HU202593B - Process for producing new cytotoxins and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új citotoxin előállítására limfoblasztoid sejtvonalak táptalajon való inkubálásával és a termelt citotoxin izolálásával. A találmány oltalmi körébe tartozik az így nyert citotoxint hatóanyagként tartalmazó humán és állatgyógyászat területén alkalmazható gyógyszerkészítmények előállítási eljárása is.

A citotoxinok az immunrendszer sejtjei által termelt fehérjék, de különböző citotoxinokat egyéb más sejtekből is elő lehet állítani. Különböző egyéb hatásuk mellett ezek a fehérjék képesek tenyészetben rákos daganatok elpusztítására és a két legismertebb citotoxin, a tumor nekrózis faktor TNFa és TNFp (amelyet a-limfotoxinnak is neveznek) in vivő is tumorellenes hatást mutat. A TNFa-át és TNFP-t egyaránt kódoló cDNS-eket E. coliban klónozták és kifejezték (Pennica és mtsai, Natúré, 1984,572,724; Gry és mtsai Natúré, 1984,372,721). Egyéb citotoxinokat, így például a természetes pusztító sejt citotoxikus faktort (natural killer cell cytotoxic factor, NKCF) nem jellemezték részletesen (Ortaldo J. R. és mtársai, J. Immunoi., 1986, 737, 2857-2863).

A találmány szerinti citotoxint - a továbbiakban bázikus limfotoxinnak nevezzük (basic lymphotoxin) és bLT-nek rövidítjük - úgy jellemezzük, hogy daganatellenes hatása van. Különösen hatásos számos emlős sejtvonal ellen, beleértve különösen a humán vastagbél adenocarcinoma HT 29 scjtvonalat (ATCC No. HTB 38) és a humán orrsövény, kvázi-diploid tumor RPMI 2650 sejtvonalat (ATCC No. CCL 30).

A találmány szerinti eljárással olyan citotoxint állítunk elő, amelynek látszólagos molekulatömege gélszűréssel meghatározva 47 + 5 kD, látszólagos izoelektromos pontja legalább 7,7 és aminosav-összetétele a következő:

Aminosav	Maradékok száma	Aminosav	Maradékok száma
Asx	36,0 ±4,3	Pro	24,5 ± 2,9
Glx	46,7 ± 5,6	Tyr	12,3 ± 1,5
Ser	41,0 ±4,9	Val	22,7 ± 2,7
Gly	38,4 ± 4,6	Met	8,4 ± 1,0
His	13,6 ± 1,6	Ile	19,6 ±2,4
Arg	19,6 ±2,4	Leu	43,1 ± 5,2
Thr	21,4 ±2,6	Phe	23,8 ± 2,9
Alá	33,2 ±4,0	Lys	26,4 ± 3,2

Natív formájában a bLT-nek feltehetően alacsony molekulatömcgű alegységekből álló kvatemer szerkezete van, de ez még nincs bizonyítva. Az Asx, ill. Glx, Asp és/vagy Asn, ill. Glu és/vagy Gin aminosavakat jelent.

A találmány szerinti eljárásnál a bLT-t lényegében tömény formában nyerjük, lényegében olyan anyagoktól mentes állapotban, amelyek egyébként természetes környezetükben általában jelen vannak. A kapott bLT tisztasága nagyobb, mint 90%, különösen nagyobb mint 95%.

A találmány szerinti eljárással nyert bLT kombináltan több olyan tulajdonsággal rendelkezik, amelyek korábban citotoxinokkal kapcsolatban eddig még nem voltak leírva. A fentiekben említett fizikai-kémiai tulajdonságokon kívül a bLT a következő, a TNFa-tól és/vagy TNFp-tól eltérő biológiai tulajdonságokkal rendelkezik:

i) 75 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után na2 gyobb a citotoxikus aktivitása, mint a rekombináns

INFa-é vagy rekombináns ΤΝΕβ-é;

ii) citotoxikus aktivitását a neuraminidázzal végzett kezelés nem befolyásolja, míg ugyanez a kezelés a természetes TNFP esetében a citotoxikus aktivitás csökkenését jelenti;

iii) patkány L929 sejtek (ATCC No. CCL 1) esetében a citotoxikus aktivitást a limfoblasztoid interferon nem gátolja eltérően a természetes TNFP-tól.

A találmány szerinti eljárásnál a bLT-t úgy állítjuk elő, hogy a limfoblasztoid sejtvonalat táptalajban inkubáljuk, a sejtvonalat indukálószerrel indukáljuk, majd a bLT-t a táptalajból izoláljuk.

A találmány szerinti eljárásnál bármilyen limfoblasztoid sejtvonal felhasználható, de különösen az olyan limfoblasztoid sejtvonal, amely interferon termelésére képes (Strander, H. és mtsai., J. Clin. Microbiol., 1975, 7,116-124 és Christofinis,G.J. és mtársai, J. Gén. Virol, 1981,52,169-171). Az ilyen sejtvonalak könnyen származtathatók Burkitt-féle limfomás betegek sejtjeiből, vagy Epstein-Barr vírus által okozott tumorsejtjeikből. Különösen előnyös származási helye az ilyen sejtvonalaknak egy Namalwa nevű afrikai kislány sejtjei (Klein, G. és mtársai, Int. J. Cancer, 1973,72, 396-408). Az innen származó sejtvonal különösen nagymennyiségű interferont termelt megfelelő stimulálás után (Strander, H. cs mtársai, J. Clin. Microbiol., 1975,7,116-117). Ascjtvonal másodlagos tenyészete Dr. I. Gresser-től (Villejuif, Franciaország) származott 1975 januárjában. Ekkor a sejtvonalat RPMI 1640 táptalajon (Moore, G. E„ J. Amer. Med. Assoc., 1967, 799, 519-524) 10%-os borjúmagzat szérum jelenlétében való tenyésztéshez adaptálták. A laboratóriumunkban a sejteket a fenti táptalajon, 6-8 hónapos borjúkból származó 5-7%-os szérummal kiegészítve tenyésztettük és másodlagos tenyészeteket készítettünk hetente két vagy három alkalommal 18 hónapon át. Ezen sejtek törzsoldatát Namalwa/WRLnek neveztük el és ampullákban folyékony nitrogénben tároltuk. A sejtekről kimutattuk, hogy mycoplazma fertőzéstől mentesek és a mintákat az amerikai törzsgyűjteményben ATCC No. CRL 1432 szám alatt letétbe helyeztük.

A limfoblasztoid sejtvonal inkubálása és a felhasznált táptalaj a szakterületen általában ismert, és előnyösen azonos az interferon előállításánál alkalmazott eljárással. így a sejteket előnyösen szérum-tartalmú táptalajon 37 °C hőmérsékleten addig inkubáljuk, amíg 0,5-10 x 10⁶ sejt/ml koncentrációt érünk el. Ekkor kívánatos lehet, hogy a sejteket például centrifugálással vagy szűréssel kinyerjük és friss táptalajban rcszuszpendáljuk. Ez előnyösen növeli a sejtsűrűséget kisebb mennyiségű táptalaj felhasználásával (ily módon fokozva a bLT-kihozatalt is) és/vagy megkönnyíti a bLT tisztítását kevesebb szérumot vagy szérumot nem tartalmazó táptalaj alkalmazásával. Ipari méretekben ez az utólagos lépés azonban még nincs bizonyítva.

Szérum-tartalmú táptalajként például RPMI 1640 táptalajt alkalmazunk 1—10 tf% borjú vagy ló-szérummal kiegészítve. Egy szérummentes erős RPMI 1640 tápközeget (táptalajt) például a következőkkel egészítünk ki:

mmól glutamin

0,5 tf% tripton

3,5 mg/ml glükóz mg/1 inzulin

HU 202 593 Β

0,14 mg/ml putreszcin mg/ml lecitin, és

2(2 mg/ml nátrium-hidrogén-karbonát

Indukálószerként előnyösen például vírusokat, különösen Sendai vírust alkalmazunk, fokozószerrel, így például karbonsavval vagy karbonsav-sóval együtt. Az adagolt vírus végkoncentrációja előnyösen 5200 HAU/ml, különösen 20-50 HAU/ml (haemagglutináció egység/ml). Erőteljes keverés után a sejttenyészetet 12-48 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk az indukálási folyamat teljes végbemenetele érdekében.

Amennyiben fokozószert is alkalmazunk, azzal a sejteket általában addig kezeljük, amíg a kívánt 0,5-10 x 10⁶ sejt/ml koncentrációt elérjük. Legalábbis laboratóriumi méretekben, kívánatos lehet az alkalmazott fokozószer felesleget az indukálás előtt eltávolítani oly módon, hogy a sejteket kinyerjük, majd a sejteket ismételten a fentiek szerint szuszpendáljuk. Ha szabad karbonsavat alkalmazunk, a tápközegben utólagosan a normál esetben benne levő különböző szervetlen és szerves sókkal, annak sója képződik. Kívánt esetben a karbonsav-sót is, így például nátrium-, kálium- vagy ammónium-sót is alkalmazhatunk.

A sejtvonalak redukálását, különösen fokozószerrcl együttesen végzett inkubálásnál előnyösen például a 4 216 203 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon végezzük.

Az inkubálást és redukálást követően a bLT a tápközegben interferonnal és más egyéb termékkel együtt van jelen. A bLT izolálását a tápközegből előnyösen antilimfoblasztoid interferon antitest immunoaffinitásos oszloppal (a limfoblasztoid interferon eltávolítására) és kromatográfiás oszloppal (az esetlegesen jelenlévő savas izoelektromos pontú citotoxinok eltávolítására) végezzük. Ily módon lényegében tömény bLT-t nyerünk, amely limfoblasztoid interferontól és savas citotoxinok tói mentes.

A limfoblasztoid interferon eltávolítására szolgáló immunoaffinitásos oszlop térhálósított agaróz gélt (Sepharose¹¹, Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsummer Boulevard, Central Milton Keynes, Bucks, Anglia, MK9 3HP) tartalmaz, amelyhez monoklón vagy poliklón anti-limfoblasztoid interferon antitest van kötve. A tápközeget centrifugáljuk vagy szűrjük a sejtek eltávolítására, majd a kapott tiszta fázist adjuk fel az oszlopra. Az oszlopról lejövő bLT-t tartalmazó folyadékot betöményíthetjük és ultracentrifugálhatjuk.

A savas citotoxinok eltávolítását az immunoaffinitásos oszlopról lejövő és adott esetben betöményített folyadék kromatofókuszálásával vagy ioncserés kromatográfiájával végezzük. Mindkét esetben kihasználjuk azt az előnyt, hogy a bLT izoelektromos pontja legalább 7,7 és az esetlegesen jelenlévő savas citotoxinok izoelektromos pontja ennél jóval alacsonyabb. Ez lehetővé teszi az elválasztást az eluens sókoncentrációjának növelésével vagy pH-jának csökkentésével, az ioncserélő típusától függőén. A kromatofókuszálás esetében az oszlop térhálósított agaróz gélt tartalmaz, amelynek tercier- és kvatemer-amin funkciós csoportjai vannak. Ilyen töltet például a Pharmacia Ltd. által gyártott PBE 94 márkanevű termék. Az ioncserélő kromatográfiánál alkalmazott térhálósított agaróz gél funkciós csoportja általában dietil-amino-etil-csoport (anioncserélő) vagy karboxi-metil-csoport (kationcserélő). Ilyen töltetek például a Pharmacia Ltd. DEAE-Speharose CL-6B és CM-Sepharose CL-6B márkanevű termékei.

A bLT és a savas citotoxinok tökéletes elválasztása érdekében előnyösen két ioncserélő oszlopot alkalmazunk. Az egyik, amely dietil-amino-etil funkciós csoportokat tartalmazó térhálósított agaróz gél-töltetű, megköti a savas citotoxinokat és átengedi a bLT-t a második oszlopra, amelynek karboxi-metil-funkciós csoportokat tartalmazó térhálósított agaróz töltete a bLT-t köti meg, de átengedi a savas citotoxinokat.

A bLT-ben gazdag oldatot ezután további tisztításnak vethetjük alá, hogy a legalább 90%-os, különösen legalább 95%-os tisztaságot elérjük. Ezt ismert módon például egy további kromatografáló oszloppal végezzük. Ha a limfoblasztoid sejtek inkubálására alkalmazott tápközeg szérumot tartalmaz, szükséges lehet a bLT-ben gazdag oldatot egy poliklon antiszérumot tartalmazó immunoaffinitásos oszlopon átengedni a szennyező szérum-fehérjék eltávolítására. Más oszlopokban töltetként alkalmazhatunk például térhálósított agaróz gélt (Procion Red, HE-3B) és kvatemer amin funkciós csoportot tartalmazó monodiszperz hidrofil polimert. Ilyenek például a Pharmacia Ltd. Red. Sepharose CL-6B és Mono-Q márkanevű termékei.

A találmány szerinti eljárással nyert bLT vagy immunogén determinánsa ismert módon immunogénként alkalmazható antitestek képzésére. Poliklón antitesteket nyerhetünk például laboratóriumi állatok bLT-val vagy immunogén determinánsával végzett immunizálásával, és az antiszérum kinyerésével. Monoklón antitesteket nyerhetünk egerek bLT-vel vagy immunogén determinánsával végzett immunizálásával, majd a szenzibilált lép-sejtek izolálásával és az ilyen sejtek myeloma sejtekkel végzett fúziójával, amikor is hibridoma sejteket nyerünk és ezeket a megfelelő módon klónozzuk és tenyésztjük.

A bLT-vel nyert poliklón és monoklón antitesteket alkalmazzuk a bLT tisztítására affinitásos kromatográfiával, valamint felhasználjuk a bLT azonosítására és jellemzésére is.

Mint azt már korábban is említettük, a bLT-nek daganatellenes hatása van és ily módon alkalmazható daganatos betegségek kezelésére és gyógyítására. Erre a célra a bLT-t megfelelő formába kell hozni, azaz a bLT-t megfelelő gyógyszerészeti hordozóanyaggal kell elkeverni. Ezen gyógyszerkészítmények előállítási eljárása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

A találmány szerinti eljárással nyert gyógyszerkészítmények előnyösen adagolásra alkalmas injekciós vagy infúziós készítmények. Ezek adott esetben semleges pH értékre beállított oldatok, amelyek az izotonicitáshoz szükséges mennyiségben sóoldatot vagy dextrózt tartalmaznak, de tartalmazhatnak még különböző stabilizátorokat is, így például humán szénim albumint vagy inért cukrot A bLT-t előnyösen liofilizált formában szereljük ki, amely megfelelő módon vízzel felhasználásra előkészíthető közvetlen az adagolás előtt.

A gyógyszerkészítményeket, akár nedves, akár liofilizált formában előnyösen zárt, steril műanyag vagy üvegedényekben szereljük ki.

A daganatos betegségek kezelésére a bLT-t hatásos mennyiségben adagoljuk az állatoknak, és a nyert bLT a humán- és állatgyógyászati készítményekhez is felhasználható.

A találmány szerinti eljárással nyert bLT-t önmagá3

HU 202 593 Β bán vagy más kemoterápiás szerekkel kombináltan adagoljuk, ilyenek például az interferonok, tumor nekrózis faktorok, interleukinek és kolónia stimuláló faktorok.

A bLT-t az állatoknak elsősorban intravaszkuláris, intratumorális, intraperitoneális és intrapleurális módon adagoljuk.

A bLT hatásos mennyisége állatok esetében természetesen számos körülménytől függ, így például az állatok korától, a betegség pontos mibenlététől és annak komolyságától, az adagolás módjától és végső soron a kezelőorvos megítélésére van bízva. Általában azonban 0,02-10 gg/kg, előnyösen 0,1-4 gg/kg mennyiségben alkalmazzuk. Egy felnőtt humán egyed esetében a (kb. 70 kg) hatásos mennyiség például 1,4-700, előnyösen 7-280 gg.

A következő példákkal a találmány szerinti eljárást mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül. A különböző oszlopokhoz kötött fehérjék mennyiségét 280 nm-en mutatott adszorpcióval határoztuk meg (A^).

1. példa bLT-ben dús oldat előállítása

Nemalwa/WRL humán limfoblasztoid sejtvonalakat (ATTC CRL 1432) tenyésztettünk és indukáltunk (Finter N. B. és mtársai, Cold Spring Harbour Symposia on Quantitative Biology, 1986, LI kötet, 571-575). A kapott sejt-felülúszót Sepharose-t (Pharmacia Ltd.) és anti-limfobiasztoid interferon poliklón antitestet (Finter N.

B. , Fantes K. H. és Johnston M. D., Developments in Biological Standardisation, 1978, 38, 343-348; Fantes K. H., Burmán C. J., Ball G. D., Johnston M. D. és Finter

N. B„ Biochemical Characterisation of Lymphokines, 1980,343-351, szerkesztő: A. L. de Wcck,F. Kristensen and M. Lardy, New York and London, Academic Press) tartalmazó oszlopon átengedjük, majd szintén az előzőekben leírtak szerint járunk el (Secher D. S. és Bürke D.

C. , 1980, Natúré, 1980,285,446-450). Ez a lépés lényegében az összes limfoblasztoid interferont eltávolítja.

Az oszlopról lejövő bLT-tartalmú folyadékot (500 ml),

O, 025 mólos imidazol-HCl-lel pH = 7,7-nél dializáltuk és 1 cm x 30 cm-es PBE 94 (Pharmacia Ltd.) töltetű, előzőleg a fenti pufferral kiegyensúlyozott oszlopra adagoltuk. 11 ml/óra sebességgel végzett folyamatos adagolást végeztünk és 11 ml-es frakciókat vettünk le. Az oszlopot ezután 100 ml fenti pufferral mostuk, az 500 ml 8-szorosra hígított Polybuffer 74-gyel (Pharmacia Ltd.) pH = 4-nél végzett eluálás előtt. Az eluálás alatt a frakciók mennyiségét 3 ml-re változtattuk. Az anyag legalább 80%-a megkötődött az oszlopon (A_ao) és így a bLT-től elválasztható. Az oszlopra megkötött anyag fehérje koncentrációja kb. 2 mg/ml és citotoxikus aktivitása 56 U/ml, az oszlopról lejövő bLTtartalmú folyadék koncentrációja kb. 0,33 mg/ml és citotoxikus aktivitása 40 U/ml.

A kiindulási anyagban is jelenlévő, az oszlophoz megkötött citotoxikus anyagot az oszlopról pH = 5,36,3 közötti pH értéknél (csúcs pH = 5,7) eluáltuk.

A citotoxikus aktivitás kimutatására LM sejteket (ATCC No. CCL 1,2) és semleges vörös festéket alkalmazunk és a kimutatást a következőképpen végezzük: az LM sejteket mikrotitráló lyukakban 5 x 10* sejt/ml (200 gl/lyuk) mennyiségben, 1% borjú-magzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegre ráoltottuk. A vizsgálatokhoz szükséges hígításokat RPMI 1640 tápközeggel készítettük, amely 1% borjú-magzat széru4 mot tartalmazott. Minden hígításból 50 gl-es mintát helyeztünk a kettős lyukakba rögtön azután, hogy a sejteket beadagoltuk, és a mikrotitráló lemezeket 37 ‘C hőmérsékleten 5% szén-dioxidban inkubáltuk. 64-72 óra elteltével a sejteket 1,5 órán át 0,036% semleges vöröst, 0,9% NaCl-ot és 0,015 n HCl-t tartalmazó oldattal (50 gl/lyuk) megfestettük. A festőoldatot ezután a sejtekről leszívattuk és a sejteket 0,9%-os NaCl-oldattal mostuk. A sejteket ezután 200 gl/lyuk mennyiségben 50 tf%-os 0,9% NaCl/etanol eleggyel 30 percig szobahőmérsékleten mostuk, majd mértük az abszorpciót 540 nm-en.

2. példa bLT-ben dús oldat előállítása más módon

Az 1. példában leírt anti-limfoblasztoid interferon poliklón antitest immunoaffinitásos oszlopról lejövő 40 liter folyadékot betöményítettük és egyidejűleg 0,01 mólos imidazol-HCl-lel szemben pH = 7,7-nél dializáltuk, Ashai mesterséges vese alkalmazásával (AM300; Kimai Scientific Products Ltd., Uxbridge, Middlesex, Anglia). A végső térfogat körülbelül 2,5 liter.

A fenti betöményített anyag 2 literét, 2,5 cm x 18 cm-es CM-Sepharose (Pharmacia Ltd.) oszlopra adagoltuk, amelyet előzőleg pH = 7,7-nél 0,01 mólos imidazolHCl-lel kiegyensúlyoztunk. Az átengedés! sebesség 50 ml/óra volt és három nagyobb frakciót vettünk le. Az oszlopot a 250 ml fenti pufferral mostuk és 10 x 25 ml-es frakciót vettünk le. Az oszlopot ezután lineárisan növekvő ionerősségű oldattal eluáltuk, amelyet 1 liter fenti imidazol-HCl-pufferből és 1 liter ilyen pufferrel készült 1 mólos nátrium-klorid oldatból állítottunk elő. Az eluálás alatt 10 ml-es frakciókat vettünk le.

Az oszlopról lejövő anyag és az eluens oldat fehérje tartalma olyan volt, hogy az A^ módon meghatározott értékek a méréshatáron kívül estek és így az oszlopon megkötött anyag mennyiségét becsülni sem lehetett.

Az eluációs profilon belül eső különböző frakciók citotoxikus aktivitását megvizsgáltuk LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával az 1. példában leírtak szerint. Aktivitás két területen mutatkozott, 0,08-0,11 mól NaCl-nál és 0,28-0,33 mól NaCl-nál. Ez két különböző formájú bLT-t reprezentálhat.

3. példa bLT-tartalmú tisztított oldat készítése

Namalwa/WRL vonalból származó humán limfoblasztoid sejteket RPMI 1640 tápközegben tenyésztettünk, amelyet 7 tf% felnőtt szarvasmarha szérummal, 0,5 t/tf% triptonnal és 3 mg/ml mennyiségű glükózzal egészítettünk ki. Amikor a sejtsűrűség a 2,5-3 x 10® sejt/ml értéket elérte, a tenyészetet 7% fenti szérummal kiegészített RPMI 1640 tápközeggel 1,0-1,5 x 10⁶ scjt/ml értékre hígítottuk, majd hozzáadtunk annyi mólos nátrium-butirátot, hogy a végső koncentráció mmól legyen. A tenyészetet ezután 37 ’C hőmérsékleten 2 napon át kevertük, majd 10 percig 800 ford/perc mellett centrifugáltuk (Mistral centrifuga, 6 literes, M. S. E., Manor Royal, Crawley, W. Sussex, Anglia). A kiülepedett sejteket mostuk és szérummentes RPMI 1640ben szuszpendáltuk, amely még a következő anyagokat tartalmazta: 1 mmól glutamin, 0,5 t/tf% tripton, 3,5 mg/ml glükóz, 1 mgóliter inzulin, 0,14 mg/liter putreszcin, 2 mg/liter lecitin és 2,2 mg/ml nátrium-hidrogén-karbonát. Ezután Sendai vírust tartalmazó (1 tf%)

HU 202 593 Β allantois folyadékot adagoltunk hozzá, majd 37 ’C hőmérsékleten 24 órán át inkubáltuk, a felülúszót centrifugálással elválasztottuk (Mistral, 6 literes centrifuga, 1500 ford/perc), majd 0,22 gm-es szűrőn átszűrtük.

A felülúszót anti-limfoblasztoid interferon poliklón antitest immunoaffinitásos (1. példa) oszlopon átengedtük. 10 liter, oszlopról lejövő folyadékot 0,5 literre betöményítünk és egyidejűleg 25 mmólos imidazol-HClval szemben pH = 7,4-nél diaszűrtük Amicon spirálszövet ultraszűrő töltet és YM10 membrán (Amicon Ltd.) alkalmazásával. A betöményített oldatot még tovább dializáltuk 4 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át 25 mmólos fenti pufferral szemben, pH = 7,4-nél.

A kapott betöményített bLT-tartaímú oldatot ezután két sorbakapcsolt ioncserélő oszlopra adagoltuk: az első

2,5 x 5 cm-es DEAE-Sepharose C1-6B (Pharmacia Ltd.), a második 2,5 cm x 2,5 cm-es CM-Sepharose C1-6B töltetű oszlop. Mindkét oszlopot előzőleg 25 mmólos imidazol-HCl oldattal pH = 7,4-nél 4 ’C hőmérsékleten kiegyensúlyoztuk. A DEAE-Sepharose C1-6B oszlopról lejövő folyadékot közvetlenül a CMSepharose töltetű oszlopra adagoltuk. Ezt az oszlopot növekvő koncentrációjú NaCl oldattal (50 mmól, 100 mmól, 250 mmól) eluáltuk 1 ml/perc átfolyási sebességgel, addig, amíg az A^ az alapvonalra visszatért. A fő bLT-tartalmú csúcs 100 mmólos NaCl esetében 30 ml-es mennyiségben jelentkezett

A bLT-tartalmú eluátumot közvetlenül 2 cm x 1,6 cm méretű Red-Sepharose CL-6B töltetű oszlopra vittük. A bLT a töltethez kötődött és a tölteten megkötődött bLT-t 50 mmól dietanol-amin - 0,1 mól arginin eleggyel eluáltuk pH = 9,4-nél 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett addig, amíg az Aa» érték a bázisvonalra visszatér. A szükséges mennyiség 15 ml. E lépésnél 5-szörös tisztítást értünk el.

A Red-Sepharose oszlopról lejövő eluátumot 1 : 4 arányban 50 mmólos dietanol-amin-HCl oldattal hígítottuk, pH = 9,4-nél és Mono Q (Pharmacia Ltd.) töltetű oszlopra adagoltuk, átfolyási sebesség 1 ml/perc. Az összes citotoxikus anyagot visszanyertük a nem kötött frakcióban.

A kapott bLT-tartalmú minták aktivitását a tisztítási folyamat alatt az 1. példában leírt LM sejtekkel és semleges vörös festékkel végzett vizsgálattal határoztuk meg és a következő táblázatban foglaljuk össze.

Minta	Teljes fehérje konc. mg/ml	bLT (U/ml)	Specifikus aktivitás (U/mg)
1. Anti-lymphoblastoid
interferon immunaff.
oszlop	0,12	150	1.25X103
2. CM-Sepharose oszlop	0,085	800	9,4 x 104
3. Red-Sepharose oszlop	0,012	8100	7,2 x 105
4. Mono Q oszlop	0,008	9750	1,2x10®

* Bio-Rad fehérjevizsgáló kittel meghat (Bio-Rad Labor. Richmond, Califomia, USA)

Az aminosav vizsgálatok elvégzéséhez a bLT-t egy további tisztításnak vetettük alá, amelyhez fordított fázisú kromatográfiás oszlopot (Pro RPC, Pharmacia Ltd.) alkalmaztunk. A mintát közvetlenül a Mono Q oszlopról erre az oszlopra adtuk fel, és az eluálást 0-15-40% gradiensű acetonitril 0,1% trifluor-ecetsavval készült oldatával végeztük. Az átfolyási sebesség 0,7 ml/perc. Az első 15%-os acetonitril koncentráció növelést 5%/perc sebességgel végeztük, majda 15%-os koncentrációt 5 percig tartottuk, majd ezután a gradienst 1%/perc sebességgel változtattuk. A bLT mennyiségét ELIS A-val mutattuk ki az A^ csúcsnál, az elúciós görbét az 1. ábrán mutatjuk be. A maximális mennyiségű bLT-t 32-35%-os acetonitrillel/eluáltuk (0,1% trifluorecetsavban).

4. példa bLT elleni monoklón antitest előállítása

A hibridoma előállításánál Kohler, G. módszerét követtük (Kohler, G. et al., Natúré, 1975, 256,495-497) az alábbi eltérésekkel:

i) Két BALB/c egeret oltottunk be intraperitoneálisan és szubkután több helyen kb. 750 ng/egér mennyiségű bLT-t tartalmazó Freud-féle komplett adjuvánssal. A bLT-t a 2. példa szerint állítottuk elő, majd anti-szarvasmarha-szérum immunaffinitásos oszlopra adagoltuk.

ii) Egy hónap elteltével mindegyik egeret a fenti módon 125 ng bLT-vei (Freud-féle hordozóban) ismételten beoltottuk. A bLT-t az i) pontban leírtak szerint állítottuk elő, majd még Sepharose 12 márkanevű agaróz mátrixon gélszűrtük.

iii) További három hét elteltével mindegyik egeret ismételten beoltottuk szubkután és intravénásán 1,75 gg/bLT-vel (Alhydrogel-ben: 2%-os vizes alumínium-hidroxid). A bLT-t a 3. példa szerinti Sepharose CM oszlopról nyertük, majd még gélszűréssel tisztítottuk.

iv) Az utolsó emlékeztető oltásnál egy hónappal később 5,75 gg bLT/egér mennyiséget intravénásán alkalmaztunk. A bLT-t a iii) pont szerint nyertük és tisztítottuk. Három nappal később az egereket leöltük és a lépsejteket alkalmaztuk a P3-NSI/IAgr-I myeloma sejtekkel való fúzióhoz (J. Mól. Bioi, 1974, 90, 691).

A kapott hibridomákat ezután ismert módon klónoztuk és tenyésztettük. A klónozott hibridomákat immunoradiometriával vagy immunodot folt vizsgálattal mutattuk ki együttesen egy olyan vizsgálattal, amelyjelezte az aktivitás kiválását immunoprecipitálásnál. így választottuk ki a kívánt antitest kiválasztására alkalmas kiónokat

5. példa bLT fizikai-kémiai tulajdonságai

A) Molekulatömeg

A bLT látszólagos molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg. A 3. példa szerinti, a CM-Sepharose oszlopról lejövő bLT 200 gg-os mennyiségét 5X betöményítettük Amicon kevert sejt + YM10 membrán (Amicon Ltd.) segítségével. A betöményített mintát ezután Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia Ltd.) töltetű oszlopon gélszűrtük, az eluálást pH = 7,2-nél 0,5 ml/perc sebességgel adagolt foszfát pufferral végezve. Az eluátum citotoxikus aktivitásának meghatározását LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával az 1. példában leírtak szerint végeztük. A kapott eredményeket

HU 202 593 Β a 2. ábrán mutatjuk be, amelyen a szaggatott vonal felel meg a citotoxikus aktivitásnak és a számozott jelölések az ismert molekulatömegű fehérjék eluálási helyének felelnek meg. Ismert fehérjeként a következőket alkalmaztuk:

1. Apoferritin

2. β-amiláz

3. Szarvasmarha szérum albumin

4. Karbon-anhidráz

5. Cytochrome C

A 2. ábra alapján megállapítva a bLT molekulatömege 47 ± 5 kDa.

B) Izoelektromos pont

Az 1. példa szerint nyert, és az anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról lejövő eluálumban lévő bLT nem kötődik a PBE 94 (Pharmacia Ltd.) kromatofókuszáló oszlophoz a megadott körülmények között. így a kromatográfiás viselkedés alapján megállapítható, hogy a bLT látszólagos izoelektromos pontja 7,7-nel nagyobb.

C) Aminosav analízis

A 3. példa szerinti Pro RPC oszlopról lejövő bLT-t 6n sósavban hidrolizáljuk, majd ismert módon a Watcrs „Pico-Tag” rendszer alkalmazásával meghatároztuk az aminosav-tartalmat. Az aminosav összetétel számításnál 47 kDa molekulatömeget vettünk alapul.

6. példa bLT biológiai tulajdonságai

A) bLT, TNFa és ΤΝΕβ citotoxikus aktivitása

A vizsgálandó emlős scjtvonalak mindegyikét azonos módon vizsgáltuk a citotoxikus aktivitással szembeni érzékenység meghatározására. A vizsgálatot a következőképpen végeztük.

A sejtvonalakat 5-10% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközegben tenyésztettünk. Az exponenciális növekedési fázis végén a tápközeget 1% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel cseréltük le. 200 μΐ-es mintát vettünk, amely 10* mennyiségű sejtet tartalmazott és ezt 0,3 ml-es lyukakkal ellátott mikrotitráló tálcába helyeztük (Costar).

Párhuzamos log₂ hígítási sorokat készítettünk a bLTból (amelyet a 3. példa szerinti Mono Q oszlopról vettünk le és koncentrációja 3250 U volt LM sejtekkel meghatározva) 1% borjúmagzat szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeg alkalmazásával. A hígításokat 50 μ/lyuk mennyiségben a vizsgálandó sejtekhez adagoltuk két párhuzamos sorban, amely azonos hígításokat tartalmazott. A vizsgálandó sejteket ezután nedves, 37 ’C hőmérsékletű inkubátorba helyeztük és 5% széndioxidban 48 órán át inkubáltuk. A folyamat végén a fenti tápközeg 40 μΐ-es mennyiségével 4 pCi (metil-³H)-timidint (Amcrsham International, England; 52 Ci/mM) vittünk be minden lyukba. A vizsgálandó sejtek jelzését a fenti inkubátorban 18 órán át végeztük. A tápközeget ezután eltávolítottuk a hozzálapadó sejtektől (LM, L 929, RPMI 2650) és 200 μΐ 0,05%-os etilén-diamin-tetraecetsavval helyettesítettük és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a sejteket mostuk, sejtbegyűjtővel (M-48R, Brandcl USA) üvegszálas szűrőtárcsára (Whatman 6F/B) gyűjtöttük. A mosáshoz foszfát puffért (pH = 7,2) alkalmaztunk. Minden szűrőtárcsát üvegfiolába helyeztünk, amelyek 5 ml szcintillációs fo6 lyadékot („Cocktail W”, British Drug Houses, Poole, Dorset, Anglia) tartalmaztak és folyadék szcintillációs számlálóval számoltuk. A vizsgált sejtek 50%-os elpusztításához szükséges bLT-egységeket az LM sejtekkel összehasonlítva probit analízissel (J. Gén. Virol, 1972,14,49) határoztuk meg.

Az alkalmazott sejteket és a kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Vizsgált sejtek	bLT LM egységeinek száma, amely 50%-os pusztulást okoz
LM		lU/ml
RPMI 2650		20 U/ml
L929		20 U/ml
MOLT-4		25 U/ml
K652		800 U/ml
RAJI		>1000 U/ml
DAUDI		>1000 U/ml
HL60		>1000 U/ml
Sejtvonal	ATCC száma	Természete
LM	CCL 1,2	Egér tumorogén fibroblaszt
RPMI 2650	CCL 30	Humán onsövény; kvázi-diploid tumor
L929	CCL1	Egér tumorogén fibroblaszt
MOLT-4	CRL 1582 Humán perifériális vér; akut limfoblasztémiás leukémia
K562	CCL 243	Humán krónikus miclogeniás leukémia
RAJI	CC186	Humán Burkitt-féle limfoma
DAUDI	CCL 213	Humán Burkitt-féle limfoma
HL 60	CC1 240	Humán perifériális vér

promieloktikus leukémia

Humán colon adenocarcinoma sejtvonal HT 29 (ATCC No. HTB 38) felhasználásával trícium felszabadítási vizsgálattal határoztuk meg a bLT, a természetes TNFa és ΤΝΕβ citotoxikus aktivitását. A bLT-t az 1. példa szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról nyertük. A természetes TNFa-t J 774.1 sejtekkel (Natúré, 1975,257,393-394) stimulált lipopoliszaccharid felül úszójának formájában alkalmaztuk. A természetes TNF3-t szintén felülúszó formában alkalmaztuk, amelyet a következők szerint állítottunk elő:

RPMI 1788 sejteket (ATCC No. CCL 156) RPMI 1640 szerummentes tápközegre ráoltottunk (6 x 10⁶ sejt/ml) 2 ng forbol -airisztát-acetát jelenlétében és a sejteket 3 órán át 37 ’C hőmérsékleten 5% szén-dioxidban inkubáltuk, majd Phytohaemaglutint adtunk hozzá 5 pg/ml végső koncentrációban és az inkubálást még 48 órán át folytattuk. A sejteket ezután centrifugálással elválasztottuk, a felülúszó ΤΝΕβ aktivitását L929 sejteken ellenőriztük, majd Amicon szűrő sejteken YM 10 membránnal (Amicon Ltd.) betöményítettük.

A trícium felszabadítás vizsgálatot a következőképpen végeztük:

A vizsgálandó sejteket jelzetté tettük úgy, hogy Dulbccco-féle módosítású Eagle-tápközegben, amelyet 25 mmól HEPES-sel, 5% termikusán inaktivált borjú-611

HU 202 593 Β magzat szérummal egészítettünk ki, 5 pCi/ml mennyiségű [metil-³-H]-timidin jelenlétében tenyésztettük. A sejt monoréteget kalciumot és magnéziumot nem tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal kétszer mostuk a jelzőanyag feleslegének eltávolítására, majd 0,05%-os etilén-diamin-tetraecetsav segítségével a műanyag tálcáról eltávolítottuk. Az így jelzett sejteket ezután Dulbecco módosítású Eagle-féle tápközegben diszpergáltuk, és 200 μΐ mennyiségeket (mindegyik 10* sejtet tartalmazott) a mikrotitráló tálca 0,3 ml-es lyukaiba szétosztottunk, és nedves inkubátorban 37 ’C hőmérsékleten 5% szén-dioxid jelenlétében 18 órán át inkubáltuk. A tápközeget ezután leszívtuk és 250 μΐ/lyuk mennyiségű hígított mintával pótoltuk két párhuzamos sorban, amelyek azonos log₃ hígításokat tartalmaztak. A lemezeket ezután 24 órán át inkubáltuk, majd 1 pg/ml mennyiségben cikloheximidet adtunk hozzá és a lemezeket ismételten további 24 órán át inkubáltuk. A lyukakból ezután 200 μΐ-es mennyiségben leszívtuk a felülúszót, „Coctail W” szcintillációs folyadékba tettük és folyadék szcintillációs számlálóval számoltuk.

A kapott eredményeket a 3. ábrán ábrázoltuk.

B) Hőmérséklet hatása a bLT, rTNFa és rTNFP citotoxikus aktivitásra

Tisztított bLT mintákat (500 U/ml), amelyeket a 3. példa szerinti Mono Q oszlopról vettünk le 30 percen át különböző hőmérsékleten inkubáltuk, majd az 1. példa szerint LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával vizsgáltuk.

Hasonlóképpen inkubáltuk a rekombináns TNFa (Genzyme Fine Chemicals Ltd„ Suffolk, Anglia) és rekombináns TNF3 (NIBSC, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire, Anglia) mintákat is. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Hőmérséklet Megmaradt citotoxikus aktivitás (’C) bLT rTNFa τΤΝΡβ

20	100	100	100
42	100	ND	ND
56	100	ND	ND
65	100	ND	ND
75	81	9	63
80	6,5	5	6
ND =	nem vizsgált

Az rTNFa és rTNFp-nál feltüntetett eredmények egy mérésből származnak, a 75 ’C és 80 ’C-os eredmények két vagy három mérés átlagát jelentik, egyébként a többi bLT-vizsgálati eredmény is egy mérésből származik.

A 75 ’C-nál kapott eredmények jelentős különbséget mutatnak a bLT, és az rTNFa, ill. rTNFp hőmérsékletstabilitás között.

C) Neuraminidáz hatása a bLT és TNFP citotoxikus aktivitására

A 3. példa szerinti Mono Q oszlopról nyert bLT mintákat vibrio cholerae-ból (BDH Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Anglia) származó neuraminidázzal kezeltünk a következőképpen:

μΐ-es mintákhoz (2500 U/ml) 5 μΐ neuraminidázt (500 U/ml) adtunk 50 μΐ 0,1 mólos nátrium-acetát puffénál, (pH = 5,1) együtt, és 60 percen át 37 ’C-on inkubáltuk. Ezután 5 μΐ 0,2 mólos siaisavat adagoltunk minden mintához az enzim inaktiválására. A térfogatot 0,3 ml-re egészítettük ki 1 % borjúmagzati szérumot tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel, majd az 1. példában leírtak szerint LM sejtvonal és semleges vörös festék alkalmazásával meghatároztuk az aktivitást. Az enzim specifitásának ellenőrzésére a vizsgálat előtt neuraminidázt, nátrium-acetátot és 0(2 mólos siaisavat tartalmazó mintákat is inkubáltunk.

A kapott eredmények azt mutatták, hogy a bLT aktivitása a neuraminidázzal végzett kezelést követően is teljesen megmaradt. Ez eltér a RPMI 1788 sejtekből származó ΤΝΡβ-nál megfigyeltektől, amely szerint ezeknél a citotoxikus aktivitás 49%-bs, illetve 92%-os csökkenést mutat 0(2, illetve 0,4 egység neuraminidáz jelenlétében (Cancer Research, 1985,45,851-862,)

D) Kimotripszin hatása a bLT, rTNFa és rTNF3 citotoxikus aktivitására.

A 3. példa szerinti Mono Q oszlopról származó bLT mintákat, valamint a fentiek szerinti rekombináns TNFa és rekombináns TNFp mintákat kimotripszin jelenlétében inkubáltuk, hogy ezen enzim emésztő hatásával szembeni viselkedésüket meghatározzuk. A vizsgálatot a következőképpen végeztük:

300 μΐ-es mintákat (500 U/ml, LM sejtekkel és semleges vörös festékkel az 1. példában leírtak szerint meghatározva) 6 egység kimotripszin (Type I-S; Sigma Chemicals Ltd., Poole, Dorset, Anglia) jelenlétében 2 órán át 37 ’C-on inkubáltuk. Ezután minden mintához szójabab tripszin inhibitort adagoltunk (Sigma Chemical Ltd.) a reakció meggátlására. A minták aktivitását ezután LM sejtek és semleges vörös festék alkalmazásával megvizsgáltuk.

A kapott eredmények azt mutatták, hogy a bLT és rTNFp aktivitása a kimotripszin hatására nem változik, míg az rTNFa aktivitása a kimutathatósági érték alá csökken (ez 20 U/ml érték).

E) Limfoblasztoid interferon hatása a bLT és TNFP citotoxikus aktivitására

Az 1. és 3. példa szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról származó bLT és a 6A. példa szerint nyert természetes TNFp minták citotoxikus aktivitását vizsgáltuk 0,1-10 000 U/lyuk mennyiségű limfoblasztoid interferon („Wellferon”) jelenlétében, valamint ilyen interferon nélkül. Sejtvonalként L929-et alkalmaztunk és a vizsgálatot a 6A példa szerinti trícium felszabadítás vizsgálat szerint végeztük. A kapott eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be.

A bLT esetében a citotoxikus aktivitás gátlása nem volt megfigyelhető, míg TNFP esetében 10 U/lyuknál nagyobb koncentrációban jelenlévő limfoblasztoid interferon a citotoxikus aktivitást gátolja. A ΤΝΕβ-val kapcsolatos eredmény egyezést mutat korábbi megfigyelésekkel (Williams, Lymphokine Research, 1984,3, 113).

F) bLT-tartalmú, oszlopról lejövő folyadékok vizsgálata interleukin-1 és γ-interferon aktivitásra

i) Az 1. példa szerinti anti-limfoblasztoid interferon immunoaffinitásos oszlopról lejövő minta interleukin-1 aktivitását C3H/He comitogenesis vizsgálattal végeztük (Eur. J. Immunoi., 1986, 16, 370-375). Aktivitás nem volt kimutatható.

-713

HU 221 593 Β ii) Az 1. példa szerinti PBE 94 oszlopról lejövő folyadék γ-interferon aktivitását immunoradiometriával végeztük (Sucrosep Kit, Boots-Celltech Diagnostics Ltd., Anglia). A mért aktivitás 1,5 egység/ml értékű volt.

Claims (5)

1. Eljárás új citotoxin (bázikus limfotoxin) előállítására, amelynek látszólagos molekulatömege gélszűréssel meghatározva 47 ± 5kDa, látszólagos izoelektromos pontja legalább 7,7 és aminosav összetétele a következő:

Aminosav Maradékok száma Aminosav Maradékok száma Asx 36,0 ±4,3 Pro 24,5 ± 2,9 Glx 46,7 ±5,6 Tyr 12,3 ± 1,5 Ser 41,0 ±4,9 Val 22,7 ± 2,7 Gly 38,4 + 4,6 Met 8,4 ±1,0 His 13,6 ±1,6 Ile 19,6 ±2,4 Arg 19,6 ±2,4 Leu 43,1 ± 5,2 Thr 21,4 ±2,6 Phe 23,8 ± 2,9 Alá 33,2 ±4,0 Lys 26,4 ± 3,2

- ahol Asx jelentése Asp és/vagy Asn és Glx jelentése Glu és/vagy Gin - αζζα/ jellemezve, hogy limfoblasztoid sejtvonalat táptalajon inkubálunk, a sejtvonalat indukálószerrel indukáljuk, majd a kapott citotoxint a táptalajtól elválasztjuk, és kívánt esetben tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a citotoxin elválasztásánál a limfoblasztoid interferon eltávolítására anti-limfoblasztoid interferon antitest immunoaffinitásos oszlopot és a savas izoelektromos ponttal rendelkező citotoxinok eltávolítására kn matográiiás oszlopot alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, az.il j< Ilemezve, hogy a citotoxint nagyobb mint 909, tis/tasa gúra tisztítjuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a citotoxint nagyobb mint 95% tisztaságúra tisztítjuk.

5. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 1. igénypont szerint előállított citotoxint gyógyszerészetileg elfogadható inért hordozóanyaggal összekeverjük és adagolásra alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.