáljuk majd mintegy 6 · 106 cpm radioaktív jelzett próbaanyaggal hibridizáljuk (17 óra 65 °C-on 5*SSC, 5*Denhardt-oldat, 0,1 % SDS, 20 pg/ml denaturált lazac-sperma-DNS).
Az EqIFN-γ próbaanyagaként a pEqG-YYCl plazmid egy fragmentumát alkalmazzuk, amely a teljes érett interferon kódolásához szükséges szekvenciát tartalmazza. A szűrőt ezután szigorú körülmények között négyszer mossuk 45 percig 65 °C-on a következő oldattal: 0,3*SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM nátrium-citrát), amely
HU 213 566 Β
0,1% SDS-t tartalmaz. Az autoradiográfiát DuPont Cronex röntgenfilmen végezzük Kodak-Lanex-Regular erősítőfóliával 7 napon át -80 °C-on.
II. A ló-gamma-interferon (QAA) expressziója 5
HB101/pEqG-QAA2 és HB101/pEqG-QAA3 E.coli sejtekben
A hatékonyabb expresszió elérése céljából
a) alkalmasabb expressziós vektorokat és
b) egy jobb riboszomális kötőhelyet alkalmazunk.
A megfelelőbb expressziós vektorok részben a Serratia marcescens (Sma) trp promoteren alapulnak. A promotert a -35 szakaszban egy báziscserével a megfelelő (consensus) -35 szakasszal tesszük egyenlővé (pRH281), másrészt egy olyan hibrid trp promoteren alapulnak, amely tartalmazza az E.coli (Eco) első A/T gazdag szakaszát plusz a Sma promoterét (pRH282).
a)pRH281/5
A következő oligonukleotidokat állítjuk elő az Applied Biosystems 381A típusú DNS-szintetizátorral:
* r ; 1' »
5‘ ‘ X XT ; XX.· XJXFXXX' X · w. x:xo ’
• Γ·,- í, í
XX 1’
X í' - '5* x :x-j: 'xxv,·a>. x xrxxxuxrx
TryX ' r -xa:gv”'.; x:?.;va:-aaaXíxx ‘'-x λχ
A Trp-2-Trp-5 oligonukleotidok 100 mM mennyiségeit külön-külön foszforiláljuk 10 μΐ-ben. A Trp-1 és Trp-2, a Trp-3 és-4, valamint a Trp-5 és -6 hibridizálásáa felfőzéssel és lassú lehűtéssel történik. Az oligonukleotid-párok oldatait egyesítjük és T4-DNS-ligáz hozzá- 25 adásával ligáljuk, 3 pg pAT153-at EcoRI-el és Clal-el duplán hasítunk. A nagy fragmentumok tisztítása után ezekhez körülbelül 20 pmol oligonukleotidot adunk és ligáljuk. Végül HB101 E.coli sejteket transzformálunk, majd néhány keletkező telepből izoláljuk a plazmidokat. A promotert tartalmazó Pst-HindlII fragmentumot szekvenáljuk. A kívánt szekvencia bizonyítása után kiválasztottunk egy plazmidot és pHR281/5-nek neveztük el.
A promoter rész szekvenciája a következő:
xx?;x x: xxxaa w
-•-'.Γ. u.;aaaaaía to..-.?: j*
.'A- :·
A.‘ ** >» *· * .
W:·
XJ.A- < ' r XX X sj,., : ‘ - a'.::-aa:?·?
Az új expressziós vektor előnyei a következők:
1. optimális -35 régió a trp-Sma promoterben;
2. a ribozomális kötőhely [RBS = riobosomal Bindung Stelle) előtti egyetlen Xhol-hely lehetővé teszi az RBS kicserélését egy másikra; I
3. az expressziós plazmid az RBS-től 5 nukleotid távolságra egy ATG transzlációs startkodont tartalmaz;
4. az ATG G-je az első bázisa az Sstl-felismerő szekvenciának [CAGCTC]. Sstl-el hasítva és végül egy tóm- 1 pa vég képzésével rendelkezésünkre áll egy olyan expressziós vektor, amely ATG transzlációs startkodont
- a s ·* ~ . ‘ ‘ X »
Λ S ' A tartalmaz és amelyhez egy, a leolvasási keret első bázisával kezdődő idegen gén hozzákapcsolható;
5. az RBS-ATG nem tartalmaz G-t vagy C-t;
6. az 5'-végen lévő oligonukleotid-szekvencia megválasztásával az eredeti EcoRI hatási helyet elbontottuk. Ezáltal a promoter 3’-végén kialakíthatóvá válik Sstlból, EcoRI-ből, Clal-ból és HindlII-ból [a pAT 15 3-ban már meglévő] álló multiklónozó hely.
b) pRH282/5
Azonos módon építjük fel a pRH282/5 expressziós vektort. A Trp-1 és Trp-2 oligonukleotidokat Trp-7 és Trp-8 oligonukleotidokkal helyettesítjük:
Trp-»: a xxxu λ.ία.ειχ xaua? ;χχχ ί
HU 213 566 Β
A pRH282/5-ben a promoter rész szekvenciája a következő:
cgctaaaa’~at7 37x.vaaaűa^33“?7a7*773cc77:: '.aa? a, : 37GA77*77’A 4 7 A : r 7 77 C7CCCAA 3' V.73GAA37?· 7 ” : 7«
MeX
-10 1 Trer.ekrtptíoanatar’ K3£
7AACTAGTACACAA3T7CAC-zGCTCGAGACG-37AAaGA3G77T4A“A~3A A77GATCA7G7 37 '7AAGTGCC3AŰC7C7G<CA7TCC7CCAAa77A7A 37
SstI T?.'6’ *’
0CTCGAA77CA7CGA7-31
OŰAGCTTAAG7AGC7A-6*
c) pGNl mg pUC18-at BamHI-el és Sall-el duplán elhasí- 20 tünk. 10 mg EqG-QAAl-böl ugyancsak BamHI-SalI-vel való kettős hajtással izoláljuk a szintetikus ló-gamma-interferon gén második felét, majd defoszforiláljuk. Körülbelül 20 ng vektort 100 ng inszertummal ligálunk és a
DNS-el JM101 E.coli sejteket transzformálunk. Egy telep plazmidját restrikciós enzimes emésztéssel megvizsgálunk és azt pGNl-nek jelöljük.
d) PGN3
A szintetikus gén első felét a riboszomális kötőhellyel együtt az alábbi oligonukleotidokból állítjuk össze:
£gö-i s’ -A.,777.%.; . ÍAGAGG’. 3A3377a771 A?7 » 17/ ' * v
AAA773AA,A*7C7 3Aaa7»AA7A77T :AA7Jl7 Z *«./ ·. >
5' 0ACGC70X77737TG777C7O3A7A7 ;'7 JAAAé * κ M75A7AAÁAA3A7CA7CCAJTC77A3-3'
Κςί-3: 5 ’ - A7CGT7?C777C7A7T?2AáAC737T?GAAAa7773Αλ?3a. b- :
7A7CCAGAAA7CGA73GACAC7AT7A*A3AA3A'7’i 7“ ’ · - . / '
7CAAC7CG7CQA77CCG-3’
W>”4< 6* -AA77CG3AG7CGAC3AG7TGAAaAA777AA3G.AA7A?-A7^7 , ’ s O7G7CCA7CŰAT7TC7a-3A?AA?C77É077-J7:7”:A5377r -. ‘ ·
7773AAG7AGAAA3AAAC5ATC70A3AC73- 3 ‘
XqG-fi; 6' -GA73A7C777tTGTCAgAG7C77C:77CCA37777TCAÍÍA“Z, ? . -a
ACA3CGGACCACCQTCÁCCAA7370-3
2«0-e. 5’-7GGG77a:GA3CG773AAG7A7:CT77CAJ‘47;::2CA'” 7? -Hí-.í
AA3CA3CC73:A’AAA7'*'A'C*7AAC7777C3A>3'kA - 3
50-50 pmol oligonukleotidot foszforilálunk, mégpedig az EqG-2-t EqG-5-el együtt 7 μΐ-ben, az EqG3-at és EqG8-ast külön 8 μΐ-ekben. A kináz-reakciót 100 °C-ra való melegítéssel állítjuk le. Az EqG-3-hoz 50 pmol EqG-4-et (1 pl) és az EqG-8-hoz 50 pmol EqG-1 -et (1 pl) adunk. Az 45 oldatokat még egyszer felmelegítjük 100 °C-ra és lassan lehűtjük. Egyesítjük az oligonukleotid-párokat tartalmazó oldatokat és T4-DNS-ligázzal összesen 30 μΐ-ben ligáljuk, majd 2 pg pUCl 8-at EcoRI-el és HindlII-al kettősen hasítunk, a vektor részt gélben tisztítjuk és 50 μΐ vízben oldjuk. 50 40 ng vektort és körülbelül 2 pmol ligáit oligonukleotidot 10 μΐ-ben ligálunk és a DNS-el végül JM101 E.coli sejteket transzformálunk. Néhány kapott plazmid EcoRI-HindlII inszertumát M13mp9-ben átklónozzuk és a szekvenciát megállapítjuk. Kiválasztottuk a kívánt szekvenciájú plazmidot és pGN3-al jelöltük.
e) pGN20
Körülbelül 3 pg pGNl-et, ill. pGN3-at HindlII-al és Sall-el kettősen elhasítunk. A pGN3 inszertumát és a pGN 1 -bői való, az Eq-gamma-interferon gén második 60 felét tartalmazó vektort gélben tisztítjuk. 0,2 pg pGN3at körülbelül 0,05 pg pGN3-inszertummal ligálunk és a DNS-el JM101 E.coli sejteket transzformálunk. Az egyik kapott klón plazmidját a restrikciós minták vizsgálata után kiválasztottuk és pGN20-al jelöltük.
f) pEqG-QAA2, ill. pEqG-QAA3 Körülbelül 10 mg pGN20-ból izoláljuk az Xhol-EcoRI inszertumot, amely együtt tartalmazza a szintetikus ló-gamma-interferon gént és az E.coli enterotoxin II riboszomális kötőhelyét [Lee, C. és mtsai: Infect. Immun. 42, 264 268 (1983), Moseley, S. és mtsai: Infect. Immun. 39, 1167-1174 (1983)]. A pRH281/5, ill. a pRH282/5 vektort Xhol-el és EcoRI-vel kettősen hasítjuk. 20 ng vektort 20 ng inszertummal ligálunk és a DNS-el HB101 E.coli sejteket 55 transzformálunk. Kiválasztunk néhány telepet, a plazmidokat izoláljuk és restrikciós analízissel megvizsgáljuk. Egy-egy plazmidot kiválasztottunk és pEqG-QAA2-vel (vektor: pRH282/5) ill. pEqG-QAA3-al (vektor: pRH282/5) jelöljük.
g) Gamma-interferon vizsgálat a lizátumokban A HB101 /pEqG-QAA2, illetve a HB101 /pEqG-QAA3
HU 213 566 Β
E.coli sejteket egy éjjelen át tenyésztjük, majd a tenyészeteket ampicillin tartalmú LB tápoldattal 1:100 arányban hígítjuk. Az LB tápoldat összetétele: 10 g/1 Trypton, g/1 élesztőkivonat, 5 g/1 NaCl, 50 mg/1 ampicillin. A hígítás után a tenyészetet tovább inkubáljuk 37 °C-on. Elérve a 0,3 optikai sűrűséget (600 nm), 50 mg/1 indolakrilsavat adunk a tenyészethez és további két órán át inkubáljuk 37 °C-on. A baktériumokat lecentrifugáljuk és ultrahanggal feltáquk. A felülúszót sterilre szüljük és NBL-6 sejteket [ATCC CCL 57] teszteljük gammainterferon aktivitásra, vírusként vesicularis stomatitis vírust [VSV] alkalmazva. Mindkét transzformált baktériumtenyészet lizátuma [HB101/pEqG-QAA2, ill. HB101/pEqG-QAA3 E.coli] 0,11 millió egység/ml interferon aktivitást mutatott. Kontrollként egy azonos módon előállított HB101/pRH281; E.coli lizátum szolgált.
A kontroll-lizátum kevesebb, mint 100 egység/ml aktivitást mutatott.

Claims (8)

1. Eljárás a ló-gamma-interferon biológiai tulajdonságaival rendelkező, kívánt esetben glükozilációtól mentes polipeptidet kódoló DNS-molekula vagy ezzel legalább 95%-ban homológ deletált vagy szubsztituált DNS 25 szekvencia vagy fragmetnumai előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) ló szövetéből, előnyösen máj szövetéből nagy molekulájú DNS-t izolálunk, ezt endonuklezáokkal statisztikusan fragmentáljuk, a fragmentumokat alkalmas vekto- 30 rokban, előnyösen egy lambda vektorban klónozva ló-DNS-génkönyvtárat hozunk létre, amelyet HuIFN-γ (humán gamma-interferon gén)-próbával nem szigorú körülmények között végzett hibridizációval szűrünk, a pozitív
R1 TAC TGC kiónokból ismert módszerekkel nyert és tisztított DNS-t HuIFN-γ próbával szigorú körülmények között szűrve a nem-kódoló 5' - és 3'-szakaszokkal is nagy homológiát mutató DNS-t izoláljuk és szekvenáljuk; vagy 5 b) a ló-gamma-interferon érett formájának aminosavszekvenciája vagy az EqIFN-γ gének az érett ló gammainterferont kódoló megfelelő DNS-szakaszai alapján ismert kémiai és kívánt esetben biológiai módszerekkel kívánt esetben a degenerált kódnak megfelelő kodonokat 10 tartalmazó és/vagy deletált és/vagy szubsztituált, kívánt esetben részlegesen vagy teljes egészében kettős szálú oligonukleotido(ka)t szintetizálunk.
2. Az 1 ,b) igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egy 15
X Gin Alá Alá Phe Phe Lys Glu Ile GlU Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Alá Arg Asn Pro ASp val 61y Asp Gly Gly Pro Leu Phe Leu Asp He Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys Lys Ile He Gin Ser Gin Ile Vél Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn leu Lys Asp Asn Gin val 11 e Gin Lys Ser Met *sp Thr Ile Lys Glu Ásp Leu Phe vei Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Lys Leu Glu Asp Phe Gl n Lys Leu He Gl n 11 e Pro- val Asrr Asp Leu Lys Val Gin Arg Lys Alá Ile Ser Glu Leu lié Lys val Met Asn Asp teu Ser Pro Lys Alá Asn L eu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Alá Leu Gl n
aminosavszekvenciájú polipeptidet amelyben
X jelentése hidrogénatom, vezető-Tyr-Tyr-Cys-, vezetőMet-Tyr-Tyr-Cys- vagy Η-Tyr-Tyr-Cys- szekvencia vagy Met— kódoló oligonukleotidot szintetizálunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy egy
CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA
---------1 N T R Ο N 1--------ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA
HU 213 566 Β
TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG
CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG
GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT
TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG
TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT
TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT
TGAAAAGAAAÁTCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT
TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA
AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC
---------------------I N T R Ο N 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT
TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG
GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
-----------1 N T R Ο N 3------------------------------CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTTCTATŐATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCC1VAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG
HU 213 566 Β
GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT
GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCT7CTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC
AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG gcctggatctaaatgggcttgaatgagaaggggagggtgttgttatgactatgtttagaa
GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA
CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT
TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA
ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA
GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA
TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CT(
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG
CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
TAG vagy
R2 GCC GCG TTT TTT AAA GAA -----1 N T R Ο N 1--------ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC gctgtcctgaaaGgtttggctgaaaaaaaatcactttcaggtgttttcctccaaaaaatg ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTIATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG
HU 213 566 Β
GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT
TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG
TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT
TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT
TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT
TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA
AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC _____________________I N T R Ο N 2TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT
TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG
GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT
-----------1 N T R Ο N 3------------------------------CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCÁGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG
HU 213 566 Β
GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA
GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA
CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT
TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA
ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA
GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA
TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC
AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC
ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA
AAA TAG szekvenciájú DNS-t - Árjelentése amelyben ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC R1 jelentése TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC 30 TTG GGT TCT TCT ACC CAG,
TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT ATG CAG vagy
TTG GGT TCT TCT ACC TAT, CAG szekvencia; és
ATG TAT vagy amely kívánt esetben egy vagy több triplett helyett
TAT szekvencia; ugyanazon aminosavat kódoló degenerált triplettet tar35 talmaz - izolálunk részlegesen vagy telj esen kettős szálú formában; vagy egy
R ' TAC T6C CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC TTG AA6 AAC T6G AAA GAG GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CC6 6TA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG
HU 213 566 Β
r GCC GCG TTT TTT AAA GAA ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC TTG AA6 AAC T6G AAA GAG GAT A6T GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC 6TC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CA6 GTC ATT CAA AAG AGC ATG 6AC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG
vagy
R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG 'ttc GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA R 2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TG6 AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA
HU 213 566 Β szekvenciájú oligonükleotidot amelyben
R'jelentése
ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT,
ATG TAT vagy
TAT szekvencia;
R2 jelentése
ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG,
ATG CAG vagy
CAG szekvencia; és amely adott esetben egy vagy több triplett helyett ugyanazon aminosavat kódoló, a degenerált kódnak megfelelő triplettet tartalmaz szintetizálunk.
4. Az 1 .b) igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az EG-1, EG-2, EG-3, EG-4, EG-5, EG-6, EG-7, EG-8, EG-9, EG-10, EG-11, EG-12, EG-13, EG-14, EG-15 vagy EG-16 képletű oligonukleotidokat vagy ezek közül legalább kettőnek összekapcsolódásval kapott oligonukleotidokat állítunk elő, amelyekben egy vagy több triplettet ugyanazon aminosavat kódoló másik kodon helyettesíthet.
5. Eljárás a ló-gamma-interferon biológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1—4. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-molekulát egy megfelelő szabályzó szakaszokat tartalmazó plazmidba inszertálunk.
6. Eljárás a ló-gamma-interferon biológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptid termelésére képes transzformáit gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas eukarióta vagy prokarióta sejtet, előnyösen E.coli-t, különösen előnyösen E.coli JM101-et vagy E.coli HBlOl-et, vagy egy emlős sejtvonalból, előnyösen lóból származó sejtet egy 5. igénypont szerint előállított expressziós vektorral transzformálunk, és a kívánt polipeptidet termelő transzformánsokat szelektáljuk.
7. Eljárás a ló-gamma-interferon biológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 6. igénypont szerint előállított transzformáit sejtet táptalajban tenyésztünk, és a termelt polipeptidet a tenyészetből izoláljuk.
8. Eljárás hatóanyagként a ló-gamma-interferon biológiai tulajdonságaival rendelkező polipeptidet tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállított hatóanyagot a gyógyszertechnológiában szokásosan használt hordozó, hígító és/vagy egyéb segédanyagokkal kombináljuk, és ismert módszerrel gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
HU875549A 1986-12-10 1987-12-09 Process for producing equine interferon-gamma HU213566B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863642096 DE3642096A1 (de) 1986-12-10 1986-12-10 Pferde-(gamma)-interferon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46066A HUT46066A (en) 1988-09-28
HU213566B true HU213566B (en) 1997-08-28

Family

ID=6315829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU875549A HU213566B (en) 1986-12-10 1987-12-09 Process for producing equine interferon-gamma

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5602010A (hu)
EP (1) EP0271824B1 (hu)
JP (3) JPS63233794A (hu)
KR (1) KR880007568A (hu)
AT (1) ATE91722T1 (hu)
AU (1) AU616873B2 (hu)
CA (1) CA1339776C (hu)
DE (2) DE3642096A1 (hu)
DK (1) DK170054B1 (hu)
ES (1) ES2058094T3 (hu)
FI (1) FI99116C (hu)
HU (1) HU213566B (hu)
IE (1) IE60404B1 (hu)
IL (1) IL84780A (hu)
NO (1) NO180239C (hu)
NZ (1) NZ222856A (hu)
PH (1) PH30889A (hu)
PT (1) PT86332B (hu)
SU (1) SU1701114A3 (hu)
ZA (1) ZA879245B (hu)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR860001471B1 (ko) 1980-04-03 1986-09-26 비오겐 엔. 브이 인체의 섬유아세포 인터페론(IFN-β)폴리펩티드의 제조방법
US5272263A (en) 1989-04-28 1993-12-21 Biogen, Inc. DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS)
US6307025B1 (en) 1989-04-28 2001-10-23 Biogen, Inc. VCAM fusion proteins and DNA coding therefor
US7049102B1 (en) 1989-09-22 2006-05-23 Board Of Trustees Of Leland Stanford University Multi-gene expression profile
GB2291645A (en) * 1994-07-21 1996-01-31 Q One Biotech Ltd Equine gamma-interferon
GB9414752D0 (en) * 1994-07-21 1994-09-07 Q One Biotech Ltd Feline gamma-interferon
AU2587002A (en) * 2000-11-03 2002-05-15 Biomedicines Inc Method for short-term and long-term drug dosimetry
US20030143197A1 (en) * 2001-11-09 2003-07-31 Moran S. Mark Method for treating diseases with omega interferon
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
MX2008014870A (es) 2006-05-30 2009-02-12 Intarcia Therapeutics Inc Modulador de flujo para sistema de suministro osmotico con canal interno de dos piezas.
DK2359808T3 (da) 2006-08-09 2013-08-05 Intarcia Therapeutics Inc Osmotiske leveringssystemer og stempelaggregater
EP2157967B1 (en) 2007-04-23 2013-01-16 Intarcia Therapeutics, Inc Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof
WO2009102467A2 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
LT2462246T (lt) 2009-09-28 2017-11-27 Intarcia Therapeutics, Inc Esminio stacionaraus vaisto tiekimo greitas įgyvendinimas ir (arba) nutraukimas
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
US10925639B2 (en) 2015-06-03 2021-02-23 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement and removal systems
EP3733694A1 (en) 2016-05-16 2020-11-04 Intarcia Therapeutics, Inc Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
CN110225762A (zh) 2017-01-03 2019-09-10 因塔西亚制药公司 包括glp-1受体激动剂的连续施用和药物的共同施用的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE88622C (hu) *
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
ZA831094B (en) * 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
DE3247922A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten
JPS60118196A (ja) * 1983-11-30 1985-06-25 Takeda Chem Ind Ltd インタ−フェロンの製造法
US4666865A (en) * 1984-01-13 1987-05-19 Centocor, Inc. Immunoassay for biologically active human interferon-gamma employing unique monoclonal antibodies
DE3414831A1 (de) * 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
FI90990C (fi) * 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4689224A (en) * 1985-10-07 1987-08-25 Neogen Corporation Method for administering vaccines containing equine leukokines and compositions therefor
DE3607835A1 (de) * 1986-03-10 1987-09-24 Boehringer Ingelheim Int Hybridinterferone, deren verwendung als arzneimittel und als zwischenprodukte zur herstellung von antikoerpern und deren verwendung sowie verfahren zu ihrer herstellung
CA1340698C (en) * 1986-07-25 1999-08-10 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kaguku Kenkyujo Preparation and uses of interferon-gamma
US4908432A (en) * 1987-01-09 1990-03-13 New York University Novel polypeptide having gamma-interferon activity

Also Published As

Publication number Publication date
FI875427A0 (fi) 1987-12-10
KR880007568A (ko) 1988-08-27
JPH07258294A (ja) 1995-10-09
FI99116C (fi) 1997-10-10
CA1339776C (en) 1998-03-24
AU616873B2 (en) 1991-11-14
AU8223387A (en) 1988-06-30
ZA879245B (en) 1989-08-30
FI875427A (fi) 1988-06-11
EP0271824A3 (en) 1989-05-24
EP0271824B1 (de) 1993-07-21
DK170054B1 (da) 1995-05-08
ATE91722T1 (de) 1993-08-15
IL84780A0 (en) 1988-05-31
ES2058094T3 (es) 1994-11-01
SU1701114A3 (ru) 1991-12-23
DE3786649D1 (de) 1993-08-26
PT86332B (pt) 1990-11-07
PH30889A (en) 1997-12-23
NZ222856A (en) 1991-11-26
HUT46066A (en) 1988-09-28
IL84780A (en) 1992-11-15
PT86332A (de) 1988-01-01
IE60404B1 (en) 1994-07-13
NO180239B (no) 1996-12-02
NO875136D0 (no) 1987-12-09
DE3642096A1 (de) 1988-06-16
NO875136L (no) 1988-06-13
EP0271824A2 (de) 1988-06-22
JPS63233794A (ja) 1988-09-29
DK645887A (da) 1988-06-11
IE873342L (en) 1988-06-10
US5602010A (en) 1997-02-11
DK645887D0 (da) 1987-12-09
FI99116B (fi) 1997-06-30
JPH07250690A (ja) 1995-10-03
NO180239C (no) 1997-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU213566B (en) Process for producing equine interferon-gamma
AU600702B2 (en) Hybrid interferons
KR920010225B1 (ko) 인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 dna의 제법
HU212836B (en) Method for producing canine and equine interferons
HU193507B (en) Process for producing interferen-like pelypeptides
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
HU193512B (en) Process for preparing hybride interferones from human erythrocytes
AU606585B2 (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor-like polypeptides and processes for producing them in high yields in microbial cells
CA1340184C (en) Cloning and characterizing omega-interferon and related genes
HU204303B (en) Process for producing bifunction proteines
IL76699A (en) Recombinant human tumor necrosis factor, its production and pharmaceutical compositions containing it
HUT54411A (en) Process for producing mutants of human interleukine-3
CA2194228C (en) Fusion proteins comprising gm-csf and antigens and their expression in yeast
HU202920B (en) Process for producing homogenous recombinant immun interferon fragments and pharmaceutical compositions containing them
JP2008507297A (ja) 最適化されたインターフェロンβ遺伝子
EP0328061A2 (en) Human colony-stimulating factors
TW420688B (en) Mpl ligand analogs
JP2675294B2 (ja) ヒト腫瘍壊死因子
WO2002081519A9 (fr) Nouvelle proteine hybride ifn-thy, preparation et utilisation
HU214698B (hu) Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására
JPH04182498A (ja) ポリペプチド
KR950008091B1 (ko) 하이브리드 인터페론 및 그의 제조방법
KR890001828B1 (ko) 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법
CA1324093C (en) Recombinant ricin a fragment and ricin toxin
JPS6012983A (ja) 環状プラスミド

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee