HU204693B - Process for producing stable liposome compositions with histidine and histidine-containing dipeptides - Google Patents

Abstract

Shelf life of microcapsules, liposomes prepd. from natural lipides is greatly increased by organism-compatible anti-oxidant systems. Constituents of these systemsa comprise water and/or lipid soluble cpds. with antioxidant characteristics e.g. histidine or histidine contg. di:peptides, their salts and/or alpha-tocopherol. This antioxidant system has a wide field of application

Description

A találmány tárgya hisztidinnel és hisztidin tartalmú dípeptidekkel és/vagy sóikkal stabilizált megnövelt élettartamú és tárolási idejű liposzóma készítmények előállítása.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the preparation of liposome formulations with increased lifetime and shelf life stabilized with histidine and histidine-containing peptides and / or salts.

A találmány tárgyát képező antíoxidáns rendszert 5 tartalmazó mikrokapszulák bármelyik Iiposzőma formuláző módszerrel készülhetnek.Microcapsules containing the antioxidant system 5 of the present invention may be prepared by any liposome formulation method.

A vizes fázis, tehát a liposzóma membránon belül elhelyezkedő oldat, általában izotonizált pufferoldat tartalmazza a vízoldékony antíoxrdánsokat és a bezá- 10 randő hatóanyagot amennyiben az nemlipidóldékony.The aqueous phase, that is, the solution within the liposome membrane, usually an isotonic buffer solution, contains the water-soluble antioxidants and the active ingredient if it is non-lipid soluble.

A szabadalom tárgyát képező antroxidáns rendszer széles körben alkalmazható. Jelen esetben az alkalmazási lehetőségek közül a hemoglobin tartalmú liposzőma, a hemoszőma készítés, stabilitás vizsgálat és táró- 15 lás során nyert eredményeket mutatjuk be. Választásunk oka volt, hogy a hemoszőma olyan rendszer, ahol a membránt alkotó lipidek és a bezárt hemoglobin közötti láncreakció az oxidatív folyamatok jellemző példája. A mesterséges vörösvérsejt előállításának 20 egyik alapproblémája az optimális antroxidáns rendszer kifejlesztése, a telítetlen zsírsavakat is tartalmazó liprdekből készített liposzőmákban a funkcíóképes hemoglobin élettartamának megnövelése.The patented anthraxidant system is widely applicable. Among the applications in this case are the results obtained from the hemoglobin-containing liposome, hemosome preparation, stability assay and storage. The reason for our choice was that the hemosome is a system where the chain reaction between lipid-forming lipids and trapped hemoglobin is a typical example of oxidative processes. One of the basic problems in the production of artificial red blood cells is the development of an optimal anthroxidant system to increase the lifetime of functional hemoglobin in liposomes made from lipids containing LFA.

-A hemoszőma (irodalomban található elnevezések 25 még: mesterséges vörösvérsejt, liposzőmába zárt vagy kapszulázott hemoglobin, neohemocyta) Iipid membránnal többszörösen vagy egyszeresen köibezárt, mikrokapszulázott lipidmentes hemolizátum, amelynek fizikai tulajdonságait a Iipid membránt alkotó molekulák 30 összetételének aránya és állapota határozzameg.-The micro-encapsulated lipid-free hemolysate, which is physically encapsulated in the lipid membrane, is a micro-encapsulated lipid-containing hemolysate, which is physically encapsulated in lipid membrane.

A hemoszőma kapszulák méretük szerint plasztikus tulajdonságuk révén képesek a keringés zavartalan fenntartására, hemoglobin tartalmuk révén pedig az oxigénellátás biztosítására. 35Hemosomal capsules, by their size, are able to maintain circulatory function by their plastic properties, and by their hemoglobin content they provide oxygenation. 35

A hisztidin és a hisztidin tartalmú dipeptidek, mint fiziológiás antioxidánsok, különböző mennyiségben találhatók gerincesekben attól függően, hogy a törzsfejlődés milyen szintjén állnak. Az alacsonyabb rendű gerincesekben főként hisztidint, emlősökben főként 40 kamozint (β-alanil-L-hisztidin) találunk. A vegyületek fnnkciójaközel azonos.Histidine and histidine-containing dipeptides, as physiological antioxidants, are present in varying amounts in vertebrates depending on the level of strain development. Inferior vertebrates are predominantly histidine, and in mammals predominantly 40 cytosine (β-alanyl-L-histidine). The function of the compounds is nearly the same.

Akamozin, ahomokamozin (τ-aminobutiril-L-hisztidin) és az anszerin (p-alanil-3-metil-L-hisztidin) magas koncentrációban található az agyban és a vázizom- 45 zatban, endogén antioxidánsok. Gyökfogó képességük mellett, amely a hisztidin rész imidazol gyűrűjének köszönhető, jelentős pufferkapacitással is rendelkeznek, amely hosszú távon biztosítja a készítmények fiziológiás 7,4-es pH-ját Kamozin 2-20 μΜ mennyiség- 50 ben található a vázizomzatban, 0,3-5,0 mM-ig az olfaktoriális ephiteliumban és a bulbusokban, és az agy egyéb részeiben. Homokamozin a cerebrospinális folyadékban (2-50 mM) található. Az anszerin szintén a központi idegrendszerben van jelen, hasonló koncent- 55 rációban.Acamozin, ahomocamosine (τ-aminobutyryl-L-histidine) and anerazine (p-alanyl-3-methyl-L-histidine) are high concentrations in the brain and skeletal muscle, endogenous antioxidants. In addition to their radical scavenging properties, which are due to the imidazole ring of the histidine moiety, they also have a significant buffering capacity which, over the long term, maintains the physiological pH of the formulations 7.4 Up to 0 mM in the olfactorial ephithelium and in the bulbs and other parts of the brain. Homocamozin is found in cerebrospinal fluid (2-50 mM). Ancerin is also present in the central nervous system at similar concentrations.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a hisztidin és hisztidin tartalmú dipeptidek (kamozin, homokamozin, anszerin) és sóik képesek oxidatív folyamatokat (pl. a hemoglobin természetes denaturáciőját, a memb- 60 i iánlipidek és a bezárt hatóanyag nemkívánatos ilyen irányú kölcsönhatását) gátolni. Liposzőmákban és emulziókban gátolják a lipidek peroxidatív bomlását, továbbá a hemoszómákban a hemoglobin és a politelítetlen lipidek között létrejövő láncreakció kialakulását is.The present invention is based on the discovery that histidine and histidine-containing dipeptides (kamosin, homocamozin, anerrin) and their salts are capable of oxidative processes (e.g., natural denaturation of hemoglobin, undesired interaction of membrane lipids and trapped active ingredient). . They also inhibit the peroxidative degradation of lipids in liposomes and emulsions, as well as the chain reaction between hemoglobin and polyunsaturated lipids in hemosomes.

Célkitűzésünk volt tennészetes forrásból származó (Iipid) mikrokapszulák, liposzőmák és hemoszőmák antíoxidáns rendszerének kifejlesztése, amely lehetővé I teszi a készítmények hosszú ideig tartő tárolását összetevői ismert fiziológiás hatásúak, nem testidegenek, könnyen hozzáférhetők és a lehetőségekhez mérten olcsók.Our goal was to develop an antioxidant system of microcapsules, liposomes and hemosomes from natural sources (lipid), which enables the ingredients to be stored for a long period of time with known physiological effects, non-foreign bodies, readily available and inexpensive.

A szakirodalomból ismert liposzóma (hemoszőma) ‘ készítményekkel szemben a jelen találmányban bemutatott liposzóma készítmények haladó jellegét biztosítja és egyben előnyük, hogy a stabilizáló antíoxidáns - gyökfogő vegyületeket korábban ilyen célra nem használták, azok az emberi szervezetben magas koncentrációban vannak jelen, általánosan alkalmazhatók liposzőmákban. Liposzőmák stabilizálását ismertetik az alábbi szakirodalmak: Biochem. Biophys. Acta 1984 79S (1) 60-67; Biooig. Khim. 1985 11 (10) 1385-1390 és Bitamin 198256(12) 641-652.Compared to prior art liposome (haemosome) formulations, the liposome formulations of the present invention provide an advanced character and also have the advantage that the stabilizing antioxidant-radicaling compounds have not been used for this purpose before, they are present in high concentrations in the human body and generally used in liposomes. Stabilization of liposomes is described in Biochem. Biophys. Acta 1984 79S (1) 60-67; Blood. Khim. 1985 11 (10) 1385-1390 and Bitamin 198256 (12) 641-652.

Az általunk alkalmazott antioxidánsok a liposzóma készítmények stabilitását és eltarthatósági idejét jelentősen megnövelték. Amennyiben a készítmény antíoxidáns koncentrációja 8 mM, (ez a kísérletek alapján az ideális érték) kamozin esetében a megfigyelhető hemoglobin bomlás 6 hét 4 fokon történő tárolás után 5%. Ez az adat hasonló mint a 85109 515.8. sz. európai szabadalomban jelzett érték, amely szabadalom csak hemoglobin tartalmú liposzőmák stabilitására vonatkozik. Ezt a stabilitást más jellegű, Iipid oldékony vegyületekkel érték el.The antioxidants we use significantly increased the stability and shelf life of liposome formulations. At an antioxidant concentration of 8 mM, (which is the ideal value for experiments), the observed hemoglobin degradation for camosin is 5% after storage for 6 weeks at 4 ° C. This data is similar to 85109 515.8. s. European patent, which relates only to the stability of hemoglobin-containing liposomes. This stability was achieved with other lipid soluble compounds of other types.

Hemoszőmában, testhőmérsékleten 4 órán át tartó inkubálás alatt, vízoldékony gyökképző vegyület mellett (AAPH) a kamozin és rokon vegyületei jobban gátolták a káros folyamatokat, mint a butíl-hidroxi-toluol (BHT). A BHT hatása 95%-a volt a kamozinénak. Puffertartalmú liposzóma készítményekben akamozin és rokonvegyületeinek hatása BHT-hoz viszonyítva 75%-os volt hasonló körülmények között. Összehasonlítva az eddig ismertetett korábbi rendelkezésünkre álló adatokkal, eredményeink feltétlenül előrelépést jelentenek. A szabadalomban említett antioxidánsok maximális koncentrációja a készítményekben a 20 mM értéket ne haladja meg, mert ez a maximális fiziológiás koncentrációjuk. További előnye az ismertetett vegyületeknek, hogy 20-30%-kal megnövelik a liposzőmába zárható hatóanyag mennyiségét amennyiben az nagymolekulájú fehérje.During incubation in hemosomes for 4 hours at body temperature with water-soluble radical-forming compound (AAPH), the cytosine and related compounds inhibited the adverse processes better than butylhydroxytoluene (BHT). The effect of BHT was 95% of that of cytosine. In buffer-containing liposome formulations, the effect of acamozine and related compounds was 75% relative to BHT under similar conditions. Compared to the previous data available so far, our results are definitely an improvement. The maximum concentration of the antioxidants mentioned in the patent should not exceed 20 mM, since this is their maximum physiological concentration. A further advantage of the disclosed compounds is that they increase the amount of liposome-lockable active ingredient by 20-30% when it is a high molecular weight protein.

A következő példákban a javasolt antioxidánsokkal készítendő liposzőmák előállítására mutatunk be néhány receptúrát. A lipidösszetétel minden esetben tömegarányt jelent milligrammban.The following examples illustrate some formulations for the preparation of liposomes with the proposed antioxidants. In each case, the lipid composition represents the weight ratio in milligrams.

1. példaExample 1

Foszfatídilkolin (tojáslecitin):koleszterin:dicetílfoszfát / 80:20:10 elegyét 5 ml klorofomrmetanol =Phosphatidylcholine (egg lecithin): cholesterol: dicetylphosphate / 80:20:10 in 5 ml chloroform / methanol =

HU 204 693 BHU 204 693 B

2:1 térfogatarányú keverékében oldjuk, majd csiszolatos gömblombikba öntjük. Lipidoldékony hatóanyag esetén (pl. ciklosporin) a bezárandó anyagot a membránkomponensekkel együtt méljük be. Büchi Rotavapor készülékben 30 °C-on, a lombik állandó forgatása mellett vákuumban filmet készítünk, majd tökéletesen oldószermentesítjük. Rámérünk 20 mg kamozint, vagy valamely rokon vegyületét, tehát anszerint, homokarnozint vagy hisztidint, majd 1,5 ml vizes fázist adunk hozzá, amely a hemoglobin oldat vagy a vízoldékony hatóanyag oldata, izotonizált pufferben. A keverékbe üveggyöngyöt teszünk, majd a lombik forgatásával és rázásával fomtuláljuk a liposzómát A be nem kapszulázott vízoldékony hatóanyagot háromszor ismételt mosással és ultracentrifugálással távolítjuk el. A liposzómák 100 000 g hatására leülepednek, így a felülúszó könnyen leönthető. Az így megtisztított liposzómákban a kamozinkoncentráció 8 mM (kb. 30%-os bezárási hatékonyság). A mosott, ultracentrifugált kapszulákat a felhasználásnak megfelelő izotonizált pufferoldat aliquot részében szuszpendálva tároljuk. Hemoglobin kapszulázásakor az előbbiek szerint mosott hemoszómákat 2 ml nátrium-kloriddal izotonizált foszfátpufferben (pH=7,4) szuszpendáljuk, majd +4, ill. -10 °C-on tároljuk. A hemoglobin bomlását spektroszkópiás módszerrel követjük.Dissolve in 2: 1 (v / v) mixture and pour into a ground-glass flask. In the case of a lipid-soluble drug (e.g. cyclosporin), the substance to be sealed is coated with the membrane components. A film was made in a Büchi Rotavapor at 30 ° C with constant rotation of the flask under vacuum and completely de-solvented. 20 mg of kamosin or a related compound, such as anerine, homocarnosine or histidine, are added and 1.5 ml of the aqueous phase, which is a solution of hemoglobin or the water-soluble active ingredient, in isotonic buffer. A glass bead is added to the mixture and the flask is turned by shaking and shaking the liposome. The non-encapsulated water soluble drug is removed three times by repeated washing and ultracentrifugation. The liposomes settle under 100,000 g so that the supernatant can be easily decanted. The liposomes purified in this way had a concentration of 8 cosmoos (approximately 30% closure efficiency). Washed, ultracentrifuged capsules are stored in an aliquot of a suitable isotonic buffer solution for use. When hemoglobin is encapsulated, the previously washed hemosomes are resuspended in 2 ml of phosphate buffer isotonic with sodium chloride (pH 7.4) and then +4 and +4. Store at -10 ° C. Hemoglobin degradation is monitored by spectroscopy.

2. példaExample 2

Az eljárás másik megvalósítási lehetősége, hogy azAnother embodiment of the process is that

1. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy doxorubicint alkalmazunk hatóanyagkéntExample 1 except that doxorubicin was used as the active ingredient

3. példaExample 3

Az eljárás további megvalósítási lehetősége, hogy azA further embodiment of the process is that

1. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy ciklosporint alkalmazunk hatóanyagkéntExample 1 except that cyclosporin was used as the active ingredient

4. példaExample 4

Az eljárás megvalósítható úgy is, hogy az 1-3. példa szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy az 1. példában megnevezett antioxidánsok, tehát a kamozin, az anszerin, a homokamozin vagy a hisztidin bármilyen arányú keverékét használjuk, ügyelve arra, hogy ne lépjük át a példában megadott 20 mg össztömegetThe process may also be carried out by applying the method of FIGS. Example 1, except that any mixture of the antioxidants named in Example 1, i.e., camosin, ancerin, homocamosine, or histidine, is used in any ratio, taking care not to exceed the total weight of 20 mg in the example.

Claims (6)

1. Eljárás, stabil liposzóma készítmények előállítására önmagában ismert liposzómamembrán-képző anyagok felhasználásával, azzal jellemezve, hogy a készítmény stabilizálószeiként hisztidint vagy hisztidin tartalmú dipeptidet alkalmazunk az egész készítményre vonatkozóan, 5 és 20 mM közötti koncentrációban.CLAIMS 1. A process for the preparation of stable liposome formulations using liposome membrane-forming agents known per se, wherein the stabilizer of the formulation is histidine or a histidine-containing dipeptide at a concentration of between 5 and 20 mM. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást növelő antioxidáns hisztidin vagy sója.2. The method of claim 1, wherein the antioxidant is a histidine or a salt thereof. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást növelő antioxidáns kamozin vagy sója.3. A process according to claim 1, wherein the antioxidant is an antioxidant or a salt thereof. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást növelő antioxidáns homokamozin vagy sója.The process of claim 1, wherein the antioxidant homocamosin or a salt thereof is a stability-enhancing antioxidant. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást növelő antioxidáns anszerin vagy sója.5. The method of claim 1, wherein the antioxidant is an anti-oxidant or a salt thereof. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilitást növelő antioxidáns hatású vegyületek, tehát a kamozin, az anszerin, a homokamozin és a hisztidin keverékét alkalmazzuk.6. A process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that a mixture of compounds having antioxidant activity, i.e., a combination of camosin, ancerin, homocamosine and histidine, is used.